DE60117591T2 - Verfahren zum Nachweis von Serin/Threonin-Kinase-Aktivität - Google Patents

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Description

  • Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zum Nachweis von Threonin- oder Serin- (Threonin/Serin)-Kinase-Aktivität in einem Immunoassay. Die Erfindung betrifft ferner einen Kit zur Durchführung des Assays und einen vorzugsweise lumineszent markierten Liganden.
  • Proteinkinasen katalysieren gewöhnlich die Überführung der γ-Phosphat-Gruppe von ATP auf einen Serin-, Threonin- oder Tyrosinrest eines Akzeptorproteins. Diese Enzyme spielen eine wichtige Rolle bei der Signaltransduktion innerhalb von Zellen. Ein Nachweis der Aktivität von Proteinkinasen wäre von Nutzen für das Hochdurchsatz-Screening chemischer Bibliotheken. Inhibitoren oder Aktivitoren von Kinase-Aktivität, insbesondere niedermolekulare Verbindungen, könnten schließlich zu Arzneiwirkstoffen weiterentwickelt werden, welche zur Behandlung von z.B. ischämischer Herzerkrankung, Leberversagen, diabetischen Neuropathien, Schlaganfall, neurodegenerativen Störungen, einschließlich Parkinson-Krankheit und Alzheimer-Krankheit, Entzündungserkrankungen, einschließlich Asthma, rheumatoider Arthritis, entzündlicher Darmerkrankung, septischem Schock und Krebs verwendet werden.
  • Es ist bekannt, dass mitogenaktivierte Proteinkinasen (MAPK) (auch bezeichnet als stressaktivierte Proteinkinasen, SAPK) viele der zellulären Wirkungen von Wachstumsfaktoren, Cytokinen und Stress vermitteln und zu Zellwachstum, Differenzierung und Onkogenese führen. MAPK/SAPK-Aktivierung erfordert eine doppelte Phosphorylierung an Threonin und Tyrosin innerhalb des Motivs Threonin-Xaa-Tyrosin, wobei Xaa Prolin in den c-Jun-NH2-terminalen Kinasen (JNKs) repräsentiert. Diese Ak tivierung wird durch mehrere MAPK-Kinasen (z.B. MKK4 (SKK1) oder MKK7 (SKK4)) katalysiert, welche sowohl die Threonin- als auch Tyrosinreste des Threonin(183)-Prolin-Tyrosin(185)-Motivs innerhalb der Schleife der aktiven Stelle von JNK1/2/3 phosphorylieren. Die MKK7-Kinase hat eine hohe Präferenz für den Threoninrest, wohingegen MKK4 vorwiegend Tyrosin phosphoryliert. Diese synergistische Aktivierung von JNK-2-3 wird von Lawler S. et al. in Current Biology 8, 1387 bis 1390 (1998) und Fleming Y. et al. (Biochemical Journal, 352, 145–153, 2000) beschrieben. Bisher wird die Identifizierung eines geeigneten Substrats, welches zum Screenen hinsichtlich spezifischer MKK7-Inhibitoren verwendet werden könnte, durch die Tatsache kompliziert, dass in der Literatur keine synthetischen Substratpeptide beschrieben sind. Die Situation wird noch kritischer in homogenen Assays, da ein potenzielles MKK7-Substratpeptid sowohl eine annehmbare Km für MKK7 als auch eine hohe Affinität für den Phosphothreonin-spezifischen Nachweisantikörper parallel aufweisen sollte. Obwohl generische Anti-Phosphotyrosin-Antikörper mit hoher Affinität und Spezifität für gegen Tyrosin gerichtete Kinasen (z.B. p60csrc-Kinase) verfügbar sind, waren Versuche zur Entwicklung generischer Anti-Phosphothreonin/Anti-Phosphoserin-Antikörper für denselben Zweck bisher weniger erfolgreich.
  • Antikörper, welche an phosphorylierte Threonin- oder Serinreste mit hoher Affinität binden, erkennen nur die phosphorylierte Aminosäure im Kontext der umgebenden Peptidsequenz. Für Antikörper, die an JNK1/2/3 oder Peptid-Derivate davon binden, ist die Erkennung deshalb von zwei Kriterien abhängig: 1) MKK7-abhängige Phosphorylierung von Threonin und 2) Phosphorylierung des Tyrosin-Aminosäurerests. Falls eines der beiden Kriterien nicht erfüllt ist, wird ein gegen vollständig aktiviertes JNK1/2/3 induzierter Antikörper die Phosphorylierungsstelle nicht spezifisch nachweisen.
  • In Anal. Biochem. 255, 257 bis 262 (1998), wird ein Fluoreszenzpolarisations(FP)-Konkurrenz-Immunoassay für Tyrosinkinasen unter Verwendung eines geeigneten Substrats für diese Kinase beschrieben. Die Kinasereaktion wurde durchgeführt durch Inkubation des Peptidsubstrats mit ATP und Lymphoid-T-Zell-Protein-Tyrosinkinase, gefolgt von Terminierung der Reaktion mit EDTA plus einem Fluoreszein-Phosphopeptid. Nach der Zugabe eines Anti-Phosphotyrosin-Antikörpers wurde das Fluoreszenzpolarisationssignal gemessen. Das phosphorylierte Produkt, das in dem Assay gebildet wurde, konkurriert mit dem Fluoreszein-Phosphopeptid um die Bindung an den Anti-Phosphotyrosin-Antikörper. Die Kinaseaktivität führt zu einer Verringerung des FP-Signals und das FP-Signal ist daher umgekehrt proportional zu dem in der Reaktion gebildeten phosphorylierten Produkt.
  • Ein solcher Ansatz für ein generisches Assay-Prinzip für Serin/Threoninkinase ist jedoch bisher nicht realisierbar. Dies liegt daran, dass keine Anti-Phosphoserin/threonin-Antikörper verfügbar sind, welche spezifisch und mit hoher Affinität an Phosphoserin- oder Phosphothreoninreste in Abwesenheit zusätzlicher spezifischer Aminosäuresequenzen neben der phosphorylierten Aminosäure binden.
  • Khokhlatchev et al. (J. Biol. Chem., Band 272, Nr. 17, (1997), Seiten 11057–11062) beschreiben ein in vivo-Verfahren zur Verfolgung von MEK-Kinase-Aktivität, wobei MEKK mit entweder durch ein extrazelluläres Signal regulierter Kinase (ERK2) oder einer stressaktivierten Proteinkinase (SAPK) coexprimiert wird. Im normalen Verlauf der Ereignisse phosphoryliert MEKK MEK, welche wiederum ERK2 oder SAPK2 phosphoryliert. Dieses Verfahren liefert jedoch keinen in vitro-Immunoassay für den Nachweis von Serin/Threoninkinase-Aktivität, bei dem die Verwendung von spezifischen hochaffi nen Anti-Phospho-serin/threonin-Antikörpern keine Vorbedingung ist.
  • Die Aufgabe der vorliegenden Erfindung war deshalb die Etablierung eines Assay-Verfahrens zum Nachweis von Serin/Threoninkinasen oder deren enzymatischer Aktivität. Das Assay-Verfahren ist sehr zuverlässig und einfach durchzuführen, ohne die Notwendigkeit, spezifische hochaffine Anti-Phosphoserin/threonin-Antikörper zu entwickeln.
  • Diese Aufgabe wurde mit dem Assay-Verfahren mit den Merkmalen von Anspruch 1 gelöst.
  • Wie hier verwendet, bezieht sich der Begriff „Kinase" auf ein Enzym, welches zur Phosphorylierung seines Substrats in der Lage ist. Eine „Serin/Threoninkinase" bezieht sich auf ein Enzym, welches zur Phosphorylierung seines Substrats an einem Serin- oder Threoninrest in der Lage ist. Der Begriff „bisphosphoryliert" oder „doppelt phosphoryliert" zeigt an, dass ein Protein oder Peptid, welches das Sequenzmotiv -Z-X-Y- oder Y-X-Z- umfasst, sowohl an der Z- als auch der Y-Position phosphoryliert ist. Soweit nicht anderweitig angegeben, schließt der Begriff „bisphosphoryliert" oder „doppelt phosphoryliert", wie hier verwendet, nicht die Möglichkeit aus, dass das Protein oder Peptid an anderen Positionen als Y und Z weiter phosphoryliert ist.
  • Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zum Nachweis von Threonin- oder Serinkinase-Aktivität in einem Immunoasay, umfassend die folgenden Schritte:
    • a) Bereitstellung eines Proteins oder Peptids, umfassend das Sequenzmotiv: -Z-X-Y- oder -Y-X-Z- worin Z = Threonin oder Serin X = eine Sequenz von vorzugsweise zwischen 1 und 1000 Aminosäuren, welche gleich oder verschieden sein können Y = Tyrosin, Threonin oder Serin als Substrat für Threonin- oder Serinkinasen, wobei das Protein oder Peptid an der Y-Position vorphosphoryliert ist;
    • b) Inkubation des Proteins oder Peptids mit einem Phosphatdonor und einer Threonin- oder Serinkinase, um ein bisphosphoryliertes Protein oder Peptid zu bilden;
    • c) Zugabe eines Antikörpers, der eine Spezifität für das Peptid/Protein aufweist, das an dem Threonin oder Serin in der Z-Position phosphoryliert wurde; und
    • d) Nachweis der Threonin- oder Serinkinase-Aktivität.
  • Mit anderen Worten betrifft die Erfindung ein Verfahren zum Nachweis der Phosphorylierungsaktivität eines Enzyms, umfassend die folgenden Schritte:
    • a) Kombinieren des Enzyms mit • einem Protein oder Peptid, umfassend das Sequenzmotiv -Z-X-Y- oder -Y-X-Z- worin Z = Threonin oder Serin X = eine Sequenz von vorzugsweise zwischen 1 und 1000 Aminosäuren, welche gleich oder verschieden sein können Y = Phosphotyrosin, Phosphothreonin oder Phosphoserin, wobei das Protein oder Peptid in der Lage ist, an der Z-Position durch das Enzym phosphoryliert zu werden; • einem Phophatdonor; und • einem Antikörper mit einer Spezifität für ein Peptid/Protein, welches sowohl an der Y- als auch an der Z-Position phosphoryliert ist; und
    • b) Nachweis der Enzymaktivität.
  • Alle Assay-Komponenten können gleichzeitig oder schrittweise kombiniert werden. Das Substrat kann insbesondere mit dem Enzym vor der Zugabe des Antikörpers kombiniert werden.
  • Insbesondere hat der Antikörper eine Spezifität für das bisphosphorylierte Produkt der Kinasereaktion. Durch Nachweis der Anwesenheit, Abwesenheit oder Menge des Produkt-Antikörper-Komplexes kann eine Threonin- oder Serinkinase-Aktivität gemessen werden. Anders ausgedrückt, die Erfindung erlaubt auch die Bestimmung der Phosphorylierung eines Substratmoleküls durch ein Enzym an einer Aminosäure, welche aus der aus Serin und Threonin bestehenden Gruppe ausgewählt ist.
  • Die vorliegende Erfindung betrifft auch einen Kit zum Nachweis von Threonin- oder Serinkinase-Aktivität in einem Immunoassay, welcher die folgenden Komponenten umfasst:
    • – vorzugsweise eine Threonin- oder Serinkinase;
    • – ein vorphosphoryliertes Substrat wie oben definiert;
    • – einen Antikörper wie oben definiert; und
    • – vorzugsweise Reaktionspuffer, die einen Phosphatdonor einschließen.
  • Die vorliegende Erfindung betrifft auch einen markierten, vorzugsweise lumineszenzmarkierten, Liganden zur Verwendung in einem Serin/Threoninkinase-Assay, umfassend das Sequenzmotiv
    -Z-X-Y- oder -Y-X-Z-
    worin
    Z = Threonin oder Serin
    X = eine Sequenz von vorzugsweise zwischen 1 und 1000 Aminosäuren, welche gleich oder verschieden sein können
    Y = Tyrosin, Threonin oder Serin
    wobei der Protein- oder Peptid-Ligand an der Z- und Y-Position phosphoryliert ist.
  • Die Unteransprüche definieren bevorzugte Ausführungsformen des Verfahrens der vorliegenden Erfindung.
  • Das Verfahren der vorliegenden Erfindung sowie der Kit und der markierte Ligand können zum Screening hinsichtlich spezifischer Modulatoren von Serin- oder Threoninkinase-Aktivität verwendet werden. Sie sind besonders geeignet zum Screen von Verbindungs-Bibliotheken, um Moleküle festzustellen, welche Kinasen inhibieren oder aktivieren. Diese Moleküle können aussichtsreiche Kandidaten zur gezielten Entwicklung von Wirkstoffen sein, welche zur Behandlung von beispielsweise ischämischer Herzerkrankung, Leberversagen, diabetischen Neuropathien, Schlaganfall, neurodegenerativen Erkrankungen, einschließlich Parkinson-Krankheit und Alzheimer-Krankheit, Entzündungserkrankungen, einschließlich Asthma, rheumatoider Arthritis, entzündlicher Darmerkrankung, septischem Schock und Krebs verwendet werden. Das Screenen hinsichtlich eines Agens, welches in der Lage ist, die Phosphorylierungsaktivität des Enzyms zu erhöhen oder zu verringern, umfasst typischerweise die Schritte von (i) Durchführung des wie oben ausgeführten Verfahrens in Anwesenheit und in Abwesenheit des Agens; und (ii) Vergleichen der Aktivität des Enzyms in Anwesenheit des Agens mit der Aktivität des Enzyms in Abwesenheit des Agens, um festzustellen, ob die Phosphorylierungsaktivität des Enzyms in Anwesenheit des Agens erhöht oder verringert wird. Der Gegenstand der vorliegenden Erfindung könnte jedoch auch zur Untersuchung der Funktionalität eines Enzyms von Nutzen sein. Beispielsweise könnte man überprüfen, ob ein unbekanntes Protein zur Gruppe von Serin/Threoninkinasen gehört oder ob eine spezifische Serin/Threoninkinase biologisch aktiv ist.
  • Die begleitenden Zeichnungen illustrieren die vorliegende Erfindung. Abkürzungen werden wie folgt verwendet:
    P1° H-Lys-Phe-Met-Met-Thr-Pro-pTyr-Val-Val-Thr-Arg-NH2
    P1* H-Lys-Phe-Met-Met-pThr-Pro-Tyr-Val-Val-Thr-Arg-NH2
    P1*° H-Lys-Phe-Met-Met-pThr-Pro-pTyr-Val-Val-Thr-Arg-NH2
    TAMRA-P1*° 5-TAMRA-AEEA-Lys-Phe-Met-Met-pThr-Pro-pTyr-Val-Val-Thr-Arg-NH2
    TAMRA 5'-(6-Carboxytethramethylrhodamin)
    AEEA 8-Amino-3,6-dioxaoctansäure-Linker
  • In den Figuren ist Folgendes gezeigt:
  • 1 ist eine schematische Zeichnung einer bevorzugten Ausführungsform des Assay-Prinzips der vorliegenden Erfindung.
  • 2 ist ein schematisches Diagramm, welches die Bindung des polyklonalen JNK-Antikörpers an TAMRA-markiertes P1*°-Peptid zeigt; als Kontrolle wird keine Bindung für TAMRA-markiertes P1°-Peptid gemessen.
  • 3 ist ein schematisches Diagramm, welches die Konkurrenz der Bindung des polyklonalen JNK-Antikörpers an das TAMRA-markierte P1*°-Peptid unter Verwendung monophosphorylierter P1°- und P1*-Peptide und doppelt phosphoryliertem P1*°-Peptid zeigt (Bestimmung des IC50-Werts für den P1*°-Peptid-Konkurrenten).
  • 4 ist ein schematisches Diagramm, welches die Konkurrenz der Bindung des polyklonalen JNK-Antikörpers an das TAMRA-markierte P1*°-Peptid in Gegenwart von 100 μm P1°-Peptid (Substrat) unter Verwendung von P1*°-Peptid zeigt (Bestimmung des IC50-Werts für den P1*°-Peptid-Konkurrenten unter MKK7-Kinase-Assaybedingungen).
  • 5 ist ein schematisches Diagramm, welches die Phosphorylierung des P1°-Peptid-Substrats durch MKK7-Kinase bei verschiedenen P1°-Peptid-Konzentrationen zeigt (Bestimmung des Km-Werts für P1°-Peptid).
  • 6 ist ein schematisches Diagramm, welches die Phosphorylierung von P1°-Peptid-Substrat durch MKK7-Kinase bei verschiedenen ATP-Konzentrationen zeigt (Bestimmung des Km-Werts für ATP).
  • 7 ist ein schematisches Diagramm, welches die Inhibierung der MKK7-Kinase-abhängigen Phosphorylierung des P1°-Peptid-Substrats durch Staurosporin zeigt (Bestimmung des IC50-Werts für Staurosporin).
  • Erfindungsgemäß wird ein Protein oder Peptid, umfassend das Sequenzmotiv -Z-X-Y- oder -Y-X-Z-, wobei Z = Threonin oder Serin; X = eine Sequenz von vorzugsweise zwischen 1 und 1000 Aminosäuren, welche gleich oder verschieden sein können; Y = Tyrosin, Threonin oder Serin, als Substrat für die Threonin- oder Serinkinase verwendet. Gemäß der vorliegenden Erfindung wird das Protein oder Peptid an der Y-Position vorphosphoryliert. Es wurde gezeigt, dass die Proteine und Peptide, die an dem Y-Rest vorphosphoryliert sind, erfolgreich als synthetische Substrate für Threonin- oder Serinkinasen verwendet werden können.
  • In dem Sequenzmotiv kann jede Aminosäure oder Sequenz von Aminosäuren (X) zwischen Z und Y inseriert werden. Die Anzahl der Aminosäuren liegt vorzugsweise im Bereich zwischen 1 und 1000 Aminosäuren. Ein Bereich von 1 bis 1000 ist bevorzugt, um sowohl lineare als auch Konformations-Antikörperepitope einzuschließen. X ist insbesondere mindestens eine Aminosäure, wobei beliebige andere kurze Aminsäuresequenzen, die min destens zwei Aminosäuren aufweisen, z.B. Oligopeptide, ebenfalls eingeschlossen sind. Vorzugsweise ist X Prolin oder Glutamat oder Glycin.
  • Der verwendete Antikörper ist gewöhnlich ein monoklonaler oder polyklonaler Antikörper.
  • Es wurde gezeigt, dass ein besonders bevorzugter Antikörper ein polyklonaler Antikörper ist, der spezifisch für bisphosphoryliertes, insbesondere aktiviertes, JNK ist. Solche Antikörper sind im Handel erhältlich.
  • Es wurde offenbart, dass der Antikörper spezifisch einen phosphorylierten Threonin- oder Serinrest an der Z-Position innerhalb sowohl eines synthetischen Substratpeptids als auch eines bisphosphorylierten, insbesondere aktivierten, JNK erkennt.
  • Der Immunoassay gemäß der vorliegenden Erfindung kann in einem homogenen Assay-Format (d.h. „Mischen, Inkubieren und Ablesen") durchgeführt werden. Dieses Assay-Format ist sehr vorteilhaft, da es für sowohl das Hochdurchsatz-Screening ("high throughput screening"; HTS) potenzieller Arzneiwirkstoffe als auch für sekundäre Assays geeignet ist.
  • Der Immunoassay der vorliegenden Erfindung kann als Immunoassay mit direkter Bindung, vorzugsweise homogener Immunoassay mit direkter Bindung, durchgeführt werden.
  • Bei dem Immunoassay mit direkter Bindung wird ein markiertes Peptid/Protein oder ein markierter Antikörper verwendet. Die Markierung kann gemäß herkömmlichen Standardtechniken durchgeführt werden. Vorzugsweise wird das Peptid/Protein oder der Antikörper mittels einer lumineszenten oder radioaktiven Mar kierung oder mittels spezifischer Markierungsmoleküle, wie z.B. eines Reporterenzyms oder eines Affinitätsliganden, markiert.
  • Der Assay der vorliegenden Erfindung kann auch als Konkurrenz-Immunoassay, vorzugsweise homogener Immunoassay mit indirekter Bindung, durchgeführt werden.
  • Bei diesem Immunoassay mit indirekter Bindung wird ein markierter doppelt phosphorylierter Ligand hinzugefügt, um mit dem doppelt phosphorylierten Peptid oder Protein um die Bindung an den Antikörper zu konkurrieren. Der Ligand wird vorzugsweise mittels einer lumineszierenden oder radioaktiven Markierung oder mittels spezifischer Markierungsmoleküle, wie z.B. eines Reporterenzyms oder eines Affinitätsliganden, markiert.
  • Im Allgemeinen bietet ein Fluoreszenznachweis eine bevorzugte Alternative gegenüber der Verwendung von radioaktiven Tracern, da Fluoreszenz nicht nur Nachweisgrenzen ermöglicht, die mit denjenigen der Radioaktivität vergleichbar sind, sondern auch die Kosten der Entsorgung von radioaktivem Abfall vermeidet.
  • Im Fall der Verwendung eines Proteins als Substrat, welches das obige Motiv enthält, wird vorzugsweise das JNK-Protein verwendet, welches die c-Jun-N-terminale Kinase ist. JNK-Kinase ist in der Literatur auch als stressaktivierte Proteinkinase 1 (SAPK1) bekannt.
  • Wenn es günstiger ist, ein Peptidsubstrat zu verwenden, ist die Peptidsequenz vorzugsweise aus der Schleife der aktiven Stelle, z.B. für MKK7 aus der aktiven Stelle von JNK1/2/3, ausgewählt. Beispielsweise umfasst das Peptid für MKK7 die Aminosäuresequenz H-Lys-Phe-Met-Met-Thr-Pro-pTyr-Val-Val-Thr-Arg-NH2, wobei p phosphoryliert bedeutet, oder besteht daraus.
  • Wenn die Inkubation des Proteins oder Peptids in Gegenwart einer Threoninkinase durchgeführt wird, ist die Threoninkinase vorzugsweise eine mitogenaktivierte Proteinkinasekinase (MKK), alternativ als stressaktivierte Proteinkinase (SKK) bezeichnet. Spezieller ist die Kinase MKK7/SKK4.
  • Gemäß einer Ausführungsform des Verfahrens der vorliegenden Erfindung wird vorzugsweise zu Beginn der Reaktion ein Antikörper zugegeben, der eine Spezifität für die bisphosphorylierte Sequenz, vorzugsweise für phosphoryliertes Threonin oder Serin, aufweist. Während der Enzymreaktion wird jegliches gebildete doppelt phosphorylierte Produkt von dem Antikörper gebunden. Dann wird am Ende der Enzymreaktion ein markierter doppelt phosphorylierter Ligand zugegeben, entweder mit oder ohne gleichzeitiger Zugabe eines Reagens zum Stoppen der Reaktion, um mit dem doppelt phosphorylierten Protein oder Peptid um die Bindung an den Antikörper zu konkurrieren. Dieses indirekte Assay-Prinzip basiert auf der Tatsache, dass, wenn das Substrat durch die Kinase, wie z.B. MKK7, doppelt phosphoryliert wird, es mit dem markierten doppelt phosphorylierten Peptid-Antikörper-Komplex konkurrieren wird. Diese Strategie hat den Vorzug der Verwendung nichtmarkierter Substrate und eines festgelegten Antigen-Antikörper-Komplexes, der die Ablesung ergibt.
  • Gewöhnlich wird der doppelt phosphorylierte Ligand mit herkömmlichen Techniken markiert, wobei eine lumineszente oder radioaktive Markierung oder Moleküle wie ein Reporterenzym oder ein Affinitätsligand verwendet werden. Vorzugsweise ist der Ligand mit einem Fluoreszenzfarbstoff markiert. Speziell umfasst der Ligand die Sequenz 5-TAMRA-AEEA-Lys-Phe-Met-Met-pThr-Pro-pTyr-Val-Val-Thr-Arg-NH2 oder besteht daraus.
  • In 1 ist das indirekte Assay-Prinzip illustrativ dargestellt. Das P1°-Substrat mit der Aminosäuresequenz H-Lys-Phe-Met-Met-Thr-Pro-pTyr-Val-Val-Thr-Arg-NH2 (p bedeutet phosphoryliert) wird an dem Threoninrest in Gegenwart von ATP und der MKK7-Kinase phosphoryliert. Dieses doppelt phosphorylierte Peptid (Ligand) konkurriert mit dem markierten TAMRA-P1*°-Peptid mit der Sequenz 5-TAMRA-AEEA-Lys-Phe-Met-Met-pThr-Pro-pTyr-Val-Val-Thr-Arg-NH2 um die Bindung an den Antikörper.
  • In einer bevorzugten Ausführungsform kann der Assay günstig als Fluoreszenz-Immunoassay, insbesondere Fluoreszenzpolarisations(FP)-Immunoassay, durchgeführt werden. Jedoch könnten andere Fluoreszenztechniken wie Fluoreszenzkorrelationsspektroskopie (FCS), Fluroeszenzintensitätsverteilungs-Analyse (FIDA), Fluoreszenz-Quenching (FQ) oder Fluoreszenzresonanzenergietransfer (FRET) angewendet werden.
  • Gemäß der Erfindung wird ein Kit zum Nachweis von Threonin- oder Serinkinase-Aktivität bereitgestellt. Der Kit umfasst vorzugsweise die folgenden Komponenten:
    • 1. eine Threonin- oder Serinkinase, wie z.B. natürliches oder rekombinantes Enzym;
    • 2. ein Substrat wie oben ausgeführt, z.B. in Form eines monophosphorylierten Peptids oder monophosphorylierten Proteins;
    • 3. einen Antikörper wie oben ausgeführt;
    • 4. Reaktionspuffer, einschließlich z.B. entweder MnCl2 oder MgCl2 und eines Phosphatdonors wie ATP;
    • 5. Reaktionsgefäße; und
    • 6. Protokoll.
  • Es ist bevorzugt, dass der Kit ein Substrat und einen Antikörper wie oben definiert einschließt und gegebenenfalls auch Reaktionspuffer, Gefäße und Protokolle. Der Verwender des Kits kann die Option haben, eine geeignete Kinase selbst zu wählen. In einer weiteren Ausführungsform könnte der Kit auch eine spezifische Threonin- oder Serinkinase einschließen.
  • Der Kit umfasst vorzugsweise ferner einen markierten (insbesondere lumineszenzmarkierten) Liganden, welcher Ligand ein Sequenzmotiv
    -Z-X-Y- oder -Y-X-Z-
    umfasst, wobei
    Z = Threonin oder Serin
    X = eine Sequenz von vorzugsweise zwischen 1 und 1000 Aminosäuren, welche gleich oder verschieden sein können
    Y = Tyrosin, Threonin oder Serin.
  • Dieser Ligand wirkt als Konkurrent bei der Durchführung des Assays gemäß der vorliegenden Erfindung, wobei der Konkurrent an den Positionen Z und Y vorphosphoryliert ist.
  • Es hat sich gezeigt, dass die im Handel erhältlichen polyklonalen Anti-Phosphokinase-Antikörper für den Assay der vorliegenden Erfindung besonders geeignet sind. Wie in 2 (bezüglich Beispiel 1) ersichtlich, weist der polyklonale Phospho-JNK-Antikörper alle drei Isoformen der JNK-Proteine nur nach, wenn sie durch doppelte Phosphorylierung bei Threonin183 und Tyrosin185 aktiviert sind. Die Polarisationswerte nehmen dramatisch zu, wenn das doppelt phosphorylierte Peptidsubstrat P1*° im Gegensatz zu dem monophosphorylierten markierten Peptid P1° (Sequenz siehe oben) verwendet wird.
  • In 3 (bezüglich Beispiel 2) ist die Bindung desselben polyklonalen Antikörpers an TAMRA-markiertes Peptid P1*° (5 nM) in Konkurrenz mit den Peptiden P1° (monophosphoryliert, Sequenz siehe oben), Peptid P1* (monophosphoryliert, mit der Sequenz H-Lys-Phe-Met-Met-pThr-Pro-Tyr-Val-Val-Thr-Arg-NH2) oder Peptid P1*° (doppelt phosphoryliert, Sequenz siehe oben), dargestellt. Wie aus der Komplexbildung abgeleitet werden kann, ist nur bisphosphoryliertes Peptid P1*° in der Lage, effektiv mit dem TAMRA-markierten Peptid P1*° um die Bindung an den Antikörper zu konkurrieren, während die anderen monophosphorylierten Peptide sogar bei hohen Konzentrationen (bis zu 1 μM) weniger als 50% des gebundenen Liganden verdrängen.
  • In 4 (bezüglich Beispiel 3) wird die Bindung desselben polyklonalen Antikörpers an TAMRA-markiertes Peptid P1*° (5 nM) durch bisphosphoryliertes Konkurrenzpeptid in Gegenwart von P1°-Peptidsubstrat (100 μM) verdrängt. Diese Bedingungen reflektieren die Konzentration, bei der P1°-Peptid als Substrat für die MKK7-Kinase verwendet wird. Wie aus dem Ergebnis ersichtlich, verringert die Anwesenheit von monophosphoryliertem P1°-Peptid den dynamischen Bereich des beschriebenen Kinase-Assays nicht.
  • In 5 (bezüglich Beispiel 4) wird die Phosphorylierungsrate von P1°-Peptidsubstrat durch MKK7-Kinase bei verschiedenen P1°-Peptidkonzentrationen bestimmt. Es wird eine effiziente Phosphorylierung von P1°-Peptid gemessen. Das gebildete doppelt phosphorylierte P1*°-Peptidprodukt kann nachgewiesen werden, da es mit dem TAMRA-markierten P1*°-Peptid um die Bindung an denselben polyklonalen Phospho-JNK-Antikörper konkurriert. Als Ergebnis wird ein Abfall der Fluoreszenpolarisation nachgewiesen, welcher umgekehrt proportional zur MKK7-Kinase-Aktivität ist. Anhand der nachgewiesenen Signale wurde die Michaelis-Menten-Konstante (Km), welche die halbmaximale Phosphorylierungsrate reflektiert, für das P1°-Peptid bestimmt.
  • In 6 (bezüglich Beispiel 5) wird die Phosphorylierungsrate von P1°-Peptidsubstrat durch MKK7-Kinase bei verschiedenen ATP-Konzentrationen bestimmt. Die effiziente Phosphorylierung des P1°-Peptids ist von der optimalen ATP-Konzentration abhängig. Die Bildung des bisphosphorylierten P1*°-Peptidprodukts wird mittels desselben Konkurrenz-Assays wie in 5 beschrieben nachgewiesen. Anhand der nachgewiesenen Fluoreszenzpolarisationssignale wurde die Michaelis-Menten-Konstante (Km), welche die halbmaximale Phosphorylierungsrate reflektiert, für ATP bestimmt.
  • In 7 (bezüglich Beispiel 6) wird die Inhibierung der Phosphorylierung von P1°-Peptidsubstrat durch MKK7-Kinase für den Kinaseinhibitor Staurosporin bestimmt. Die Inhibierung der MKK7-Kinase wird mittels desselben Konkurrenz-Assays wie im Beispiel 5 beschrieben nachgewiesen. Als Ergebnis wird keine Konkurrenz des TAMRA-markierten P1*°-Peptids von demselben polyklonalen Phospho-JNK-Antikörper bei hohen Staurosporin-Konzentrationen nachgewiesen. Die halbmaximale Hemmkonzentration (IC50) wurde für Staurosporin berechnet.
  • Die folgenden Beispiele erläutern den Assay der vorliegenden Erfindung. Die hier im Folgenden beschriebenen Experimente zeigen die Möglichkeit, die Phosphorylierungsaktivität von Serin/Threoninkinasen in einem homogenen Assayformat, das für ein Screening mit hohem Durchsatz geeignet ist, zu überprüfen. Die Experimente basieren auf dem Befund, dass eine Modifizierung – Phosphorylierung an der Y-Position – des Substrats in räumlicher Nähe zu der Z-Position der Phosphorylierung nicht nur die Affinität des phosphorylierten Produkts für den Nachweisantikörper erhöht, sondern auch in einer ho hen Spezifität für die phosphorylierte Z-Position resultiert. Neben dem Vorteil einer Affinitätsverstärkung des Antikörpers zeigt sich, dass die Modifizierung des Substrats gemäß der vorliegenden Erfindung auch eine unerwartete positive Wirkung auf die Kinetik der Kinasereaktion aufweist.
  • Beispiel 1:
  • Messung der Bindungsaffinität (KD) des Antikörpers NEB #9251:
  • Dieser polyklonale Antikörper weist alle drei Isoformen der SAPK1/JNK-Proteine nur auf, wenn sie durch doppelte Phosphorylierung bei Threonin183/Tyrosin185 aktiviert sind. Die Bindung des polyklonalen Phospho-JNK-Antikörpers von NEB (bei einer Verdünnung von 1:20) an TAMRA-markierte P1°- und P1*°-Peptide (jeweils 5 nM) wurde durch Fluoreszenpolarisation gemessen.
  • Affinität von polyklonalem Phospho-JNK-Antikörper für das Peptid P1*°-TAMRA: KD = 2,6 nM
  • Die Ergebnisse dieses Experiments sind in 2 dargestellt.
  • Beispiel 2:
  • Bestimmung von IC50 für das Peptid P1°:
  • Die Konkurrenz des NEB-Antikörper-P1*°-TAMRA-Komplexes mit P1*°-Peptid wurde durch Fluoreszenzkorrelationsspektroskopie gemessen: Die Bindung von polyklonalem Phospho-SAPK1-JNK-Antikörper von NEB (1:20 verdünnt) an TAMRA-markiertes Peptid P1*° (5 nM) wurde mit nichtfluoreszierendem doppelt phosphoryliertem Peptid P1*° in Konkurrenz gesetzt. Kontrollpeptide: monophosphoryliertes P1° und P1*.
    Peptid P1*°: IC50 = 5,0 nM ± 3,3 nM
  • Die Ergebnisse dieses Experiments sind in 3 dargestellt.
  • Beispiel 3:
  • Bestimmung von IC50 für das Peptid P1° (unter MKK7-Enzym-Assay-Bedingungen).
  • Die Konkurrenz des NEB-Antikörper-P1*°-TAMRA-Komplexes mit P1*° in Gegenwart von P1°-Substratpeptid (welches MKK7-Assay-Bedingungen reflektiert) wurde durch Fluoreszenzpolarisation gemessen: Bindung von polyklonalem Phospho-JNK-Antikörper von NEB #9251 (bei einer Verdünnung von 1:20) an TAMRA-markiertes Peptid P1*° (5 nM), Konkurrenz mit P1*°-Peptid (0,1, 0,5, 2,5, 20, 50, 200, 2000 nM) in Hepes-Puffer (MgCl2 10 mM, ATP 20 μm, Pluronic 0,1%, P1°-Substratpeptid 100 μM.
    Peptid P1*°: IC50 = 35, 1 nM ± 10, 6 nM
  • Die Ergebnisse dieses Experiments sind in 4 dargetellt.
  • Beispiel 4:
  • Bestimmung von Km für das Peptid P1° (Ablesung: Fluoreszenzpolarisation):
  • sAssaybedingungen: MKK7-Kinase (80 nM), P1°-Peptid (0, 10, 30, 70, 100, 200, 500 μM), ATP (100 μM), NEB-Antikörper #9251 (1:20 verdünnt) und P1*°-Peptid-TAMRA (5 nM) bei RT (Raumtemperatur).
    Km = 94 nM ± 59 nM, Vmax = 94, 6 nM/min ± 0,03 nM/min
  • Die Ergebnisse dieses Experiments sind in 5 dargestellt.
  • Beispiel 5:
  • Bestimmung von Km für ATP (Ablesung: Fluoreszenzpolarisation):
  • Assaybedingungen: MKK7 (80 nM), P1°-Peptid (100 μM), ATP (0, 1, 5, 10, 20, 50, 100, 200, 500 μM), Inkubationszeit bis 2 Stunden bei RT, polyklonaler Antikörper gegen aktives JNK von NEB #9251 (1:20 Verdünnung) und P1*°-Peptid-TAMRA bei (5 nM).
    Km = 17,3 ± 18,1 nM, VmaX = 0,28 mP/min ± 0,07 mP/min
  • Die Ergebnisse dieses Experiments sind in 6 dargestellt.
  • Beispiel 6:
  • Inhibierung von MKK7-Aktivität mit Staurosporin (Ablesung: Fluoreszenzpolarisation):
  • Assaybedingungen: MKK7 (0,3 μM), P1°-Peptid (100 μM), ATP (10 μM), Staurosporin (0, 0,05, 0,2, 1, 2, 5, 10 μM), polyklonaler Antikörper gegen aktives JNK von NEB #9251 (1:20 Verdünnung) und P1*°-Peptid-TAMRA bei (5 nM).
    IC50 = 63,3 nM ± 10,2 nM
  • Die Ergebnisse dieses Experiments sind in 7 dargestellt.
  • Beispiel 7:
  • Fluoreszenzpolarisationsmessungen von MKK7-Aktivität (Zeitverlauf):
  • In diesem Experiment wurde der Zeitverlauf bei P1°-Substratkonzentrationen von 100 μM untersucht. Die Reaktionen wurden durch EDTA gestoppt.
  • Es wurden die folgenden Reagenzien verwendet (die Zusammensetzungen der Puffer und Spezifikationen der Reagenzien werden detaillierter später erläutert):
    Hepes-Puffer, MgCl2 10 mM, ATP 20 μM, P1°-Peptid bei 100 μM, NEB-Antikörper #9251, 1:20 Verdünnung, P1*°-TAMRA 5 nM, Pluronic 0,1%, MKK7 mit 0, 0,005, 0,02, 0,08, 0,2, 0,5 und 2 μM. Nach Zugabe von MKK7 wurden die Enzymreaktionen in Nunc-Kammern bei Raumtemperatur durchgeführt. Die Proben wurden kontinuierlich zu unterschiedlichen Zeitpunkten mittels Fluoreszenzpolarisation gemessen.
  • Figure 00200001
    • Fluoreszenzpolarisations(FP)-Werte sind in mP angegeben.
  • Beispiel 8:
  • Fluoreszenzpolarisationsmessungen von MKK7-Aktivität (Zeitverlauf):
  • In diesem Experiment wurden die Assaybedingungen optimiert. Die Reaktionen wurden mit EDTA gestoppt.
  • Es wurden zwei unterschiedliche Assay-Strategien untersucht: Erstens war der NEB-Ablesungs-Antikörper in der Enzymreaktion eingeschlossen (STOP-Lösung: enthält nur EDTA und P1*°-TAMRA); zweitens war der NEB-Ablesungs-Antikörper in der STOP-Lösung eingeschlossen.
  • Es wurden die folgenden Reagenzien verwendet (Erläuterungen später): Hepes-Puffer, MgCl2 (10 mM), ATP (20 μM), P1°-Peptid (100 μM), polyklonaler Antikörper NEB #9251 (1:20, P1*°-TAMRA (5 nM), Pluronic (0,1%), BSA (0,01% , MKK7 mit (0,04, 0,08, und 0,2 μM), EDTA (10 mM) (alles Endkonzentrationen).
  • Die Enzymreaktionen wurden in Eppendorf-Reaktionsröhrchen bei Raumtemperatur durchgeführt. Aliquots von 20 μl wurden aus den Reaktionen zu verschiedenen Zeitpunkten entnommen und mit 10 μl STOP-Lösung gemischt. Die abgestoppten Reaktionen wurden für mindestens 30 Minuten bei RT inkubiert und mittels Fluoreszenzpolarisation gemessen.
  • Ergebnisse:
    Figure 00210001
  • Figure 00220001
    • Fluoreszenzpolarisations(FP)-Werte sind in mP angegeben.
  • Beispiel 9:
  • Fluoreszenzpolarisationsmessungen von MKK7-Aktivität (Zeitverlauf) in Nanocarrier-Platten (Lieferant: EVOTEC BioSystems AG, 1,2 μl Volumen):
  • Assaybedingungen (Endkonzentration):
    • 1. P1°-Substrat 100 μM, polyklonaler Antikörper NEB #9251 (1:20), ATP 20 μM, MgCl2 10 mM
    • 2. MKK7-Enzym: 0, 25, 50, 75, 100, 200, 350, 500 nM
    • 3. STOP-Lösung: EDTA 10 mM, P1*°-TAMRA (5 nM)
  • Stammlösungen:
    • 1. P1°-Substrat 125 μM, NEB-Antikörper (1:13,3), ATP 25 μM, MgCl2 12,5 mM
    • 2. MKK7-Enzym: 2500 nM
    • 3. STOP-Lösung EDTA 60 mM, P1-TAMRA 30 nM Lösungen 1.–3. in Hepes-Puffer, Pluronic 0,1%, BSA 0,01%.
  • Es zeigte sich, dass das bisphosphorylierte TAMRA-P1*°-Peptid (Ligand) durch den polyklonalen Antikörper gegen aktives JNK gebunden wird, welches als „hoch" oder „positive Kontrolle" bezeichnet wird. Bisphosphoryliertes Peptid P1*° kann als Konkurrent verwendet werden, was zu freiem markierten Liganden führt, als „niedrig" oder „negative Kontrolle" bezeichnet. Dies ist in 8 zu beobachten, wobei die FP-Werte in mP angegeben sind und die Balken den Zeitverlauf bei verschiedenen Enzymkonzentrationen darstellen.
  • Liste von Reagenzien des MKK7-Kinase-Assays:
  • Liste verwendeter JNK1-Peptide:
    • P1° H-Lys-Phe-Met-Met-Thr-Pro-pTyr-Val-Val-Thr-Arg-NH2
    • P1* H-Lys-Phe-Met-Met-pThr-Pro-Tyr-Val-Val-Thr-Arg-NH2
    • P1*° H-Lys-Phe-Met-Met-pThr-Pro-pTyr-Val-Val-Thr-Arg-NH2
    • TAMRA-P1*° 5-TAMRA-AEEA-Lys-Phe-Met-Met-pThr-Pro-pTyr-Val-Val-Thr-Arg-NH2
  • Ligand:
    • TAMRA-P1*°-Peptid: 5-TAMRA-AEEA-Lys-Phe-Met-Met-pThr-Pro-pTyr-Val-Val-Thr-Arg-NH2
    • Lieferant: EVOTEC BioSystems AG, Festphasen-Peptidsynthese HK-03-65-P1-13; M = 2089 g/mol; MALDI (2092,18)
    • 1 mM Stammlösung in 100% DMSO
    • Die Stammlösung sollte in Aligots von 10 μl aliquotiert und bei –20°C aufbewahrt werden.
    • 5 nM Arbeitslösung.
  • Konkurrent:
    • P1*°-Peptid: H-Lys-Phe-Met-Met-pThr-Pro-pTyr-Val-Val-Thr-Arg-NH2
    • Lieferant: EVOTEC BioSystems AG, Festphasen-Peptidsynthese HK-03-60-P1-7; M = 1532 g/mol; MALDI (1531,88)
    • 10 mM Stammlösung in 100 DMSO
    • Die Stammlösung sollte in 10 μl Aliquots aliquotiert und bei –20°C aufbewahrt werden.
    • 200 μM Arbeitslösung.
  • Substrat: MKK7-Kinase-Substrat
    • P1°-Peptid: H-Lys-Phe-Met-Met-Thr-Pro-pTyr-Val-Val-Thr-Arg-NH2
    • Lieferant: EVOTEC BioSystems AG, Festphasen-Peptidsynthese HK-03-59-HF; M = 1451 g/mol; MALDI (1453,57)
    • 10 mM Stammlösung in 100% DMSO
    • Die Stammlösung sollte in 10 μl Aliquots aliquotiert und bei –20°C aufbewahrt werden.
    • 100 μM Arbeitslösung.
  • Enzym:
    • MKK7-Kinase-Lieferant: Upstate Biotech, Katalog-Nr. 14-366, Lot Nr. 19105 und Nr. 20658.
    • Siehe Enzymaktivitätsspezifikationen auf dem jeweiligen Analysezertifikat.
    • Spezifische Aktivität: Etwa 20 Einheiten/mg bei maximaler Aktivierung.
    • 20 μg Enzym (9 μM) in 50 μl von 50 mM Tris-HCl, pH 7,5, 150 nM NaCl, 270 mM Sucrose, 0,1 mM EGTA, 0,1% 2-Mercaptoethanol, 0,03 Brij-35, 1 mM Benzamidin, 0,2 mM PMSF.
    • Die Stammlösung wurde bei –70°C gehalten. Einfrier- und Auftauzyklen wurden vermieden.
  • Für aktives SAPK1/JNK spezifischer Antikörper:
  • New England Biolabs, USA: NEB #9251
  • Polyklonaler Antikörper gegen aktives JNK, gereinigt mittels Affinitätschromatographie (Protein A) aus Kaninchenserum,
  • Konzentration: 0,02 mg/ml, äquivalent 130 nM. Lagerungspuf fer: 10 mM Hepes pH 7,5, 150 mM NaCl, 100 μg/ml BSA, 50% Glycerin, Lagerung bei –70°C. Die Stammlösung sollte in Aliquots von 10 μl aliquotiert und bei –20°C gelagert werden.
  • Arbeitslösung: 1:20-Verdünnung in 1× Assay-Puffer/0,1% Pluronic.
  • Reagenzien und Puffer:
  • Assay-Puffer:
    • 10× HEPES-Assay-Puffer, pH 7,5
    • 500 mM HEPES
    • 1 mM EGTA
    • 100 mM DTT
    • 62,5 mM NaCl
    • Lösen von 770 mg DTT (FLUKA, Katalog-Nr. 43815; MG 154,25 g/mol) [Endkonzentration 100 mM] in 30 ml Millipore-Wasser, Zugeben von 625 μl 5 M NaCl [Endkonzentration 62,5 mM], 19,02 mg EGTA (Merck Katalog-Nr. 1.06404; MG 380,35 g/mol) [Endkonzentration 1 mM] und 5,96 g HEPES (FLUKA Katalog-Nr. 54457) [Endkonzentration 500 mM] und Einstellen des pH-Werts mit 1 M NaOH auf pH 7,5. Auffüllen auf 50 ml mit Millipore-Wasser. Der Puffer wurde steril filtriert (0,22 μm), auf 1,5 ml aliquotiert und bei –20°C gelagert.
    • 1 M MgCl2:
    • Lösen von 10,2 g MgCl2. 6H2O (FLUKA, Katalog-Nr. 63068) in 50 ml Millipore-Wasser. Der Puffer wurde filtriert (0,42 μm) und kann mehrere Monate lang bei 4°C gelagert werden.
    • 1% (Gew./Vol.) Pluronic F-127
    • Lösen von 0,5 g Pluronic (Sigma, Katalog-Nr. P-2443) in 50 ml Millipore-Wasser. Sanftes Rühren, um eine klare Lösung zu erhalten. Die Lösung wurde filtriert (0,42 μm) und kann mehrere Monate lang bei 4°C gelagert werden.
    • 1× HEPES-Assay-Puffer/0,1% Pluronic, pH 7,5: (15 ml):
    • 50 mM HEPES
    • 0,1 mM EGTA
    • 10 mM DTT
    • 0,1% Pluronic
    • Zugeben von 1,5 ml 1%-igem (Gew./Vol.) Pluronic F-127 in Wasser und 1,5 ml 10× HEPES-Assay-Puffer, pH 7,5 auf 12 ml Millipore-Wasser. Rühren der Mischung und Überprüfen des pH-Werts. Die Mischung konnte 1–2 Wochen lang bei 4°C gelagert werden.
    • 0,5 M EDTA (50ml):
    • Lösen von 9,309 g EDTA (Roche Molecular Biochemicals, Katalog-Nr. 808288) in 40 ml Millipore-Wasser und Einstellung des pH-Werts auf 8–9 mit 10 M NaOH, um eine klare Lösung zu erhalten. Auffüllen bis 50 ml mit Millipore-Wasser. Der Puffer wurde filtriert (0,42 μm) und kann mehrere Monate lang bei 4°C gelagert werden.
    • 10 mM ATP (15 ml):
    • Lösen von 9,1 mg ATP (Roche Molecular Biochemicals, Katalog-Nr. 126888) in 1,5 ml 1× HEPES-Assay-Puffer/0,1% Pluronic, pH 7,5. Die Lösung wurde filtriert (0,42 μm) und kann zwei Wochen lang bei –20°C gelagert werden.
    • DMSO: 100%-iges DMSO
    • Das Lösungsmittel wurde von SIGMA (Katalog-Nr. P-2650) bezogen und steril filtriert.

Claims (28)

  1. Verfahren zum Nachweis von Threonin- oder Serinkinase-Aktivität in einem Immunoassay, umfassend die folgenden Schritte: a) Bereitstellung eines Proteins oder Peptids, umfassend das Sequenzmotiv -Z-X-Y- oder -Y-X-Z- worin Z = Threonin oder Serin X = eine Sequenz von Aminosäuren zwischen 1 und 1000 Aminosäuren, welche gleich oder verschieden sein können, Y = Tyrosin, Threonin oder Serin als Substrat für Threonin- oder Serinkinase, wobei das Protein oder Peptid an der Y-Position vorphosphoryliert ist; b) Inkubation des Proteins oder Peptids mit einem Phosphatdonor und einer Threonin- oder Serinkinase, um ein Protein oder Peptid zu bilden, welches an den Positionen Y und Z phosphoryliert ist; c) Zugabe eines Antikörpers, der eine Spezifität für ein Peptid oder Protein aufweist, das an der Y- und Z-Position phosphoryliert ist; und d) Nachweis der Threonin- oder Serinkinase-Aktivität.
  2. Verfahren nach Anspruch 1, wobei der Phosphatdonor ATP, GTP oder ein synthetisches Kosubstrat ist.
  3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, wobei der Immunoassay als ein Immunoassay mit direkter Bindung, vorzugsweise ein homogener Immunoassay mit direkter Bindung, durchgeführt wird.
  4. Verfahren nach Anspruch 3, wobei ein markiertes Peptid oder Protein als Substrat verwendet wird.
  5. Verfahren nach Anspruch 3, wobei ein markierter Antikörper verwendet wird.
  6. Verfahren nach Anspruch 4 oder 5, wobei das Peptid/Protein oder der Antikörper mit einer Lumineszenzmarkierung, einem radioaktiven Marker, einem Reporterenzym oder einem Affinitätsliganden markiert ist.
  7. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, wobei der Immunoassay als ein Immunoassay mit indirekter Bindung, vorzugsweise ein homogener Immunoassay mit indirekter Bindung, durchgeführt wird.
  8. Verfahren nach Anspruch 7, wobei ein markierter Ligand, der an seiner Y- und Z-Position phosphoryliert ist, (bisphosphorylierter Ligand) zugegeben wird, um mit dem Protein oder Peptid, welches an seiner Y- und Z-Position phosphoryliert ist, (bisphosphoryliertes Protein oder Peptid) um die Bindung an den Antikörper zu konkurrieren.
  9. Verfahren nach Anspruch 8, wobei der bisphosphorylierte Ligand mit einer Lumineszenzmarkierung, einem radioaktiven Marker, einem Reporterenzym oder einem Affinitätsliganden markiert ist.
  10. Verfahren nach Anspruch 9, wobei der Ligand Lys-Phe-Met-Met-pThr-Pro-pTyr-Val-Val-Thr-Arg-NH2 umfasst.
  11. Verfahren nach mindestens einem der Ansprüche 1 bis 10, wobei der Assay als ein Fluoreszenzimmunoassay, insbesondere ein Fluoreszenzpolarisationimmunoassay, ein Fluoreszenzkorre- lationsspektroskopie-Assay, ein Fluoreszenzresonanzenergietransfer-Assay oder ein Fluoreszenzintensitätsverteilungs-Assay, durchgeführt wird.
  12. Verfahren nach mindestens einem der Ansprüche 1 bis 11, wobei X in dem Sequenzmotiv Prolin oder Glutamat oder Glycin umfasst.
  13. Verfahren nach mindestens einem der Ansprüche 1 bis 12, wobei das bereitgestellte Protein ein JNK1-, JNK2- oder JNK3-Protein ist.
  14. Verfahren nach mindestens einem der Ansprüche 1 bis 12, wobei das bereitgestellte Peptid Sequenzen einschließt, welche mit denjenigen der Schleife der aktiven Stelle von JNK1, JNK2 oder JNK3 identisch sind.
  15. Verfahren nach den Ansprüchen 1 bis 12, wobei das Peptid die Aminosäuresequenz H-Lys-Phe-Met-Met-Thr-Pro-pTyr-Val-Val-Thr-Arg-NH2 (p bedeutet phosphoryliert) umfasst.
  16. Verfahren nach den Ansprüchen 1 bis 12, wobei das Peptid aus der Aminosäuresequenz H-Lys-Phe-Met-Met-Thr-Pro-pTyr-Val-Val-Thr-Arg-NH2 (p bedeutet phosphoryliert) besteht.
  17. Verfahren nach mindestens einem der Ansprüche 1 bis 16, wobei die Inkubation des Proteins oder Peptids in Gegenwart einer Threoninkinase durchgeführt wird.
  18. Verfahren nach Anspruch 17, wobei die Threoninkinase eine mitogenaktivierte Proteinkinasekinase (MKK) (auch als stressaktivierte Proteinkinasekinase, SKK, bezeichnet) ist.
  19. Verfahren nach Anspruch 18, wobei die Kinase MKK7 (auch als SKK4 bezeichnet) ist.
  20. Verfahren nach mindestens einem der Ansprüche 1 bis 19, wobei der Antikörper ein monoklonaler oder polyklonaler Antikörper ist.
  21. Verfahren nach Anspruch 20, wobei der Antikörper ein polyklonaler Antikörper ist.
  22. Verfahren nach Anspruch 21, wobei der Antikörper ein polyklonaler Antikörper ist, welcher für bisphosphoryliertes, insbesondere aktives JNK spezifisch ist.
  23. Verfahren nach mindestens einem der Ansprüche 1 bis 22, wobei die Schritte a) bis d) sequenziell durchgeführt werden.
  24. Kit zum Nachweis von Threonin- oder Serinkinase-Aktivität in einem Immunoassay, umfassend die folgenden Komponenten: – ein Substrat wie in Anspruch 1 definiert; – einen Antikörper wie in Anspruch 1 definiert.
  25. Kit nach Anspruch 24, ferner umfassend eine Threonin- oder Serinkinase und/oder Reaktionspuffer, die einen Phosphatdonor, vorzugsweise ATP, einschließen.
  26. Kit nach Anspruch 24 oder 25, ferner umfassend einen markierten Liganden, vorzugsweise einen lumineszenzmarkierten Liganden, wobei der Ligand das folgende Sequenzmotiv -Z-X-Y- oder -Y-X-Z- umfasst, worin Z = Threonin oder Serin X = eine Sequenz von Aminosäuren zwischen 1 und 1000 Aminosäuren, welche gleich oder verschieden sein können, Y = Tyrosin, Threonin oder Serin, wobei der Protein- oder Peptid-Ligand an den Z- und Y-Positionen phosphoryliert ist.
  27. Markierter Ligand zur Verwendung in einem Serinkinase/Threoninkinase-Assay, umfassend das Sequenzmotiv nach Anspruch 26.
  28. Verwendung des Assay-Verfahrens nach mindestens einem der Ansprüche 1 bis 23 oder des Kits nach den Ansprüchen 24 bis 26 oder des Liganden nach Anspruch 27 zum Screenen hinsichtlich von Modulatoren von Threonin- oder Serinkinase-Aktivität, insbesondere Inhibitoren für eine Threonin- oder Serinkinase, oder zum Nachweis neuer Threonin- oder Serinkinasen.
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