JP2003527113A - 細胞内カルシウムレベルの測定による高処理能スクリーニング - Google Patents

細胞内カルシウムレベルの測定による高処理能スクリーニング

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Abstract

(57)【要約】 本発明は、細胞への２価陽イオン（特に、カルシウム）流入により誘因されるシグナル発生の反応速度を変更するために細胞内キレート剤を用いる評価を提供する。前記評価において細胞内キレート剤を用いると、シグナルを遅延及び延長させることができ、よって検出時に液体を同時に取り扱う必要なくシグナルを自動化装置を用いて検出することができる。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】 （発明の分野） 本発明は、２価陽イオン（特に、カルシウム）により誘因されるシグナル発生
の反応速度を変更するために細胞内キレート剤を使用する評価に関する。
【０００２】 （発明の背景） 各種の細胞を基にした機能の評価は、正常な生理学的環境においてタンパク質
の活性を評価するために細胞内カルシウム濃度の測定を利用している。これらの
評価には、Ｇタンパク質結合受容体（ＧＰＣＲ）及び血漿膜イオンチャネルに対
する評価が含まれる。前記受容体及びイオンチャネルの刺激による細胞内カルシ
ウム濃度の大きく且つ急速な上昇は、蛍光染料、カルシウム結合タンパク質（例
えば、生物発光タンパク質、エクオリン及び改良緑色蛍光タンパク質−カルモジ
ュリンキメラ）を含めた細胞内カルシウム感受性プローブにより検出され得る（
Ｕｎｇｒｉｎ，Ｍ．Ｄ．，Ｓｉｎｇｈ，Ｌ．Ｍ．Ｒ．，Ｓｔｏｃｃｏ，Ｒ．，Ｓ
ａｓ，Ｄ．Ｅ．，Ａｂｒａｍｏｖｉｔｚ，Ｍ．，「Ｇタンパク質結合受容体に対
する自動エクオリン発光ベースの機能カルシウム評価(An automated aequorin l
uminescence-based functional calcium assay for G-protein-coupled recepto
rs)」，Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，２７２，３４−４２（１９９９）；Ｔａ
ｋａｈａｓｈｉ，Ａ．，Ｃａｍａｃｈｏ．Ｐ．，Ｌｅｃｈｌｅｉｔｅｒ，Ｊ．Ｄ
．及びＨｅｒｍａｎ，Ｂ．，「細胞内カルシウムの測定(Measurement of intrac
ellular calcium)」，Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｒｅｖｉｅｗｓ，７９，１
０８９−１１２５（１９９９）；Ｃｏｎｚａｌｅｚ，Ｊ．Ｅ．，Ｏａｄｅｓ，Ｋ
．，Ｌｅｙｃｈｉｓ，Ｙ．，Ｈａｒｏｏｔｕｎｉａｎ，Ａ．及びＮｅｇｕｌｅｓ
ｃｕ，Ｐ．，「イオンチャネル標的のスクリーニングのための細胞に基づく評価
及び機器(Cell-based assays and instrumentation for screening ion-channel
targets)」，Ｄｒｕｇ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ Ｔｏｄａｙ，４，４３１−４３
９（１９９９）；Ｍｉｙａｗａｋｉ，Ａ．，Ｌｌｏｐｓｉ，Ｊ．，Ｈｅｉｍ，Ｒ
．，ＭｃＣａｆｆｅｒｙ，Ｊ．Ｍ．，Ａｄａｍｓ，Ｊ．Ａ．，Ｉｋｕｒａ，Ｍ．
及びＴｓｉｅｎ，Ｒ．Ｙ．，「緑色蛍光タンパク質及びカルモジュリンを主成分
とするＣａ２＋に対する蛍光指示薬(Fluorescent indicators for Ca2+ based o
n green fluorescent proteins and calmodulin)」，Ｎａｔｕｒｅ，３８８，８
８２−８８７（１９９７）；Ｃｒｅｔｏｎ，Ｒ．，Ｋｒｅｉｌｉｎｇ，Ｊ．Ａ．
及びＪａｆｆｅ，Ｌ．Ｆ．，「化学発光を用いるカルシウムイメージング(Calci
um imaging with chemiluminescence)」，Ｍｉｃｒｏｓｃ．Ｒｅｓ．Ｔｅｃｈ．
，４６，３９０−３９７（１９９９）；Ｐｒａｓｈｅｒ，Ｄ．，ＭｃＣａｎｎ，
Ｒ．Ｏ．及びＣｏｒｍｉｅｒ，Ｍ．Ｊ．，「エクオリンをコードするｃＤＮＡの
クローニング及び発現、生物発光カルシウム結合タンパク質(Cloning and expre
ssion of the cDNA coding for aequorin, A bioluminescent calcium-binding
protein)」，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．，１２
６，１２５９−１２６８（１９８５））。
【０００３】 細胞内カルシウム濃度の急速且つ一過性変化を検出するには、誘発剤を細胞と
混合すると同時にカルシウムリポーターからの蛍光または発光の変化を直ちに検
出する機器が必要である。これには液体分配及びシグナル検出を同時に実施する
ことが要求されるが、適切な機器が不足しているため細胞ベースの機能評価にお
けるカルシウムの一過性測定の使用が制限される。本発明は、高密度スクリーニ
ングフォーマット（例えば、９６穴、３８４穴、１５２６穴または３４５６穴微
量滴定プレート）におけるカルシウムシグナリング応答を遅延及び／または延長
させるための細胞内カルシウムキレート剤の有用性を立証する。キレート剤の存
在下でカルシウムシグナルの反応速度を変化すると、評価は完全なまま、誘発剤
の添加後一過性シグナルを測定するのに十分な時間が与えられる。従って、高処
理能スクリーニング機能評価を多種類の検査器具を用いて実施し得る。
【０００４】 スクリーニングの分野の当業者は、蛍光または発光シグナルを測定するために
利用できる時間を延長し得る方法を提供しようとしてきた。例えば、１つのアイ
デアは細胞リポーター酵素反応の反応速度を変化または遅延するために試薬を添
加することであった。この方法の例は、ＰＡＣＫＡＲＤ ＬＵＣＬＩＴＥ（登録
商標）ルシフェラーゼリポーター遺伝子評価キット（米国特許第５，６１８，６
８２号明細書及び欧州特許出願第９４ １０２ ０８０．２号明細書参照）また
はＰＲＯＭＥＧＡ ＳＴＥＡＤＹ−ＧＬＯ（商標）ルシフェラーゼ評価システム
（米国特許第５，２８３，１７９号明細書参照）のようなフラッシュルシフェラ
ーゼに基づく発光をグロー発光フォーマットに変換することである。
【０００５】 カルシウムの細胞内キレート剤は多くのシステムにおいてカルシウム応答を排
除するために日常的に使用されているが、細胞内カルシウム応答の反応速度は主
としてキレート剤の非存在下で研究されてきた（Ｔａｋａｈａｓｈｉ，Ａ．，Ｃ
ａｍａｃｈｏ，Ｐ．，Ｌｅｃｈｌｅｉｔｅｒ，Ｊ．Ｄ．及びＨｅｒｍａｎ，Ｂ．
，「細胞内カルシウムの測定(Measurement of intracellular calcium)」，Ｐｈ
ｙｓｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｒｅｖｉｅｗｓ，７９，１０８９−１１２５（１９９
９）；Ｓｔｒｕｋ，Ａ．，Ｓｚｕｃｓ，Ｇ．，Ｋｒｅｍｍｅｒ，Ｈ．及びＭｅｌ
ｚｅｒ，Ｗ．，「高濃度のＥＧＴＡを充填した骨格筋線維におけるＦｕｒａ−２
カルシウムシグナル(Fura-2 calcium signals in skeletal muscle fibres load
ed with high concentrations of EGTA)」，Ｃｅｌｌ Ｃａｌｃｉｕｍ，２３，
２３−３２（１９９８）；Ｋｅｌｌｅｒ，Ｊ．Ｎ．，Ｇｕｏ，Ｑ．，Ｈｏｌｔｓ
ｂｅｒｇ，Ｆ．Ｗ．，Ｂｒｕｃｅ−Ｋｅｌｌｅｒ，Ａ．Ｊ．及びＭａｔｔｓｏｎ
，Ｍ．Ｐ．，「突然変異プレセニリン−１を発現する神経細胞におけるミトコン
ドリア毒素誘発のアポトーシスに対する高い感受性は混乱したカルシウム恒常性
及び高いオキシラジカル生成に結びつく(Increased sensitivity to microchond
rial toxin-induced apoptosis in neural cells expressing mutant presenili
n-1 is linked to perturbed calcium homeostasis and enhanced oxyradical p
roduction)」，Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．，１８，４４３９−４４５０（１９９８
））。しかしながら、ＢＡＰＴＡ−ＡＭの神経保護特性を理解する試みにおいて
、細胞内カルシウム一過性応答に対するキレート剤の影響が若干詳細に研究され
ている（Ｔｙｍｉａｎｓｋｉ，Ｍ．，Ｗａｌｌａｃｅ，Ｍ．Ｃ．，Ｓｐｉｇｅｌ
ｍａｎ，Ｉ．，Ｕｎｏ，Ｍ．，Ｃａｒｌｅｎ，ＰＩ Ｌ．，Ｔａｔｏｒ，Ｃｈ
Ｈ．及びＣｈａｒｌｔｏ，Ｍ．Ｐ．，「細胞浸透性Ｃａ２＋キレート剤はインビ
トロ及びインビボで早期に興奮毒性虚血性ニューロン損傷を減少させる(Cell-pe
rmeant Ca2+ chelators reduce early excitotoxic and ischemic neuronal inj
ury in vitro and in vivo)」，Ｎｅｕｒｏｎ，１１，２２１−２３５（１９９
３））。例えば、マウスの骨髄ニューロンを刺激するために高濃度のグルタミン
酸を使用した場合には、ＢＡＰＴＡ−ＡＭは保護的であり、振幅を減少させ、一
過性応答の上昇及び減衰時間を遅延することにより主に急速一過性応答に影響を
与えた（Ｔｙｍｉａｎｓｋｉ，Ｍ．，Ｃｈａｒｌｔｏｎ，Ｍ．Ｐ．，Ｃａｒｌｅ
ｎ，Ｐ．Ｌ．及びＴａｔｏｒ，Ｃ．Ｈ．，「神経保護性細胞浸透性Ｃａ２＋キレ
ート剤の特性：インビトロでの［Ｃａ２＋］ｉ及びグルタメート神経毒性に対す
る影響(Properties of neuroprotective cell-permeant Ca2+ chelators: Efect
s on [Ca2+]i and glutamate neurotoxicity in vitro)」，Ｊ．Ｎｅｕｒｏｐｈ
ｙｓ．，７２，１９７３−１９９２（１９９４））。同様の結果がイオノマイシ
ン誘導カルシウム流入を用いて得られ、観察されたカルシウム一過性応答はＢＡ
ＰＴＡ−ＡＭの存在下で最高８倍遅かった（Ｃｏｌｌａｔｚ，Ｍ．Ｂ．，Ｒｕｄ
ｅｌ，Ｒ．及びＢｒｉｎｋｍｅｉｅｒ，Ｈ．，「細胞内カルシウムキレート剤Ｂ
ＡＰＴＡは毒性カルシウム過剰負荷から細胞を保護し、生理学的カルシウム応答
を変更させる(Intracelllular calcium chelator BAPTA protects cells agains
t toxic calcium overload but also alter physiological calium responses)
」，Ｃｅｌｌ Ｃａｌｃｉｕｍ，２１，４５３−４５９（１９９７））。
【０００６】 今回、細胞内カルシウムをカルシウム結合試薬で緩衝すると、高処理能スクリ
ーニング評価に実際適用し得る方法でカルシウムシグナリング応答が遅延及び／
または延長され得ることを知見した。
【０００７】 （発明の要旨） 本発明は、細胞質での２価陽イオン（特に、カルシウム）蓄積により誘因され
るシグナル発生の反応速度を変化させるために細胞内キレート剤を使用する評価
を提供する。前記評価においてキレート剤を使用すると、シグナルを遅延且つ延
長させることができ、よって検出時に液体を同時に取り扱う必要なくシグナルを
自動化装置を用いて検出することができる。
【０００８】 本発明の一態様は、活性時に細胞へのカルシウム流入を誘導する受容体を有す
る細胞を細胞内カルシウムキレート剤と接触させる高処理能評価である。好まし
い実施態様において、キレート剤は１，２−ビス（ｏ−アミノフェノキシ）エタ
ン−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラ酢酸テトラ（アセトキシメチル）エステル（Ｂ
ＡＰＴＡ−ＡＭ）である。特定の実施態様において、細胞はエクオリンベースも
しくは蛍光染料ベース、または緑色蛍光タンパク質−カルモジュリンキメラベー
スのシグナル発生系をも含む。好ましい実施態様において、前記評価は微量滴定
プレートフォーマットで実施され、各穴のシグナルを検出するための装置が使用
される。
【０００９】 「約」は特定した値よりも１０〜２０％の範囲内で多いまたは少ないことを意
味する。
【００１０】 本明細書中、「作動薬」は受容体と相互作用し、受容体の活性を刺激する化合
物または分子である。
【００１１】 本明細書中、「拮抗薬」は受容体と相互作用し、受容体の活性化を阻害または
干渉する化合物である。
【００１２】 本明細書中、「阻害剤」は受容体と相互作用し、受容体の活性化を阻害または
防止する化合物である。
【００１３】 本明細書で引用した文献はすべて援用により参考資料として本明細書に含まれ
るとする。
【００１４】 （図面の簡単な説明） 図１は、アポエクオリンと同時発現させたイオンチャネルを用いる評価におけ
る細胞内キレート剤添加時のカルシウム依存性発光の反応速度を示す。
【００１５】 図２は、アポエクオリンと同時発現させたイオンチャネルを用いる評価におけ
る細胞内キレート剤での細胞に基づく機能発光評価の概略図を表す。
【００１６】 図３は、アポエクオリンと同時発現させたイオンチャネルを用いる評価におけ
る細胞内キレート剤の添加時の発光の反応速度に対する受容体拮抗薬の影響を示
す。
【００１７】 図４は、アポエクオリンと同時発現させたＧＰＣＲを用いる評価における細胞
内カルシウムキレート剤の正または負の反応速度を示す。
【００１８】 図５は、イオンチャネルを用いる評価における細胞内キレート剤の添加時のカ
ルシウム依存性蛍光の反応速度を表す。
【００１９】 図６は、ｆｌｕｏ−３蛍光を用いて測定してＢＡＰＴＡがＶＲ１細胞における
カルシウム応答を遅延させることを示す。ＶＲ１細胞を９６穴評価プレートにお
いて一晩培養後、「材料及び方法」に記載した指定濃度のＢＡＰＴＡ−ＡＭの非
存在または存在下で５μＭのｆｌｕｏ−ＡＭを３０分間充填した。細胞を洗浄し
、ＰＢＳまたは２０μＭのカプサゼピンを３０分間添加した。次いで、プレート
をＶＩＰＲ蛍光検出器（励起４８０ｎｍ、放出５３５ｎｍ；Ｇｏｎｚａｌｅｚ，
Ｊ．Ｅ．，Ｏａｄｅｓ，Ｋ．，Ｌｅｙｃｈｉｓ，Ｙ．，Ｈａｒｏｏｔｕｎｉａｎ
，Ａ．及びＮｅｇｕｌｅｓｃｕ，Ｐ．，「イオンチャネル標的をスクリーニング
するための細胞ベースの評価及び機器(Cell-based assays and instrumentation
for screening ion-channel targets)」，Ｄｒｕｇ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ Ｔ
ｏｄａｙ，４，４３１−４３９（１９９９））を用いて読んだ。８秒間測定後０
．５μＭ（Ａ）または０．１μＭ（Ｂ）のカプサイシンを添加し、全部で１８０
秒間測定し続けた。データは１Ｈｚで獲得し、すべてのデータを初期基線蛍光（
２〜５秒）に対して正規化した。示したデータは４つの同一穴からの平均である
。
【００２０】 図７は、エクオリン発光により測定してＢＡＰＴＡがＶＲ１細胞におけるカル
シウム応答を遅延させることを示す。ＶＲ１をアポエクオリンをも発現するＨＥ
Ｋ−２９３細胞に安定的に発現させた。細胞を９６穴評価プレートにおいて一晩
培養後、アポエクオリンをエクオリンに変換させるために細胞を基質のセレンテ
ラジン（５μＭ）と２時間インキュベートした。細胞をＰＢＳで洗浄した後、指
定濃度のＢＡＰＴＡ−ＡＭと３０分間インキュベートした。ＰＢＳ洗浄後、細胞
にＰＢＳまたは５０μＭのカプサゼピンを３０分間以上かけて添加した。次いで
、プレートをＷＡＬＬＡＣ ＭＩＣＲＯＢＥＴＡ ＪＥＴルミノメーターを用い
て読んだ。（Ａ）データは５０ｎＭのカプサイシンを添加後１Ｈｚで獲得した。
データは６個の個別穴の平均である。（Ｂ）別の実験で、指定ＢＡＰＴＡ−ＡＭ
濃度とインキュベートした後に発光のピークが生じた時間（６回の測定の平均）
をＷＡＬＬＡＣ ＭＩＣＲＯＢＥＴＡ ＪＥＴにより添加したカプサイシンの濃
度に対してプロットした。
【００２１】 図８は、蛍光及び発光の両方により測定してＢＡＰＴＡがｈＧＨＳＲ１におけ
るカルシウム応答を遅延させることを示す。ｈＧＨＳＲ１Ａを発現する細胞を９
６穴評価プレートにおいて一晩培養後、前記細胞に（Ａ）図２に示すように７０
分間かけて５μＭのｆｌｕｏ−４−ＡＭまたは（Ｂ）図３に示すように５μＭの
セレンテラジンを充填した。細胞をＰＢＳで洗浄した後、指定濃度のＢＡＰＴＡ
−ＡＭと３０分間インキュベートした。細胞を再びＰＢＳで洗浄した後、場合に
より１０μＭのＬ−７５６，８６７と３０分間インキュベートした。（Ａ）１０
０ｎＭのゲレリン（ｇｈｒｅｌｉｎ）を添加後のＶＩＰＲ（励起４８０ｎｍ、放
出５３５ｎｍ）での蛍光応答。データを初期基線蛍光（２〜５秒）に対して正規
化し、Ｌ−７５６，８６７の非存在下または存在下での１２または４穴の平均を
示す。（Ｂ）１００ｎＭのゲレリンを添加後ＷＡＬＬＡＣ ＭＩＣＲＯＢＥＴＡ
ＪＥＴで測定したエクオリン発光。データは６穴の平均であり、各１秒測定に
ついて異なるスケールでの２０μＭのＢＡＰＴＡ−ＡＭデータを標準偏差と共に
示す。
【００２２】 図９は、ｆｌｕｏ−４蛍光により測定してＢＡＰＴＡはＨＥＫ−ＡＥＱ細胞に
おいてカルシウム応答を遅延させることを示す。ＨＥＫ−ＡＥＱ細胞は細胞内ス
トアからのカルシウムのＩｎｓＰ３媒介放出に結合する内因性ｍＡＣｈＲを有し
ている。（Ａ）細胞を９６穴評価プレートにおいて一晩培養後、５μＭのｆｌｕ
ｏ−４−ＡＭ±指定濃度のＢＡＰＴＡ−ＡＭと６０分間インキュベートした。細
胞をＰＢＳで洗浄し、ＰＢＳまたは５０μＭのアトロピンを１５分間添加した。
次いで、８秒後１０μＭのムスカリンを添加したプレートをＶＩＰＲ蛍光検出器
（励起４８０ｎｍ、放出５３５ｎｍ）で読んだ。データは１Ｈｚで獲得し、すべ
てのデータは初期基線蛍光（２〜５秒）に対して正規化した。ラインは６個の個
別穴の平均を表す。（Ｂ）（Ａ）と同一であるが、すべての穴を３μＭのＢＡＰ
ＴＡ−ＡＭ及び指定濃度のアトロピンとインキュベートした。１０μＭのムスカ
リンを添加する前に、ＶＩＰＲで各穴の蛍光を５秒間読んだ。蛍光シグナルの安
定性を調べるために、プレートをムスカリンを添加後ＶＩＰＲで更に５秒間読む
前５分間遅延した。ポイントは８個の個別の穴で記録した蛍光の変化の平均及び
標準偏差を表す。
【００２３】 図１０は、ゲレリンまたはカプサイシンを添加してから２分後に測定した発光
の抑制を示す。細胞は、図３に示すようにＷＡＬＬＡＣ ＭＩＣＲＯＢＥＴＡ
ＪＥＴで測定する発光用に作成した。図中、白三角はＢＡＰＴＡ−ＡＭなし、白
丸は３μＭのＢＡＰＴＡ−ＡＭ、白四角は１０μＭのＢＡＰＴＡ−ＡＭを表す。
（Ａ）ｈＧＨＳＲ１Ａ細胞を指定濃度のＬ−７５６，８６７とインキュベートし
た。（Ｂ）ＶＲ１細胞を指定濃度のカプサゼピンとインキュベートした。（Ａ）
ゲレリン（１００ｎＭ）または０．５μＭのカプサイシン（Ｂ）を手動で６個の
穴に添加し、２分後発光を１０秒間測定した。各ポイントは１〜１０測定の平均
及び標準偏差である。
【００２４】 （発明の詳細説明） 本発明は、細胞への２価陽イオン（特に、カルシウム）流入により誘因される
シグナル発生の反応速度を変更させるために細胞内キレート剤を使用する評価を
提供する。前記評価において細胞内キレート剤を使用すると、シグナルを遅延且
つ延長させることができ、よって検出時に液体を同時に取り扱わずにシグナルを
自動化装置により検出し得る。
【００２５】 本発明は一般的に、特定受容体、酵素または反応が直接阻害されず、遊離カル
シウムのレベルを変化させることによりシグナル発生の反応速度のみが変化する
ため、蛍光、発光または他の検出技術であろうとカルシウムの細胞内レベルを測
定のために適用可能である。ＢＡＰＴＡやＥＧＴＡのような特定カルシウムキレ
ート剤は細胞外及び細胞内カルシウムレベルを緩衝するために広く使用されてき
たが、本発明はカルシウム感受性リポーター（タンパク質、酵素または化学物質
）の反応速度を変更させるために細胞内キレート剤を使用する。その結果、シグ
ナルは遅延且つ延長される。加えて、本発明は生物学的活性を有する化合物に対
する高処理能スクリーニング及び全細胞機能評価に特に適用される。
【００２６】 最も一般的な前提として、細胞内カルシウムを迅速に結合、封鎖し得るタイプ
のタンパク質または化合物を使用することができる。本発明に記載の評価におい
て試験し、その結果をＢＡＰＴＡ−ＡＭを用いて実施した評価と比較することに
より特定のカルシウム結合試薬が適当かどうか調べることができる。
【００２７】 本発明は、細胞浸透性カルシウムキレート剤、例えばＢＡＰＴＡ−ＡＭ、１，
２−ビス（ｏ−アミノフェノキシ）エタン−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラ酢酸テ
トラ（アセトキシメチル）エステルの細胞カルシウムレベルの変化を調節するた
めの使用を包含する。この方法は、細胞カルシウムの急速且つ一過性変化を測定
することにより生物学的活性を有する化合物をスクリーニングするために適用し
得る。その例には、細胞カルシウム濃度の変化を引き出すカルシウムイオンチャ
ネルまたはＧタンパク質結合受容体（ＧＰＣＲ）に対する受容体作動薬または拮
抗薬の評価が含まれる。カルシウムキレート剤ＢＡＰＴＡ−ＡＭを細胞に添加す
ると、カルシウム応答が緩衝され、細胞内リポーター（例えば、カルシウム感受
性生物発光エクオリンタンパク質または蛍光タンパク質）または合成プローブ（
例えば、蛍光カルシウム染料のＦｕｒａ ２、Ｆｕｒｏ ３、Ｑｕｉｎ ２、Ｉ
ｎｄｏ １等）を用いて測定したカルシウムシグナルの反応速度が変化する。
【００２８】 ＢＡＰＴＡ−ＡＭのような細胞内カルシウムキレート剤（１〜５０ｕＭ）を細
胞に添加すると、受容体の刺激は影響されないが、リポーターより発生したシグ
ナルはキレート化により遊離カルシウム濃度が緩衝されるため遅延する。結果と
して、カルシウム依存性シグナル（例えば、発光または蛍光変化）が数秒遅延し
、シグナルが数分間延長する。カルシウムシグナリングに対する多くの機能評価
は即時及び一過性（刺激の数秒以内に完了）であるために「フラッシュ」評価と
称されているが、ＢＡＰＴＡ−ＡＭのような遅延試薬を添加すると液体を同時に
取り扱うことなくシグナルを機器により読みとることができる。
【００２９】 ＢＡＰＴＡによるカルシウムキレート化がエクオリン発光を遅延し得るモデル
は図２を参照して検討し得る。刺激前にカルシウムキレート剤ＢＡＰＴＡを細胞
に充填するためにＢＡＰＴＡ−ＡＭを使用する。カプサイシンがＶＲ１受容体に
結合したときに生ずるような細胞内カルシウムの増加により、エクオリンはセレ
ンテラジンをセレンテラミドに酸化し、同時に光子が放出される。ＢＡＰＴＡの
ようなカルシウムキレート剤がエクオリンより迅速に遊離カルシウムを結合する
ならば発光が防止され得る。その後、相対結合率により、エクオリン（または他
のカルシウム感受性リポーター）対ＢＡＰＴＡに結合するカルシウムの量が決定
される。結合率の差は、固有の会合率、カルシウムの遊離濃度、有効なＢＡＰＴ
Ａ及びエクオリンのような多くの因子に依存し得る。ＢＡＰＴＡはカルシウムに
対する親和性よりも少なくとも１０倍の濃度で細胞に充填され得るので、細胞内
カルシウム流入をキレート化する能力は、遊離カルシウム濃度ではなく細胞質内
で達成される遊離ＢＡＰＴＡ濃度により決定されるであろう。遊離ＢＡＰＴＡは
カルシウムと結合するようになるので、カルシウム流入により主にエクオリン発
光が生ずる。ＶＲ１受容体の不活化及び細胞内での他のカルシウム緩衝は最終的
にカルシウム流入を遅くする。その後、カルシウムが休止レベルに戻るかまたは
エクオリンが消耗するまでＢＡＰＴＡ及び他の細胞緩衝能力によりカルシウムは
細胞の細胞質にゆっくり放出されるので、発光は延長し得る。
【００３０】 本発明は、細胞浸透性カルシウムキレート剤（例えば、ＢＡＰＴＡ−ＡＭ）を
使用してカルシウム感受性リポーターで測定したカルシウム応答を遅延するプロ
トコルを提供する。このプロトコルは蛍光及び発光カルシウム感受性リポーター
の両方に対して有用である。例えば、エクオリン発現細胞系中のリガンドゲート
カルシウムチャネルの活性化により生ずるカルシウムシグナルは数秒遅延し、総
シグナル出力を大きく低下させることなく応答はＢＡＰＴＡで数分間延長させる
ことができる。これは、従来注入及びシグナルの測定を同時に実施する機器を必
要とした急速且つ一過性カルシウムシグナルが他の機器のホストにより実施され
得ることを意味する。本発明の方法は、有利にはカルシウムイオンチャネル及び
Ｇタンパク質結合受容体の両方の全細胞機能評価に対して適用され得る。いずれ
の場合も、蛍光または発光シグナルの遅延は、外部液体ハンドリングシステムに
より複数の穴へ作動薬を同時に添加し、その後蛍光または発光イメージングシス
テム（例えば、ＰＥ ＢＩＯＳＹＳＴＥＭＳ ＭＯＲＴＨＳＴＡＲ（商標）ＨＴ
Ａワークステーション）へ急速移動させるために十分である。
【００３１】 グロー発光評価は本質的に感受性が高く及び長いシグナルが長いために、高処
理能スクリーニング分野で利用されてきた。ルシフェラーゼやβ−ガラクトシダ
ーゼリポーター遺伝子のような化学発光またはアルカリホスファターゼ結合体の
シグナルは多くの場合数時間安定である。フラッシュ発光評価はグロー評価より
も主要なスクリーニング用には適しておらず、第２のスクリーニング用に用いら
れている。しかしながら、高処理能スクリーニングフォーマットで実施し得る全
細胞機能評価において大規模な化学ライブラリーの活性を評価する必要がますま
す高くなっている。
【００３２】 フラッシュ発光をベースとする機能評価の例は、生物発光タンパク質のエクオ
リンを含む細胞におけるカルシウムシグナリング経路の測定である（Ｂｕｔｔｏ
ｎ，Ｄ．及びＢｒｏｗｎｓｔｅｉｎ，Ｍ．，「Ｃａ２＋動態の表示のために使用
したエクオリン発現哺乳動物細胞系(Aequorin-expressing mammalian cell line
s used to report Ca2+ mobilization)」，Ｃｅｌｌ Ｃａｌｃｉｕｍ，１４，
６６３−６７１（１９９３））。エクオリンは、セレンテラジンの酸化時に発光
（４６６ｎｍ）するカルシウム依存性酵素である。通常、Ｇタンパク質結合受容
体（ＣＰＣＲ）またはリガンドゲートカルシウムチャネルに対するエクオリンベ
ースの機能細胞評価は、細胞内ストアまたは外部カルシウムの摂取からカルシウ
ムの細胞内濃度を増加させる作動薬を添加することにより開始する。細胞内カル
シウム濃度の増加は、エクオリンとその基質の反応を開始し、よって急速に発光
シグナルを与える。このフラッシュ発光応答の反応速度を図１に示すが、リガン
ドゲートカルシウムチャネルまたはＧＰＣＲの活性化に対する発光シグナルはた
った数秒で最大レベルに達し、１分未満で完結する。従って、このシグナルの検
出は作動薬の添加と同時になされなればならない。評価を微量滴定プレートで実
施する場合には、液体注入及びサンプル検出を同時に実施し得るルミノメーター
が必要となる。
【００３３】 液体分配とシグナル検出を同時に実施するという要件により、ＨＴＳスクリー
ンにおけるカルシウム一過性応答測定の用途が狭まる。カルシウム反応速度を遅
延させるためにキレート剤を使用する本発明の主たる作用効果は、高価な機器な
しにＨＴＳ機能評価を実施し得ることである。ＦＬＩＰＲ（ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ
ＤＥＶＩＣＥＳ）（Ｓｕｌｌｉｖａｎ，Ｅ．，Ｔｕｃｋｅｒ，Ｅ．Ｍ．及びＤ
ａｌｅ，Ｉ．Ｌ．，「蛍光イメージングプレートリーダー（ＦＬＩＰＲ）を用い
る［Ｃａ２＋］の測定(Mearuement of [Ca2+] using the fluorometric imaging
plate reader (FLIPR))，Ｃａｌｃｉｕｍ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ Ｐｒｏｔｏｃ
ｏｌｓ，１１４，１２５−１３３（１９９９）」の導入に伴って、液体添加と同
時に９６穴及び３８４穴からの蛍光を記録することが可能であるが、これは通常
受け入れがたい高価な器具である。現在のところ、発光を測定するための同等の
装置はない。
【００３４】 ＷＡＬＬＡＣ ＶＩＣＴＯＲ２（１穴）、ＭＩＣＲＯＢＥＴＡ（登録商標）Ｊ
ＥＴ（６穴）またはＡＵＲＯＲＡ ＶＩＰＲ（８穴）のような１個以上の穴に液
体を同時に注入し得る発光及び蛍光検出器は幾つか市販されている。通常、前記
機器はフラッシュ発光または蛍光モード（１分／穴）で９６穴プレートを読みと
るのに１２〜９６分を要する。これは、多くの高処理能スクリーニングにとって
かなり長い。別の方法では、すべてのサンプル穴に誘発剤／作動薬を同時に注入
し、カルシウム応答をＦＬＩＰＲまたはＦＬＩＰＲ−３８４機器においてカルシ
ウム感受性蛍光染料により読みとる方法と同様にしてＣＣＤカメラで撮影するこ
とにより全プレートの発光を測定する。液体の取り扱いを含む他の発光または蛍
光イメージングシステムは、ＡＭＥＲＳＨＡＭの第２世代ＬＥＡＤＳＥＥＫＥＲ
、ＷＡＬＬＡＣ ＶＩＥＷＬＵＸ（商標）ｕｌｔｒａＨＴＳマイクロプレートイ
メージャー及びＭＯＬＥＣＵＬＡＲ ＤＥＶＩＣＥＳ ＣＬＩＰＲイメージャー
のような他の業者から期待されている。
【００３５】 最近、ＰＥ ＢＩＯＳＹＳＴＥＭＳ ＴＲＯＰＩＸはＣＣＤベースのルミノメ
ーター、ＮＯＲＴＨＳＴＡＲ（商標）ＨＴＳワークステーションを導入した。こ
の機器は同時に液体を分配できないが、外部の８または１６ヘッド分配器を用い
て９６穴または３８４穴に液体を迅速に分配することができ、その後全プレート
を撮影するＣＣＤカメラにプレートを迅速に移送することができる。液体をプレ
ートに分配し、ブレートをリーダーに移送する時間は合わせて１０秒以上であり
、５〜１０秒で完了する多くのフラッシュ評価にとって長すぎる。液体ハンドリ
ングシステムを検出システムに組み込むと、液体分配とプレート移送の間にどう
しても１０秒以上の処理時間が必要と予想される。本発明は、ＮＯＲＴＨＳＴＡ
Ｒ（商標）ＨＴＳワークステーションのような同時に液体を分配する機器を用い
なくても、細胞内カルシウムキレート化剤はカルシウムシグナリング応答を機器
により測定するのに十分遅延及び／または延長させるのに有用であることを立証
する。
【００３６】 本発明の有効性を、リガンドゲートカルシウムチャネルに対するモデルエクオ
リンベースの機能細胞評価で立証している。この評価では、当該受容体及びアポ
エクオリンを同時に発現するＨＥＫ２９３細胞をＢＩＯＣＯＡＴポリ−Ｄ−リシ
ンの不透明白色９６穴微量滴定プレート（ＢＥＣＴＯＮ ＤＩＣＫＩＮＳＯＮ）
において密集培養させた。細胞を標準増殖培地で維持した。細胞に、５％ ＣＯ ２ の加湿インキュベーターにおいて３７℃で５ｕＭのセレンテラジンｈ（オレゴ
ン州ユージーンに所在のＭＯＬＥＣＵＬＡＲ ＰＲＯＢＥＳ）を補充した増殖培
地を充填した。次いで、充填した細胞を洗浄し、評価緩衝液を充填した。
【００３７】 作動薬を添加すると、急速且つ一過性発光シグナルが発生し、１０〜１５秒以
内に完了する（図１）。作動薬を充填細胞を収容している穴に直接注入するＷＡ
ＬＬＡＣ ＭＩＣＲＯＢＥＴＡ ＪＥＴ機器を用いてフラッシュ発光シグナルの
反応速度を追跡した。緩衝試薬として、細胞浸透性アセトキシメチルエステルＢ
ＡＰＴＡ−ＡＭを使用した。ＢＡＰＴＡはカルシウムを迅速に結合、放出する特
異的カルシウムキレート剤である。ＢＡＰＴＡ−ＡＭの細胞への添加は、細胞に
セレンテラジンを充填中にキレート剤を配合してもその後増殖培地において３７
℃、５％ ＣＯ２で１時間インキュベートしても等しく有効であった。この評価
の概略を図２に示す。
【００３８】 漸増レベルのＢＡＰＴＡ−ＡＭ（０〜３０ｕＭ）を添加すると、作動薬の注入
時に最初エクオリンベースの発光シグナルが遅延し、このシグナルが３０秒以上
延長した（図１）。公知の受容体作動薬を添加すると、シグナルが完全にブロッ
クされ得た（図３）。その後溶解緩衝液（０．１％ トリトンＸ１００）を添加
すると、シグナルの低下により受容体媒介カルシウムシグナルの拮抗薬による競
合的ブロックが起こり得ることが立証された。エクオリン応答の反応速度はＢＡ
ＰＴＡで緩衝することにより変化したが、全体のシグナルは殆ど抑制されなかっ
た。
【００３９】 カルシウムシグナリングのための遅延試薬の一般的有用性を立証するために、
キレート剤の１例としてＢＡＰＴＡ−ＡＭをＧタンパク質結合受容体（ＧＰＣＲ
）に対する機能エクオリンベースの細胞評価において試験した。リガンドゲート
カルシウムイオンチャネルの場合のように、当該ＧＰＣＲ及びアポエクオリンを
同時発現するＨＥＫ細胞をポリ−Ｄ−リシン被覆プレートで密集培養し、細胞に
セレンテラジンを充填した。ＢＡＰＴＡ−ＡＭを添加すると、Ｇタンパク質経路
による細胞内ストアからのカルシウムの放出による作動薬での刺激後カルシウム
シグナルの反応速度が変更した（図４）。カルシウムイオンチャネルを発現する
ＨＥＫ−２９３細胞への作動薬の添加時に細胞内カルシウム濃度を検出するため
にカルシウム感受性染料（Ｆｌｕｏ ３、Ｆｌｕｏ ４、Ｆｌｕｏ ５）の蛍光
をエクオリン応答から発生した発光の代わりに使用したときに遅延試薬の一般的
用途が立証された。
【００４０】 細胞におけるカルシウムシグナリングを緩衝する際に細胞内キレート剤を用い
る可能性を立証するためにＢＡＰＴＡ−ＡＭを選択したが、他のカルシウム結合
試薬も有用であり得る。これらには、ｆｕｒａ−２または他の蛍光染料のような
他の構造的に関連したキレート剤、ジアゾ−２のような光活性化キレート剤及び
その細胞浸透性誘導体が含まれる。或いは、構成的遅延試薬としてＢＡＰＴＡの
代わりにカルシウム結合タンパク質、例えば改質エクオリンまたはカルモジュリ
ン−ＧＦＰキメラを使用し得る（Ｔｓｉｅｎ，Ｒ．Ｙ．，「マンガン及びプロト
ンに対して高い選択性を有する新規なカルシウムインジケーター及び緩衝剤：表
現型構造物の設計、合成及び特性(New calcium indicators and buffers with h
igh selectivity against magnesium and protons: design, synthesis, and pr
operties of prototype structures)」，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，１９，２
３９６−２４０４（１９８０）；Ｇｏｎｚａｌｅｚ，Ｊ．Ｅ．，Ｏａｄｅｓ，Ｋ
．，Ｌｅｙｃｈｉｓ，Ｙ．，Ｈａｒｏｏｔｕｎｉａｎ，Ａ．及びＮｅｇｕｌｅｓ
ｃｕ，Ｐ．，「イオンチャネル標的をスクリーニングするための細胞ベースの評
価及び機器(Cell-based assays and instrumentation for screening ion-chann
el targets)」，Ｄｒｕｇ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ Ｔｏｄａｙ，４，４３１−４
３９（１９９９）；Ｕｎｇｒｉｎ，Ｍ．Ｄ．，Ｓｉｎｇｈ，Ｌ．Ｍ．Ｒ．，Ｓｔ
ｏｃｃｏ，Ｒ．，Ｓａｓ，Ｄ．Ｅ．，Ａｂｒａｍｏｖｉｔｚ，Ｍ．，「Ｇタンパ
ク質結合受容体に対する自動エクオリン発光ベースの機能カルシウム評価(An au
tomated aequorin luminescence-based functional calcium assay for G-prote
in coupled receptors)」，Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，２７２，３４−４２
（１９９９））。
【００４１】 多数の試薬がエクオリンベースの機能評価に対する遅延試薬として有用であり
得る。当業者は本明細書に記載の評価において特定試薬を試し、結果をＢＡＰＴ
Ａ−ＡＭを用いて得た結果と比較する必要がある。前記試薬はエクオリンベース
の生物発光リポーター評価由来だけでなく、一般的にカルシウムシグナリングを
用いる機能評価のための遅延試薬として有用でもあり得る。
【００４２】 特異的受容体拮抗薬の添加により観察されるカルシウム一過性応答の反応速度
も影響され得ることも注目されたい。幾つかの用途として、機能評価の反応速度
を変化させるためには拮抗薬を使用すれば十分であり得る。実際、フラッシュ蛍
光及び発光を「グロー」フォーマットまで延長させる幾つかの市販品が導入され
ている。ＰＡＣＫＡＲＤ ＬＵＣＬＩＴＥ（登録商標）評価キットは、発光シグ
ナルの反応速度を数分から数時間に遅延させるために特定のルシフェラーゼ阻害
剤を利用する評価方法の例である。
【００４３】 評価 本発明の評価は、化合物を生物学的活性または受容体への結合についてスクリ
ーニングする分野で通常公知の多くのフォーマットで設計され得る。本発明の評
価は、有利には２価陽イオンの蓄積により誘因されるシグナル発生の反応速度を
緩衝する２価陽イオンの細胞内キレート剤の能力を活用し得る。
【００４４】 有利には、本発明は慣用のプレートリーダーにより読みとることができるよう
にシグナルを延長させるためにカルシウムチャネルやＧＰＣＲのようなカルシウ
ムシグナリングに対する全細胞機能評価及び高処理能スクリーニング評価で使用
される。本発明は、通常カルシウムチャネル、またはカルシウムチャネルに結合
する受容体またはイオンチャネルに対する全細胞機能評価に適用され得る。例え
ば、本発明は電圧ゲートカルシウムチャネルに結合する受容体の評価に適用する
ことできる。しかしながら、本明細書の記載を簡潔とするために、一般的にカル
シウムチャネルまたは受容体について説明する。
【００４５】 遅延試薬は、細胞におけるカルシウムシグナリングを調べる必要があるが注入
及び急速な一過性シグナルの測定を同時に実施する機器を持っていない当業者が
使用し得る。本発明の評価で提供される遅延は、９６穴、３８４穴、３４５６穴
または他のプレートフォーマットを使用する全細胞機能評価の高処理能スクリー
ニングのために特に有用である。カルシウム誘因シグナル発生の遅延により、前
記プレート密度に対応し易いので長時間かけて試薬を添加し、プレートを取り扱
える。機能リードアウトを与える評価において細胞内キレート剤を使用すること
ができ、反応速度平衡を確立しなければならない場合には、遅延によりもたらさ
れる追加の時間により他の試薬の添加やサンプルの移動のような細胞の別の操作
を実施することができる。
【００４６】 本発明は、受容体ポリペプチドと特異的に相互作用する化合物の同定方法を包
含する。受容体と相互作用する化合物は受容体の活性を刺激または阻害し得る。
受容体に対して親和性を有する化合物の結合特異性は、受容体ポリペプチドを発
現する組み換え細胞由来の膜に対する化合物の親和性を測定することにより調べ
ることができる。受容体ポリペプチドの発現及び受容体に結合するかまたは受容
体の活性化を阻害する化合物のスクリーニングにより、受容体に対して親和性を
有する化合物の迅速選択のための有効な方法が提供される。
【００４７】 従って、本発明は、受容体作動薬、拮抗薬及び阻害剤である化合物を同定し得
る評価を包含する。本発明の評価方法は、本評価が細胞を細胞内キレート剤と接
触させる少なくとも１つのステップを含むので従来技術の方法とは異なる。
【００４８】 本発明は、当業界で公知の評価フォーマットに広く適用可能である。有利には
、本発明は、検出時に液体を同時に取り扱う必要なく細胞由来の蛍光または発光
シグナルを検出するための機器の使用を提供する。リガンド、作動薬及び拮抗薬
を同定するための一般的な方法及び評価フォーマットは当業界で公知であり、評
価前または評価中に細胞内キレート剤と接触する細胞において発現させた受容体
の作動薬及び拮抗薬を同定するように改変し得る。所与の方法におけるステップ
の順序は評価業界の当業者が認識しているように変更されるかまたは同時に実施
され得る。下記は本発明の評価を実施するために使用可能な各種フォーマットの
サンプリングである。
【００４９】 本発明で有用な細胞はカルシウム感受性リポーター系を含む。幾つかの実施態
様では、安定的に組み込んだ遺伝子からリポーター系を発現するように細胞を工
学処理する。或いは、細胞にカルシウム感受性リポーターをコードする核酸を一
過性にトランスフェクトしてもよい。最も一般的には、リポーター系は細胞で発
現するタンパク質、例えばアポエクオリンまたは緑色蛍光タンパク質−カルモジ
ュリンキメラから構成されている。しかしながら、感受性であり、カルシウムに
応答してシグナルを発生する多タンパク質系または多ポリペプチドアセンブリが
使用可能であると考えられる。或いは、本明細書に記載されているカルシウム感
受性染料を含めた非タンパク質有機化合物を使用してもよい。細胞膜浸透性染料
が好ましい。細胞を誘導体化エステルまたはアミドと接触させることにより染料
を細胞内部に捕捉することができる。染料を摂取後、前記アミドまたはエステル
は分裂して、染料部分は細胞内に捕捉される（Ｔｓｉｅｎ，Ｒ．Ｙ．，「カルシ
ウム緩衝液及び指示薬を細胞に充填するための非破壊方法(A non-disruptive te
chnique for loading calcium buffers and indicators into cells)」，Ｎａｔ
ｕｒｅ，２９０．５２７−５２８（１９８１））。
【００５０】 従って、本発明はアポエクオリンまたは緑色蛍光タンパク質−カルモジュリン
キメラのようなカルシウム感受性リポーターを含む細胞を用いて候補化合物が受
容体の阻害剤であるかどうかを調べる方法を包含し、その方法は、 （ａ）細胞に受容体ポリペプチドをコードする発現ベクターをトランスフェクト
し、 （ｂ）トランスフェクトした細胞を、受容体を細胞において発現させるのに十分
な時間培養し、 （ｃ）細胞をカルシウムの細胞内キレート剤に曝し、 （ｄ）細胞を化合物の存在または非存在下で受容体の活性化剤に曝し、 （ｅ）細胞で発生したシグナルを測定し、 （ｆ）化合物の存在下及び非存在下でのシグナルの量を比較する ことを含み、化合物の存在下でシグナルの量が低下していれば該化合物が受容体
の活性化の阻害剤であることを指す。
【００５１】 従って、本発明はアポエクオリンまたは緑色蛍光タンパク質−カルモジュリン
キメラのようなカルシウム感受性リポーターを含む細胞を用いて候補化合物が受
容体の作動薬であるかどうかを調べる方法を包含し、その方法は、 （ａ）細胞に受容体ポリペプチドをコードする発現ベクターをトランスフェクト
し、 （ｂ）トランスフェクトした細胞を、受容体を細胞において発現させるのに十分
な時間培養し、 （ｃ）細胞をカルシウムの細胞内キレート剤に曝し、 （ｄ）細胞を試験化合物に曝し、 （ｅ）細胞で発生したシグナルを測定し、 （ｆ）化合物の存在下及び非存在下でのシグナルの量を比較し、 を含み、シグナルの増加が公知作動薬と類似していれば該化合物が受容体の作動
薬であることを指す。シグナルの増加が緩衝剤コントロールよりも多いが公知の
作動薬よりも少ないときには化合物が部分作動薬であることを指す。
【００５２】 方法のステップ（ｄ）を実施する条件はタンパク質−リガンド相互作用の研究
に関する業界で通常使用されている条件、例えば生理学的ｐＨ、ＰＢＳのような
慣用されている緩衝液または組織培養培地で表されるような塩条件、約４〜約５
５℃の温度である。このステップでは、受容体及び候補化合物を細胞に対して逐
次または同時に適用し得る。好ましくは、候補化合物をまず適用するかまたは化
合物及び受容体を同時に適用する。
【００５３】 上記した一般的な評価の別の実施態様では、細胞は内因性カルシウム感受性リ
ポーター系を含まず、評価を実施する目的で前記系を一過性にトランスフェクト
する。この実施態様は、評価で使用したい受容体を内因的に発現するかまたは安
定的にトランスフェクトした細胞を用いる場合に有用である。別の実施態様では
、内因性カルシウム感受性リポーター系の代わりにＦｌｕｏ−３のようなカルシ
ウム感受性蛍光染料を使用する。この実施態様では、（ｂ）と（ｃ）の間に細胞
を１〜１０μＭのＦｌｕｏ−３ ＡＭ（すなわち、Ｆｌｕｏ−３の膜パーマネン
トエステル）とインキュベートする別のステップを加える。一般的な評価フォー
マットに対する更なる実施態様では、ステップ（ａ）及び（ｂ）を省略し、その
代わりに受容体ポリペプチドを安定的に発現する細胞から始める。
【００５４】 上記方法の更なる修飾として、受容体をコードするＲＮＡを例えばバクテリオ
ファージＴ７プロモーターのコントロール下で受容体含有プラスミドを用いるイ
ンビトロ転写により作成し、前記ＲＮＡをアフリカツメガエル卵母細胞に微量注
入して卵母細胞において受容体を発現させる。次いで、卵母細胞を細胞内キレー
ト剤に曝す。次いで、受容体への結合または卵母細胞で発現した受容体の活性阻
害について化合物を調べる。本発明のすべての評価と同様に、細胞を細胞内キレ
ート剤に曝すステップを評価に加える。
【００５５】 上記した全細胞方法は、化合物が受容体と相互作用し得るかどうかを評価した
い評価において使用され得る。
【００５６】 実施例１ 細胞系及び培養条件 リガンドゲートカルシウムイオンチャネルまたはＧＰＣＲを発現する安定なク
ローン細胞系を発生させるためにアポエクオリンを発現する母ＨＥＫ２９３細胞
系（２９３ＡＥＱ１７細胞）を使用した（Ｂｕｔｔｏｎ，Ｄ．及びＢｒｏｗｎｓ
ｔｅｉｎ，Ｍ．，「Ｃａ２＋動態を表示のために使用するエクオリン発現哺乳動
物細胞系(Aequorin-expressing mammalian cell lines used to report Ca2+ mo
bilization)」，Ｃｅｌｌ Ｃａｌｃｉｕｍ，１４，６６３−６７１（１９９３
））。イオンチャネル２９３ＡＥＱ１７細胞を、ＤＭＥＭ（ＧＩＢＣＯＢＲＬ，
高グルコース，Ｌ−グルタミン＋１１０ｍｇ／Ｌ ピルビン酸ナトリウム＋ピリ
ドキシンＨＣｌ含有）、２５ｍＭのＨＥＰＥＳ（ＧＩＢＣＯＢＲＬ、１Ｍストッ
ク）、０．５ｍｇ／ｍｌのジェネティシン（ＧＩＢＣＯＢＲＬ，５０ｍｇ／ｍｌ
ストック）、１μｇ／ｍｌのピューロマイシン（ＣＬＯＮＴＥＣＨ）及び１０％
ウシ胎児血清（Ｇｅｍｉｎｉ Ｂｉｏ−Ｐｒｏｄｕｃｔｓ、熱不活化）を含む
増殖培地において３７℃、５％ ＣＯ２で維持した。ＧＰＣＲ ２９３ＡＥＱ１
７細胞を、ＤＭＥＭ（ＧＩＢＣＯＢＲＬ，高グルコース，Ｌ−グルタミン＋１１
０ｍｇ／Ｌ ピルビン酸ナトリウム＋ピリドキシンＨＣｌ含有）、２５ｍＭ Ｈ
ＥＰＥＳ、０．５ｍｇ／ｍｌのジェネティシン、０．２ｍｇ／ｍｌのハイグロマ
イシン（ＢＯＥＨＲＩＮＧＥＲ ＭＡＮＨＥＩＭ）及び１０％ ウシ胎児血清（
上記したＨＹＣＬＯＮＥ）を含む増殖培地において３７℃、５％ ＣＯ２で維持
した。
【００５７】 細胞の平板培養及び充填： 細胞を組織培養フラスコ（Ｔ−２２５，Ｃｏｒｎｉｎｇ）において密集培養さ
せ、トリプシン処理（トリプシン／ＥＤＴＡ，ＧＩＢＣＯＢＲＬ）により回収し
た。細胞を９６穴の白色不透明または透明底部を有するＢＩＯＣＯＡＴポリ−Ｄ
−リシンプレート（マサチューセッツ州ベッドフォードに所在のＢＥＣＴＯＮ
ＤＩＣＫＩＮＳＯＮ）の増殖培地に分配し（約１×１０５細胞／０．２ｍｌ／穴
）、５％ ＣＯ２の加湿インキュベータにおいて３７℃で一晩インキュベートし
た。細胞にセレンテラジンを充填するために、増殖培地をＴＩＴＥＲＴＥＫ細胞
洗浄装置を用いて吸引除去した後、５μＭのセレンテラジンｈ（オレゴン州ユー
ジーンに所在のＭＯＬＥＣＵＬＡＲ ＰＲＯＢＥＳ）を補充した増殖培地（０．
１％ ウシ胎児血清及び０．１５ｍＭ 還元グルタチオンを含むＤＭＥＭ培地）
を添加した。幾つかの実験では、他のセレンテラジンアナログを指定したように
充填緩衝液において置換した。細胞を更に５％ ＣＯ２の加湿インキュベータに
おいて充填緩衝剤中３７℃で２時間インキュベートした。次いで、培地を除去し
、細胞を０〜３０ｕＭの１，２−ビス（ｏ−アミノフェノキシ）エタン−Ｎ，Ｎ
，Ｎ’，Ｎ’−テトラ酢酸テトラ（アセトキシメチル）エステル（ＢＡＰＴＡ−
ＡＭ，ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ ＰＲＯＢＥＳ）及び０．０２％ Ｐｌｕｒｏｎｉｃ
Ｆ−１２７溶液（ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ ＰＲＯＢＥＳ）を補充した、１０ｍＭ
のＨＥＰＥＳ及び２ｍｇ／ｍｌのグルコース添加のカルシウム＋マグネシウム含
有ダルベッコリン酸緩衝食塩液（ＰＢＳ，ＧＩＢＣＯＢＲＬ）で洗浄し、５％
ＣＯ２の加湿インキュベーターにおいて３７℃で１時間インキュベートした。或
いは、細胞に同時にセレンテラジンｈ及びＢＡＰＴＡ−ＡＭを５％ ＣＯ２の加
湿インキュベーターにおいて３７℃で２時間充填した。次いで、細胞を洗浄し、
１０ｍＭのＨＥＰＥＳ及び２ｍｇ／ｍｌのグルコースを補充したＰＢＳ（９０μ
ｌ）を充填した。拮抗薬またはＤＭＳＯコントロールを穴に添加した（１０μｌ
，１％ ＤＭＳＯ最終）。
【００５８】 エクオリンベースの発光の可能性がある緩衝または遅延をリガンドゲートカル
シウムチャネルに対する機能細胞評価において評価した。低レベルのＢＡＰＴＡ
を用いると、低レベルの拮抗薬を添加したときに見られた全蓄積光が有意に抑制
されることなく作動薬の添加時に発光シグナルの反応速度を変化させることがで
きたと知見された（図１〜４）。
【００５９】 実施例２ ＶＲ１細胞を用いる蛍光の測定 細胞系及び培養条件： ラットＶＲ１カプサイシン受容体を発現する安定なクローン細胞系を発生させ
るためにアポエクオリンを発現する親ＨＥＫ２９３細胞系（２９３ＡＥＱ１７細
胞）を使用した（Ｃａｔｅｒｉｎａ，Ｍ．Ｊ．，Ｓｃｈｕｍａｃｈｅｒ，Ｍ．Ａ
．，Ｔｏｍｉｎａｇａ，Ｍ．，Ｒｏｓｅｎ，Ｔ．Ａ．，Ｌｅｖｉｎｅ，Ｊ．Ｄ．
及びＪｕｌｉｕｓ，Ｄ．，「カプサイシン受容体：痛み経路における熱活性化イ
オンチャネル(The capsaicin receptor: a heat-activated ion channel in the
pain pathway)」，Ｎａｔｕｒｅ，３８９，８１６−８２４（１９９７））。Ｖ
Ｒ１ ２９３ＡＥＱ１７を、ＤＭＥＭ（ＧＩＢＣＯＢＲＬ，高グルコース，Ｌ−
グルタミン＋１１０ｍｇ／ｍｌ ピルビン酸ナトリウム＋ピリドキシンＨＣｌ含
有）、２５ｍＭのＨＥＰＥＳ（ＧＩＢＣＯＢＲＬ，１Ｍストック）、０．５ｍｇ
／ｍｌのジェネティシン（ＧＩＢＣＯＢＲＬ，５０ｍｇ／ｍｌストック）、１μ
ｇ／ｍｌのピューロマイシン（ＣＬＯＮＴＥＣＨ）及び１０％ ウシ胎児血清（
ＧＥＭＩＮＩ ＢＩＯ−ＰＲＯＤＵＣＴＳ、熱不活化）を含む増殖培地において
３７℃、１０％ ＣＯ２で維持した。
【００６０】 評価用細胞の調製： 細胞を組織培養フラスコ（Ｔ−２２５，ＣＯＲＮＩＮＧ）において８０〜９５
％密集培養させ、トリプシン処理（トリプシン／ＥＤＴＡ，ＧＩＢＣＯＢＲＬ）
により収集した。細胞を９６穴の黒色透明底部を有するＢＩＯＣＯＡＴポリ−Ｄ
−リシンプレート（マサチューセッツ州ベッドフォードに所在のＢＥＣＴＯＮ
ＤＩＣＫＥＮＳＯＮ）の増殖培地に分配し（約１×１０５細胞／０．２ｍｌ／穴
）、１０％ ＣＯ２の加湿インキュベータにおいて３７℃で一晩インキュベート
した。細胞を強化ＰＢＳ（ダルベッコＰＢＳ（ＧＩＢＣＯＢＲＬ ＃１４０４０
−１１７），１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ，２ｇ／Ｌ グルコース；ｐＨ７．２）（２
００μｌ）で１回洗浄した後、０．０２％ ｐｌｕｒｏｎｉｃ Ｆ−１２７（Ｍ
ＯＬＥＣＵＬＡＲ ＰＲＯＢＥＳ ＃Ｐ−３０００）を含有する強化ＰＢＳ中場
合により１，２−ビス（ｏ−アミノフェノキシ）エタン−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−
テトラ酢酸テトラ（アセトキシメチル）エステル（ＢＡＰＴＡ−ＡＭ，ＭＯＬＥ
ＣＵＬＡＲ ＰＲＯＢＥＳ ＃Ｂ１２０５）を存在させて５μＭのｆｌｕｏ−３
−ＡＭ（ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ ＰＲＯＢＥＳ ＃Ｆ１２４１）（１００μｌ）と
３０〜７０分間インキュベートした。穴を強化ＰＢＳ（１００μｌ）で２回洗浄
し、その後場合により作動薬を含む強化ＰＢＳ（１００μｌ）を１５〜３０分間
添加した後、ＡＵＲＯＲＡ蛍光プレートリーダーＶＩＰＲ（励起４８０ｎｍ，放
出５３５ｎｍ）で評価した。ｆｌｕｏ−３染色後薬物添加前の別ステップとして
ＢＡＰＴＡ−ＡＭを３０分間インキュベートすることができ、この間シグナルの
顕著な違いは認められなかった。指定濃度のカプサイシン（ＳＩＧＭＡ ＃Ｍ２
０２８）（１００μｌ）を添加することによりカルシウム応答を開始させた。１
０秒間ベースラインを記録した後（強化ＰＢＳ １００μｌ中の）作動薬を添加
するためにＶＩＰＲ器具を使用し、蛍光を最長３００秒間測定した。
【００６１】 ｆｌｕｏ−３染料を用い、ＶＲ１発現細胞にＶＲ１作動薬のカプサイシン（０
．５ｕＭ）を添加後の応答の反応速度をＶＩＰＲ蛍光プレートリーダー（図５及
び６Ａ）を用いて検出して細胞内カルシウムの変化を調べた。ＢＡＰＴＡの非存
在下では、応答は約２０秒でピークに達し、約１５０秒で５０％に減衰した。こ
の応答は、ＶＲ１の選択的競合拮抗薬である２０μＭのカプサゼピンにより完全
にブロックされた。細胞を３μＭのＢＡＰＴＡ−ＡＭと３０秒間インキュベート
すると、蛍光シグナルが遅延し、ピークは約４０秒であったが、ｆｌｕｏ−３シ
グナルの減衰時間（≠１５０秒）は影響を受けなかった。しかしながら、ＢＡＰ
ＴＡ−ＡＭの濃度を１０μＭ及び３０μＭに増加すると、ピーク応答時間が最長
１００秒まで遅延し、持続蛍光シグナルはこの時間スケール（３分）で有意な減
衰を示さなかった。ＢＡＰＴＭ−ＡＭの非存在下でも３分後蛍光は部分的にしか
減衰しなかったたことは注目に値し、この減衰の理由の一部はｆｌｕｏ−３の光
漂白にあると見られる。
【００６２】 作動薬の活性化及びＢＡＰＴＡによるカルシウムキレート化の程度の適正なバ
ランスを使用することが重要であった。従って、滴定実験は適正なパラメーター
を確立するために有用である。予想されたように、低作動薬濃度を使用すると（
図６Ｂ、０．１μＭ カプサイシン）、蛍光応答は低下し、より迅速に減衰した
。この低い作動薬濃度では、３μＭのＢＡＰＴＡはピークまたは減衰反応速度ま
での時間に大きな影響を与えることなくピークシグナルを低下させた。３０μＭ
のキレート剤では、安定なカルシウムシグナルが作動薬の非存在下で２０μＭの
カプサゼピンの存在と比較してわずかだけ大きい。この小さい蛍光シグナルは３
０〜１８０秒間維持され、拮抗薬でブロックしたときの蛍光シグナルの減衰に比
較して容易に識別し得る表示を与える。
【００６３】 実施例３ 成長ホルモン分泌促進剤受容体１ａを発現する細胞を用いる蛍光の測定 細胞系及び培養条件： ヒト成長ホルモン分泌促進剤受容体タイプ１ａ（ｈＧＨＳＲ１Ａ，Ｓｍｉｔｈ
，Ｒ．Ｇ．，Ｇｒｉｆｆｉｎ，Ｐ．Ｒ．，Ｘｕ，Ｙ．，Ｓｍｉｔｈ，Ａ．Ｇ．Ａ
．，Ｌｉｕ，Ｋ．，Ｇａｌａｃａｙ，Ｊ．，Ｆｅｉｇｈｎｅｒ，Ｓ．Ｄ．，Ｐｏ
ｎｇ，Ｃ．Ｓ．，Ｌｅｏｎｇ，Ｄ．，Ｐｏｍｅｓ，Ａ．，Ｃｈｅｎｇ，Ａ．，Ｖ
ａｎ ｄｅｒ Ｐｌｏｅｇ，Ｌ．Ｈ．Ｔ．，Ｈｏｗａｒｄ，Ａ．Ｄ．，Ｓｃｈａ
ｅｆｆｅｒ，Ｊ．及びＬｅｏｎａｒｄ，Ｒ．Ｊ．，「アデノシン：成長ホルモン
分泌促進剤受容体の部分作動薬(Adenosine: A partial agonist of the growth
hormone secretagogue receptor)」），Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅ
ｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．，２７６，１３０６−１３１３（２０００）；Ｂｅｄｎａｒ
ｅｋ，Ｍ．Ａ．，Ｆｅｉｇｈｎｅｒ，Ｓ．Ｃ．，Ｐｏｎｇ，Ｓ．Ｓ．，ＭｃＫｅ
ｅ，Ｋ．Ｋ．，Ｈｒｅｎｉｕｋ，Ｄ．Ｌ．，Ｓｉｌｖａ，Ｍ．Ｖ．，Ｗａｒｒｅ
ｎ，Ｖ．Ａ．，Ｈｏｗａｒｄ，Ａ．Ｄ．，Ｖａｎ ｄｅｒ Ｐｌｏｅｇ，Ｌ．Ｈ
．Ｙ．及びＨｅｃｋ，Ｊ．Ｖ．，「新しい成長ホルモン放出ペプチドのゲレリン
に関する構造−機能研究：成長ホルモン分泌促進剤受容体１ａの活性化に必要な
ゲレリンの最終配列(Structure-function studies on the new growth hormone-
releasing peptide,ghrelin: Minimal sequence of ghrelin necessary for act
ivation of growth hormone secretagogue receptor 1a)」，Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈ
ｅｍ．，４３，４３７０−４３７６（２０００））を発現する安定なクローン細
胞系を発生させるためにアポエクオリンを発現する親ＨＥＫ２９３細胞系（２９
３ＡＥＱ１７細胞）を使用した。ｈＧＨＳＲ１Ａ及び親２９３ＡＥＱ１７細胞を
、ＤＭＥＭ（ＧＩＢＣＯＢＲＬ，高グルコース，Ｌ−グルタミン＋１１０ｍｇ／
ｍｌ ピルビン酸ナトリウム＋ピリドキシンＨＣｌ含有）、２５ｍＭのＨＥＰＥ
Ｓ（ＧＩＢＣＯＢＲＬ，１Ｍストック）、０．５ｍｇ／ｍｌのジェネティシン（
ＧＩＢＣＯＢＲＬ，５０ｍｇ／ｍｌストック）、０．２ｍｇ／ｍｌのハイグロマ
イシン（ＢＯＥＨＲＩＮＧＥＲ ＭＡＮＮＨＥＩＭ）及び１０％ ウシ胎児血清
（上記のＨＹＣＯＮＥ）を含む増殖培地において３７℃、１０％ ＣＯ２で維持
した。
【００６４】 評価用細胞の調製： 細胞を組織培養フラスコ（Ｔ−２２５，Ｃｏｒｎｉｎｇ）において８０〜９５
％密集培養し、トリプシン処理（トリプシン／ＥＤＴＡ，ＧＩＢＣＯＢＲＬ）に
より収集した。細胞を９６穴の黒色透明底部を有するＢＩＯＣＯＡＴポリ−Ｄ−
リシンプレート（マサチューセッツ州ベッドフォードに所在のＢＥＣＴＯＮ Ｄ
ＩＣＫＥＮＳＯＮ）の増殖培地に分配し（約１×１０５細胞／０．２ｍｌ／穴）
、１０％ ＣＯ２の加湿インキュベータにおいて３７℃で一晩インキュベートし
た。細胞を強化ＰＢＳ（ダルベッコＰＢＳ（ＧＩＢＣＯＢＲＬ ＃１４０４０−
１１７），１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ，２ｇ／Ｌ グルコース；ｐＨ７．２）（２０
０μｌ）で１回洗浄した後、０．０２％ ｐｌｕｒｏｎｉｃ Ｆ−１２７（ＭＯ
ＬＥＣＵＬＡＲ ＰＲＯＢＥＳ ＃Ｐ−３０００）を含有する強化ＰＢＳ中場合
により１，２−ビス（ｏ−アミノフェノキシ）エタン−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テ
トラ酢酸テトラ（アセトキシメチル）エステル（ＢＡＰＴＡ−ＡＭ，ＭＯＬＥＣ
ＵＬＡＲ ＰＲＯＢＥＳ ＃Ｂ１２０５）を存在させて５μＭのｆｌｕｏ−４−
ＡＭ（＃Ｆ１４２０２）（１００μｌ）と３０〜７０分間インキュベートした。
穴を強化ＰＢＳ（１００μｌ）で２回洗浄し、その後場合により拮抗薬を含む強
化ＰＢＳ（１００μｌ）を１５〜３０分間添加した後、ＡＵＲＯＲＡ蛍光プレー
トリーダーＶＩＰＲ（励起４８０ｎｍ，放出５３５ｎｍ）で評価した。指定濃度
のゲレリン（ＰＨＯＥＮＩＸ ＰＨＡＲＭＡＣＥＵＴＩＣＡＬＳ ＃０３１０３
１）（１００μｌ）を添加することによりカルシウム応答を開始させた。１０秒
間ベースラインを記録した後（強化ＰＢＳ １００μｌ中の）作動薬を添加する
ためにＶＩＰＲ器具を使用し、蛍光を最長３００秒間測定した。
【００６５】 ｈＧＨＳＲ１ａ作動薬のゲレリン（１００μＭ）により活性化し、ｆｌｕｏ−
４でモニターしたカルシウム一過性応答をＶＩＰＲを用いて測定した（図８Ａ）
。ゲレリン誘発カルシウム応答は公知のＧＨＳＲ作動薬のＬ−７５６，８６７に
より抑制された。ｈＧＨＳＲ１ａを活性化すると、蛍光が迅速に増加し、約１５
秒で最高に達し、約１００秒でベースラインまで完全に減衰した。ＢＡＰＴＡ（
３０μＭ ＢＡＰＴＡ−ＡＭ）を添加すると、ピーク蛍光応答が１５秒から１５
０秒に遅延し、蛍光シグナルは最長５分間安定であった。
【００６６】 実施例４ ムスカリン作用性アセチルコリン受容体を発現する細胞を用いる蛍光の測定 細胞系及び培養条件： アポエクオリンを発現する親ＨＥＫ２９３細胞系（２９３ＡＥＱ１７細胞）を
、ＤＭＥＭ（ＧＩＢＣＯＢＲＬ，高グルコース，Ｌ−グルタミン＋１１０ｍｇ／
ｍｌ ピルビン酸ナトリウム＋ピリドキシンＨＣｌ含有）、２５ｍＭのＨＥＰＥ
Ｓ（ＧＩＢＣＯＢＲＬ，１Ｍストック）、０．５ｍｇ／ｍｌのジェネティシン（
ＧＩＢＣＯＢＲＬ，５０ｍｇ／ｍｌストック）及び１０％ ウシ胎児血清（ＧＥ
ＭＩＮＩ ＢＩＯ−ＰＲＯＤＵＣＴＳ、熱不活化）を含む増殖培地において３７
℃、１０％ ＣＯ２で維持した。
【００６７】 評価用細胞の調製： 細胞を組織培養フラスコ（Ｔ−２２５，Ｃｏｒｎｉｎｇ）において８０〜９５
％密集培養し、トリプシン処理（トリプシン／ＥＤＴＡ，ＧＩＢＣＯＢＲＬ）に
より収集した。細胞を９６穴の黒色透明底部を有するＢＩＯＣＯＡＴポリ−Ｄ−
リシンプレート（マサチューセッツ州ベッドフォードに所在のＢＥＣＴＯＮ Ｄ
ＩＣＫＥＮＳＯＮ）の増殖培地に分配し（約１×１０５細胞／０．２ｍｌ／穴）
、１０％ ＣＯ２の加湿インキュベータにおいて３７℃で一晩インキュベートし
た。細胞を強化ＰＢＳ（ダルベッコＰＢＳ（ＧＩＢＣＯＢＲＬ ＃１４０４０−
１１７），１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ，２ｇ／Ｌ グルコース；ｐＨ７．２）（２０
０μｌ）で１回洗浄した後、０．０２％ ｐｌｕｒｏｎｉｃ Ｆ−１２７（ＭＯ
ＬＥＣＵＬＡＲ ＰＲＯＢＥＳ ＃Ｐ−３０００）を含有する強化ＰＢＳ中場合
により１，２−ビス（ｏ−アミノフェノキシ）エタン−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テ
トラ酢酸テトラ（アセトキシメチル）エステル（ＢＡＰＴＡ−ＡＭ，ＭＯＬＥＣ
ＵＬＡＲ ＰＲＯＢＥＳ ＃Ｂ１２０５）を存在させて５μＭのｆｌｕｏ−４−
ＡＭ（ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ ＰＲＯＢＥＳ ＃Ｆ１４２０２）（１００μｌ）と
３０〜７０分間インキュベートした。穴を強化ＰＢＳ（１００μｌ）で２回洗浄
し、その後場合により拮抗薬を含む強化ＰＢＳ（１００μｌ）を１５〜３０分間
で添加した後、ＡＵＲＯＲＡ蛍光プレートリーダーＶＩＰＲ（励起４８０ｎｍ，
放出５３５ｎｍ）で評価した。指定濃度の（±）−ムスカリン（ＳＩＧＭＡ ＃
Ｍ０４０５）（１００μｌ）を添加することによりカルシウム応答を開始させた
。１０秒間ベースラインを記録した後（強化ＰＢＳ １００μｌ中の）作動薬を
添加するためにＶＩＰＲ器具を使用し、蛍光を最長３００秒間測定した。
【００６８】 ムシモールは、ＨＥＫ−ＡＥＱ１７細胞において内因性ムスカリン作用性受容
体（Ｍｏｒｉｙａ，Ｈ．，Ｔａｋａｇｉ，Ｙ．，Ｎａｋａｎｉｓｈｉ，Ｔ．，Ｈ
ａｙａｓｈｉ，Ｍ．，Ｔａｎｉ，Ｔ．及びＨｉｒｏｔｓｕ，Ｉ．，「ラット心臓
及び顎下腺におけるクローン化ヒトムスカリン作用性アセチルコリン受容体（Ｍ
ＡＣＨＲ）サブタイプ及びＭＡＣＧＲＳに対する各種ムスカリン作用性拮抗薬の
アファニティープロフィール(Affinity profiles of various muscarinic antag
onists for cloned human muscarinic acetylcholine receptor (MACHR) subtyp
es and MACHRS in rat hear and submandibular gland)」，Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅ
ｎｃｅｓ，２５，２３５１−２３５８（１９９９）；Ｃａｕｌｆｉｅｌｄ，Ｍ．
Ｐ．，「ムスカリン受容体−特性付け、カップリング及び機能(Muscarinic rece
ptors- characterization, coupling and function)」，Ｐｈａｒｍａｃ．Ｔｈ
ｅｒ．，５８，３１９−３７９（１９９３））を刺激し、ＶＩＰＲを用いてｆｌ
ｕｏ−４で測定したときロバストな蛍光シグナルを与えた。このカルシウム一過
性応答の反応速度は、ＶＲ１またはｈＧＨＳＲ１カルシウム一過性応答について
測定したものとは異なっていた。ムシモール（１０μＭ）で活性化すると、急速
に一過性応答が生じ、その後応答は緩慢であった（図９Ａ）。急速な一過性応答
はＢＡＰＴＡに対して非常に感受性が高く、低レベルのキレート剤（３μＭ Ｂ
ＡＰＴＡ−ＡＭ）により消失したが、蛍光シグナルはこうした条件下でも検出さ
れ得、少なくとも３分間安定であった。より高いＢＡＰＴＡ濃度（１０μＭ Ｂ
ＡＰＴＡ−ＡＭ）では、蛍光の上昇は非常に緩慢で、３分後でも安定しなかった
。
【００６９】 実施例５ ＶＲ１を発現する細胞を用いる発光の測定 細胞系及び培養条件： ラットＶＲ１カプサイシン受容体を発現する安定なクローン細胞系を発生させ
るためにアポエクオリンを発現する親ＨＥＫ２９３細胞系（２９３ＡＥＱ１７細
胞）を使用した。ＶＲ１ ２９３ＡＥＱ１７を、ＤＭＥＭ（ＧＩＢＣＯＢＲＬ，
高グルコース，Ｌ−グルタミン＋１１０ｍｇ／ｍｌ ピルビン酸ナトリウム＋ピ
リドキシンＨＣｌ含有）、２５ｍＭのＨＥＰＥＳ（ＧＩＢＣＯＢＲＬ，１Ｍスト
ック）、０．５ｍｇ／ｍｌのジェネティシン（ＧＩＢＣＯＢＲＬ，５０ｍｇ／ｍ
ｌストック）、１μｇ／ｍｌのピューロマイシン（ＣＬＯＮＴＥＣＨ）及び１０
％ ウシ胎児血清（ＧＥＭＩＮＩ ＢＩＯ−ＰＲＯＤＵＣＴＳ、熱不活化）を含
む増殖培地において３７℃、１０％ ＣＯ２で維持した。
【００７０】 評価用細胞の調製： 細胞を組織培養フラスコ（Ｔ−２２５，Ｃｏｒｎｉｎｇ）において８０〜９５
％密集培養し、トリプシン処理（トリプシン／ＥＤＴＡ，ＧＩＢＣＯＢＲＬ）に
より回収した。細胞を９６穴の白色透明底部を有するＢＩＯＣＯＡＴポリ−Ｄ−
リシンプレート（マサチューセッツ州ベッドフォードに所在のＢＥＣＴＯＮ Ｄ
ＩＣＫＥＮＳＯＮ）の増殖培地に分配し（約１×１０５細胞／０．２ｍｌ／穴）
、１０％ ＣＯ２の加湿インキュベータにおいて３７℃で一晩インキュベートし
た。増殖培地を除去し、細胞を充填緩衝液（ＤＭＥＭ ＧＩＢＣＯＢＲＬ ＃１
２３２０−０３２；０．１％ ＦＢＳ ＧＥＭＩＮＩ ＢＩＯ−ＰＲＯＤＵＣＴ
Ｓ，Ｉｎｃ．，＃１００−１０７；５μＭ セレンテラジンｈ；３０μＭ 還元
グルタチオン）（７５μｌ）と３７℃、１０％ ＣＯ２で２時間インキュベート
することによりエクオリン基質のセレンテラジンｈ（ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ ＰＲ
ＯＢＥＳ，＃Ｃ−６７８０）を充填した。次いで、充填緩衝液を除去し、細胞を
強化ＰＢＳ（ｐＨ７．２）（１００μｌ）で２回洗浄した後０〜３０μＭのＢＡ
ＰＴＡ−ＡＭを補充した強化ＰＢＳ（１００μｌ）と３７℃、１０％ ＣＯ２で
３０〜１２０分間インキュベートした。次いで、細胞を洗浄し、場合により指定
の拮抗薬を含む強化ＰＢＳ（１００μｌ）を充填した。ＷＡＬＬＡＣ ＭＩＣＲ
ＯＢＥＴＡ ＪＥＴにより穴に指定濃度のカプサイシン（ＳＩＧＭＡ ＃２０２
８）（１００μｌ）を添加することによりカルシウム応答を開始させた。より不
変の反応速度を得るために、Ｊｅｔは１回の測定あたり６個の穴のみを同時に測
定するように設定した。
【００７１】 ＶＲ１の活性時のエクオリンフラッシュ発光応答は、ｆｌｕｏ−３蛍光シグナ
ルほど細胞内ＢＡＰＴＡによっては容易に遅延しなかった。上記実験では、フラ
ッシュ発光の反応速度を、試薬を注入すると同時に９６穴の６穴からの発光を記
録するＷＡＬＬＡＣ ＭＩＣＲＯＢＥＴＡ ＪＥＴルミノメーターを用いて追跡
した。カプサイシン（５０ｎＭ）を添加すると、急速且つ一過性発光シグナルが
生じ、ピークレベルは約１０秒で生じ、３０秒以内にほぼ完了した（図７Ａ）。
漸増レベルのＢＡＰＴＡ（０〜３０μＭのＢＡＰＴＡ−ＡＭ）を添加すると、エ
クオリン発光シグナルの開始が段階的に遅延し、１０秒から遅れ、３０秒で最大
応答が生じた。このシグナルは最長３分間延長した。上記実験では、高作動薬濃
度（０．５μＭ）で３０μＭのＢＡＰＴＡ−ＡＭであってもピーク応答が５秒か
ら１０秒に遅延したので低濃度の作動薬を使用することが重要であった（図７Ｂ
）。エクオリン応答の反応速度はＢＡＰＴＡでの緩衝により変更するが、全体の
シグナルは所与濃度での全シグナルが０〜３０μＭのＢＡＰＴＡ−ＡＭを用いて
有意に変化しなかったので殆ど抑制されなかった。
【００７２】 実施例６ 成長ホルモン分泌促進剤受容体１ａを発現する細胞を用いる発光の測定 細胞系及び培養条件： ヒト成長ホルモン分泌促進剤受容体タイプ１ａ（ｈＧＨＳＲ１Ａ）を発現する
安定なクローン細胞系を発生させるためにアポエクオリンを発現する親ＨＥＫ２
９３細胞系（２９３ＡＥＱ１７細胞）を使用した。ｈＧＨＳＲ１Ａ細胞を、ＤＭ
ＥＭ（ＧＩＢＣＯＢＲＬ，高グルコース，Ｌ−グルタミン＋１１０ｍｇ／ｍｌ
ピルビン酸ナトリウム＋ピリドキシンＨＣｌ含有）、２５ｍＭのＨＥＰＥＳ（Ｇ
ＩＢＣＯＢＲＬ，１Ｍストック）、０．５ｍｇ／ｍｌのジェネティシン（ＧＩＢ
ＣＯＢＲＬ，５０ｍｇ／ｍｌストック）、０．２ｍｇ／ｍｌのハイグロマイシン
（ＢＯＥＨＲＩＮＧＥＲ ＭＡＮＨＥＩＭ）及び１０％ ウシ胎児血清（上記Ｈ
ＹＣＬＯＮＥ）を含む増殖培地において３７℃、１０％ ＣＯ２で維持した。
【００７３】 評価用細胞の調製： 細胞を組織培養フラスコ（Ｔ−２２５，Ｃｏｒｎｉｎｇ）において８０〜９５
％密集培養させ、トリプシン処理（トリプシン／ＥＤＴＡ，ＧＩＢＣＯＢＲＬ）
により回収した。細胞を９６穴の白色透明底部を有するＢＩＯＣＯＡＴポリ−Ｄ
−リシンプレート（マサチューセッツ州ベッドフォードに所在のＢＥＣＴＯＮ
ＤＩＣＫＥＮＳＯＮ）の増殖培地に分配し（約１×１０５細胞／０．２ｍｌ／穴
）、１０％ ＣＯ２の加湿インキュベータにおいて３７℃で一晩インキュベート
した。増殖培地を除去し、細胞に充填緩衝液（ＤＭＥＭ ＧＩＢＣＯＢＲＬ ＃
１２３２０−０３２；０．１％ ＦＢＳ ＧＥＭＩＮＩ ＢＩＯ−ＰＲＯＤＵＣ
ＴＳ，Ｉｎｃ．，＃１００−１０７；５μＭ セレンテラジンｈ；３０μＭ 還
元グルタチオン）（７５μｌ）と３７℃、１０％ ＣＯ２で２時間インキュベー
トすることにより細胞にエクオリン基質のセレンテラジンｈ（ＭＯＬＥＣＵＬＡ
Ｒ ＰＲＯＢＥＳ，＃Ｃ−６７８０）を充填した。次いで、充填緩衝液を除去し
、細胞を強化ＰＢＳ（ｐＨ７．２）（１００μｌ）で２回洗浄した後０〜３０μ
ＭのＢＡＰＴＡ−ＡＭを補充した強化ＰＢＳ（１００μｌ）と３７℃、１０％
ＣＯ２で３０〜１２０分間インキュベートした。次いで、細胞を洗浄し、場合に
より指定の拮抗薬を含む強化ＰＢＳ（１００μｌ）を充填した。ＷＡＬＬＡＣ
ＭＩＣＲＯＢＥＴＡ ＪＥＴにより指定濃度のゲレリン（ＰＨＯＥＮＩＸ ＰＨ
ＡＲＭＡＣＥＵＴＩＣＡＬＳ ＃０３１０３１）（１００μｌ）を添加すること
によりカルシウム応答を開始させた。より不変の反応速度を得るために、Ｊｅｔ
は１回の測定あたり６個の穴のみを同時に測定するように設定した。
【００７４】 ｈＧＨＳＲ１ａ作動薬（１００ｎＭ ゲレリン）を添加すると、Ｊｅｔルミノ
メーターで測定したとき発光が急速に増加し、たった３秒でピークに達し、３０
秒後殆どなくなった（図８Ｂ）。対照的に、ＢＡＰＴＡ（３０μＭ ＢＡＰＴＡ
−ＡＭ）を添加すると、発光シグナルはＢＡＰＴＡの非存在下での応答の約５％
に低下したが、最大発光に達する時間は７５秒に遅延した（図８Ｂインサート）
。更に、シグナルの振幅は減少したが、スクリーニング評価で使用し得る作動薬
の存在下及び非存在下でのシグナル間に有意な表示が存在した。
【００７５】 実施例７ ムスカリン作用性アセチルコリン受容体を発現する細胞を用いる発光の手動測定 細胞系及び培養条件： アポエクオリンを発現する親ＨＥＫ２９３細胞系（２９３ＡＥＱ１７細胞）を
、ＤＭＥＭ（ＧＩＢＣＯＢＲＬ，高グルコース，Ｌ−グルタミン＋１１０ｍｇ／
ｍｌ ピルビン酸ナトリウム＋ピリドキシンＨＣｌ含有）、２５ｍＭのＨＥＰＥ
Ｓ（ＧＩＢＣＯＢＲＬ，１Ｍストック）、０．５ｍｇ／ｍｌのジェネティシン（
ＧＩＢＣＯＢＲＬ，５０ｍｇ／ｍｌストック）及び１０％ ウシ胎児血清（ＧＥ
ＭＩＮＩ ＢＩＯ−ＰＲＯＤＵＣＴＳ、熱不活化）を含む増殖培地において３７
℃、１０％ ＣＯ２で維持した。
【００７６】 評価用細胞の調製： 細胞を組織培養フラスコ（Ｔ−２２５，Ｃｏｒｎｉｎｇ）において８０〜９５
％密集培養させ、トリプシン処理（トリプシン／ＥＤＴＡ，ＧＩＢＣＯＢＲＬ）
により収集した。細胞を９６穴の黒色透明底部を有するＢＩＯＣＯＡＴポリ−Ｄ
−リシンプレート（マサチューセッツ州ベッドフォードに所在のＢＥＣＴＯＮ
ＤＩＣＫＥＮＳＯＮ）の増殖培地に分配し（約１×１０５細胞／０．２ｍｌ／穴
）、１０％ ＣＯ２の加湿インキュベータにおいて３７℃で一晩インキュベート
した。細胞を強化ＰＢＳ（ダルベッコＰＢＳ（ＧＩＢＣＯＢＲＬ ＃１４０４０
−１１７），１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ，２ｇ／Ｌ グルコース；ｐＨ７．２）（２
００μｌ）で１回洗浄した後、０．０２％ ｐｌｕｒｏｎｉｃ Ｆ−１２７（Ｍ
ＯＬＥＣＵＬＡＲ ＰＲＯＢＥＳ ＃Ｐ−３０００）を含有する強化ＰＢＳ中場
合により１，２−ビス（ｏ−アミノフェノキシ）エタン−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−
テトラ酢酸テトラ（アセトキシメチル）エステル（ＢＡＰＴＡ−ＡＭ，ＭＯＬＥ
ＣＵＬＡＲ ＰＲＯＢＥＳ ＃Ｂ１２０５）を存在させて５μＭのｆｌｕｏ−４
−ＡＭ（ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ ＰＲＯＢＥＳ ＃Ｆ１４２０２）（１００μｌ）
と３０〜７０分間インキュベートした。穴を強化ＰＢＳ（１００μｌ）で２回洗
浄し、その後場合により拮抗薬を含む強化ＰＢＳ（１００μｌ）を３０分間添加
した後、ＡＵＲＯＲＡ蛍光プレートリーダーＶＩＰＲ（励起４８０ｎｍ，放出５
３５ｎｍ）で評価した。手動デバイスを用いて指定濃度の（±）−ムスカリン（
ＳＩＧＭＡ ＃Ｍ０４０５）（１００μｌ）を添加することによりカルシウム応
答を開始させた。５秒初期蛍光を測定し、その後５分の遅延後別の５秒蛍光応答
を記録するためにＶＩＰＲ器具を使用した。
【００７７】 ＶＩＰＲ及びＪＥＴ器具を用いる反応速度実験により、低レベルの細胞内ＢＡ
ＰＴＡはイオンチャネル及びＧＰＣＲに対する各種機能評価においてカルシウム
応答を遅延、延長させ得ることが立証される。使用するキレート剤及び作動薬の
濃度のバランスを取るために最初実験アプローチを必要とするが、いずれにせよ
有用な蛍光ベースまたはエクオリンベースの評価が延長したカルシウム応答で実
施された。
【００７８】 本発明の有用な用途は、標準の実験プレートリーダーにより蛍光または発光を
測定し得るように十分に一過性カルシウムシグナルを延長させる評価条件を明ら
かにすることである。液体の添加及び記録を同時に実施する上で使用した器具を
置換するためには、作動薬を添加後観察可能なシグナルが数分のオーダーで維持
されなければならない。反応速度実験からの結果に基づいて、９６穴プレートに
作動薬を手動ピペットデバイスを用いて添加でき、その後プレートを適当なリー
ダーに移し、ＨＴＳ評価を実施するのに適したバックグラウンドに比べて安定な
シグナルを維持できるかどうかを試験した。
【００７９】 ＨＥＫ−ＡＥＱ１７細胞のプレートに５μＭのｆｌｕｏ−４及び３μＭのＢＡ
ＰＴＡ−ＡＭを充填した。ＶＩＰＲを用いて初期蛍光測定（５秒）を実施した後
、ムシモール（１０μＭ）をマルチチャネルピペットを用いてプレートに手動で
添加して内因性ムスカリン作用性ＡＣｈＲを活性化した。プレートを５分間イン
キュベートした後、ＶＩＰＲを用いて第２蛍光を測定した（５秒）。ムシモール
で刺激してから５分後でも、蛍光シグナルの明らかな増加が検出された。これら
の条件下で、アトロピンで蛍光シグナルの用量依存性低下が観察された。ＫＩは
０．７ｎＭであり、これはアトロピンに対して予想される効果に類似していた（
図９Ｂ）。
【００８０】 実施例８ ＶＲ１を発現する細胞を用いる発光の手動測定 細胞系及び培養条件： ラットＶＲ１カプサイシン受容体を発現する安定なクローン細胞系を発生させ
るためにアポエクオリンを発現する親ＨＥＫ２９３細胞系（２９３ＡＥＱ１７細
胞）を使用した。ＶＲ１ ２９３ＡＥＱ１７及び親２９３ＡＥＱ１７細胞を、Ｄ
ＭＥＭ（ＧＩＢＣＯＢＲＬ，高グルコース，Ｌ−グルタミン＋１１０ｍｇ／ｍｌ
ピルビン酸ナトリウム＋ピリドキシンＨＣｌ含有）、２５ｍＭのＨＥＰＥＳ（
ＧＩＢＣＯＢＲＬ，１Ｍストック）、０．５ｍｇ／ｍｌのジェネティシン（ＧＩ
ＢＣＯＢＲＬ，５０ｍｇ／ｍｌストック）、１μｇ／ｍｌのピューロマイシン（
ＣＬＯＮＴＥＣＨ）及び１０％ ウシ胎児血清（ＧＥＭＩＮＩ ＢＩＯ−ＰＲＯ
ＤＵＣＴＳ、熱不活化）を含む増殖培地において３７℃、１０％ ＣＯ２で維持
した。
【００８１】 評価用細胞の調製： 細胞を組織培養フラスコ（Ｔ−２２５，Ｃｏｒｎｉｎｇ）において８０〜９５
％密集培養させ、トリプシン処理（トリプシン／ＥＤＴＡ，ＧＩＢＣＯＢＲＬ）
により収集した。細胞を９６穴の白色透明底部を有するＢＩＯＣＯＡＴポリ−Ｄ
−リシンプレート（マサチューセッツ州ベッドフォードに所在のＢＥＣＴＯＮ
ＤＩＣＫＥＮＳＯＮ）の増殖培地に分配し（約１×１０５細胞／０．２ｍｌ／穴
）、１０％ ＣＯ２の加湿インキュベータにおいて３７℃で一晩インキュベート
した。増殖培地を除去し、細胞を充填緩衝液（ＤＭＥＭ ＧＩＢＣＯＢＲＬ ＃
１２３２０−０３２；０．１％ ＦＢＳ ＧＥＭＩＮＩ ＢＩＯ−ＰＲＯＤＵＣ
ＴＳ，Ｉｎｃ．，＃１００−１０７；５μＭ セレンテラジンｈ；３０μＭ 還
元グルタチオン）（７５μｌ）と３７℃、１０％ ＣＯ２で２時間インキュベー
トすることにより細胞にエクオリン基質のセレンテラジンｈ（ＭＯＬＥＣＵＬＡ
Ｒ ＰＲＯＢＥＳ，＃Ｃ−６７８０）を充填した。次いで、充填緩衝液を除去し
、細胞を強化ＰＢＳ（ｐＨ７．２）（１００μｌ）で２回洗浄した後０または１
０μＭのＢＡＰＴＡ−ＡＭを補充した強化ＰＢＳ（１００μｌ）と３７℃、１０
％ ＣＯ２で３０分間インキュベートした。次いで、細胞を洗浄し、場合により
指定の拮抗薬を含む強化ＰＢＳ（１００μｌ）を充填した。手動デバイスを用い
て６穴の適当な組に指定濃度のカプサイシン（ＳＩＧＭＡ ＃２０２８）（１０
０μｌ）を添加することによりカルシウム応答を開始させた。ＷＡＬＬＡＣ Ｍ
ＩＣＲＯＢＥＴＡ ＪＥＴを用いて２分の遅延後１０秒の発光を測定した。
【００８２】 ＶＲ１細胞にセレンテラジンを充填し、場合によりＢＡＰＴＡ−ＡＭで処理し
た後漸増濃度の拮抗薬カプサゼピンとインキュベートした。手動マルチチャネル
ピペットを用いて、ＶＲ１発現細胞を含む９６穴プレートにカプサイシン（０．
５ｕＭ）を添加した（図１０Ｂ）。２分経過後、プレートをＷＡＬＬＡＣ ＭＩ
ＣＲＯＢＥＴＡ ＪＥＴネミノメーターを用いて読んだ。拮抗薬カプサゼピンに
関して、複雑な用量−応答曲線が観察された。発光シグナルは実際作動薬濃度と
共にポイントまで増加したが、より高濃度では完全にブロックされた。この複雑
な用量−応答曲線はＢＡＰＴＡの存在下及び非存在下でも観察された。全体とし
て、ＢＡＰＴＡを添加すると、バックグランドの４倍のシグナルが作動薬での刺
激から２分後に観察され得るように発光が増加した。更に、受容体作動薬はＢＡ
ＰＴＡの存在下で予想される効果を遅延させた。
【００８３】 用量−応答曲線の複雑さをより良く理解するために、ＶＲ１ ＨＥＫ２９３−
ＡＥＱ細胞におけるエクオリン発光の反応速度を漸増濃度の拮抗薬の存在下で試
験した。サブ飽和濃度の拮抗薬それ自はキレート剤の非存在下でのカルシウムシ
グナルを遅延させることが判明した。恐らく、遅延反応速度は受容体に対する作
動薬及び拮抗薬間の競合に起因するであろう。これは、カルシウムのキレート化
のためにＢＡＰＴＡが発光を遅延させるメカニズムとは明確に異なる。メカニズ
ムは異なるが、結果は、公知の拮抗薬はカルシウム一過性応答を遅延させるため
にも使用されるであろうことを示す。しかしながら、細胞内キレート剤の使用は
カルシウムベースの機能評価に対してより全般的に適用させるべきである。
【００８４】 実施例９ 成長ホルモン分泌促進剤受容体１ａを発現する細胞を用いる発光の手動測定 細胞系及び培養条件： ヒト成長ホルモン分泌促進剤受容体タイプ１ａ（ｈＧＨＳＲ１Ａ）を発現する
安定なクローン細胞系を発生させるためにアポエクオリンを発現する親細胞ＨＥ
Ｋ２９３細胞系（２９３ＡＥＱ１７細胞）を使用した。ｈＧＨＳＲ１Ａ細胞をＤ
ＭＥＭ（ＧＩＢＣＯＢＲＬ，高グルコース，Ｌ−グルタミン＋１１０ｍｇ／ｍｌ
ピルビン酸ナトリウム＋ピリドキシンＨＣｌ含有）、２５ｍＭのＨＥＰＥＳ（
ＧＩＢＣＯＢＲＬ，１Ｍストック）、０．５ｍｇ／ｍｌのジェネティシン（ＧＩ
ＢＣＯＢＲＬ，５０ｍｇ／ｍｌストック）、０．２ｍｇ／ｍｌのハイグロマイシ
ン（ＢＯＥＨＲＩＮＧＥＲ ＭＡＮＮＨＥＩＭ）及び１０％ ウシ胎児血清（上
記ＨＹＣＬＯＮＥ）を含む増殖培地において３７℃、１０％ ＣＯ２で維持した
。
【００８５】 評価用細胞の調製： 細胞を組織培養フラスコ（Ｔ−２２５，Ｃｏｒｎｉｎｇ）において８０〜９５
％密集培養させ、トリプシン処理（トリプシン／ＥＤＴＡ，ＧＩＢＣＯＢＲＬ）
により収集した。細胞を９６穴の白色透明底部を有するＢＩＯＣＯＡＴポリ−Ｄ
−リシンプレート（マサチューセッツ州ベッドフォードに所在のＢＥＣＴＯＮ
ＤＩＣＫＥＮＳＯＮ）の増殖培地に分配し（約１×１０５細胞／０．２ｍｌ／穴
）、１０％ ＣＯ２の加湿インキュベータにおいて３７℃で一晩インキュベート
した。増殖培地を除去し、細胞を充填緩衝液（ＤＭＥＭ ＧＩＢＣＯＢＲＬ ＃
１２３２０−０３２；０．１％ ＦＢＳ ＧＥＭＩＮＩ ＢＩＯ−ＰＲＯＤＵＣ
ＴＳ，Ｉｎｃ．，＃１００−１０７；５μＭ セレンテラジンｈ；３０μＭ 還
元グルタチオン）（７５μｌ）と３７℃、１０％ ＣＯ２で２時間インキュベー
トすることにより細胞にエクオリン基質のセレンテラジンｈ（ＭＯＬＥＣＵＬＡ
Ｒ ＰＲＯＢＥＳ，＃Ｃ−６７８０）を充填した。次いで、充填緩衝液を除去し
、細胞を強化ＰＢＳ（ｐＨ７．２）（１００μｌ）で２回洗浄した後、０〜１０
μＭのＢＡＰＴＡ−ＡＭを補充した強化ＰＢＳ（１００μｌ）と３７℃、１０％
ＣＯ２で３０分間インキュベートした。次いで、細胞を洗浄し、場合により指
定の拮抗薬を含む強化ＰＢＳ（１００μｌ）を充填した。手動式デバイスを用い
て指定濃度のゲレリン（Ｐｈｏｅｎｉｘ ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ ＃
０３１０３１）を６穴の適当な組に添加することによりカルシウム応答を開始さ
せた。ＷＡＬＬＡＣ ＭＩＣＲＯＢＥＴＡ ＪＥＴを用いて２分の遅延後１０秒
の発光を測定した。
【００８６】 ｈＧＨＳＲ１ａ細胞にセレンテラジンを充填し、場合によりＢＡＰＴＡ−ＡＭ
で処理した後、漸増濃度の拮抗薬Ｌ−７５６，８６７とインキュベートした（Ｓ
ｍｉｔｈ，Ｒ．Ｇ．，Ｇｒｉｆｆｉｎ，Ｐ．Ｒ．，Ｘｕ，Ｙ．，Ｓｍｉｔｈ，Ａ
．Ｇ．Ａ．，Ｌｉｕ，Ｋ．，Ｃａｌａｃａｙ，Ｊ．，Ｆｅｉｇｈｎｅｒ，Ｓ．Ｄ
．，Ｐｏｎｇ，Ｃ．Ｓ．，Ｌｅｏｎｇ，Ｄ．，Ｐｏｍｅｓ，Ａ．，Ｃｈｅｎｇ．
Ｋ．，Ｖａｎ ｄｅｒ Ｐｌｏｅｇ，Ｌ．Ｈ．Ｔ．，Ｈｏｗａｒｄ，Ａ．Ｄ．，
Ｓｃｈａｅｆｆｅｒ，Ｊ．及びＬｅｏｎａｒｄ，Ｒ．Ｊ．，「アデノシン：成長
ホルモン分泌促進剤受容体の部分的作動薬(Adenosine: A partial agonist of t
he growth hormone secretagogue receptor)」），Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈ
ｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．，２７６，１３０６−１３１３（２０００）；Ｂ
ｅｄｎａｒｅｋ，Ｍ．Ａ．，Ｆｅｉｇｈｎｅｒ，Ｓ．Ｃ．，Ｐｏｎｇ，Ｓ．Ｓ．
，ＭｃＫｅｅ，Ｋ．Ｋ．，Ｈｒｅｎｉｕｋ，Ｄ．Ｌ．，Ｓｉｌｖａ，Ｍ．Ｖ．，
Ｗａｒｒｅｎ，Ｖ．Ａ．，Ｈｏｗａｒｄ，Ａ．Ｄ．，Ｖａｎ ｄｅｒ Ｐｌｏｅ
ｇ，Ｌ．Ｈ．Ｙ．及びＨｅｃｋ，Ｊ．Ｖ．，「新しい成長ホルモン放出ペプチド
のゲレリンに関する構造−機能研究：成長ホルモン分泌促進剤受容体１ａの活性
化に必要なゲレリンの最小配列(Structure-function studies on the new growt
h hormone-releasing peptide,ghrelin: Minimal sequence of ghrelin necessa
ry for activation of growth hormone secretagogue receptor 1a)」，Ｊ．Ｍ
ｅｄ．Ｃｈｅｍ．，４３，４３７０−４３７６（２０００））。手動マルチチャ
ネルピペットを用いて、ｈＧＨＳＲ１ａ細胞を含む９６穴プレートにゲレリン（
１００μＭ）を添加した。２分経過後、プレートをＷＡＬＬＡＣ ＭＩＣＲＯＢ
ＥＴＡ ＪＥＴルミノメーターを用いて読んだ。発光シグナルは実際作動薬濃度
と共にポイントまで増加したが、より高濃度で完全にブロックされた。この複雑
な用量−応答曲線はＢＡＰＴＡの存在下でも非存在下でも観察された。全体とし
て、ＢＡＰＴＡを添加すると、バックグランドの６倍のシグナルが作動薬での刺
激から２分後に観察され得るように発光が増加した。更に、受容体作動薬はＢＡ
ＰＴＡの存在下で予想される効果を遅延させた。
【００８７】 検討 低レベルの細胞内キレート剤ＢＡＰＴＡは、血漿膜イオンチャネル（ＶＲ１）
を介する流入または細胞内ストア（ＩｎｓＰ３ゲートチャネル）からの放出によ
り生じたカルシウム一過性応答の反応速度を遅延させ得る。本明細書に記載され
ている好ましい実施態様では、市販されており、９６穴プレートで培養した細胞
に容易に充填され得るのでカルシウムキレート剤ＢＡＰＴＡの細胞浸透性アセト
キシメチルエステルを使用した。カルシウム結合反応速度及び多くのカルシウム
キレート剤の効果を調べ、迅速である（２〜８×１０８Ｍ−１ｓ−１）が広範囲
に変更可能なオフレート（１００〜１０，０００ｓ−１）及び親和性で結合する
ことが判明した。これらはＦｕｒａ−２のような蛍光カルシウムプローブを含み
、非蛍光キレート剤ＢＡＰＲＡをここで使用した。最も一般的に使用されている
カルシウムキレート剤のＥＤＴＡ及びＥＧＴＡはＢＡＰＴＡに比して非常にゆっ
くり（１００倍）カルシウムに結合し、カルシウムを放出し、ＶＲ−１チャネル
より生成するカルシウムの非常に迅速な変化を遅延させるのにＢＡＰＴＡほど有
効であり得ない。
【００８８】 カルシウム応答は、予想されるように十分に高濃度のＢＡＰＴＡ−ＡＭにより
完全にブロックされ得る。上記データーは、受容体刺激及び細胞内ＢＡＰＴＡ濃
度のバランスをとることが重要であることを立証している。細胞内ＢＡＰＴＡ濃
度は特にインキュベーション時間、温度及び細胞の種類を含めた幾つかの因子に
より決定されるので、使用するＢＡＰＴＡ−ＡＭ濃度を注意深く滴定しなければ
ならない。
【００８９】 文献に記載されている多くの他のカルシウムキレート剤及びカルシウム結合タ
ンパク質はカルシウム感受性リポーターにより測定される応答を遅延する際に使
用し得る。例えば、細胞にＢＡＰＴＡ−ＡＭを充填する必要なくカルシウム結合
タンパク質を発現する安定な細胞系を生成し得る。
【００９０】 本発明の記載の教示に従って、高処理能評価の設計において使用し得るウィン
ドーを効果的に与える適当な濃度を決定するために特定のキレート剤または結合
タンパク質のみを試験しなければならない。例えば細胞内での利用性、カルシウ
ム親和性及びカルシウムの放出率を含めた特性及び蛍光または発光シグナルの遅
延における全性能に基づいて特定のキレート剤または結合タンパク質を選択する
ことができる。
【図面の簡単な説明】
【図１】 アポエクオリンと同時発現させたイオンチャネルを用いる評価における細胞内
キレート剤の添加時のカルシウム依存性発光の反応速度を示す。
【図２】 アポエクオリンと同時発現させたイオンチャネルを用いる評価における細胞内
キレート剤での細胞ベースの機能発光評価の概略図を表す。
【図３】 アポエクオリンと同時発現させたイオンチャネルを用いる評価における細胞内
キレート剤の添加時の発光の反応速度に対する受容体拮抗薬の影響を示す。
【図４】 アポエクオリンと同時発現させたＧＰＣＲを用いる評価における細胞内カルシ
ウムキレート剤の正または負の反応速度を示す。
【図５】 イオンチャネルを用いる評価における細胞内キレート剤の添加時のカルシウム
依存性蛍光の反応速度を表す。
【図６】 ｆｌｕｏ−３蛍光を用いて測定してＢＡＰＴＡがＶＲ１細胞におけるカルシウ
ム応答を遅延させることを示す。
【図７】 エクオリン発光により測定してＢＡＰＴＡがＶＲ１細胞におけるカルシウム応
答を遅延させることを示す。
【図８】 蛍光及び発光の両方により測定してＢＡＰＴＡがｈＧＨＳＲ１におけるカルシ
ウム応答を遅延させることを示す。
【図９】 ｆｌｕｏ−４蛍光により測定してＢＡＰＴＡはＨＥＫ−ＡＥＱ細胞においてカ
ルシウム応答を遅延させることを示す。
【図１０】 ゲレリンまたはカプサイシンの添加２分後に測定した発光抑制を示す。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ，ＴＲ)，ＯＡ(ＢＦ ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ， ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，Ｇ Ｍ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＭＺ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＴＺ ，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ， ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＧ，ＡＬ，ＡＭ， ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，Ｂ Ｚ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＯ，ＣＲ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ ，ＤＫ，ＤＭ，ＤＺ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＤ， ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＮ，Ｉ Ｓ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＡ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ， ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＭＺ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，Ｒ Ｏ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＴＺ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ， ＶＮ，ＹＵ，ＺＡ，ＺＷ (72)発明者 カクゾロウスキー，グレゴリー・ジエイ アメリカ合衆国、ニユー・ジヤージー・ 07065−0907、ローウエイ、イースト・リ ンカーン・アベニユー・126 (72)発明者 ミドルトン，リチヤード・イー アメリカ合衆国、ニユー・ジヤージー・ 07065−0907、ローウエイ、イースト・リ ンカーン・アベニユー・126 Ｆターム(参考） 2G045 AA40 BA13 BB20 CB01 DA36 DB07 FA11 GC15 4B024 AA11 BA63 BA80 CA02 DA02 GA11 HA11 4B063 QA05 QA18 QQ08 QQ13 QQ20 QQ89 QR32 QR48 QR77 QR80 QS36 QS38 QX02

Claims (10)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 候補化合物がタンパク質の作動薬または阻害剤であることを
    カルシウム感受性リポーターを含むを細胞用いて決定する方法であって、 （ａ）前記タンパク質を発現し、カルシウム感受性リポーターを含む細胞を準備
    するステップ、 （ｂ）前記細胞をカルシウムの細胞内キレート剤に曝すステップ、 （ｃ）前記細胞の第１部分を化合物に曝すステップ、 （ｄ）前記第１部分で発生するシグナルを測定するステップ、及び （ｅ）化合物の存在下及び非存在下でのシグナルの量を比較するステップ を含み、化合物の存在下でシグナルの量が増加すれば当該化合物はタンパク質の
    作動薬であり、カルシウム感受性リポーターより発生したシグナルがカルシウム
    の細胞内キレート剤の存在により遅延することを特徴とする前記方法。
  2. 【請求項２】 ステップ（ａ）は、タンパク質を発現させる発現ベクターを
    用いて一過性にトランスフェクトした細胞を準備することを含むことを特徴とす
    る請求の範囲第１項に記載の方法。
  3. 【請求項３】 リポーターがタンパク質であることを特徴とする請求の範囲
    第１項に記載の方法。
  4. 【請求項４】 細胞にリポーターを発現させる発現ベクターを一過性にトラ
    ンスフェクトすることを特徴とする請求の範囲第３項に記載の方法。
  5. 【請求項５】 リポーターを発現させるポリヌクレオチドが細胞のゲノムに
    安定的に組み込まれていることを特徴とする請求の範囲第３項に記載の方法。
  6. 【請求項６】 リポーターがエクオリンであることを特徴とする請求の範囲
    第３項に記載の方法。
  7. 【請求項７】 カルシウム感受性リポーターが有機化合物であることを特徴
    とする請求の範囲第１項に記載の方法。
  8. 【請求項８】 カルシウムの細胞内キレート剤がＢＡＰＴＡ−ＡＭであるこ
    とを特徴とする請求の範囲第１項に記載の方法。
  9. 【請求項９】 タンパク質がＧＰＣＲまたはイオンチャネルであることを特
    徴とする請求の範囲第１項に記載の方法。
  10. 【請求項１０】 タンパク質がカルシウムチャネルに結合する受容体である
    ことを特徴とする請求の範囲第１項に記載の方法。
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