WO2012136910A1 - Dérives de 4- arylcoumarine et de 4 arylquinoléine, leurs utilisations thérapeutiques et leur procédé de synthèse - Google Patents
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- C07D403/04—Heterocyclic compounds containing two or more hetero rings, having nitrogen atoms as the only ring hetero atoms, not provided for by group C07D401/00 containing two hetero rings directly linked by a ring-member-to-ring-member bond
Definitions
- antimitotic agents which target microtubules, are among the most effective compounds for the treatment of solid tumors and metastatic cancers. These compounds promote cell death by interfering with the structural and microtubule normalization functions at the cellular level. Antitubulin agents can be classified into two groups depending on whether they destabilize or stabilize microtubules.
- the screening and development of new therapeutic targets as well as new anti-cancer agents are, at present, one of the major concerns of the fight against cancer. More particularly, the screening and the development of new anticancer agents insensitive to these membrane pumps remain a real challenge.
- X is chosen from an oxygen or nitrogen atom
- Y is an oxygen atom when X is an oxygen atom, and Y is a hydrogen atom when X is a nitrogen atom;
- R2 is chosen from a hydrogen atom, a linear or branched alkoxy radical of 1 to 4 carbon atoms or -CF3;
- R 3 is chosen from a hydrogen atom, a hydroxyl, a linear or branched alkoxy radical of 1 to 4 carbon atoms, -CF 3, -NO 2 or -NH 2;
- R 4 is chosen from a hydrogen atom, a linear or branched alkoxy radical of 1 to 4 carbon atoms or -CF 3;
- Z is chosen from an alkoxy radical of 1 to 4 carbon atoms or a mono- or dialkylamino radical of 1 to 4 carbon atoms, or taken together with
- the Applicant has been able to demonstrate that the 4-arylcoumarin and 4-arylquinoline derivatives according to the invention are cytotoxic agents having an effective antiproliferative activity.
- the compounds according to the invention are insensitive to membrane efflux pumps of the ABC family which cause the main mechanism of resistance developed by the tumor cells or by the endothelial cells lining the irrigating vessels.
- tumor cells in particular the expression or overexpression of ATP-dependent efflux pumps, such as ABC P-gp (ABCB1) and BCRP (ABCG2) transporters also known as Mitoxantrone Resistance Protein (MXR) or Placenta ABC Protein ( ABC-P), which expel out of the tumor cell cytotoxics of various structures.
- P-gp is mainly expressed or even overexpressed at the proximal convoluted tubule cells of the kidney and the adrenal glands, intestinal, liver, lung, colon, pancreatic, trophoblasts of the placenta and endothelium of the blood brain and blood-testis barrier, even on the surface of lymphocytes of the immune system.
- the expression of P-gp in these cells and in particular in the cerebral capillaries (hemomeningeal barrier) and testicular explains the phenomena of associated resistance.
- BCRP is more particularly expressed by the endothelial cells of the cerebral capillaries.
- the other tissues, which have the highest level of expression of BCRP are the placenta (trophoblastic cells), the liver (canalicular membranes), the small intestine and the colon (apical membranes), the lung, the kidney, adrenal glands, epithelia of veins, blood vessels and some hematopoietic stem cells.
- the present invention also has for its second object compounds of general formula:
- X is chosen from an oxygen or nitrogen atom
- Y is an oxygen atom when X is an oxygen atom, and Y is a hydrogen atom when X is a nitrogen atom;
- R1 is chosen from a hydrogen atom or a linear or branched alkoxy radical of 1 to 4 carbon atoms;
- R2 is chosen from a hydrogen atom, a linear or branched alkoxy radical of 1 to 4 carbon atoms or -CF3;
- R 3 is chosen from a hydrogen atom, a hydroxyl, a linear or branched alkoxy radical of 1 to 4 carbon atoms, -CF 3, -NO 2 or -NH 2;
- R 4 is chosen from a hydrogen atom, a linear or branched alkoxy radical of 1 to 4 carbon atoms or -CF 3;
- R10, R1 1, R12, R13 taken independently are selected from a hydrogen atom, a linear or branched alkyl radical of 1 to 6 carbon atoms, a hydroxyl or a linear or branched alkoxy radical of 1 to 4 carbon atoms ;
- Z is chosen from an alkoxy radical of 1 to 4 carbon atoms or a mono- or dialkylamino radical of 1 to 4 carbon atoms, or taken together with R 12 forms a pyrrole group optionally monosubstituted by a linear or branched alkyl radical of 1 to 3 carbon atoms;
- the subject of the present invention is also a product containing a compound of general formula:
- X is chosen from an oxygen or nitrogen atom
- Y is an oxygen atom when X is an oxygen atom, and Y is a hydrogen atom when X is a nitrogen atom;
- R1 is chosen from a hydrogen atom or a linear or branched alkoxy radical of 1 to 4 carbon atoms;
- R2 is chosen from a hydrogen atom, a linear or branched alkoxy radical of 1 to 4 carbon atoms or -CF3;
- R 3 is chosen from a hydrogen atom, a hydroxyl, a linear or branched alkoxy radical of 1 to 4 carbon atoms, -CF 3, -NO 2 or -NH 2;
- R 4 is chosen from a hydrogen atom, a linear or branched alkoxy radical of 1 to 4 carbon atoms or -CF 3;
- R10, R1 1, R12, R13 taken independently are selected from a hydrogen atom, a linear or branched alkyl radical of 1 to 6 carbon atoms, a hydroxyl or a linear or branched alkoxy radical of 1 to 4 carbon atoms ;
- Z is chosen from an alkoxy radical of 1 to 4 carbon atoms or a mono- or dialkylamino radical of 1 to 4 carbon atoms, or taken together with R 12 forms a pyrrole group optionally monosubstituted by a linear or branched alkyl radical of 1 to 3 carbon atoms;
- the subject of the present invention is also a fourth product containing a compound of general formula:
- X is chosen from an oxygen or nitrogen atom
- Y is an oxygen atom when X is an oxygen atom, and Y is a hydrogen atom when X is a nitrogen atom;
- R1 is chosen from a hydrogen atom or a linear or branched alkoxy radical of 1 to 4 carbon atoms;
- R2 is chosen from a hydrogen atom, a linear or branched alkoxy radical of 1 to 4 carbon atoms or -CF3;
- R 4 is chosen from a hydrogen atom, a linear or branched alkoxy radical of 1 to 4 carbon atoms or -CF 3;
- R10, R11, R12, R13 taken independently are selected from a hydrogen atom, a linear or branched alkyl radical of 1 to 6 carbon atoms, a hydroxyl or a linear or branched alkoxy radical of 1 to 4 carbon atoms;
- Z is chosen from an alkoxy radical of 1 to 4 carbon atoms or a mono- or dialkylamino radical of 1 to 4 carbon atoms, or taken together with R12 forms a pyrrole group optionally monosubstituted with a linear or branched alkyl radical of 1 to 3 carbon atoms;
- the compounds can easily cross the blood-brain barrier unlike other anticancer agents sensitive to ABC pumps.
- ABC pumps are indeed overexpressed at the level of endothelial cells and more specifically the P-gp and BCRP proteins which strongly limit the diffusion of anticancer agents to the brain tissues;
- the compounds can be used for the treatment of any type of tumor, known to overexpress generally ABC pumps (more particularly BCRP and P-gp) which give the tumor greater resistance to anticancer agents; the compounds can be used for the treatment of all types of vascularized tumors by vessels lined with endothelial cells overexpressing ABC pumps, and more particularly BCRP and P-gp;
- ABC pumps more particularly BCRP and P-gp
- the compounds are conformationally constrained in the bioactive form, so as to avoid any isomerization and loss of activity during storage and / or administration to the patient;
- the compounds can be formulated for oral administration
- the compounds are easily synthesizable.
- FIG. 1 shows, by the MTT test, the effect of 6-methoxy-4- (N-methyl-indol-5-yl) coumarin (compound 14) at various concentrations on the cellular growth of 786-0 renal tumor cells. ;
- FIG. 2 shows the effect of 4- (3-hydroxy-4-methoxyphenyl) -6-aminocoumarin (compound 6) on the cell cycle of 786-0 renal tumor cells by CycleTest TM PLUS / DNA.
- the positive control illustrated in this figure corresponds to the studied line placed in the presence of the JAI 51 molecule.
- This molecule is different from those described in the patent document but also comprises an inhibition action of the P-gp and BCRP pumps and of inhibition of tubulin polymerization;
- FIG. 3A and FIG. 3B show the effects of 6-methoxy-4- (N-methyl-indol-5-yl) coumarin (compound 14) on 5 renal tumor cell lines ACHN, CAKI-1, 786- 0, RCC4 + and RCC4- at the cell cycle level by CycleTest TM PLUS / DNA (3A) and apoptosis determination by Annexin V-FITC / PI (3B);
- FIG. 4 represents the effect of 6-methoxy-4- (N-methyl-indol-5-yl) coumarin (compound 14) on the expression of caspase-3 of ACHN renal tumor cell lines, CAKI-1, 786-0, RCC4 + and RCC4-;
- FIG. 5 shows the incorporation of mitoxanthrone by reversal of the action of ABC pumps (BCRP and P-gp) on HCT1 16 / S cells (without pumps) and HCT116 / R (BCRP pumps) and K562 / S cells ( without pumps) and K562 / R (P-gp pumps) with different concentrations of 6-methoxy-4- (N-methyl-indol-5-yl) coumarin (compound 14);
- FIG. 6 illustrates the survival rate of mice in which cells
- FIG. 7 shows a general reaction scheme for the preparation of 4-arylcoumarin and 4-arylquinoline derivatives according to the invention
- FIG. 8 illustrates a synthesis scheme of the reaction intermediates having a coumaric cycle
- FIG. 9 illustrates a synthesis scheme of the reaction intermediates having a quinoline ring
- FIG. 10 illustrates a synthetic scheme of an example of an arylboronic acid derivative.
- the compounds according to the invention are 4-arylcoumarin and 4-arylquinoline derivatives of general formula
- Y is an oxygen atom when X is an oxygen atom, and Y is a hydrogen atom when X is a nitrogen atom;
- R1 is chosen from a hydrogen atom or a linear or branched alkoxy radical of 1 to 4 carbon atoms;
- R2 is chosen from a hydrogen atom, a linear or branched alkoxy radical of 1 to 4 carbon atoms or -CF3;
- R 3 is chosen from a hydrogen atom, a hydroxyl, a linear or branched alkoxy radical of 1 to 4 carbon atoms, -CF 3, -NO 2 or -NH 2;
- derivative By derivative is meant a compound which has structural characteristics common with 4-arylcoumarin or 4-arylquinoline and which comes from these compounds by chemical transformation.
- analog By analog is meant a compound which shares common or similar properties or characteristics with the compounds according to the invention.
- the compounds can also be in the form of pro-drugs.
- pro-drug is meant a pharmacological substance (a drug) that is administered in an inactive form (or much less active than its metabolite). Once administered, the prodrug is metabolized in vivo to an active metabolite.
- pro-drugs can be classified into two categories based on their conversion sites in their definitive active form.
- Type I pro-drugs are those in which the conversion is intracellular.
- Type II pro-drugs are those that are converted extracellularly, especially in the digestive juices or systemic circulation.
- Both types can be further subdivided into subtypes A or B, based on additional criteria.
- Those of types IA and IB are distinguished by the activation site which is the site of therapeutic action or not.
- types IIA and IIB they are classified according to whether the conversion takes place in the gastrointestinal tract or the systemic circulation.
- the compounds according to the invention may comprise groups making it possible to increase their solubility.
- the compounds according to the invention are particularly suitable for applications in oncology, that is to say for the treatment of cancer, and in particular for the treatment of solid tumors and metastatic cancers, preferentially for cancers developing, in general, cancers.
- resistance mechanisms related to P-gp and BCRP pumps even more preferably for cancers overexpressing P-gp and / or BCRP and tumor cells irrigated by vessels lined with endothelial cells of the hemato-encephalic and haemato-testicular barrier overexpressing the P-gp and / or BCRP pumps.
- X is chosen from an oxygen or nitrogen atom
- R1 is chosen from a hydrogen atom or a linear or branched alkoxy radical of 1 to 4 carbon atoms;
- R2 is chosen from a hydrogen atom, a linear or branched alkoxy radical of 1 to 4 carbon atoms or -CF3;
- R 3 is chosen from a hydrogen atom, a hydroxyl, a linear or branched alkoxy radical of 1 to 4 carbon atoms, -CF 3, -NO 2 or -NH 2; '
- R10, R11, R12, R13 taken independently are selected from a hydrogen atom, a linear or branched alkyl radical of 1 to 6 carbon atoms, a hydroxyl or a linear or branched alkoxy radical of 1 to 4 carbon atoms;
- Z is chosen from an alkoxy radical of 1 to 4 carbon atoms or a mono- or dialkylamino radical of 1 to 4 carbon atoms, or taken together with R 12 forms a pyrrole group optionally monosubstituted by a linear or branched alkyl radical of 1 to 3 carbon atoms;
- X is chosen from an oxygen or nitrogen atom
- R4 is chosen from a hydrogen atom, a methoxy group or -
- R12 is selected from a hydrogen atom or a hydroxy
- Z is chosen from a methoxy group, or a dimethyl amino group, or taken together with R12 forms a pyrrole group monosubstituted by a methyl radical
- one of the remarkable properties of the compounds according to the invention is that they possess a very strongly marked antiproliferative activity and induce the apoptosis of the tumor cells.
- tubulin assembly was the main mode of action of the compounds according to the invention.
- the binding site of the compounds according to the invention to tubulin was identified as the binding domain of colchicine.
- the compounds of general formula according to the invention are intended to treat tumor cells present in organs which in general develop resistance mechanisms related to P-gp and BCRP pumps which give the tumor greater resistance.
- anti-cancer agents and more particularly organs in which the cells Tumors overexpress P-gp and / or BCRP or are irrigated by endothelial cell vessels overexpressing P-gp and / or BCRP, by ( inhibition of tubulin assembly and membrane efflux pumps of the ABC family, such as than P-gp and BCRP.
- the compounds of general formula according to the invention are used for the treatment of tumor cells overexpressing the P-gp and / or BCRP pumps chosen from kidney, colon, lung, liver and pancreatic cancer.
- the compounds according to the general formula according to the invention are also used for the treatment of tumor cells irrigated by vessels lined with endothelial cells of the blood-brain and hemato-testicular barrier overexpressing the chosen P-gp and / or BCRP pumps. among testicular and brain cancer.
- the compounds according to the invention can easily cross the blood-brain and hemato-testicular barrier in contrast to other anti-cancer agents sensitive to the BPC pumps.
- the ABC pumps are notably overexpressed at the level of the endothelial cells of the blood-brain and blood-testicular barrier and more specifically the P-gp and BCRP proteins which strongly limit the diffusion of the anti-cancer agents to the brain tissues in particular.
- the compounds according to the invention are thus anticancer agents of choice for the treatment of glioblastoma.
- the compounds according to the invention are also of particular interest for the treatment of testicular cancer.
- the compounds according to the invention could thus induce the death of known tumor stem cells to express the ABC pumps, in particular BCRP and P-gp, which are involved in the relapse process.
- the cytostatic and cytotoxic activities of compounds according to the invention were tested on human mammary epithelial cells in culture, more particularly the HBL100 cells.
- the human mammary epithelial cells HBL100 are cultured in DMEM medium (Gibco®) enriched with 10% fetal calf serum (FBS), 2 mM L-glutamine and 1% penicillin / streptomycin (Gibco®).
- the HBL100 cells are maintained in a humidified incubator at 37 ° C with 5% CO 2.
- the exponentially growing HBL100 cells (2.6 * 10 4 cells / cm 2 ) were inoculated 24h before the treatment with compounds according to the invention.
- the compounds according to the invention inhibit the growth of mammary cells (HBL100) with a GI50 of between 39 nM and 2.95 ⁇ M, and for the majority of the nanomolar order.
- HBL100 mammary cells
- the compounds of the invention are identified as potent antineoplastics that inhibit cell growth.
- a compound having a GI50 of less than 1 ⁇ l has a very significant antiproliferative activity and is particularly effective; between 1 and 5 ⁇ , a compound has a significant antiproliferative activity while compounds with a GI50 greater than 5 ⁇ has insignificant antiproliferative activity, which is not the case with the compounds according to the invention.
- DAPI 6-diamidino-2-phenylindole
- Table 2 indicates the molar ratio (ligand / tubulin) required to inhibit half of microtubule formation in vitro.
- a molar ratio of 0.07 moles of combretastatin per mole of tubulin is required to halve the formation of microtubules.
- Tubulin purification was performed by extracting tubulin from lamb brains by ammonium sulfate fractionation and ion exchange chromatography and stored in liquid nitrogen. Before use, aliquots of proteins were chromatographed on a column (1 * 5 cm) of Sephadex G25® spin, equilibrated with PG buffer (20 mM sodium phosphate, 0.1 mM GTP, pH 7), followed by a passage on a Sephadex G25® gravity column (1 * 10 cm) and equilibrated with the same buffer.
- PG buffer (20 mM sodium phosphate, 0.1 mM GTP, pH 7
- Protein concentration was measured spectrophotometrically with a Perkin-Elmer Lambda 800® spectrophotometer at 275 nm with an extinction coefficient of 1.09 L g-1 cm -1 guanidine hydrochloride or 1.07 L g -1 cm -1 in 0.5% SDS in neutral aqueous buffer.
- microtubule formation was monitored on a Fluoroscan® Ascent FL spectrofluorometer (Labsystems) using a 96-well plate.
- the excitation wavelength was set at 355 nm and the emission wavelength was set at 460 nm.
- the experiments were carried out at 37 ° C. with 7.5 ⁇ l of DAPI, 15 ⁇ l of tubulin in 20 mM of sodium phosphate buffer, 1 mM of ethylene glycol tetraacetic acid (EGTA), 10 mM MgCl 2 , 10 -4 M GTP and 3.4 M glycerol, pH 6.5. Under these conditions, the exaltation of the DAPI fluorescence is directly proportional to the polymerized tubulin concentration and was measured as a function of time. The concentration of e 2 SO was kept below 4% in all samples and controls.
- fluorescence measurements were made with a Perkin-Elmer 50® luminescence spectrometer with slit widths of 10/10 nm. Unpatched fluorescence spectra were obtained in PG buffer, pH 7, using 0.2 (excitation direction) * 1 cm cells (Hellma) thermostated at 25 ° C in water circulation from a external water bath. The determination of the binding parameters was carried out by measuring the extinction of the intrinsic fluorescence signal of the proteins by the ligands. Tubulin (1-4 ⁇ ) was titrated with different concentrations of compounds. Fluorescence measurements were made with an excitation wavelength of 295 nm to specifically excite tryptophan residues of tubulin.
- Fcorr Fobs exp ⁇ (Aexc + Aem) / 2 ⁇ ;
- Fobs and Fcorr are respectively the observed and corrected fluorescence values at the emission wavelengths
- the quenched fluorescence quenching curves were inverted and fitted to the saturation curve equation using nonlinear least squares regression analysis.
- Fmax is the plateau fluorescence value.
- [L0] and [P0] which are the total ligand and protein concentrations, respectively.
- the algorithm starts with an arbitrary value of Kd. With this value, [Lb] and [Lf] are calculated, and thus the non-linear least squares regression analyzes are performed.
- the initial set is corrected in the next step by a Newton-Gauss process. This iterative process is continued up to the minimum sum of the square deviations between the experimental values and the calculated Fcorr values obtained.
- concentrations of the compounds were measured spectrophotometrically.
- the extinction coefficients, 8, were determined by dissolving the dry powder of the compounds in Me 2 SO (dimethylsulfoxide) and the diluent in 20 mM NaPi buffer, pH 7, and then taking the visible UV spectra.
- human leukemia cells CEM are obtained from the "American Tissue Culture Collection”. The cells are cultured at 37 ° C in a humidified atmosphere containing 5% CO 2 in RPMI 1640 medium, enriched with 10% fetal calf serum, 2 mM L-glutamine, 1.5 g / L sodium bicarbonate, 4.5 g / L glucose, 10 mM HEPES, 1 mM sodium pyruvate, penicillin (100 lU / mL) and streptomycin (100 g / mL).
- the 786-0 cells were cultured for 24 hours before addition of 4- (3-hydroxy-4-methoxyphenyl) -6-aminocoumarin (compound 6) (200 nM). The cells were then cultured for 24h or 48h, trypsinized, rinsed twice and then used to analyze their cell cycle using the 24h CycleTestTM PLUS / DNA reaction kit. The percentage of cells of each phase of the cell cycle was obtained using the Modfit® software.
- the negative control is characterized by the absence of any addition of any compound and the positive control is characterized by the addition of the molecule JAI 51 at a concentration of 10 ⁇ .
- the mitochondrial polarization was determined through the retention of the DiOC6 fluorescent dye (3,3-dihexyloxacarbocyanine iodide, Molecular Probes, Inc.). After treatment with the compound according to the invention, 10 6 cells in 1 ml of complete RPMI 1640 medium were loaded with DiOC6 probe (usually 25 nm unless otherwise indicated) for 30 minutes at 37 ° C prior to cytometry analysis. of flow. The same incubation time was applied to the control conditions and to the samples treated with the compound according to the invention.
- DiOC6 fluorescent dye 3,3-dihexyloxacarbocyanine iodide, Molecular Probes, Inc.
- Control conditions were performed by incubating cells with CCCP (carbonyl cyanide p-chlorophenylhydrazone) at 5 and 50 ⁇ for 10 minutes at 37 ° C.
- CCCP carbonyl cyanide p-chlorophenylhydrazone
- DiOC6 was excited at 488 nm, and the fluorescence was analyzed at 525 nm (FI-1) after logarithmic amplification.
- Diffracted light (FSC) and reflected light (SSC) were analyzed after linear amplification.
- the cells ACHN, CAKI-1, 786-0, RCC4 + and RCC4- were cultured for 24 hours before the addition of 6-methoxy-4- (N-methyl-indol-5-yl) coumarin (compound 14) ( 150 nM).
- the cells were then cultured for 24h or 48h, trypsinized, rinsed twice and then used to analyze the cell cycle using the CycleTest TM PLUS / DNA reaction kit (6A) at 24 hours or for the determination of apoptosis using the Annexine V-FITC / PI (6B) method at 48h.
- the percentage of cells in each phase of the cell cycle was obtained using the software Modfit® and the number mentioned indicate the percentage of cells in the G2 / M phase of the cell cycle.
- the culture medium is identical to that described above.
- K562 / S (without pumps) and K562 / R (P-gp pumps) were treated with different concentrations of 6-methoxy-4- (N-methyl-indol-5-yl) coumarin (compound 14) (0 to 0). , DM 5) in the presence of mitoxantrone and analyzed by flow cytometry.
- the controls are represented by the resistant lines with mitoxantrone alone and the lines not expressing the P-gp and BCRP pumps with mitoxantrone alone.
- Sensitive forms (without pumps) have high fluorescence values: (not shown)
- Example 1 Effects of 6-methoxy-4- (N-methyl-indol-5-yl) coumarin (compound 14) on renal tumor cells
- the mitotic index corresponds to the percentage of cancer cells that are dividing, in the mitosis phase and makes it possible to evaluate the rate of tumor proliferation generally correlated with the aggressiveness of the cancer. From the values obtained, it appears that the mitotic index increases by a factor of at least 3 in the presence of the compound according to the invention, reflecting a blockage of the cells during mitosis. There is also a notable increase (mostly a factor of 2) in the number of cells in G2 / M phase and in GO. Thus, the compound 6-methoxy-4- (N-methyl-indol-5-yl) coumarin (150 nM) according to the invention is identified as an antimitotic agent and inducer of apoptosis for all renal tumor cell lines. tested.
- Example 12 Effects of 6-methoxy-4- (N-methyl-indol-5-yl) coumarin (Compound 14) on K562 and HCT 6 cell lines.
- K562 and HCT116 cells were cultured in RPMI supplemented with 10% fetal calf serum with 6-methoxy-4- (N-methyl-indol-5-yl) coumarin (Cmp: Compound 14) (100 nM). or without (control) for 24h and 48h. The cells were rinsed twice and used as in Example 11. Table 8:
- R 4 is chosen from a hydrogen atom, a linear or branched alkoxy radical of 1 to 4 carbon atoms or -CF 3;
- R10, R1 1, R12, R13 taken independently are selected from a hydrogen atom, a linear or branched alkyl radical of 1 to 6 carbon atoms, a hydroxyl or a linear or branched alkoxy radical of 1 to 4 carbon atoms ;
- R 3 is chosen from a hydrogen atom, a hydroxyl, a linear or branched alkoxy radical of 1 to 4 carbon atoms, -CF 3, -NO 2 or -NH 2;
- R 4 is chosen from a hydrogen atom, a linear or branched alkoxy radical of 1 to 4 carbon atoms or -CF 3;
- X is chosen from an oxygen or nitrogen atom
- R10, R1 1, R12, R13 taken independently are selected from a hydrogen atom, a linear or branched alkyl radical of 1 to 6 carbon atoms, a hydroxyl or a linear or branched alkoxy radical of 1 to 4 carbon atoms ;
- Z is chosen from an alkoxy radical of 1 to 4 carbon atoms or a mono- or dialkylamino radical of 1 to 4 carbon atoms, or taken together with
- FIG. 9 illustrates a synthesis scheme of the quinole type coupling intermediates of formula:
- Q is more particularly a triflate group prepared according to the following detailed procedure:
- FIG. 10 illustrates a synthesis scheme of an example of an arylboronic derivative of formula:
- Step a preparation of 2-methoxyphenyl acetate
- Step b preparation of 5-bromo-2-methoxyphenyl acetate
- the reaction medium is poured into ether (100 ml), washed with an aqueous solution of 10% HCl (4.times.50 ml) and the combined aqueous phases are extracted with ether (3.times.30 ml).
- the combined organic phases are washed with a saturated aqueous solution of NaCl (2 * 30 mL) and dried over Na 2 SO 4 .
- the solvent is concentrated under reduced pressure to a small volume (5 mL) and petroleum ether (about 50 mL) is added to the residue to crystallize 3-benzyloxy-4-methoxyphenylboronic acid, which after filtration, is isolated as fine needle white crystals (2.52 g, 65%), mp 138 ° C.
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Abstract
L'invention concerne des dérivés de 4-arylcoumarine et de 4-arylquinoléine comme médicament pour le traitement du cancer, plus particulièrement pour le traitement des cellules tumorales surexprimant les pompes P-gp et/ou BCRP et des cellules tumorales irriguées par des vaisseaux tapissés de cellules endothéliales de la barrière hémato-encéphalique et hémato-testiculaire surexprimant les pompes P-gp et/ou BCRP, préférentiellement pour le traitement des cancers du testicule, du cerveau, du rein, du colon, du poumon, du foie et du pancréas. L'invention concerne également le procédé de synthèse de tels dérivés de 4-arylcoumarine et de 4-arylquinoléine.
Description
Dérivés de 4-arylcoumarine et de 4-arylquinoléine, leurs utilisations thérapeutiques et leur procédé de synthèse
L'invention concerne des dérivés de 4-arylcoumarine et de 4-arylquinoléine dans le domaine de la chimie du médicament. Plus particulièrement, l'invention concerne des dérivés de 4-arylcoumarine et de 4-arylquinoléine pour le traitement du cancer. Ces dérivés sont de façon générale efficaces sur des cancers développant des mécanismes de résistance liés aux pompes P-gp et BCRP, plus particulièrement sur des cellules tumorales surexprimant les protéines de type P-gp (glycoprotéine P) et/ou BCRP (transporteur ATP-dépendant codé par le gène ABCG2) et sur des cellules tumorales irriguées par des vaisseaux tapissés de cellules endothéliales de la barrière hémato-encéphalique et hémato-testiculaire surexprimant les pompes P-gp et/ou BCRP.
Dans les pays industrialisés, le cancer est actuellement la deuxième cause de décès derrière les maladies cardiovasculaires. Malgré les progrès réalisés dans le traitement du cancer, la chimiothérapie reste dans beaucoup de cas peu efficace et présente des effets secondaires parfois importants. La limitation majeure à l'utilisation d'agents antimitotiques est leurs toxicités aiguë et/ou chronique et notamment neurologique dues en partie aux cycles multiples de la thérapie. La poursuite du traitement est limitée dans le temps et l'ablation chirurgicale du tissu ou de l'organe atteint, si elle est possible, est souvent inévitable.
De plus, en dépit des avancées récentes réalisées dans les domaines du dépistage, du diagnostic et du traitement du cancer, la progression de la tumeur et l'apparition de métastases constituent toujours une cause importante de morbidité et de mortalité.
La compréhension des mécanismes moléculaires et cellulaires, qui contribuent à la formation, à la progression et à l'apparition de métastases, est un défi important dans la recherche sur le cancer, de même que la nécessité d'inhiber efficacement la prolifération des cellules tumorales.
La plupart des composés anticancéreux utilisés en traitement clinique à l'heure actuelle induisent la mort des cellules tumorales par activation endogène d'un processus biochimique plus connu sous le nom de mort cellulaire programmée ou apoptose.
Cependant, de nombreuses lignées cellulaires malignes développent des défauts dans la régulation des gènes qui commandent le processus apoptotique. Des protéines antiapoptotiques sont surexprimées dans de nombreux cancers. La résistance à l'apoptose est un mécanisme par lequel les cellules tumorales peuvent
à la fois éviter la sénescence et la mort cellulaire programmée mais également les effets de la chimiothérapie.
Parmi les divers mécanismes d'action des composés anticancéreux, l'interaction avec la tubuline est l'un des plus importants avec 25% des nouveaux candidats cliniques qui agissent selon ce mode d'action.
L'importance de la tubuline comme cible cellulaire des agents anticancéreux a augmenté de manière significative depuis 1990. A cette époque, les seuls composés disponibles en thérapie étaient les alcaloïdes de vinca, vinblastine (Velbé™), vincristine (Oncovin™, Vincristine™) et vindesine (Eldisine™). L'introduction du paclitaxel (Taxol™, Paclitaxel™, Paxene™, Abraxane™) sur le marché a marqué un tournant dans l'importance de la tubuline comme cible des agents anticancéreux.
A l'heure actuelle, sept nouveaux composés ont notamment été approuvés par la « Food and Drug Administration » (l'administration des produits alimentaires et médicamenteux aux Etats-Unis d'Amérique) pour une utilisation en thérapie anticancéreuse, à savoir les alcaloïdes de vinca, vinorelbine (Vinorelbine™, Navelbine™) et vinflunine (Javlor™), la dolastatine, romidepsine (Istodax™), les taxanes, docetaxel (Taxotère™) et cabazitaxel (Jevtana™), l'épothilone, ixabepilone (Ixempra™) et l'estramustine (Estracyt™).
II apparaît que les agents antimitotiques, qui ciblent les microtubules, sont parmi les composés les plus efficaces pour le traitement des tumeurs solides et des cancers métastatiques. Ces composés favorisent la mort cellulaire en interférant avec les fonctions structurelles et de normalisation des microtubules au niveau cellulaire. Les agents antitubuline peuvent être classés en deux groupes selon qu'ils déstabilisent ou stabilisent les microtubules.
La très grande majorité des agents actifs sont des produits naturels ou des dérivés hémisynthétiques de structures complexes. Ces composés sont isolés d'organismes marins ou de plantes qui ne sont pas cultivées et dans lesquels ils sont présents en quantité infime. La synthèse totale de ces composés n'est pas une solution envisageable ce qui explique, au moins en partie, la lenteur des développements cliniques des nouveaux agents antitubuline.
Les agents de déstabilisation des microtubules tels que les alcaloïdes de vinca, inhibent l'assemblage de la tubuline et induisent la dépolymérisation des microtubules existants. Les composés qui se lient au domaine de liaison des alcaloïdes de vinca à la tubuline comprennent les alcaloïdes de vinca (vinblastine, vincristine, vinorelbine, vindesine et vinflunine), les cryptophycines et les dolastatines (eribuline, spongistatine, rhizoxine, maytansinoides et tasidotine). Les composés de liaison au domaine de la colchicine incluent la colchicine et ses
analogues, podophyllotoxine, combretastatines, CI-980, 2-méthoxyoestradiol, phénylahistines (diketôpiperazine), steganacines et curacines.
Les agents de stabilisation des microtubules tels que les taxanes, favorisent la polymérisation de la tubuline et comprennent les taxanes, paclitaxel et docetaxel, les épothilones, ixabepilone et patupilone, discodermolide, eleutherobines, sarcodictyines, cyclostreptine, dictyostatine, laulimalide, rhazinilame, peloruside A.
On connaît également le document intitulé « 4-Arylcoumarin analogues of combretastatins stimulate apoptosis of leukemic cells from chronic lymphocytic leukemia patients » (Billard C. et al., Expérimental Hematology 2008, 36, 1625- 1633) qui décrit notamment que certains analogues de l'arylcoumarine sont capables d'induire l'apoptose de cellules de leucémie lymphoïde chronique, via la voie mitochondriale caspase dépendante. Plus particulièrement, ce document divulgue notamment que certains des analogues de 4-arylcoumarine synthétisés se lient à la tubuline, inhibent l'assemblage microtubulaire, bloquent la mitose, et induisent l'apoptose de cellules tumorales humaines.
On connaît aussi le document intitulé « Interaction of 4-Arylcoumarin Analogues of Combretastatins with Microtubule Network of HBL 00 Cells and Binding to Tubulin » (Rappl C. et al., Biochemistry 2006, 45, 9210-9218) qui décrit notamment que certains analogues de l'arylcoumarine ont une activité cytotoxique et sont capable d'induire l'apoptose de cellules cancéreuses du sein. Plus particulièrement, ce document divulgue que certains des analogues de 4- arylcoumarine synthétisés dépolymérisent le réseau microtubulaire et bloquent la mitose.
De même, on connaît le document intitulé « Synthesis and biological évaluation of 4-arylcoumarin analogues of combretastatins » (Bailly C. et al., Journal of Médicinal Chemistry 2003, 46, 5437-5444) qui décrit notamment que certains analogues de l'arylcoumarine ont une activité cytotoxique et sont capables d'induire l'apoptose de cellules cancéreuses du sein.
On connaît en outre le document intitulé « Synthesis and biological évaluation of polymethoxylated 4-heteroarylcoumarins as tubulin assembly inhibitor » (Ganina O. et al., Bioorganic & Médicinal Chemistry 2008, 16, 8806-8812) qui décrit des voies de synthèse de 4-hétéroarylcoumarine ainsi que les activités liées aux composés synthétisés. Parmi les activités des composés, l'inhibition de l'assemblage microtubulaire a été mise en évidence in vitro.
De plus, il existe divers mécanismes de résistance aux agents de chimiothérapie développés par la tumeur parmi lesquels un efflux cellulaire des agents anticancéreux, une inefficacité de l'interaction avec la cible et une déficience dans l'induction de l'apoptose.
Les pompes à efflux membranaires de la famille ABC, ou transporteurs ABC, ou transporteurs ATP-dépendante (ATP Binding Cassette), sont à l'origine du mécanisme principal de résistance développé par les cellules tumorales exposées aux agents de liaison de la tubuline in vitro. Ainsi, la glycoprotéine P (P-gp) est plus particulièrement responsable de résistance à de multiples agents de chimiothérapie (MDR) et extrude activement les alcaloïdes de vinca et les taxanes ce qui réduit leur concentration intracellulaire et leur activité cytotoxique. D'autres transporteurs sont plus sélectifs de certains types de composés. Par exemple, les alcaloïdes de vinca sont activement transportés par la protéine MRP1 , alors que les taxanes sont substrats de MRP2 et MRP7 et l'épothilone B de MRP7.
Le fait qu'un agent antitubuline soit substrat des pompes à efflux limite considérablement sa diffusion à l'intérieur du système nerveux central (CNS) et représente un obstacle à une administration orale, suggérant que de nouveaux composés moins sensibles au transport par les protéines ABC, pourraient posséder de nouvelles propriétés pharmacocinétiques.
Toutefois, les tentatives d'inverser le mécanisme de résistance en combinant des agents antitubuline à des inhibiteurs des pompes à efflux se sont révélées décevantes.
D'une manière générale, le criblage et le développement de nouvelles cibles thérapeutiques ainsi que de nouveaux agents anticancéreux sont, à l'heure actuelle, l'une des préoccupations majeures de la lutte contre le cancer. Plus particulièrement, le criblage et le développement de nouveaux agents anticancéreux insensibles à ces pompes membranaires restent un réel enjeu.
Considérant ce qui précède, un problème que se propose de résoudre l'invention est de développer de nouveaux composés proposant une alternative aux produits existants ou en développement, afin de permettre notamment le traitement de patients résistants aux thérapies existantes, notamment aux patients résistants aux traitements par des agents antimitotiques qui ciblent les microtubules. En outre, il existe donc à ce jour un besoin de développer des composés qui possèdent une activité antitumorale et qui ne sont pas sensibles au mécanisme de résistance développé par les cellules tumorales, et plus particulièrement aux transporteurs ABC. Il existe également un besoin de développer de nouveaux composés permettant de répondre au problème de diffusion à l'intérieur du système nerveux central, en vue d'une administration orale facilitée. A cet effet, il existe un besoin de développer des composés anticancéreux efficaces pour le traitement des tumeurs solides et des cancers métastatiques, plus particulièrement pour les cancers du testicule, du cerveau, du rein, du colon, du poumon, du foie et du pancréas. Par exemple, pour le traitement du glioblastome, qui est la tumeur cérébrale la plus
fréquente, les thérapies actuelles ne permettent que rarement d'envisager une survie des patients au-delà d'un an. De la même manière, les nouvelles thérapies ciblées n'ont amélioré que de six mois la survie des patients dans les tumeurs rénales en phase métastatique. Enfin, il existe un besoin de développer de nouveaux composés anticancéreux qui sont facilement synthétisables.
La solution au problème posé a pour premier objet des composés de formule générale :
dans laquelle :
- X est choisi parmi un atome d'oxygène ou d'azote ;
- Y est un atome d'oxygène lorsque X est un atome d'oxygène, et Y est un atome d'hydrogène lorsque X est un atome d'azote ;
- R1 est choisi parmi un atome d'hydrogène ou un radical alkoxy linéaire ou ramifié de 1 à 4 atomes de carbone ;
- R2 est choisi parmi un atome d'hydrogène, un radical alkoxy linéaire ou ramifié de 1 à 4 atomes de carbone ou -CF3 ;
- R3 est choisi parmi un atome d'hydrogène, un hydroxy, un radical alkoxy linéaire ou ramifié de 1 à 4 atomes de carbone, -CF3, -N02 ou -NH2 ;
- R4 est choisi parmi un atome d'hydrogène, un radical alkoxy linéaire ou ramifié de 1 à 4 atomes de carbone ou -CF3 ;
- R10, R11 , R12, R13 pris indépendamment sont choisis parmi un atome d'hydrogène, un radical alkyle linéaire ou ramifié de 1 à 6 atomes de carbone, un hydroxy ou un radical alkoxy linéaire ou ramifié de 1 à 4 atomes de carbone ;
- Z est choisi parmi un radical alkoxy de 1 à 4 atomes de carbone ou un radical mono ou dialkylamino de 1 à 4 atomes de carbone, ou pris ensemble avec
R12 forme un groupement pyrrole éventuellement monosubstitué par un radical alkyle linéaire ou ramifié de 1 à 3 atomes de carbone ;
choisis parmi :
- 4-(3-Hydroxy-4-méthoxyphényl)coumarine ;
- 4-(3-Hydroxy-4-méthoxyphényl)-7-méthoxycoumarine ;
- 4-(3-Hydroxy-4-méthoxyphényl)-6-méthoxycoumarine ;
- 4-(3-Hydroxy-4-méthoxyphényl)-6-hydroxycoumarine ;
- 4-(3-Hydroxy-4-méthoxyphényl)-6-nitrocoumarine ;
- 4-(3-Hydroxy-4-méthoxyphényl)-6-arninocournarine ;
- 4-(3-Hydroxy-4-méthoxyphényl)-5-méthoxycoumarine ;
- 4-(3-Hydroxy-4-méthoxyphényl)-6,7-diméthoxycoumarine ;
- 4-(3-Hydroxy-4-méthoxyphényl)-5,6-diméthoxycoumarine ;
- 4-(/V-méthyl-indol-5-yl)coumarine ;
- 7-méthoxy-4-(/\/-méthyl-indol-5-yl)coumarine ;
- 6-méthoxy-4-(A/-méthyl-indol-5-yl)coumarine ;
- 6-hydroxy-4-(/V-méthyl-indol-5-yl)coumarine ;
- 5-méthoxy-4-(/V-méthyl-indol-5-yl)coumarine ;
- 6,7-diméthoxy-4-(/V-méthyl-indol-5-yl)coumarine ;
- 5,7-diméthoxy-4-(/V-méthyl-indol-5-yl)coumarine ;
- 5,6-diméthoxy-4-(A/-méthyl-indol-5-yl)coumarine ;
- 5,6 J-triméthoxy-4-(A/-méthyl-indol-5-yl)cournarine ;
- 4-(4-N,N-diméthylaminophényl)-6-nitrocoumarine ;
- 6-amino-4-(4-N,N-diméthylaminophényl)coumarine ;
- 4-(4-N,N-diméthylaminophényl)-6-méthoxycoumarine ;
- 4-(3-hydroxy-4-méthoxyphényl)quinoléine ;
- 4-(3-hydroxy-4-méthoxyphényl)-7-méthoxyquinoléine ;
- 4-(3-hydroxy-4-méthoxyphényl)-6-méthoxyquinoléine ;
- 4-(3-hydroxy-4-méthoxyphényl)-6,7-diméthoxyquinoléine ;
- 4-(3-hydroxy-4-méthoxyphényl)-5,7-diméthoxyquinoléine ;
- 4-(3-hydroxy-4-rnéthoxyphényl)-5,6,7-triméthoxyquinoléine;
- 4-(3-hydroxy-4-méthoxyphényl)-7-trifluorométhylquinoléine;
- 4-(3-hydroxy-4-méthoxyphènyl)-6-trifluorométhylquinoléine;
- 4-(3-hydroxy-4-méthoxyphényl)-6-méthoxy-7-trifluorométhylquinoléine ;
- 4-(3-hydroxy-4-méthoxyphényl)-5-trifluorométhyl-7-méthoxyquinoléine ;
- 4-(3-hydroxy-4-méthoxyphényl)-5-méthoxy-7-trifluorométhylquinoléine ;
- 4-(3-hydroxy-4-méthoxyphényl)-5,7-bis(trifluorométhyl)quinoléine ;
leurs analogues et leurs sels pharmaceutiquement acceptables, à titre de médicament.
De façon surprenante, le Demandeur a pu mettre en évidence que les dérivés de 4-arylcoumarine et de 4-arylquinoléine selon l'invention sont des agents cytotoxiques présentant une activité antiproliférative efficace.
En outre, ces composés ont été testés in vitro, notamment à encontre de la prolifération de différentes cellules cancéreuses humaines, et ex-wVo, et ont prouvé leur rôle dans l'inhibition de l'assemblage de la tubuline. Le Demandeur a
également pu mettre en évidence de façon surprenante que les composés selon l'invention sont insensibles aux pompes à efflux membranaires de la famille ABC à l'origine du mécanisme principal de résistance développé par les cellules tumorales ou par les cellules endothéliales qui tapissent les vaisseaux irriguant les cellules tumorales, en particulier l'expression ou la surexpression de pompes d'efflux ATP- dépendante, telles que les transporteurs ABC P-gp (ABCB1) et BCRP (ABCG2) appelée également Mitoxantrone Résistance Protein (MXR) ou Placenta ABC Protein (ABC-P), qui expulsent hors de la cellule tumorale des cytoxiques de structures variées.
A titre d'exemple, P-gp se retrouve principalement exprimée voire surexprimée au niveau des cellules du tubule contourné proximal du rein et des glandes surrénales, des cellules de l'intestin, du foie, du poumon, du colon, du pancréas, des trophoblastes du placenta et de l'endothélium de la barrière hématoencéphalique et hémato-testiculaire, voire à la surface des lymphocytes du système immunitaire. L'expression de P-gp dans ces cellules et notamment dans les capillaires cérébraux (barrière hémoméningée) et testiculaires explique les phénomènes de résistance associée.
Aussi, à titre d'exemple, BCRP est plus particulièrement exprimée par les cellules endothéliales des capillaires cérébraux. Les autres tissus, qui comportent le plus haut niveau d'expression de la BCRP, sont le placenta (cellules trophoblasiques), le foie (membranes canaliculaires), l'intestin grêle et le colon (membranes apicales), le poumon, le rein, les glandes surrénales, les épithéliums des veines, les vaisseaux sanguins et certaines cellules souches hématopoïétiques.
La présente invention a également pour deuxième objet des composés de formule générale :
dans laquelle :
- X est choisi parmi un atome d'oxygène ou d'azote ;
- Y est un atome d'oxygène lorsque X est un atome d'oxygène, et Y est un atome d'hydrogène lorsque X est un atome d'azote ;
- R1 est choisi parmi un atome d'hydrogène ou un radical alkoxy linéaire ou ramifié de 1 à 4 atomes de carbone ;
- R2 est choisi parmi un atome d'hydrogène, un radical alkoxy linéaire ou ramifié de 1 à 4 atomes de carbone ou -CF3 ;
- R3 est choisi parmi un atome d'hydrogène, un hydroxy, un radical alkoxy linéaire ou ramifié de 1 à 4 atomes de carbone, -CF3, -N02 ou -NH2 ;
- R4 est choisi parmi un atome d'hydrogène, un radical alkoxy linéaire ou ramifié de 1 à 4 atomes de carbone ou -CF3 ;
- R10, R1 1 , R12, R13 pris indépendamment sont choisis parmi un atome d'hydrogène, un radical alkyle linéaire ou ramifié de 1 à 6 atomes de carbone, un hydroxy ou un radical alkoxy linéaire ou ramifié de 1 à 4 atomes de carbone ;
- Z est choisi parmi un radical alkoxy de 1 à 4 atomes de carbone ou un radical mono ou dialkylamino de 1 à 4 atomes de carbone, ou pris ensemble avec R12 forme un groupement pyrrole éventuellement monosubstitué par un radical alkyle linéaire ou ramifié de 1 à 3 atomes de carbone ;
leurs analogues et leurs sels pharmaceutiquement acceptables, pour le traitement des cellules tumorales surexprimant les pompes P-gp et/ou BCRP et des cellules tumorales irriguées par des vaisseaux tapissés de cellules endothéliales de la barrière hémato-encéphalique et hémato-testiculaire surexprimant les pompes P-gp et/ou BCRP.
La présente invention a également pour troisième objet un produit contenant un composé de formule générale :
dans laquelle :
- X est choisi parmi un atome d'oxygène ou d'azote ;
- Y est un atome d'oxygène lorsque X est un atome d'oxygène, et Y est un atome d'hydrogène lorsque X est un atome d'azote ;
- R1 est choisi parmi un atome d'hydrogène ou un radical alkoxy linéaire ou ramifié de 1 à 4 atomes de carbone ;
- R2 est choisi parmi un atome d'hydrogène, un radical alkoxy linéaire ou ramifié de 1 à 4 atomes de carbone ou -CF3 ;
- R3 est choisi parmi un atome d'hydrogène, un hydroxy, un radical alkoxy linéaire ou ramifié de 1 à 4 atomes de carbone, -CF3, -N02 ou -NH2 ;
- R4 est choisi parmi un atome d'hydrogène, un radical alkoxy linéaire ou ramifié de 1 à 4 atomes de carbone ou -CF3 ;
- R10, R1 1 , R12, R13 pris indépendamment sont choisis parmi un atome d'hydrogène, un radical alkyle linéaire ou ramifié de 1 à 6 atomes de carbone, un hydroxy ou un radical alkoxy linéaire ou ramifié de 1 à 4 atomes de carbone ;
- Z est choisi parmi un radical alkoxy de 1 à 4 atomes de carbone ou un radical mono ou dialkylamino de 1 à 4 atomes de carbone, ou pris ensemble avec R12 forme un groupement pyrrole éventuellement monosubstitué par un radical alkyle linéaire ou ramifié de 1 à 3 atomes de carbone ;
choisis parmi :
- 4-(3-Hydroxy-4-méthoxyphényl)coumarine ;
- 4-(3-Hydroxy-4-méthoxyphényl)-7-méthoxycoumarine ;
- 4-(3-Hydroxy-4-méthoxyphényl)-6-méthoxycoumarine ;
- 4-(3-Hydroxy-4-méthoxyphényl)-6-hydroxycoumarine ;
- 4-(3-Hydroxy-4-méthoxyphényl)-6-nitrocoumarine ;
- 4-(3-Hydroxy-4-méthoxyphényl)-6-aminocoumarine ;
- 4-(3-Hydroxy-4-méthoxyphényl)-5-méthoxycoumarine ;
- 4-(3-Hydroxy-4-méthoxyphényl)-6,7-diméthoxycoumarine ;
- 4-(3-Hydroxy-4-méthoxyphényl)-5,6-diméthoxycoumarine ;
- 4-(/V-méthyl-indol-5-yl)coumarine ;
- 7-méthoxy-4-(/V-méthyl-indol-5-yl)coumarine ;
- 6-méthoxy-4-(/V-méthyl-indol-5-yl)coumarine ;
- 6-hydroxy-4-(A/-méthyl-indol-5-yl)coumarine ;
- 5-méthoxy-4-(/V-méthyl-indol-5-yl)coumarine ;
- 6,7-diméthoxy-4-(A/-méthyl-indol-5-yl)coumarine ;
- 5,7-diméthoxy-4-(A/-méthyl-indol-5-yl)coumarine ;
- 5,6-diméthoxy-4-(/V-méthyl-indol-5-yl)coumarine ;
- 5,6,7-triméthoxy-4-(A/-méthyl-indol-5-yl)coumarine ;
- 4-(4-N,N-diméthylaminophényl)-6-nitrocoumarine ;
- 6-amino-4-(4-N,N-diméthylaminophényl)coumarine ;
- 4-(4-N,N-diméthylaminophényl)-6-méthoxycoumarine ;
- 4-(3-hydroxy-4-méthoxyphényl)quinoléine ;
- 4-(3-hydroxy-4-méthoxyphényl)-7-méthoxyquinoléine ;
- 4-(3-hydroxy-4-méthoxyphényl)-6-méthoxyquinoléine ;
- 4-(3-hydroxy-4-méthoxyphényl)-6,7-diméthoxyquinoléine ;
- 4-(3-hydroxy-4-méthoxyphényl)-5,7-diméthoxyquinoléine ;
- 4-(3-hydroxy-4-méthoxyphényl)-5,6,7-triméthoxyquinoléine;
- 4-(3-hydroxy-4-méthoxyphényl)-7-trifluorométhylquinoléine;
- 4-(3-hydroxy-4-méthoxyphényl)-6-trifluorométhylquinoléine;
- 4-(3-hydroxy-4-méthoxyphényl)-6-méthoxy-7-trifluorométhylquinoléine ;
- 4-(3-hydroxy-4-méthoxyphényl)-5-trifluorornéthyl-7-méthoxyquinoléine ;
- 4-(3-hydroxy-4-méthoxyphényl)-5-méthoxy-7-trifluorométhylquinoléine ;
- 4-(3-hydroxy-4-méthoxyphényl)-5,7-bis(trifluorométhyl)quinoléine ;
leurs analogues et leurs sels pharmaceutiquement acceptables, et au moins un autre ingrédient actif comme produit de combinaison pour une administration simultanée, séparée ou étalée dans le temps, pour le traitement du cancer.
La présente invention a également pour quatrième objet un produit contenant un composé de formule générale :
dans laquelle :
- X est choisi parmi un atome d'oxygène ou d'azote ;
- Y est un atome d'oxygène lorsque X est un atome d'oxygène, et Y est un atome d'hydrogène lorsque X est un atome d'azote ;
- R1 est choisi parmi un atome d'hydrogène ou un radical alkoxy linéaire ou ramifié de 1 à 4 atomes de carbone ;
- R2 est choisi parmi un atome d'hydrogène, un radical alkoxy linéaire ou ramifié de 1 à 4 atomes de carbone ou -CF3 ;
- R3 est choisi parmi un atome d'hydrogène, un hydroxy, un radical alkoxy linéaire ou ramifié de 1 à 4 atomes de carbone, -CF3, -N02 ou -NH2 ;
- R4 est choisi parmi un atome d'hydrogène, un radical alkoxy linéaire ou ramifié de 1 à 4 atomes de carbone ou -CF3 ;
- R10, R11 , R12, R13 pris indépendamment sont choisis parmi un atome d'hydrogène, un radical alkyle linéaire ou ramifié de 1 à 6 atomes de carbone, un hydroxy ou un radical alkoxy linéaire ou ramifié de 1 à 4 atomes de carbone ;
- Z est choisi parmi un radical alkoxy de 1 à 4 atomes de carbone ou un radical mono ou dialkylamino de 1 à 4 atomes de carbone, ou pris ensemble avec
R12 forme un groupement pyrrole éventuellement monosubstitué par un radical alkyle linéaire ou ramifié de 1 à 3 atomes de carbone ;
leurs analogues et leurs sels pharmaceutiquement acceptables, et au moins un autre ingrédient actif comme produit de combinaison pour une administration simultanée, séparée ou étalée dans le temps, pour le traitement des cellules tumorales surexprimant les pompes P-gp et/ou BCRP et des cellules tumorales irriguées par des vaisseaux tapissés de cellules endothéliales de la barrière hémato-encéphalique et hémato-testiculaire surexprimant les pompes P-gp et/ou BCRP.
Enfin, la présente invention a pour cinquième objet un procédé de synthèse des composés selon l'invention comprenant une étape de couplage de ligands en catalyse au palladium entre deux unités aromatiques, le cycle coumarique ou quinoléique préformé, convenablement activé et un dérivé arylboronique respectivement de formules
- X est choisi parmi un atome d'oxygène ou d'azote ;
- Y est un atome d'oxygène lorsque X est un atome d'oxygène, et Y est un atome d'hydrogène lorsque X est un atome d'azote ;
- Q est choisi parmi un atome d'halogène ou un groupement triflate ou tosylate ou tout autre groupement libérable ;
- R1 est choisi parmi un atome d'hydrogène ou un radical alkoxy linéaire ou ramifié de 1 à 4 atomes de carbone ;
- R2 est choisi parmi un atome d'hydrogène, un radical alkoxy linéaire ou ramifié de 1 à 4 atomes de carbone ou -CF3 ;
- R3 est choisi parmi un atome d'hydrogène, un hydroxy, un radical alkoxy linéaire ou ramifié de 1 à 4 atomes de carbone, -CF3, -N02 ou -NH2 ;
- R4 est choisi parmi un atome d'hydrogène, un radical alkoxy linéaire ou ramifié de 1 à 4 atomes de carbone ou -CF3 ;
- R10, R1 1 , R12, R13 pris indépendamment sont choisis parmi un atome d'hydrogène, un radical alkyle linéaire ou ramifié de 1 à 6 atomes de carbone, un hydroxy ou un radical alkoxy linéaire ou ramifié de 1 à 4 atomes de carbone ;
- R est choisi parmi un atome d'hydrogène ou un radical alkyle linéaire ou ramifié de 1 à 6 atomes de carbone ;
- Z est choisi parmi un radical alkoxy de 1 à 4 atomes de carbone ou un radical mono ou dialkylamino de 1 à 4 atomes de carbone, ou pris ensemble avec R12 forme un groupement pyrrole éventuellement monosubstitué par un radical alkyle linéaire ou ramifié de 1 à 3 atomes de carbone ;
leurs analogues et leurs sels pharmaceutiquement acceptables.
Les composés selon l'invention offrent notamment les avantages suivants par rapport à l'art antérieur :
- les composés sont capables de restaurer le processus de mort cellulaire chez des cellules malignes déficientes sans pour autant affecter les cellules saines ;
- les composés combinent une activité antiproliférative très fortement marquée induisant l'apoptose à une forte activité d'inhibition des pompes à efflux membranaires de la famille ABC (plus particulièrement BCRP et P-gp) qui sont impliquées dans des mécanismes de résistance à la chimiothérapie. Plus particulièrement, ils sont inhibiteurs des pompes ABC ou insensibles aux dites pompes ;
- les composés peuvent tuer les cellules souches tumorales connues pour exprimer les pompes ABC (plus particulièrement BCRP et P-gp) qui sont impliquées dans le processus de rechute. Tout type de tumeurs concernées par la présence de telles cellules souches pourra alors être ciblées par ces composés à double action ;
- les composés permettent avantageusement d'éviter le traitement thérapeutique par combinaison de deux agents, l'un jouant le rôle de composé anticancéreux, et l'autre le rôle d'inhibiteur de P-gp et BCRP de sorte à limiter les effets secondaires et faciliter les études de pharmacocinétiques incompatibles avec une pratique quotidienne ;
- les composés peuvent franchir facilement la barrière hémato-encéphalique contrairement à d'autres agents anticancéreux sensibles aux pompes ABC. Les pompes ABC sont en effet surexprimées au niveau des cellules endothéliales et plus spécifiquement les protéines P-gp et BCRP qui limitent fortement la diffusion des agents anticancéreux vers les tissus cérébraux ;
- les composés peuvent être utilisés pour le traitement de tout type de tumeurs, connues pour surexprimer de manière générale les pompes ABC (plus particulièrement BCRP et P-gp) qui confèrent à la tumeur une plus grande résistance aux agents anticancéreux ;
- les composés peuvent être utilisés pour le traitement de tout type de tumeurs vascularisées par des vaisseaux tapissés de cellules endothéliales surexprimant les pompes ABC, et plus particulièrement BCRP et P-gp ;
- les composés sont conformationnellement contraints dans la forme bioactive, de manière à éviter toute isomérisation et perte d'activité lors du stockage et/ou de l'administration au patient ;
- les composés peuvent être formulés pour une administration par voie orale ;
- les composés sont facilement synthétisables.
L'invention sera mieux comprise à la lecture de la description non limitative qui suit, rédigée au regard des figures annexées, dans lesquelles :
- la figure 1 représente par le test MTT l'effet de la 6-méthoxy-4-(N-méthyl- indol-5-yl)coumarine (composé 14) à différentes concentrations sur la croissance cellulaire de cellules tumorales rénales 786-0 ;
- la figure 2 représente l'effet de la 4-(3-hydroxy-4-méthoxyphényl)-6- aminocoumarine (composé 6) sur le cycle cellulaire de cellules tumorales rénales 786-0 par le CycleTest™ PLUS/DNA. Le contrôle positif illustré dans cette figure correspond à la lignée étudiée mise en présence de la molécule JAI 51. Cette molécule est différente de celles décrites dans le document brevet mais comporte également une action d'inhibition des pompes P-gp et BCRP et d'inhibition de la polyméristaion de la tubuline ;
- la figure 3A et la figure 3B représentent les effets de la 6-méthoxy-4-(N- méthyl-indol-5-yl)coumarine (composé 14) sur 5 lignées de cellules tumorales rénales ACHN, CAKI-1 , 786-0, RCC4+ et RCC4- au niveau du cycle cellulaire par le CycleTest™ PLUS/DNA (3A) et de la détermination de l'apoptose par la méthode Annexine V-FITC/PI (3B) ;
- la figure 4 représente l'effet de la 6-méthoxy-4-(N-méthyl-indol-5- yl)coumarine (composé 14) sur l'expression de la caspase-3 de 5 lignées de cellules tumorales rénales ACHN, CAKI-1 , 786-0, RCC4+ et RCC4- ;
- la figure 5 représente l'incorporation de mitoxanthrone par réversion de l'action des pompes ABC (BCRP et P-gp) sur des cellules HCT1 16/S (sans pompes) et HCT116/R (pompes BCRP) et K562/S (sans pompes) et K562/R (pompes P-gp) taitées avec différentes concentrations de 6-méthoxy-4-(N-méthyl- indol-5-yl)coumarine (composé 14) ;
- la figure 6 illustre le taux de survie de souris dans lesquelles des cellules
786-0 ont été injectées, ces souris étant traitées soit par un véhicule contrôle soit par la 6-méthoxy-4-(N-méthyl-indol-5-yl)coumarine (composé 14) ; et
- la figure 7 présente un schéma général de réaction de préparation de dérivés de 4-arylcoumarine et 4-arylquinoléine selon l'invention ;
- la figure 8 illustre un schéma de synthèse des intermédiaires réactionnels présentant un cycle coumarique ;
- la figure 9 illustre un schéma de synthèse des intermédiaires réactionnels présentant un cycle quinoléique ; et
- la figure 10 illustre un schéma de synthèse d'un exemple de dérivé d'acide arylboronique.
Les composés selon l'invention sont des dérivés de 4-arylcoumarine et de 4- arylquinoléine de formule générale
dans laquelle :
- X est choisi parmi un atome d'oxygène ou d'azote ;
- Y est un atome d'oxygène lorsque X est un atome d'oxygène, et Y est un atome d'hydrogène lorsque X est un atome d'azote ;
- R1 est choisi parmi un atome d'hydrogène ou un radical alkoxy linéaire ou ramifié de 1 à 4 atomes de carbone ;
- R2 est choisi parmi un atome d'hydrogène, un radical alkoxy linéaire ou ramifié de 1 à 4 atomes de carbone ou -CF3 ;
- R3 est choisi parmi un atome d'hydrogène, un hydroxy, un radical alkoxy linéaire ou ramifié de 1 à 4 atomes de carbone, -CF3, -N02 ou -NH2 ;
- R4 est choisi parmi un atome d'hydrogène, un radical alkoxy linéaire ou ramifié de 1 à 4 atomes de carbone ou -CF3 ;
- R10, R1 1 , R12, R13 pris indépendamment sont choisis parmi un atome d'hydrogène, un radical alkyle linéaire ou ramifié de 1 à 6 atomes de carbone, un hydroxy ou un radical alkoxy linéaire ou ramifié de 1 à 4 atomes de carbone ;
- Z est choisi parmi un radical alkoxy de 1 à 4 atomes de carbone ou un radical mono ou dialkylamino de 1 à 4 atomes de carbone, ou pris ensemble avec R12 forme un groupement pyrrole éventuellement monosubstitué par un radical alkyle linéaire ou ramifié de 1 à 3 atomes de carbone ;
choisis parmi :
- 4-(3-Hydroxy-4-méthoxyphényl)coumarine ;
- 4-(3-Hydroxy-4-méthoxyphényl)-7-méthoxycoumarine ;
- 4-(3-Hydroxy-4-méthoxyphényl)-6-méthoxycoumarine ;
- 4-(3-Hydroxy-4-méthoxyphény!)-6-hydroxycoumarine ;
- 4-(3-Hydroxy-4-méthoxyphényl)-6-nitrocoumarine ;
- 4-(3-Hydroxy-4-méthoxyphényl)-6-aminocoumarine ;
- 4-(3-Hydroxy-4-méthoxyphényl)-5-méthoxycoumarine ;
- 4-(3-Hydroxy-4-méthoxyphényl)-6,7-diméthoxycoumarine ;
- 4-(3-Hydroxy-4-méthoxyphényl)-5,6-dirnéthoxycoumarine ;
- 4-(A/-méthyl-indol-5-yl)coumarine ;
- 7-méthoxy-4-(W-méthyl-indol-5-yl)coumarine ;
- 6-méthoxy-4-(A/-méthyl-indol-5-yl)coumarine ;
- 6-hydroxy-4-(/\/-méthyl-indol-5-yl)coumarine ;
- 5-méthoxy-4-(/\/-méthyl-indol-5-yl)coumarine ;
- 6,7-diméthoxy-4-(A/-méthyl-indol-5-yl)coumarine ;
- 5,7-diméthoxy-4-(Ay-méthyl-indol-5-yl)coumarine ;
- 5,6-diméthoxy-4-(/V-méthyl-indol-5-yl)coumarine ;
- 5,6,7-triméthoxy-4-(A/-méthyl-indol-5-yl)coumarine ;
- 4-(4-N,N-diméthylaminophényl)-6-nitrocoumarine ;
- 6-amino-4-(4-N,N-diméthylaminophényl)coumarine ;
- 4-(4-N,N-diméthylaminophényl)-6-méthoxycoumarine ;
- 4-(3-hydroxy-4-méthoxyphényl)quinoléine ;
- 4-(3-hydroxy-4-mét oxyphényl)-7-méthoxyquinoléine ;
- 4-(3-hydroxy-4-méthoxyphényl)-6-méthoxyquinoléine ;
- 4-(3-hydroxy-4-méthoxyphényl)-6,7-diméthoxyquinoléine ;
- 4-(3-hydroxy-4-méthoxyphényl)-5,7-diméthoxyquinoléine ;
- 4-(3-hydroxy-4-méthoxyphényl)-5,6,7-triméthoxyquinoléine;
- 4-(3-hydroxy-4-méthoxyphényl)-7-trifluorométhylquinoléine;
- 4-(3-hydroxy-4-méthoxyphényl)-6-trifluorométhylquinoléine;
- 4-(3-hydroxy-4-méthoxyphényl)-6-méthoxy-7-trifluorométhylquinoléine ;
- 4-(3-hydroxy-4-méthoxyphényl)-5-trifluorométhyl-7-méthoxyquinoléine ;
- 4-(3-hydroxy-4-méthoxyphényl)-5-méthoxy-7-trifluorométhylquinoléine ;
- 4-(3-hydroxy-4-méthoxyphényl)-5,7-bis(trifluorométhyl)quinoléine ;
leurs analogues et leurs sels pharmaceutiquement acceptables, à titre de médicament, préférentiellement pour le traitement du cancer.
Par dérivé, on entend un composé qui possède des caractéristiques structurales communes avec les 4-arylcoumarine ou 4-arylquinoléine et qui provient de ces composés par transformation chimique.
Par analogue, on entend un composé qui partage des propriétés ou des caractéristiques communes ou similaires avec les composés selon l'invention.
Par sel pharmaceutiquement acceptable, on entend préférentiellement les sels ammonium.
Selon l'invention, les composés peuvent également se présenter sous forme de pro-drogues. On entend par pro-drogue, une substance pharmacologique (un médicament) qui est administrée sous une forme inactive (ou beaucoup moins active que son métabolite). Une fois administrée, la pro-drogue est métabolisée in vivo en un métabolite actif. Plus particulièrement, les pro-drogues peuvent être classées en deux catégories basées sur leurs sites de conversion dans leur forme active définitive.
Les pro-drogues de type I sont celles où la conversion est intracellulaire. Les pro-drogues de type II sont celles qui sont converties extracellulairement, notamment dans les sucs digestifs ou la circulation systémique.
Les deux types peuvent être encore subdivisés en sous-types A ou B, basés sur des critères supplémentaires. Ceux de types IA et IB se distinguent par le site d'activation qui est le site d'action thérapeutique ou non. Pour les types IIA et IIB, ils sont classés selon que la conversion a lieu dans le tractus gastro-intestinal ou la circulation systémique.
Avantageusement, les composés selon l'invention peuvent comprendre des groupements permettant d'augmenter leur solubilité.
Les composés selon l'invention sont particulièrement adaptés pour des applications en cancérologie, c'est-à-dire pour le traitement du cancer, et notamment pour le traitement des tumeurs solides et des cancers métastatiques, préférentiellement pour des cancers développant de façon générale des mécanismes de résistance liés aux pompes P-gp et BCRP, encore plus préférentiellement pour les cancers surexprimant P-gp et/ou BCRP et les cellules tumorales irriguées par des vaisseaux tapissés de cellules endothéliales de la barrière hémato-encéphalique et hémato-testiculaire surexprimant les pompes P-gp et/ou BCRP.
L'expression tumeur solide désigne un cancer formé d'une tumeur principale représentant une masse individualisée, accompagnée ou non de métastases. Une tumeur est désignée par solide par opposition aux hémopathies malignes, cancers atteignant des cellules sanguines, qui sont diffuses dans l'organisme, principalement dans la moelle osseuse, les ganglions ou le sang : c'est le cas des leucémies, des lymphomes, du myélome multiple. Les tumeurs solides représentent plus de 90% de tous les cancers. Ce sont surtout des carcinomes, développés à
partir d'un épithélium, accessoirement des sarcomes des os ou des tissus mous (muscles, graisse, etc.).
A titre d'exemple non limitatif de cancers pour lesquels les composés selon l'invention sont plus particulièrement adaptés, on peut citer notamment le cancer du sein, des glandes surrénales, de l'intestin, de l'estomac, de l'ovaire, de l'utérus, du placenta, de l'épithélium veineux, des vaisseaux sanguins, des cellules souches hématopoïétiques, des neuroblastomes, des fibrosarcomes, des tumeurs anaplasiques de la thyroïde, des myélomes, de la leucémie myéloïde aiguë, des cellules tumorales surexprimant les pompes P-gp et/ou BCRP préférentiellement choisies parmi le cancer du rein, du colon, du poumon, du foie et du pancréas et encore plus préférentiellement du rein, et des cellules tumorales irriguées par des vaisseaux tapissés de cellules endothéliales de la barrière hémato-encéphalique et hémato-testiculaire surexprimant les pompes P-gp et/ou BCRP préférentiellement choisies parmi le cancer du testicule et du cerveau.
Aussi, les composés selon l'invention sont de puissants agents cytostatiques capables de restaurer le processus de mort cellulaire chez des cellules malignes déficientes sans pour autant affecter les cellules saines. Cette action sélective permet d'envisager avantageusement de nouvelles thérapies chez des patients atteints de leucémie.
Un autre objet de la présente invention concerne les composés de formule générale :
dans laquelle :
- X est choisi parmi un atome d'oxygène ou d'azote ;
- Y est un atome d'oxygène lorsque X est un atome d'oxygène, et Y est un atome d'hydrogène lorsque X est un atome d'azote ;
- R1 est choisi parmi un atome d'hydrogène ou un radical alkoxy linéaire ou ramifié de 1 à 4 atomes de carbone ;
- R2 est choisi parmi un atome d'hydrogène, un radical alkoxy linéaire ou ramifié de 1 à 4 atomes de carbone ou -CF3 ;
- R3 est choisi parmi un atome d'hydrogène, un hydroxy, un radical alkoxy linéaire ou ramifié de 1 à 4 atomes de carbone, -CF3, -N02 ou -NH2 ; '
- R4 est choisi parmi un atome d'hydrogène, un radical alkoxy linéaire ou ramifié de 1 à 4 atomes de carbone ou -CF3 ;
- R10, R11 , R12, R13 pris indépendamment sont choisis parmi un atome d'hydrogène, un radical alkyle linéaire ou ramifié de 1 à 6 atomes de carbone, un hydroxy ou un radical alkoxy linéaire ou ramifié de 1 à 4 atomes de carbone ;
- Z est choisi parmi un radical alkoxy de 1 à 4 atomes de carbone ou un radical mono ou dialkylamino de 1 à 4 atomes de carbone, ou pris ensemble avec R12 forme un groupement pyrrole éventuellement monosubstitué par un radical alkyle linéaire ou ramifié de 1 à 3 atomes de carbone ;
leurs analogues et leurs sels pharmaceutiquement acceptables, pour le traitement des cellules tumorales surexprimant les pompes P-gp et/ou BCRP et des cellules tumorales irriguées par des vaisseaux tapissés de cellules endothéliales de la barrière hémato-encéphalique et hémato-testiculaire surexprimant les pompes P-gp et/ou BCRP.
De préférence, les composés selon l'invention sont de formule générale :
dans laquelle :
- X est choisi parmi un atome d'oxygène ou d'azote ;
- Y est un atome d'oxygène lorsque X est un atome d'oxygène, et Y est un atome d'hydrogène lorsque X est un atome d'azote ;
- R1 est un atome d'hydrogène ;
- R2 est choisi parmi un atome d'hydrogène, un groupement méthoxy ou - CF3 ;
- R3 est choisi parmi un atome d'hydrogène, un hydroxy, un groupement méthoxy, -CF3, -N02 ou -NH2 ;
- R4 est choisi parmi un atome d'hydrogène, un groupement méthoxy ou -
CF3 ;
- R10, R1 1 , R13 sont un atome d'hydrogène ;
- R12 est choisi parmi un atome d'hydrogène ou un hydroxy ;
- Z est choisi parmi un groupement methoxy, ou un groupement diméthyle amino, ou pris ensemble avec R12 forme un groupement pyrrole monosubstitué par un radical méthyle ;
leurs analogues et leurs sels pharmaceutiquement acceptables.
Encore plus préférentieliement, les composés selon l'invention sont choisis parmi :
- 4-(3-Hydroxy-4-méthoxyphényl)coumarine ;
- 4-(3-Hydroxy-4-méthoxyphényl)-7-méthoxycoumarine ;
- 4-(3-Hydroxy-4-méthoxyphényl)-6-méthoxycoumarine ;
- 4-(3-Hydroxy-4-méthoxyphényl)-6-hydroxycoumarine ;
- 4-(3-Hydroxy-4-méthoxyphényl)-6-nitrocoumarine ;
- 4-(3-Hydroxy-4-méthoxyphényl)-6-aminocoumarine ;
- 4-(3-Hydroxy-4-méthoxyphényl)-5-méthoxycoumarine ;
- 4-(3-Hydroxy-4-méthoxyphényl)-6,7-diméthoxycoumarine ;
- 4-(3-Hydroxy-4-méthoxyphényl)-5,7-diméthoxycoumarine ;
- 4-(3-Hydroxy-4-méthoxyphényl)-5,6-diméthoxycoumarine ;
- 4-(3-Hydroxy-4-méthoxyphényl)-5,6,7-triméthoxycoumarine;
- 4-(/V-méthyl-indol-5-yl)coumarine ;
- 7-méthoxy-4-(/V-méthyl-indol-5-yl)coumarine ;
- 6-méthoxy-4-(A/-méthyl-indol-5-yl)coumarine ;
- 6-hydroxy-4-(/V-méthyl-indol-5-yl)coumarine ;
- 5-méthoxy-4-(A/-méthyl-indol-5-yl)coumarine ;
- 6,7-diméthoxy-4-(/V-méthyl-indol-5-yl)coumarine ;
- 5,7-diméthoxy-4-(A/-méthyl-indol-5-yl)coumarine ;
- 5,6-diméthoxy-4-(A/-méthyl-indol-5-yl)coumarine ;
- 5,6,7-triméthoxy-4-(A/-méthyl-indol-5-yl)coumarine ;
- 4-(4-N,N-diméthylaminophényl)-6-nitrocoumarine ;
- 6-amino-4-(4-N,N-diméthylaminophényl)coumarine ;
- 4-(4-N,N-diméthylaminophényl)-6-méthoxycoumarine ;
- 4-(3-hydroxy-4-méthoxyphényl)quinoléine ;
- 4-(3-hydroxy-4-méthoxyphényl)-7-méthoxyquinoléine ;
- 4-(3-hydroxy-4-méthoxyphényl)-6-méthoxyquinoléine ;
- 4-(3-hydroxy-4-méthoxyphényl)-6,7-diméthoxyquinoléine ;
- 4-(3-hydroxy-4-méthoxyphényl)-5,7-diméthoxyquinoléine ;
- 4-(3-hydroxy-4-méthoxyphényl)-5,6,7-triméthoxyquinoléine;
- 4-(3-hydroxy-4-méthoxyphényl)-7-trifluorométhylquinoléine;
- 4-(3-hydroxy-4-méthoxyphényl)-6-trifluorométhylquinoléine;
- 4-(3-hydroxy-4-méthoxyphényl)-6-méthoxy-7-trifluorométhylquinoléine ;
- 4-(3-hydroxy-4-méthoxyphényl)-5-trifluorométhyl-7-méthoxyquinoléine ;
- 4-(3-hydroxy-4-méthoxyphényl)-5-méthoxy-7-trifluorométhylquinoléine ;
- 4-(3-hydroxy-4-méthoxyphényl)-5,7-bis(trifluorométhyl)quinoléine ;
leurs analogues et leurs sels pharmaceutiquement acceptables.
Tel qu'illustré dans les exemples ci-après, l'une des propriétés remarquables des composés selon l'invention est qu'ils possèdent une activité antiproliférative très fortement marquée et induisent l'apoptose des cellules tumorales.
Des études mécanistiques détaillées ont clairement établi que l'inhibition de l'assemblage de la tubuline était le principal mode d'action des composés selon l'invention. Le site de liaison des composés selon l'invention à la tubuline a était identifié comme étant le domaine de liaison de la colchicine.
Avantageusement, les composés selon l'invention sont conformationnellement contraints dans la forme bioactive, de manière à éviter toute isomérisation et perte d'activité lors du stockage et/ou de l'administration au malade.
Aussi, seuls les composés 4-(3-Hydroxy-4-méthoxyphényl)-5,7- diméthoxycoumarine et 4-(3-Hydroxy-4-méthoxyphényl)-5,6,7-triméthoxycoumarine parmi les composés de formule générale selon l'invention apparaissent avoir été décrits dans les documents de l'art antérieur cité, pour leur activité concernant l'inhibition de l'assemblage microtubulaire et l'induction d'apoptose de cellules tumorales du sein.
De plus, tel qu'illustré dans les exemples ci-après, les composés selon l'invention, et donc également les composés 4-(3-Hydroxy-4-méthoxyphényl)-5,7- diméthoxycoumarine et 4-(3-Hydroxy-4-méthoxyphényl)-5,6,7-triméthoxycoumarine, combinent de façon surprenante cette activité antiproliférative à une forte activité d'inhibition des pompes ABC et/ou sont insensibles aux pompes ABC, et plus particulièrement BCRP et P-gp, qui sont impliquées dans les mécanismes de résistance à la chimiothérapie.
L'intérêt majeur et l'avantage des composés selon l'invention réside dans cette double action combinée d'agents cytotoxiques inhibiteurs des pompes ABC et/ou insensibles aux pompes ABC. Les composés selon l'invention possèdent une forte activité inhibitrice des pompes ABC et/ou sont insensibles aux pompes ABC, plus particulièrement BCRP et P-gp, et ne sont pas substrats de ces pompes.
A cet effet, les composés de formule générale selon l'invention sont destinés à traiter des cellules tumorales présentes dans des organes qui de manière générale développent des mécanismes de résistance liés aux pompes P-gp et BCRP qui confèrent à la tumeur une plus grande résistance aux agents anticancéreux, et plus particulièrement des organes dans lesquels les cellules
tumorales surexpriment P-gp et/ou BCRP ou sont irriguées par des vaisseaux tapissés de cellules endothéliales surexprimant P-gp et/ou BCRP, par( inhibition de l'assemblage de la tubuline et des pompes à efflux membranaires de la famille ABC, telles que P-gp et BCRP.
Préférentiellement, les composés de formule générale selon l'invention sont utilisés pour le traitement des cellules tumorales surexprimant les pompes P-gp et/ou BCRP choisies parmi le cancer du rein, du colon, du poumon, du foie et du pancréas.
Préférentiellement, les composés selon de formule générale selon l'invention sont également utilisés pour le traitement des cellules tumorales irriguées par des vaisseaux tapissés de cellules endothéliales de la barrière hémato-encéphalique et hémato-testiculaire surexprimant les pompes P-gp et/ou BCRP choisies parmi le cancer du testicule et du cerveau.
Avantageusement, les composés selon l'invention peuvent franchir facilement la barrière hémato-encéphalique et hémato-testiculaire contrairement à d'autres agents anticancéreux sensibles aux pompes ÂBC. Les pompes ABC sont notamment surexprimées au niveau des cellules endothéliales de la barrière hémato-encéphalique et hémato-testiculaire et plus spécifiquement les protéines P- gp et BCRP qui limitent fortement la diffusion des agents anticancéreux vers les tissus cérébraux notamment. Les composés selon l'invention sont ainsi des agents anticancéreux de choix pour le traitement du glioblastome. De même, les composés selon l'invention sont également particulièrement intéressants pour le traitement du cancer du testicule.
Les composés selon l'invention pourraient induire ainsi la mort des cellules souches tumorales connues pour exprimer les pompes ABC, en particulier BCRP et P-gp, qui sont impliquées dans le processus de rechute.
L'utilisation des composés selon l'invention en oncologie permet avantageusement d'éviter le traitement thérapeutique par combinaison de deux agents, l'un jouant le rôle de composé anticancéreux, et l'autre le rôle d'inhibiteur de P-gp et BCRP. En effet, de telles combinaisons peuvent induire d'importants effets secondaires chez le patient et nécessitent, de plus, différentes études pharmacocinétiques incompatibles avec une pratique quotidienne.
Les composés 6-méthoxy-4-(N-méthyl-indol-5-yl)coumarine, 4-(3-hydroxy-4- méthoxyphényl)-6-aminocoumarine et 4-(3-hydroxy-4-méthoxyphényl)-6- méthoxycoumarine, ainsi que les composés 4-(3-Hydroxy-4- méthoxyphényl)coumarine, 4-(3-Hydroxy-4-méthoxyphényl)-5,7- diméthoxycoumarine, 4-(N-méthyl-indol-5-yl)coumarine, 5-méthoxy-4-(N-méthyl- indol-5-yl)coumarine et 5,7-diméthoxy-4-(N-méthyl-indol-5-yl)coumarine,
appartenant à la classe des composés néoflavonoiques, ont été préférentiellement identifiés, encore plus préférentiellement les composés 6-méthoxy-4-(N-méthyl- indol-5-yl)coumarine, 4-(3-hydroxy-4-méthoxyphényl)-6-aminocoumarine et 4-(3- hydroxy-4-méthoxyphényl)-6-méthoxycoumarine.
D'autres avantages et caractéristiques de l'invention apparaîtront mieux à la lecture des exemples ci-dessous donnés à titre illustratif et non limitatif.
Exemple 1 : Test de prolifération
Suivant le protocole décrit ci-dessous, on a testé les activités cytostatiques et cytotoxiques de composés selon l'invention sur des cellules épithéliales mammaires humaines en culture, plus particulièrement les cellules HBL100.
Les cellules épithéliales mammaires humaines HBL100 sont cultivées dans un milieu DMEM (Gibco®) enrichi avec 10% de sérum de veau fœtal (FBS), 2 mM de L-glutamine et 1 % de pénicilline/streptomycine (Gibco®). Les cellules HBL100 sont maintenues dans un incubateur humidifié à 37°C avec 5% de C02.
Les cellules HBL100 en croissance exponentielle (2,6*104 cellules/cm2) ont été ensemencées 24h avant le traitement avec des composés selon l'invention.
L'inhibition de la croissance de ces cellules a été étudiée 72h après traitement avec différents composés selon l'invention, en utilisant le test colorimétrique MTT (3-(4,5-diméthylthiazol-2-yl)-2,5-diphényltétrazolium bromide ; Sigma®). L'absorbance a été mesurée à 550 nm (MR 7-000 ; Dynatech®).
On a alors déterminé graphiquement la GI50, c'est-à-dire la concentration provoquant 50% d'inhibition de la prolifération des cellules HBL100. Les différentes GI50 caractérisant les activités cytostatiques et cytotoxiques obtenues pour chacun des composés selon l'invention testés sont récapitulées dans le tableau 1 ci- dessous :
Tableau 1 : Cvtotoxicité de composés selon l'invention sur des cellules HBL100
Il apparaît que les composés selon l'invention inhibent la croissance des cellules mammaires (HBL100) avec une GI50 comprise entre 39 nM et 2,95 μΜ, et pour la majorité de l'ordre du nanomolaire. Ainsi, les composés selon l'invention sont identifiés comme de puissants antinéoplasiques qui inhibent la croissance cellulaire.
En effet, on considère, d'une manière générale, qu'un composé ayant une GI50 inférieure à 1 μΜ a une activité antiproliférative très significative et est
particulièrement efficace ; entre 1 et 5 μΜ, un composé a une activité antiproliférative significative alors que les composés présentant une GI50 supérieure à 5 μΜ présente une activité antiproliférative peu significative, ce qui n'est pas le cas avec les composés selon l'invention.
Exemple 2: Effets sur la liaison et l'assemblage de la tubuline
On a utilisé la fluorescence du 4',6-diamidino-2-phénylindole (DAPI) pour suivre la formation des microtubules. Cet agent de liaison bien connu se lie aux microtubules avec une plus grande affinité que pour les dimères de tubuline. Ainsi, le DAPI est un fluorophore intéressant pour suivre la formation des microtubules en ce qu'il n'affecte pas les propriétés de la tubuline pour former les microtubules et son utilisation est plus sensible qu'une analyse turbidimétrique.
Le tableau 2 ci-après indique le rapport molaire (ligand/tubuline) nécessaire pour inhiber la moitié de la formation des microtubules in vitro.
Par exemple, un rapport molaire de 0,07 mole de combretastatine par mole de tubuline est nécessaire pour diviser en deux la formation des microtubules.
La constante stoechiométrique d'affinité apparente de liaison Ka a également été calculée pour chaque composé selon l'invention testé et répertoriée dans le tableau 2.
Pour la purification de la tubuline, la tubuline a été extraite à partir de cerveaux d'agneau par fractionnement au sulfate d'ammonium et chromatographie échangeuse d'ions et stockée dans de l'azote liquide. Avant utilisation, des aliquotes de protéines ont été chromatographiées sur colonne (1 *5 cm) de Sephadex G25® spin, équilibrées avec un tampon PG (20 mM de phosphate de sodium, 0,1 mM GTP, pH 7), suivi d'un passage sur une colonne de gravité de Sephadex G25® (1*10 cm) et équilibrées avec le même tampon. La concentration en protéines a été mesurée par spectrophotométrie avec un spectrophotomètre de Perkin-Elmer Lambda 800® à 275 nm avec un coefficient d'extinction de 1 ,09 L g-1 cm-1 en chlorhydrate de guanidine ou de 1 ,07 L g-1 cm-1 dans 0,5% de SDS dans un tampon aqueux neutre.
Pour l'assemblage de la tubuline, la formation des microtubules a été suivie sur un spectrofluoromètre Fluoroscan® Ascent FL (Labsystems) en utilisant une plaque 96 puits. La longueur d'onde d'excitation a été placée à 355 nm et la longueur d'onde d'émission a été placée à 460 nm. Les expériences ont été effectuées à 37°C avec 7,5 μΜ de DAPI, 15 μΜ de tubuline dans 20 mM d'un tampon de phosphate de sodium, 1 mM d'acide tétraacétique d'éthylène-glycol (EGTA), 10 mM de MgCI2, 10~4 M de GTP et 3,4 M de glycérol, pH 6,5. Dans ces conditions, l'exaltation de la fluorescence DAPI est directement proportionnelle à la
concentration de tubuline polymérisée et a été mesurée en fonction du temps. La concentration de e2SO a été maintenue en-dessous de 4% dans tous les échantillons et les contôles.
Pour les mesures de liaison par titrage de fluorescence, les mesures de fluorescence ont été effectuées avec un spectromètre de luminescence de Perkin- Elmer 50® avec des largeurs de fente de 10/10 nm. Des spectres de fluorescence non corrigés ont été obtenus dans un tampon PG, pH 7, en utilisant 0,2 (direction d'excitation) * 1 cm cellules (Hellma) thermostatées à 25°C en circulation d'eau à partir d'un bain d'eau externe. La détermination des paramètres de liaison a été réalisée en mesurant l'extinction du signal intrinsèque de fluorescence des protéines par les ligands. La tubuline (1-4 μΜ) a été titrée avec différentes concentrations de composés. Des mesures de fluorescence ont été effectuées avec une longueur d'onde d'excitation de 295 nm afin d'exciter spécifiquement les résidus tryptophane de la tubuline.
Pour le titrage de la fluorescence de liaison pour les composés, l'émission de fluorescence a été enregistrée à 340 nm. Les effets du filtre intérieur ont été corrigés selon la procédure suivante :
Fcorr = Fobs exp {(Aexc + Aem)/2};
Fobs et Fcorr sont respectivement les valeurs observées et corrigées de fluorescence aux longueurs d'onde d'émission;
Aexc et Aem sont respectivement les absorptions aux longueurs d'onde d'excitation et d'émission, calculées avec Ax = SxlxC dans lequel x est la direction d'excitation ou d'émission, 8 est le coefficient d'extinction, I est la longueur de trajet de la cellule dans les directions d'excitation et d'émission, et C est la concentration de ligand. Les courbes d'extinction corrigée de titrage de fluorescence ont été inversées et adaptées à l'équation de la courbe de saturation au moyen d'analyse de régression des moindres carrés non linéaires.
Fmax est la valeur de fluorescence de plateau. Les concentrations (ligand lié [Lb] et ligand libre [Lf]) et la constante de dissociation stoechiométrique de liaison Kd ont été déterminées à partir de l'équation suivante : [Lb] = 1/2 {([L0] + [P0] + Kd) - (([L0] + [P0] + Kd)2 - 4[P0][L0])1/2},
avec [L0] et [P0] qui sont respectivement les concentrations totales en ligand et en protéine. L'algorithme commence avec une valeur arbitraire de Kd. Avec cette valeur, [Lb] et [Lf] sont calculées, et ainsi les analyses de régression des moindres carrés non linéaires sont exécutés. L'ensemble initial est corrigé dans la prochaine étape par un procédé de Newton-Gauss. Ce procédé itératif est poursuivi jusqu'à la somme minimum des déviations carrées entre les valeurs expérimentales et les valeurs calculées de Fcorr obtenues.
Les concentrations des composés ont été mesurées par spectrophotométrie. Les coefficients d'extinction, 8, ont été déterminés en dissolvant la poudre sèche des composés dans du Me2SO (diméthylsulfoxyde) et la diluant dans un tampon 20 mM NaPi, pH 7, puis en prenant les spectres UV visibles.
Tableau 2: Effets inhibiteurs sur la formation de microtubules à 37°C et paramètres de liaison des composés à la tubuline dans un tampon PG à 25°C
NT: non testé
Les composés selon l'invention inhibent fortement l'assemblage de la tubuline avec une bonne corrélation à leur activité antiproliférative. Ainsi, les composés selon l'invention sont identifiés comme de puissants inhibiteurs de polymérisation de la tubuline agissant pour la plupart selon un mode d'action substoechiométrique.
En effet, on considère, d'une manière générale, qu'on a une activité efficace dans l'inhibition de l'assemblage des microtubules pour un rapport molaire inférieur à 5 μΜ. Ici, on observe uniquement des rapports molaires inférieurs à 5 μΜ, de l'ordre du micromolaire, caractéristique d'un mode d'action substoechiométrique pour les composés selon l'invention.
Cette analyse fluorimétrique met en évidence une inhibition marquée de la formation des microtubules avec l'utilisation des composés selon l'invention. Le taux d'assemblage, ainsi que la quantité finale de microtubules, sont inférieurs en présence des composés selon l'invention par rapport à l'expérience de contrôle relative à la polymérisation de la tubuline seule, sans ajout de composé de l'invention qui représente un plateau de polymérisation égale à 100% d'assemblage de la tubuline.
Aussi, la combretastatine est prise comme composé de référence et un rapport molaire de 0,07 mole de combretastatine par mole de tubuline est nécessaire pour diviser en deux la formation des microtubules.
Le rapport molaire pour les composés selon l'invention testés a été calculé par rapport aux résultats expérimentaux des tests. De même, par rapport à ces
résultats, on a pu tracer les courbes d'inhibition de polymérisation de la tubuline en fonction de la concentration en composé testé (non représenté). Ce graphe donne une droite de pente donnée et permet de conclure que l'inhibition de l'assemblage de la tubuline est dose dépendante et linéaire. L'ampleur de l'inhibition avec tous les composés selon l'invention augmente de façon linéaire avec le rapport molaire ligand total / tubuline totale dans la solution.
Plus particulièrement, les spectres d'émission intrinsèques non corrigés de fluorescence de la tubuline ont été examinés en excitant les résidus de tryptophane à 295 nm. On a observé une diminution de l'intensité d'émission de fluorescence à 340 nm avec l'augmentation des concentrations des composés testés. Cette extinction de la fluorescence a été utilisée pour réaliser des expériences de titrage de liaison. L'extinction de la fluorescence de la tubuline a été observée pour tous les composés testés et suggère que les composés se lient à la tubuline sur un site de liaison proche du fluorophore, par exemple, au niveau des résidus tryptophane et tyrosine. On observe des Ka supérieures à 106 M pour les composés selon l'invention les plus acifs, ce qui met en évidence une forte liaison de ces composés à la tubuline. Il a été montré que ces composés se lient rapidement et de manière réversible à la tubuline. Une décroissance de l'affinité pour la tubuline est corrélée avec une diminution de l'activité inhibitrice de l'assemblage de la tubuline in vitro.
Exemple 3: Inhibition de la prolifération cellulaire in vitro de différentes lignées de cellules tumorales avec la 4-(3-Hvdroxy-4-méthoxyphényl)-57-diméthoxycoumarine (composé 9)
Dans cette expérience, les cellules leucémiques humaines CEM sont obtenues à partir de l'« American Tissue Culture Collection ». Les cellules sont cultivées à 37°C dans une atmosphère humidifiée contenant 5% de C02 dans un milieu RPMI 1640, enrichi avec 10% de sérum de veau fœtal, 2 mM de L-glutamine, 1 ,5 g/L de sodium bicarbonate, 4,5 g/L de glucose, 10 mM de HEPES, 1 mM de sodium pyruvate, de la pénicilline (100 lU/mL) et de la streptomycine (100 g/mL).
La lignée cellulaire EHEB, établie à partir de patient CLL (leucémie lymphocytique chronique) sont cultivées à 37°C dans une atmosphère humidifiée contenant 5% de C02 dans un milieu RPMI 1640, enrichi avec 2 mM de glutamine, 1 mM de sodium pyruvate, 100 lU/ml de pénicilline, 100 g ml de streptomycine et 10% de sérum de veau foetal (PAA Laboratories, Pasching, Autriche) à une densité d'ensemencement de 2*106 cellules/ml.
Les lignées cellulaires HCT1 16 et K562 sont cultivées à 37°C dans une atmosphère humidifiée contenant 5% de C02 dans un milieu RPMI 1640 enrichi avec 10% de sérum de veau fœtal.
Les cellules épithéliales mammaires humaines HBL100 sont cultivées dans un milieu DMEM (Gibco®) enrichi avec 10% de sérum de veau foetal (FBS), 2 mM de L-glutamine et 1 % de pénicilline/streptomycine (Gibco®). Les cellules HBL100 sont maintenues dans un incubateur humidifié à 37°C avec 5% de C02.
L'effet de la 4-(3-Hydroxy-4-méthoxyphényl)-5,7-diméthoxycoumarine
(composé 9) selon l'invention sur la prolifération cellulaire a ainsi été testé suivant le protocole décrit dans l'exemple 1 sur ces différentes cellules : cellules T (CEM), cancer du sein (HBL100), carcinome du colon (HCT116, HCT1 16R résistant au BCRP), hématopoïétique K562, K562R résistant à la P-gp), leucémie lymphocytique chronique et lymphocyte B normaux (CLL, B-cell) (non représentés), cellules tumorales du rein (ACHN, 786-0, Caki-1 , RCC4+, RCC4-) (non représentées).
Pour l'analyse par cytométrie de flux du contenu d'ADN, 106 cellules en croissance exponentielle ont été traitées avec des concentrations graduées du composé selon l'invention testé pendant 24h et puis lavées avec 1 ml de PBS. Après centrifugation, le culot de cellules a été resuspendu dans 1 ml d'éthanol froid pendant 1 h à 4°C. L'éthanol a ensuite été éliminé, le culot a été lavé avec 1 ml PBS puis incubé pendant 30 minutes dans une solution d'iodure de propidium (PI à 50 pg/mL) contenant 100 pg/ml de RNAse. Les échantillons ont été analysés sur un cytomètre de flux Becton Dickinson FACScan en utilisant le logiciel CelIQuest qui a également été utilisé pour déterminer le pourcentage de cellules dans les différentes phases du cycle cellulaire. PI a été excité à 488 nm, et la fluorescence a été analysée à 620 nm sur le canal FI-2.
Les résultats de cytotoxicité et le profil du cycle cellulaire observé sur ces cellules avec 1 μΜ de 4-(3-Hydroxy-4-méthoxyphényl)-5,7-diméthoxycoumarine sont répertoriés dans le Tableau 3 ci-dessous :
Tableau 3 : Cytotoxicité et profil du cycle cellulaire de différentes lignées traitées avec 1 uM de 4-(3-Hvdroxy-4-méthoxyphényl)-5,7-diméthoxycoumarine (composé 9}
Lignée Profil du cycle cellulaire après
Origine Glso(nM)
cellulaire 24h de traitement
Forte accumulation G2/M;
CEM Lymphoïde 83
Forte accumulation sous-G1
Sang
EHEB 35 Non testé
périphérique
Accumulation massive G2/M;
HBL100 Sein 88
Forte accumulation sous-G1
Accumulation G2/M;
HCT116 Colon 210
Forte accumulation sous-G1
Accumulation G2/M;
K562 Hématopoïétique 100
Forte accumulation sous-G1
En conclusion, la 4-(3-Hydroxy-4-méthoxyphényl)-5,7-diméthoxycoumarine a un effet cytostatique sur les cellules tumorales du sein, du colon, du sang, des organes lymphoïdes dans une plage nanomolaire, par arrêt du cycle cellulaire en mitose. Le profil du cycle cellulaire révèle une accumulation d'événements dans la région sous G1 ce qui est significatif de cellules en apoptose. Il a également été observé que les cellules normales de contrôle ne sont pas affectées par ce composé dans cette expérience.
Exemple 4: Effet de la 6-méthoxy-4-(N-méthyl-indol-5-yl)coumarine (composé 14) sur la croissance cellulaire de cellules tumorales rénales 786-Q
Les cellules 786-0 ont été cultivées pendant 24h avant l'ajout d'un véhicule (solution de PBS à 1/1000 de DMSO) ou de la 6-méthoxy-4-(N-méthyl-indol-5- yl)coumarine (composé 14) à des concentrations de 50 nM, 100 nM ou 200 nM. Les cellules viables ont alors été comptées 24h, 48h et 72h après traitement par le test MTT. Les lignées dérivées de carcinomes rénaux ont toutes été cultivés en présence de de RPMI 640 avec 10% de sérum de veau foetal inactivé. Les cellules ont été cultivées dans un incubateurs à 37°C avec 5% de C02. Les effets sur la viabilité cellulaire ont été déterminés par exclusion du bleu trypan à 0,4% et confirmé par un test au MTT qui consiste en la réduction du bromure de 3-(4,5- diméthylthiazol-2-yl)-2,5-diphényltétrazolium.
La figure 1 montre qu'une concentration d'au moins 50 nM de 6-méthoxy-4- (N-méthyl-indol-5-yl)coumarine permet de réduire la croissance cellulaire de cellules tumorales rénales de la la lignée 786-0 après 72h. Aussi, plus on augmente la concentration en 6-méthoxy-4-(N-méthyl-indol-5-yl)coumarine, plus on réduit la croissance de ces cellules tumorales, passant de 90% à 50% voire 20% avec des concentrations respectivement de 100 nM ou 200 nM après 72h ce qui met en évidence l'action significative de cette molécule à 200 nm.
Exemple 5: Effet de la 4-(3-hvdroxy-4-méthoxyphényl)-6-aminocoumarine (composé 6) sur le cycle cellulaire de cellules tumorales rénales 786-0
Les cellules 786-0 ont été cultivées pendant 24h avant ajout de la 4-(3- hydroxy-4-méthoxyphényl)-6-aminocoumarine (composé 6) (200 nM). Les cellules ont été ensuite cultivées pendant 24h ou 48h, trypsinisées, rincées 2 fois puis utilisées pour analyser leur cycle cellulaire en utilisant le kit de réaction CycleTestTM PLUS/DNA à 24h. Le pourcentage de cellules de chaque phase du cycle cellulaire a été obtenu en utilisant le logiciel Modfit®. Le contrôle négatif est caractérisé par l'absence d'ajout d'un quelconque composé et le contrôle positif est caractérisé par l'ajout de la molécule JAI 51 à une concentration de 10 μΜ.
La figure 2 montre un pic caractéristique de cellules en apoptose pour les cellules tumorales rénales traitées avec la molécule JAI 51 (contrôle positif) et avec 200 nM de 4-(3-hydroxy-4-méthoxyphényl)-6-aminocoumarine. Cette figure 2 met ainsi en évidence une nette accumulation de cellules en phase G2/M avec également une augmentation des cellules au-delà de la phase G2/M traduisant un phénomène d'endoréplication. La nette augmentation des événements dans la zone sous G1 traduit de nombreuses cellules en apoptose. Ainsi, à une concentration de 200 nm en 4-(3-hydroxy-4-méthoxyphényl)-6-aminocoumarine (composé 6), on observe des cellules qui rentrent en apoptose et un blocage de la division cellulaire.
Exemple 6: Induction de l'apoptose
Afin de démontrer que l'activité cytotoxique des composés selon l'invention est provoquée par l'induction de l'apoptose, trois techniques d'analyses complémentaires qui détectent spécifiquement l'apoptose ont été réalisées sur des cellules CEM traitées avec la 4-(3-hydroxy-4-méthoxyphényl)-5,7- diméthoxycoumarine (composé 9), Chacune des analyses suivantes permet de détecter des marqueurs précoces de l'apoptose, i) variation du potentiel membranaire des mitochondries, ii) activation des caspases, iii) perméabilisation membranaire.
i) La polarisation mitochondriale a été déterminée à travers la rétention du colorant fluorescent DiOC6 (3,3-dihexyloxacarbocyanine iodure, Molecular Probes, Inc.). Après le traitement par le composé selon l'invention, 106 cellules dans 1 ml de milieu complet RPMI 1640 ont été chargées avec la sonde DiOC6 (habituellement 25 nm sauf indication contraire) pendant 30 minutes à 37°C avant l'analyse par cytométrie de flux. Le même temps d'incubation a été appliqué aux conditions contrôles et aux échantillons traités par le composé selon l'invention.
Les conditions de contrôle ont été réalisées en incubant des cellules avec du CCCP (carbonyl cyanide p-chlorophénylhydrazone) à 5 et 50 μΜ pendant 10 minutes à 37°C. DiOC6 a été excité à 488 nm, et la fluorescence a été analysée à 525 nm (FI-1 ) après amplification logarithmique. La lumière diffractée (FSC) et la lumière réfléchie (SSC) ont été analysées après amplification linéaire.
Le pourcentage de cellules dépolarisées en fonction de la concentration en composé testé a été déterminé à partir de l'analyse des variations du potentiel membranaire des mitochondries. On observe (non représenté) une augmentation graduelle du pourcentage de cellules dépolarisées significative d'une induction d'apoptose irréversible par la 4-(3-hydroxy-4-méthoxyphényl)-5,7- diméthoxycoumarine.
ii) Après le traitement par la 4-(3-hydroxy-4-méthoxyphényl)-5,7- diméthoxycoumarine (composé 9), les cellules ont été centrifugées, lavées avec du PBS et resuspendues dans 50 μΐ du substrat PhiPhil_ux-G1 D2 (Oncolmmunin Inc., DM) pendant 1 h à 37°C suivant le protocole donné par le fabricant. Le clivage du peptide lieur PhiPhiLux (séquence DEVD) séparent les parties rhodamine et résulte en une fluorescence observable par cytométrie de flux. Les pourcentages de cellules montrant une activation des caspase-3 ont été déterminés par cytométrie de flux. Le composé de l'invention induit (non représenté) une activation massive des caspases dont l'effet est comparable à celui l'étoposide, un composé anticancéreux proapoptotique bien connu.
iii) Après le traitement par la 4-(3-hydroxy-4-méthoxyphényl)-5,7- diméthoxycoumarine (composé 9), les cellules ont été marquées par l'iodure de propidium et l'annexine V-FITC qui sont respectivement des marqueurs de l'ADN et des résidus phosphatidylsérine. La fluorescence a été suivie par cytométrie de flux. Le pourcentage de cellules marquées par l'annexine V augmente sensiblement après traitement (non représenté) par le composé de l'invention ce qui est caractéristique d'un état précoce d'apoptose. Rapidement, une accumulation de cellules doublement marquées par l'annexine V et l'iodure de propidium témoigne d'un procéssus d'apoptose plus avancé. Ainsi, la perte de la perméabilité membranaire et l'extemalisation de phosphaditylsérine qui s'en suit sur la face externe de la membrane plasmique indique que la 4-(3-hydroxy-4-méthoxyphényl)- 5,7-diméthoxycoumarine induit l'apoptose.
Ainsi, l'induction de l'apoptose par les composés de l'invention est associé a un changement charactéristique du cycle cellulaire, à une perte du potentiel membranaire mitochondriale, à l'activation de caspases 3 et à une perméation membranaire des cellules.
Exemple 7 : Effets de la 6-méthoxy-4-(N-méthyl-indol-5-yl)coumarine (composé 14) sur 5 lignées de cellules tumorales rénales ACHN. CAKI-1 , 786-Q, RCC4+ et RCC4- au niveau du cycle cellulaire par le CvcleTest™ PLUS/DNA (6A) et de la détermination de l'apoptose par la méthode Annexine V-FITC/PI (6B)
Les cellules ACHN, CAKI-1 , 786-0, RCC4+ et RCC4- ont été cultivées pendant 24h avant l'ajout de la 6-méthoxy-4-(N-méthyl-indol-5-yl)coumarine (composé 14) (150 nM). Les cellules ont ensuite été cultivées pendant 24h ou 48h, trypsinisées, rincées 2 fois puis utilisées pour analyser le cycle cellulaire en utilisant le kit de réaction CycleTest™ PLUS/DNA (6A) à 24h ou pour la détermination de l'apoptose en utilisant la méthode Annexine V-FITC/PI (6B) à 48h. Le pourcentage de cellules dans chaque phase du cycle cellulaire a été obtenu en utilisant le logiciel
Modfit® et le nombre mentionné indique le poucentage de cellules en phase G2/M du cycle cellulaire. Le milieu de culture est identique à celui décrit plus haut.
La figure 3A montre une phase sous G1 caractéristique de cellules en apoptose pour les 5 lignées traitées avec 150 nM de 6-méthoxy-4-(N-méthyl-indol- 5-yl)coumarine, avec quasiment deux fois plus de cellules dans la phase G2/M du cycle cellulaire. La 6-méthoxy-4-(N-méthyl-indol-5-yl)coumarine induit donc une apoptose et une accumulation des cellules en G2/M du cycle cellulaire.
La figure 3B montre dans la colonne de gauche les cellules non traitées par la 6-méthoxy-4-(N-méthyl-indol-5-yl)coumarine et dans la colonne de droite les cellules incubées avec la 6-méthoxy-4-(N-méthyl-indol-5-yl)coumarine. Les cellule sont incubées avec de l'annexine V couplée au FITC (en abscisse) et avec de l'iodure de propidium (en ordonnée) révélant respectivement l'apoptose et la nécrose cellulaire. On peut voir sur toutes les lignées une augmentation notable de l'apoptose et de la nécrose cellulaire avec la 6-méthoxy-4-(N-méthyl-indol-5- yl)coumarine (composé 14) par rapport à la condition contrôle.
Exemple 8 : Effet de la 6-méthoxy-4-(N-méthyl-indol-5-yl)coumarine (composé 14) sur l'expression de la caspase-3 de 5 lignées de cellules tumorales rénales ACHN, CAKI-1. 786-Q. RCC4+ et RCC4- Les cellules tumorales rénales (ACHN, 786-0, CAKI-1 , RCC4+ et RCC4-) ont été cultivées avec ou sans 6-méthoxy-4-(N-méthyl-indol-5-yl)coumarine (composé 14) (200 nM) pendant 24h et 48h. Les cellules ont été rincées 2 fois, puis utilisées pour déterminer l'expression de la caspase-3. L'activité de la caspase a été détectée par un substrat fluôrimétrique.
La figure 4 montre une élévation de l'activité de la caspase 3 pour l'ensemble des lignées cellulaires en présence de la 6-méthoxy-4-(N-méthyl-indol-5- yl)coumarine (composé 14), avec un pic à 24h pour la lignée 786-0.
Exemple 9: Interactions avec les pompes P-gp et BCRP
Sur la base de leurs effets cytotoxiques, des composés selon l'invention ont été choisis afin d'évaluer leur activité en tant que modulateurs potentiels des pompes à efflux membranaires de la famille ABC (P-gp et BCRP) (cassette de liaison à l'ATP), qui sont impliquées dans la chimiorésistance dans différents cancers. La sensibilité des composés selon l'invention en tant que substrat P-gp et BCRP a été analysée.
Pour l'évaluation de l'activité sur P-gp et BCRP (Tableau 4), des études d'accumulation de la mitoxantrone (substrat de BCRP) et de la daunorubicine (substrat de P-gp) ont été réalisées sur la lignée cellulaire HCT1 16S sauvage
(sensible) qui n'exprime pas BCRP, et la forme résistante HCT116R de BCRP- transfecté, et sur la lignée cellulaire K562S sauvage (sensible) et K562R (résistante) exprimant P-gp. Les cellules ont été cultivées dans un milieu RPMI 1640 avec 10% de sérum de veau foetal et trypsinisées (HCT116), rincées deux fois puis resuspendues dans un milieu RPMI 1640 avec 10% de sérum de veau fœtal pour obtenir une densité de 106 cellules/mL Différentes concentrations (0 à 150 μΜ) des composés selon l'invention ou de cyclosporine A inhibiteur de P-gp et BCRP (concentration finale 10 μΜ) ont été ajoutées à 1 ml de cellules et incubées pendant 15 minutes à 37°C, suivi de l'addition de la mitoxantrone (concentration finale 3 μΜ) ou de la daunorubicine (concentration finale 1 μΜ). Après 30 minutes d'incubation à 37°C, 4 ml de PBS glacé ont été ajoutés pour arrêter l'accumulation de drogue et la fluorescence a été mesurée par cytométrie de flux et analysée en utilisant le logiciel CELLQUEST PRO™ (Becton Dickinson Sciences). Tableau 4. Modulation des pompes à efflux P-gp et BCRP
Composé 1 3 7 9 réversion (μΜ)
P-gp 80 40 45 30
BCRP 20 40 10 10
Le seuil d'efficacité des différents composés selon l'invention a été testé par comparaison avec la cyclosporine A (10 μΜ). D'une manière générale, on peut considérer que si avec deux fois plus de médicament on arrive à obtenir le même effet qu'avec la cyclosporine, on a un bon composé d'intérêt qui ne présente pas d'effets indésirables. Aussi, seuls des essais in vivo permettraient de dire si on peut augmenter les doses sans risque d'effets indésirables. Ainsi, d'après les résultats obtenus dans ce tableau 4, dans les lignées cellulaires K562R et HCT1 16R, les composés selon l'invention restaurent l'accumulation intracellulaire de daunorubicine (substrat P-gp) et de mitoxantrone (substrat BCRP) avec une concentration de l'ordre du μΜ.
Plus particulièrement, les composés 1 , 7, 9 semblent les plus efficaces sur l'inhibition de la pompe BCRP avec une concentration équivalente ou seulement 2 fois supérieures à celle de la cyclosporine A inhibiteur de BCRP. Les composés 3 et 9 semblent avoir une efficacité sur l'inhibition de la pompe P-gp avec des risques
limités d'effets indésirables, risques qui sont susceptibles d'augmenter pour les composés 1 et 7.
Dans l'expérience ci-dessus, lorsque deux molécules (la mitoxantrone et un composé selon l'invention étudié) sont administrées ensemble, un mécanisme de compétition pour la liaison à P-gp ou BCRP peut apparaître. En présence d'une seule des deux molécules, la cinétique de liaison à P-gp ou BCRP est sensiblement différente. Ceci a été testé en traitant les cellules HCT116S et R, et K562S et R, avec 0, 1 μΜ ou 10 μΜ des composés selon l'invention (Tableau 5) pendant 24h, suivi par une analyse du cycle cellulaire.
Pour l'analyse du cycle cellulaire, les cellules HCT1 16S et R, K562S et R en croissance exponentielle ont été incubées pendant 24h dans du DMSO (véhicule/0,1 %) ou avec des composés selon l'invention à des concentrations de 0,1 μΜ et de 10 μΜ. Le contenu d'ADN cellulaire a été analysé en utilisant le kit de réaction CycleTest™ PLUS/DNA (BD Sciences, San José, CA). Les données ont été rassemblées et analysées sur un cytomètre de flux FACSCalibur (Becton Dickinson, La Jolla, CA) en utilisant le logiciel de CELLQUEST PRO™ (BD Sciences, Le Pont de Claix, France).
Tableau 5. Pourcentage de cellules bloquée en phase G2/M par les composés selon l'invention testés
Lignée cellulaire Cellules G2/M (%)
Contrôle 1 3 7 9
(μΜ) (μΜ) (μΜ) (μΜ)
0,1 10 0, 1 10 0, 1 10 0, 1 10
K562S 23 ± 2 36 43 38 40 40 47 35 43
±5 ±2 ±5 ±4 ±3 ±3 ±2 ±3
K562R 18 ± 2 24 40 26 42 46 42 35 39
±3 ±3 ±6 ±3 ±1 ±4 ±3 ±3
HCT1 16S 32 ± 3 44 48 46 56 44 60 44 50
±2 ±2 ±4 ±4 ±3 ±5 ±2 ±2
HCT1 16R 30 ± 4 33 49 39 47 27 50 33 43
±3 ±4 ±3 ±4 ±i ±6 ±3 ±4
On observe une augmentation du pourcentage de cellules bloquées en phase G2/M du cycle cellulaire après 24h d'incubation des lignées de cellules chimiosensitives ou chimiorésistantes avec des composés selon l'invention à 0, 1 μΜ, l'augmentation étant encore plus effective avec une concentration de 10 μΜ.
En effet, on retrouve toutefois quelques conditions à 0, 1 μΜ pour les composés 1 , 3, 7 et 9 pour lesquelles on n'a observé aucune différence significative entre le contrôle et les cellules traitées traduisant alors que le composé à 0,1 μΜ ne reste pas dans la cellule.
L'effet des composés selon l'invention sur la viabilité des cellules a également été évalué par le test MTT après 48h de traitement. Une comparaison de la GI50 (concentration inhibant la moitié de la prolifération cellulaire) des lignées de cellules parentales et résistantes a mis en évidence la capacité des composés selon l'invention de moduler la sensibilité des cellules en présence ou en absence de P-gp ou de BCRP (Tableau 6).
Pour les analyses de cytotoxicité, les cellules HCT1 16S et R, K562S et R ont été cultivées dans des plaques 96 puits pendant 48h. Le nombre de cellules viables a été déterminé en utilisant le test MTT (bromure de 3-(4,5-diméthylthiazol- 2-yl)-2,5-diphényltétrazolium), comme décrit par le fabricant (Sigma Aldrich, l'isle d'Abeau, France) et les valeurs de GI50 ont été déterminées graphiquement.
Tableau 6. Cytotoxicité des composés selon l'invention sur les lignées de cellules K562 et HCT1 16
Lignée cellulaire Gl50 (nM)
1 3 7 9
K562S 96±10 88±8 86±7 100±10
K562R 92±4 78±12 86±1 1 88±9
HCT116S 100±11 150±9 190±13 210±8
HCT1 16R 120±10 140±9 200±12 310±7
Une concentration en composé selon l'invention de l'ordre du nM inhibe la croissance cellulaire des cellules testées, indépendamment de leurs origines, après incubation dans un milieu de culture pendant 48h. Que les cellules soient résistantes ou sensibles aux pompes ABC, les écarts de GI50 enregistrés sont inférieurs de 5 à 10% : ainsi, les composés selon l'invention sont identifiés comme étant insensibles aux pompes ABC.
Exemple 10 : Réversion de l'action des pompes ABC (BCRP et P-gp) sur des cellules HCT116/S (sans pompes) et HCT116/R (pompes BCRP) et K562/S (sans pompes) et K562/R (pompes P-gp) taitées avec différentes concentrations de 6- méthoxy-4-(N-méthyl-indol-5-yl)coumarine (composé 14)
Les cellules HCT1 16/S (sans pompes) et HCT1 16/R (pompes BCRP) et
K562/S (sans pompes) et K562/R (pompes P-gp) ont été traitées avec différentes concentrations de 6-méthoxy-4-(N-méthyl-indol-5-yl)coumarine (composé 14) (0 à 0,5 DM) en présence de mitoxantrone et analysées par cytométrie en flux. Les contrôles sont représentés par les lignées résistantes avec la mitoxantrone seule et les lignées n'exprimant pas les pompes P-gp et BCRP avec la mitoxantrone seule.
Les deux lignées résistantes en présence de mithoxantrone servent à évaluer l'efficacité des pompes P-gp et BCRP. On obtient des intensités de fluorescence basses : (non représentées)
HCT1 16/R + mitoxanthrone = 65 +/-5,
K562/R + mitoxanthrone = 50 +/-6.
Les formes sensibles (sans pompes) ont des valeurs élevées de fluorescence : (non représentées)
HCT1 16/S + mitoxanthrone = 288 +/- 20,
K562/S + mitoxanthrone = 255 +/- 15.
Tel qu'illustré par la figure 5, on peut donc considérer que la 6-méthoxy-4-
(N-méthyl-indol-5-yl)coumarine (composé 14) à 200 nm permet une incorporation de 80% de mitoxantrone donc une réversion de 80% de l'effet des pompes. Ceci s'accroit légèrement en augmentant les concentrations du composé de l'invention pour obtenir une réversion de 90% à 400 nm.
Exemple 1 1 : Effets de la 6-méthoxy-4-(N-méthyl-indol-5-yl)coumarine (composé 14) sur des cellules tumorales rénales
Les cellules tumorales rénales (ACHN, 786-0, Caki-1 , RCC4+ et RCC4-) ont été cultivées en présence de RPMI et de 10% de sérum de veau fœtal avec la 6- méthoxy-4-(N-méthyl-indol-5-yl)coumarine (Cmp: composé 14) (150 nM) ou sans (contrôler) pendant 24h et 48h. Les cellules ont été rincées 2 fois, puis utilisées
pour déterminer (Tableau 7) le pourcentage de cellules en phase G2/M et en phase sousG0/G1 (apoptose) après coloration avec le kit de réaction CycleTest™ PLUS/DNA et analyse avec le cytomètre de flux. L'index mitotique (Ml) a également été déterminé avec une coloration Papanicolaou de l'échantillon.
Tableau 7
786-0 ACHN CAKI-1 RCC4+ RCC4-
C Cmp C Cmp C Cmp C Cmp C Cmp
G2/M 19± 34±3 10 20±3 12± 26±4 20 35±5 9± 22±4
2 ±5 3 ±2 2
M.l. 3±1 9±3 2± 12±3 3±2 9±2 2± 15±2 5± 16±4
2 2 2
Sous- 6±2 30±3 7± 10±3 7±3 24±4 8± 20±5 9± 25±4 G0 5 2 2
L'index mitotique (M.l.) correspond au pourcentage de cellules cancéreuses en train de se diviser, en phase de mitose et permet d'évaluer la vitesse de prolifération tumorale en général corrélée à l'agressivité du cancer. D'après les valeurs obtenues, il apparaît que l'index mitotique, augmente d'un facteur d'au moins 3 en présence du composé selon l'invention, traduisant un blocage des cellules lors de la mitose. On note également une augmentation notable (en majorité un facteur 2) du nombre de cellules en phase G2/M et sous GO. Ainsi, le composé 6-méthoxy-4-(N-méthyl-indol-5-yl)coumarine (150 nM) selon l'invention est identifié comme agent antimitotique et inducteur d'apoptose pour l'ensemble des lignées de cellules tumorales rénales testées.
Exemple 12 : Effets de la 6-méthoxy-4-(N-méthyl-indol-5-yl)coumarine (composé 14) sur les lignées de cellules K562 et HCT 6.
Les cellules K562 et HCT1 16 ont été cultivées en RPMI additionné de 10% de sérum de veau foetal avec la 6-méthoxy-4-(N-méthyl-indol-5-yl)coumarine (Cmp: composé 14) (100 nM) ou sans (contrôler) pendant 24h et 48h. Les cellules ont été rincées 2 fois et utilisées comme dans l'exemple 1 1 . Tableau 8:
K562/S K562/R HCT116/S HCT116/R
C Cmp C Cmp C Cmp C Cmp G2/M 25±2 52±3 31 ±5 50±8 25±5 38±4 22±6 36+2
M.l. 5±2 32±3 7±3 36±4 3±1 12±2 4±2 16±3
Sous- 5±2 40±6 7±3 50±7 9±2 31 ±3 8±2 32±5 G0
De même, d'après les valeurs obtenues, il apparaît que l'index mitotique augmente d'un facteur d'au moins 4. Or, les résultats obtenus montrent que la 6- méthoxy-4-(N-méthyl-indol-5-yl)coumarine (composé 14) (100 nM) induit l'apoptose pour ces lignées de cellules tumorales rénales qu'elles surexpriment ou non P-gp ou BCRP. En effet, on note une augmentation notable (un facteur d'au moins 1 ,5) du nombre de cellules en phase G2/M et sous GO.
Exemple 13: Inhibition de la croissance tumorale in vivo.
Pour cette expérience, les souris ont reçu une xénogreffe sous-cutanée de
5*106 cellules 786-0 de cancer de rein humain. Le taux de survie a été analysé pendant 4 semaines en commençant 48h après que la tumeur ait atteinte un diamètre de 1 mm pour des souris ayant reçues deux traitements différents (5 souris par groupe de traitement).
Le premier traitement correspond au contrôle. Les souris ont reçu un véhicule contrôle d'injection en absence de composé selon l'invention composé de : 10% DMSO ; 10% PEG-400 ; 30% (EtOH/Cremophor (1/2)); et 50% eau stérile.
Le second traitement correspond à l'administration d'un composé selon l'invention, à savoir la 6-méthoxy-4-(/V-méthyl-indol-5-yl)coumarine (composé 14) à un dosage de 30mg/kg.
Les résultats sont illustrés dans la figure 6. Ainsi, il apparaît que la 6- méthoxy-4-(/V-méthyl-indol-5-yl)coumarine (composé 14) augmente le taux de survie en réduisant la croissance de la tumeur sur un modèle de xénogreffe d'une tumeur rénale agressive (60% de survie contre 0% dans les contrôles).
Exemple 14: Inhibition de la prolifération cellulaire in vitro de différentes lignées de cellules tumorales avec la 4-(3-Hvdroxy-4-méthoxyphényl)-6-aminocoumarine (composé 6) et son sel de chlorhydrate hvdrosoluble
L'effet de la 4-(3-Hydroxy-4-méthoxyphényl)-6-aminocoumarine (composé 6) selon l'invention et de son sel de chlorhydrate sur la prolifération cellulaire a ainsi été testé suivant le protocole décrit dans l'exemple 1 sur ces différentes cellules : cellules SKBR3 (sein), T47D (sein), CAPAN (pancréas), HCT1 16 (colon), U937 (lymphome), HL60 (leucémie aiguë promyélocytaire), SKMI (leucémie myélodysplasique), KASUMI (leucémie aiguë myéloïde).
Les différentes GI50 caractérisant les activités cytostatiques et cytotoxiques obtenues pour chacun des composés selon l'invention testés sont récapitulées dans le tableau 9 ci-dessous : Tableau 9: Cvtotoxicité du composé 6 selon l'invention et de son sel de chlorhydrate sur différentes lignées cellulaires
En conclusion, la 4-(3-Hydroxy-4-méthoxyphényl)-6-aminocoumarine et son sel de chlorhydrate ont un effet cytostatique comparable dans une plage nanomolaire sur l'ensemble des cellules tumorales étudiées.
Un autre objet de l'invention concerne un produit contenant un composé de formule générale :
dans laquelle :
- X est choisi parmi un atome d'oxygène ou d'azote ;
- Y est un atome d'oxygène lorsque X est un atome d'oxygène, et Y est un atome d'hydrogène lorsque X est un atome d'azote ;
- R1 est choisi parmi un atome d'hydrogène ou un radical alkoxy linéaire ou ramifié de 1 à 4 atomes de carbone ;
- R2 est choisi parmi un atome d'hydrogène, un radical alkoxy linéaire ou ramifié de 1 à 4 atomes de carbone ou -CF3 ;
- R3 est choisi parmi un atome d'hydrogène, un hydroxy, un radical alkoxy linéaire ou ramifié de 1 à 4 atomes de carbone, -CF3, -N02 ou -NH2 ;
- R4 est choisi parmi un atome d'hydrogène, un radical alkoxy linéaire ou ramifié de 1 à 4 atomes de carbone ou -CF3 ;
- R10, R1 1 , R12, R13 pris indépendamment sont choisis parmi un atome d'hydrogène, un radical alkyle linéaire ou ramifié de 1 à 6 atomes de carbone, un hydroxy ou un radical alkoxy linéaire ou ramifié de 1 à 4 atomes de carbone ;
- Z est choisi parmi un radical alkoxy de 1 à 4 atomes de carbone ou un radical mono ou dialkylamino de 1 à 4 atomes de carbone, ou pris ensemble avec R12 forme un groupement pyrrole éventuellement monosubstitué par un radical alkyle linéaire ou ramifié de 1 à 3 atomes de carbone ;
choisis parmi :
- 4-(3-Hydroxy-4-méthoxyphényl)coumarine ;
- 4-(3-Hydroxy-4-méthoxyphényl)-7-méthoxycoumarine ;
- 4-(3-Hydroxy-4-méthoxyphényl)-6-méthoxycoumarine ;
- 4-(3-Hydroxy-4-méthoxyphényl)-6-hydroxycoumarine ;
- 4-(3-Hydroxy-4-méthoxyphényl)-6-nitrocoumarine ;
- 4-(3-Hydroxy-4-méthoxyphényl)-6-aminocoumarine ;
- 4-(3-Hydroxy-4-méthoxyphényl)-5-méthoxycoumarine ;
- 4-(3-Hydroxy-4-méthoxyphényl)-6,7-diméthoxycoumarine ;
- 4-(3-Hydroxy-4-méthoxyphényl)-5,6-diméthoxycoumarine ;
- 4-(A/-méthyl-indol-5-yl)coumarine ;
- 7-méthoxy-4-(A/-méthyl-indol-5-yl)coumarine ;
- 6-méthoxy-4-(A/-méthyl-indol-5-yl)coumarine ;
- 6-hydroxy-4-(A/-méthyl-indol-5-yl)coumarine ;
- 5-méthoxy-4-(W-méthyl-indol-5-yl)coumarine ;
- 6,7-diméthoxy-4-(A/-méthyl-indol-5-yl)coumarine ;
- 5,7-diméthoxy-4-(A/-méthyl-indol-5-yl)coumarine ;
- 5,6-diméthoxy-4-(A/-méthyl-indol-5-yl)coumarine ;
- 5,6,7-triméthoxy-4-(/\/-méthyl-indol-5-yl)coumarine ;
- 4-(4-N,N-diméthylaminophényl)-6-nitrocoumarine ;
- 6-amino-4-(4-N,N-diméthylaminophényl)coumarine ;
- 4-(4-N,N-diméthylaminophényl)-6-méthoxycoumarine ;
- 4-(3-hydroxy-4-méthoxyphényl)quinoléine ;
- 4-(3-hydroxy-4-méthoxyphényl)-7-méthoxyquinoléine ;
- 4-(3-hydroxy-4-méthoxyphényl)-6-méthoxyquinoléine ;
- 4-(3-hydroxy-4-méthoxyphényl)-6,7-diméthoxyquinoléine ;
- 4-(3-hydroxy-4-méthoxyphényl)-5,7-diméthoxyquinoléine ;
- 4-(3-hydroxy-4-méthoxyphényl)-5,6,7-triméthoxyquinoléine;
- 4-(3-hydroxy-4-méthoxyphényl)-7-trifluorométhylquinoléine;
- 4-(3-hydroxy-4-méthoxyphényl)-6-trifluorométhylquinoléine;
- 4-(3-hydroxy-4-méthoxyphényl)-6-méthoxy-7-trifluorométhylquinoléine ;
- 4-(3-hydroxy-4-méthoxyphényl)-5-trifluorométhyl-7-méthoxyquinoléine ;
- 4-(3-hydroxy-4-méthoxyphényl)-5-méthoxy-7-trifluorométhylquinoléine ;
- 4-(3-hydroxy-4-méthoxyphényl)-5,7-bis(trifluorométhyl)quinoléine ;
leurs analogues et leurs sels pharmaceutiquement acceptables,
et au moins un autre ingrédient actif comme produit de combinaison pour une administration simultanée, séparée ou étalée dans le temps, pour le traitement du cancer, préférentiellement pour le traitement du cancer du sein, des glandes surrénales, de l'ovaire, des neuroblastomes, des tumeurs anaplasiques de la thyroïde, des cellules tumorales surexprimant les pompes P-gp et/ou BCRP encore plus préférentiellement choisies parmi le cancer du rein, du colon, du poumon, du foie et du pancréas, et des cellules tumorales irriguées par des vaisseaux tapissés de cellules endothéliales de la barrière hémato-encéphalique et hémato-testiculaire surexprimant les pompes P-gp et/ou BCRP encore plus préférentiellement choisies parmi le cancer du testicule et du cerveau.
En outre, un autre objet de l'invention concerne un produit contenant un composé selon l'invention de formule générale :
dans laquelle :
- X est choisi parmi un atome d'oxygène ou d'azote ;
- Y est un atome d'oxygène lorsque X est un atome d'oxygène, et Y est un atome d'hydrogène lorsque X est un atome d'azote ;
- R1 est choisi parmi un atome d'hydrogène ou un radical alkoxy linéaire ou ramifié de 1 à 4 atomes de carbone ;
- R2 est choisi parmi un atome d'hydrogène, un radical alkoxy linéaire ou ramifié de 1 à 4 atomes de carbone ou -CF3 ;
- R3 est choisi parmi un atome d'hydrogène, un hydroxy, un radical alkoxy linéaire ou ramifié de 1 à 4 atomes de carbone, -CF3, -N02 ou -NH2 ;
- R4 est choisi parmi un atome d'hydrogène, un radical alkoxy linéaire ou ramifié de 1 à 4 atomes de carbone ou -CF3 ;
- R10, R1 1 , R12, R13 pris indépendamment sont choisis parmi un atome d'hydrogène, un radical alkyle linéaire ou ramifié de 1 à 6 atomes de carbone, un hydroxy ou un radical alkoxy linéaire ou ramifié de 1 à 4 atomes de carbone ;
- Z est choisi parmi un radical alkoxy de 1 à 4 atomes de carbone ou un radical mono ou dialkylamino de 1 à 4 atomes de carbone, ou pris ensemble avec R12 forme un groupement pyrrole éventuellement monosubstitué par un radical alkyle linéaire ou ramifié de 1 à 3 atomes de carbone ;
leurs analogues et leurs sels pharmaceutiquement acceptables,
et au moins un autre ingrédient actif comme produit de combinaison pour une administration simultanée, séparée ou étalée dans le temps, pour le traitement des cellules tumorales surexprimant les pompes P-gp et/ou BGRP préférentiellement choisies parmi le cancer du rein, du colon, du poumon, du foie et du pancréas, et des cellules tumorales irriguées par des vaisseaux tapissés de cellules endothéliales de la barrière hémato-encéphalique et hémato-testiculaire surexprimant les pompes P-gp et/ou BCRP encore plus préférentiellement choisies parmi le cancer du testicule et du cerveau.
Avantageusement, le deuxième principe actif est un agent anti- inflammatoire, ou un agent diminuant les effets secondaires liés aux composés selon l'invention.
Par utilisation thérapeutique simultanée, au sens de la présente invention, on entend une administration d'au moins deux principes actifs par la même voie et au même moment ou sensiblement au même moment.
Par utilisation thérapeutique séparée, au sens de la présente invention, on entend notamment une administration d'au moins deux principes actifs au même moment ou sensiblement au même moment par des voies différentes.
Par utilisation thérapeutique étalée dans le temps, on entend une administration d'au moins deux principes actifs à des moments différents, la voie d'administration étant identique ou différente.
Plus particulièrement, on entend un mode d'administration selon lequel l'ensemble de l'administration de l'un des principes actifs est effectué avant que l'administration de l'autre ou des autres ne commence.
On peut ainsi administrer l'un des principes actifs pendant plusieurs mois avant d'administrer l'autre ou les autres principes actifs. Il n'y a pas de traitement simultané dans ce cas. On peut aussi envisager une administration alternée de chaque principe actif pendant plusieurs semaines.
Un autre objet de l'invention concerne une composition pharmaceutique comprenant un composé selon l'invention et un support pharmaceutiquement acceptable.
De préférence, la biodisponibilité du composé selon l'invention est d'au moins 80%, 90% ou 95%.
La voie d'administration de la composition selon l'invention peut être par voie orale, parentérale.
De préférence, la composition pharmaceutique est conditionnée sous une forme convenant à une application par voie orale.
Ainsi, par voie orale, la composition, peut se présenter sous forme de comprimés, de gélules, de dragées, de sirops, de suspensions, de solutions, de poudres, de granulés, d'émulsions, de suspensions de microsphères ou nanosphères ou de vésicules lipidiques ou polymériques permettant une libération contrôlée.
De façon alternative, lorsque la composition selon l'invention est administrée par voie parentérale, elle peut se présenter sous forme de solutions ou suspensions pour perfusion ou pour injection intramusculaire, intraveineuse ou sous-cutanée ou encore pulmonaire par inhalation.
Selon l'invention, le sujet à traiter est préférentiellement un mammifère. Préférentiellement encore, il s'agit d'un humain, d'un cheval, d'un chien ou d'un chat. Plus préférentiellement encore, le patient à traiter est un humain.
Un autre objet de l'invention est un procédé de synthèse des composés selon l'invention comprenant une étape de couplage de ligands en catalyse au palladium entre deux unités aromatiques, le cycle coumarique ou quinoléique préformé, convenablement activé et un dérivé arylboronique respectivement de formules
- Y est un atome d'oxygène lorsque X est un atome d'oxygène, et Y est un atome d'hydrogène lorsque X est un atome d'azote ;
- Q est choisi parmi un atome d'halogène ou un groupement triflate ou tosylate ou tout autre groupement libérable ;
- R1 est choisi parmi un atome d'hydrogène ou un radical alkoxy linéaire ou ramifié de 1 à 4 atomes de carbone ;
- R2 est choisi parmi un atome d'hydrogène, un radical alkoxy linéaire ou ramifié de 1 à 4 atomes de carbone ou -CF3 ;
- R3 est choisi parmi un atome d'hydrogène, un hydroxy, un radical alkoxy linéaire ou ramifié de 1 à 4 atomes de carbone, -CF3, -N02 ou -NH2 ;
- R4 est choisi parmi un atome d'hydrogène, un radical alkoxy linéaire ou ramifié de 1 à 4 atomes de carbone ou -CF3 ;
- R10, R1 1 , R12, R13 pris indépendamment sont choisis parmi un atome d'hydrogène, un radical alkyle linéaire ou ramifié de 1 à 6 atomes de carbone, un hydroxy ou un radical alkoxy linéaire ou ramifié de 1 à 4 atomes de carbone ;
- R est choisi parmi un atome d'hydrogène ou un radical alkyle linéaire ou ramifié de 1 à 6 atomes de carbone ;
- Z est choisi parmi un radical alkoxy de 1 à 4 atomes de carbone ou un radical mono ou dialkylamino de 1 à 4 atomes de carbone, ou pris ensemble avec
R12 forme un groupement pyrrole éventuellement monosubstitué par un radical alkyle linéaire ou ramifié de 1 à 3 atomes de carbone ;
leurs analogues et leurs sels pharmaceutiquement acceptables.
Un tel schéma général de réaction de préparation de dérivés de 4- arylcoumarine et 4-arylquinoléine selon l'invention est illustré par la figure 7. La réaction de couplage entre les deux unités aromatiques peut être idéalement réalisée dans un mélange toluène-éthanol à reflux, en présence de carbonate de sodium, de tétrakistriphénylphosphine-palladium comme catalyseur et d'iodure de cuivre comme co-catalyseur. Ce procédé n'est pas limitatif et d'autres catalyseurs (Pd(dppf)CI2, Pd(OAc)2...) peuvent-être employés ainsi que d'autres co- catalyseurs (Bu4NBr), bases (K3P04...) et solvants (C6H6, MeCN, ...)■
A titre d'exemple non limitatif, sous argon, un mélange de substrat coumarique ou quinoléique activé (1 ,5 mmol), de tétrakis(triphénylphosphine)palladium (70 mg, 4% mol), d'iodure de cuivre (I) (317 mg, 1 ,65 mmol), de carbonate de sodium (1 , 1 g, 10,5 mmol) et de dérivé d'acide arylboronique (1 ,97 mmol) en suspension dans un mélange toluène-éthanol absolu (5: 1) (12 mL) est chauffé à reflux pendant 12h. Le mélange réactionnel est refroidi à température ambiante, dilué avec du chloroforme (50 mL) et filtré sur célite. Le
filtrat est lavé avec une solution aqueuse saturée en Na2C03 (3*25 mL) et les phases aqueuses combinées sont extraites au chloroforme (3*25 mL). Les phases organiques combinées sont lavées avec une solution aqueuse saturée en NaCI et séchées sur Na2S04. Le solvant est distillé sous pression réduite et le résidu est purifié par chromatographie sur colonne de silice pour conduire au produit 4-arylé attendu.
De plus, à titre d'exemple non limitatif, la figure 8 illustre un schéma de synthèse des intermédiaires de couplage de type coumarique de formule :
formule dans laquelle, par exemple, Q est plus particulièrement un groupement triflate, préparée selon la procédure détaillée suivante :
Etape a' : préparation des 2-hydroxyacétophénones
Sous argon, à un mélange de dérivé méthoxybenzène (30 mmol) et de chlorure d'acétyle (2,34 mL, 33 mmol) en solution dans de l'éther sec (50 mL) est additionné au goutte à goutte sur une période d'une heure, une solution de chlorure d'aluminium (10,08 g, 75 mmol) dans de l'éther sec (50 mL). Après la fin de l'addition, le mélange réactionnel est successivement porté à reflux pendant 2h, laissé revenir à température ambiante, et agité à cette température pendant 12h. Le mélange réactionnel est extrait avec une solution aqueuse de NaOH à 10% (3*50 mL). Les phases aqueuses combinées sont lavées à l'éther, acidifiées avec une solution aqueuse d'HCI concentré jusqu'à pH=1 et extraites à l'éther (3*30 mL). Les phases organiques combinées sont lavées avec une solution aqueuse saturée en NaCI, séchées sur Na2S04 et le solvant est distillé sous pression réduite. Le résidu est purifié sur colonne chromatographique ou directement par recristallisation pour conduire à la 2-hydroxyacétophénone attendue.
De façon alternative, étape a" : préparation des 2-hydroxyacétophénones Une solution de dérivé phénolique (27 mmol) et d'acétate de sodium (5 g, 61 mmol) dans de l'anhydride acétique (25 mL, 0,265 mol) est chauffée à 1 10°C pendant 2h. Le mélange réactionnel est concentré sous vide, étendu à l'eau (100 mL) et extrait au dichlorométhane (3*30mL). Les phases organiques combinées sont lavées successivement avec une solution aqueuse saturée en Na2C03, à l'eau et séchées sur Na2S04. Le solvant est distillé sous pression réduite et le résidu tiré sous vide à la pompe à huile. Le solide obtenu est recristallisé dans de l'éthanol pour conduire à l'acétate d'aryle attendu. Sous argon, à une suspension
d'acétate d'aryle (24 mmol) dans du dichlorométhane sec (4 mL) est injecté du trifluorure de bore éthérate (20 mL). Le mélange réactionnel est porté à reflux durant 2h, refroidi à température ambiante et prudemment versé sur une solution aqueuse de NaOH à 10% (150 mL). La phase aqueuse est successivement lavée à l'éther (2*30 mL), acidifiée avec une solution aqueuse d'HCI concentré jusqu'à pH=1 et extraite au dichlorométhane (4*30 mL). Les phases organiques combinées sont lavées avec une solution aqueuse saturée en NaCI, séchées sur Na2S04 et le solvant est distillé sous pression réduite. Le résidu huileux cristallise à l'air pour conduire à la 2-hydroxyacétophénone attendue.
Etape b: préparation des 4-hydroxycoumarines
Sous argon, à une solution de dérivé 2-hydroxyacétophénone (17 mmol) (préparée selon les étapes a' ou a") dans du diéthylcarbonate (50 mL) est additionné par fraction solide de l'hydrure de sodium à 60% dans l'huile (7,08 g, 0,17 mol). Après la fin de l'addition, le mélange réactionnel est chauffé à reflux pendant 5h, puis l'agitation est poursuivie à température ambiante durant 12h. De l'éthanol (10 mL) est additionné précautionneusement au milieu réactionnel. La solution résultante est versée sur de l'éther (200 mL) et extraite à l'eau (5*50 mL). Les phases aqueuses combinées sont successivement lavées à l'éther (1*30 mL), acidifiées avec une solution aqueuse d'HCI à 10% jusqu'à pH=1 et extraites au dichlorométhane (3*30 mL). Les phases organiques combinées sont séchées sur Na2S04 et le solvant est distillé sous pression réduite. Le résidu est cristallisé dans l'éther pour conduire à la 4-hydroxycoumarine attendue.
Etape c: préparation des 4-trifluorométhylsulfonyloxycoumarines
Sous argon, à 0°C, à une suspension de dérivé 4-hydroxycoumarine (3 mmol) (préparée selon l'étape b) et de triéthylamine (0,55 mL, 3,9 mmol) dans du dichlorométhane sec (20 mL) est additionné au goutte à goutte de l'anhydride trifluorométhanesulfonique (0,66 mL, 3,9 mmol) pendant une période de 10 minutes. Le milieu réactionnel est agité pendant 1 heure à 0°C, dilué avec un mélange éther-éther de pétrole (1 :1 , 50 mL) et filtré à travers une courte colonne de silice. Le solvant est distillé sous pression réduite jusqu'à faible volume (10 mL) et le résidu est placé à -15 °C pendant 12h. Le précipité est collecté par filtration et lavé à l'éther de pétrole pour conduire à la 4-trifluorométhylsulfonyloxycoumarine attendue.
Aussi, à titre d'exemple non limitatif, la figure 9 illustre un schéma de synthèse des intermédiaires de couplage de type quinoléique de formule :
formule dans laquelle, par exemple, Q est plus particulièrement un groupement triflate, préparée selon la procédure détaillée suivante :.
Etape a: préparation des 5-anilinométhylène-2,2-diméthyl-1 ,3-dioxane-4,6- diones
Une solution de dérivé aniline (6 mmol) et de 5-(méthoxyméthylène)-2,2- diméthyl-1 ,3-dioxane-4,6-dione (1 ,1 g, 6 mmol) dans le dichlorométhane (30 ml_) est chauffée à reflux pendant 30 minutes. Le solvant est distillé sous vide puis le solide obtenu est recristallisé dans du méthanol pour conduire à la 5- (anilinométhylène)-2,2-diméthyl-1 ,3-dioxane-4,6-dione attendue.
Etape b : préparation des 1 H-quinolin-4-ones
Une solution de dérivé 5-(anilinométhylène)-2,2-diméthyl-1 ,3-dioxane-4,6- dione (5,5 mmol) (préparée selon l'étape a) dans du diphényléther est chauffée à 280°C pendant 3 minutes puis refroidie dans un bain de glace. Le milieu réactionnel est purifié par chromatographie sur colonne, éluant dichlorométhane-éthanol (9:1) pour conduire à la 1 H-quinolin-4-one attendue qui est recristallisée dans l'éthanol.
Etape c : préparation des dérivés 4-trifluorométhylsulfonyloxyquinoléines
Sous argon, à une suspension de dérivé 1 H-quinolin-4-one (1 ,5 mmol) (préparée selon l'étape b) et de triéthylamine (0,27 mL, 1 ,95 mmol) à 0°C dans du dichlorométhane sec (10 mL) est additionné au goutte à goutte pendant 10 minutes de l'anhydride trifluorométhanesulfonique (0,33 mL, 1 ,95 mmol). Le milieu réactionnel est ramené à température ambiante, agité pendant 12h à cette température, dilué avec de l'éther de pétrole (45 mL) et filtré à travers une courte colonne de silice, éluant dichlorométhane. Le solvant est distillé sous pression réduite pour conduire à la 4-trifluorométhylsulfonyloxyquinoléine attendue.
Enfin, à titre d'exemple non limitatif, la figure 10 illustre un schéma de synthèse d'un exemple de dérivé arylboronique de formule :
Un mélange en suspension de 2-méthoxyphénol (0,16 mol) et d'acétate de sodium (0,24 mol) dans de l'anhydride acétique (30 mL) est chauffée à 45°C pendant 12h. Le mélange réactionnel est versé sur de l'eau glacée (100 mL) et extrait au chloroforme (3*20 mL). Les phases organiques combinées sont successivement lavées avec une solution aqueuse saturée en carbonate de sodium (4*20 mL), à l'eau, et séchées sur Na2S04. Le solvant est distillé sous pression réduite pour conduire à l'acétate de 2-méthoxyphényle sous forme d'une huile incolore(26 g, 97%).
Etape b : préparation de de l'acétate de 5-bromo-2-méthoxyphényle
Sous argon, à 0°C, à une solution d'acétate de 2-méthoxyphényle (0, 12 mol) (préparée selon l'étape a) dans du chloroforme sec (80 mL) est additionné au goutte à goutte une solution de dibrome (0, 12 mol) dans du chloroforme sec (10 mL), pendant 50 minutes. Après la fin de l'addition, l'agitation est poursuivie à 0°C pendant 30 minutes, puis le mélange réactionnel est laissé revenir à température ambiante avant d'être versé sur de l'eau (200 mL). La phase aqueuse est extraite au chloroforme (2*30 mL) et les phases organiques combinées sont lavées avec une solution aqueuse saturée en NaCI (2*30 mL) et séchées sur Na2S0 . Le solvant est distillé sous pression réduite pour conduire à l'acétate de 5-bromo-2- méthoxyphényle, isolé sous forme de cristaux orange (28,7 g, 98 %), pf 65°C.
Etape c : préparation du 5-bromo-2-méthoxyphénol
A une solution d'acétate de 5-bromo-2-méthoxyphényle (0,207 mol) (préparée selon l'étape b) dans de l'éthanol (150 mL) est additionné, en une seule fois, une solution aqueuse de NaOH 14M (150 mL, 2,07 mol). Le mélange réactionnel est chauffé à reflux durant 30 minutes, puis laissé revenir à température ambiante. L'éthanol est distillé sous pression réduite. Le résidu est acidifié par une solution aqueuse de HCI concentré jusqu'à pH=1 et extrait à l'éther (3*30 mL). Les phases organiques combinées sont lavées avec une solution aqueuse saturée en NaCI (2*20 mL), séchées sur Na2S04 et le solvant est distillé sous pression réduite pour conduire au 5-bromo-2-méthoxyphénol sous forme d'une huile marron qui cristallise à l'air (41 g, 98%), pf 64-65°C.
Etape d : préparation du 3-benzyloxy-4-méthoxybromobenzène
Sous argon, à un mélange de 5-bromo-2-méthoxyphénol (50 mmol) (préparée selon l'étape c) et de bromure de benzyle (50 mmol) en solution dans du tétrahydrofurane sec (100 mL) est additionné en solide, par petites portions, NaH à 80% dans l'huile (55 mmol). Après la fin de l'addition le mélange réactionnel est successivement porté à reflux pendant 12h, refroidi à température ambiante, versé prudemment sur de l'eau (100 mL) et extrait à l'éther (3*50 mL). Les phases
organiques combinées sont lavées avec une solution aqueuse de NaOH à 10% (3*50 mL), séchées sur Na2S04 et le solvant est distillé sous pression réduite pour conduire au 3-benzyloxy-4-méthoxybromobenzène, isolé sous forme de cristaux blancs en aiguilles (1 1 ,4g, 78%), pf 105°C.
Etape e : préparation de l'acide 3-benzyloxy-4-méthoxyphénylboronique
Sous argon, à -78°C, à une solution de 3-benzyloxy-4- méthoxybromobenzène (15 mmol) (préparée selon l'étape d) dans du tétrahydrofurane (150 mL) fraîchement distillé est additionnée une solution de n- Buthyl lithium 2,5 M dans l'hexane (18 mmol), au goutte à goutte rapide, sous une période de 15 minutes. Après la fin de l'addition, le mélange réactionnel est laissé sous agitation 10 minutes supplémentaires à -78°C et du triisopropylborate (18 mmol) est additionné au goutte à goutte sous une période de 10 minutes. Le mélange réactionnel est agité à -78°C durant 2h puis laissé revenir à température ambiante. L'agitation est poursuivie à cette température pendant 12h. Le milieu réactionnel est versé sur de l'éther (100 mL), lavé avec une solution aqueuse d'HCI à 10% (4*50 mL) et les phases aqueuses combinées sont extraites à l'éther (3*30 mL). Les phases organiques combinées sont lavées avec une solution aqueuse saturée en NaCI (2*30 mL) et séchées sur Na2S04. Le solvant est concentré sous pression réduite jusqu'à un faible volume (5 mL) et de l'éther de pétrole (environ 50 mL) est additionné au résidu pour entraîner la cristallisation de l'acide 3-benzyloxy- 4-méthoxyphénylboronique qui, après filtration, est isolé sous forme de cristaux blancs en fines aiguilles (2,52 g, 65%), pf 138°C.
Etape f : préparation de l'acide 3-hydroxy-4-méthoxyphénylboronique
Un mélange d'acide 3-benzyloxy-4-méthoxyphénylboronique (5, 16, 20 mmol) (préparé selon l'étape e) et de palladium sur du graphite à 10% (2% en masse) en suspension dans du tétrahydrofurane sec (40 mL) est agité sous atmosphère d'hydrogène pendant 24h. Le mélange réactionnel est dilué avec de l'acétone, puis filtré sur célite. Le filtrat est concentré sous pression réduite et le résidu solide lavé avec un mélange un pour un éther-pentane pour conduire à l'acide 3-hydroxy-4-méthoxyphénylboronique sous forme d'une poudre blanche (2,86 g, 85%), pf 221 °C.
Bien entendu, l'invention ne se limite pas aux modes de réalisation et aux exemples présentés ci-dessus et l'homme du métier, grâce à des opérations de routine, pourra être amené à réaliser d'autres modes de réalisation non décrits explicitement, qui entrent dans le cadre large de l'invention.
Claims
1. Composés de formule générale
dans laquelle :
- X est choisi parmi un atome d'oxygène ou d'azote ;
- Y est un atome d'oxygène lorsque X est un atome d'oxygène, et Y est un atome d'hydrogène lorsque X est un atome d'azote ;
- R1 est choisi parmi un atome d'hydrogène ou un radical alkoxy linéaire ou ramifié de 1 à 4 atomes de carbone ;
- R2 est choisi parmi un atome d'hydrogène, un radical alkoxy linéaire ou ramifié de 1 à 4 atomes de carbone ou -CF3 ;
- R3 est choisi parmi un atome d'hydrogène, un hydroxy, un radical alkoxy linéaire ou ramifié de 1 à 4 atomes de carbone, -CF3, -N02 ou -NH2 ;
- R4 est choisi parmi un atome d'hydrogène, un radical alkoxy linéaire ou ramifié de 1 à 4 atomes de carbone ou -CF3 ;
- R10, R1 1 , R12, R13 pris indépendamment sont choisis parmi un atome d'hydrogène, un radical alkyle linéaire ou ramifié de 1 à 6 atomes de carbone, un hydroxy ou un radical alkoxy linéaire ou ramifié de 1 à 4 atomes de carbone ;
- Z est choisi parmi un radical alkoxy de 1 à 4 atomes de carbone ou un radical mono ou dialkylamino de 1 à 4 atomes de carbone, ou pris ensemble avec R12 forme un groupement pyrrole éventuellement monosubstitué par un radical alkyle linéaire ou ramifié de 1 à 3 atomes de carbone ;
choisis parmi :
- 4-(3-Hydroxy-4-méthoxyphényl)coumarine ;
- 4-(3-Hydroxy-4-méthoxyphényl)-7-méthoxycoumarine ;
- 4-(3-Hydroxy-4-méthoxyphényl)-6-méthoxycoumarine ;
- 4-(3-Hydroxy-4-méthoxyphényl)-6-hydroxycoumarine ;
- 4-(3-Hydroxy-4-méthoxyphényl)-6-nitrocoumarine ;
- 4-(3-Hydroxy-4-méthoxyphényl)-6-aminocoumarine ;
- 4-(3-Hydroxy-4-méthoxyphényl)-5-méthoxycoumarine ; - 4-(3-Hydroxy-4-méthoxyphényl)-6,7-diméthoxycoumarine ;
- 4-(3-Hydroxy-4-méthoxyphényl)-5,6-diméthoxycoumarine ;
- 4-(/V-méthyl-indol-5-yl)coumarine ;
- 7-méthoxy-4-(/V-méthyl-indol-5-yl)coumarine ;
- 6-méthoxy-4-(A/-méthyl-indol-5-yl)coumarine ;
- 6-hydroxy-4-(/V-méthyl-indol-5-yl)coumarine ;
- 5-méthoxy-4-(/V-méthyl-indol-5-yl)coumarine ;
- 6,7-diméthoxy-4-(A/-méthyl-indol-5-yl)coumarine ;
- 5 ,7-diméthoxy-4-(/V-méthyl-indol-5-yl)coumarine ;
- 5,6-diméthoxy-4-(A/-méthyl-indol-5-yl)coumarine ;
- 5,6,7-triméthoxy-4-(A/-méthyl-indol-5-yl)coumarine ;
- 4-(4-N,N-diméthylaminophényl)-6-nitrocoumarine ;
- 6-amino-4-(4-N,N-diméthylaminophényl)coumarine ;
- 4-(4-N,N-diméthylaminophényl)-6-méthoxycoumarine ;
- 4-(3-hydroxy-4-méthoxyphényl)quinoléine ;
- 4-(3-hydroxy-4-méthoxyphényl)-7-méthoxyquinoléine ;
- 4-(3-hydroxy-4-méthoxyphényl)-6-méthoxyquinoléine ;
- 4-(3-hydroxy-4-méthoxyphényl)-6,7-diméthoxyquinoléine ;
- 4-(3-hydroxy-4-méthoxyphényl)-5,7-diméthoxyquinoléine ;
- 4-(3-hydroxy-4-méthoxyphényl)-5,6,7-triméthoxyquinoléine;
- 4-(3-hydroxy-4-méthoxyphényl)-7-trifluorométhylquinoléine;
- 4-(3-hydroxy-4-méthoxyphényl)-6-trifluorométhylquinoléine;
- 4-(3-hydroxy-4-méthoxyphényl)-6-méthoxy-7-trifluorométhylquinoléine ;
- 4-(3-hydroxy-4-méthoxyphényl)-5-trifluorométhyl-7-méthoxyquinoléine ;
- 4-(3-hydroxy-4-méthoxyphényl)-5-méthoxy-7-trifluorométhylquinoléine ;
- 4-(3-hydroxy-4-méthoxyphényl)-5,7-bis(trifluorométhyl)quinoléine ;
leurs analogues et leurs sels pharmaceutiquement acceptables, à titre de médicament.
2. Composés selon la revendication 1 , pour le traitement du cancer.
3. Composés selon la revendication 2, pour le traitement du cancer du sein, des glandes surrénales, de l'intestin, de l'estomac, de l'ovaire, de l'utérus, du placenta, de l'épithélium veineux, des vaisseaux sanguins, des cellules souches hématopoïétiques, des neuroblastomes, des fibrosarcomes, des tumeurs anaplasiques de la thyroïde, des myélomes, de la leucémie myéloïde aigûe.
4. Composés selon la revendication 2, pour le traitement des cellules tumorales surexprimant les pompes P-gp et/ou BCRP et des cellules tumorales irriguées par des vaisseaux tapissés de cellules endothéliales de la barrière hémato-encéphalique et hémato-testiculaire surexprimant les pompes P-gp et/ou BCRP.
5. Composés selon la revendication 4, pour le traitement des cellules tumorales surexprimant les pompes P-gp et/ou BCRP choisies parmi le cancer du rein, du colon, du poumon, du foie et du pancréas.
6. Composés selon la revendication 4, pour le traitement des cellules tumorales irriguées par des vaisseaux tapissés de cellules endothéliales de la barrière hémato-encéphalique et hémato-testiculaire surexprimant les pompes P-gp et/ou BCRP choisies parmi le cancer du testicule et du cerveau.
7. Composés de formule générale :
dans laquelle :
- X est choisi parmi un atome d'oxygène ou d'azote ;
- Y est un atome d'oxygène lorsque X est un atome d'oxygène, et Y est un atome d'hydrogène lorsque X est un atome d'azote ;
- R1 est choisi parmi un atome d'hydrogène ou un radical alkoxy linéaire ou ramifié de 1 à 4 atomes de carbone ;
- R2 est choisi parmi un atome d'hydrogène, un radical alkoxy linéaire ou ramifié de 1 à 4 atomes de carbone ou -CF3 ;
- R3 est choisi parmi un atome d'hydrogène, un hydroxy, un radical alkoxy linéaire ou ramifié de 1 à 4 atomes de carbone, -CF3, -N02 ou -NH2 ;
- R4 est choisi parmi un atome d'hydrogène, un radical alkoxy linéaire ou ramifié de 1 à 4 atomes de carbone ou -CF3 ; - R10, R1 1 , R12, R13 pris indépendamment sont choisis parmi un atome d'hydrogène, un radical alkyle linéaire ou ramifié de 1 à 6 atomes de carbone, un hydroxy ou un radical alkoxy linéaire ou ramifié de 1 à 4 atomes de carbone ;
- Z est choisi parmi un radical alkoxy de 1 à 4 atomes de carbone ou un radical mono ou dialkylamino de 1 à 4 atomes de carbone, ou pris ensemble avec
R12 forme un groupement pyrrole éventuellement monosubstitué par un radical alkyle linéaire ou ramifié de 1 à 3 atomes de carbone ;
leurs analogues et leurs sels pharmaceutiquement acceptables, pour le traitement des cellules tumorales surexprimant les pompes P-gp et/ou BCRP et des cellules tumorales irriguées par des vaisseaux tapissés de cellules endothéliales de la barrière hémato-encéphalique et hémato-testiculaire surexprimant les pompes P-gp et/ou BCRP.
8. Composés selon la revendication 7, pour le traitement des cellules tumorales surexprimant les pompes P-gp et/ou BCRP choisies parmi le cancer du rein, du colon, du poumon, du foie et du pancréas.
9. Composés selon la revendication 7, pour le traitement des cellules tumorales irriguées par des vaisseaux tapissés de cellules endothéliales de la barrière hémato-encéphalique et hémato-testiculaire surexprimant les pompes P-gp et/ou BCRP choisies parmi le cancer du testicule et du cerveau.
10. Composés selon l'une des revendications 7 à 9, choisis parmi :
- 4-(3-Hydroxy-4-méthoxyphényl)coumarine ;
- 4-(3-Hydroxy-4-méthoxyphényl)-7-méthoxycoumarine ;
- 4-(3-Hydroxy-4-méthoxyphényl)-6-méthoxycoumarine ;
- 4-(3-Hydroxy-4-méthoxyphényl)-6-hydroxycoumarine ;
- 4-(3-Hydroxy-4-méthoxyphényl)-6-nitrocoumarine ;
- 4-(3-Hydroxy-4-méthoxyphényl)-6-aminocoumarine ;
- 4-(3-Hydroxy-4-méthoxyphényl)-5-méthoxycoumarine ;
- 4-(3-Hydroxy-4-méthoxyphényl)-6,7-diméthoxycoumarine ;
- 4-(3-Hydroxy-4-méthoxyphényl)-5,7-diméthoxycoumarine ;
- 4-(3-Hydroxy-4-méthoxyphényl)-5,6-diméthoxycoumarine ;
- 4-(3-Hydroxy-4-méthoxyphényl)-5,6,7-triméthoxycoumarine;
- 4-(A/-méthyl-indol-5-yl)coumarine ;
- 7-méthoxy-4-(/V-méthyl-indol-5-yl)coumarine ;
- 6-méthoxy-4-(/V-méthyl-indol-5-yl)coumarine ;
- 6-hydroxy-4-(A/-méthyl-indol-5-yl)coumarine ; - 5-méthoxy-4-(A/-méthyl-indol-5-yl)coumarine ;
- 6,7-diméthoxy-4-(A/-méthyl-indol-5-yl)coumarine ;
- 5;7-diméthoxy-4-(A/-méthyl-indol-5-yl)coumarine ;
- 5,6-diméthoxy-4-(A/-méthyl-indol-5-yl)coumarine ;
- 5,6,7-triméthoxy-4-(/V-rnéthyl-indol-5-yl)coumarine ;
- 4-(4-N,N-diméthylaminophényl)-6-nitrocoumarine ;
- 6-amino-4-(4-N,N-diméthylar inophényl)coumarine ;
- 4-(4-N,N-diméthylaminophényl)-6-méthoxycoumarine ;
- 4-(3-hydroxy-4-méthoxyphényl)quinoléine ;
- 4-(3-hydroxy-4-méthoxyphényl)-7-méthoxyquinoléine ;
- 4-(3-hydroxy-4-méthoxyphényl)-6-méthoxyquinoléine ;
- 4-(3-hydroxy-4-méthoxyphényl)-6,7-diméthoxyquinoléine ;
- 4-(3-hydroxy-4-méthoxyphényl)-5,7-diméthoxyquinoléine ;
- 4-(3-hydroxy-4-méthoxyphényl)-5,6,7-triméthoxyquinoléine;
- 4-(3-hydroxy-4-méthoxyphényl)-7-trifluorométhylquinoléine;
- 4-(3-hydroxy-4-rnéthoxyphényl)-6-trifluorométhylquinoléine;
- 4-(3-hydroxy-4-méthoxyphényl)-6-méthoxy-7-trifluorométhylquinoléine ;
- 4-(3-hydroxy-4-méthoxyphényl)-5-trifluorométhyl-7-méthoxyquinoléine ;
- 4-(3-hydroxy-4-méthoxyphényl)-5-méthoxy-7-trifluorométhylquinoléine ;
- 4-(3-hydroxy-4-méthoxyphényl)-5,7-bis(trifluorométhyl)quinoléine ;
leurs analogues et leurs sels pharmaceutiquement acceptables.
1 1. Composés selon la revendication 10, choisis parmi :
- 6-méthoxy-4-(N-méthyl-indol-5-yl)coumarine ;
- 4-(3-hydroxy-4-méthoxyphényl)-6-aminocoumarine ;
- 4-(3-hydroxy-4-méthoxyphényl)-6-méthoxycoumarine.
12. Produit contenant un composé selon l'une des revendication 1 à 6 et au moins un autre ingrédient actif comme produit de combinaison pour une administration simultanée, séparée ou étalée dans le temps, pour le traitement du cancer.
13. Produit contenant un composé selon l'une des revendications 7 à 1 1 et au moins un autre ingrédient actif comme produit de combinaison pour une administration simultanée, séparée ou étalée dans le temps, pour le traitement des cellules tumorales surexprimant les pompes P-gp et/ou BCRP et des cellules tumorales irriguées par des vaisseaux tapissés de cellules endothéliales de la barrière hémato-encéphalique et hémato-testiculaire surexprimant les pompes P-gp et/ou BCRP.
14. Produit selon la revendication 13, pour le traitement des cancers du testicule, du cerveau, du rein, du colon, du poumon, du foie et du pancréas.
15. Procédé de synthèse des composés selon l'une des revendications 1 à 1 1 comprenant une étape de couplage de ligands en catalyse au palladium entre deux unités aromatiques, le cycle coumarique ou quinoléique préformé, convenablement activé et un dérivé arylboronique respectivement de formules
- X est choisi parmi un atome d'oxygène ou d'azote ;
- Y est un atome d'oxygène lorsque X est un atome d'oxygène, et Y est un atome d'hydrogène lorsque X est un atome d'azote ;
- Q est choisi parmi un atome d'halogène ou un groupement triflate ou tosylate ou tout autre groupement libérable ;
- R1 est choisi parmi un atome d'hydrogène ou un radical alkoxy linéaire ou ramifié de 1 à 4 atomes de carbone ;
- R2 est choisi parmi un atome d'hydrogène, un radical alkoxy linéaire ou ramifié de 1 à 4 atomes de carbone ou -CF3 ;
- R3 est choisi parmi un atome d'hydrogène, un hydroxy, un radical alkoxy linéaire ou ramifié de 1 à 4 atomes de carbone, -CF3, -N02 ou -NH2 ;
- R4 est choisi parmi un atome d'hydrogène, un radical alkoxy linéaire ou ramifié de 1 à 4 atomes de carbone ou -CF3 ;
- R10, R11 , R12, R13 pris indépendamment sont choisis parmi un atome d'hydrogène, un radical alkyle linéaire ou ramifié de 1 à 6 atomes de carbone, un hydroxy ou un radical alkoxy linéaire ou ramifié de 1 à 4 atomes de carbone ; - R est choisi parmi un atome d'hydrogène ou un radical alkyle linéaire ou ramifié de 1 à 6 atomes de carbone ;
- Z est choisi parmi un radical aikoxy de 1 à 4 atomes de carbone ou un radical mono ou dialkylamino de 1 à 4 atomes de carbone, ou pris ensemble avec R12 forme un groupement pyrrole éventuellement monosubstitué par un radical alkyle linéaire ou ramifié de 1 à 3 atomes de carbone ;
leurs analogues et leurs sels pharmaceutiquement acceptables.
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