JPH08502265A

JPH08502265A - 生体内で哺乳類動物細胞の傷害を軽減させるための細胞透過性カルシウムバッファーの使用

Info

Publication number: JPH08502265A
Application number: JP6509477A
Authority: JP
Inventors: チヤールトン，ミルトン，ピー; タイミアンスキー，マイケル
Original assignee: チヤールトン，ミルトン，ピー; タイミアンスキー，マイケル
Priority date: 1992-10-20
Filing date: 1993-10-14
Publication date: 1996-03-12
Also published as: US6015834A; AU5282493A; CA2147123C; AU677613B2; CA2147123A1; WO1994008573A1; EP0668760A1

Abstract

(57)【要約】哺乳動物類組織の細胞を生体内で細胞膜透過性カルシウムバッファーで処理することによる哺乳動物類組織の対する傷害の損傷効果の低減方法。この方法は哺乳動物類組織を損傷を減少させるのに有効な量のカルシウムバッファー、好ましくは、BAPTAで処理することからなる。この方法は細胞のイオンチャンネル細孔付近のCa²⁺イオンの濃度を制御することにより、有毒な量のCa²⁺イオンがCa²⁺流入源に近い位置の細胞下部位に拡散するのことを防止するのに使用し得る。このバッファー処理は予防処置として又は哺乳動物類組織に傷害が生じた後に適用し得る。カルシウムバッファーを含有する医薬組成物及びその製造方法が記載されている。

Description

【発明の詳細な説明】生体内で哺乳類動物細胞の傷害を軽減させるための細胞膜透過性カルシウムバッファーの使用発明の技術分野本発明は、細胞膜透過性カルシウムバッファー（calcium buffer）を用いて処理することにより、哺乳類動物細胞に対する傷害（injure）による損傷効果を軽減させる方法、該カルシウムバッファーそれ自体、該カルシウムバッファーを含有してなる医薬組成物及び該医薬組成物の製造方法に関する。発明の背景脳や脊髄に対する虚血性又は外傷性の傷害は、中枢神経系（CNS）ニューロン及びそのプロセスに対して回復し得ない損傷を与える場合が多い。これらの傷害はこれらが頻繁に生じることから、社会にとって大きな問題であり、前記の損傷は過酷である場合が多く、現在では急性のCNS傷害に対する有効な治療法はまだ存在していない。臨床的には、虚血性脳発作又は脊髄の傷害はそれ自体、小さな巣状の欠損（focal defects）から破滅的な全体的機能障害すなわち死までの範囲に及ぶ神経学的能力（capacity）の重大な（acute）低下として現われる。前記欠損（deflict）の最終的な大きさは、初期の物理的な傷害（insult）の性質及び程度によって規定され（dictated）、またさらにニューロン死（neuronal d eath）を引き起こす一連の時間依存性の進展性の２次的現象によって規定されると現在は思われる。すなわち、不確かな期間の理論的タイムウインドウ（time-w indow）が存在し、そこにおいては時間的に適切に干渉すること（intervention ）よって遅延神経毒性を生じる前記の事象を中断させ得るかもしれない。しかしながら、虚血性又は外傷性のニューロン死のプロセスを開始させ（trigger）且つ維持する細胞メカニズムについてはほとんど知られておらず、実用的な予防方法を案出することを困難にしている。従って、脳発作又は脊髄傷害に臨床的に有効な治療法は今のところ無い。生体内（in vio）では、CNS組織潅流における局部的低下（localreduction）は、低酸素性のCNS傷害と外傷性のCNS傷害の両方においてニューロン死に介在する。局部的な灌流低下（hypoperfusion）は通常、局部血管系の物理的破損、脈管血栓症、血管痙攣又は塞栓性の塊によって引き起こされる。その病因にもかかわらず、結果として生じる虚血は、種々の細胞恒常性維持メカニズムに悪影響を及ぼすことによって感受性ニューロンを損傷させるものと思われる。正確な障害の性質は十分に理解されていないが、ニューロン傷害の多数の実験モデルに共通した特徴は、遊離の細胞内カルシウムの濃度（［Ca²⁺］_i）の上昇にある。ニューロンは［Ca²⁺］_iを生理学的な機能に必要な低い濃度（約100nM）に留める多数のメカニズムを有している。持続した［Ca²⁺］_iの上昇は複数の厳密に制御されたCa²⁺依存性プロセスを調節解除し（deregulate）、該プロセスに過度の反応生成物を生成させ、通常的に活動していない酵素経路を活性化させるか又は調節細胞防御メカニズムを不活性化させるものと広く思われる。これは、次々に、細胞の破壊を実験的に観察し得る手段（measures）、例えば脂肪分解、タンパク質分解、細胞骨格の破損、pH変化及びフリーラジカルの生成の産物（creation）をもたらす。 Ca²⁺神経毒性を防止する古典的アプローチは、Ca²⁺チャンネルを通り抜けたCa²⁺ の侵入の薬理学的妨害及び／又は興奮性アミノ酸（EAA）-関門チャンネル（ga ted channel）の薬理学的閉鎖によるものである。この方法の変法は、生体内でE AA-誘発性又は酸素欠乏性の細胞死を少なくする場合が多く、Ca²⁺神経毒性仮説を信じさせる。しかしながら、種々のCa²⁺チャンネルアンタゴニスト（antagoni st）及びEAA-アンタゴニストは、生体内のニューロン傷害、特に実験的脊髄損傷害（SCI）、頭部の傷害及び全体的脳虚血を保護することができない。これは不十分な薬物濃度、不適当なCa²⁺流入遮断によるものであるか、又は非Ca²⁺ 依存性の神経毒性プロセスからの寄与によるものであるか否かは知られていない。Ca²⁺神経毒性は種々の種類のCNSニューロンにおける種々の経路を介して引き起こされるものと思われる。従って、結果の良いCa²⁺遮断は多薬投与アプローチを必要とするであろう。カルシウムバッファーの塩類及びそのアセトキシメチルエステル類が細胞内神経生理学の種々の態様（aspect）を研究するのに広く使用されていることは周知である。これらの研究は、主として試験管内で（in vitro）単離された組織標本に関連する実験に集中している。 Kudoらの論文、Brain Research,528,48-54（1990）には、カルシウムイオンの存在を蛍光によって指示するのに使用されるQuin-2、すなわち膜透過性カルシウムバッファーを用いて、細胞内カルシウム濃度に対するこのバッファーの影響を調べることを目的とした、試験管内での両性類動物ニューロン標本の処理、及び神経毒L-グルタミン酸ナトリウムと、カルシウムイオノフォアA23187すなわち細胞膜をカルシウムイオン透過性にする化合物との投与のもとでの過度の電気刺激に対する耐性について記載されている。 ScharfmanとSchwartzkroinの論文、Science,246,（Oct.,13）,257-260（1989 ）には、カルシウム結合タンパク質を有する単一のニューロンが過度の電気刺激に対してより一層耐性であったということを例証する生体外（in vitro）実験が記載されている。カルシウム結合タンパク質をより少ない量で有するニューロンは過度の刺激に対して耐性がより一層小さかった。カルシウム結合タンパク質の中にCa²⁺バッフアーの塩がマイクロピペットで注入されている該カルシウム結合タンパク質を有していないニューロンは、過度の電気刺激に対して、ニューロンの中に前記Ca²⁺バッファーが注入されていないニューロンよりも一層耐性になった。著者らは、過度の興奮（excitation）の期間中に細胞内カルシウムの効果的な緩衝化（buffering）がニューロンの生存にとって重要であると結論を下した。別の結論は、易損性ニューロンのカルシウム結合能力を補うと細胞の損傷を防止し得るということであった。 Billman GE、McIlroy B、Johnson JDらの論文、“Elevated myocardial calci um and its role in sudden cardic death（高められた心筋カルシウム及びその突然心臓死における役割）”、FASEB J,5:2586-2592には、犬に対してCa²⁺バッファーを投与することよる膜透過性カルシウムキレート化剤を用いた心臓不整脈の治療法が記載されている。犬には心臓の致命的な電気的機能障害をもつ機会が少なくなることが認められた。この論文は、膜透過性カルシウムバッファーを犬に与えると、犬の心臓の電気的活性が変えられることを示唆している。 Niesen C、Charlton MP、Carlen PLの論文、“Postsynaptic and presynaptic effects of the calcium chelator BAPTA on synaptic transmission in rat h ippocampal dentate granuleneurons（ラットの海馬歯状核顆粒状ニューロンにおけるシナプス伝達に対するカルシウムキレート化剤BAPTAの後シナプス効果及び前シナプス効果）”、Brain Res.,555:319-325（1991）には、膜透過性Ca²⁺キレート化剤BAPTA-AMを、単離した脳切片標本に対して生体外で施用すると、それがニューロンの電気的活性を生じ得ることが明らかにされている。観察された効果は、BAPTAの塩をガラス微小電極を介してニューロンに直接に注入した際に認められた効果と同様である。しかしながら、この論文はBAPTA-AMが神経保護性であるかもしれないということを示すデータを与えていない。 Carpenter-Deyo L、Duimstra JR、Hedstrom O、Reed DJらの論文、“Toxicity to isolated hepatocytes caused by the intercellul ar calcium indicator，Quin 2.（細胞内カルシウム指示薬、Quin 2によって引き起こされる単離肝細胞に対する毒性）”、J Pharmacol．Exp Therapeut．258: 739-746（1991）には、膜透過性カルシウムバッファー類（Quin 2、Indo 1、Flu o 3、5,5'-ジメチル-BAPTAの各アセトキシメチルエステル）を単離した肝臓細胞に生体外で投与すると、これらの細胞に対して毒性を生じることが教示されている。この論文は、膜透過性Ca²⁺バッファーが生体内で毒性が起こらないように防いでいるという教示からかけ離れた教示をもたらしている。 K.G．BaimbridgeとK.M．Abdel-Hamidの論文、“Intra-neuronalCa²⁺buffering with BAPTA enhances glutamate excitotoxicity in vitro and ischemic dama ge in vivo（BAPTAを用いたニユーロン内Ca²⁺緩衝化は生体外でグルタメート刺激毒性高め、生体内で虚血性損傷を高める）”、Society for Neuroscience Abs tracts，18，1992，571.4，22nd Annual Meeting，Anaheim，California，Octob er25-30，1992には、試験管内で培養したニューロンにBAPTA-AMを加えると、グルタメートの毒性が著しく高められることが教示されている。また、BAPTA-AMを生体内でラットの脳に直接に注射し、その後にラットに発作を与えると、発作の損傷効果が著しく高められる。この論文もまた、膜透過性Ca²⁺バッファーが生体内毒性が起こらないように防いでいるという教示からかけ離れた教示をもたらしている。引用文献リスト本明細書では下記の刊行物を引用し、そのそれぞれは本明細書において参考文献として参照される。刊行物１．Armitage P．Berry G（1987），“Statistical Methods in Medical Rese arch”Oxford：Blackwell Scientific Publications．２．Billman GE、McIlroy B、Johnson JD（1991）、“Elevated myocardial calcium and its role in sudden cardic death”、FASEB J．5:258 6-2592．３．Brint S，Jacewicz M，Kiessling M，Tanabe J，Pulsinelliw（1988）， “Focal brain ischemia in the rat：Methods for reproducible neocortical infarction using tandem occlusion of the distal middle cerebral and ipsi lateral common carotid artery”J．Cereb Blood Flow Metab．8:474-485．４．Buchan AM，Xue D，Slivka A（1992），“A new model of temporary foc al neocortical ischemia in the rat.”Stroke 23:273-279．５．Carpenter-Deyo L，Duimstra JR，Hedstrom O，Reed JD（1991），“Toxi city to isolated hepatocytes caused by the intracellular calcium indicat or,Quin 2.”，J. Pharmacol ExpTherapeut 258:739-746．６．Glaum SR，Scholz WK，Miller RJ（1990），“Acute- and thelong-term glutamate-mediated regulation of [Ca²⁺]_i in rathippocampal pyramidal neu rons in vitro．”，Journal ofPharmacology & Experimental Therapeutics，2 53:1293-1302．７．Goldman WF，Bova S，Blaustein MP（1990），“Measurementof intracel lular Ca²⁺ in caltured arterial smooth musclecells using fura-2 and digi tal imaging microscopy”CellCalcium 11:221-231．８．Grynkiewicz G，Poenie M，Tsien RY（1985），“A newgeneration of ca lcium indicators with greatly improvedfluorescence properties．”，J．Bi ol．Chem 260:3440-3450．９．Guthrie PB，Brenneman DE，Neale EA（1987），“Morphological and bi ochemical differences expressed in separatedissociated cell cultures of dorsal and ventral halves of the mouse spinal cord．”Brain Res 420:313-323． 10．Kudo Y，Takeda K，Yamazaki K（1990），“Quin 2 protectsneurons agai nst cell death due to Ca²⁺ overload．”Brain Res528:48-54． 11．Moore EDW，Becker PL，Fogarty KE，Williams DA，Fay FS（1990），“Ca²⁺ imaging in single living cells: Theoreticaland practical issues．”Ce ll Calcium 11:157-179． 12．Niesen C、Charlton MP、Carlen PL（1991），“Postsynapticand presyna ptic effects of the calcium chelator BAPTA onsynaptic transmission in ra t hippocampal dentate granuleneurons．”Brain Res 555:319-325． 13．Park CK，Mendelow AD，Graham DI，McCullock J，TeasdaleGM（1988）， “Correlation of triphenyltetrazolium chlorideperfusion staining with co nventional neurohistology in thedetection of early brain ischemia．”Neu ropathol ApplNeurobiol 14:289-298． 14．Randall RD，Thayer SA（1992），“Glutamate-induced calcium transien t triggers delayed calcium overload andneurotoxicity in rat hippocampal neurons．”J．Neurosci 12:1882-1895． 15．Regan RF，Choi DW（1991），“Glutamate neurotoxicity inspinal cord cell culture．”Neuroscience 43:585-591． 16．Scharfman HE，Schwartzkroin PA（1989），“Protection ofdentate hila r cells from prolonged stimulation by intracellular calcium chelation． ”Science 246:257-260． 17．Tymianski M，Charlton MP，Carlen PL，Tator 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inity for Calcium Ion is increased by Illumination（カルシウムイオンに対する親和性が照明によって高められるキレート化剤）”に関する米国特許第5141 627号明細書本発明者らは鋭意研究を続けた結果、細胞膜透過性のカルシウムバッファーを用いて哺乳類動物細胞を処理することによって生体内で哺乳類動物に対して傷害による損傷害効果を軽減する方法を知見した。発明の要約本発明の目的は、その最も広い要旨においては、哺乳類動物細胞に対する傷害による損傷効果を減少させる方法を提供することにある。更に別の目的においては、本発明は哺乳類動物を処理して哺乳類動物組織に対する傷害による損傷効果を減少させるために使用する医薬組成物を提供することにある。本発明はCa²⁺の流入の遮断を必要としない、細胞内Ca²⁺バッファリング能力の操作による、毒性促進性（excitotoxic）及び虚血性傷害に対する神経保護効果の発見に基づいている。この発見は全ての型のニューロンに適用できかつ更にある場合には、Ca²⁺神経毒性は細胞内貯蔵部位からの内部Ca²⁺放出から生ずるという可能を示している。驚くべきことに、本発明者は多数の膜透過性Ca²⁺バッファーは生体外で脊髄ニューロンでのCa²⁺仲介毒性促進（Ca²⁺ mediatedexcitotoxity）を阻止しかつ生体内での脳虚血の後のニューロン死と梗塞容積を著しく低下させることを発見した。従って、本発明は、最も広い要旨においては、細胞のイオンチャンネル細孔（ ion channel pore）付近のCa²⁺イオンの濃度を制御して有毒な量のCa²⁺イオンが Ca²⁺の流入（Ca²⁺influx）源付近の位置にある細胞下の部位（subcellular site ）へ拡散することを防止することにより神経毒現象（neurotoxic phenomena）の誘発（triggering）を防止するにあたり、有効なかつ無毒性の量の膜透過性Ca²⁺ バッファーを生体内の細胞投与することを特徴とするCa²⁺イオンの濃度の制御方法を提供する。本発明は、更にその一つの要旨によれば、哺乳類動物組織を生体内で、損傷を減少させる、無毒性のかつ有効な量の細胞膜透過性カルシウムバッファーで処理することを特徴とする、哺乳類動物組織中の細胞に対する傷害による損傷効果を減少させかつテンカンを処置するための方法が提供される。バッファーは細胞内カルシウムイオン濃度をミリモル水準以下に減少させるか又はこの水準に保持する量で存在させることが好ましい。細胞膜透過性バッファーはカルシウムイオンキレート化剤であることが好ましく、１ｘ10^-4〜１ｘ10^-8モルの範囲から選ばれたK_Dを有するバッファーであることがより好ましい。バッファーは細胞内での他の金属、例えばFe，Mg，K，Naのイオンバランスの破壊を最小にするために、他の金属に比較して、実質的にカルシウム選択性であることが更に好ましい。 K_Dという用語は下記の式：で表されるごとき、バッファーカルシウム塩（BCa）のバッファー（B）及びCa²⁺ イオンへの解離についての前進及び逆行速度定数の比を意味する。哺乳動物類細胞を傷害から効果的に保護するためには、細胞内のCa²⁺バッファーの有効量を10μM〜10mMの濃度範囲とすべきである。これによって、原子ブラスト（atomic blast）により引裂かれて小片（bit）になる場合のごとく臨床的に不適切な状態に対して、治療を開始するのに適切な条件下、即ち、発作（stro ke）のごとき臨床的に適切な状態において、全動物における哺乳類動物の細胞に対する傷害が生じている際に、細胞内カルシウム濃度がミリモル水準まで上昇することが防止される。第１の形式においては、本発明の実施に使用される新規化合物は、キレート化剤の２個の半分の部分が、（a）簡単な1，2-エタンジイル（-CH₂CH₂-）部分であって、これに結合した-CH₃、-C₂H₅又は-CH₂OHのごとき嵩高の（bulky）置換基を有するもの、（b）炭素環中に導入された1，2-エタンジイル部分、（c）複素環中に導入された1，2-エタンジイル部分からなる群から選ばれた結合手により連結されているBAPTA状のキレート化剤からなる：この化合物においてはキレート化剤は2-ニトロソベンゾフェノンの光化学的先駆体である、単一の2-ニトロベンジル誘導体とカップルされている。この形式においては、新規化合物は一般式：［式中、Aは-N0₂又は-Hであり； R¹は-H（R²もHでない場合）、-CH₃、-F、-Cl及び-Brからなる群から選ばれ； R²は-H（R²もHでない場合）、-CH₃、-F、-Cl、-Br及びC₁-C₄アルコキシからなる群から選ばれ； R³、R⁴及びR⁵は各々-H、OH、NR⁶R⁷又はアルコキシであるか、又は、R³とR⁴が一緒に-OCH₂O-又は-OCH₂CH₂O-を表し、R⁵が-H、OH、NR⁶R⁷又はアルコキシを表すか、又は、 R⁴とR⁵が一緒に-OCH₂O-又は-OCH₂CH₂O-を表し、R³が-H、OH、NR⁶R⁷又はアルコキシを表し； Xは-OH、アルコキシ、-Cl、-Br、-NR⁶R⁷、-OCOCH₃、-OCOCF₃、 -OC0CH₂NH₂、-OPO₃H及び-OSO₂CH₃からなる群から選ばれ； R⁶及びR⁷は各々-H、メチル又はエチルであり； R⁸及びR⁹は各々-H、-CH₃、-C₂H₅又は-CH₂OHであるが、但し、両者が同時に-Hであることできないものし；或いは R⁸及びR⁹が一緒に-（CH₂）m-Y-（CH₂）n-（m及びnは各々1又は2であり、Yは-CH₂ -、-O-、-NR⁶、-S-及び-S-S-からなる群から選ばれる）を表し； Wは-H、-OH又は-NHR⁶である］を有する化合物及びその薬理学的に許容される無毒性塩及びエステルからなる。第２の形式においては、本発明の実施に使用される化合物は、キレート化剤の２個の半分の部分が、（a）簡単な1，2-エタンジイル（-CH₂CH₂-）部分であって、これに結合した-CH₃、-C₂H₅又は-CH₂OHのごとき嵩高の（bulky）置換基を有するもの、（b）炭素環中に導入された1，2-エタンジイル部分、（c）複素環中に導入された1，2-エタンジイル部分からなる群から選ばれた結合手により連結されているBAPTA状のキレート化剤からなる；この化合物においてはキレート化剤はそれ自体、関連する2-ニトロソベンゾフェノンの光化学的先駆体である、２個の2-ニトロベンジル誘導体とカップルされている。この形式においては、上記化合物は一般式：［式中、Aは-NO₂又は-Hであり； R³、R⁴及びR⁵は各々-H、OH、NR⁶R⁷又はアルコキシであるか、又は、R³とR⁴が一緒に-OCH₂O-又は-OCH₂CH₂O-を表し、R⁵が-H、OH、NR⁶R⁷ 又はアルコキシを表すか、又は、 R⁴とR⁵が一緒に-OCH₂O-又は-OCH₂CH₂O-を表し、R³が-H、OH、NR⁶R⁷又はアルコキシを表し； Xは-OH、アルコキシ、-Cl、-Br、-NR⁶R⁷、-OCOCH₃、-OCOCF₃、 -OCOCH₂NH₂、-OPO₃H及び-OSO₂CH₃からなる群から選ばれ； R⁶及びR⁷は各々-H、メチル又はエチルであり； R⁸及びR⁹は各々-H、-CH₃、-C₂H₅又は-CH₂OHであるが、但し、両者が同時に-Hであることできないものとし；或いは R⁸及びR⁹が一緒に-（CH₂）m-Y-（CH₂）n-（m及びnは各々1又は2であり、Yは-CH₂ -、-O-、-NR⁶、-S-及び-S-S-からなる群から選ばれる）を表し， Wは-H、-OH又は-NHR⁶である］を有する化合物及びその薬理学的に許容される無毒性塩及びエステルからなる。第３の形式においては、本発明の実施に使用される化合物は、一般式：［式中、E¹及びE²は各々H、CH₃、C₂H₅、CH₂OH、COOH又はCH₂COOHであるか又はE¹ とE²は一緒に-（CH₂）m-V-（CH₂）n-（m及びnは各々1又は2であり、Vは-CH₂-、- O-、NH-、-NMc-、-S-及び-S-S-からなる群から選ばれる）を表し； WはH、OH又はCOOHであり： XはH、Me、COOH、F、Cl、Br、I又はNO₂であり； Yは-O-、-NMe-、-S-、-CH₂-、-CMe₂-、-CF₂又は5員中心環を形成する直接シグマ結合であり； Z¹、Z²、Z³及びZ⁴は各々H、F、Cl、Br、I又はMeであり、Q¹及びQ²はR₁R₂N-、HO- 又は0=（R₁及びR₂は各々H、Me及びEtからなる群から選ばれる）に等しいか又はZ¹ 、Q¹又はZ³は一緒に -（CH₂）₃-N-（CH₂）₃を表し；Z²、Q²、Z⁴は一緒に -（CH₂）₃-N-（CH₂）₃を表す］を有する化合物及びその薬理学的に許容される無毒性塩及びエステルからなる。テトラ酢酸エステルはα−アシルオキシアルキルエステルであることが好ましく、このα−アシルオキシアルキルエステルはアセトキシメチルエステルであることがより好ましい。第４の形式においては、本発明の実施に使用される化合物は、一般式：［式中、E¹及びE²は各々H、CH₃、C₂H₅、CH₂OH、COOH又はCH₂COOHであるか又はE¹ とE²は一緒に-（CH₂）m-V-（CH₂）n-（m及びnは各々1又は2であり、Vは-CH₂-、- O-、NH-、-NMe-、-S-及び-S-S-からなる群から選ばれる）を表し； WはH、OH又はCOOHであり； XはH、Me、COOH、F、Cl、Br、I又はNO₂であり；Yは-O-、-NMe-、-S-、-CH₂-、-C Me₂-、-CF₂、-CO-又は5員中心環を形成する直接シグマ結合であり； Z¹、Z²、Z³及びZ⁴は各々H、F、Cl、Br、I又はMeであり、Q¹及びQ²はR₁R₂N-、 + R₁R₂N- 又はHO-、O=又はR₁R₂N-、O-（R₁及びR₂は各々H、Me及びEtからなる群から選ばれる）に等しい；か又はZ¹、Q¹、Z³は一緒に -（CH₂）₃-N-（CH₂）₃を表し； Z²、Q²、Z⁴は一緒に -（CH₂）₃-N-（CH₂）₃を表す］を有する化合物及びその薬理学的に許容される無毒性塩及びエステルからなる。第５の形式においては、本発明の実施に使用される化合物は、一般式：［式中、R¹及びR³は各々-H、OH、-CH₃、-F、-Cl、-Br、-I、 -COOH、-CN、-NO₂又は-NHR⁷（R⁷は-H、メチル又はエチルから選ばれる）から選ばれ； R²は-（C=O）CR⁸-N-N（R⁸は-H、C₁-C₄アルキル、フェニル、-COOH、 -COOR⁷-（C-O）CH₃又は-CF₃であり、R₇は前記の意義を有する）であり； R⁴はR²、-H、-CH₃、-CH₂CH₃、-F、-Cl、-Br、-I、COOH、-CN又は-NO₂から選ばれ； R⁵及びR⁶は各々-H、-CH₃、-C₂H₅、フェニル又は-CH₂OHから選ばれるか、又はR⁵とR⁶は一緒に-（CH₂）m-Y-（CH₂）n- （m及びnは各々1又は2であり、Yは-CH₂-、-O-、-NHR⁷、-S-又は-S-S-から選ばれ、R⁷は前記に意義を有する）を形成している］を有する化合物及びその塩又は非重合体状エステルからなる。定義本明細書及び請求の範囲において、挙げられている技術語句及び技術用語は本明細書における使用に関して特に下記の通りに定義される。本明細書で使用する“［Ca²⁺］_i”は、細胞内の遊離カルシウムを意味する。本明細書で使用する“EGTA”は、エチレングリコールビス（β-アミノエチルエーテル）-N，N，N’，N’-四酢酸を意味する。本明細書で使用する“BAPTA”は、1，2-ビス（2-アミノフェノキシ）エタン-N ，N，N’，N’-四酢酸を意味する。本明細書で使用する“quin-2”は、2-｛[2-ビス（カルボキシメチル）アミノ］-5-メチルフェノキシ｝-6-メトキシ-8-ビス（カルボキシメチル）アミノ-キノリンを意味する。本明細書で使用する“BAPTA様の（like）”は、ビス（カルボキシメチル）アミノ置換-フェニル環を２個有するという必須の特徴を保持しているBAPTAの置換誘導体を意味する。前記の２個の置換フェニル環は、前記アミノ基に対してオルトの位置で、４個の原子からなる架橋であって前記それぞれのフェニル環に隣り合った原子がＮ原子又はＯ原子であり且つ該架橋の２個の中心原子がそれぞれＣ原子である架橋を介して連結されているものである。この定義により、“BAPTA 様の”はquin-1及びquin-2様の化合物を包含することを意味する。本明細書で使用する、医薬に許容し得るエステルとは、公知のエステルであって且つ医薬工業において使用されている易加水分解性エステル、特にα-アシルオキシアルキルエステル類を意味する。本明細書で使用する、医薬に許容し得る無毒性の塩とは、カルボン酸の塩であってその対イオン又はイオンが全てNa、K、NR₄=+（式中、ＲはＨ原子、Ｃ₁〜Ｃ₄ アルキル基又はその混合物である）、コリン、N-メチル-グルカミン、Ca又はMg 、あるいはこれらの対イオンのある種の組み合わせ、あるいは複数の酸塩のある種の組み合わせ、あるいはこれらの対イオンと遊離の酸基とある種の組み合わせを意味する。 “細胞膜透過性カルシウムバッファー”という用語は、それ自体が膜透過性であるカルシウムイオンキレート化剤又はその膜透過性の誘導体であって細胞内で前記カルシムイオンキレート化剤を放出する膜透過性の誘導体、例えばエステル、アミド、及び該キレート化剤自体を放出する他の誘導体、並びに医薬に許容し得るこれらの無毒性の塩を意味する。本発明の実施に使用する最も好ましいカルシウムバッファーの具体例は、下記のような当該分野で知られているカルシウムバッファーである：すなわち BAPTA-AM〔1，2-ビス（2-アミノフェノキシ）エタン-N，N，N’，N’-四酢酸アセトキシメチルエステル〕； EGTA-AM〔エチレングリコールビス（2-アミノエチルエーテル）-N,N，N’，N ’-四酢酸アセトキシメチルエステル〕； 5，5’-ジブロモ-BAPTA-AM 5，5’-ジフルオロ-BAPTA-AM 4，4’-ジフルオロ-BAPTA-AM である。前記カルシウムバッファーのCa⁺²の概略の解離定数を下記の第１表に示す。第１表キレート化剤概略のＫ_d ** EGTA-AM 100 nM BAPTA-AM 160 nM（Mg 0mM中で） 440 nM（Mg 1mM中で） 5，5’-Br₂-BAPTA-AM 3600 nM 5，5’-F₂-BAPTA-AM 660 nM（Mg 0mM中で） 706 nM（Mg 1mM中で） 4，4’-F₂-BAPTA-AM 4600 nM（Mg 0mM中で） ** Molecular Probes Inc．（オレゴン州ユージーン所在）本発明の、哺乳類動物細胞に対する傷害による損傷効果を軽減させる方法は、傷害を受けた後の治療法として前記の細胞膜透過性カルシウムバッファーの施用に適用される。 BAPTA-AM及びその誘導体の構造を下記に示す。但し、BAPTA：R₁=R₂=H 4，4’-F₂-BAPTA：R₁=F、 R₂=H 5，5’-F₂-BAPTA：R₁=H、R₂=F 5，5’-Br₂-BAPTA :R₁=H、R₂=Br BAPTA-AMは下記のプロセス：すなわちで細胞内で脱エステル化して活性なキレート化化合物を生成する。本発明の別の方法においては、前記の細胞膜透過性カルシウムバッファーは、傷害を受ける前に該バッファーを投与することによって細胞に対する傷害の程度を低減させる予防剤として使用し得る。本発明の方法は、前記組織に対する血流の減少、酸素流、栄養素流、外傷、放射線、毒素暴露、感染、異常増殖（neoplasia）又は炎症によって引き起こされる傷害に適用し得るし、またテンカンの治療に適用し得る。すなわち、膜透過性カルシウムバッファーによる患者の治療は、２つの主な状況のもとで：すなわち1）神経系に対する傷害が予期される場合の予備処置、例えば来るべき手術におけるような予備処置、及び2）後処置のもとで行われる。膜透過性カルシウムバッファーは、例えば下記の４つの経路すなわち静脈内経路、動脈内経路、莢膜内経路（すなわち神経組織を取り巻く膜の中に）又は心室内経路〔すなわち脳の内部の室（chamber）すなわち脳室に直接に〕のうちの１つにより投与し得る。該バッファーは典型的には適当なビヒクルに加えられる。該ビヒクル中では活性成分バッファーが液体に溶解又は懸濁され、しかも該ビヒクルは該バッファーを血流から神経細胞内へのデリバリー（delivery）を可能にし、それによって不適当な毒性なしに脳血液関門を越える（cross）か又は不適当な毒性なしに脳脊髄液から神経細胞中に行き渡る。溶液は典型的には、例えばポリエチレングリコール、例えばポリエチレングリコール400、Cremophor-EL 又はシクロデキストリンを含有しているアルコール溶液、ジメチルスルホキシド溶液又は水溶液である。かかるビヒクルは当該技術において周知であり、膜透過性カルシウムキレート化剤のデリバリーのために有用である。一般的に、膜透過性カルシウムバッファーを作用させるためには、該バッファーは血流の別の（ot herwise）水性環境において該バッファーが沈殿するのを防止する溶媒中に加えられねばならない。かかる有効な溶媒の１つはジメチルスルホキシドすなわちDM SOである。このようにして、膜透過性カルシウムバッファーによる患者の治療が行われる。本発明による治療に供される具体的な哺乳類動物細胞は、神経系、心臓、肝臓、牌臓、腎臓、副腎、胃腸管、血管平滑筋及び皮膚の細胞である。前記の細胞膜透過性カルシウムバッファーは哺乳類動物に対して、当該技術において周知の方法、すなわち静脈内投与、動脈内投与、局所投与、皮下投与、経口摂取、筋肉内注射、吸入などにより投与し得る。神経細胞の治療に最も有効な投与方法は、１）静脈内投与；２）動脈内投与；３）莢膜内投与及び／又は嚢内投与；並びに４）脳室内（intra-ventricularly）投与であるのが好ましい。本発明者らは、本発明の方法において、細胞膜透過性カルシウムバッファーを損傷した組織に到達させ且つ該組織細胞に侵入させるのに十分な時間であらねばならないこと、及び該バッファーの誘導体の場合には生体内で該バッファーそれ自体を発生させるのに十分な時間であらねばならないことを認めた。別の要旨によれば、本発明により哺乳類動物組織中の細胞に対する傷害による損傷効果を軽減させる細胞膜透過性カルシウムバッファーが提供される。前記バッファーは、カルシウムイオン用のキレート化剤であるのが好ましく、他の金属イオン例えばFe²⁺、Mg²⁺、K⁺及びNa⁺よりも本質的にカルシウムイオン選択性であるバッファーであるのがさらに好ましい。１×10^-4〜１ ×10^-8モルの範囲から選択されるＫ_Dを有するカルシウムバッファーが最も好ましい。本発明において有用な特定の細胞膜透過性カルシウムバッファーは、前記に定義したBAPTA-AM；EGTA-AM；5，5’-ジフルオロ-BAPTA-AM及び4，4’-ジフルオロ -BAPTA-AM；並びに5，5’-ジブロモ-BAPTA-AMである。さらに別の要旨によれば、本発明により、哺乳類動物組織の細胞に対する傷害による損傷効果を軽減させるための医薬組成物であって、前記の細胞膜透過性カルシウムバッファーを適当な医薬に許容し得る希釈剤、担体又は補助剤との混合物として含有してなる医薬組成物が提供される。医薬として活性な細胞膜透過性カルシウムバッファーは医薬有効量で存在させるべきであることが当業者には理解されるであろう。さらにまた別の要旨によれば、本発明により、哺乳類動物組織の細胞に対する傷害による損傷効果を軽減させるか又はテンカンを治療するための医薬組成物の製造方法が提供される。該方法は細胞膜透過性カルシウムバッファーを医薬に許容し得る担体と混合することからなる。発明の詳細な説明ニューロンの一次培養の実験方法組織培養法胎児性のE13スイスマウスから得た脊髄ニューロンを、ポリ-D-リシン臭化水素塩（分子量30,000〜70,000、Sigma社製、P-7280）で被覆したガラス製カバーグラス（coverslips）上で２週間培養した。背根の神経節を離解（dissection）中に除いた。ニューロンを慣用のようにして一次ニューロン培養物から分離した（ Guthrieraらの1987年の論文）。培養物全部を加湿した５％CO₂／95％空気の雰囲気中で36.5℃で維持し、最小必須培地（MEM）58％、ウシ胎児血清20％及び蒸留水20％を含有し、グルコース40mM、NaHCO₃11.6mM、L-グルタミン0.4mM及びInsulin-Toronto 80生物学的単位／培地100mlを補足し、300 mOsm及び５％CO₂中でpH7.4に釣り合わせた培地を用いて週２回（biweekly）培養した。試験管内で４日目に、培養物を5’- フルオローデオキシウリジン20μg/mlとウリジン50μg/mlとを用いて24時間処理して、非ニューロン細胞の増殖を阻止した。抗生物質は使用しなかった。ニューロフィラメント、ニューロン特異的エノラーゼ及び神経膠原線維会合（glial fi brillary associated）タンパク質を免疫細胞化学染色することによって、培養物中のニューロン及びアストログリア（すなわち星状膠細胞）の有無を確認した。カルシウム指示薬とCa²⁺バッファーを用いたニューロンのローディング 0.2％ジメチルスルホキシド（DMSO）の最終濃度で、フラ-2-アセトキシメチルエステル（フラ-2/AM；Molecular Probes Inc.製）１μMを含有するローディング培地（loading medium）（MEM 78％及び蒸留水20％、D-グルコース40 mM、Mg² ⁺ 1.0 mM、HEPES 20mMを補足したもの、５％CO₂中でpH7.4）中で、前記培養物を7 0分間培養した。フラ-2を用いたローディングの10分後に、上記ローディング培地に、該培地に所定の濃度まで溶解した膜透過性Ca²⁺バッファー（第１表）を補足した。親油性の膜透過性フラ-2/AMはニューロンの中に浸透し、細胞内エステラーゼの作用によって膜不透過性のフラ-2塩に転化され、これは特異的カルシウム指示薬として細胞内に捕捉される（Grynkiewiczらの1985年の論文）。非蛍光性BAPTA及びその誘導体は上記と同じようにしてニューロンの中に浸透する。ローディングの後に、培養物を平板（plain）ローディング培地中で30分間洗浄して残存する細胞外カルシウム指示薬からのバックグラウンド蛍光を減衰させた。装置指示薬を負荷した〔すなわち、充填した（loaded）〕培養物を顕微鏡ステージインキュベーター（Medical Systems Corp.製、型式TC-202）の中に取り付け、倒立顕微鏡〔キセノンエピ蛍光光学素子（epifluorescence optics）を取り付けたNikon Diaphot-TMD〕を用いて前記カバーグラスの底部と接触した蛍石油入レンズ（a fluoriteoil-immersion lens）（Nikon CFUV-F×40，NA=1.3）を通して観察した。第２世代のマイクロチャンネルプレート増感（microchannel-plate i ntestified）CCD-着装カメラ（Qunatex Corp.製、型式QX-100）により、コンピューター制御フィルターホイール（filter wheel）中に収納してある狭帯域フィルター（340±5 nm；360±6.5 nm；OmegaOptical製）を通して励起したニューロンのフラ-2からの510 nmの蛍光の発光を記録した。データは全て80386-ベースのパーソナルコンピューターに集め、光学ディスクドライブ（Panasonic，LF-500 ）上に記録した。このシステム（system）は継続的な［Ca²⁺］_i測定の間で２秒の時間分離能（time-resolution）を可能にした。検定（Calibration）式［Ca²⁺］_i＝K_d（F_min／F_max）［（R-R_min）／（R_max-R）］〔式中、K_d＝224 nM、すなわちフラ-2の解離定数（Grynkiewiczらの1995年の論文；レビューについてはMooreらの1990年の論文；Goldmanらの1990年の論文参照〕によって描いた検量線を作成するのに使用した試験管内で誘導した換算係数を使用して［Ca²⁺］_i を測定した。（F_min／F_max）、R_min及びR_maxを測定するために、対照溶液（下記を参照）、フラ-2の５カリウム塩１μM及び飽和カルシウム負荷物（Load）（1 mM）か又はEGT A 10mMを用いたカルシウム無しを含有する100μLのチャンバー（chamber）をもつガラス底部スライドの画像を作成した。フラ-2を含んでいない対照溶液を含有する第３のチャンバーを使用して、バックグラウンド画像を作成した。換算係数の典型的な値は、F_min／F_max＝ 10.31、R_min＝0.54、R_max＝10.48であった。比率設定（ratio）画像を作成するために、各波長（340 nm及び380 nm）で集めた８枚の生の蛍光画像の平均をとり、バックグランドを引き算し、次いで疑似カラー（pseudocolor）ディスプレーを使用してオンラインで、［Ca²⁺］_iの検定比率設定画像に変換した。それぞれの実験について新しいバックグラウンド画像を得た。このシステム（syatem）を装置に対する調整に従って検定した。ニューロン［Ca²⁺］_iの時間経過をプロットすると（例えば、第1A図）、測定した［Ca²⁺］_iが結果として検量線の有意な範囲の値を越える値まで上昇した場合には、明確にするために追跡値は［Ca²⁺］_i 約1500nMの値でその先を省略した（星印）。本ニューロン標本においては非ニューロン細胞に関する検定（例えば、WilliamsとFayの1990年の論文）によって記載された生体内検定（calibration）を再現することができなかった。その理由は、カルシウムイグノフォアの濃度の変化（４-ブロモ-A23187 0.5〜10μM）に暴露された脊髄ニューロンは、常に、細胞外培地（medium）中で前記の値に近い［Ca²⁺］_iを達成する前に溶解（lysis）を受けたからである。薬物及び溶液対照溶液はNaCl 130mM、CaCl₂1.3mM、KCl 4.5mM、D-グルコース22mM、HEPES 2 0mM、ピルビン酸ナトリウム1.0mM及びグリシン0.001mMを含有していた。溶液は全て、投与する前に300 mOSM、pH7.4及び36.5℃に調整した。EGTA/AM（Calbioch em製）及び全てのBAPTA-AM誘導体（Molecular probes inc.製；第１表参照）は、乾燥DMSO中で30MMのストック（stock）として調製し、それらの最終濃度までローディング媒地中に溶解した。実験中は、最終DMSO濃度は決して1.0％を越えることはなく、その濃度は中規模研究において［Ca²⁺］_i 又はニューロン生存率に影響を及ぼすことはなかった。ニュ−ロンの生存率の検定それぞれの実験に続いて、培養物をエチジウムホモ二量体２μM及びカルセイン-AM １μMを用いて36.5℃で10分間インキュベートした。エチジウムホモ二量体は死細胞中の核物質に結合し、一方、カルセイン-AMは該エステルの酵素加水分解によって、生細胞中に保持される（Mooreらの1990年の論文）。従って、フルオレセイン領域（485〜500 nm）内で励起されると、死細胞は赤橙色を生じ、これに対して生細胞は緑色を生じる。また、生細胞の生存率の別の測定として、培養物は0.4％トリパンブルー染色剤を用いて２分間スーパーフューズし（super fused）、ニューロン生存率を明視野顕微鏡で確認した。実験方法実験は全て36.5±5℃で行った。フラ-2を負荷した（loaded）ニューロンを対照溶液を用いて１〜２ml／分でスーパーフューズさせた。［Ca²⁺］_iを実験全体を通してその場でいくつかのニューロン中で同時に測定した。バセリン［Ca²⁺］_i を５〜15分間記録し、その後にニューロンをグルタメート（GLU）250μMを用いる50分チャレンジ（challenge）に暴露させた。前記チャレンジの開始からピーク［Ca²⁺］_iが記録されるまで、２秒ごとにニューロン［Ca²⁺］_iの上昇を測定した。次いで、［Ca²⁺］_i測定値の波（frequency）が［Ca²⁺］_iが低下するにつれて徐々に低下し、［Ca²⁺］_iの低下が止まった際には３分ごとの測定に至った。前記50分チャレンジに続いて、いくつかの実験ではニューロンを再度対照溶液を用いてさらに30分間スーパーフューズさせた。データ分析 Newman-Keuls法を使用するpost-hoc多重比較（multiple comparisons）を用いるANOVAを使用して統計的分析を行い、個体群平均値（means）の間の有意差を調べた（ArmitageとBerryの1987年の論文の7.4節参照）。モデル（model）の死細胞の確率及び試験固体群のの死細胞の確率に、線形回帰分析及びロジスティック回帰分析を用いた。適当ならば、Kaplan-Meier生存率モデルを用いる生存率分析法（ArmitageとBerryの1987年の論文の14.54節参照）を時間依存効果を試験するのに用いた。特に断らない限りは、平均値はその標準誤差と共に示す（平均値±標準誤差）。単離したラットの脳切片についての実験方法薬物及び溶液：カルシウムクリムソン-AK、すなわち蛍光性、膜透過性のBAPTAベースのCa²⁺指示薬（Molecular Probes Inc.製、C-3018）を、それぞれの実験の直前に乾燥DMS Oに溶解した（DMSO 0.5ml中に400mg）。人工脳脊髄液（ACSF）はNaCl 125mM、KC l 2.5mM、NaH₂PO₄1.25mM、MgCl₂ 2 mM、CaCl₂ 2 mM、NaHCO₃ 25mM及びグルコース10 mMを含有し、５％CO₂-95％O₂で通気されたpH7.4を有していた。ACSFの浸透圧モル濃度は300±5 m.osmolであった。実験方法体重240〜300ｇのフィッシャー344ラットを1.5％ハロタン（すなわちフルオタン、Ayerst Laboratories製、カナダ国モントリオール所在）と亜酸化窒素／酸素（70％／30％）とを用いて麻酔をかけ、気管切開手術によって陽圧通気法を用いて生命維持させた。大腿部の動脈及び静脈それぞれに挿入したポリエチレン製カテーテルにより平均（mean）動脈圧（MAP）測定値及び静脈発作（access）を得た。MAPは実験中は80mmHgに維持した。それぞれの動物において、中心部（cor e）体温（直腸探針を用いて測定した）及び側頭筋温度を監視し、37±0.5℃に維持した。カルシウムクリムソン（Calcium Crimson）を用いてラットをローディングする方法を第５図の挿入図に示す。簡単に言えば、DMSO 0.5mlに溶解したカルシウムクリムソン-AM400mgをラットの大腿部静脈中に、注入ポンプを使用して60分間にわたって注入した。対照動物にはDMSO 0.5mlのみの注入を受けさせた。ラットは常に対照として働く動物１匹との対として注入を受けさせた。さらに３時間後にラットを断頭し、脳の横断切片（400μm）を得、使用するまで室温でACSF中で維持した。カルシウムクリムソンを負荷したラットの脳切片をガラス底部のチャンバー中に対照脳切片と一緒に置いた。これらの切片をレーザー走査共焦点顕微鏡（Bio- Rad MRC 600）を用いて蛍石レンズ（NikonCF UV-F×10）を通して室温で観察した。それぞれの実験において、両方の切片（対照切片及び負荷切片）をローダミンフィルター管を使用して同じ焦点設定で観察した。生体内実験方法ａ）外科標本（surgical preparation）：雄性フィッシャー344ラット41匹（体重275〜340ｇ）をベルチャンバー中で、２％ハロタンと、亜酸化窒素／酸素（１：１）の混合物とを用いて麻酔をかけた。気管切開手術を行い、機械的通気を開始した（Harvard rodent ventilator）型式683）。１％ハロエタンを血圧に滴定し（titrated）、麻酔を持続させた。血圧を連続的に監視し且つ薬物及び液体を投与するために大腿部の動脈と静脈それぞれにポリエチレン管を挿入した。一定の間隔で取り出される動脈血液ガスに従って通気を変化させた。温度を直腸探針と、側頭筋中に入れた微小探針とを用いて監視し、オーバーヘッドランプ（overhead lamp）を使用して記録される直腸温度を37℃に維持した。血管カテーテルを、ヘパリンを加えた生理的食塩水（ 100IU／ml）で満たした。ｂ）実験デザイン２つの独立した盲実験（blinded experiment）を行った。外科標本を完成させ、血液ガスを安定化させた後に、実験動物を実験群に無作為に振り分け、0.5ccの容量で60分間にわたって注入（Harvard製注入ポンプ、型式901,903 ）を開始した。注入開始後４時間目に脳虚血が始まった。ｉ）研究Ｉ：動物を無作為に２つの群に分け、第１の群にはDMSOの注入を受けさせ、第２の群には同じDMSO溶液に溶解したBAPTA/AM（18mg/kg）の注入を受けさせた。 ii）研究II：第２の研究では５つの実験群に分け、第１の研究の外科医と異なる外科医によって行った。動物を下記の注入群に無作為に振り分けた。１．生理的食塩水２．DMSO ３．DMSOに溶解したBAPTA/TM ４．DMSOに溶解した4，4’-ジフルオロ-BAPTA ５．DMSOに溶解した5，5’-ジフルオロ-BAPTA ｃ）脳虚血４時間の前処理時間の終了の30分前に、中脳の咬合せについて外科的調製（su rgical preparation）を開始した。前記の両方の研究に使用した方法はすでに報告されている方法であった（Brintらの1988年の論文、Buchanらの1992年の論文）。簡単に言えば、左の普通の（common）頸動脈を気管切開手術による切開により露出させ、小規模な側頭の頭蓋周囲切開により遠心中脳動脈を露出させた。前処理時間が終わった後に、前記の普通の（common）頚動脈を動脈瘤クリップ（an eurysm clip）で塞ぎ、前記の中脳動脈を焼灼し、操作顕微鏡の助けをかりて切断した。切開部分を縫合糸で縫ってふさいだ。虚血後（post-ischemia）時間を４時間経過させ、その間、平均動脈血圧と動脈血液ガスを連続的に監視した。中心部（直腸）及び側頭筋温度を37 ±0.5℃に維持した。ｄ）結果４時間の虚血後時間が経過した後に、トリフェニルテトラゾリウムクロリド（ TTC）とホルムアルデヒドを用いて、すでに報告されているようにして注入を行った（Parkらの1988年の論文）。簡単に言えば、腹部切開により上行大動脈にカニューレを挿入し、ヘパリンを加えた生理的食塩水を内部大動脈の穴を経由する溶出液が透明になるまで点滴した。80mmHgの注入圧力で、TTCの注入、次いでホルムアルデヒドの注入はその注入固定を完結した（concluded）。頭部を取り出し、ホルムアルデヒド中に24時間入れて置き、その後に脳を取り出した。脳を８つの冠状平面で切片に切り分け、TTC染色により評価した。盲実験群に振り分けられた２つの個体群はTTC欠損（defect）を記録した。画像解析装置（M CID、Imaging Research INC.製）により８つの冠状平面におけるTTC欠損の横断面積から梗塞の大きさ（volume）を算出した。冠状の脳切片をパラフィン中に封埋し、ミクロトームで７ミクロンの切片に切断し、次いでヘマトキシリンとエオシンを用いて染色した。２つの個体群、すなわち実験群に対する盲実験群について組織学的に調べて、８個の冠状切片のそれぞれについて梗塞の面積を区別した。梗塞の大きさ（volume）と梗塞を生じた皮質の割合を画像解析装置により算出した。統計学的分析は、研究Ｉに関するスチューデント（Student）のＴ検定による処理群と、研究IIに関するpost hoc Ｔ検定を用いた分散（variance）の分析との間の、梗塞の大きさ（volume）又は皮質の梗塞の割合の比較を伴う。TTCに対する、対梗塞を評価する個体間の梗塞の大きさ（volume）及びばらつき（variab ility）の組織学的評価についての相関係数を算出した。図面の詳細な説明第１図は神経毒、L-グルタメート-ナトリウムを適用した際の細胞内カルシウムの変化の時間的経過のグラフを表す。第２図は［Ca²⁺］_i及び二次Ca²⁺の過負荷（overload）に対する膜透過性Ca²⁺ バッファーの効果を示すグラフを表す。個々の図面は250Mμグルタメート（GLU ；黒線）で攻撃した（challenge）単一のニューロンにおける［Ca²⁺］_iの時間的経過を示す。A.GLUの不存在下でのベースライン［Ca²⁺］_iの安定性。B.外性（ex ogeneous）［Ca²⁺］バッファーの不存在下においてはGLUは大きな一次［Ca²⁺］_i 過渡現象（transient）（矢印）を誘発し、これは復帰して下方“プラトー”（ “plateau”）を形成し、ついで12/15ニューロンにおいて二次［Ca²⁺］過負荷を生ずる。C-F.BAPTA-AM（C,D）、EGTA-AM（E）及び4,4'-F₂BAPTA-AM（F）で予備処理したニューロンにおける［Ca²⁺］_iの時間的経過。十分な濃度においては、B APTAとEGTA（K_d=100nM）はピーク［Ca²⁺］_iの上昇を減少させ、ニューロンを二次［Ca²⁺］過負荷から保護した（D,E）。4,4'-F₂BAPTA-AM、低親和性Ca²⁺バッファー（K_d=2600nM）は脊髄ニューロンに対して有毒であった（F）。第３図はCa²⁺バッファー、［Ca²⁺］_i、Ca²⁺］_i-親和性（K_d）及びグルタメートの攻撃後のニューロンの生存（neuronal survival）の関係を示すグラフを表す。ニューロンは第２図におけるごとく250μMグルタメートでスーパーフューズした。A-Cにおける記号は所与のCa2+バッファーで処理したニューロン（合計で4 50個のニューロン）の全てについての平均値を示す。標準誤差が示されており、この場合、標準誤差は記号サイズを越えている。A.当初の［Ca²⁺］_i過渡現象（プラトー［Ca²⁺］_iからの復帰後のK_dと死亡ニューロンのフラクションとの関係。B.各々のCa²⁺バッファー群におけるK_dと死亡ニューロンのフラクションとの関係。C.Ca²⁺バッファーを負荷したニューロンにおける死亡ニューロンとプラトー［Ca²⁺］_iフラクションとの直線的関係［関係係数（Corelation Coefficient）＝0.986,P0.0003］により例示される、外性バッファーによる細胞内Ca²⁺バッファリングの優位性。対照ニューロン（四角形）はこのラインまで低下しないことに注意せよ。D.トリパンブルー及び二次Ca²⁺過負荷により測定したニューロンの生存に対する種々の Ca²⁺バッファーの影響。種々の記号を伴う棒線はP0.001において統計学的に異なる。第４図はTTC法［MCA＆CCA吸臓（occlusion）］により測定した皮質性梗塞（co rtical infarction）容積に対するBAPTA-AMの代表的な影響を示す。BAPTA-AM又はその誘導体で処理したラット（ラットNo.4）は、末端中脳（distal middle ce rebral）及び同側総頚動脈吸臓（ipsilateral common carotid occlusion）の後には、対照（ラットNo.6）より著しく小さい皮質性梗塞を起こした。各々の場合の梗塞容積を第４図に示すごとき８個の標準化冠状脳切断図（slice）について行った梗塞面積測定値から算定した。同一のテンプレートをトリフェニルテトラゾリウムクロライドパーフュージョン（灌流）（perfusion）（TTC）及び標準組織学的方法により梗塞容積の評価に利用した。左側の図はラットNo.4に対する0. 5mlのDMSO中に供給されたBAPTA-AM、18mg/kgについての結果を表し、右側の図はラットNo.6ついての0.5mlのDMSO中での対照にっいての結果を表す。第５図はBAPTA-AMは巣状脳虚血（focal cerebral ischemia）の後の梗塞容積を減少させることを示すグラフを表す。A.ランダム化二重盲検プラシーボ制御試験（randomized,double blinded placebocontrolled trial）においては、BAPTA -AM又はその誘導体による予備処理により、対照と比較して巣状梗塞容積が50％まで減少した。梗塞容積は２つの方法で評価した。第１は、トリフェニルテトラゾリウムクロライド（TTC）パーフュージョン、即ち、非梗塞帯域を赤色に生体染色することにより梗塞帯域を図で示す技術であり、第２は、梗塞帯域の組織学的評価である。梗塞容積は第４図に示すごとき方法で算定した。結果は平均値±標準偏差値で示されている。B.TTCによる梗塞容積評価値と組織学的評価値との関係。挿入図（inset）（上部）：２つの二重盲検ランダム化試験についての外科的プロトコール。第６図は第２の二重盲検ランダム化試験においては、BAPTA-AM及びその高K_d（低Ca²⁺-親和性）誘導体は、巣状脳虚血の後の梗塞容積を減少させることを示すグラフを表す。第２のランダム化二重盲検プラシーボ制御試験においては、BAPT A-AM（K_d約160nM）による予備処理により、対照と比較して、巣状梗塞容積が66 ％まで減少した。結果は平均値±標準偏差値で示されている。パート１：細胞培養試験培養CNSニューロンに対して外性グルタメートを適用することは、生体外での細胞毒性について一般的に使用されるかつ許容されている方式であり、生体内で CNSに生起する毒性促進性現象に近似するものである。従って、グルタメートによる攻撃（glutamatechallenge）をこの試験における細胞毒による刺激（cytoti xicstimulus）として使用した。デイジタルイメージ法（digitalimaging approa ch）を使用して、［Ca²⁺］_iを種々のニューロン（平均：実験１回当り、ニューロン10個、範囲4-27）にいおて同時に測定した。68回の試験において全体で667 個の脊髄ニューロンを検討した。23個（3.44％）のニューロンは、ベースラインの測定中に一様に高い［Ca²⁺］_i（＞250nM）を示すため、この試験から排除し、残りの644個のニューロンを生理学的パラメーターの統計学的分析のために使用した。全てのニューロンを14-17日間培養して、培養物についてグルタメート細胞毒に対する一定の高い感受性を得た（Regan及びChoi，1991）。生体外でのこの段階で、ニューロンは多量のニューライト（neurite）を形成し、卵形の、相の鮮明な（phase-bright）細胞体（ソーマ）の存在及びそのプロセスの形態（morphology）により周囲の細胞から容易に区別された。この研究で使用したニューロンの細胞体直径は平均で17 ±5.7μm（平均値±標準偏差）であった。全ての関連する試験を姉妹培養（sist er culture）で行い、その結果は後の分割物（dissection）からの培養物において反復された。“Ca²⁺調節解除”（“Ca²⁺deregulation”）はニューロン死の早期の指標（indi cator）である。第１図は脊髄ニューロンを250μMグルタメート（GLU）による50分間の攻撃に暴露した場合、［Ca²⁺］_iが急速に上昇し、ついで下方の“プラトー”まで降下することを示している。攻撃の終了後、生存ニューロン中の［Ca²⁺］_iは新しいプラトーに残留するか又はベースレベルに戻った。しかしながら、多くのニューロンにおいては［Ca²⁺］_iは遅延した、永続的なそして一般的に不可逆的な上昇を示し、これはしばしば、Ca²⁺指示器の動的範囲（dynamic range）を越えるた。この現象は生体染色染料、トリパンブルーによるニューロンの染色と密接に対応し、これはニューロン死に先行するか又は一致しなければならないことを指示している。脊髄ニューロンにおける観察は、グルタメート-誘発［Ca²⁺］_i過渡現象は一回の攻撃（Randall及びThayer,1992）又は反復した攻撃（Glaum等、1990 ）の後に海馬（hippocampal）ニューロンにおいて遅延したCa²⁺過負荷と細胞毒性を誘発するという最近報告された観察結果と一致する。この“Ca²⁺調節解除” （“Ca²⁺デイレギュレーション”）は、その開始後、ジヒドロピリジン（DHP）ニモジピン（nimopidine）（１μM）によるCa²⁺チャンネルの閉塞によっては阻止できず、DL-２-アミノ-５-ホスホノ吉草酸（APV,50μM）によるNMDAレセプターの閉塞によっても阻止し得ない。また、多くのニューロンにおいてはゼロ-Ca² ⁺ バッファーに切替えることにより直ちに逆転させることはできず、この［Ca²⁺ ］_iの第２の上昇は非特異的プラズマ膜の漏洩（plasma membrane leakiness）から生ずるものではなく、細胞Ca²⁺のホメオスタシス（ho meostatic）機構から生ずるらしいことを示唆している。“Ca²⁺調節解除”のプロセスは、通常、トリパンブルー又はエチジウムホモダイマー（ethidium homod imer）による明確な（positive）染色の前に生起し、細胞内フラ-2-フルオレッセンスの損失により判定される膜の溶解（membrane lysis）の前の30-40分間継続する。理論によって拘束されるものではないが、この観察結果は更に第２のCa²⁺ 過負荷はニューロン膜の甚だしい損傷の前に生起するという見解を支持している。膜透過性Ca²⁺バッファーは生体外でのCa²⁺調節解除とニューロン死を阻止する。本発明者はCa²⁺のニューロンへの流入により誘発される毒性の程度は［Ca²⁺］_i の上昇だけではなしに、Ca²⁺の流入経路の種類にも依存することを発見した。脊髄ニューロンにおいてはNMDAレセプター作動チャンネルからのCa²⁺の流入は、他の経路から誘発される同一の程度のCa²⁺の上昇に比較してよりかなり大きな損傷を与える（Tymaiansky等,1992）。このことはCa²⁺がNMDAレセプターチャンネルから流入した場合、このチャンネルは主としてこれらのプロセスで共働する（ co-localized）ため、神経毒性はより顕著になり、その結果、制御されていないか又は過度の方法で活性化された場合には、神経毒性が発現することを示している。このことはNMDAチャンネルとは関係なしに、グルタメート-誘発膜透過Ca²⁺ 勾配を調節する方法を使用して確認した。これはニューロンに膜透過型の種々のカルシウムバッファーを負荷させることにより行った。これらの薬剤は一旦、ニューロン中に入るとCa²⁺とキレートを生ずるが、NMDAチャンネル対して、報告されている効果を示さなかった。神経毒カスケードについての開始部位が真実にNM DAチャンネルに対して物理的に近接して配置されている場合、高い細胞質移動度（cytoplasmic mobility）を有する迅速性のCa²⁺バッファー（例えば、BAPTA,K_d約160nM,D_BAPTA 約2x10^-6cm²/sec）は、これらがその神経毒性“誘発部位”（D_Ca約0.2x10^-9cm²/ sec）に拡散する前にNMDAチャンネルを経て透過するので、Ca²⁺イオンを捕捉することにより神経保護性（neuroprotective）であることを示すべきである。同様の理由から、小さなCa²⁺親和性を有するが、より遅いバッファリング速度（bu ffering kinetics）を有するカルシウムバッファー（例えばEGTA,K_dpH7.2で約10 0nM）はCa²⁺を余りにも遅く捕捉する場合、神経保護性がより低いものであり、C a²⁺は神経毒作用部位に到達するのに十分な時間、放置され得る。解離培地（dissociated culture）中の脊髄ニューロンにフラ2-AMとCa²⁺ケレート化剤とを同時に負荷させた（load）（表１）。ついで脊髄ニューロンを前記したごとく250μMグルタメートによる50分間の攻撃に暴露した。BAPTA-AMとEGTA -AMによる負荷によりニューロン中に等濃度の２種のCa²⁺バッファーを生成させるために、バッファーを負荷媒体中に100μMの濃度（BAPTA-AMについての飽和濃度に近い濃度）で存在させた。過剰の膜透過性Ca²⁺バッファーの存在下では、バッファー負荷における制限因子は細胞内エステラーゼ活性となり、これは種々の実験からのニューロンにおいて等しいであろうと仮定した。第２図はニューロンを10μMのBAPTA-AMで予備処理した場合（第2C図）、［Ca² ⁺ ］_i過渡最大反応（transient amplitude）は対照と比較して減少していないことを示す実験を表す（第2B図参照）。しかしながら、Ca²⁺調節解除の頻度（freq uency）（星印）は明らかに減少した。ニューロンを100μMのBAPTA-AM（第2D図）及び100μMのEGTA-AM（第2E図）により予備処理することによりグルタメート誘発［Ca²⁺］_i過渡状態は著しく減少した。この効果は対照と比較してCa²⁺調節解除の割合が減少することを伴っていた。これに対して、30 μMの4,4'-F₂BAPTA、即ち、低いCa²⁺親和性（K_d約4600nM）を有するバッファーで予備処理したニューロンは、全て、50分間のグルタメートの攻撃により損傷した（succumb）。第2A図は実験時間を通じての記録の安定性を示す。第3D図は250μMのグルタメートで50分間攻撃した脊髄ニューロンの全てについての生存結果を示す。この攻撃によりCa²⁺調節解除と対照条件下での約80％のニューロンの細胞死が生じた（第3D図、CTRL）。このデーターは4,4'-F₂BAPTA（K_d =4600nM）を除いてこの研究で使用したCa²⁺バッファーの全ては細胞死を減少させるのに有効であることを示している。特に、ニューロンに等しい濃度（100μM ）で負荷させた場合、BAPTA）即ち、迅速性Ca²⁺バッファーは、EGTA、即ち、BAP TAに類似する親和性を有するより遅速性のCa²⁺バッファーより、著しくより神経保護性であった。この結果はCa²⁺は細胞質内の比較的短い距離を拡散してその神経毒作用部位に到達しなければならないという当初の仮説を支持している。この結果はまた、3600nMまでのK_dを有するバッファー（Br₂BAPTA）は高度に神経保護性であるので、神経毒性を誘発するためには［Ca²⁺］_iはマイクロモル濃度まで上昇しなければならないことも示している。これらのデーターはCa²⁺は、その濃度が4,4'-F₂BAPTAのCa²⁺親和性に近い水準まで上昇した場合には神経毒性になることを示している。 Ca²⁺バッファーを負荷させたニューロンの間においては、各々の実験での死亡ニューロンのフラクションと、当初の［Ca²⁺］_i過渡状態が定常状態に低下したときに到達する［Ca²⁺］_iプラトーの値（第3C図、R=0.986,p=0.0003）との間に直線的な関係がある。対照ニューロン（Ca²⁺バッファーを負荷させていないもの）における［Ca²⁺］_iプラトー値はこの関係における最も適合した（most-fit）直線上に存在しない（中実の四角形、第3C図）。対照ニューロンにおけるこの結果は、細胞質Ca²⁺指数（ピーク［Ca²⁺］_i、平均［Ca²⁺］_i及び［Ca²⁺］_i-時間経過曲線下の面積）はニューロン死率と相関関係がないことを示している本発明者が以前に報告したデーター（Tymianski等、1992）と一致する。プラトー［Ca²⁺］_iはこの研究でのバッファー負荷ニューロンにおける細胞死と高度に相関関係を有するという事実は、外部的に投与したCa²⁺バッファーは他の細胞Ca²⁺ホメオスタシスプロセスより優位を占めることを示している。即ち、細胞死の可能性は他の細胞ホメオスタシスプロセスよりも、［Ca²⁺］_iに関係するものとなっている。第3A図はBAPTA及びその誘導体を負荷させたニューロンにおけるプラトー［Ca² ⁺ ］_iは、バッファーのCa²⁺親和性に対数的に比例する水準に固定されることを示している。各々の実験における死亡ニューロンのフラクションと、バッファーの Ca²⁺親和性との間には同様の関係が存在する（第3B図）。この関係はEGTAの場合には存在しない。このことは後者のバッファーのバッファリング速度はBAPTA誘導体のバッファリング速度と比較して遅いことによって説明され得る。更に、細胞内pHは細胞死の際に低下するので、Ca²⁺に対するEGTAの親和性は、このバッファーは高度にpH感受性であるため、低下する可能性がある。パート２：脳切片についての実験前記の実験は、外生的に加えたCa²⁺バッファーが、グルタメートで誘発させたニューロン死に対して神経保護性であることを示している。下記の実験を行って、前記薬剤が生体内でニューロン中に首尾よく送達される（delivered）ことを明らかにした（方法については前記が参照される）。蛍光性BAPTA誘導体は動物全体に静脈内投与されると標的CNSニューロンに到達し、その中に浸透することを表わす証拠写真が得られた。1.5％ハロタンと、70 ％／30％の亜酸化窒素／酸素・混合物とを用いてフィッシャー344ラット成体に麻酔をかけた。カルシウムクリムソン-AM）すなわち590nmで最大励起を有するBAPTA誘導体をDMSOに溶解し、注入ポンプにより静脈内に注入した。対照動物にはDMSOのみの注入を受けさせた。この後で、ラットを断頭し、脳の横断切片（400μm）を得、レーザー走査共焦点顕微鏡（Bio-Rad MRC600）を用いて観察した。対照切片及び薬物負荷切片を同じ焦点設定で観察した。ラットの脳切片から得られた共焦点顕微鏡画像は、カルシウムクリムソン-AM ）すなわちBAPTAの蛍光性誘導体が静脈内注入（第2A図参照）により海馬CA1領域のニューロンと、皮質ニューロンとの中に送達され得ることを明らかにしている。ラット血液及び細胞外流体中における前記誘導体の溶解性を確実にするために、カルシウムクリムソン-AMをDMSO中に溶解した（0.5ml中に400μｇ）。DMSOのみを用いた対照の脳切片では、可視蛍光はほとんど又は全くないことが明確に示された。比較により、このCa²⁺バッファーを負荷したラットから得られた切片中の個々の皮質ニューロン及び海馬CA1ニューロンにおいてカルシウムクリムソンの蛍光が明確に肉眼で観察し得た。これにより、静脈内注入による個々のCNSニューロン中への膜透過性Ca²⁺バッファーのローディングが明らかにされた。パート３：生体内実験前記の結果は、膜透過性のCa²⁺バッファーが生体外で脊髄ニューロンにおいて神経保護性であること及び該バッファーが哺乳類動物CNS中に首尾よく送達され得ることを明らかにしている。本発明者らはさらに、外生的（exogeneously）に投与されたCa²⁺バッファーを使用する細胞内Ca²⁺キレート化が、生体内での有効な神経保護法として存在することを明らかにした。第４図は第１の研究における実験から得られた代表的結果を表わし、該研究においてはBAPTA-AM（DMSO 0.5ml において送達された18mg/kg）の神経保護効果がラット皮質発作モデルで評価された。第４図は、対照（第４図右側パネル画像）に比べて、BAPTA-AMで処理したラット（第４図左側パネル画像の影を付けた領域）において、皮質発作（cortical stroke）の大きさ（volume）が顕著に減少したことを表わしている。皮質の梗塞の大きさ（volume）は２つの独立した方法：すなわちTTCと組織学（前記の方法の部参照）とを用いて評価した。第5B 図は、両方の方法が皮質の梗塞の大きさを評価するのに信頼し得るものであったことを表わしている。第１の生体内研究の結果を第5A図に示す。対照と比較して、BAPTA-AMで処理したラットでは皮質の発作の大きさが著しく減少した。対照のラットではTTC評価及び組織学的評価それぞれを使用して、38.32％±10.95％及び46.14％±9.52％（平均値±標準誤差）の発作の大きさ（volume）が確認された。これに対して、BAPTA-AMで前処理したラットでは、TTC評価及び組織学的評価それぞれを使用して、19.58％±5.41％及び20.62％±7.42％の発作の大きさ（ volume）が確認された。すなわち、BAPTA-AMを用いた動物の前処理により、皮質発作の大きさにおいて50％の低下（TTC評価及び組織学的評価それぞれについてp =0.008及びp=0.001）が達成された。 BAPTA-AM並びに5,5'-F₂-BAPTA-AM及び4,4'-F₂-BAPTA-AMを使用する同じラット発作モデルでの第２の研究（方法の部参照）は、全体でラット38匹及び５群（１群当たりにつき７〜８ラット）を含んでいた。BAPTA並びにその誘導体である4,4 '-ジフルオロ-BAPTA及び5,5'-ジフルオロ-BAPTAを、ラットに体重kg当たり18mg の投与量で且つDMSOの0.5ccの溶液で50分間にわたって注入した。DMSOのみの点滴を受けたラットに生じた梗塞が通常よりも大きいか否かを試験するために、本発明者らは、生理的食塩水0.5ccの注入を受けさせた１群を第２の対照として加えた。第６図は、BAPTA並びにその２種類の誘導体を用いて処理したラットがDMS Oの注入を受けた対照又は生理的食塩水の注入を受けた対照のいずれよりも実質的に小さい梗塞の大きさを支持していることを示している。梗塞の大きさの低下は、DMSO単独の群と比較して4,4'-ジフルオロ-BAPTA及び5,5'-ジフルオロ-BAPTA での50％から、BAPTA-AM単独での55％にまで及ぶ。結果は4,4'-F₂-BAPTA-AMに関してはp≦0.05並びにBAPTA-AM及び5,5'-F₂-BAPTA-AMに関してはp≦0.005で実質的に有意であった。さらに本発明者らは、前記の組織培養実験において認められたCa²⁺緩衝化（bu ffering）能力とニューロン生存率との間に認められた関係（第3B図）が生体内で再現されることを確認した。これについての重要性は、相当する神経保護が低いCa²⁺親和性（高いK_d）をもつCa²⁺バッファーを用いて得られることから、これらの薬剤すなわちバッファーはニューロンの通常の機能をあまり妨害しないように思われるということにある。本発明の医薬組成物の例医薬に許容し得るキャリヤであるジメチルスルホキシドにBAPTA-AMを溶解することによって、BAPTA-AMを１％（重量／容量）含有するジメチルスルホキシドの溶液を調製した。本発明を詳細に且つその特定の態様を挙げて説明したが、本明細書及び請求の範囲に記載の発明の精神及び範囲から掛け離れることなく種々の改変及び改良を行い得ることは当業者には明らかであろう。

【手続補正書】特許法第１８４条の８【提出日】１９９４年９月２３日【補正内容】請求の範囲１．哺乳類動物を無毒性でかつ損傷を減少させるのに有効な量の細胞膜透過性カルシウムバッファーで処理することを特徴とする、哺乳類動物における脳又は脊髄に対する虚血又は外傷的傷害による損傷効果を低減させるか又はテンカンを処置するための方法。２．前記細胞膜透過性バッファーはカルシウムイオンキレート化剤である、請求の範囲１に記載の方法。３．前記細胞膜透過性バッファーは他の金属イオンと比較して、本質的にカルシウムイオン選択性である、請求の範囲１に記載の方法。４．前記細胞膜透過性バッファーは１ｘ10^-4〜１ｘ10^-8モルの範囲から選ばれたK_D有する、請求の範囲１に記載の方法。５．前記細胞膜透過性バッファーは一般式：［式中、Aは-NO₂又は-Hであり； R¹は-H（R²もHでない場合）、-CH₃、-F、-Cl及び-Brからなる群から選ばれ； R²は-H（R²もHでない場合）、-CH₃、-F、-Cl、-Br及び C₁-C₄アルコキシからなる群から選ばれ； R³、R⁴及びR⁵は各々-H、OH、NR⁶R⁷又はアルコキシであるか、又は、 R³とR⁴が一緒に-OCH₂O-又は-OCH₂CH₂O-を表し、R⁵が-H、OH、NR⁶R⁷又はアルコキシを表すか、又は、 R⁴とR⁵が一緒に-OCH₂O-又は-OCH₂CH₂O-を表し、R³が-H、OH、NR⁶R⁷又はアルコキシを表し； Xは-OH、アルコキシ、-Cl、-Br、-NR⁶R⁷、-OCOCH₃、-OCOCF₃、-OCOCH₂NH₂、-OPO₃ H及び-OSO₂CH₃からなる群から選ばれ； R⁶及びR⁷は各々-H、メチル又はエチルであり； R⁸及びR⁹は各々-H、-CH₃、-C₂H₅又は-CH₂OHであるが、但し、両者が同時に-Hであることできないものし；或いは R⁸及びR⁹が一緒に-（CH₂）m-Y-（CH₂）n-（m及びnは各々１又は２であり、Yは-C H₂-、-O-、-NR⁶、-S-及び-S-S-からなる群から選ばれる）を表し； Wは-H、-OH又は-NHR⁶である］を有する化合物及びその薬理学的に許容される無毒性塩及びエステルである、請求の範囲１に記載の方法。６．前記細胞膜透過性バッファーは一般式：［式中、Aは−NO₂又は-Hであり； R³、R⁴及びR⁵は各々-H、OH、NR⁶R⁷又はアルコキシであるか、又は、R³とR⁴が一緒に-OCH₂O-又は-OCH₂CH₂O-を表し、R⁵が-H、OH、NR⁶R⁷又はアルコキシを表すか、又は、 R⁴とR⁵が一緒に-OCH₂O-又は-OCH₂CH₂O-を表し、R³が-H、OH、NR⁶R⁷又はアルコキシを表し； Xは-OH、アルコキシ、-Cl、-Br、-NR⁶R⁷、-OCOCH₃、-OCOCF₃、 -OCOCH₂NH₂、-OPO₃H及び-OSO₂CH₃からなる群から選ばれ； R⁶及びR⁷は各々-H、メチル又はエチルであり； R⁸及びR⁹は各々-H、-CH₃、-C₂H₅又は-CH₂OHであるが、但し、両者が同時に-Hであることできないものとし；或いは R⁸及びR⁹が一緒に-（CH₂）m-Y-（CH₂）n-（m及びnは各々１又は２であり、Yは-C H₂-、-O-、-NR⁶、-S-及び-S-S-からなる群から選ばれる）を表し； Wは-H、-OH又は-NHR⁶である］を有する化合物及びその薬理学的に許容される無毒性塩及びエステルである、請求の範囲１に記載の方法。７．前記細胞膜透過性バッファーは一般式：［式中、E¹及びE²は各々H、CH₃、C₂H₅、CH₂OH、COOH又はCH₂COOHであるか又はE¹ とE²は一緒に-（CH₂）m-V-（CH₂）n-（m及びnは各々１又は２であり、Vは-CH₂- 、-O-、NH-、-NMc-、-S-及び-S-S-からなる群から選ばれる）を表し； WはH、OH又はCOOHであり； XはH、Me、COOH、F、Cl、Br、Ｉ又はNO₂であり； Yは-O-、-NMe-、-S-、-CH₂-、-CMe₂-、-CF₂又は５員中心環を形成する直接シグマ結合であり； Z¹、Z²、Z³及びZ⁴は各々H、F、Cl、Br、Ｉ又はMeであり、Q及びQ²はR₁R₂N-、HO- 又はO=（R₁及びR₂は各々H、Me及びEtからなる群から選ばれる）に等しいか又はZ¹、Q¹又はZ³は一緒に -（CH₂）₃-N-（CH₂）₃を表し；Z²、Q²、Z⁴は一緒に -（CH₂）₃-N-（CH₂）₃を表す］を有する化合物及びその薬理学的に許容される無毒性塩及びエステルである、請求の範囲１に記載の方法。８．前記細胞膜透過性バッファーは一般式：［式中、E¹及びE²は各々H、CH₃、C₂H₅、CH₂OH、COOH又はCH₂COOHであるか又はE¹ とE²は一緒に-（CH₂）m-V-（CH₂）n-（m及びnは各々１又は２であり、Vは-CH₂- 、-O-、NH-、-NMc-、-S-及び-S-S-からなる群から選ばれる）を表し； WはH、OH又はCOOHであり； XはH、Me、COOH、F、Cl、Br、Ｉ又はNO₂であり； Yは-O-、-NMe-、-S-、-CH₂-、-CMe₂-、-CF₂-、-CO-又は５員中心環を形成する直接シグマ結合であり； Z¹、Z²、Z³及びZ⁴は各々H、F、Cl、Br、Ｉ又はMeであり、 Q¹及びQ²はR₁R₂N-、 + R₁R₂N- 又はHO-、O=又はR₁R₂N-、O-（R₁及びR₂は各々H、Me及びEtからなる群から選ばれる）に等しいか又はZ¹、Q¹、Z³は一緒に -（CH₂）₃-N-（CH₂）₃ を表し； Z²、Q²、Z⁴は一緒に -（CH₂）₃-N-（CH₂）₃ を表す］を有する化合物及びその薬理学的に許容される無毒性塩及びエステルである、請求の範囲１に記載の方法。９．前記細胞膜透過性バッファーは一般式：［式中、R¹及びR³は各々-H、OH、-CH₃、-F、-Cl、-Br、-Ｉ、-COOH、-CN、-NO₂ 又は-NHR⁷（R⁷は-H、メチル又はエチルから選ばれる）から選ばれ； R²は-（C=O）CR⁸-N-N（R⁸は-H、C₁-C₄アルキル、フェニル、-COOH、-COOR⁷-（C- O）CH₃又は-CF₃であり、R₇は前記の意義を有する）であり； R⁴はR²、-H、-CH₃、-CH₂CH₃、-F、-Cl、-Br、-Ｉ、COOH、-CN又は-NO₂から選ばれ； R⁵及びR⁶は各々-H、-CH₃、-C₂H₅、フェニル又は-CH₂OHから選ばれるか、又はR⁵ とR⁶は一緒に-（CH₂）m-Y-（CH₂）n-（m及びnは各々１又は２であり、Yは-CH₂- 、-O-、-NHR⁷、-S-又は-S-S-から選ばれ、R⁷は前記に意義を有する）を形成している］を有する化合物及びその塩又は非重合体状エステルである、請求の範囲１に記載の方法。１０．前記細胞膜透過性バッファーはBAPTA-AM；EGTA-AM；5,5'ジブロモBAPTA -AM；5,5'ジフルオロBAPTA-AM；及び4,4'ジフルオロBAPTA-AMからなる群から選ばれる、請求の範囲１に記載の方法。１１．前記の傷害は前記組織に対する血液流、酸素流又は栄養流の減少、外傷、放射線、毒素への暴露、新組織形成退化プロセス又は炎症により惹起される、請求の範囲１に記載の方法。１２．前記の傷害は脳虚血である、請求の範囲１に記載の方法。１３．前記哺乳類動物組織は中枢神経系の哺乳類動物細胞からなる、請求の範囲１１に記載の方法。１４．哺乳類動物に対する前記の傷害が発生する前に、該哺乳類動物を予防量の前記細胞膜透過性カルシウムバッファーで処理する、請求の範囲１に記載の方法。１５．哺乳類動物に前記の傷害が生じた後に、前記細胞膜透過性カルシウムバッファーを哺乳類動物に投与する、請求の範囲１に記載の方法。１６．細胞膜透過性カルシウムバッファーを静脈内投与により、包膜内投与により、槽内投与により、室内投与により、局部投与により、皮下投与により、注射により及び筋肉内注射により哺乳類動物に投与する、請求の範囲１に記載の方法。１７．哺乳類動物の脳又は脊髄に対する虚血又は外傷的傷害による損傷効果を低減させるか又は哺乳類動物のテンカンを処置するための細胞膜透過性カルシウムバッファー。１８．カルシウムイオンキレート化剤である、請求の範囲１７に記載の細胞膜透過性カルシウムバッファー。１９．他の金属イオンと比較して、本質的にカルシウムイオン選択性である、請求の範囲１７に記載の細胞膜透過性カルシウムバッファー。２０．１ｘ10^-4〜１ｘ10^-8モルの範囲から選ばれたK_D有する、請求の範囲１７に記載の細胞膜透過性カルシウムバッファー。２１．BAPTA-AM；EGTA-AM；5,5'ジブロモBAPTA-AM；5,5'ジフルオロBAPTA-AM ；及び4,4'ジフルオロBAPTA-AMからなる群から選ばれる、請求の範囲１７に記載の細胞膜透過性カルシウムバッファー。２２．請求の範囲１７に記載の細胞膜透過性カルシウムバッファーとそのための薬理学的に許容される担体とを混合してなる、哺乳類動物の脳又は脊髄に対する虚血又は外傷的傷害による損傷効果を低減させるか又は哺乳類動物のテンカンを処置するための医薬組成物。２３．生体内の細胞のイオンチャンネル付近のCa²⁺イオンの濃度を制御して有毒な量のCa²⁺イオンがCa²⁺流入源付近の位置の細胞下の部位へ拡散することを防止することにより、神経毒現象の誘発を防止するにあたり、有効な、無毒性の量の細胞膜透過性Ca²⁺バッファーを生体内の細胞に投与することを特徴とする、Ca²⁺ イオンの濃度の制御方法。２４．前記細胞膜透過性カルシウムバッファーは１ｘ10^-4〜１ｘ10^-8モルの範囲から選ばれたK_D有するカルシウムイオンキレート化剤である、請求の範囲２３に記載の方法。２５．前記細胞膜透過性バッファーはBAPTA-AM；EGTA-AM；5,5'ジブロモBAPTA -AM；5,5'ジフルオロBAPTA-AM；及び4,4'ジフルオロBAPTA-AMからなる群から選ばれる、請求の範囲２３に記載の方法。２６．細胞膜透過性カルシウムバッファーとそのための薬理学的に許容される担体とを混合することを特徴とする、哺乳類動物の脳又は脊髄に対する虚血又は外傷的傷害による損傷効果を低減させるか又はテンカンを処置するための医薬組成物の調製方法。２７．前記細胞膜透過性カルシウムバッファーはカルシウムイオンキレート剤である、請求の範囲２６に記載の方法。２８．前記細胞膜透過性カルシウムバッファーは、哺乳類動物組織の細胞に対する傷害による損傷効果を低減させるために、他の金属イオンと比較して、実質的にカルシウムイオン選択性である、請求の範囲２６に記載の方法。２９．細胞膜透過性カルシウムバッファーは１ｘ10^-4〜１ｘ10^-8モルの範囲から選ばれたK_D有する、請求の範囲２６に記載の方法。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号庁内整理番号ＦＩＡ６１Ｋ 31/38 9454−4Ｃ // Ｃ０７Ｄ 311/80 9360−4Ｃ 335/12 9455−4Ｃ 339/08 9455−4Ｃ (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＴ，ＡＵ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＨＵ，ＪＰ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＫ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＧ，ＭＮ，ＭＷ，ＮＬ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＫ，ＵＡ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ (72)発明者チヤールトン，ミルトン，ピーカナダ国．オンタリオ・エム５テイ・２エス８．トロント．バタースト・ストリート．399．トロント・ウエスターン・ホスピタル．プレイフエアー・ニユーロサイエンス・ユニツト (72)発明者タイミアンスキー，マイケルカナダ国．オンタリオ・エム５テイ・２エス８．トロント．バタースト・ストリート．399．トロント・ウエスターン・ホスピタル．プレイフエアー・ニユーロサイエンス・ユニツト

Claims

【特許請求の範囲】１．哺乳類動物組織を無毒性で、損傷を減少させるのに有効な量の細胞膜透過性カルシウムバッファーで処理することを特徴とする、生体内での哺乳類動物組織の細胞に対する傷害による損傷効果を低減させかつテンカンを処置するため方法。２．前記細胞膜透過性バッファーはカルシウムイオンキレート化剤である、請求の範囲１に記載の方法。３．前記細胞膜透過性カルシウムバッファーは他の金属イオンと比較して本質的にカルシウムイオン選択性である、請求の範囲１に記載の方法。４．前記細胞膜透過性バッファーは１ｘ10^-4〜１ｘ10^-8モルの範囲から選ばれたＫ_D有する、請求の範囲１に記載の方法。５．前記細胞膜透過性バッファーは一般式：［式中、Aは-NO₂又は-Hであり； R¹は-H（R²もHでない場合）、-CH₃、-F、-Cl及び-Brからなる群から選ばれ； R²は-H（R²もHでない場合）、-CH₃、-F、-Cl、-Br及びC₁−C₄アルコキシからなる群から選ばれ； R³、R⁴及びR⁵は各々-H、OH、NR⁶R⁷又はアルコキシであるか、又は、R³とR⁴が一緒に-OCH₂O-又は-OCH₂CH₂O-を表し、R⁵が-H、OH、NR⁶R⁷又はアルコキシを表すか、又は、 R⁴とR⁵が一緒に-OCH₂O-又は-OCH₂CH₂O-を表し、R³が-H、OH、NR⁶R⁷又はアルコキシを表し； Xは-OH、アルコキシ、-Cl、-Br、-NR⁶R⁷、-OCOCH₃、-OCOCF₃、-OCOCH₂NH₂、-OPO₃ H及び-OSO₂CH₃からなる群から選ばれ； R⁶及びR⁷は各々-H、メチル又はエチルであり； R⁸及びR⁹は各々-H、-CH₃、-C₂H₅又は-CH₂OHであるが、但し、両者が同時に-Hであることできないものし；或いは R⁸及びR⁹が一緒に-（CH₂）m-Y-（CH₂）n-（m及びnは各々１又は２であり、Yは-C H₂-、-O-、-NR⁶、-S-及び-S-S-からなる群から選ばれる）を表し； Wは-H、-OH又は-NHR⁶である］を有する化合物及びその薬理学的に許容される無毒性塩及びエステルである、請求の範囲１に記載の方法。６．前記細胞膜透過性バッファーは一般式：［式中、Aは-NO₂又は-Hであり； R^３、R^４及びR⁵は各々-H、OH、NR⁶R⁷又はアルコキシであるか、又は、R³とR⁴が一緒に-OCH₂O-又は-OCH₂CH₂O-を表し、R⁵が-H、OH、NR⁶R⁷又はアルコキシを表すか、又は、 R⁴とR⁵が一緒に-OCH₂O-又は-OCH₂CH₂O-を表し、R³が-H、OH、NR⁶R⁷又はアルコキシを表し； Xは-OH、アルコキシ、-Cl、-Br、-NR⁶R⁷、-OCOCH₃、-OCOCF₃、 -OCOCH₂NH₂、-OPO₃H及び-OSO₂CH₃からなる群から選ばれ； R₆及びR₇は各々-H、メチル又はエチルであり； R⁸及びR⁹は各々-H、-CH₃、-C₂H₅又は-CH₂OHであるが、但し、両者が同時に-Hであることできないものとし；或いは R⁸及びR⁹が一緒に-（CH₂）m-Y-（CH₂）n-（m及びnは各々１又は２であり、Yは-C H₂-、-O-、-NR⁶、-S-及び-S-S-からなる群から選ばれる）を表し； Wは-H、-OH又は-NHR⁶である］を有する化合物及びその薬理学的に許容される無毒性塩及びエステルである、請求の範囲１に記載の方法。７．前記細胞膜透過性バッファーは一般式：［式中、E¹及びE²は各々H、CH₃、C₂H₅、CH₂OH、COOH又はCH₂COOHであるか又はE¹ とE²は一緒に-（CH₂）m-V-（CH₂）n-（m及びnは各々１又は２であり、Vは-CH₂- 、-O-、NH-、-NMc-、-S-及び-S-S-からなる群から選ばれる）を表し； WはＨ、OH又はCOOHであり； XはH、Me、COOH、F、Cl、Br、Ｉ又はNO₂であり； Yは-O-、-NMe-、-S-、-CH2-、-CMe₂-、-CF₂又は５員中心環を形成すZ¹、Z²、Z3 及びZ⁴は各々H、F、Cl、Br、Ｉ又はＭｅであり、Q¹及びQ²はR₁R₂N-、HO-又はO= （R₁及びR₂は各々H、Me及びEtからなる群から選ばれる）に等しいか又はZ¹、Q¹又はZ³は一緒に -（CH₂）₃-N-（CH₂）₃を表し；Z²、Q²、Z⁴は一緒に-（CH₂）₃-N-（CH₂）₃を表す］を有する化合物及びその薬理学的に許容される無毒性塩及びエステルである、請求の範囲１に記載の方法。８．前記細胞膜透過性バッファーは一般式：［式中、E¹及びE²は各々H、CH₃、C₂H₅、CH₂OH、COOH又はCH₂COOHであるか又はE¹ とE²は一緒に-（CH₂）m-V-（CH₂）n-（m及びnは各々１又は２であり、Vは-CH₂- 、-O-、NH-、-NMc-、-S-及び-S-S-からなる群から選ばれる）を表し； WはH、OH又はCOOHであり； XはH、Me、COOH、F、Cl、Br、Ｉ又はNO₂であり； Yは-O-、-NMe-、-S-、-CH₂-、-CMe₂-、-CF₂-、-CO-又は５員中心環を形成する直接シグマ結合であり： Z¹、Z²、Z³及びZ⁴は各々H、F、Cl、Br、Ｉ又はMeであり、 Q¹及びQ²はR₁R₂N-、＋ R₁R₂N- 又はHO-、O=又はR₁R₂N-、O-（R₁及びR₂は各々H、Me及びEtからなる群から選ばれる）に等しいか又はZ¹、Q¹、Z³は一緒に -（CH₂）₃-N-（CH₂）₃ を表し； Z²、Q²、Z⁴は一緒に -（CH₂）₃-N-（CH₂）₃ を表す］を有する化合物及びその薬理学的に許容される無毒性塩及びエステルである、請求の範囲１に記載の方法。９．前記細胞膜透過性バッファーは一般式：［式中、R¹及びR³は各々-H、OH、-CH₃、-F、ーCl、-Br、-I、-COOH、-CN、-NO₂又は-NHR⁷（R⁷は-H）メチル又はエチルから選ばれる）から選ばれ； R²は-（C=O）CR⁸-N-N（R⁸は-H、C₁-C₄アルキル、フェニル、-COOH、-COOR⁷-（C- O）CH₃又は-CF₃であり、R₇は前記の意義を有する）であり； R⁴はR²、-H、-CH₃、-CH₂CH₃、-F、-Cl、-Br、-I、COOH、-CN又は-NO₂から選ばれ； R⁵及びR⁶は各々-H、-CH₃、-C₂H₅、フェニル又は-CH₂OHから選ばれるか、又はR⁵ とR⁶は一緒に-（CH₂）m-Y-（CH₂）n-（m及びnは各々１又は２記に意義を有する）を形成している］を有する化合物及びその塩又は非重合体状エステルである、請求の範囲１に記載の方法。１０．前記細胞膜透過性バッファーはBAPTA-AM；EGTA-AM；5,5'ジブロモBAPTA -AM；5,5'ジフルオロBAPTA-AM；及び4,4'ジフルオロBAPTA-AMからなる群から選ばれる、請求の範囲１に記載の方法。１１．前記傷害は前記組織に対する血液流、酸素流又は栄養流の減少、外傷、放射線、毒素への暴露、新組織形成退化プロセス又は炎症により惹起される、請求の範囲１に記載の方法。１２．前記の傷害は脳虚血である、請求の範囲１に記載の方法。１３．前記哺乳類動物組織は心臓、肝臓、脾臓、胃腸管、血管平滑筋及び神経系統の哺乳類動物細胞からなる、請求の範囲１に記載の方法。１４．哺乳類動物組織の前記細胞を、該細胞に対する前記の傷害が発生する前に、予防量の前記細胞膜透過性カルシウムバッファーで処理する、請求の範囲１に記載の方法。１５．哺乳類動物組織が前記の傷害を受けた後に細胞膜透過性カルシウムバッファーを前記細胞に投与する、請求の範囲１に記載の方法。１６．細胞膜透過性カルシウムバッファーを静脈内投与により、内包膜投与により、槽内投与により、室内投与により、局部投与により、皮下投与により、注射により及び筋肉内注射により哺乳類動物に投与する、請求の範囲１に記載の方法。１７．哺乳類動物組織の細胞に対する傷害による損傷効果を低減させるための細胞膜透過性カルシウムバッファー。１８．哺乳類動物組織の細胞に対する傷害による損傷効果を低減させるためのカルシウムイオンキレート化剤である、請求の範囲１７に記載の細胞膜透過性カルシウムバッファー。１９．哺乳類動物組織の細胞に対する傷害による損傷効果を低減させるための、他の金属イオンと比較して本質的にカルシウムイオン選択性である、請求の範囲１７に記載の細胞膜透過性カルシウムバッファー。２０．哺乳類動物組織の細胞に対する傷害による損傷効果を低減させるための、１ｘ10^-4〜１ｘ10^-8モルの範囲から選ばれたK_D有する、請求の範囲１７に記載の細胞膜透過性カルシウムバッファー。２１．BAPTA-AM；EGTA-AM；5,5'ジブロモ-BAPTA-AM；5,5'ジフルオロBAPTA-AM及び4,4'ジフルオロBAPTA-AMからなる群から選ばれる、請求の範囲１７に記載の細胞膜透過性カルシウムバッファ。２２．請求の範囲１７に記載の細胞膜透過性カルシウムバッファーとこれに対する薬理学的に許容される担体とを混合してなる、哺乳類動物組織の細胞に対する傷害による損傷効果を低減させるか又はテンカンを処置するための医薬組成物。２３．生体内の細胞のイオンチャンネル付近のCa²⁺イオンの濃度を制御して有毒な量のCa²⁺イオンがCa²⁺流入源付近の位置の細胞下の部位へ拡散することを防止することにより、神経毒現象の誘発を防止するにあたり、有効な、無毒性の量の細胞膜透過性Ca²⁺バッファーを生体内の細胞に投与することを特徴とする、Ca²⁺ イオンの濃度の制御方法。２４．細胞膜透過性バッファーは１ｘ10^-4〜１ｘ10^-8モルの範囲から選ばれた K_D有するカルシウムイオンキレート化剤である、請求の範囲２３に記載の方法。２５．前記細胞膜透過性バッファーはBAPTA-AM；EGTA-AM；5,5'ジブロモBAPTA -AM；5,5'ジフルオロBAPTA-AM；及び4,4'ジフルオロBAPTA-AMからなる群から選ばれる、請求の範囲２３に記載の方法。２６．細胞膜透過性カルシウムバッファーとこれに対する薬理学的に許容される担体とを混合することを特徴とする、哺乳類動物組織の細胞に対する傷害による損傷効果を低減させるか又はテンカンを処置するための医薬組成物の調製方法。２７．前記細胞膜透過性カルシウムバッファーはカルシウムイオンキレート化剤である、請求の範囲２６に記載の方法。２８．前記細胞膜透過性カルシウムバッファーは、哺乳類動物組織の細胞に対する傷害による損傷効果を低減させるために、他の金属イオンと比較して、本質的にカルシウムイオン選択性である、請求の範囲２６に記載の方法。２９．前記細胞膜透過性カルシウムバッファーは１ｘ10^-4〜１ｘ10^-8モルの範囲から選ばれたK_D有する、請求の範囲２６に記載の方法。