DE60010086T2

DE60010086T2 - Verfahren zur Auffindung von Dephosphorylierung phosphorylierte Threonin oder Serin durch Phosphataseaktivität

Info

Publication number: DE60010086T2
Application number: DE60010086T
Authority: DE
Inventors: Dr. Joachim Krämer; Christiane Peiker; Dr. Karsten Henco
Original assignee: Evotec OAI AG
Current assignee: Evotec OAI AG
Priority date: 2000-10-18
Filing date: 2000-10-18
Publication date: 2005-04-28
Anticipated expiration: 2020-10-19
Also published as: EP1199370B1; EP1199370A1; DE60010086D1; ATE264921T1

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zum Nachweis der Dephosphorylierung von Phosphoserin oder Phosphothreonin (im Folgenden auch "Phosphoserin/threonin") durch die Aktivität einer Phosphatase in einem Immunoassay. Die Erfindung betrifft ferner einen Kit zur Durchführung des Assays und einen lumineszenzmarkierten Liganden.
Reversible Protein-Phosphorylierung ist eine wichtige Weise der Regulierung zellulärer Prozesse. Es ist nun klar, dass Proteinphosphatasen im Vergleich zu Proteinkinasen eine gleichermaßen integrale Rolle bei der Steuerung zellulärer Phosphoproteine spielen. Die gleichzeitige Steuerung von Kinasen und Phosphatasen bietet der Zelle die Möglichkeit, Proteine schnell von ihrem phosphorylierten zum dephosphorylierten Zustand zu verändern, um variierenden physiologischen Bedürfnissen zu entsprechen.
Proteinphosphatasen sind eine diverse Gruppe von Proteinen, welche nach ihrer Substratspezifität in zwei Hauptfamilien klassifiziert werden können: Serin/Threoninphosphatasen, welche Phosphoserin/threoninreste dephosphorylieren und Tyrosinphosphatasen, welche Phosphotyrosinreste dephosphorylieren. Eine dritte Gruppe, Proteinphosphatasen mit zweifacher Spezifität, welche sowohl Phosphoserin/threonin- als auch Phosphotyrosinreste dephosphorylieren können, gehört tatsächlich zu der Tyrosinphosphatasefamilie.
Die molekulare Klonierung hat viele Serin/Threonin-Proteinphosphatasen identifiziert. PP1 (oder Phosphatase vom Typ 1) und PP2A machen mehr als 90% der Serin/Threonin phosphatase-Aktivität in Säugerzellen aus. PP1-Phosphatasen regulieren ein breites Spektrum zellulärer Prozesse, einschließlich Zellzyklus-Progression, Zellproliferation, Proteinsynthese, transkriptionaler Regulation und Neurotransmission. PP1 ist die hauptsächliche Phosphatase, welche den Glycogen-Metabolismus als Reaktion auf Insulin und Adrenalin reguliert. Es wird angenommen, dass PP2A eine Funktion als Tumorsuppressor hat.
Bisher wurden mehrere Phosphatasen mit zweifacher Spezifität in Säugerzellen identifiziert. Beispielsweise ist gezeigt worden, dass CL100/3CH134 Threonin- und Tyrosinreste von durch ein extrazelluläres Signal regulierten Kinasen (ERK) dephosphoryliert und somit zur Kinase-Inaktivierung führt. Nach der ersten Klonierung von CL100/3CH134 wurden weitere Phosphatasen mit zweifacher Spezifität identifiziert. Diese schließen unter anderem PAC1, hVH-2/MKP-2, hVH-3/B23 ein. Diese Phosphatasen mit zweifacher Spezifität scheinen alle bei der Vermittlung der Inaktivierung von Mitogen-aktivierten Proteinkinasen (MAP) wirksam zu sein (Camps, M., et al., The FASEB Journal, 14, 6–16, 2000).
Der Nachweis der Aktivität von Proteinphosphatasen wäre von Nutzen für das Hochdurchsatz-Screening chemischer Banken. Modulatoren von Phosphatase-Aktivität könnten schließlich zu Arzneiwirkstoffen zur Behandlung von beispielsweise Parkinson-Krankheit, Krebs oder Diabetis mellitus und anderen Stoffwechselstörungen entwickelt werden. Ein Überblick bekannter Proteinphosphatase-Inhibitoren wird von C. J. Oliver und S. Shenolikar (Frontiers in Bioscience 3, d961–972, 1. September 1998) gegeben.
Bei einem im Handel erhältlichen Phosphatase-Assay wird die Freisetzung von Phosphat von Serin oder Threonin durch eine Extinktionsänderung unter Verwendung von Malachitgrün als Indikator nachgewiesen (Upstate Biotechnology, U.S.A., Katalog Nr. 14-110 und Nr. 14-111). Ein Assay-Prinzip, basierend auf der Absorptionsfähigkeit des Molybdat:Malachitgrün: Phosphat-Komplexes, wurde ebenfalls in EP 0 874 052 offenbart. Das Malachitgrün-Assay-Prinzip ist eine zeitraubende mehrstufige Prozedur und hochempfindlich gegenüber Phosphatverunreinigungen. Deshalb müssen die verschiedenen Komponenten des Phosphatase-Assays vor dem Versuch sorgfältig gereinigt werden.
Bei einem weiteren herkömmlichen Ansatz wird Radioaktivität eingesetzt, um die Dephosphorylierung von Phosphoserin oder Phosphothreonin durch die Aktivität einer Phosphatase durch die Freisetzung von ³²P aus dem Substratpeptid oder -protein nachzuweisen (Current Protocols in Molecular Biology, Unit 18.2, John Wiley & Sons). Es gibt jedoch aufgrund von Problemen mit Kosten, Sicherheit, Entsorgung und Lagerbeständigkeit der Ligand-Reagenzien ein wachsendes Bedürfnis von der Verwendung von Radioaktivität in Assay-Anwendungen wegzukommen.
Im Gegensatz zur Dephosphorylierung von Tyrosin wurde die Entwicklung von vorzugsweise homogenen Assays zum Nachweis der Dephosphorylierung von Phosphoserin/threonin durch Phosphatasen bisher durch das Fehlen von verfügbaren Anti-Phosphoserin/Phosphothreonin-Antikörpern, welche spezifisch und mit hoher Affinität an Phosphoserin- oder Phosphothreoninreste binden, behindert.
Es war deshalb eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung, ein Assay-Verfahren zum Nachweis der Dephosphorylierung von Phosphoserin oder Phosphothreonin durch Phosphatasen zu etablieren. Das Assay-Verfahren ist sehr zuverlässig und einfach durchzuführen, ohne die Notwendigkeit zur Entwicklung spezi fischer Anti-Phosphoserin/Phosphothreonin-Antikörper mit hoher Affinität.
Diese Aufgabe wurde mit dem Assay-Verfahren gemäß den Merkmalen von Anspruch 1 gelöst.
Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zum Nachweis der Dephosphorylierung von Phosphoserin/threonin durch Phosphatase-Aktivität in einem Immunoassay, welches die folgenden Schritte umfasst:

a) Bereitstellung eines Proteins oder Peptids, umfassend das Sequenzmotiv -Z-X-Y- oder -Y-X-Z- worin Z = Serin oder Threonin X = eine Sequenz von zwischen 1 und 10 Aminosäuren, welche gleich oder verschieden sein können, Y = Tyrosin, Serin oder Threonin, als Substrat für die Phosphatase, wobei das Protein oder Peptid an den Y- und Z-Positionen vorphosphoryliert ist;
b) Inkubation des Proteins oder Peptids mit der Phosphatase zur Bildung eines Proteins oder Peptids, das an der Z-Position dephosphoryliert ist;
c) Zugabe eines Antikörpers mit einer Spezifität für das Peptid oder Protein, das an der Y- und Z-Position phosphoryliert ist; und
d) Nachweis der Phosphatase-Aktivität.

Durch Nachweis der Anwesenheit, Abwesenheit oder Menge eines Komplexes zwischen bisphosphoryliertem Protein/Peptid und Antikörper kann eine Phosphatase-Aktivität gemessen werden.
Die Unteransprüche definieren bevorzugte Ausführungsformen des Verfahrens der vorliegenden Erfindung.
In dem Sequenzmotiv kann jede Aminosäure oder Sequenz von Aminosäuren (X) zwischen Z und Y inseriert werden. Die Anzahl der Aminosäuren liegt im Bereich von 1 bis 10 Aminosäuren. Ein Bereich von 1 bis 10 reicht aus, um sowohl lineare als auch Konformations-Antikörperepitope einzuschließen. X ist insbesondere mindestens eine Aminosäure, wobei irgendwelche anderen kurzen Aminosäuresequenzen mit mindestens zwei Aminosäuren, z.B. Oligopeptide, ebenfalls eingeschlossen sind. Beispielsweise ist X Prolin oder Glutamat oder Glycin.
Der verwendete Antikörper ist gewöhnlich ein monoklonaler oder polyklonaler Antikörper.
Es ist gezeigt worden, dass ein besonders bevorzugter Antikörper ein polyklonaler Antikörper ist, beispielsweise ein polyklonaler Antikörper, der für aktiviertes JNK spezifisch ist. Es wurde festgestellt, dass der Antikörper spezifisch einen phosphorylierten Threonin- oder Serinrest an der Z-Position in sowohl einem synthetischen Substratpeptid als auch aktiviertem JNK erkennt. Solche Antikörper sind im Handel erhältlich.
Der Immunoassay der vorliegenden Erfindung kann als Immunoassay mit direkter Bindung, vorzugsweise als homogener Immunoassay mit direkter Bindung, durchgeführt werden.
Ein homogener Immunoassay mit direkter Bindung basiert auf einem Prinzip von Mischen und Messen. Dies ist sehr vorteilhaft gegenüber den herkömmlichen Assays mit direkter Bindung, die immer komplizierte Trennungsschritte der Assay-Komponenten vor dem Nachweis erfordern.
Bei dem Immunoassay mit direkter Bindung wird ein markiertes Peptid oder Protein oder ein markierter Antikörper verwendet. Die Markierung kann nach herkömmlichen Standardtechniken durchgeführt werden. Vorzugsweise wird das Peptid/Protein oder der Antikörper unter Verwendung einer lumineszenten oder radioaktiven Markierung oder unter Verwendung spezifischer markierender Moleküle, wie z.B. eines Reporterenzyms oder eines Affinitätsliganden, markiert.
Der Assay der vorliegenden Erfindung kann auch als Konkurrenz-Immunoassay, vorzugsweise ein homogener Immunoassay mit indirekter Bindung, durchgeführt werden. Ein homogener Immunoassay mit indirekter Bindung basiert ebenfalls auf dem Prinzip von Mischen und Messen.
Bei diesem Immunoassay mit indirekter Bindung wird ein markierter bisphosphorylierter Ligand zugegeben, um mit dem bisphosphorylierten Peptid oder Protein um die Bindung an den Antikörper zu konkurrieren. Der Ligand wird vorzugsweise unter Verwendung einer lumineszenten oder radioaktiven Markierung oder unter Verwendung spezifischer markierender Moleküle, wie z.B. eines Reporterenzyms oder eines Affinitätsliganden, markiert.
Im Falle der Verwendung eines Proteins, welches das obige Motiv enthält, kann jedes Protein, dass das Motiv enthält, verwendet werden. Beispielsweise wird ein Protein wie das JNK-Protein eingesetzt, welches die c-Jun-N-terminale Kinase ist und in der Literatur als auch stressaktivierte Proteinkinase 1 (SAPK1) bekannt ist.
Wenn es günstiger ist, ein Peptidsubstrat zu verwenden, ist die Peptidsequenz vorzugsweise aus der Schleife der aktiven Stelle ausgewählt, z.B. für PP1 oder PP2A aus der aktiven Stelle von JNK1/2/3. Beispielsweise umfasst das Peptid für PP1 oder PP2A die Aminosäuresequenz H-Lys-Phe-Met-Met-pThr-Pro-pTyr-Val-Val-Thr-Arg-NH₂, worin p phosphoryliert bedeutet, oder besteht daraus.
Wenn die Inkubation des Proteins oder Peptids in Gegenwart einer Serin- oder Threoninphosphatase durchgeführt wird, ist die Phosphatase vorzugsweise eine Serin/Threonin-Proteinphosphatase vom Typ 2A (PP2A) oder Typ 2B (PP2B). In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform könnte die Inkubation unter Verwendung von PP1, PP4 (auch als PPX bezeichnet) oder PP6 (auch als PPV bezeichnet) als Phosphatase durchgeführt werden.
Es ist jedoch auch möglich, den Assay unter Verwendung einer Tyrosinphosphatase mit zweifacher Spezifität durchzuführen. Beispiele für solche Phosphatasen umfassen CL100/3CH134, PAC1, hVH-2/MKP-2, hVH-3/B23, hVH-5, MKP-3/PYST1, B59, MKP-4 und MKP-5.
Die vorliegende Erfindung betrifft auch einen Kit zum Nachweis von Phosphatase-Aktivität in einem Immunoassay, welcher die folgenden Komponenten umfasst:

– eine Phosphatase;
– ein bisphosphoryliertes Substrat, d.h. ein Protein oder Peptid, umfassend das Sequenzmotiv Z-X-Y oder -Y-X-Z worin Z = Serin oder Threonin X = eine Sequenz zwischen 1 und 10 Aminosäuren, welche gleich oder verschieden sein können, Y = Tyrosin, Serin oder Threonin als Substrat für die Phosphatase, wobei das Protein oder Peptid an den Y- und Z-Positionen vorphosphoryliert ist;
– einen Antikörper mit einer Spezifität für das Peptid oder Protein, das an der Y- und Z-Position phosphoryliert ist.

Der Kit kann ferner einen nachweisbaren Liganden umfassen, vorzugsweise einen lumineszenzmarkierten Liganden, welcher das Sequenzmotiv -Z-X-Y oder -Y-X-Z umfasst, worin
Z = Serin oder Threonin
X = eine Sequenz zwischen 1 und 10 Aminosäuren, welche gleich oder verschieden sein können,
Y = Tyrosin, Serin oder Threonin
wobei der Protein- oder Peptidligand an den X- und Z-Positionen phosphoryliert ist.
Von den verfügbaren Phosphatasen kann die in dem Kit der Erfindung enthaltene Phosphatase eine Serin- oder Threoninphosphatase sein. Es ist auch möglich, eine Tyrosinphosphatase mit zweifacher Spezifität einzusetzen. Beispiele der Serin- oder Threoninphosphatase sowie der Tyrosinphosphatase mit zweifacher Spezifität sind oben beschrieben.
Die vorliegende Erfindung betrifft auch einen nachweisbaren Liganden, vorzugsweise einen lumineszenzmarkierten Liganden, wobei der Ligand das folgende Sequenzmotiv umfasst• -Z-X-Y oder -Y-X-Z worin
Z = Serin oder Threonin
X = eine Sequenz zwischen 1 und 10 Aminosäuren, welche gleich oder verschieden sein können,
Y = Tyrosin, Serin oder Threonin
wobei der Protein- oder Peptidligand an den X- und Z-Positionen phosphoryliert ist.
Das Verfahren der vorliegenden Erfindung sowie der Kit und der markierte Ligand können zum Screenen hinsichtlich spezifischer Modulatoren von Serin- oder Threoninphosphatase-Aktivität oder Phosphatase-Aktivität mit zweifacher Spezifität eingesetzt werden. Der Assay ist insbesondere geeignet zum Screenen von Verbindungsbanken, um Moleküle festzustellen, welche Phosphatasen inhibieren oder aktivieren. Diese Moleküle können aussichtsreiche Kandidaten zur Entwicklung von Arzneiwirkstoffen sein, welche zur Behandlung von z.B. Stoffwechselstörungen und Krebs verwendet werden.
Die Begleitzeichnungen veranschaulichen die vorliegende Erfindung. Abkürzungen für die beschriebenen Peptide sind wie folgt:
In den Figuren ist folgendes gezeigt:
1 ist eine schematische Zeichnung einer bevorzugten Ausführungsform des Prinzips des direkten Phospha tase-Assays der vorliegenden Erfindung: Das TAMRA-P1°*-Substrat mit der Aminosäuresequenz 5-TAMRA-AEEA-Lys-Phe-Met-Met-pThr-Pro-pTyr-Val-Val-Thr-Arg-NH₂ (p bedeutet phosphoryliert) wird an dem Threoninrest in Gegenwart der Phosphatase dephosphoryliert. Nach der Dephosphorylierung wird das TAMRA-markierte P1°*-Peptide nicht mehr an den polyklonalen, gegen aktives JNK gerichteten Antikörper binden.
2 ist ein Diagramm, welches die spezifische Bindung des polyklonalen, gegen aktives JNK gerichteten Antikörpers an TAMRA-markiertes P1°*-Peptid zeigt; als Kontrolle wird keine Bindung für TAMRA-markiertes P1°-Peptid gemessen.
3 ist ein Diagramm, welche die Konkurrenz der Bindung des polyklonalen JNK-Antikörpers an das TAMRA-markierte P1°*-Peptid unter Verwendung von zweifach phosphoryliertem P1°*-Peptid (Bestimmung des IC₅₀-Werts für den P1°*-Peptid-Kompetitor) und, als Kontrollen, monophosphorylierten P1°- und P1*-Peptiden zeigt.
4 ist ein Diagramm eines direkten Phosphatase-Assays (siehe 1), das den Zeitverlauf der Dephosphorylierung des TAMRA-P1°*-Peptids bei verschiedenen PP2A-Phosphatase-Konzentrationen zeigt. Dephosphoryliertes TAMRA-P1°*-Peptid bindet nicht an den polyklonalen, gegen aktives JNK gerichteten Antikörper, was zu einer niedrigen Fluoreszenzpolarisation führt.
5 ist ein Diagramm eines direkten Phosphatase-Assays (siehe 1), das den Zeitverlauf der Dephosphorylierung des TAMRA-P1°*-Peptids bei verschiedenen PP1-Phosphatasekonzentrationen zeigt. Dephosphoryliertes TAMRA-P1°*-Peptid bindet nicht an den polyklonalen, gegen aktives JNK gerichteten Antikörper, was zu niedriger Fluoreszenzpolarisation führt.
6 ist ein Diagramm eines direkten Phosphatase-Assays (siehe 1), welches die Inhibierung der Dephosphorylierung des TAMRA-P1°*-Peptids durch PP2A-Phosphatase bei verschiedenen Konzentrationen von Mikrocystin-LR (Phosphatase-Inhibitor) zeigt. Dephosphoryliertes TAMRA-P1°*-Peptid bindet nicht an den polyklonalen, gegen aktives JNK gerichteten Antikörper, was zu niedriger Fluoreszenzpolarisation führt.
7 ist ein Diagramm, welches die Inhibierung der PP2A-abhängigen Dephosphorylierung des TAMRA-P1°*-Peptid-Substrats durch den Phosphatase-Inhibitor Mikrocystin-LR zeigt. Aus der Inhibierungskurve wird die halb-maximale Inhibierungskonzentration (IC₅₀) berechnet.
8 ist ein Diagramm, welches die Inhibierung der PP2A-abhängigen Dephosphorylierung des TAMRA-P1°*-Peptid-Substrats durch den Phosphatase-Inhibitor Okadainsäure zeigt. Aus der Inhibierungskurve wird die halb-maximale Inhibierungskonzentration (IC₅₀) berechnet.
9 ist ein Diagramm eines direkten Phosphatase-Assays (siehe 1), welches den Zeitverlauf der Dephosphorylierung des TAMRA-P1°*-Peptids durch PP1-Phosphatase zeigt, welche mit zwei verschiedenen Antikörpern nachgewiesen wird. Der gegen aktives JNK gerichtete polyklonale Antikörper weist die Dephosphorylierung des Phosphothreonins und/oder die Dephosphorylierung des Phosphotyrosins nach. Als Kontrolle weist der monoklonale Anti-Phosphotyrosin-Antikörper nur die Dephosphorylierung des Phosphotyrosins nach. Beide Ereignisse führen zu niedriger Fluoreszenzpolarisation. Die als "hoch" bezeichneten Kontrollen bedeuten maximale Bindung der Antikörper an das TAMRA-P1°*-Peptid. Die als "niedrig" bezeichneten Kontrollen bedeuten keine Bindung der Antikörper an das TAMRA-P1°*-Peptid aufgrund der Zugabe von 200 nM P1°*-Kompetitor-Peptid.
10 ist ein Diagramm eines direkten Phosphatase-Assays (siehe 1), welches den Zeitverlauf der Dephosphorylierung des TAMRA-P1°*-Peptids durch PP2A-Phosphatase zeigt, welche mit zwei verschiedenen Antikörpern nachgewiesen wird. Der polyklonale, gegen aktives JNK gerichtete Antikörper weist die Dephosphorylierung des Phosphothreonins und/oder die Dephosphorylierung des Phosphotyrosins nach. Der monoklonale Anti-Phosphotyrosin-Antikörper weist nur die Dephosphorylierung des Phosphotyrosins nach. Beide Ereignisse führen zu einer niedrigen Fluoreszenzpolarisation. Die als "hoch" bezeichneten Kontrollen bedeuten eine maximale Bindung der Antikörper an das TAMRA-P1°*-Peptid. Die als "niedrig" bezeichneten Kontrollen bedeuten kei ne Bindung der Antikörper an das TAMRA-P1°*-Peptid aufgrund der Zugabe von 200 nM P1°*-Kompetitor-Peptid.
11 ist eine schematische Zeichnung des Prinzips des indirekten Phosphatase-Assays der vorliegenden Erfindung. In einem ersten Schritt wird das bisphosphorylierte nicht-fluoreszente P1°*-Peptid durch die Aktivität einer Phosphatase dephosphoryliert. Das Produkt der Reaktion (dephosphoryliertes P1°*-Peptid) wird nicht mehr mit dem TAMRA-markierten P1°*-Peptid um die Bindung an den polyklonalen, gegen aktives JNK gerichteten Antikörper konkurrieren, welche beide in einem zweiten Schritt zugegeben werden (Stopp-Lösung einschließlich eines Reagenz, das die Phosphatase inaktiviert).
12 ist ein Diagramm eines indirekten Phosphatase-Assays (siehe 11), welches den Zeitverlauf der Dephosphorylierung des P1°*-Peptid-Substrats durch PP2A-Phosphatase bei verschiedenen P1°*-Peptid-Konzentrationen zeigt. Dephosphoryliertes P1°*-Peptid konkurriert nicht mehr mit dem TAMRA-markierten P1°*-Peptid um die Bindung an den polyklonalen, gegen aktives JNK gerichteten Antikörper, was zu hoher Fluoreszenzpolarisation führt. Die als "hoch" bezeichneten Kontrollen bedeuten eine maximale Bindung der Antikörper an das TAMRA-P1°*-Peptid. Die als "niedrig" bezeichneten Kontrollen bedeuten keine Bindung der Antikörper an das TAMRA-P1°*-Peptid aufgrund der Anwesenheit von 100 nM oder 500 nM P1°*-Substrat-Peptid.
Die folgenden Experimente erläutern die vorliegende Erfindung näher.
Beispiel 1:
Messung der Bindungsaffinität (KD) des gegen aktives JNK gerichteten Antikörpers (New England Biolabs NEB #9251)
Dieser polyklonale, anti-aktive Antikörper weist alle drei Isoformen der SAPK1/JNK-Proteine nur nach, wenn sie durch zweifache Phosphorylierung bei Threonin₁₈₃/Tyrosin₁₈₅ aktiviert sind. Die Bindung von polyklonalem, gegen aktives JNK gerichtetem Antikörper #9251 (Konzentration: 0,02 mg/ml, äquiv. 130 nM) an TAMRA-markiertes P1*°-Peptid (bei 5 nM) wurde bei verschiedenen Antikörperkonzentrationen durch Fluoreszenzpolarisation gemessen. Als Kontrolle wird keine Bindung des Antikörpers an das monophosphorylierte TAMRA-P1°-Peptid (bei 5 nM) nachgewiesen.
Affinität des polyklonalen, gegen aktives JNK gerichteten Antikörpers für das Peptid P1*°-TAMRA: K_D = 2,6 nM.
Die Ergebnisse dieses Experiments sind in 2 dargestellt. Es wurde festgestellt, dass die im Handel erhältlichen polyklonalen, gegen aktives JNK gerichteten spezifischen Antikörper für den Assay der vorliegenden Erfindung besonders von Nutzen sind. Wie in 2 ersichtlich, weist der polyklonale, gegen aktives JNK gerichtete Antikörper die Peptide – die von der Schleife der aktiven Stelle des JNK-Proteins abgeleitet sind – nur bei zweifacher Phosphorylierung bei Threonin₁₈₃ und Tyrosin₁₈₅ nach. Die Polarisationswerte erhöhen sich dramatisch, wenn das zweifach phosphorylierte TAMRA-P1*°-Peptid eingesetzt wird, im Gegensatz zu monophosphoryliertem markiertem TAMRA-P1°-Peptid (Sequenzen siehe oben).
Beispiel 2:
Bestimmung des IC₅₀-Werts für das Peptid P1°*:
Die Konkurrenz des NEB #9251-Antikörper-P1°*-TAMRA-Komplexes mit P1°*-Peptid wurde durch Fluoreszenzkorrelationsspektroskopie gemessen: Die Bindung des gegen aktives JNK gerichteten Antikörpers NEB #9251 (1:20 verdünnt) an TAMRA-markiertes Peptid P1*° (5 nM) wurde mit nicht-fluoreszierendem, zweifach phosphoryliertem Peptid P1*° in Konkurrenz gesetzt. Kontrollpeptide, monophosphoryliertes P1° und P1*, konkurrierten nicht effektiv. Peptid P1*°: IC₅₀ = 5,0 nM ± 3,3 nM.
Die Ergebnisse dieses Experiments sind in 3 dargestellt. In 3 ist die Bindung desselben polyklonalen anti-aktiven Antikörpers an TAMRA-markiertes Peptid P1*° (5 nM) in Konkurrenz mit den Peptiden P1° (monophosphoryliert, Sequenz siehe oben), Peptid P1* (mono-phosphoryliert, Sequenz siehe oben) oder Peptid P1*° (zweifach phosphoryliert, Sequenz siehe oben) dargestellt. Wie aus der Komplexbildung abgeleitet werden kann, ist nur bisphosphoryliertes P1*°-Peptid in der Lage, effektiv mit dem TAMRA-markierten P1*° (Peptidligand) um die Bindung an den Antikörper zu konkurrieren, während die anderen monophosphorylierten Peptide weniger als 50% des gebundenen Liganden verdrängen, selbst bei hohen Konzentrationen (bis zu 1 μM).
Beispiel 3:
Dephosphorylierung von TAMRA-P1°*-Peptid durch PP2A-Phosphatase
In 4 wird die Dephosphorylierungsgeschwindigkeit des P1°*-TAMRA-Substrat-Peptids durch PP2A-Phosphatase bei verschiedenen PP2A-Konzentrationen bestimmt. Eine effiziente Dephosphorylierung des P1°*-TAMRA-Substrat-Peptids unter Anwendung des direkten Phosphatase-Assays wird wie folgt durchgeführt: In einem Gesamtvolumen von 80 μl wird das P1°*-TAMRA-Substrat-Peptid (bei 10 nM) unter Verwendung von 0,1, 0,01 oder 0,001 Einheiten von PP2A dephosphoryliert. Die Phosphatasereaktionen werden bei 30°C inkubiert und Aliquots (20 μl) werden nach 0 min, 30 min, 60 min und 90 min entnommen und mit 10 μl einer Stopplösung gemischt, welche die folgenden Reagenzien (alles Endkonzentrationen) enthält: Wasserstoffperoxid 10 mM, polyklonaler, gegen aktives JNK gerichteter Antikörper aus NEB in einer Verdünnung von 1:20.
Das gebildete dephosphorylierte P1°*-TAMRA-Peptid-Produkt kann nachgewiesen werden, da es nicht an den polyklonalen, gegen aktives JNK gerichteten Antikörper bindet. Als Ergebnis wird eine Abnahme der Fluoreszenzpolarisation nachgewiesen, welche umgekehrt proportional zur PP2A-Phosphatase-Aktivität ist.
Beispiel 4:
Dephosphorylierung des TAMRA-P1°*-Peptids durch PP1-Phosphatase:
In 5 wird die Geschwindigkeit der Dephosphorylierung des P1°*-TAMRA-Substrat-Peptids durch PP1-Phosphase bei verschiedenen Konzentrationen nachgewiesen unter Anwendung desselben direkten Assays wie im Beispiel 3 beschrieben. Eine effiziente Dephosphorylierung des P1°*-TAMRA-Substrat-Peptids unter Verwendung des direkten Phosphatase-Assays wird wie folgt durchgeführt: In einem Gesamtvolumen von 80 μl wird das P1°*-TAMRA-Substrat-Peptid (bei 10 nM) unter Einsatz von 0,1, 0,01 oder 0,001 Einheiten PP1 dephosphoryliert. Die Phosphatasereaktionen werden bei 30°C inkubiert und Aliquots (20 μl) werden nach 0 min, 30 min, 60 min und 90 min entnommen und mit 10 μl einer Stopplösung gemischt, welche die folgenden Reagenzien (alle Endkonzentrationen) enthält: Wasserstoffperoxid 10 mM, polyklonaler, gegen aktives JNK gerichteter Antikörper aus NEB (1:20 Verdünnung). Das gebildete dephosphorylierte P1°*-TAMRA-Peptid-Produkt kann nachgewiesen werden, da es nicht an den polyklonalen, gegen aktives JNK gerichteten Antikörper bindet. Als Ergebnis wird eine Abnahme der Fluoreszenzpolarisation nachgewiesen, welche umgekehrt proportional zur PP1-Phosphatase-Aktivität ist.
Beispiel 5:
Inhibierung der PP2A-Phosphatase-abhängigen Dephosphorylierung des TAMRA-P1°*-Peptids durch Mikrocystin-LR:
In 6 wird die Inhibierung der Dephosphorylierung des P1°*-TAMRA-Substrat-Peptids durch PP2A-Phosphatase für den Phosphatase-Inhibitor Mikrocystin-LR nachgewiesen. Die Inhibierung von PP2A-Phosphatase wird unter Anwendung desselben direkten Assays wie in Beispiel 3 beschrieben nachgewiesen. Als Ergebnis wird keine Verringerung der Bindung des TAMRA-markierten P1*°-Peptids an den polyklonalen, gegen aktives JNK gerichteten Antikörper bei hohen Mikrocystin-LR-Konzentrationen aufgrund einer vollständigen Inhibierung von PP2A nachgewiesen.
Assay-Bedingungen: PP2A-Phosphatase (0,004 Einheiten) wird mit P1°*-TAMRA-Peptid (10 nM) und Mikrocystin-LR (0, 0,01, 0,1, 0,2, 0,4, 0,8, 2 nM) in einem Gesamtvolumen von 100 μl bei 30°C inkubiert. Zu verschiedenen Zeitpunkten werden Aliquots aus der Enzymreaktion entnommen. und mit Wasserstoffperoxid (10 nM), polyklonalem, gegen aktives JNK gerichtetem Antikörper aus NEB #9251 (1:20 Verdünnung) gemischt.
Beispiel 6:
Inhibierung der PP2A-Phosphatase-abhängigen Dephosphorylierung des TAMRA-P1°*-Peptids durch Mikrocystin-LR:
7 zeigt die Inhibierung der Dephosphorylierung des P1°*-TAMRA-Substrat-Peptids durch PP2A-Phosphatase unter Einsatz des Phosphatase-Inhibitors Mikrocystin-LR. Die halb-maximale Inhibierungskonzentration (IC₅₀) für Mikrocystin-LR wird anhand der Daten von 6 berechnet: IC₅₀ = 0,26 nM +/– 0,04 nM.
Beispiel 7:
Inhibierung der PP2A-Phosphatase-abhängigen Dephosphorylierung des TAMRA-P1°*-Peptids durch Okadainsäure:
8 zeigt die Inhibierung der Dephosphorylierung des P1°*-TAMRA-Substrat-Peptids durch PP2A-Phosphatase unter Verwendung des Phosphatase-Inhibitors Okadainsäure. Die halbmaximale Inhibierungskonzentration (IC₅₀) für Okadainsäure wird berechnet: IC₅₀ = 0,3 nM +/– 0,02 nM.
Assay-Bedingungen: PP2A-Phosphatase (0,003 Einheiten) wird mit P1°*-TAMRA-Peptid (10 nM) und Okadainsäure (0, 0,001, 0,01, 0,1, 0,2, 0,4, 0,8, 2, 10 nM) bei 30°C inkubiert. Zu verschiedenen Zeitpunkten werden Aliquots aus der Enzymreaktion entnommen und mit Wasserstoffperoxid (10 nM), polyklonalem, gegen aktives JNK gerichtetem Antikörper aus NEB #9251 (1:20 Verdünnung) gemischt.
Beispiel 8:
Messung der Spezifität von PP1-Phosphatase unter Verwendung zweier verschiedener Antikörper:
9 zeigt den Nachweis der PP1-Phosphatase-abhängigen Dephosphorylierung von TAMRA-P1°*-Peptid unter Verwendung des polyklonalen, gegen aktives JNK gerichteten Antikörpers (NEB #9251) und des monoklonalen Anti-Phosphotyrosin-Antikörpers (NEB #9411). Die Dephosphorylierung des TAMRA-P1°*-Peptids durch PP1-Phosphatase wird mit Hilfe desselben direkten Assays wie in 5 beschrieben durchgeführt, mit der einzigen Ausnahme, dass zwei Antikörper mit unterschiedlichen Spezifitäten für die Anzeige verwendet wurden.
Als Folge wird eine PP1-Phosphatase-abhängige Dephosphorylierung des Phosphothreonins und des Phosphotyrosins nachgewiesen. PP1 hat eine niedrigere Spezifität im Vergleich zu PP2A (siehe Beispiel 9).
Assay-Bedingungen: PP1-Phosphatase (0,1 Einheiten) wird mit P1°*-TAMRA-Peptid (10 nM) bei 30°C inkubiert. Zu verschiedenen Zeitpunkten werden Aliquots aus der Enzymreaktion entnommen und mit der Stopplösung gemischt, die Wasserstoffperoxid (10 nM) zusammen mit entweder dem polyklonalen, gegen aktives JNK gerichteten Antikörper aus NEB #9251 (1:20 Verdünnung) oder dem monoklonalen Anti-Phosphotyrosin-Antikörper aus NEB #9411 (Verdünnung 1:100) enthält.
Beispiel 9:
Messung der Spezifität von PP2A-Phosphatase unter Verwendung zweier verschiedener Antikörper:
10 zeigt den Nachweis der PP2A-Phosphatase-abhängigen Dephosphorylierung von TAMRA-P1°*-Peptid unter Verwendung des polyklonalen, gegen aktives JNK gerichteten Antikörpers (NEB #9251) und des monoklonalen Anti-Phosphotyrosin-Antikörpers NEB #9411. Die Dephosphorylierung des TAMRA-P1°*-Peptids durch PP2A-Phosphatase wird unter Anwendung desselben direk ten Assays wie in 5 beschrieben durchgeführt, mit der einzigen Ausnahme, dass zwei Antikörper mit unterschiedlichen Spezifitäten für die Anzeige verwendet wurden. Als Folge wird eine PP2A-Phosphatase-abhängige Dephosphorylierung des Phosphothreonins nachgewiesen. PP2A besitzt eine hohe Spezifität für Phosphothreonin.
Assay-Bedingungen: PP2A-Phosphatase (0,006 Einheiten) wird mit P1°*-TAMRA-Peptid (10 nM) bei 30°C inkubiert. Zu verschiedenen Zeitpunkten werden Aliquots aus der Enzymreaktion entnommen und mit der Stopplösung gemischt, die Wasserstoffperoxid (10 nM) zusammen mit entweder dem polyklonalen, gegen aktives JNK gerichteten Antikörper aus NEB #9251 (Verdünnung 1:20) oder dem monoklonalen Anti-Phosphotyrosin-Antikörper aus NEB #9411 (1:100 Verdünnung) enthält.
Beispiel 10:
Dephosphorylierung von nicht-fluoreszentem P1°*-Peptid durch PP2A-Phosphatase (indirekter Phosphatase-Assay, siehe 11)
12 zeigt den Nachweis der PP2A-Phosphatase-abhängigen Dephosphorylierung des P1°*-Substrat-Peptids in einem indirekten Phosphatase-Assay.
In einem ersten Schritt (Enzymreaktion) wird das bisphosphorylierte P1°*-Substrat-Peptid mit PP2A inkubiert. In einem zweiten Schritt (Stopplösung, einschließlich Wasserstoffperoxid) wird der polyklonale, gegen aktives JNK gerichtete Antikörper (NEB #9251) zusammen mit TAMRA-P1°*-Peptid zugegeben. Als Folge der PP2A-Aktivität wird das P1°*-Substrat-Peptid dephosphoryliert und konkurriert nicht länger mit dem TAMRA-P1°*-Peptid um die Bindung an den polyklonalen, gegen aktives JNK gerichteten Antikörper. Dies kann durch eine Zunahme der Fluoreszenzpolarisation nachgewiesen werden.
Assay-Bedingungen: PP2A-Phosphatase (0,5 Einheiten) wird mit 100 nM oder 500 nM P1°*-Substrat-Peptid in einem Gesamtvolumen von 80 μl bei 30°C inkubiert. Zu verschiedenen Zeitpunkten werden Aliquots (20 μl) aus der Enzymreaktion entnommen und mit 10 μl der Stopplösung gemischt, die Wasserstoffperoxid (10 nM), TAMRA-P1°*-Peptid (5 nM) zusammen mit dem polyklonalen, gegen aktives JNK gerichteten Antikörper aus NEB #9251 (Verdünnung 1:20) enthält.
Liste von Reagenzien für die beschriebenen Phosphatase-Assays
Liste verwendeter Peptide:
Bisphosphoryliertes Substrat-Peptid:

Lieferant: Festphasen-Peptidsynthese im Hause von EVOTEC HK-03-65-P1-13; M = 2089 g/mol; MALDI (2092.18) 1 mM Stammlösung in 100% DMSO

Bisphosphoryliertes Kompetitor-Peptid:

Lieferant: Festphasen-Peptidsynthese im Hause von EVOTEC HK-03-60-P1-7; M = 1532 g/mol; MALDI (1531.88) 10 mM Stammlösung in 100% DMSO

Monophosphorylierte Kontroll-Peptide:

Lieferant: Festphasen-Peptidsynthese im Hause von EVOTEC HK-03-58-HF; M = 1451 g/mol; MALDI (1453.57) 10 mM Stammlösung in 100% DMSO

Lieferant: Festphasen-Peptidsynthese im Hause von EVOTEC HK-03-33-HF; M = 1452 g/mol; MALDI (1452.23) 10 mM Stammlösung in 100% DMSO

Enzym:
PP1-Phosphatase:

Lieferant: Upstate Biotech, Kat. Nr. 14-110, Lot Nr. 18524

PP2A-Phosphatase:

Lieferant: Upstate Biotech, Kat. Nr. 14-111, Lot Nr. 20574.

Gegen aktives JNK gerichteter spezifischer Antikörper:

New England Biolabs, U.S.A.: NEB #9251

Monoklonaler spezifischer Anti-Phosphotyrosin-Antikörper pY100:

New England Biolabs, U.S.A.: NEB #9411

Reagenzien und Puffer
Assay-Puffer:

10 × HEPES-Assay-Puffer pH 7,2
500 mM HEPES
100 mM MgCl₂
10 mM DTT
Auflösen von 77 mg DTT (FLUKA Kat. Nr. 43815; M6 154,25 g/mol) [Endkonzentration 10 mM] in 30 ml Millipore-Wasser, Zugabe von 5 ml 1M MgCl₂ [Endkonzentration 100 mM] und 5,96 g HEPES (FLUKA Kat. Nr. 54457) [Endkonzentration 500 mM] und Einstellen des pH-Wertes mit 1M NaOH auf pH 7,2. Auffüllen auf 50 ml mit Millipore-Wasser. Der Puffer wird filtersterilisiert (0,22 μm), auf 1,5 ml aliquotiert und sollte bei –20°C gelagert werden.

1M MgCl₂:

Auflösen von 10,2 g MgCl₂.6H₂O (FLUKA Kat. Nr. 63068) in 50 ml Millipore-Wasser. Der Puffer sollte filtriert werden (0,42 μm) und kann mehrere Monate lang bei 4°C gelagert werden.

1%iges (Gew./Vol.) Pluronic F-127

Auflösen von 0,5 g Pluronic (Sigma, Kat. Nr. P-2443) in 50 ml Millipore-Wasser. Sanftes Rühren, um eine klare Lösung zu erhalten. Die Lösung sollte filtriert werden (0,42 μm) und kann mehrere Monate lang bei 4°C gelagert werden.

1× HEPES-Assay-Puffer/0,1% Pluronic/0,01% BSA, pH 7,5: (2 ml)

50 mM HEPES
10 mM MgCl₂
1 mM DTT
0,1% Pluronic
0,01% BSA
Zugabe von 50 μl 4%igem (Gew./Vol.) Pluronic F-127 in Wasser, Zugabe von 200 μl 10× HEPES-Assay-Puffer, pH 7,5, und Zugabe von 20 μl 1%igem BSA in Wasser (Merck Albumin Fraktion V) zu 2 ml Millipore-Wasser.

1%iges (Gew./Vol.) Albumin Fraktion V (BSA)

Lösen von 0,1 g Albumin Fraktion V (Merck Kat. Nr. 1.12018.0100) in 10 ml steril filtriertem (0,22 μm) Millipore-Wasser und Aliquotierung auf 100 μl. Die Stammlösung sollte bei –20°C gelagert werden.

DMSO: 100%iges DMSO

Das Lösungsmittel wurde von SIGMA (Kat. Nr. P-2650) bezogen, steril filtriert.

Wasserstoffperoxid 30% (H₂O₂)

Zugabe von 10 μl 30%igem H₂O₂ (Merck Kat. Nr.8.22287.1000) in 78 μl 1× HEPES-Assay-Puffer/0,1% Pluronic/0,01 BSA, pH 7,5 (Endkonzentration 1M).

Mikrocystin-LR:

Lieferant: Sigma, Kat. Nr. M-2912, Lot Nr. 48H1100

Okadainsäure:

Lieferant: Sigma, Kat. Nr. 0-7760, Lot Nr. 129H1199

Claims

Verfahren zum Nachweis von Phosphatase-Aktivität in einem Immunoassay, umfassend die folgenden Schritte: a) Bereitstellung eines Proteins oder Peptids, umfassend das Sequenzmotiv -Z-X-Y- oder -Y-X-Z worin Z = Serin oder Threonin X = eine Sequenz von zwischen 1 und 10 Aminosäuren, welche gleich oder verschieden sein können, Y = Tyrosin, Serin oder Threonin, als Substrat für eine Phosphatase, wobei das Protein oder Peptid an den Y- und Z-Positionen vorphosphoryliert ist; b) Inkubation des Proteins oder Peptids mit einer Phosphatase zur Bildung eines Proteins oder Peptids, welches an der Z-Position dephosphoryliert ist; c) Zugabe eines Antikörpers mit einer Spezifität für das Peptid oder Protein, das an der Y- und Z-Position phosphoryliert ist; und d) Nachweis der Phosphatase-Aktivität.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei der Immunoassay als ein Immunoassay mit direkter Bindung, vorzugsweise ein homogener Immunoassay mit direkter Bindung, durchgeführt wird.
Verfahren nach Anspruch 2, wobei ein markiertes Peptid oder Protein verwendet wird.
Verfahren nach Anspruch 2, wobei ein markierter Antikörper verwendet wird.
Verfahren nach Anspruch 3 oder 4, wobei das Peptid/Protein oder der Antikörper mit einer Lumineszenzmarkierung, einem radioaktiven Marker, einem Reporterenzym oder einem Affinitätsliganden markiert ist.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei der Immunoassay als ein Immunoassay mit indirekter Bindung, vorzugsweise ein homogener Immunoassay mit indirekter Bindung, durchgeführt wird.
Verfahren nach Anspruch 6, wobei ein markierter bisphosphorylierter Ligand zugegeben wird, um mit dem bisphosphorylierten Protein oder Peptid um die Bindung an den Antikörper zu konkurrieren, wobei der Ligand an den Y- und Z-Positionen phosphoryliert ist.
Verfahren nach Anspruch 7, wobei der Ligand, der an den Y- und Z-Positionen bisphosphoryliert ist, mit einer Lumineszenzmarkierung, einem radioaktiven Marker, einem Reporterenzym oder einem Affinitätsliganden markiert ist.
Verfahren nach Anspruch 8, wobei der Ligand 5-Tamra-AEEA-Lys-Phe-Met-Met-pThr-Pro-pTyr-Val-Val-Thr-Arg-NH₂ ist, wobei AEEA einen 8-Amino-3,6-dioxaoctansäure-Linker bezeichnet.
Verfahren nach mindestens einem der Ansprüche 1 bis 9, wobei der Assay als Fluoreszenzimmunoassay, insbesondere als ein Fluoreszenzpolarisationsimmunoassay, ein Fluoreszenzkorrelationsspektroskopie-Assay, ein Fluoreszenz lebensdauer-Assay oder ein Fluoreszensintensitätsverteilungs-Assay durchgeführt wird.
Verfahren nach mindestens einem der Ansprüche 1 bis 10, wobei X in dem Sequenzmotiv Prolin oder Glutamat oder Glycin umfaßt.
Verfahren nach mindestens einem der Ansprüche 1 bis 11, wobei das bereitgestellte Protein aktiviertes JNK1-, JNK2- oder JNK3-Protein ist.
Verfahren nach mindestens einem der Ansprüche 1 bis 11, wobei das bereitgestellte Peptid Sequenzen einschließt, die mit denjenigen der Schleife der aktiven Stelle von aktiviertem JNK1, JNK2 oder JNK3 identisch sind.
Verfahren nach Anspruch 1 bis 11, wobei das Peptid die Aminosäuresequenz H-Lys-Phe-Met-Met-pThr-Pro-pTyr-Val-Val-Thr-Arg-NH₂ (p bedeutet phosphoryliert) umfaßt.
Verfahren nach Anspruch 1 bis 11, wobei das Peptid aus der Aminosäuresequenz H-Lys-Phe-Met-Met-pThr-Pro-Tyr-Val-Val-Thr-Arg-NH₂ (p bedeutet phosphoryliert) besteht.
Verfahren nach mindestens einem der Ansprüche 1 bis 15, wobei die Phosphatase eine Serin- oder Threoninphosphatase ist.
Verfahren nach Anspruch 16, wobei die Inkubation des Proteins oder Peptids in Gegenwart einer Serin/Threonin-Proteinphosphatase vom Typ 2A (PP2A) oder Typ 2B (PP2B) durchgeführt wird.
Verfahren nach Anspruch 16, wobei die Inkubation des Proteins oder Peptids in Gegenwart der Phosphatase PP1 durchgeführt wird.
Verfahren nach Anspruch 16, wobei die Inkubation des Proteins oder Peptids in Gegenwart der Phosphatase PP4 (auch als PPX bezeichnet) oder PP6 (auch als PPV bezeichnet) durchgeführt wird.
Verfahren nach mindestens einem der Ansprüche 1 bis 15, wobei die Phosphatase eine Tyrosinphosphatase mit zweifacher Spezifität ist.
Verfahren nach Anspruch 20, wobei die Phosphatase mit zweifacher Spezifität CL100/3CH134 oder PAC1 oder hVH-2/MKP-2 oder hVH-3/B23 oder hVH-5 oder MKP-3/PYST1 oder B59 oder MKP-4 oder MKP-5 ist.
Verfahren nach mindestens einem der Ansprüche 1 bis 21, wobei das Protein oder Peptid an der Y-Position durch die Wirkung der Phosphatase dephosphoryliert wird.
Verfahren nach mindestens einem der Ansprüche 1 bis 22, wobei der Antikörper ein monoklonaler oder polyklonaler Antikörper ist.
Verfahren nach Anspruch 23, wobei der Antikörper ein polyklonaler Antikörper ist.
Verfahren nach Anspruch 23, wobei der Antikörper ein polyklonaler Antikörper ist, der für aktives JNK spezifisch ist.
Kit zum Nachweis von Phosphatase-Aktivität in einem Immunoassay, umfassend die folgenden Komponenten: – eine Phosphatase; – ein Substrat wie in Anspruch 1 definiert; – einen Antikörper wie in Anspruch 1 definiert.
Kit nach Anspruch 26, wobei die Phosphatase eine Serin- oder Threoninphosphatase ist.
Kit nach Anspruch 26, wobei die Phosphatase eine Tyrosinphosphatase mit zweifacher Spezifität ist.
Verwendung des Assay-Verfahrens nach mindestens einem der Ansprüche 1 bis 25 oder des Kits nach mindestens einem der Ansprüche 26 bis 28 zum Screenen hinsichtlich von Modulatoren von Phosphatase-Aktivität, insbesondere Inhibitoren für eine Serin- oder Threoninphosphatase oder Phosphatase mit zweifacher Spezifität.