JP2002519699A - カルシウム結合レセプタに対するアゴニスト及び／またはアンタゴニストの高処理能率スクリーニング特性表示及び／または用量決定方法 - Google Patents
カルシウム結合レセプタに対するアゴニスト及び／またはアンタゴニストの高処理能率スクリーニング特性表示及び／または用量決定方法Info
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Abstract
(57)【要約】
【解決手段】 この発明は、カルシウム結合レセプタまたはカルシウム結合チャンネルまたはその他のカルシウム結合蛋白質に対するアゴニスト及び／またはアンタゴニストまたはモジュレーターの特性表示及び／または用量決定方法であって、アゴニスト及び／またはアンタゴニストを固形支持体上に載置し；アポエクオリンまたはその他の関連蛋白質及びカルシウム結合レセプタを発現する１つまたは２つ以上の細胞をシーレンテラジンまたはその他の感カルシウム蛋白質と一緒にインキュベートすることにより、細胞によって活性エクオリンを再構成し；固形支持体に細胞の１つまたは２つ以上を加え；細胞による発光の測定値を得るステップから成ることを特徴とする特性表示及び／または用量決定方法。この発明はまた、この特性表示及び／または用量決定方法を実施するための特性表示及び／または用量決定装置にも係る。
Description
【０００１】 この発明は、カルシウム結合レセプタに対するアゴニスト及び／またはアンタ
ゴニストの高処理能率スクリーニング特性表示及び／または用量決定方法及び装
置と、前記方法及び装置によって同定される前記カルシウム結合レセプタのアゴ
ニスト及び／またはアンタゴニストに係る。
ゴニストの高処理能率スクリーニング特性表示及び／または用量決定方法及び装
置と、前記方法及び装置によって同定される前記カルシウム結合レセプタのアゴ
ニスト及び／またはアンタゴニストに係る。
【０００２】
Ｇ−蛋白質結合レセプタ（ＧＰＣＲ, Ｇ−Ｐｒｏｔｅｉｎ−Ｃｏｕｐｌｅｄ
Ｒｅｃｅｐｔｏｒ）の多くは、アゴニストが結合すると、細胞内カルシウム濃度
が一時的に上昇する。この変化は内部２次メッセンジャーとして作用し、多様な
生理機構の重要なモジュレーターとして作用する（Ｒｉｎｋ（１９９０）, Ｔｓ
ｕｎｏｄａ（１９９３）及び Ｓａｎｔｅｌｌａ ＆ Ｃａｒａｆｏｌｉ（１９９
７））。ＧＰＣＲ発現細胞における細胞内カルシウム濃度の測定を利用すること
で、このＧＰＣＲのリガンドであることが判明または推定されている種々の化合
物によるＧＰＣＲの活性化効果をモニターすることができる。
Ｒｅｃｅｐｔｏｒ）の多くは、アゴニストが結合すると、細胞内カルシウム濃度
が一時的に上昇する。この変化は内部２次メッセンジャーとして作用し、多様な
生理機構の重要なモジュレーターとして作用する（Ｒｉｎｋ（１９９０）, Ｔｓ
ｕｎｏｄａ（１９９３）及び Ｓａｎｔｅｌｌａ ＆ Ｃａｒａｆｏｌｉ（１９９
７））。ＧＰＣＲ発現細胞における細胞内カルシウム濃度の測定を利用すること
で、このＧＰＣＲのリガンドであることが判明または推定されている種々の化合
物によるＧＰＣＲの活性化効果をモニターすることができる。
【０００３】 その他のレセプタ、例えば、イオンチャンネルを活性化させることによっても
、細胞内カルシウム濃度の上昇を誘発することができる。
、細胞内カルシウム濃度の上昇を誘発することができる。
【０００４】 カルシウム濃度の変化は、（例えば、フラ−２、フルオ−３、フルオ−４、イ
ンド−１のような）蛍光染料を利用するなど、幾つかの手段及び方法で検出する
ことができる。
ンド−１のような）蛍光染料を利用するなど、幾つかの手段及び方法で検出する
ことができる。
【０００５】 但し、感Ｃａ＋＋染料には制約がある。即ち、励起ビームで染料を活性化する
には、複雑且つ高価な器具が必要であり、微量滴定プレートのようなプラスチッ
ク製試験用具の使用が制限される。
には、複雑且つ高価な器具が必要であり、微量滴定プレートのようなプラスチッ
ク製試験用具の使用が制限される。
【０００６】 細胞内カルシウム濃度を測定する他の方法として、Sheu等が報告（１９９３年
）しているような、ＧＰＣＲ及びアポエクオリンを過剰発現する細胞系を利用す
る方法がある。この方法では、アポエクオリン発現細胞を、エクオリンの補因子
であるシーレンテラジン（ｃｏｅｌｅｎｔｅｒａｚｉｎｅ）と一緒にインキュベ
ートする。このインキュベーションの過程で、シーレンテラジンが細胞内に進入
し、アポエクオリンと複合することによって、この酵素の活性形態であるエクオ
リンを形成する。細胞をＧＰＣＲのアゴニストと一緒にインキュベートすると、
細胞内カルシウム濃度が上昇する。この上昇によって、エクオリンの触媒作用が
活性化され、その結果、シーレンテラジンが酸化され、アポエクオリン、シーレ
ンテラミド、ＣＯ２が生成し、これに発光が伴う。フォトンが放出された後、再
び発光するためには、複合体が分離し、アポエクオリンが新しいシーレンテラジ
ン分子と再度結合しなければならない。つまり、この方法では、アゴニスト添加
に続く発光が、ＧＰＣＲを活性化して細胞内カルシウム濃度を上昇させるアゴニ
ストの能力を反映する。発光時間はＧＰＣＲ活性化後の２０〜３０秒に過ぎない
から、細胞にアゴニストを添加した後、数秒間で発光を記録しなければならない
。発光をフラッシュ・タイプの信号として捕らえねばならない理由は、（１）Ｇ
ＰＣＲによってトリガーされる細胞内カルシウム濃度上昇が一時的でしかなく、
（２）既に述べたように、シーレンテラジンが酸化された後、再び発光するには
、アポエクオリンがシーレンテラジンと再度結合しなければならないことにある
。
）しているような、ＧＰＣＲ及びアポエクオリンを過剰発現する細胞系を利用す
る方法がある。この方法では、アポエクオリン発現細胞を、エクオリンの補因子
であるシーレンテラジン（ｃｏｅｌｅｎｔｅｒａｚｉｎｅ）と一緒にインキュベ
ートする。このインキュベーションの過程で、シーレンテラジンが細胞内に進入
し、アポエクオリンと複合することによって、この酵素の活性形態であるエクオ
リンを形成する。細胞をＧＰＣＲのアゴニストと一緒にインキュベートすると、
細胞内カルシウム濃度が上昇する。この上昇によって、エクオリンの触媒作用が
活性化され、その結果、シーレンテラジンが酸化され、アポエクオリン、シーレ
ンテラミド、ＣＯ２が生成し、これに発光が伴う。フォトンが放出された後、再
び発光するためには、複合体が分離し、アポエクオリンが新しいシーレンテラジ
ン分子と再度結合しなければならない。つまり、この方法では、アゴニスト添加
に続く発光が、ＧＰＣＲを活性化して細胞内カルシウム濃度を上昇させるアゴニ
ストの能力を反映する。発光時間はＧＰＣＲ活性化後の２０〜３０秒に過ぎない
から、細胞にアゴニストを添加した後、数秒間で発光を記録しなければならない
。発光をフラッシュ・タイプの信号として捕らえねばならない理由は、（１）Ｇ
ＰＣＲによってトリガーされる細胞内カルシウム濃度上昇が一時的でしかなく、
（２）既に述べたように、シーレンテラジンが酸化された後、再び発光するには
、アポエクオリンがシーレンテラジンと再度結合しなければならないことにある
。
【０００７】 特許出願ＥＰ−０３４１４７７号は、エクオリンの生合成を特定する遺伝子ｐ
ＡＱ４４０を哺乳類細胞系の発現ヴェクトル・プラスミドにクローニングし、得
られたプラスミドを自己増殖させ、哺乳類細胞中に発光蛋白質エクオリンを生成
させることにより、哺乳類細胞系中にクラゲ発光蛋白質エクオリンを発現させる
方法を開示している。
ＡＱ４４０を哺乳類細胞系の発現ヴェクトル・プラスミドにクローニングし、得
られたプラスミドを自己増殖させ、哺乳類細胞中に発光蛋白質エクオリンを生成
させることにより、哺乳類細胞系中にクラゲ発光蛋白質エクオリンを発現させる
方法を開示している。
【０００８】 米国特許第５，４２２，２６６号は、大腸菌中にアポエクオリンを発現させる
ことができるベクトルに含まれる遺伝子符号化アポエクオリン蛋白質を開示して
いる。
ことができるベクトルに含まれる遺伝子符号化アポエクオリン蛋白質を開示して
いる。
【０００９】 米国特許第５，７１４，６６６号は、アポエクオリンを発現する哺乳類細胞系
または形質転換動物、及び細胞内カルシウムの調節に関与するレセプタを開示し
ている。この文献はまた、アポエクオリンを発現する前記哺乳類細胞にシーレン
テラジン補因子を添加し、フォトン放出が細胞内カルシウム濃度の目安であると
して発光量を測定するステップから成る、細胞内カルシウム測定方法をも開示し
ている。
または形質転換動物、及び細胞内カルシウムの調節に関与するレセプタを開示し
ている。この文献はまた、アポエクオリンを発現する前記哺乳類細胞にシーレン
テラジン補因子を添加し、フォトン放出が細胞内カルシウム濃度の目安であると
して発光量を測定するステップから成る、細胞内カルシウム測定方法をも開示し
ている。
【００１０】 しかし、これら公知の方法では、先ずアポエクオリンを発現する哺乳類細胞系
からの細胞を、（例えば、９６−ウェル・プレートのような）固形支持体上に分
散させ、次いでシーレンテラジン補因子を細胞上に添加し、インキュベートする
ことによって活性エクオリンを再構成し、さらに、細胞内カルシウム濃度の調節
に関与するレセプタに作用する薬剤を調製し、これを細胞に添加し、最後に、発
光量を測定するステップを踏まねばならない。
からの細胞を、（例えば、９６−ウェル・プレートのような）固形支持体上に分
散させ、次いでシーレンテラジン補因子を細胞上に添加し、インキュベートする
ことによって活性エクオリンを再構成し、さらに、細胞内カルシウム濃度の調節
に関与するレセプタに作用する薬剤を調製し、これを細胞に添加し、最後に、発
光量を測定するステップを踏まねばならない。
【００１１】 また、上述したように、ＧＰＣＲの活性化後、発光が起こるのは僅か２０〜３
０秒に過ぎない。従って、細胞にアゴニストを添加した後の数秒の間に発光を記
録しなければならない。
０秒に過ぎない。従って、細胞にアゴニストを添加した後の数秒の間に発光を記
録しなければならない。
【００１２】 従って、公知技術において利用される方法は、高処理能率スクリーニング・レ
ベルで測定するには不充分である。即ち、従来の高処理量スクリーニングでは、
数千種の化合物を試験するのにルミノメータが必要であり、微量滴定プレートの
使用が必要である。
ベルで測定するには不充分である。即ち、従来の高処理量スクリーニングでは、
数千種の化合物を試験するのにルミノメータが必要であり、微量滴定プレートの
使用が必要である。
【００１３】
この発明は、生物学的活性物質、特にカルシウム結合レセプタに作用するアゴ
ニスト及び／またはアンタゴニストを検出するための、公知技術の問題を伴なわ
ない方法及び装置を提供することを目的とする。
ニスト及び／またはアンタゴニストを検出するための、公知技術の問題を伴なわ
ない方法及び装置を提供することを目的とする。
【００１４】 この発明の主な目的は、従来の高処理量スクリーニング装置に変更を加えなく
ても、微量滴定プレートのような特殊な容器に適応させながら、高処理能率で生
物学的活性物質の検出を可能にする方法及び装置を提供することにある。
ても、微量滴定プレートのような特殊な容器に適応させながら、高処理能率で生
物学的活性物質の検出を可能にする方法及び装置を提供することにある。
【００１５】 この発明の他の目的は、容易に自動化でき、操作し易い、低コストの方法を提
供することにある。
供することにある。
【００１６】
この発明は、“カルシウム結合”レセプタに対するアゴニスト及び／またはア
ンタゴニストの高処理能率スクリーニング特性表示及び／または用量決定方法に
係わり、下記ステップから成る： −前記レセプタの（好ましくは分子の形態の）アゴニスト及び／またはアンタゴ
ニストを固形支持体上に載置し、 −アポエクオリン及び前記“カルシウム結合”レセプタを発現する１つまたは２
つ以上の細胞をシーレンテラジンと一緒にインキュベートすることにより、前記
細胞によって活性エクオリンを再構成し、 −前記固形支持体に前記細胞の１つまたは２つ以上を加え、 −前記細胞による発光の測定値を得る。
ンタゴニストの高処理能率スクリーニング特性表示及び／または用量決定方法に
係わり、下記ステップから成る： −前記レセプタの（好ましくは分子の形態の）アゴニスト及び／またはアンタゴ
ニストを固形支持体上に載置し、 −アポエクオリン及び前記“カルシウム結合”レセプタを発現する１つまたは２
つ以上の細胞をシーレンテラジンと一緒にインキュベートすることにより、前記
細胞によって活性エクオリンを再構成し、 −前記固形支持体に前記細胞の１つまたは２つ以上を加え、 −前記細胞による発光の測定値を得る。
【００１７】 “カルシウム結合”レセプタとは、（イオン、既知または未知のアゴニストま
たはアンタゴニスト分子による）活性化の結果として、前記レセプタを含む細胞
、好ましくはその細胞膜中の細胞内カルシウム濃度を上昇させることになる、（
例えば、Ｇ−結合レセプタまたはイオンチャンネルのような）すべてのレセプタ
を意味する。
たはアンタゴニスト分子による）活性化の結果として、前記レセプタを含む細胞
、好ましくはその細胞膜中の細胞内カルシウム濃度を上昇させることになる、（
例えば、Ｇ−結合レセプタまたはイオンチャンネルのような）すべてのレセプタ
を意味する。
【００１８】 “固形支持体上に・・・を載置する”とは、微量滴定プレートまたはその他の
固形支持体のような容器に前記化合物を置くステップを意味し、（共有結合など
の形で）前記固形支持体に前記化合物を固定する必要はない。
固形支持体のような容器に前記化合物を置くステップを意味し、（共有結合など
の形で）前記固形支持体に前記化合物を固定する必要はない。
【００１９】 固形支持体としては微量滴定プレート、特に９６−ウェル微量滴定プレートが
好ましい。
好ましい。
【００２０】 アポエクオリン及びカルシウム結合レセプタを発現する細胞は、Ｇ−結合レセ
プタ及びレセプタとカルシウム経路との結合を確実にしようとする１つまたは２
つ以上の蛋白質を発現する細胞であることが好ましい。
プタ及びレセプタとカルシウム経路との結合を確実にしようとする１つまたは２
つ以上の蛋白質を発現する細胞であることが好ましい。
【００２１】 好ましくは、前記蛋白質を、天然Ｇα１６またはＧα１５蛋白質、２つの異な
るＧ−蛋白質間の融合から得られるキメラＧ−蛋白質及びホスホリパーゼＣβ２
蛋白質から成るグループから選択する。
るＧ−蛋白質間の融合から得られるキメラＧ−蛋白質及びホスホリパーゼＣβ２
蛋白質から成るグループから選択する。
【００２２】 発光測定値は、数個のディスペンサー及び測光ヘッドを装備した単一または複
数のルミノメーターを使用して求めるのが好ましい。
数のルミノメーターを使用して求めるのが好ましい。
【００２３】 この発明はまた、上記特性表示及び用量決定方法を実施するための、高処理能
率スクリーニング特性表示及び／または用量決定装置にも係わり、前記装置は、
−容器、好ましくは微量滴定プレート、より好ましくは９６−ウェル微量滴定プ
レートと、 −アポエクオリン及びカルシウム結合レセプタを発現する細胞を含有する培地と
、 −シーレンテラジンを含有する培地と、 −前記細胞による発光を検知し、でき得れば定量するための（１つまたは２つ以
上のディスペンサー及び測光ヘッドを装備した単一または複数のルミノメーター
のような）手段と から成る。
率スクリーニング特性表示及び／または用量決定装置にも係わり、前記装置は、
−容器、好ましくは微量滴定プレート、より好ましくは９６−ウェル微量滴定プ
レートと、 −アポエクオリン及びカルシウム結合レセプタを発現する細胞を含有する培地と
、 −シーレンテラジンを含有する培地と、 −前記細胞による発光を検知し、でき得れば定量するための（１つまたは２つ以
上のディスペンサー及び測光ヘッドを装備した単一または複数のルミノメーター
のような）手段と から成る。
【００２４】 この発明に係る装置は、上記の発明の特性表示及び／または用量決定方法の各
ステップを順次自動的に行なう手段を含むことが好ましい。
ステップを順次自動的に行なう手段を含むことが好ましい。
【００２５】 この発明はまた、上記の発明の方法及び装置によって同定されるカルシウム結
合レセプタのアゴニスト及び／またはアンタゴニストにも係る。
合レセプタのアゴニスト及び／またはアンタゴニストにも係る。
【００２６】 この発明の詳細を、添付の図面を参照しながら、実施例に従って以下に説明す
る。
る。
【００２７】
アポエクオリン及びＧＰＣＲを発現する哺乳類細胞系によってアゴニスト作用
を検出するには、発光量の測定を、アゴニストと想定される物質と細胞を接触さ
せた直後に行なわねばならない。この測光は、単管ルミノメーターを使用して容
易に行なうことができるが、処理能率は低く、このような生物学的装置を高処理
能率規模で利用することはできない。即ち： （１）細胞を被検アゴニストと接触させた直後に測光しなければならないから
、必然的に、ディスペンサーを組み込んだルミノメーターを使用せざるを得ない
。例えば、発光時間が短いため、プレートをルミノメーターの作用範囲外に置い
た状態で、その９６個のウェル内の細胞に被検薬剤を注入し、次いで、プレート
をルミノメーターの作用範囲内に移して発光量を記録することは不可能である。
被検薬剤の注入後、プレートを素早く（即ち、１５秒以内に）ルミノメーターの
作用範囲内へ移すことができても、従来の装置では、エクオリンのフラッシュ信
号が消える前に９６個のウェルからの発光量を測定することはできない。従来の
ルミノメーターは９６個の検出器を装備してはいないからである。
を検出するには、発光量の測定を、アゴニストと想定される物質と細胞を接触さ
せた直後に行なわねばならない。この測光は、単管ルミノメーターを使用して容
易に行なうことができるが、処理能率は低く、このような生物学的装置を高処理
能率規模で利用することはできない。即ち： （１）細胞を被検アゴニストと接触させた直後に測光しなければならないから
、必然的に、ディスペンサーを組み込んだルミノメーターを使用せざるを得ない
。例えば、発光時間が短いため、プレートをルミノメーターの作用範囲外に置い
た状態で、その９６個のウェル内の細胞に被検薬剤を注入し、次いで、プレート
をルミノメーターの作用範囲内に移して発光量を記録することは不可能である。
被検薬剤の注入後、プレートを素早く（即ち、１５秒以内に）ルミノメーターの
作用範囲内へ移すことができても、従来の装置では、エクオリンのフラッシュ信
号が消える前に９６個のウェルからの発光量を測定することはできない。従来の
ルミノメーターは９６個の検出器を装備してはいないからである。
【００２８】 （２）ディスペンサー組み込みルミノメーターでは、９６個のウェルに単一種
類の溶液を注入することはできても、個々のウェルにそれぞれ異なる薬剤を注入
することは不可能である。また、次のウェルに別の薬剤を注入するため、測光ご
とにディスペンサーを洗浄する作業は多大の時間を要し、高処理能率スケールの
測光には不向きである。これと同じ問題は、６個のディスペンサーを装備した装
置（例えば、ＥＧ＆Ｇ Ｗａｌｌａｃ社製の“Ｍｉｃｒｏｂｅｔａ Ｊｅｔ”）
でも起こる。６個のディスペンサーでは単一の種類の溶液を注入するだけである
。
類の溶液を注入することはできても、個々のウェルにそれぞれ異なる薬剤を注入
することは不可能である。また、次のウェルに別の薬剤を注入するため、測光ご
とにディスペンサーを洗浄する作業は多大の時間を要し、高処理能率スケールの
測光には不向きである。これと同じ問題は、６個のディスペンサーを装備した装
置（例えば、ＥＧ＆Ｇ Ｗａｌｌａｃ社製の“Ｍｉｃｒｏｂｅｔａ Ｊｅｔ”）
でも起こる。６個のディスペンサーでは単一の種類の溶液を注入するだけである
。
【００２９】 この発明は、アポエクオリン及びＧＰＣＲを発現する哺乳類細胞系を使用し、
また在来型ルミノメーターを使用することにより、ＧＰＣＲと結合する薬剤を高
処理能率でスクリーニングする方法を提供する。この方法では、アゴニストまた
はアンタゴニスト作用度を測定すべき溶液を、９６−ウェル・プレートのウェル
に注入する。アポエクオリン及びＧＰＣＲ発現細胞を培養プレートから脱離させ
（または培養懸濁液から回収し）、シーレンテラジンと一緒にインキュベートす
ることによって、活性エクオリンを再構成する。磁気攪拌子を使用してこれを懸
濁液の状態に維持し、ウェルごとに、被検アゴニスト溶液へ細胞懸濁液を注入す
る。次いで、１秒間（または３０秒間以上）にわたって発光を記録する。９６個
のウェルのそれぞれに同じ細胞懸濁液を注入するから、この方法では、測光ごと
にディスペンサーを洗浄する必要がなく、単一ディスペンサー・ルミノメーター
を使用して１５分以内に、９６件のアゴニストによるエクオリン発光測定を行な
うことができる。また、６個のディスペンサー及び測光ヘッドを装備したルミノ
メーターを使用すれば、２分以内に、９６件のアゴニストによるエクオリン発光
測定を行なうことができる（例えば、ＥＧ＆Ｇ Ｗａｌｌａｃ社製“Ｍｉｃｒｏ
ｂｅｔａ Ｊｅｔ”）。
また在来型ルミノメーターを使用することにより、ＧＰＣＲと結合する薬剤を高
処理能率でスクリーニングする方法を提供する。この方法では、アゴニストまた
はアンタゴニスト作用度を測定すべき溶液を、９６−ウェル・プレートのウェル
に注入する。アポエクオリン及びＧＰＣＲ発現細胞を培養プレートから脱離させ
（または培養懸濁液から回収し）、シーレンテラジンと一緒にインキュベートす
ることによって、活性エクオリンを再構成する。磁気攪拌子を使用してこれを懸
濁液の状態に維持し、ウェルごとに、被検アゴニスト溶液へ細胞懸濁液を注入す
る。次いで、１秒間（または３０秒間以上）にわたって発光を記録する。９６個
のウェルのそれぞれに同じ細胞懸濁液を注入するから、この方法では、測光ごと
にディスペンサーを洗浄する必要がなく、単一ディスペンサー・ルミノメーター
を使用して１５分以内に、９６件のアゴニストによるエクオリン発光測定を行な
うことができる。また、６個のディスペンサー及び測光ヘッドを装備したルミノ
メーターを使用すれば、２分以内に、９６件のアゴニストによるエクオリン発光
測定を行なうことができる（例えば、ＥＧ＆Ｇ Ｗａｌｌａｃ社製“Ｍｉｃｒｏ
ｂｅｔａ Ｊｅｔ”）。
【００３０】 従って、この方法では、アポエクオリン及びＧＰＣＲを発現する哺乳類細胞系
で、且つ在来型ルミノメーターを使用することによって、高処理能率のスクリー
ニングを行なうことができる（１００００サンプル／日）。これにより、スクリ
ーニング時間が短縮され、測光ごとに必要な薬剤量が節減される。
で、且つ在来型ルミノメーターを使用することによって、高処理能率のスクリー
ニングを行なうことができる（１００００サンプル／日）。これにより、スクリ
ーニング時間が短縮され、測光ごとに必要な薬剤量が節減される。
【００３１】 この方式では、測光毎の細胞数を極めて少なく抑えて（測光毎の細胞数が５０
００個またはそれ以下）、機能的なスクリーニングを行なうことができる。
００個またはそれ以下）、機能的なスクリーニングを行なうことができる。
【００３２】 アゴニストを収容しているウェルへの細胞注入に伴う測光バックグラウンドの
増大（例えば、細胞の破壊、細胞から培地中へのエクオリン分子放出、その場合
に起こるカルシウム濃度によってトリガーされるエクオリンからの発光などに起
因する）は見られなかった。この細胞注入では、シグナルとノイズとの比が５０
以上となるのが普通であった。
増大（例えば、細胞の破壊、細胞から培地中へのエクオリン分子放出、その場合
に起こるカルシウム濃度によってトリガーされるエクオリンからの発光などに起
因する）は見られなかった。この細胞注入では、シグナルとノイズとの比が５０
以上となるのが普通であった。
【００３３】 この発明の方法は、レセプタ及びアポエクオリンを発現する細胞を使用して、
既知または未知のアゴニストによるＧＰＣＲなどのようなカルシウム結合レセプ
タ刺激を、高処理能率分析するのに好適である。これらの細胞は、Ｓｈｅｕ等（
１９９３年）やＢｕｔｔｏｎとＢｒｏｗｎｓｔｅｉｎ （１９９３年）が報告し
ているように細胞質中にアポエクオリンを発現したり、Ｓｔａｂｌｅｓ等（１９
９７年）が採用しているように、ミトコンドリア標的配列をエクオリンに添加す
ることによって、ミトコンドリア中にアポエクオリンを発現したり、さらには、
細胞のその他の部分に発現することもできる。これらの細胞はまた、過剰発現し
たレセプタをカルシウム経路に結合させるように作用する蛋白質をも発現する。
これらの蛋白質としては、天然Ｇα１６またはＧα１５蛋白質（Ｍｉｌｌｉｇａ
ｎ ｅｔ ａｌ．， １９９６）、２つの異種Ｇ蛋白質間の融合から得られるキメ
ラＧ蛋白質（Ｋｏｍａｔｓｕｚａｋｉ ｅｔ ａｌ．， １９９７）、ホスホリパ
ーゼＣ−β２（Ｐａｒｋ ｅｔ ａｌ．， １９９２）、その他の“自在結合”蛋
白質が挙げられる。これらの細胞を用意し、シーレンテラジンを添加すると、数
時間（少なくとも９時間）にわたって使用できる。添加されたシーレンテラジン
も、アゴニストによる刺激に応答して細胞が放出する光の強さも、上記時間にわ
たって安定である。
既知または未知のアゴニストによるＧＰＣＲなどのようなカルシウム結合レセプ
タ刺激を、高処理能率分析するのに好適である。これらの細胞は、Ｓｈｅｕ等（
１９９３年）やＢｕｔｔｏｎとＢｒｏｗｎｓｔｅｉｎ （１９９３年）が報告し
ているように細胞質中にアポエクオリンを発現したり、Ｓｔａｂｌｅｓ等（１９
９７年）が採用しているように、ミトコンドリア標的配列をエクオリンに添加す
ることによって、ミトコンドリア中にアポエクオリンを発現したり、さらには、
細胞のその他の部分に発現することもできる。これらの細胞はまた、過剰発現し
たレセプタをカルシウム経路に結合させるように作用する蛋白質をも発現する。
これらの蛋白質としては、天然Ｇα１６またはＧα１５蛋白質（Ｍｉｌｌｉｇａ
ｎ ｅｔ ａｌ．， １９９６）、２つの異種Ｇ蛋白質間の融合から得られるキメ
ラＧ蛋白質（Ｋｏｍａｔｓｕｚａｋｉ ｅｔ ａｌ．， １９９７）、ホスホリパ
ーゼＣ−β２（Ｐａｒｋ ｅｔ ａｌ．， １９９２）、その他の“自在結合”蛋
白質が挙げられる。これらの細胞を用意し、シーレンテラジンを添加すると、数
時間（少なくとも９時間）にわたって使用できる。添加されたシーレンテラジン
も、アゴニストによる刺激に応答して細胞が放出する光の強さも、上記時間にわ
たって安定である。
【００３４】
例 １ ケモキンＣＣＲ−５レセプタ、Ｇα１６結合蛋白質及びアポエクオリンを発現
するＣＨＯ細胞系を樹立した。細胞は、１０％のウシ胎児血清（ＦＢＳ, Ｆｏｅ
ｔａｌ ｂｏｖｉｎｅ ｓｅｒｕｍ）を含有するＨＡＭ’ｓＦ１２培地中で単層培
養した。実験当日、培地を除き、室温で５分間にわたり、ＰＢＳ−ＥＤＴＡ（カ
ルシウムを含まず、５ｍＭのＥＤＴＡを加えた燐酸塩緩衝食塩水, ｐｈｏｓｐｈ
ａｔｅ ｂｕｆｆｅｒｅｄ ｓａｌｉｎｅ）中で細胞をインキュベートした。手で
培養プレートを振とうすると共に、ピペット・アップとピペット・ダウンを繰り
返して培養容器から細胞を脱離させた。細胞を遠心分離処理し、上澄みを取り除
くことによりＥＤＴＡを除去した。ＦＢＳを含まず、０．１％ウシ血清アルブミ
ンを加えたＨＡＭ’ｓ Ｆ１２培地中にペレットを再懸濁させた。トーマ・ツァ
イス細胞計数板によって細胞をカウントし、再度遠心分離処理し、ＦＢＳを含ま
ず、０．１％ウシ血清アルブミンを加えた濃度５．１０６細胞／ｍｌのＨＡＭ’
ｓ Ｆ１２培地中に再懸濁させた。シーレンテラジン（またはその誘導体、例え
ば、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ社製のシーレンテラジンｆ、ｈ、ｎ、ｃ
ｐまたはｈｃｐ）の５００μＭメタノール溶液を、最終濃度５μＭの細胞懸濁液
に加えた。この細胞懸濁液を１５〜３０分毎に振とうして細胞を懸濁液状態に維
持しながら、３〜５時間にわたり、室温で暗所に貯蔵した。
するＣＨＯ細胞系を樹立した。細胞は、１０％のウシ胎児血清（ＦＢＳ, Ｆｏｅ
ｔａｌ ｂｏｖｉｎｅ ｓｅｒｕｍ）を含有するＨＡＭ’ｓＦ１２培地中で単層培
養した。実験当日、培地を除き、室温で５分間にわたり、ＰＢＳ−ＥＤＴＡ（カ
ルシウムを含まず、５ｍＭのＥＤＴＡを加えた燐酸塩緩衝食塩水, ｐｈｏｓｐｈ
ａｔｅ ｂｕｆｆｅｒｅｄ ｓａｌｉｎｅ）中で細胞をインキュベートした。手で
培養プレートを振とうすると共に、ピペット・アップとピペット・ダウンを繰り
返して培養容器から細胞を脱離させた。細胞を遠心分離処理し、上澄みを取り除
くことによりＥＤＴＡを除去した。ＦＢＳを含まず、０．１％ウシ血清アルブミ
ンを加えたＨＡＭ’ｓ Ｆ１２培地中にペレットを再懸濁させた。トーマ・ツァ
イス細胞計数板によって細胞をカウントし、再度遠心分離処理し、ＦＢＳを含ま
ず、０．１％ウシ血清アルブミンを加えた濃度５．１０６細胞／ｍｌのＨＡＭ’
ｓ Ｆ１２培地中に再懸濁させた。シーレンテラジン（またはその誘導体、例え
ば、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ社製のシーレンテラジンｆ、ｈ、ｎ、ｃ
ｐまたはｈｃｐ）の５００μＭメタノール溶液を、最終濃度５μＭの細胞懸濁液
に加えた。この細胞懸濁液を１５〜３０分毎に振とうして細胞を懸濁液状態に維
持しながら、３〜５時間にわたり、室温で暗所に貯蔵した。
【００３５】 ＦＢＳを含まず、０．１％ウシ血清アルブミンを含むＨＡＭ’ｓ Ｆ１２培地
で既知リガンドの種々の希釈液を用意し、９６−ウェル・プレートのウェルにそ
れぞれの希釈液を５０μｌ注入した。ＦＢＳを含まず、０．１％ウシ血清アルブ
ミンを加えた培地ＨＡＭ’ｓＦ１２で、細胞懸濁液を５倍に希釈し、アルミ箔で
遮光したガラスまたはプラスチック容器中に置いた。懸濁液を、磁気攪拌棒で低
速（１〜５回転／秒）で攪拌することによって、細胞を均質懸濁液の状態に維持
した。磁気攪拌棒には、細胞が潰れて培地中にエクオリンが放出されるのを防ぐ
ためのリングを設けた。尚、懸濁液中で細胞を培養するように構成した培養容器
を使用してもよい。
で既知リガンドの種々の希釈液を用意し、９６−ウェル・プレートのウェルにそ
れぞれの希釈液を５０μｌ注入した。ＦＢＳを含まず、０．１％ウシ血清アルブ
ミンを加えた培地ＨＡＭ’ｓＦ１２で、細胞懸濁液を５倍に希釈し、アルミ箔で
遮光したガラスまたはプラスチック容器中に置いた。懸濁液を、磁気攪拌棒で低
速（１〜５回転／秒）で攪拌することによって、細胞を均質懸濁液の状態に維持
した。磁気攪拌棒には、細胞が潰れて培地中にエクオリンが放出されるのを防ぐ
ためのリングを設けた。尚、懸濁液中で細胞を培養するように構成した培養容器
を使用してもよい。
【００３６】 ＥＧ＆Ｇ Ｗａｌｌａｃ社製ＭｉｃｒｏＬｕｍａｔ−Ｐｌｕｓマイクロプレー
ト・ルミノメーターは、注入の直後、９６−ウェル・プレートの各ウェルからの
発光を記録することができる。ディスペンサーの導入チューブ先端を細胞懸濁液
の底に位置させ、チューブ及びポンプの全容積が細胞懸濁液で満たされるように
、装置のデッド・ボリュームの３倍でディスペンサーを洗浄した。次いで、アゴ
ニスト溶液を含む９６−ウェル・プレートをルミノメーター内へ挿入した。次い
で、ウェル毎に、５０μｌの細胞懸濁液（即ち、１０００００個の細胞）を、細
胞が破壊してエクオリンが培地中に放出されないように極力低い注入速度（０．
４秒）でウェルに分配し、直ちに、３０秒間にわたって発光を記録した。最初の
ウェルの測光結果を記録した後、次のウェルに細胞を注入し、測光結果を記録し
た。以下、同様の操作を繰り返した。プレート毎に、且つそれぞれのウェルに関
して、経時的な発光の強さを表わす一連の曲線を示した（図１）。ルミノメータ
ーと組み合せたウィングロー・ソフトウェア（Ｗｉｎｇｌｏｗ ｓｏｆｔｗａｒ
ｅ）を利用して３０秒間の発光の強さを積分することにより、ウェル毎に、発光
値、即ち、ウェル中に存在するアゴニストによるＣＣＲ−５の刺激値を求めた。
これらの値を、リガンド濃度の対数値に対してプロットすることによって、図２
に示すような用量応答曲線が得られる。これにより、それぞれのリガンドについ
て、半最大応答用量（ＥＣ５０）を求めることができる。このデータを得るため
、３時間以内に２８８回の測定を行なった。
ト・ルミノメーターは、注入の直後、９６−ウェル・プレートの各ウェルからの
発光を記録することができる。ディスペンサーの導入チューブ先端を細胞懸濁液
の底に位置させ、チューブ及びポンプの全容積が細胞懸濁液で満たされるように
、装置のデッド・ボリュームの３倍でディスペンサーを洗浄した。次いで、アゴ
ニスト溶液を含む９６−ウェル・プレートをルミノメーター内へ挿入した。次い
で、ウェル毎に、５０μｌの細胞懸濁液（即ち、１０００００個の細胞）を、細
胞が破壊してエクオリンが培地中に放出されないように極力低い注入速度（０．
４秒）でウェルに分配し、直ちに、３０秒間にわたって発光を記録した。最初の
ウェルの測光結果を記録した後、次のウェルに細胞を注入し、測光結果を記録し
た。以下、同様の操作を繰り返した。プレート毎に、且つそれぞれのウェルに関
して、経時的な発光の強さを表わす一連の曲線を示した（図１）。ルミノメータ
ーと組み合せたウィングロー・ソフトウェア（Ｗｉｎｇｌｏｗ ｓｏｆｔｗａｒ
ｅ）を利用して３０秒間の発光の強さを積分することにより、ウェル毎に、発光
値、即ち、ウェル中に存在するアゴニストによるＣＣＲ−５の刺激値を求めた。
これらの値を、リガンド濃度の対数値に対してプロットすることによって、図２
に示すような用量応答曲線が得られる。これにより、それぞれのリガンドについ
て、半最大応答用量（ＥＣ５０）を求めることができる。このデータを得るため
、３時間以内に２８８回の測定を行なった。
【００３７】 例 ２ セロトニン５ＨＴ−２Ｂレセプタ、Ｇα１６結合蛋白質及びアポエクオリンを
発現するＣＨＯ細胞系を樹立した。例１で述べたように細胞を処理し、希釈（１
００μｌ／ウェル、５００００個の細胞に相当）した後、このレセプタに対する
既知アゴニストの溶液１００μｌに分配した。ウェル毎に発光量を２０秒間にわ
たって記録した。種々のアゴニストに関して得られた用量応答曲線を図３に示す
。このデータを得るため、１時間以内に１４４回の測定を行なった。
発現するＣＨＯ細胞系を樹立した。例１で述べたように細胞を処理し、希釈（１
００μｌ／ウェル、５００００個の細胞に相当）した後、このレセプタに対する
既知アゴニストの溶液１００μｌに分配した。ウェル毎に発光量を２０秒間にわ
たって記録した。種々のアゴニストに関して得られた用量応答曲線を図３に示す
。このデータを得るため、１時間以内に１４４回の測定を行なった。
【００３８】 例 ３ ケモキンＣＣＲ３レセプタを発現するＫ５６２細胞を、エクオリン及びＧα１
６結合蛋白質を発現させるためのプラスミドによってトランスフェクション処理
した。２週間にわたり抗生物質Ｚｅｏｃｉｎを作用させて、安定的にトランスフ
ェクトされた細胞だけを選び出した。これらの細胞を、１０％ＦＢＳを含有する
ＤＭＥＭ培地中で懸濁培養した。遠心分離処理後、得られたペレットを例１で述
べたように使用することにより、エクオリン測光を行なった。この方法によって
得られたエオタキシン（ｅｏｔａｘｉｎ）及びＭＣＰ−４の用量応答曲線を図４
に示す。
６結合蛋白質を発現させるためのプラスミドによってトランスフェクション処理
した。２週間にわたり抗生物質Ｚｅｏｃｉｎを作用させて、安定的にトランスフ
ェクトされた細胞だけを選び出した。これらの細胞を、１０％ＦＢＳを含有する
ＤＭＥＭ培地中で懸濁培養した。遠心分離処理後、得られたペレットを例１で述
べたように使用することにより、エクオリン測光を行なった。この方法によって
得られたエオタキシン（ｅｏｔａｘｉｎ）及びＭＣＰ−４の用量応答曲線を図４
に示す。
【００３９】 例 ４ オレキシン１またはオレキシン２レセプタ、Ｇα１６結合蛋白質及びアポエク
オリンを発現するＣＨＯ細胞系を樹立した。例１で述べたように細胞を処理し、
希釈（１００μｌ／ウェル、２５０００個の細胞に相当）した後、これらのレセ
プタに対する既知アゴニストの溶液５０μｌに分配した。ウェル毎に２０秒間、
測光値を記録した。この方法で得られた用量応答曲線を図５Ａに示す。
オリンを発現するＣＨＯ細胞系を樹立した。例１で述べたように細胞を処理し、
希釈（１００μｌ／ウェル、２５０００個の細胞に相当）した後、これらのレセ
プタに対する既知アゴニストの溶液５０μｌに分配した。ウェル毎に２０秒間、
測光値を記録した。この方法で得られた用量応答曲線を図５Ａに示す。
【００４０】 例 ５ カナビノイドＣＢ１レセプタ、Ｇα１６結合蛋白質及びアポエクオリンを発現
するＣＨＯ細胞系を培養した。例１で述べたように細胞を処理し、希釈（１００
μｌ／ウェル、５００００個の細胞に相当）した後、このレセプタに対する既知
アゴニストの溶液１００μｌに分配した。ウェル毎に２０秒間、測光値を記録し
た。この方法で得られた用量応答曲線を図５Ｂに示す。
するＣＨＯ細胞系を培養した。例１で述べたように細胞を処理し、希釈（１００
μｌ／ウェル、５００００個の細胞に相当）した後、このレセプタに対する既知
アゴニストの溶液１００μｌに分配した。ウェル毎に２０秒間、測光値を記録し
た。この方法で得られた用量応答曲線を図５Ｂに示す。
【００４１】 アンタゴニスト作用度を測定するため、一連のアンタゴニスト希釈溶液に細胞
を注入した。この段階で、被検アンタゴニストがアゴニスト作用を具えていない
ことをチェックするため、発光現象を記録した。細胞を、アンタゴニストと一緒
に３０分間インキュベートした。次いで、５ＨＴ−２Ｂレセプタのアゴニスト（
α−メチル−５ＨＴ）溶液を細胞に注入し、直ちに、ウェル毎に発光現象を記録
した。アンタゴニスト濃度の対数に対応する発光量の変化をプロットすることに
より、図示のグラフを得た。アンタゴニスト濃度が上昇すると、アゴニスト添加
に伴う発光量が低下した。次いで、細胞によって発現される他のレセプタのアゴ
ニスト（典型的な例としてはｐ２レセプタに作用するＡＴＰ）を、対照としての
アンタゴニスト、細胞及びアゴニストの混合物に注入することによって、細胞が
実験の時点まで活性エクオリンを有しているか否かをチェックすることができる
。例えば、細胞内カルシウム濃度を上昇させる細胞毒性化合物は、エクオリンが
細胞中に存在するシーレンテラジンを残らず消費するように作用する。このよう
な細胞毒性化合物の存在は、ＡＴＰ注入にもかかわらず信号が発生しないことで
検知される（図６）。
を注入した。この段階で、被検アンタゴニストがアゴニスト作用を具えていない
ことをチェックするため、発光現象を記録した。細胞を、アンタゴニストと一緒
に３０分間インキュベートした。次いで、５ＨＴ−２Ｂレセプタのアゴニスト（
α−メチル−５ＨＴ）溶液を細胞に注入し、直ちに、ウェル毎に発光現象を記録
した。アンタゴニスト濃度の対数に対応する発光量の変化をプロットすることに
より、図示のグラフを得た。アンタゴニスト濃度が上昇すると、アゴニスト添加
に伴う発光量が低下した。次いで、細胞によって発現される他のレセプタのアゴ
ニスト（典型的な例としてはｐ２レセプタに作用するＡＴＰ）を、対照としての
アンタゴニスト、細胞及びアゴニストの混合物に注入することによって、細胞が
実験の時点まで活性エクオリンを有しているか否かをチェックすることができる
。例えば、細胞内カルシウム濃度を上昇させる細胞毒性化合物は、エクオリンが
細胞中に存在するシーレンテラジンを残らず消費するように作用する。このよう
な細胞毒性化合物の存在は、ＡＴＰ注入にもかかわらず信号が発生しないことで
検知される（図６）。
【図１】 ＣＣＲ５レセプタ、アポエクオリン及びＧα１６を発現する細胞を注入された
９６−ウェル・プレートの各ウェルにおける細胞による発光の強さを時間の経過
とともに表わす一連の曲線である。スケーリングは、すべてのグラフに共通であ
る。信号の記録は３０秒間にわたって行なった。リガンド濃度は、カラム１から
カラム１２に向かって上昇する。測定は、すべて重複方式で行なった。即ち、ラ
インＡとＢとではリガンドとしてランテスを使用し、ラインＣとＤとではリガン
ドとしてＭＩＰ−１αを使用し、ラインＥとＦとではリガンドとしてＭＩＰ−β
を使用し、ラインＧとＨとではリガンドとしてランテスの誘導体Ａを使用した。
９６−ウェル・プレートの各ウェルにおける細胞による発光の強さを時間の経過
とともに表わす一連の曲線である。スケーリングは、すべてのグラフに共通であ
る。信号の記録は３０秒間にわたって行なった。リガンド濃度は、カラム１から
カラム１２に向かって上昇する。測定は、すべて重複方式で行なった。即ち、ラ
インＡとＢとではリガンドとしてランテスを使用し、ラインＣとＤとではリガン
ドとしてＭＩＰ−１αを使用し、ラインＥとＦとではリガンドとしてＭＩＰ−β
を使用し、ラインＧとＨとではリガンドとしてランテスの誘導体Ａを使用した。
【図２】 ＲＬＵ（３０秒間の総発光量）とリガンド最終濃度対数との関係を、ＣＣＲ５
レセプタの種々のアゴニストに関して表わす用量応答曲線である。
レセプタの種々のアゴニストに関して表わす用量応答曲線である。
【図３】 ５ＨＴ−２Ｂレセプタの種々のアゴニストに関する用量応答曲線である。
【図４】 ＣＣＲ３及びエクオリンを発現するＫ５６２細胞からの発光量の用量応答曲線
を、エオタキシンによるレセプタ活性化に対する応答として示す。
を、エオタキシンによるレセプタ活性化に対する応答として示す。
【図５】 エクオリン及びＧα１６とオレキシン１レセプタ（図５Ａ）またはオレキシン
２レセプタ（図５Ｂ）を発現する細胞に関する用量応答曲線である。
２レセプタ（図５Ｂ）を発現する細胞に関する用量応答曲線である。
【図６】 ５ＨＴ−２Ｂレセプタの種々のアンタゴニストに関する用量応答曲線である。
【参考文献】
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ｇ０１Ｎ 37/00 １０３ Ｇ０１Ｎ 37/00 １０３ (72)発明者 パルメンティール，マルク ベルギー，ベ−1630 ブリュッセル，シャ スエー ドックル 304 Ｆターム(参考） 2G045 AA40 CB01 FB13 GC15 4B029 AA07 BB11 FA02 FA12 4B063 QA01 QQ08 QR48 QS03 QS36 QX02
Claims (10)
- 【請求項１】 カルシウム結合レセプタまたはカルシウム結合チャンネルま
たはその他のカルシウム結合蛋白質に対するアゴニスト及び／またはアンタゴニ
ストまたはモジュレーターの特性表示及び／または用量決定方法であって、 −アゴニスト及び／またはアンタゴニストを固形支持体上に載置し、 −アポエクオリンまたはその他の関連蛋白質及び前記カルシウム結合レセプタを
発現する１つまたは２つ以上の細胞をシーレンテラジンまたはその他の感カルシ
ウム蛋白質と一緒にインキュベートすることにより、前記細胞によって活性エク
オリンを再構成し、 −前記固形支持体に前記細胞の１つまたは２つ以上を加え、 −前記細胞による発光の測定値を得る ステップから成ることを特徴とする前記方法。 - 【請求項２】 固形支持体が微量滴定プレートであることを特徴とする請求
項１に記載の方法。 - 【請求項３】 微量滴定プレートが９６−ウェル・微量滴定プレート、また
は３８４−ウェル・プレート、または１５３６−ウェル・プレートまたはその他
の形態を有するプレートであることを特徴とする請求項２に記載の方法。 - 【請求項４】 細胞が、その細胞質またはミトコンドリアまたはその他の部
分にアポエクオリンを発現することを特徴とする請求項１〜３のいずれか１項に
記載の方法。 - 【請求項５】 カルシウム結合レセプタを発現する細胞が、内性または組み
替えＧ−蛋白質−結合レセプタを発現する細胞及び／または被検レセプタ（内性
または過剰発現）をカルシウム経路と結合させる作用を有する蛋白質を発現する
細胞であることを特徴とする請求項１〜４のいすれか１項に記載の方法。 - 【請求項６】 前記蛋白質を、天然Ｇα１６またはＧα１５蛋白質、２つの
異なるＧ−蛋白質間の融合から生成するキメラＧ−蛋白質またはホスホリパーゼ
Ｃβ２蛋白質またはその他の結合蛋白質または化学物質から成るグループから選
択することを特徴とする請求項５に記載の方法。 - 【請求項７】 好ましくは複数のディスペンサー及び測光ヘッドを装備した
単一または複数のルミノメーターを使用して、発光量を測定することを特徴とす
る請求項１〜６のいずれか１項に記載の方法。 - 【請求項８】 請求項１〜７のいずれか１項に記載の高処理能率スクリーニ
ング特性表示及び／または用量決定方法を実施するための高処理能率スクリーニ
ング特性表示及び／または用量決定装置であって、 −微量滴定プレート、好ましくは９６−ウェル・微量滴定プレートと、 −アポエクオリン及びカルシウム結合レセプタを発現する細胞を含有する培地と
、 −シーレンテラジンを含有する培地と、 −前記細胞による発光を検知する手段と から成ることを特徴とする前記装置。 - 【請求項９】 請求項１〜７のいずれか１項に記載の特性表示及び／または
用量決定方法の一連のステップを自動的に行なうための手段を含むことを特徴と
する請求項８に記載の装置。 - 【請求項１０】 請求項１〜８のいずれか１項に記載の方法によって同定さ
れるレセプタのアゴニストまたはアンタゴニスト。
Applications Claiming Priority (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| EP98870149 | 1998-07-06 | ||
| EP98870149.6 | 1998-07-06 | ||
| PCT/BE1999/000087 WO2000002045A2 (en) | 1998-07-06 | 1999-07-06 | Bioluminescent assay for agonists or antagonists of a calcium-coupled receptor |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JP2002519699A true JP2002519699A (ja) | 2002-07-02 |
| JP3495987B2 JP3495987B2 (ja) | 2004-02-09 |
Family
ID=8237065
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2000558390A Expired - Lifetime JP3495987B2 (ja) | 1998-07-06 | 1999-07-06 | カルシウム結合レセプタに対するアゴニスト及び／またはアンタゴニストの高処理能率スクリーニング特性表示及び／または用量決定方法 |
Country Status (9)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US6872538B1 (ja) |
| EP (1) | EP1145002B2 (ja) |
| JP (1) | JP3495987B2 (ja) |
| AT (1) | ATE232298T1 (ja) |
| CA (1) | CA2336929C (ja) |
| DE (1) | DE69905291T3 (ja) |
| DK (1) | DK1145002T4 (ja) |
| ES (1) | ES2192060T5 (ja) |
| WO (1) | WO2000002045A2 (ja) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2007530027A (ja) * | 2004-03-26 | 2007-11-01 | ブリーニ、マリサ | 細胞内パラメータを改変することができる分子をスクリーニングするための発光タンパク質プローブを用いて、前記パラメータを検出するための方法 |
Families Citing this family (19)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
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