KR20170051058A

KR20170051058A - 미각 수용체를 이용한 살충제 또는 기피제의 스크리닝 방법

Info

Publication number: KR20170051058A
Application number: KR1020150153399A
Authority: KR
Inventors: 이영석; 문석준; 몬텔 크레이그
Original assignee: 국민대학교산학협력단; 유니버시티 오브 캘리포니아 엣 산타바바라; 연세대학교 산학협력단
Priority date: 2015-11-02
Filing date: 2015-11-02
Publication date: 2017-05-11
Also published as: KR101816102B1

Abstract

본 발명은 초파리 유래 미각 수용체를 이용한 해충방제제 예를 들어, 살충제 또는 기피제의 스크리닝 방법에 관한 것으로, 구체적으로는 초파리 유래 미각 수용체의 활성을 변화시키는 물질을 선별하는 단계를 포함하는 해충방제제의 스크리닝 방법에 관한 것이다.

Description

미각 수용체를 이용한 살충제 또는 기피제의 스크리닝 방법{Method of Screening Insecticides or Repellents by using a Gustatory Receptor}

음식의 품질을 평가하기 위해서 맛은 중요하다. 전용 감각 세포는 각각의 미각 양상에 전념하고, 유인 또는 기피를 직접 높은 두뇌 센터로 감각 정보를 전송한다. 많은 쓴맛과 다른 기피 화합물은 독성이 있기 때문에 이러한 화합물의 신속하고 정확한 감지는 많은 초식 동물에서 중요한 방어이다.

초파리에서 막 단백질의 여러 종류는 기피 화학물질의 자각에 참여한다. 적어도 2개의 TRP (transient receptor potential) 채널, TRPA1 및 TRPL은 기피 화학물질을 감각하는 기능이 있다. 하지만, 대부분의 미각을 자극하는 기피 화학물질의 감지는 68개의 단백질을 암호화하는 미각 수용체(gustatory receptor; GR) 패밀리의 구성원을 통해 수행될 것으로 판단된다. 곤충의 미각 수용체는 포유류의 미각 수용체와 관련이 없으나, G-단백질 결합 수용체는 초파리의 후각 수용체(olfactory receptors; ORs)와 먼 관련이 있다. 이형 이합체의 후각 수용체 복합체는 후각원-개폐형-양이온 채널을 포함하고, 곤충의 과당 수용체는 비선택적 양이온 채널 18개를 형성하는 단일 GR 서브유닛으로 구성되는 있는 것으로 보고된 바 있다.

초파리 미각 수용체는 여러 개의 서브유닛으로 구성되어 있고, 이들은 기피 화학물질에 응답한다. 생체 기능 상실 연구에 기초하여, 3개 GR32a, GR33a 및 GR66a의 미각 수용체는 폭넓게 조정되어, 회피 화합물의 광범위한 감지 기능이 있다. 또한, GR8a, GR47a 및 GR93a와 같은 미각 수용체는 범위가 좁게 조정되고, L-카나바닌, 스트리크닌, 카페인을 각각 감지하기 위해 필요하다.

L-카나바닌은 아미노산 L-아르기닌의 식물-유래 유사체로, 이를 섭취하면 L-아르기닌 대신에 단백질 합성시 도입되기 때문에 초파리와 많은 다른 곤충에게는 치명적이다. 그럼에도 불구하고, 기피 화합물에 응답하는 L-카나바닌 수용체의 최소 서브유닛 조성물 또는 다른 어떤 미각 수용체 복합체는 알려져 있지 않다. 이러한 이종다합체(heteromultimeric) 미각 수용체는 양이온 채널이 있는 경우 또한 불분명하다.

이러한 기술적 배경하에서, 본 출원의 발명자들은 L-카나바닌 감지에 관여하는 완전한 세트의 미각 수용체를 밝혀내고, 이를 이용하여 해충방제제 예를 들어, 살충제 또는 기피제를 스크리닝 할 수 있음을 확인하고, 본 발명을 완성하였다.

본 배경기술 부분에 기재된 상기 정보는 오직 본 발명의 배경에 대한 이해를 향상시키기 위한 것이며, 이에 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가지는 자에게 있어 이미 알려진 선행기술을 형성하는 정보를 포함하지 않을 수 있다.

본 발명의 목적은 본 출원의 발명자들에 의해 밝혀진 L-카나바닌 감지에 관여하는 완전한 세트의 미각 수용체를 통해, 이에 결합하는 리간드를 해충방제제로 스크리닝 하기 위한 방법을 제공하는 데 있다.

본 발명의 목적은 또한, L-카나바닌 감지에 관여하는 완전한 세트의 미각 수용체를 포함하는 리간드 스크리닝용 조성물을 제공하는 데 있다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 다음 단계를 포함하는 살충제 또는 기피제의 스크리닝 방법을 제공한다: (a) 초파리 유래의 미각 수용체 (Gustatory Receptor)에 후보물질을 처리하는 단계; 및 (b) 미처리 대조군과 비교하여, 초파리 유래의 미각 수용체의 활성을 증가시키거나 억제시키는 물질을 해충방제제로 선별하는 단계.

본 발명은 또한, 다음 단계를 포함하는 살충제의 스크리닝 방법을 제공한다: (a) 초파리 유래의 미각 수용체 (Gustatory Receptor)에 후보물질을 처리하는 단계; 및

(b) 미처리 대조군과 비교하여, 초파리 유래의 미각 수용체의 활성을 억제시키는 물질을 살충제로 선별하는 단계.

본 발명은 또한, 다음 단계를 포함하는 기피제의 스크리닝 방법을 제공한다: (a) 초파리 유래의 미각 수용체 (Gustatory Receptor)에 후보물질을 처리하는 단계; 및

(b) 미처리 대조군과 비교하여, 초파리 유래의 미각 수용체의 활성을 증가시키는 물질을 기피제로 선별하는 단계.

본 발명은 더욱이, 초파리 유래의 미각 수용체를 포함하는, 상기 미각 수용체에 결합하는 리간드를 해충방제제로 스크리닝하기 위한 조성물을 제공한다.

본 발명은 L-카나바닌 감지에 관여하는 완전한 세트의 신규한 미각 수용체를 통해 이에 결합하는 리간드, 이를 이용한 해충방제제 예를 들어 살충제 또는 기피제를 스크리닝 하기 위한 유의한 타겟을 제공할 수 있으며, 본 발명에 따른 스크리닝 방법 및 스크리닝용 조성물은 해충방제제의 발굴 및 개발에 유용하게 사용될 수 있다.

도 1은 L-카나바닌 기피에 필요한 맛 수용체의 식별에 관한 것이다. 도 1a는 L-카나바닌 기피에 결함에 대한 58 UAS-Gr RNAi 기준선 및 13 UAS-Ir의 RNAi 유전자선별검사를 실시하였다. Gr33a-GAL4을 이용하여 RNAi하고, RNAi의 효과를 향상시키기 위해 UASDcr2(Dicer2)을 포함하였다. 점선은 무선호(no preference)를 나타낸 것이다.
도 1b는 2개의 서로 다른 RNAi 라인을 이용한 양방향 선택 분석에 관한 것이다. 대조군은 RNAi 형질전환 없이 UASDcr2; Gr33a-GAL4 초파리로 구성된다. RNAi 스톡 넘버(VDRC)는 막대 안에 기재하였다. 각 유전자형에 대해 5회 실시하였다. 데이터는 ±SEM을 의미한다. **p<0.01(ANOVA with post-hoc Tukey test).
도 1c는 말단 아웃 상동 재조합에 의한 Gr98a ¹ 대립유전자(allele)를 제조하기 위한 전략을 도시한 것이다. 화살촉(arrowheads)은 Gr98b 삭제를 확인하는데 사용되는 genomic PCR 프라이머를 나타낸 것이다. 543 bp band는 Gr98b ¹ 이 없는 제어 초파리(control flies)에 나타난다.
도 1d는 Gr98b ¹ 이 L-카나바닌 기피의 결함이 나타나는지 테스트하기 위한 양방향 선택 분석에 관한 것이다. Gr98b ¹ 형질형(phenotype)의 구조(rescue)에 대하여 테스트로, Gr66a-GAL4, Gr8a-GAL4 및 Gr98b-GAL4을 이용하여 Gr98b ¹ background에서 Gr98b cDNA를 발현하였다. 각 유전자형에 대해 5회 실시하였다. *p<0.05(ANOVA with post-hoc Tukey test).
도 1e는 쓴맛을 나타내는 화학약품에 대한 Gr98b ¹ flies의 기피를 테스트하기 위한 양방향 선택 분석에 관한 것이다. 초파리(flies)는 1 mM 수크로오스와 5 mM 수크로오스+다음 기피 화합물 사이에서 선택하였다: 0.5 mM 파파베린(PAP), 0.5 mM 스트리크닌(STR), 0.1 mM 데나토늄(DEN), 0.05 mM 베르베린(BER), 0.1 mM 로벨린(LOB), 5 mM 카페인(CAF), 0.2% DEET 및 0.5 mM 퀴닌(QUIN). 각 유전자형에 대해 4-7회 실시하였다. 모든 데이터는 ±SEM을 의미한다.
도 2는 Gr98a에 활동 전위를 유도하는 L-카나바닌의 의존성에 관한 것이다. 도 2a는 30 mM L-카나바닌에 응답하는 대조군(w ¹¹¹⁸ ), Gr98b ¹ 및 rescue 초파리(Gr66a-GAL4/UAS-Gr98b;Gr98b ¹ )의 S6 감각기에서 활동 전위가 유발되었다. 도 2b는 30 mM L-카나바닌에 노출시 활동 전위의 평균 주파수를 나타낸 것이다. 상기 유전자형과 감각기(S3, S5 및 S10)에 대하여 테스트하였으며, 각 유전자형에 대해 10-12회 실시하였다. 도 2c는 쓴맛을 나타내는 화학약품(1 mM 파파베린(papaverine), 1 mM 스트리크닌(strychnine), 1 mM 데나토늄 (denatonium), 0.1 mM 베르베린 (Berberine), 1 mM 로벨린 (lobeline), 10 mM 카페인(caffeine), 0.2% 디에틸톨루아미드(DEET) 및 1 mM 퀴닌(quinine)에 응답하는 S6 감각기에서 유도된 활동 전위의 평균 주파수를 나타낸 것이다. 각 유전자형에 대해 10-21회 실시하였다. 모든 데이터는 ±SEM을 의미한다. **p<0.01(ANOVA with post-hoc Tukey test).
도 3은 L-카나바닌 감도를 부여하는 쓴맛을 감지하는 GRNs에서 Gr8a 및 Gr98b의 이소성 발현에 관한 것이다. 도 3a는 Gr8a, Gr66a 및 Gr98b 수용체 각각의 발현 패턴 및 라벨룸(파리의 입 끝부분)에서 Gr8a, Gr66a 및 Gr98b-발현 감각기의 위치를 도시한 것이다. 기준자는 50 μm이다. 도 3b는 쓴맛을 감지하는 GRNs(I-type 감각기)에서 Gr8a 및 Gr98b의 이소성 발현은 정상적으로 L-카나바닌에 응답하지 않는 감각기에 L-카나바닌 감도를 부여하였다. 도면 상단은 이소성 발현 실험을 묘사한 감각기를 도시한 것이고, 하단은 대표 트레이스가 대조군 및 UAS-Gr8a,UAS-Gr98b;Gr33a-GAL4 초파리의 I4 감각기로부터 30 mM L-카나바닌에 의해 유발되었다. 도 3c는 응답 주파수는 각 감각기에서 Gr8a 및 Gr98b의 이소성 발현 후 30 mM L-카나바닌에 의해 유발되었다. UASGr8a, UAS-Gr98b 초파리는 음성 대조군이다. 4-14회 실시하였다. **p<0.01(Mann-Whitney U test). 중간값(Medians)과 사분위수(quartiles)를 표시하였다.
도 4는 당분과 저염 반응하는 GRNs에서 Gr8a, Gr66a 및 Gr98b의 이소성 발현으로 인한 효과에 관한 것이다. 도 4a 상단은 단맛을 감지하는 GRNs에서 Gr8a, Gr66a 및 Gr98b의 이소성 발현 실험을 도시한 것이고, 하단은 대표적 트레이스가 단맛을 감지하는 GRNs에서 Gr8a, Gr66a 및 Gr98b을 발현하는 L3 감각기로부터 30 mM L-카나바닌에 의해 유발되었다. 도 4b는 각각의 단맛을 감지하는 GRNs에서 L-카나바닌의 용량-의존 응답을 나타낸 것이다. GAL4가 없는 대조군 초파리(UAS-Gr8a,UAS-Gr66a,UAS-Gr98b; 점선)와 Gr64f-GAL4(실선)조절 하에 3 Grs가 발현된 초파리로부터 나타난 감각기의 응답을 도시한 것이다. 6-21회 실시하였다. 도 4c 응답 주파수는 Gr64f-GAL4을 이용하여 각각의 단맛을 감지하는 GRNs에서 Gr8a, Gr66a 및 Gr98b의 이소성 발현 후 30 mM L-카나바닌에 의해 유발되었다. 유전자형: 1) green circles: 2X(UAS-Gr66a,UAS-Gr98b);Gr64f-GAL4/+, 2) blue circles: 2X(UAS-Gr8a,UAS-Gr98b);Gr64f-GAL4/+, 3) ocher circles: 2X(UAS-Gr8a,UAS-Gr66a);Gr64f-GAL4/+, 및 4) purple circles: 2X(UAS-Gr8a,UAS-Gr66a,UAS-Gr98b);Gr64f-GAL4/+. 각 유전자형에 대해 4-21회 실시하였다. 중간값(Medians)과 사분위수(quartiles)를 표시하였다. *p<0.05, **p<0.01(Kruskal-Wallis test with Mann-Whitney U post hoc test). 도 4d 응답 주파수는 Ir76b-GAL4을 이용하여 각각의 저염분을 감지하는 GRNs에서 Gr8a, Gr66a 및 Gr98b의 이소성 발현 후 30 mM L-카나바닌에 의해 유발되었다. 유전자형: 1) blue circles: Ir76b-GAL4/+, 및 2) purple circles: UAS-Gr8a,UAS-Gr66a,UASGr98b/+; Ir76b-GAL4/+. 8-14회 실시하였다. 중간값(Medians)과 사분위수(quartiles)를 표시하였다. *p<0.05, **p<0.01(Mann-Whitney U test). 도 4e 당분에 응답하는 GRNs에서 Gr8a, Gr66a 및 Gr98b의 이소성 발현된 초파리의 감각기로부터 유발된 응답 주파수이다. 각각의 화학약품을 카페인(CAF; 5 mM)을 제외하고 1 mM씩(파파베린: PAP, 스트리크닌: STR, 데나토늄: DEN, 베르베린: BER, 로벨린: LOB) 테스트하였다. 6-9회 실시하였다. 중간값(Medians)과 사분위수(quartiles)를 표시하였다.
도 5는 단맛을 감지하는 GRNs의 이소성 발현에 의해 유도된 L-카나바닌에 대한 유인에 관한 것이다. 단맛을 감지하는 GRNs에서 Gr8a, Gr66a 및 Gr98b이 mis-expressing 초파리에서 L-카나바닌에 대한 유인 또는 기피에 대한 양방향 선택 분석시험에 관한 것이다. 상기 Grs은 Gr66a ^ex83 mutant background에서 이소성 발현되었다. 각 유전자형에 대해 5회 실시하였다. 데이터는 ±SEM을 의미한다. *p<0.05(ANOVA with post-hoc Tukey test).
도 6은 S2 세포 발현 미각 수용체의 전세포 전압 고정 레코딩에 관한 것이다. 세포를 30 mM L-카나바닌으로 자극하였다. 도 6a 및 도 6b에서, 세포를 pActin5c-GAL4, pUAST-EGFP only (mock) 또는 pActin5c-GAL4, pUAST-EGFP plus pUAST-Gr8a, pUAST-Gr66a 및 pUAST-Gr98b (3 GRs)로 형질감염하였다. 도 6a L-카나바닌의 존재하에 얻은 500 ms 지속기간의 전압단계(-80 mV to +80 mV in 20 mV increments)에 응답하여 생성된 전류이다. 도 6b GR8a, GR66a 및 GR98b 발현 세포를 이용하고 L-카나바닌으로 자극한 I-V 관계도이다. 도 6c +80 mV에서 전류 밀도. 세포는 그래프 하단에 표시된 Grs을 발현시켰으며, L-카나바닌 자극의 존재 혹은 부재하에 기록되었다. 레코딩 숫자는 도면에 기재되어 있다. *p<0.05(paired Student's t-test). 도 6d-f에서 전류-전압 추적 결과 S2 세포에서 2개의 Grs 발현은 전류밀도에서 L-카나바닌-유도 증가와 연결되지 않음을 보여주었다. 도 6d Gr8a 및 Gr66a 발현 S2 세포(n=10). 도 6e Gr8a 및 Gr98b 발현 S2 세포(n=11). 도 6f Gr66a 및 Gr98b 발현 S2 세포(n=6). 도 6g I-V 관계에서 La³⁺의 효과. 세포는 GR8a, GR66a 및 GR98b 발현되고, L-카나바닌의 존재하에 기록되었다. 도 6h +80 mV에서 얻은 전류밀도에서 La³⁺의 효과. 세포는 3개의 GRs 발현되고, L-카나바닌으로 자극하였다. **p<0.05 (ANOVA with posthoc Tukey test). 도 6i GR8a, GR66a 및 GR98b 발현 세포 및 다음 쓴맛의 화학약품으로 자극한 전류밀도: 30 mM L-카나바닌, 1 mM 파파베린(PAP), 1 mM 스트리크닌(STR), 1 mM 데나토늄(DEN), 100 μM 베르베린(BER), 1 mM 로벨린(LOB), 5 mM 카페인(CAF) 및 1 mM 퀴닌(QUIN). 레코딩 숫자는 도면에 기재되어있다. *p<0.01(ANOVA with post-hoc Tukey test). 모든 에러바(error bars)는 ±SEM을 의미한다.

다른 식으로 정의되지 않는 한, 본 명세서에서 사용된 모든 기술적 및 과학적 용어들은 본 발명이 속하는 기술분야에서 숙련된 전문가에 의해서 통상적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 갖는다. 일반적으로, 본 명세서에서 사용된 명명법은 본 기술분야에서 잘 알려져 있고 통상적으로 사용되는 것이다.

본 출원의 발명자들은 L-카나바닌과 같은 살충제의 쓴 맛 감지에 관여하는 완전한 세트의 미각 수용체를 연구하던 중, Gr8a 및 Gr66a의 넉다운은 L-카나바닌 회피 행동을 손상시키고, L-카나바닌 회피를 방해하는 하나의 추가 유전자(Gr98b)의 발현을 억제하는 것을 발견하였다. L-카나바닌에 응답하는 행동 반발과 활동 전위를 제거하기 위해 Gr98b를 삭제하여 실험하였고, 단맛을 감지하는 미각 뉴런 또는 낮은 짠맛을 감지하는 미각 뉴런에 Gr8a, Gr66a 및 Gr98b을 도입한 결과, L-카나바닌에 응답하는 능력이 부여됨을 확인하였다. 또한, 단맛을 감지하는 미각 뉴런에서 이러한 미각 수용체의 이소성 발현은 초파리의 타고난 L-카나바닌을 기피하는 것에서 오히려 유인하는 것으로 전환되었다. S2 조직 배양 세포에서 Gr8a, Gr66a 및 Gr98b의 이소성 발현은 L-카나바닌 의존 전류를 부여하게 됨을 확인하였다.

이를 기초로, 일 관점에서 본 발명은 다음 단계를 포함하는 해충방제제의 스크리닝 방법에 관한 것이다: (a) 초파리 유래의 미각 수용체 (Gustatory Receptor)에 후보물질을 처리하는 단계; 및 (b) 미처리 대조군과 비교하여, 초파리 유래의 미각 수용체의 활성을 증가시키거나 억제시키는 물질을 해충방제제로 선별하는 단계.

L-카나바닌 감지에 필요한 수용체를 확인하기 위해, Gr2a(v102185), Gr5a(v13730), Gr8a(v31104), Gr9a(v15446), Gr10a(v39237), Gr10b(v31151), Gr21a(v104122), Gr22a(v106736), Gr22b(v107792), Gr22c(v7249), Gr22e(v9389), Gr22f(v102860), Gr23a(v40852), Gr28a(v100938), Gr28b(v101727), Gr32a(v47956), Gr33a(v42802), Gr36a(v48018), Gr36b(v8062), Gr36c(v3872), Gr39a(v8685), Gr39b(v33215), Gr43a(v39518), Gr47b(v4594), Gr57a(v45879), Gr58a(v1703), Gr58b(v9565), Gr58c(v29137), Gr59a(v31107), Gr59b(v101219), Gr59c(v3530), Gr59d(v2766), Gr59e(v31110), Gr59f(v18989), Gr61a(v106007), Gr63a(v108203), Gr64a(v103342), Gr64b(v42517), Gr64c(BL36734), Gr64d(v29422), Gr64e(v109176), Gr64f(v105084), Gr66a(v14820), Gr68a(v13380), Gr77a(BL38236), Gr85a(v47992), Gr89a(v8253), Gr92a(v44408), Gr93a(v13569), Gr93b(v12160), Gr93c(v109794), Gr93d(v6813), Gr94a(v9537), Gr97a(v4395), Gr98a(v1300), Gr98b(v1302 및 v101040), Gr98c(BL36735), Gr98d(v4398), IR7a(v108171), IR47a(v11812), IR56a(v5010), IR56b(v4704), IR56d(v6112), IR94e(v33066), IR20a(v8658), IR94a(v7566), IR94c(v6817), IR94h(v1563), IR60b(v12089), IR67c(v37261), IR94f(v109702)와 같은 미각 수용체 및 이온 수용체에 대하여 스크리닝한 결과, 상기 초파리 유래의 미각 수용체는 Gr8a, Gr66a 및 Gr98b로 구성된 군에서 선택된 둘 이상의 서브유닛을 포함하는 이종다합체, 특히 Gr8a, Gr66a 및 Gr98b로 구성된 서브유닛을 포함하는 이종다합체인 경우 L-카나바닌에 응답성이 있음을 확인하였다.

상기 Gr8a 서브유닛은 서열번호 1의 아미노산 서열 또는 서열번호 10의 뉴클레오티드 서열로 표시되고, 상기 Gr66a 서브유닛은 서열번호 2의 아미노산 서열 또는 서열번호 11의 뉴클레오티드 서열로 표시되며, 상기 Gr98b의 서브유닛은 서열번호 3의 아미노산 서열 또는 서열번호 12의 뉴클레오티드 서열로 표시된다.

하나의 실시예에서, 상기 Gr8a, Gr66a 및 Gr98b로 구성된 서브유닛을 포함하는 미각 수용체를 후보물질에 반응하는 미각 뉴런으로 도입한 후 발현시켜 살충제 또는 기피제 스크리닝에 사용할 수 있다. 예를 들어, 상기 미각 수용체를 코딩하는 뉴클레오티드를 공지의 발현벡터에 클로닝시키고, 이를 미각 뉴런에 형질도입하여 발현시킬 수 있다.

상기 벡터는 적당한 숙주세포에서 목적 단백질을 발현할 수 있는 발현 벡터로서, 유전자 삽입물이 발현되도록 작동가능하게 연결된 필수적인 조절 요소를 포함하는 유전자 구조체를 의미한다. 프로모터, 오퍼레이터, 개시코돈, 종결코돈, 폴리아데닐화 시그널, 인핸서 같은 발현 조절 요소 외에도 막 표적화 또는 분비를 위한 신호 서열 또는 리더 서열을 포함하며 목적에 따라 다양하게 제조될 수 있다. 또한 상기 벡터의 프로모터는 구성적(constitutive) 또는 유도성(inducible)일 수 있다. 또한, 상기 벡터는 벡터를 포함하는 형질전환체를 선택하기 위한 선택성 마커를 포함하고, 복제 가능한 발현벡터인 경우 복제 기원을 포함한다.

상기 도입은 형질감염(transfection) 또는 형질도입(transduction)으로 외래 DNA를 세포로 유입시키는 것을 의미한다. 형질감염 및 형질도입은 당업계에 공지된 여러 방법에 의해 수행될 수 있다.

본 발명에서 이용된 Gr8a, Gr66a 및 Gr98b로 구성된 서브유닛을 포함하는 미각 수용체를 코딩하는 유전자를 클로닝하여 적합한 숙주세포에서 발현될 수 있으며, 숙주세포로는 대장균 등 다양한 미생물, 곤충세포 또는 동물세포가 이용될 수 있으나, 예를 들어 신경세포 특히 S2 세포가 이용될 수 있다.

상기 후보물질은 예를 들어, Gr8a, Gr66a 및 Gr98b로 구성된 서브유닛을 포함하는 미각 수용체의 활성을 변화시키는 화합물, 예를 들어 유기 또는 무기 저분자, 생물학적 분자, 예를 들어 펩타이드, 단백질, 핵산, 또는 이들의 유사체, 박테리아, 식물, 곰팡이 등으로부터 제조되는 추출물 등일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

상기 Gr8a, Gr66a 및 Gr98b로 구성된 서브유닛을 포함하는 미각 수용체를 바탕으로, 미처리 대조군과 비교하여, 후보물질을 처리한 초파리 유래의 미각 수용체에서 이의 활성이 증가되거나 억제되는 물질을 해충방제제 예를 들어, 살충제 또는 기피제로 선별할 수 있다.

이를 기초로, 본 발명은 다음 단계를 포함하는 살충제의 스크리닝 방법에 관한 것이다: (a) 초파리 유래의 미각 수용체 (Gustatory Receptor)에 후보물질을 처리하는 단계; 및 (b) 미처리 대조군과 비교하여, 초파리 유래의 미각 수용체의 활성을 억제시키는 물질을 살충제로 선별하는 단계.

또한, 본 발명은 다음 단계를 포함하는 기피제의 스크리닝 방법에 관한 것이다: (a) 초파리 유래의 미각 수용체 (Gustatory Receptor)에 후보물질을 처리하는 단계; 및 (b) 미처리 대조군과 비교하여, 초파리 유래의 미각 수용체의 활성을 증가시키는 물질을 기피제로 선별하는 단계.

본 발명에서 해충은 인간이나 가축, 경작 식물에 직간접적으로 피해를 입히거나, 이로 인해 경제적 손실을 야기할 수 있는 대상을 의미한다. 방제의 측면에서 살충제는 해충을 적극적으로 살해하는 약제를 의미하고, 기피제는 해충을 쫓는 목적을 가지고 사용하는 약제를 의미한다.

예를 들어, 후보물질을 처리한 초파리 유래의 미각 수용체에서 미처리 대조군과 비교하여 활성 증가가 나타난다면, 후보물질을 강한 쓴 맛으로 느끼게 되고, 곤충 또는 해충이 후보물질을 기피하게 될 수 있음을 의미하므로, 곤충 또는 해충의 접근을 막는 기피제로 선별할 수 있다. 또한, 후보물질을 처리한 초파리 유래의 미각 수용체에서 미처리 대조군과 비교하여 활성 억제가 나타난다면, 이는 후보물질을 인지하지 못하고 섭취하여 체내로 유입되도록 할 가능성이 있으므로, 이러한 후보물질은 곤충 또는 해충을 퇴치하는 살충제로 선별할 수 있다. 본 발명의 실시예에서는 L-카나바닌을 통해 본 발명에 따른 초파리 유래 미각 수용체가 해충방제제 스크리닝 시스템으로 사용될 수 있는지 여부를 확인하였다.

상기 후보물질은 곤충의 Gr8a, Gr66a 및 Gr98b로 구성된 서브유닛을 포함하는 미각 수용체와 후보물질의 결합에 의해 미각 수용체의 활성이 변화되면, 해충방제제 예를 들어 살충제 또는 기피제로 사용 가능한 리간드로 선별될 수 있다. 이 때 미각 수용체의 활성 변화는 mRNA 발현 수준을 측정하여 확인하거나, 미각 수용체에 특이적으로 결합하는 항체를 이용하여 면역 측정법에 의해 단백질의 양을 확인할 수 있으며, 본 발명의 실시예에서는 후보물질을 리간드로 인식한 미각 수용체 내에 채널이 형성되어 발생하는 전류 변화를 측정하여 확인하였다.

다른 관점에서, 본 발명은 초파리 유래의 미각 수용체를 포함하는, 상기 미각 수용체에 결합하는 리간드를 해충방제제로 스크리닝하기 위한 조성물에 관한 것이다. 이와 관련된 구성은 앞서 구체적으로 설명한 바와 같다. 본 발명에 따른 조성물은 스크리닝에 사용되는 당업계에 공지된 시약을 추가로 포함할 수 있다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것으로서, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지는 않는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.

[실시예]

실시예 1: L-카나바닌 감지에 필요한 수용체 스크리닝

모든 초파리 스톡은 25℃ 및 60% 습도에서 12h light/12h dark 주기로 종래의 옥수수 한천 당밀 배지에서 유지하였다. 블루밍턴 스톡 센터로부터 1)70FLP,70I-SceI/CyO, 2)UAS-Dcr2, 및 3)UAS-mCD8::GFP의 초파리 스톡을 얻었다. UAS-Gr8a, UAS-Gr66a, Gr33a-GAL4 및 Gr8a-GAL4 초파리는 전술하였다. Gr66a-GAL4 초파리는 H. Amrein이 선물로 주었다. Gr98b-GAL4 및 Gr64f-GAL4은 J. Carlson에게 제공받았다. RNAi 유전자선별검사를 위해 비엔나 초파리 RNAi 센터 및 블루밍턴 스톡 센터로부터 초파리 스톡을 얻었다. 스톡 넘버는 다음과 같다: Gr2a(v102185), Gr5a(v13730), Gr8a(v31104), Gr9a(v15446), Gr10a(v39237), Gr10b(v31151), Gr21a(v104122), Gr22a(v106736), Gr22b(v107792), Gr22c(v7249), Gr22e(v9389), Gr22f(v102860), Gr23a(v40852), Gr28a(v100938), Gr28b(v101727), Gr32a(v47956), Gr33a(v42802), Gr36a(v48018), Gr36b(v8062), Gr36c(v3872), Gr39a(v8685), Gr39b(v33215), Gr43a(v39518), Gr47b(v4594), Gr57a(v45879), Gr58a(v1703), Gr58b(v9565), Gr58c(v29137), Gr59a(v31107), Gr59b(v101219), Gr59c(v3530), Gr59d(v2766), Gr59e(v31110), Gr59f(v18989), Gr61a(v106007), Gr63a(v108203), Gr64a(v103342), Gr64b(v42517), Gr64c(BL36734), Gr64d(v29422), Gr64e(v109176), Gr64f(v105084), Gr66a(v14820), Gr68a(v13380), Gr77a(BL38236), Gr85a(v47992), Gr89a(v8253), Gr92a(v44408), Gr93a(v13569), Gr93b(v12160), Gr93c(v109794), Gr93d(v6813), Gr94a(v9537), Gr97a(v4395), Gr98a(v1300), Gr98b(v1302 및 v101040), Gr98c(BL36735), Gr98d(v4398), IR7a(v108171), IR47a(v11812), IR56a(v5010), IR56b(v4704), IR56d(v6112), IR94e(v33066), IR20a(v8658), IR94a(v7566), IR94c(v6817), IR94h(v1563), IR60b(v12089), IR67c(v37261), IR94f(v109702). V로 시작하는 라인 숫자는 Vienna Drosophila RNAi Center (VDRC)에서 구입한 라인을 나타내고, 각각의 서열은 http://stockcenter.vdrc.at/control/vtlibrary/에서 확인 가능하다.

58개의 이용 가능한 UAS-Gr RNAi 라인의 풀세트 정보를 얻기 위하여 다른 미각 수용체의 전위(potential) 요구를 다루기 위한 RNAi 유전자선별검사를 수행하였다. 또한, GRNs에 발현된 이온성 수용체(Ionotropic Receptors; IRs)를 인코딩한 13개 유전자를 녹다운하였다. 이러한 RNAi 라인이 발현된 다이서(UAS-Dcr2) 및 Gr33a-GAL4 드라이버를 초파리에 교배하였으며, 기피 화합물에 반응하는 미각 뉴런 (gustatory sensory neuron: GRNs)에 발현되었다. 모든 자손(progeny)은 생존 가능하고 건강하게 나타났다.

L-카나바닌 기피를 평가하기 위하여, 양방향 선택 행동 분석을 수행하였다. 1 mM 수크로오스(Sucrose) 및 30 mM L-카나바닌을 혼합한 5 mM 수크로오스(Sucrose) 사이의 선택을 감안할 때, 야생형 초파리(wild-type flies)는 L-카나바닌을 가미한 높은 당분을 강하게 피했다. 예상대로, Gr8a 또는 Gr66a의 녹다운은 L-카나바닌의 기피를 현저하게 감소시켰다(도 1a). 또한, 하나의 다른 수용체(Gr98b)의 RNAi-mediated suppression 역시 L-카나바닌의 기피를 현저하게 감소시키는 것을 발견하였다(도 1a; v101040 라인). 그 외 UAS-Gr 또는 UAS-Ir RNAi 라인의 도입은 L-카나바닌의 기피에 영향을 주지 않았다(도 1a). 제1라인에서 같은 형질형(phenotype)을 생산한 UASGr98b RNAi line(v1302)을 추가로 테스트하였다(도 1b; v101040). 따라서, GR98b는 L-카나바닌을 감지하기 위한 추가 후보 수용체로 중요함을 확인하였다.

실시예 2: L-카나바닌을 감지하지 못하도록 하는 Gr98b 의 돌연변이

L-카나바닌 반발하는 GR98b의 역할을 확인하기 위하여, ends-out 상동 재조합으로 돌연변이를 제조하였다(도 1c). ends-out 상동 재조합으로부터 Gr98b 돌연변이체(Gr98b ¹ )을 생성하였다. 상동 재조합을 위해 DNA construct를 얻기 위하여, 동질 유전자인 w ¹¹¹⁸ 초파리로부터 Genomic DNA 템플릿을 사용하였고, Gr98b locus 타겟으로 하여 5' 및 3'에 위치한 3kb arms을 PCR로 증폭시켰다. 5' arm에 사용된 프라이머는 5'-GGTGGCTTAGGTGCTGCCATTAC-3' (서열번호 4) 및 5'-TTGGGTGAGTTCTGAAAACTAAC-3' (서열번호 5)이다. 3' arm에 사용된 프라이머는 5'-TCTGAAACGCAATCAATTGCTA-3' (서열번호 6) 및 5'-GTAGCCCAATATCACAATTC-3' (서열번호 7)이다. 생식 세포 변환에 의해 생성된 형질전환 초파리의 pw35 벡터로 두개의 arm을 subcloned 하였고(BestGene Inc., Chino Hills, CA), 상술한 상동 재조합을 생성하기 위해 형질전환 유전자가 동원되었다. 다음 프라이머들과 결합한 Genomic PCR을 통해 Gr98b ¹ 의 대립유전자를 확인하였다: 5'-TCTCCTGGCCAGAGCCTTTCCATA-3' (서열번호 8) 및 5'-TGCTGCATTATCATGACGAACTCGG-3' (서열번호 9).

UAS-Gr98b 형질전환 초파리를 생성하기 위하여, Hi-fidelity PCR kit (Roche)을 사용하여 w ¹¹¹⁸ -파생 labellar cDNA library로 부터 Gr98b cDNA를 증폭하였으며, pUAST 벡터로 cDNA를 복제하였다. DNA 염기 서열의 cDNA 복제를 확인하였으며, 형진전환 초파리는 BestGene Inc.(Chino Hills, CA)에 의해 생성되었다. 5 세대를 위한 w ¹¹¹⁸ 초파리에 Gr98b1 및 UASGr98b 초파리를 이종 교배 하였다.

GR98b ¹ 돌연변이는 403 잔류물 중 N-말단 233으로 인코딩한 영역을 삭제하였다. 돌연변이체 초파리는 동형접합이 가능하고 생식력이 있다. GR98b ¹ 초파리는 L-카나바닌을 피하지 못했으며, RNAi 실험과 일치하였다(도 1d). Gr66a(Gr66a-GAL4), Gr8a(Gr8a-GAL4), 또는 Gr98b(Gr98b-GAL4) 촉진제(promoter) 제어하에 발현 야생형 Gr98b 전이유전자(UAS-Gr98b)로 Gr98b ¹ 초파리에서 L-카나바닌 기피를 구제하였다(도 1d). L-카나바닌에 의한 활동 전위는 Gr98b ¹ 초파리에서 파괴되고, 결함은 Gr66a-GAL4를 이용한 발현 야생형 Gr98b 전이유전자(UAS-Gr98b)로 구제된다. L-카나바닌을 감지하는 효과와는 달리, Gr98b ¹ 초파리는 파파베린, 스트리크닌, 데나토늄, 베르베린, 로벨린, 카페인, DEET 및 퀴닌에 강력하게 기피하고 전기 생리학적 반응을 관찰하였다(도 1e 및 2c). 이러한 데이터는 GR98b가 L-카나바닌의 감지에 필요한 것을 나타내고, 좁게 조정하였다.

세포 배양 및 형질주입(Cell culture and transfection)

S2 세포(아주대학교 김은영 교수 Lab)를 25℃ T-25 플라스크(Thermo, Waltham, MA)에서 10% FBS(Invitrogen, Carlsbad, CA), 50 units/ml 페니실린-스트렙토마이신을 보충하여 Schneider's 곤충 배지(Welgene, Gyeongsan-si, Republic of Korea)에서 성장시켰다. 패치 고정(patch clamp) 실험을 수행하기 위해, pActin5c-GAL4, pUAST-EGFP 및 X-tremeGENE HP DNA 형질감염 시약(Roche)을 이용한 Gr 플라스미드(pUAST-Gr8a, pUAST-Gr66a 및 pUAST-Gr98b)의 2 또는 3개로 플레이팅하고 24시간 후에 세포를 형질주입하였다. 이 때, Gr8a, Gr66a 및 Gr98b의 유전자 서열은 각각 Drosophila melanogaster 유래의 서열번호 10, 11 및 12이다. 형질주입 혼합물은 4 μl 형질주입 시약 및 전체 DNA의 1.3 μg으로 구성된다. 12시간 동안 무혈청 배지에서 형질주입 혼합제(cocktail)와 세포를 배양시킨 후, 혈청 배지로 옮기고 미각 수용체 및 EGFP 발현할 수 있도록 24시간 동안 세포 배양을 지속하였다.

S2 세포 내 패치 고정 실험(Patch-Clamp experiments in S2 cells)

커버글라스(coverslips)에 놓인 Gr- 및 EGFP- 배양 S2 세포를 도립 현미경(inverted microscope)(IX71, Olympus)의 스테이지에 위치한 챔버로 옮겼다. 전세포 전류는 -60 mA holding potential에서 Axon 200B 증폭기를 이용하여 측정하였다. bath 용액은 일반적인 링거액(in mM): 140 NaCl, 5 KCl, 5 HEPES, 2 pyruvic acid sodium salt, 1.25 KH₂PO₄, 2 CaCl₂, 2 MgCl₂ 및 10 D-glucose(pH 7.4)을 포함한다. pipette 용액은(in mM): 140 KCl, 5 EGTA-2K, 10 HEPES 및 10 D-glucose(pH 7.2)을 포함한다. fire polishing 후 2-4Ω 저항을 갖는 붕규산 유리(borosilicate glass)에서 전극을 가져왔다. 전세포 배열을 한 후, -60 mA holding potential과 20 mV 단계로 +80 및 -80의 전압램프를 이용하여 전압 펄스를 hyperpolarizing 및 depolarizing에 적용하여, L-카나바닌의 존재하에 전류를 기록하였다. 모든 기록은 상온에서 Axopatch-200B 증폭기(Axon Instruments, Foster City, CA)를 이용하여 수행하였으며, 5 kHz로 필터링하여 Digidata 1440A 컨버터(Axon Instruments, Foster City, CA)로 전류를 수치화하였다. Command potential 및 데이터 수집은 pClamp 10.2 software(Axon instruments)으로 조정되었다. 전세포를 기록한 데이터 분석은 Clampfit 10.2을 이용하여 수행하였다. 전류 밀도는 세포 커패시턴스로 정상화하였다.

실시예 3: 쓴맛을 감지하는 GRNs에 L-카나바닌 반응성 부여

초파리의 주요 맛 기관인 라벨룸(파리의 입 끝부분)은 미각 강모(감각기)로 구성되고, 길이와 위치에 따라 3가지 분류로 나누어진다: Long(L), intermediate(I) 및 short(S). Gr66a는 S-type 및 I-type 감각기의 쓴맛을 감지하는 GRNs에서 널리 발현되는 반면에, Gr8a 발현은 L-카나바닌에 응답하는 Gr66a-발현 GRNs의 서브셋에 제한된다. Gr98b의 발현 패턴을 밝혀내기 위하여, Gr98b-GAL4;UAS-mCD8::GFP flies의 GFP 염색을 실시하였다. I1, S1, S3, S5, S6, S7, S10 및 S11 감각기의 GRNs에서 Gr98b-GAL4 리포터 발현이 감지되었다(도 3a). L-카나바닌을 감지하는 역할과 일치하였으며, L-카나바닌에 반응하는 감각기 전부를 포함하고, GRNs가 들어있는 S-type 감각기는 Gr8a-GAL4를 발현시킨다.

Gr8a, Gr66a 및 Gr98b은 일반적으로 L-카나바닌에 응답하지 않는 GRN에 L-카나바닌 감도를 부여하기에 충분한지 밝혀내기 위하여, L-카나바닌에 둔감한 Gr66a-발현 GRNs에 Gr8a 및 Gr98b을 이소성 발현하였다. Gr66a-발현에 Gr8a의 mis-expression은 L-카나바닌에 둔감한 GRNs에 L-카나바닌 감도를 부여하지 않았다. S2 및 I-type 감각기에 강력한 L-카나바닌 반응이 부여된 Gr33a-GAL4의 제어하에, L-카나바닌에 둔감한 S2 및 I-type 감각기에 Gr8a 및 Gr98b의 도입을 발견하였다(도 3b, 3c). 상기 결과는 Gr8a 및 Gr98b이 기능적 L-카나바닌 수용체의 필수 성분임을 나타낸 것이다.

실시예 4: 단맛을 감지하는 GRNs에 L-카나바닌 반응성 부여

S2 및 I-type 감각기에서 쓴맛을 감지하는 GRNs은 다른 미각 수용체도 발현시키기 때문에, 이는 추가의 기피 미각 수용체가 L-카나바닌 감지에 관련될 수 있다는 것이 가능하였다. 4개의 GRNs을 포함하는 야생형 L-type 감각기 중 하나는 당분에는 응답하고 L-카나바닌에는 응답하지 않았다. Gr8a, Gr66a, 및 Gr98b이 L-카나바닌 감각에 충분한지 더 강력한 증거를 제공하기 위하여, Gr64f-GAL4을 이용하여 L-type 감각기의 당분활성화 GRNs에 상기 3개 미각 수용체를 혼합 발현시켰다(도 4a). 이 조작은 L-카나바닌에 강력하게 응답하는 능력과 단맛을 감지하는 GRNs을 부여하는 것을 발견하였다(도 4b, 4c). 상기 3개 미각 수용체 중 오직 2개의 이소성 발현은 현저한 L-카나바닌 응답성을 부여하기 위해 불충분하였다(도 4c). 그러나, 90개 중 12 레코딩에서, 2개의 미각 수용체(Gr8a 및 Gr66a) 공동발현은 L-카나바닌 감각기에서 작은 L-카나바닌-유발 반응을 일으켰다(도 4c). 낮은 짠맛을 감지하는 Ir76b-GAL4-positive GRNs에서 Gr8a, Gr66a 및 Gr98b을 이소성으로 발현하였고, 이러한 GRNs에 현저한 L-카나바닌 응답성을 부여하는 것을 발견하였다(도 4d). Gr8a, Gr66a 및 Gr98b의 이소성 발현은 여러 쓴 화합물 테스트에서 응답성을 유발하지 않았다(도 4e).

이미징(Imaging)

rabbit anti-GFP(1:1000. 분자 프로브) primary antibodies 및 goat anti-rabbit Alexa488(1:400, 분자 프로브) secondary antibodies를 사용하여 전체의 mount 초파리 labella의 면역염색을 수행하였다. labella는 머리에서 해부하여, PBS-T(1x PBS for 20 min and 0.2% TritonX-100)에 희석한 4% 파라포름알데히드를 사용하여 20분 동안 고정하고, PBS-T로 3회 세척하였다. 상기 labella는 면도날로 이등분하여, blocking 용액(5% heat-inactivated goat serum in PBS-T)에서 30분 동안 배양하고, blocking 용액에 희석된 primary antibodies와 4℃에서 하룻밤 동안 배양하였다. 상기 조직은 PBS-T로 3회 세척되었으며, blocking 용액에 희석된 secondary antibodies와 상온에서 1시간 동안 배양하였다. PBS-T로 3회 세척한 다음, 상기 샘플은 Vectashield(Vector Laboratories, Burlingame, CA)로 고정시키고 Zeiss LSM700 공초점 현미경(Jena, Germany)으로 관찰하였다.

양방향 선택 행동 분석(Two-way choice behavioral assay)

binary food 선택 분석에서 각 분석을 위해 18시간 동안 굶주린 ~50 마리의 초파리(3~6일된)와 72-well microtiter dish에 상기 초파리를 배치하였다. 각 교대웰은 2종류의 테스트 혼합물 중 하나와 1% 아가로오스(agarose)의 결합으로 가득 채워졌다. 쓴 화학 물질에 대한 기피는 1 mM 수크로오스와 5 mM 수크로오스 + 기피 화합물의 표시 농도에 대한 선호도를 비교하여 분석하였다. L-카나바닌에 당분 GRNs의 활성화 효과를 측정하기 위하여, 1 mM 수크로오스(Sucrose) 대 1 mM 수크로오스(Sucrose) + 30 mM L-카나바닌에 대한 선호도를 시험하였다.

음식 섭취를 모니터링하기 위해, 하나의 테스트 혼합물에는 청색 염료(Brilliant Blue FCF, 0.125 mg/ml)를 첨가하고, 또 다른 테스트 혼합물에는 적색 염료(sulforhodamine B, 0.2 mg/ml)를 첨가하였다. 초파리가 어두운 상온에서 90분 동안 섭취할 수 있도록 한 다음, 초파리를 -20℃에서 동결시켰다. 청색(N_B), 적색(N_R) 또는 보라색(N_MIX) 초파리의 숫자는 실체 현미경(dissection microscope)으로 계산되었고, 선호도 지수(preference index; P.I.) 값은 다음 식에 따라 계산되었다: (N_B-N_R)/(N_R+N_B+N_MIX) 또는 (N_R-N_B)/(N_R+N_B+N_MIX). 1.0 및 -1.0의 P.I.는 하나 또는 또 다른 음식에 대한 완벽한 선호를 나타낸다. P.I.가 0인 것은 선호하는 음식이 없음을 나타낸다.

팁 레코딩 (Tip recordings)

팁 레코딩을 위해, 부화(eclosion)한 다음 하룻동안 신선한 음식에서 초파리를 유지하였다. 복부 및 복부에서 머리로 연장하여 링거액을 채운 유리 모세관 기준 전극을 삽입하여 동물(초파리)을 고정하였다. 1 mM 염화칼륨(KCl) 또는 30 mM 트리콜린 구연산염(tricholine citrate)에 용해된 미각 자극 물질(tastants)를 포함하는 레코딩 전극(10-20 μm tip diameter)로 labella sensilla를 자극하였다. 레코딩 전극은 증폭기(TastePROBE, Syntech, Hilversum, The Netherlands)에 연결되고, 맛 응답(taste responses)은 수집되고 100-3000 Hz 대역 필터와 결합하여 신호 interface(Syntech)를 이용하여 증폭되었다. 입력은 오디오 모니터링을 용이하게 하기 위해 스피커에 열결되었다. 12-kHz 샘플링레이트에서 활성 전위가 기록되었으며, 진폭(amplitude) 기반 스파이크(spikes)를 분류하였으며, Autospike 3.1 Software package(Syntech)를 이용하여 정량화를 수행하였다.

실시예 5: L-카나바닌에 대한 행동적 유인 유도

Gr8a, Gr66a 및 Gr98b의 발현은 단맛을 감지하는 GRNs에 L-카나바닌 감도를 부여하기 충분했기 때문에, 상기 미각 수용체의 이소성 발현이 L-카나바닌에 유인을 유발하는지 테스트 하였다. 대조군 초파리(w ¹¹¹⁸ )는 30 mM L-카나바닌을 혼합한 1 mM 수크로오스보다 1 mM 수크로오스를 강하게 선호하였다(도 5). 대조적으로 Gr66a ^ex83 돌연변이체는 1 mM 수크로오스에 대한 선호도를 갖지 않았다. 단맛을 감지하는 GRNs인 2개의 미각 수용체(Gr8a/Gr66a, Gr8a/Gr98b 또는 Gr66a/Gr98b)를 발현시킨 Gr66a ^ex83 초파리는 L-카나바닌이 첨가된 수크로오스쪽에 비해 수크로오스 단독인 곳에 더 무관심 하였다(도 5). 하지만, 3개의 미각 수용체(Gr8a/Gr66a/Gr98b)의 도입은 L-카나바닌이 포함된 음식에 상당한 유인을 유발하였다(도 5).

실시예 6: S2 세포에서 GR8a/GR66a/GR98b-의존 L-카나바닌 전류

Gr8a, Gr66a 및 Gr98b이 L-카나바닌-활성 양이온 채널을 형성할 수 있는지 테스트하기 위하여, 초파리 S2 세포에서 상기 3 미각 수용체를 공동발현하고 전세포(whole-cell) 전압고정(voltage-clamp) 레코딩을 수행하였다. -60 mV holding potential에서 세포를 고정하였으며 -80 에서 +80 mV까지 전압 램프를 인가하였다. 생리학적 bath 용액을 사용하여, 30 mM L-카나바닌의 첨가가 -0.88±1.89 mV reversal potential을 가진 약간 바깥쪽으로 정류 전류를 생산하는 것을 발견하였다(도 6a, 6b). 하지만, 2 미각 수용체의 모든 조합(Gr8a/Gr66a, Gr8a/Gr98b 또는 Gr66a/Gr98b)을 발현시킬 때에는 전류가 생산되지 않았다(도 6c 내지 6f). L-카나바닌을 유도 전류는 광범위한 스펙트럼 양이온 억제제인 La³⁺에 의해 완벽하게 억제되었다(도 6g, 6h). 인비보 데이터와 일치하여, GR8a, GR66a 및 GR98b 발현 S2 세포에서 전도도를 유도하는 테스트에서 다른 기피 화합물은 없었다.

본 발명이 속한 분야에서 통상의 지식을 가진 자라면 상기 내용을 바탕으로 본 발명의 범주내에서 다양한 응용 및 변형을 행하는 것이 가능할 것이다.

<110> Kookmin University Industry Academy Cooperation Foundation Industry-Academic Cooperation Foundation, Yonsei University University of California at Santa Barbara <120> Method of Screening Insecticides or Repellents by using a Gustatory Receptor <130> 302 <160> 12 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 516 <212> PRT <213> Drosophila melanogaster <400> 1 Met Ser Gly His Leu Gly Arg Val Leu Gln Phe His Leu Arg Leu Tyr 1 5 10 15 Gln Val Leu Gly Phe His Gly Leu Pro Leu Pro Gly Asp Gly Asn Pro 20 25 30 Ala Arg Thr Arg Arg Arg Leu Met Ala Trp Ser Leu Phe Leu Leu Ile 35 40 45 Ser Leu Ser Ala Leu Val Leu Ala Cys Leu Phe Ser Gly Glu Glu Phe 50 55 60 Leu Tyr Arg Gly Asp Met Phe Gly Cys Ala Asn Asp Ala Leu Lys Tyr 65 70 75 80 Val Phe Ala Glu Leu Gly Val Leu Ala Ile Tyr Leu Glu Thr Leu Ser 85 90 95 Ser Gln Arg His Leu Ala Asn Phe Trp Trp Leu His Phe Lys Leu Gly 100 105 110 Gly Gln Lys Thr Gly Leu Val Ser Leu Arg Ser Glu Phe Gln Gln Phe 115 120 125 Cys Arg Tyr Leu Ile Phe Leu Tyr Ala Met Met Ala Ala Glu Val Ala 130 135 140 Ile His Leu Gly Leu Trp Gln Phe Gln Ala Leu Thr Gln His Met Leu 145 150 155 160 Leu Phe Trp Ser Thr Tyr Glu Pro Leu Val Trp Leu Thr Tyr Leu Arg 165 170 175 Asn Leu Gln Phe Val Leu His Leu Glu Leu Leu Arg Glu Gln Leu Thr 180 185 190 Gly Leu Glu Arg Glu Met Gly Leu Leu Ala Glu Tyr Ser Arg Phe Ala 195 200 205 Ser Glu Thr Gly Arg Ser Phe Pro Gly Phe Glu Ser Phe Leu Arg Arg 210 215 220 Arg Leu Val Gln Lys Gln Arg Ile Tyr Ser His Val Tyr Asp Met Leu 225 230 235 240 Lys Cys Phe Gln Gly Ala Phe Asn Phe Ser Ile Leu Ala Val Leu Leu 245 250 255 Thr Ile Asn Ile Arg Ile Ala Val Asp Cys Tyr Phe Met Tyr Tyr Ser 260 265 270 Ile Tyr Asn Asn Val Ile Asn Asn Asp Tyr Tyr Leu Ile Val Pro Ala 275 280 285 Leu Leu Glu Ile Pro Ala Phe Ile Tyr Ala Ser Gln Ser Cys Met Val 290 295 300 Val Val Pro Arg Ile Ala His Gln Leu His Asn Ile Val Thr Asp Ser 305 310 315 320 Gly Cys Cys Ser Cys Pro Asp Leu Ser Leu Gln Ile Gln Asn Phe Ser 325 330 335 Leu Gln Leu Leu His Gln Pro Ile Arg Ile Asp Cys Leu Gly Leu Thr 340 345 350 Ile Leu Asp Cys Ser Leu Leu Thr Arg Met Ala Cys Ser Val Gly Thr 355 360 365 Tyr Met Ile Tyr Ser Ile Gln Phe Ile Pro Lys Phe Ser Asn Thr Tyr 370 375 380 Met Cys Gly Ala Thr Ala Cys Gly Ala Ala Thr Cys Gly Ala Thr Thr 385 390 395 400 Gly Cys Cys Thr Cys Gly Gly Cys Cys Thr Gly Ala Cys Cys Ala Thr 405 410 415 Cys Cys Thr Gly Gly Ala Thr Thr Gly Cys Ala Gly Thr Cys Thr Thr 420 425 430 Cys Thr Ala Ala Cys Thr Cys Gly Gly Ala Thr Gly Gly Cys Cys Thr 435 440 445 Gly Thr Thr Cys Cys Gly Thr Gly Gly Gly Cys Ala Cys Cys Thr Ala 450 455 460 Cys Ala Thr Gly Ala Thr Cys Thr Ala Thr Ala Gly Cys Ala Thr Cys 465 470 475 480 Cys Ala Gly Thr Thr Thr Ala Thr Ala Cys Cys Ala Ala Ala Gly Thr 485 490 495 Thr Cys Ala Gly Cys Ala Ala Thr Ala Cys Cys Thr Ala Thr Ala Thr 500 505 510 Gly Thr Ala Gly 515 <210> 2 <211> 527 <212> PRT <213> Drosophila melanogaster <400> 2 Met Ala Gln Ala Glu Asp Ala Val Gln Pro Leu Leu Gln Gln Phe Gln 1 5 10 15 Gln Leu Phe Phe Ile Ser Lys Ile Ala Gly Ile Leu Pro Gln Asp Leu 20 25 30 Glu Lys Phe Arg Ser Arg Asn Leu Leu Glu Lys Ser Arg Asn Gly Met 35 40 45 Ile Tyr Met Leu Ser Thr Leu Ile Leu Tyr Val Val Leu Tyr Asn Ile 50 55 60 Leu Ile Tyr Ser Phe Gly Glu Glu Asp Arg Ser Leu Lys Ala Ser Gln 65 70 75 80 Ser Thr Leu Thr Phe Val Ile Gly Leu Phe Leu Thr Tyr Ile Gly Leu 85 90 95 Ile Met Met Val Ser Asp Gln Leu Thr Ala Leu Arg Asn Gln Gly Arg 100 105 110 Ile Gly Glu Leu Tyr Glu Arg Ile Arg Leu Val Asp Glu Arg Leu Tyr 115 120 125 Lys Glu Gly Cys Val Met Asp Asn Ser Thr Ile Gly Arg Arg Ile Arg 130 135 140 Ile Met Leu Ile Met Thr Val Ile Phe Glu Leu Ser Ile Leu Val Ser 145 150 155 160 Thr Tyr Val Lys Leu Val Asp Tyr Ser Gln Trp Met Ser Leu Leu Trp 165 170 175 Ile Val Ser Ala Ile Pro Thr Phe Ile Asn Thr Leu Asp Lys Ile Trp 180 185 190 Phe Ala Val Ser Leu Tyr Ala Leu Lys Glu Arg Phe Glu Ala Ile Asn 195 200 205 Ala Thr Leu Glu Glu Leu Val Asp Thr His Glu Lys His Lys Leu Trp 210 215 220 Leu Arg Gly Asn Gln Glu Val Pro Pro Pro Leu Asp Ser Ser Gln Pro 225 230 235 240 Pro Gln Tyr Asp Ser Asn Leu Glu Tyr Leu Tyr Lys Glu Leu Gly Gly 245 250 255 Met Asp Ile Gly Ser Ile Gly Lys Ser Ser Val Ser Gly Ser Gly Lys 260 265 270 Asn Lys Val Ala Pro Val Ala His Ser Met Asn Ser Phe Gly Glu Ala 275 280 285 Ile Asp Ala Ala Ser Arg Lys Pro Pro Pro Pro Pro Leu Ala Thr Asn 290 295 300 Met Val His Glu Ser Glu Leu Gly Asn Ala Ala Lys Val Glu Glu Lys 305 310 315 320 Leu Asn Asn Leu Cys Gln Val His Asp Glu Ile Cys Glu Ile Gly Lys 325 330 335 Ala Leu Asn Glu Leu Trp Ser Tyr Pro Ile Leu Ser Leu Met Ala Tyr 340 345 350 Gly Phe Leu Ile Phe Thr Ala Gln Leu Tyr Phe Leu Tyr Cys Ala Thr 355 360 365 Gln Tyr Gln Ser Ile Pro Ser Leu Phe Arg Ser Ala Lys Asn Pro Phe 370 375 380 Ile Thr Val Ile Val Leu Ser Tyr Thr Ser Gly Lys Cys Val Tyr Leu 385 390 395 400 Ile Tyr Leu Ser Trp Lys Thr Ser Gln Ala Ser Lys Arg Thr Gly Ile 405 410 415 Ser Leu His Lys Cys Gly Val Val Ala Asp Asp Asn Leu Leu Tyr Glu 420 425 430 Ile Val Asn His Leu Ser Leu Lys Leu Leu Asn His Ser Val Asp Phe 435 440 445 Ser Ala Cys Gly Phe Phe Thr Leu Asp Met Glu Thr Leu Tyr Gly Val 450 455 460 Ser Gly Gly Ile Thr Ser Tyr Leu Ile Ile Leu Ile Gln Phe Asn Leu 465 470 475 480 Ala Ala Gln Gln Ala Lys Glu Ala Ile Gln Thr Phe Asn Ser Leu Asn 485 490 495 Asp Thr Ala Gly Leu Val Gly Ala Ala Thr Asp Met Asp Asn Ile Ser 500 505 510 Ser Thr Leu Arg Asp Phe Val Thr Thr Thr Met Thr Pro Ala Val 515 520 525 <210> 3 <211> 403 <212> PRT <213> Drosophila melanogaster <400> 3 Met Val Ala Gln Lys Ser Arg Leu Leu Ala Arg Ala Phe Pro Tyr Leu 1 5 10 15 Asp Ile Phe Ser Val Phe Ala Leu Thr Pro Pro Pro Gln Ser Phe Gly 20 25 30 His Thr Pro His Arg Arg Leu Arg Trp Tyr Leu Met Thr Gly Tyr Val 35 40 45 Phe Tyr Ala Thr Ala Ile Leu Ala Thr Val Phe Ile Val Ser Tyr Phe 50 55 60 Asn Ile Ile Ala Ile Asp Glu Glu Val Leu Glu Tyr Asn Val Ser Asp 65 70 75 80 Phe Thr Arg Val Met Gly Asn Ile Gln Lys Ser Leu Tyr Ser Ile Met 85 90 95 Ala Ile Ala Asn His Leu Asn Met Leu Ile Asn Tyr Arg Arg Leu Gly 100 105 110 Gly Ile Tyr Lys Asp Ile Ala Asp Leu Glu Met Asp Met Asp Glu Ala 115 120 125 Ser Gln Cys Phe Gly Gly Gln Arg Gln Arg Phe Ser Phe Arg Phe Arg 130 135 140 Met Ala Leu Cys Val Gly Val Trp Met Ile Leu Met Val Gly Ser Met 145 150 155 160 Pro Arg Leu Thr Met Thr Ala Met Gly Pro Phe Val Ser Thr Leu Leu 165 170 175 Lys Ile Leu Thr Glu Phe Val Met Ile Met Gln Gln Leu Lys Ser Leu 180 185 190 Glu Tyr Cys Val Phe Val Leu Ile Ile Tyr Glu Leu Val Leu Arg Leu 195 200 205 Arg Arg Thr Leu Ser Gln Leu Gln Glu Glu Phe Gln Asp Cys Glu Gln 210 215 220 Gln Asp Met Leu Gln Ala Leu Cys Val Ala Leu Lys Arg Asn Gln Leu 225 230 235 240 Leu Leu Gly Arg Ile Trp Arg Leu Glu Gly Asp Val Gly Ser Tyr Phe 245 250 255 Thr Pro Thr Met Leu Leu Leu Phe Leu Tyr Asn Gly Leu Thr Ile Leu 260 265 270 His Met Val Asn Trp Ala Tyr Ile Asn Lys Phe Leu Tyr Asp Ser Cys 275 280 285 Cys Gln Tyr Glu Arg Phe Leu Val Cys Ser Thr Leu Leu Val Asn Leu 290 295 300 Leu Leu Pro Cys Leu Leu Ser Gln Arg Cys Ile Asn Ala Tyr Asn Cys 305 310 315 320 Phe Pro Arg Ile Leu His Lys Ile Arg Cys Thr Ser Ala Asp Pro Asn 325 330 335 Phe Ala Met Leu Thr Arg Gly Leu Arg Glu Tyr Ser Leu Gln Met Glu 340 345 350 His Leu Lys Leu Arg Phe Thr Cys Gly Gly Leu Phe Asp Ile Asn Leu 355 360 365 Lys Tyr Phe Gly Gly Leu Leu Val Thr Ile Phe Gly Tyr Ile Ile Ile 370 375 380 Leu Ile Gln Phe Lys Val Gln Ala Ile Ala Ala Asn Arg Tyr Lys Lys 385 390 395 400 Val Val Asn <210> 4 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 4 ggtggcttag gtgctgccat tac 23 <210> 5 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 5 ttgggtgagt tctgaaaact aac 23 <210> 6 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 6 tctgaaacgc aatcaattgc ta 22 <210> 7 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 7 gtagcccaat atcacaattc 20 <210> 8 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 8 tctcctggcc agagcctttc cata 24 <210> 9 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 9 tgctgcatta tcatgacgaa ctcgg 25 <210> 10 <211> 1027 <212> DNA <213> Drosophila melanogaster <400> 10 atgagcggcc atctgggtcg ggtcctgcag ttccacctgc ggctctacca ggtgctcggc 60 ttccatgggc tgccgttgcc gggcgatggg aatccggcca ggaccaggag gcgtctgatg 120 gcatggagcc tgttcctgct catttcgctg agtgccctcg tactcgcgtg cctctttagc 180 ggcgaggagt tcctctatcg cggcgacatg ttcggctgtg ccaatgatgc ccttaaatac 240 gtattcgccg aattgggcgt gctggccata tatctggaga cgctgagcag ccagcggcat 300 ttggccaact tctggtggct gcacttcaag ttgggcggcc aaaaaacggg cttggtgagc 360 ctgcgcagtg agttccagca gttttgtcgc tatctgatat tcctgtacgc catgatggcc 420 gccgaagtgg cgatccattt gggattgtgg cagttccaag cgctcaccca acatatgttg 480 ctcttttgga gcacctatga gccgctcgtg tggctgacgt atctgcgcaa tctgcagttc 540 gtactgcact tggagctgct cagggagcag ctgaccggct tggaacgcga aatgggtctg 600 ctggcggagt actcgcgatt tgctagcgaa acgggtcgga gttttcctgg attcgaaagt 660 ttcctgcgcc gacgactagt gcagaagcag cgcatctata gccatgtgta tgacatgctc 720 aaatgtttcc agggtgcctt caacttctcc attctcgccg tcctgctgac catcaacata 780 cgcatcgccg tggactgcta cttcatgtac tacagcatct acaacaatgt gattaacaac 840 gattactacc taatcgttcc cgccttgctc gagattcccg ccttcatata cgcttcgcag 900 agctgcatgg tcgtggtgcc caggatcgcc caccagctgc ataatatagt caccgattcc 960 ggttgctgca gctgtcccga tctctccctg cagattcaga acttttcact gcaactcctg 1020 catcagc 1027 <210> 11 <211> 1584 <212> DNA <213> Drosophila melanogaster <400> 11 atggcgcagg cggaggacgc agtgcaacca ctattgcagc agttccagca actgttcttc 60 atatccaaga tagctggaat tctgccacag gatctcgaga agtttcgatc taggaatctg 120 ctggagaaat cccgtaatgg catgatttac atgctgagta ctttaatact ctacgttgtg 180 ctctataata ttttgatata ttcctttgga gaggaggacc gcagcctaaa ggcctcgcag 240 agcaccttga ctttcgtgat tggcttgttc ctgacctata tcggtctgat tatgatggtc 300 tccgaccagt tgaccgcgtt acgaaaccag ggtagaattg gagagcttta cgagcgcatc 360 cgtctggtgg atgagcgcct ttacaaagag gggtgtgtta tggacaacag tacaattgga 420 cggcgcatac gaattatgct gatcatgacg gtcatctttg agttgtccat tttggtgagc 480 acctatgtca agctggtgga ctatagtcaa tggatgtcct tgttatggat agtgtccgcc 540 attcccacgt tcatcaacac gctagacaag atctggttcg ctgtttcgtt atatgcgttg 600 aaagaacgct tcgaggccat aaacgccacc ctagaggaac tggtggacac gcacgagaag 660 cataagctgt ggctgcgagg caatcaagag gttccgcctc ctctggacag ctcccagccg 720 cctcagtatg acagcaacct ggagtatctg tacaaggaac taggaggtat ggacataggt 780 tccattggca agagttcagt gtctggttcg gggaaaaaca aagtagcacc agtggcccac 840 tccatgaact cctttggtga agcaattgat gcggccagca ggaagcctcc accgcctccc 900 ctggccacta acatggtcca tgaaagcgag ctgggaaatg ccgctaaggt agaggagaaa 960 ctaaacaacc tgtgccaggt gcacgacgag atctgtgaaa tcggaaaagc tttgaacgag 1020 ctgtggagct atcccattct atctctaatg gcctatggtt ttctgatttt cactgctcaa 1080 ctttatttcc tctactgcgc tacacagtac caatcgatac catcgctttt ccgttccgcc 1140 aagaatccct tcatcactgt tatagttcta agttatacgt ctggaaaatg cgtgtacctc 1200 atctacctga gttggaaaac gtcgcaggcc tccaagcgca caggaatcag tctgcacaaa 1260 tgtggcgtgg tggccgatga taatcttctc tacgaaattg ttaaccacct atcgctaaaa 1320 ttgctcaacc actcggtgga cttttcggct tgcggcttct ttaccctgga catggaaaca 1380 ttgtatggtg tgagtggcgg gatcactagc tacctgatca tcctgattca gttcaatttg 1440 gccgcccagc aggccaaaga ggctatacag acgttcaact cgcttaatga caccgccggc 1500 ttggttggtg ccgccaccga tatggataat attagctcca cgctgcgtga tttcgtcacc 1560 acgaccatga caccggcggt ctaa 1584 <210> 12 <211> 1212 <212> DNA <213> Drosophila melanogaster <400> 12 atggtggccc agaagagccg tctcctggcc agagcctttc catatctcga catcttttcc 60 gtgtttgctc tcacaccacc gccccaaagt tttggccaca ctccacatag acgtcttaga 120 tggtacttga tgactggcta tgtgttctat gccaccgcga tccttgcgac ggtcttcatt 180 gtgtcctact ttaacattat agccattgac gaagaggtct tggagtacaa tgtgtctgat 240 tttaccagag tgatgggtaa tattcaaaag agcctgtatt cgattatggc catcgccaac 300 catctcaata tgctcatcaa ttatcgccgg cttggcggaa tctacaagga cattgccgat 360 ttggagatgg acatggacga ggcatcgcag tgctttggtg gccaaagaca acgctttagt 420 ttccgctttc gcatggccct ctgtgtgggc gtgtggatga ttctgatggt gggttcaatg 480 ccccgattaa ccatgacggc catgggtcct tttgtcagca cgctattgaa gatcttaacc 540 gagttcgtca tgataatgca gcagctgaag agtctggagt attgcgtctt tgtactcatc 600 atttatgagt tggtcctgcg gttgcgccgc acacttagtc agctgcagga ggagttccag 660 gactgcgagc agcaggacat gcttcaagct ctatgtgtgg ctctgaaacg caatcaattg 720 ctattgggac ggatttggag gctggagggc gatgtgggca gctacttcac cccgacaatg 780 ttgctgctgt tcctctacaa tggtctgacc atccttcaca tggtcaactg ggcgtacatc 840 aacaagttcc tctacgattc gtgttgtcag tatgaacggt tcttagtttg ctccacgctg 900 cttgtaaacc ttctattgcc ttgccttcta agtcagcgtt gcataaatgc gtacaactgc 960 tttccacgaa tcctgcataa gattcgctgc acatccgcgg atcccaattt tgccatgttg 1020 accagaggat tgcgggagta ctccctgcaa atggaacacc tgaagttgcg tttcacatgc 1080 ggcgggttat ttgacatcaa tttgaaatac tttggcgggt tgcttgtcac catttttgga 1140 tatatcataa tcctcataca attcaaagtg caggcgattg ctgcgaatag atacaaaaaa 1200 gtggttaatt aa 1212

Claims

다음 단계를 포함하는 해충방제제의 스크리닝 방법:
(a) 초파리 유래의 미각 수용체 (Gustatory Receptor)에 후보물질을 처리하는 단계; 및
(b) 미처리 대조군과 비교하여, 초파리 유래의 미각 수용체의 활성을 증가시키거나 억제시키는 물질을 해충방제제로 선별하는 단계.
다음 단계를 포함하는 살충제의 스크리닝 방법:
(a) 초파리 유래의 미각 수용체 (Gustatory Receptor)에 후보물질을 처리하는 단계; 및
(b) 미처리 대조군과 비교하여, 초파리 유래의 미각 수용체의 활성을 억제시키는 물질을 살충제로 선별하는 단계.
다음 단계를 포함하는 기피제의 스크리닝 방법:
(a) 초파리 유래의 미각 수용체 (Gustatory Receptor)에 후보물질을 처리하는 단계; 및
(b) 미처리 대조군과 비교하여, 초파리 유래의 미각 수용체의 활성을 증가시키는 물질을 기피제로 선별하는 단계.
제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 초파리 유래의 미각 수용체는 Gr8a, Gr66a 및 Gr98b로 구성된 군에서 선택된 둘 이상의 서브유닛을 포함하는 이종다합체인 것을 특징으로 하는 방법.
제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 Gr8a 서브유닛은 서열번호 1의 아미노산 서열 또는 서열번호 10의 뉴클레오티드 서열을 가지는 것을 특징으로 하는 방법.
제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 Gr66a 서브유닛은 서열번호 2의 아미노산 서열 또는 서열번호 11의 뉴클레오티드 서열을 가지는 것을 특징으로 하는 방법.
제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 Gr98b의 서브유닛은 서열번호 3의 아미노산 서열 또는 서열번호 12의 뉴클레오티드 서열을 가지는 것을 특징으로 하는 방법.
제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 초파리 유래의 미각 수용체는 신경세포에서 발현되는 것을 특징으로 하는 방법.
제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 미각 수용체의 활성은 후보물질을 리간드로 인식한 미각 수용체 내에 채널이 형성되어 발생하는 전류 변화를 통해 측정하는 것을 특징으로 하는 방법.
초파리 유래의 미각 수용체를 포함하는, 상기 미각 수용체에 결합하는 리간드를 해충방제제로 스크리닝하기 위한 조성물.