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Die
vorliegende Erfindung bezieht sich auf ein neues Verfahren zum Messen
einer Veränderung in
einem zellulären
morphologischen Parameter z.B. der Position und/oder der Form einer
Zelle, wobei das Verfahren einen verbesserten Durchsatz aufweist
und mit einer Automatisierung kompatibel ist.
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Zellbeweglichkeit
ist ein wesentliches Element in einer Vielfalt von normalen und
anormalen zellulären
Prozessen. Viele Zelltypen zeigen dramatische Veränderungen
in ihrer Morphologie, wie Bewegung, Verlängerung von Nervenaxonen und
Veränderungen
in der Form während
der Zellteilung. Wundheilung, Embryogenese und Immunsystem-Reaktionen,
wie Chemotaxis, erfordern alle spezialisierte Zelltypen, um auf
externe Stimuli durch Ausführen
einer Zellbewegung zu reagieren. Die Untersuchung der Mechanismen,
die die Zellbewegung steuern, und die Entwicklung von Mitteln, die
die Zellbewegung modulieren können,
sind von signifikantem Interesse bei der Entwicklung neuer Therapeutika.
Die Messung eines Neuritauswuchses und die Effekte von infrage kommenden
Arzneimitteln auf diesen Prozess sind der Schlüssel zum Bewerten möglicher
Behandlungen für
eine Vielfalt von Verletzungen, einschließlich Schlaganfall und Rückenmarkschädigung,
und für
neuro-degenerative Zustände, wie
Parkinson- und Alzheimer-Krankheit.
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Eine
Vielzahl von Verfahren wurden für
die Messung der Zellbewegung beschrieben. Sie fallen in zwei allgemeine
Kategorien. Die erste davon bezieht sich auf Verfahren, in denen
Zellen auf einer Seite einer Membranbarriere positioniert werden
und die Bewegung der Zellen durch die Barriere gemessen wird (Hagedom
et al., Biochim. Biophys. Acta, (1995), 1269 (3), 221–231; Bock
und Mrowietz, J. Biochem. Biophys. Methods, (2001), 48 (3), 257–268); Dunzendorfer
et al., Immunol. Lett., (2000), 71 (1), 5–11). Die zweite nutzt optische
Verfahren zum Messen der Zellbewegung, wobei die Verfahren typischerweise
das Aufnehmen einer Reihe von Zeitraffer-Bildern von Zellen und
dann Ausführen
einer Analyse der Bilder zum Messen der Zellbewegung beinhaltet
(Thurston et al., Cytometry, (1988), 9, 411–417; Thurston et al., Experimental
Cell Research (1986), 165, 380–390).
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Hauptanstrengungen
bei der Erforschung des zentralen Nervensystems sind auf die Identifizierung
von Verbindungen gerichtet, die das Wachstum von Neuriten beeinflussen.
Mittel, die das Nervenwachstum fördern,
besitzen ein therapeutisches Potential in einer breiten Vielfalt
von Krankheiten und Traumata, einschließlich Schlaganfall, Rückenmark-Verletzungen
und neurodegenerativen Zuständen,
wie Parkinson- und Alzheimer-Krankheit. Gegenwärtige Verfahren zum Messen
von Neuritauswuchs beruhen auf der manuellen Untersuchung individueller
Zellen, um das Ausmaß des
Neuritauswuches aus Zellkörpern
zu bestimmen (Jiang, Z. G. et al., Brain Res. Dev. Brain Res., (1995),
85(2), 212–9; Patrick,
C.W. et al., Exp. Neurol. (1996), 138(2), 277–85). Verfahren zum Messen
von Neuritauswuchs sind in WO 01/11340 beschrieben durch die Verwendung
neuronaler Zellen, die ein lumineszierend markiertes Reportermolekül, das über den
Ort einer Zelle Auskunft gibt, und ein zweites lumineszierend markiertes
Reportermolekül
enthaften, das über Neuritauswuchs
Auskunft gibt. Veränderungen
in der Verteilung, der Umgebung oder der Aktivität des ersten und zweiten lumineszierend
markierten Reporters auf oder innerhalb der Zellen wird durch digitale Bildgebung
bestimmt. Dieses Verfahren erfordert, während es eine Verbesserung über die
Bildanalyseverfahren ist, die rein auf morphologischer Analyse basieren,
noch komplexe Analyseprozeduren, um die relative räumliche
Anordnung der zwei lumineszierenden Reporter zu bestimmen.
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Bis
heute sind die Verfahren zum Messen zellulärer Bewegung im allgemeinen
arbeitsintensiv aufzubauen, und während Varianten entworfen wurden,
die verfügbare
Komponenten und chemische Analyseverfahren zum Bestimmen der Anzahl
von Zellen, die Barrierenmembranen durchqueren, verwenden Frevert
et al. J. Immunol. Methods (1998, 213 (1), 41–52) bleiben sie ungeeignet
für Anwendungen
mit hohem Durchsatz. Bildgebungsverfahren besitzen den Nachteil,
dass der Analyseprozess extrem komplex sein kann, da ausreichend
Bilder gesammelt werden müssen,
um das Verfolgen individueller Zellen von einem Bild zum nächsten in
einer Serie zu ermöglichen.
Zusätzlich
kann, da Säugerzellen in
Kultur ziemlich signifikante relative Bewegungsgeschwindigkeiten
von bis zu 1–2 μm/min erreichen können (Zicha
et al., J. Cell. Sci., (1999), 112, 447–454; Thurston and Palcic,
Cell Motility and the Cytoskeleton, (1987), 7, 361–367) sich
eine einzelne Zelle der Größe 10–20 μm einfach
in 10 bis 30 Minuten zu einer Position bewegen, die mit ihrer vorherigen
Position nicht übereinstimmt.
Da Zellmigrations-Messungen über
viele Stunden oder länger
ausgeführt
werden können,
müssen
Zeitrafferfilm- oder Video-Aufnahmen ausreichend Information sammeln,
um alle Zellen zu verfolgen, um eine falsche Identifizierung von
Zellen zwischen Bildern zu vermeiden. Zusätzlich ist, sobald Bilder erhalten
wurden, eine intensive manuelle Analyse oder eine anspruchsvolle
Software erforderlich, um Daten zu analysieren und die Translokation
jeder Zelle in einer Population zu bestimmen (Thurston et al., (1988),
loc cit; Thurston et al., (1986) loc cit).
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Einige
Versuche wurden unternommen, um Assays zu vereinfachen, um sie für die Automatisierung
in hohem Durchsatz geeigneter zu machen. Diese Assays verwendeten
Fluoreszenzintensitäts-Messungen
von markierten Zellen entweder in Standardkultur oder in Kulturen
auf Membranbarrieren (Crouch M. F., J. Neurosci. Methods, (2000),
104(1), 87–91),
wobei Neuritauswuchs aus fluoreszierend markierten Zellen durch
eine Membran gemessen wird. Diese Assays erlauben, dass die Quantifizierung
von Neuritauswuchs ausgeführt
wird unter Verwenden nur von Fluoreszenzintensitäts-Messungen. Jedoch können Intensitätsmessungen,
die mit Standardkulturen ausgeführt
werden, nicht genau zwischen fluoreszierend markierten neuronalen
Zellkörpern
und Neuriten unterscheiden, was zu einer Ungenauigkeit in der Messung
von Neuritauswuchs führt. Barrierenverfahren
unterliegen, während
sie eine Unterscheidung zwischen Zellkörpern und Neuriten ermöglichen,
denselben Problemen beim Aufbauen von Assays, wie zuvor beschrieben
für Barrieren-Zellmigrations-Verfahren.
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Die
vorstehenden Verfahren sind gekennzeichnet durch die Verwendung
physikalischer Barrieren und/oder individueller Zellidentifizierung,
um Änderungen
in der zel lulären
Morphologie zu bestimmen. Demzufolge erlegen sie hohe Erfordernisse
für die
manuelle Intervention und/oder den analytischen Aufwand auf, in
Verbindung mit einer anspruchsvollen Instrumentierung und Software,
die ausschließen,
dass große
Anzahlen von Analysen parallel ausgeführt werden. Es gibt deshalb
eine Notwendigkeit für
Verfahren zum Messen zellulärer
morphologischer Veränderungen,
die minimale Aufbauprozeduren erfordern und mit Screening mit hohem
Durchsatz und Automatisierung kompatibel sind. Die vorliegende Erfindung
liefert ein Verfahren zum Messen einer Veränderung in einer morphologischen
Eigenschaft einer Zelle, insbesondere einer Veränderung in der Zellposition
und/oder Zellform, welche die Erfordernisse für physikalische Barrieren zum
Segregieren von Zellpopulationen vermeidet und ferner die Notwendigkeit
zum Verfolgen individueller Zellen vermeidet. Es werden dadurch
Verfahren für
die Zellanalyse bereitgestellt, die mit einem weiten Bereich von Zelltypen
und Kulturbedingungen verwendet werden können, deren Ergebnisse unter
Verwenden einer verfügbaren
Instrumentierung analysiert werden können.
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Demgemäß wird in
einem ersten Aspekt der Erfindung ein Verfahren zum Messen einer
Veränderung
in einem zellulären
morphologischen Parameter bereitgestellt, wobei das Verfahren umfasst:
- a) Belichten einer Subpopulation von Zellen
in einer Zellpopulation mit Licht einer ersten Wellenlänge, wobei
die Zellpopulation mit einer Markersubstanz markiert ist, die von
einem im wesentlichen nicht-detektierbaren
Zustand in einen detektierbaren Zustand durch Belichten des Markers mit
Licht einer ersten Wellenlänge
umgewandelt werden kann;
- b) zu einem ersten Zeitpunkt Belichten mindestens eines Teils
der Zellpopulation mit Licht einer zweiten Wellenlänge und
Detektieren eines ersten Verteilungsmusters der Markersubstanz;
und
- c) zu einem zweiten Zeitpunkt Belichten des Teils der Zellpopulation
mit Licht der zweiten Wellenlänge
und Detektieren eines zweiten Verteilungsmusters der Markersubstanz;
wobei
ein Unterschied zwischen dem ersten und dem zweiten Verteilungsmuster
der Markersubstanz eine Veränderung
in dem zellulären
morphologischen Parameter anzeigt.
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Bevorzugt
ist der zelluläre
morphologische Parameter unter Zellgröße, Zellposition und/oder Zellform
ausgewählt
und eine Veränderung
in dem Verteilungsmuster der Markersubstanz in der Subpopulation
zeigt eine Veränderung
in der Zellgröße und/oder
Position und/oder der Form der Zelle an. In einer besonders bevorzugten
Ausführungsform
zeigt die Veränderung
in der Zellform einen Neuritauswuchs an.
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Daher
wird gemäß des Verfahrens
der vorliegenden Erfindung die Messung eines zellulären morphologischen
Parameters durch Markieren einer Population von Zellen mit einer
Markersubstanz erreicht, die sich in einem nicht-detektierbaren
Zustand befindet, aber die veranlasst werden kann, durch Belichtung
mit Licht einer geeigneten ersten Wellenlänge detektierbar zu werden.
Durch Belichten einer Subpopulation markierter Zellen mit Licht
einer geeigneten ersten Wellenlänge
in einem vorbestimmten Muster kann die Subpopulation der Zellen
definiert werden, in der das Gebiet, das von der Subpopulation abgedeckt
wird, dem verwendeten Muster der Bestrahlung entspricht. Nachfolgende
Untersuchung mindestens eines Teils der Population von Zellen, unter
Verwenden von bestrahlendem Licht einer zweiten Wellenlänge, die
ausgewählt
ist, um für
die Detektion des Markers geeignet zu sein, wird nur jene Zellen
zeigen, in denen der Marker mit Licht der ersten Wellenlänge bestrahlt
wurde.
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Der
Teil der Zellpopulation, der mit Licht der zweiten Wellenlänge gemäß der Schritte
(b), (c) untersucht wird, kann sein:
- i) die
gesamte Zellpopulation, wobei alle Zellen mit Licht der zweiten
Wellenlänge
belichtet werden, und das Muster der Verteilung der Markersubstanz über alle
Zellen aufgenommen wird, wobei eine derartige Untersuchung durch
Entfernen des Mittels der verwendeten Lichtbemusterung entfernt
wird, um die Bestrahlung mit Licht der ersten Wellenlänge zu erreichen;
oder
- ii) eine Subpopulation von Zellen, wobei dieselbe Subpopulation
von Zellen, die mit Licht der ersten Wellenlänge belichtet wird, mit Licht
der zweiten Wellenlänge
belichtet wird und das Verteilungsmuster der Markersubstanz aufgenommen
wird, wobei eine derartige Untersuchung erreicht wird durch Beibehalten
der räumlichen
Position des Mittels der verwendeten Lichtbemusterung, um eine Bestrahlung
mit Licht der ersten Wellenlänge zu
erreichen, und dieses Mittel verwendet wird, um eine Bestrahlung
mit Licht der zweiten Wellenlänge
zu erreichen; oder
- iii) eine Subpopulation von Zellen, wobei eine Subpopulation,
die zu jener unterschiedlich ist, die mit Licht der ersten Wellenlänge belichtet
worden ist, mit Licht der zweiten Wellenlänge belichtet wird, und das
Verteilungsmuster der Markersubstanz aufgenommen wird, wobei eine
derartige Untersuchung durch Veränderung
der räumlichen Position
des Mittels der verwendeten Lichtbemusterung erreicht wird, um eine
Bestrahlung mit Licht der ersten Wellenlänge zu erreichen, und dieses Mittel
verwendet wird, um eine Bestrahlung mit Licht der zweiten Wellenlänge zu erreichen.
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Das
Verfahren gemäß der Erfindung
kann mit einem beliebigen haftenden Zelltyp verwendet werden, der
durch Standard-Gewebekultur-Verfahren kultiviert werden kann. Derartige
Zelltypen umfassen alle normalen und transformierten Zellen, die von
einer beliebigen erkannten Quelle abgeleitet werden können, im
Hinblick auf Spezien (z.B. Mensch, Nager, Affe), Gewebequelle (z.B.
Gehirn, Leber, Lunge, Herz, Niere, Haut, Muskel) und Zelltyp (z.B.
epithelial, endothelial). Zusätzlich
können
Zellen, die mit rekombinanten Genen transfiziert worden sind, auch
im Verfahren der Er findung kultiviert und genutzt werden. Es gibt
etablierte Protokolle, die für die
Kultur diverser Zelltypen verfügbar
sind. (Siehe z. B. Freshney, R.I., Culture of Animal Cells: A Manual of
Basic Technique, 2. Ausgabe, Alan R. Liss Inc. 1987). Derartige
Protokolle können
die Verwendung spezialisierter Beschichtungen und selektiver Medien erfordern,
um Zellwachstum und die Expression spezialisierter zellulärer zellmorphologischer
Parameter zu ermöglichen.
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Geeigneterweise
können
die Veränderungen in
einem morphologischen Parameter lebender Zellen kategorisiert werden
als:
- i) transiente morphologische Veränderungen,
in denen die Zellen eine Veränderung
in der Größe, Form
oder Position zeigen, wobei mindestens ein Teil der Zelle denselben
Raum belegt, z.B. wenn Zellen in Kultur wachsen und sich teilen;
- ii) Veränderungen
in der Zellposition, die beinhalten die Bewegung von Zellen in einer
willkürlichen Weise
(Zellbeweglichkeit) oder die Bewegung von Zellen in Richtung oder
weg von einem chemischen oder physikalischen Stimulus (Zellmigration),
in der sich die Zellposition derart verändert, dass die gesamte Zelle
einen Raum belegt, der nicht mit einer zuvor belegten Position überlappt;
- iii) Permanente morphologische Veränderungen der Zellgröße und Form,
typischerweise auftretend als ein Ergebnis der Zell-Differentiation
und die zu einem signifikanten Anstieg in der/dem Zellmasse und
-gebiet führen
können.
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Während alle
kultivierten Zellen morphologische Veränderungen gemäß Kategorie
(i) zeigen werden, können
bestimmte spezialisierte biologische Prozesse einen oder beide der
Kategorien (ii) und (iii) beinhalten. Zum Beispiel zeigen Fibroblasten,
die mit Cytokinen stimuliert sind, eine gerichtete Chemotaxis (Sasaki
et al., Mediators Inflamm., (2000), 9, (3–4), 155–60), die auf einen Gradienten
eines chemischen Lockstoffs orientiert sind. In diesem Fall entspricht das
Zellverhalten der oben angegebe nen Kategorie (ii). In PC12-Zellen
veranlasst eine durch NGF induzierte Differentiation Zellen, an
Beweglichkeit zu verlieren und Auswüchse von Neuriten zu erzeugen (Green
and Reid, Nature, (1977), 268, 349), wobei ein Neurit als ein Zellauswuchs
einer Länge
klassifiziert ist, der größer ist
als zweimal der Durchmesser des Zellkörpers. In diesem Fall entspricht
das Zellverhalten der Kategorie (iii). In der Myotuben-Bildung, dem
Prozess, durch den individuelle Muskelzellen Muskelfasern bilden,
wandern individuelle Zelle, bevorzugt in Richtung von Gebieten mit
hohen Dichten von Zellen und verschmelzen nachfolgend mit anderen
Zellen, um lineare Fasern zu bilden, (Chazaud et al., J. Muscle
Res. Cell Motil., (1998), 19(8), 931–6). In diesem Fall zeigen
Zellen beide Verhaltensweisen der Kategorien (ii) und (iii).
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In
einer Ausführungsform
gemäß des ersten Aspektes
stellt die vorliegende Erfindung ein Verfahren zum Messen von Veränderungen
in einem zellulären
morphologischen Parameter über
die Zeit bereit, durch mindestens einmal eine weitere Untersuchung
der Subpopulation markierter Zellen. Derartige Veränderungen
können
aus der Expansion und/oder Diffusion des Musters des detektierbaren
Markers über
die Zeit folgen. Dies kann ohne die Notwendigkeit zum Identifizieren
oder Verfolgen individueller Zellen ausgeführt werden. In dieser Ausführungsform umfasst
das Verfahren folgenden Schritt c): Belichten des Teils der Zellpopulation
mit Licht der zweiten Wellenlänge
N weitere Male, wobei N ≥ 1
gilt, und Detektieren eines Verteilungsmusters der Markersubstanz,
wobei die Verteilungsmuster der Markersubstanz verwendet werden,
um ein Profil zu erzeugen, das Veränderungen des zellulären morphologischen
Parameters anzeigt.
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In
einer besonderen Ausführungsform
gemäß des ersten
Aspektes wird ein Verfahren zum Screenen nach einem Testmittel bereitgestellt,
dessen Wirkung auf den zellulären
morphologischen Parameter bestimmt werden soll. Das Verfahren umfasst
die Schritte: (a) Ausführen
des Verfahrens nach dem ersten Aspekt in der Anwesenheit und in
der Abwesenheit des Mittels; und (b) Messen eines Unterschiedes
zwischen den Verteilungsmustern der Markersubstanz in der Anwesenheit
und in der Abwesenheit des Mittels; wobei ein Unterschied zwischen den
Verteilungsmustern in der Anwesenheit und in der Abwesenheit des
Testmittels den Effekt des Mittels auf den zellulären morphologischen
Parameter anzeigt. Alternativ kann das Messen ausgeführt werden
durch Ausführen
des Verfahrens in Anwesenheit eines Testmittels und Vergleichen
des Verteilungsmusters der Markersubstanz mit einem Kontroll-Verteilungsmusters
das in der Abwesenheit des Testmittels gemessen wurde. Das Kontrollmuster
kann günstigerweise
elektronisch in einer Datenbank oder in einem anderen elektronischen
Format gespeichert werden.
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Geeigneterweise
ist die Markersubstanz zum Markieren von Zellen gemäß der Erfindung
ein Marker, der von einem nicht-detektierbaren oder im wesentlichen
nicht-detektierbaren
Zustand in einen detektierbaren Zustand umgewandelt werden kann, durch
Belichten des Markers mit Licht einer geeigneten Wellenlänge. Geeignete
Markersubstanzen können
in zwei Kategorien gemäß ihrer
Eigenschaften und des Verfahrens der Verwendung getrennt werden.
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In
der ersten Kategorie wird auf Marker, die hier als direkte Marker
definiert sind, direkt mit Licht eingewirkt, um den Marker in einen
detektierbaren Zustand umzuwandeln. Direkte Marker können in
alle Zellen in einer Population und einer Subpopulation von Zellen
geladen werden oder daran gebunden werden, die nachfolgend durch
Belichtung mit Licht einer definierten Geometrie markiert werden.
Geeignete Substanzen zur Verwendung als direkte Marker umfassen
Käfig-Fluoreszenzmoleküle, photochrome Moleküle und photochrome
Proteine. Direkte Marker können
auch eine zweite Einheit enthalten, die fähig ist, die biophysikalischen
oder Fluoreszenz-Eigenschaften
des Reportermoleküls
zu beeinflussen. In derartigen Fällen
fluoresziert der Reporter im extrazellulären Medium nicht und fluoresziert
darin, oder wenn er an die Zelle gebunden ist, nach der Belichtung
mit Licht. Geeignete Substanzen zur Verwendung als direkte Marker
in dieser Kategorie umfassen photochrome Enzymsubstrat-Fluoreszenzfarbstoffe, Membran-emfindliche
photochrome Farbstoffe und pH-empfindliche photochrome Farbstoffe.
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Marker
gemäß der zweiten
Kategorie, die hier als indirekte Marker definiert sind, ändern ihre Detektionseigenschaften
nicht, wenn sie mit Licht belichtet werden, können aber in Zusammenhang mit anderen
photoaktivierbaren Substanzen verwendet werden. Indirekte Marker
können
in eine Subpopulation von Zellen innerhalb einer Gesamtpopulation
geladen werden oder daran gebunden werden, durch Belichtung mit
Licht einer definierten Geometrie. Geeignete Substanzen zur Verwendung
als indirekte Marker umfassen selbst-löschende fluoreszierende Farbstoffe,
die in hohen Konzentrationen innerhalb photoaktivierbarer Liposomen
enthalten sind, und photoreaktive Marker.
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Bevorzugte
Markersubstanzen zur Verwendung gemäß der Erfindung besitzen eine
Anzahl erwünschter
Eigenschaften, wie unten beschrieben:
- a) sie
sollten in wässrigen
Medien und Puffern frei löslich
sein;
- b) sie sollten Zellmembranen frei durchdringen oder darin eindringen
können,
aber innerhalb von oder in Verbindung mit Zellen zurückgehalten werden;
oder
- c) sie sollten nicht detektierbar oder im wesentlichen nicht
detektierbar in freier Lösung
und innerhalb von Zellen in Abwesenheit von Licht einer Wellenlänge, die
zur Aktivierung geeignet ist, sein.
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Besonders
bevorzugte Markersubstanzen zur Verwendung gemäß der Erfindung besitzen eine Anzahl
zusätzlicher
Eigenschaften:
- a) nicht detektierbar oder im
wesentlichen nicht detektierbar in freier Lösung nach der Belichtung mit
Licht einer Wellenlänge,
die für
die Aktivierung geeignet ist; und
- b) detektierbar innerhalb von Zellen nach der Belichtung mit
Licht einer Wellenlänge,
die für
die Aktivierung geeignet ist.
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Es
ist erwünscht,
dass Reportermoleküle
mit diesen Eigenschaften ermöglichen,
dass eine Zellpopulation einer Lösung
einer nicht detektierbaren oder im wesentlichen nicht detektierbaren
Markersubstanz ausgesetzt wird, um zu ermöglichen, dass alle Zellen mit
dem Marker beladen werden, und dass die Umwandlung zu einem detektierbaren
Marker innerhalb einer Subpopulation von Zellen ermöglicht wird, ohne
dass eine Umwandlung des losen Markers in freier Lösung eine
Interferenz mit der Analyse verursacht.
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Ein
Käfig-Fluoreszenzmolekül ist ein
Molekül,
dessen Fluoreszenzeigenschaften durch photolytische Umwandlung von
einer inaktiven (nicht fluoreszierenden) zu einer aktiven (fluoreszierenden) Form
gesteuert werden können.
Eine Vielfalt von Käfig-bildenden
Gruppen sind verfügbar
und mehrere davon wurden verwendet, um Käfig-Fluoreszenz-Farbstoffe
zu erzeugen, die nicht fluoreszieren, bis sie durch Bestrahlung
mit UV-Licht „aus
dem Käfig
freigegeben werden" (Adams
und Tsien, Ann. Rev. Physiol., (1993), 55, 755–784; Handbook of Fluorescent
Probes and Research Products, (2001), Molecular Probes).
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Geeignete
Beispiele von Käfig-Fluoreszenzmolekülen zur
Verwendung im Verfahren gemäß der vorliegenden
Erfindung umfassen N-(DMNB-Käfig-Fluoreszein)-1,2-dihexadecanoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamin-
und 5-Carboxyfluoreszein-bis-(5-carboxymethoxy-2-nitrobenzyl)ether-alanin-carboxamid-succinimidyl
ester (Molecular Probes Inc.). Diese bei UV-Bestrahlung fluoreszierenden
Käfig-Stoffe
können "aus dem Käfig freigegeben
werden" durch kurze
Belichtung mit UV-Licht einer Wellenlänge von 300–360 nm. Im Prinzip kann ein
beliebiges Käfig-Fluoreszenzmolekül, das an
lebende Zellen gebunden werden kann oder darin eingebaut werden
kann, im Verfahren der Erfindung verwendet werden.
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In
der Alternative kann der Marker ein photochromes Material sein,
das eine umschaltbare Fluoreszenz zeigt. Geeignete photochrome Materialien umfassen
Silberoxid-Nanoclusterteilchen (Peyser et al., Science, (2001),
291 103–106),
die durch Bestrahlung mit 488 nm-Licht derart aktiviert werden können, dass
die nachfolgende Bestrahlung mit Licht bei 520–550 nm verursacht, dass die
Teilchen fluoreszieren, während
Teilchen, die nicht zuvor der 488 nm-Bestrahlung ausgesetzt waren,
nicht fluoreszieren, wenn sie bei 520–550 nm angeregt werden. Andere
auf Fluoreszenz basierende photochrome Schalter werden beschrieben,
z.B. Fulgid-Derivate (Inada, T. et al., Chem. Lett., (1997), 321;
Inada T. et al., Chem. Lett., (1997), 961; Walz J. et al., Chem. Phys.
Lett., (1993), 213, 321–324)
und Dihydroazulen-Derivate (Daub, J. et al., Mol. Cryst. Liq. Cryst., (1992),
217, 177–185).
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Alternative
photochrome Materialien zur Verwendung im Verfahren gemäß der vorliegenden
Erfindung umfassen photochrome Moleküle, wie Spirobenzopyrane und
Naphthacenquinone, wie beschrieben in
US
5268862 und
US 5847141 .
Derartige Materialien verändern
die Farbe, wenn sie mit UV, sichtbarer oder Infrarotstrahlung bestrahlt
werden, während
sie in einem Grundzustand sind. Das Molekül durchläuft dann eine photochemische
Umwandlung zu einem metastabilem Zustand, wobei der metastabile
Zustand Licht bei einer zum Grundzustand unterschiedlichen Wellenlänge absorbiert.
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Photochrome
Proteine sind fluoreszierende Proteine mit zwei oder mehr stabilen
Zuständen
mit sich unterscheidenden Anregungs- oder Emissions-Spektren, in
denen die photochromen Proteine zwischen Zuständen umgeschaltet werden durch
Bestrahlung mit Licht einer geeigneten Wellenlänge.
US 6046925 beschreibt optische Speichervorrichtungen, die
photochrome fluoreszierende Proteine umfassen. In einer Ausführungsform
ist das photochrome Protein eine Variante von Aequorea green fluorescent
protein (GFP), das eine Aminosäure-Substitution
von T203 enthält,
wie T203F, T203Y, T203S, S65G/S72A/T203F, S65G/72A/T203Y oder T204S/S205T.
Eine weitere GFP-Variante wurde beschrieben (Patterson, G.H. und
Lippincott-Schwartz, J.
Science, (2002), 297, 1873–7),
die, nach einer intensiven Bestrahlung mit 413 nm-Licht die Fluoreszenz
100 mal erhöht,
wenn sie mit 488 nm-Licht angeregt wird, und für Tage unter aeroben Bedingungen stabil
bleibt. Die Expression von GFP wird weitverbreitet als eine Fluoreszenzsonde
und ein Marker in lebenden Zellen verwenden (Misteli, T. und Spector, D.L.,
Nat. Biotechnol., (1997), 15(10), 961–4).
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Photochrome
Varianten von GFP oder anderen photochromen fluoreszierenden Proteinen,
die für
die konstitutive Expression in lebenden Zellen unter Verwenden von
Verfahren konstruiert sind, die jenen Fachleuten gut bekannt sind
(siehe z.B. die Techniken beschrieben in Maniatis et al., Molecular Cloning,
A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, N.Y. (1989)),
liefern weitere Mittel zum Markieren von Zellen durch das Verfahren
der vorliegenden Erfindung.
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Andere
Beispiele direkter Marker, die in Zusammenhang mit photochromen
Materialien verwendet werden können,
umfassen Materialien, die nicht fluoreszieren, bis sie mit intrazellulären Komponenten
umgesetzt worden sind, z.B. Biman-Derivate, z.B. Monobromobiman.
Bei der passiven Diffusion in die Zelle und Reaktion mit intrazellulären Glutathion- und
Thiol-enthaltenden Proteinen werden blau fluoreszierende Addukte
gebildet.
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Das
Markieren von Zellen unter Verwenden der Markersubstanz gemäß der vorliegenden
Erfindung kann durch die Verwendung einer Methodik erreicht werden,
die für
das Design der Markersubstanz geeignet ist. Z. B. sind Verfahren
zum Markieren des Cytoplasmas der studierten Zelle verfügbar, oder
alternativ kann der Marker verwendet werden, um die Zelloberfläche zu markieren.
Die Wahl des Markierungsverfahrens hängt von dem Typ der Markersubstanz
ab, die eingesetzt wird und wird dem Fachmann offenkundig sein.
Zum Beispiel wird das Markieren der Zelloberfläche die Verwendung von photochromen
Materialien im Verfahren der vorliegenden Erfindung erlauben. Alternativ
kann die Markersubstanz in Zellen durch Mikroinjektion oder durch
etablierte Volumenbeladungs-Verfahren beladen werden, z.B. InfluxTM, geliefert von Molecular Probes.
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Ein
weiteres Verfahren zum Bereitstellen der Aktivierung eines nicht-detektierbaren
Markers in eine detektierbare Form, die zur Verwendung in der vorliegenden
Erfindung geeignet ist, ist es, den Marker in einer Form zu kompartimentieren,
in der er nicht detektierbar ist. Das Nicht-Detektierbar-Machen eines
fluoreszierenden Moleküls
kann z.B. erreicht werden, durch Segregieren einer fluoreszierenden Einheit
in einem Vesikel, in dem die hohe Konzentration des Markers den
Verlust der Fluoreszenz durch Selbstlöschung verursacht, oder durch
Einkapseln einer pH-empfindlichen
fluoreszierenden Einheit in einer Umgebung eines pH, in der sie
nicht fluoresziert. Die Einführung
der eingekapselten fluoreszierenden Einheit und die nachfolgende
Freisetzung durch Belichtung mit einer bemusterten Bestrahlung erlaubt
eine räumlich
gesteuerte Umwandlung des Fluoreszenzmoleküls von einer nicht detektierbaren Form
zu einer detektierbaren Form. Die mit Licht aktivierte Freisetzung
von Verbindungen von Licht-empfindlichen Liposomen in lebenden Zellen durch
UV-Photolyse wurde für
Drug-Delivery-Anwendungen beschrieben (Bisby, R.H. et al., Photochem, Photobiol.,
(2000), 72(1), 57–61;
Morgan, C.G. et al., Photochem. Photobiol., (1995), 62(1), 24–9). Das Einkapseln
eines geeigneten fluoreszierenden Markers in Liposomen, die ein
photochromes Lipid enthalten, wie (1,2-(4'-n-Butylphenyl)azo-4'-(gammaphenylbutyroyl))-glycero-3-phosphocholin
(Morgan, C.G. et al., Biochim. Biophys. Acta, (1987), 903(3), 504–9), das
bei Bestrahlung mit Licht des nahen UV isomerisiert mit resultierenden
Veränderungen
in der Membrandurchlässigkeit
gegenüber
gelösten
Stoffen, und nachfolgende Licht-gerichtete Fusion mit Zellmembranen
stellt ein Mittel der Lieferung eines Fluoreszenzmarkers an Zellen
bereit, um das Markieren von Zellen gemäß der vorliegenden Erfindung
zu ermöglichen.
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Geeignete
Fluoreszenzmoleküle
zur Verwendung in diesem Verfahren des Markierens umfassen jene,
wie Fluoreszein, die nicht fluoreszieren aufgrund von Selbst-Löschung, wenn sie bei hohen lokalen
Konzentrationen kompartimentiert sind (Shi, L.B. und Verkman, A.S.,
J. Gen. Physiol., (1989), 94(6), 1101–15), werden aber fluoreszierend,
wenn sie verdünnt
sind, z.B. wenn sie in eine Zelle durch Licht-gerichtete Fusion
eines Liposoms mit der Zellmembran freigesetzt werden. Alternativ
können
Fluoreszenzmoleküle,
wie 2'-7'-Bis-(2-carboxyethyl)-5(und-6)-carboxyfluoreszein
(Molecular Probes) verwendet werden, die pH-empfindlich sind. Zum Beispiel
kann ein pH-empfindlicher, bei UV-Bestrahlung fluoreszierender Stoff
in Lichtempfindlichen Liposomen in einer Lösung von saurem pH eingekapselt
werden, unter welchen Bedingungen die Moleküle eine geringe Fluoreszenz
zeigen, aber wenn sie in eine Zelle durch Photolyse des Liposoms
freigesetzt werden und einem höheren
pH ausgesetzt werden, steigern die Moleküle die Fluoreszenz. Zusätzliche pH-empfindliche Fluoreszenzmoleküle zur Verwendung
in der Erfindung sind die pH-empfindlichen
Cyanin-Farbstoffe, wie beschrieben in WO 00/75237.
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Eine
weitere Gruppe von Markern, die zur Verwendung im Verfahren der
vorliegenden Erfindung geeignet sind, sind photoreaktive oder photoaffine
Marker, die einen bei UV-Bestrahlung fluoreszierenden Stoff oder
eine andere detektierbare Einheit umfassen, die an eine reaktive
Gruppe geknüpft
ist, die durch Bestrahlung mit Licht geeigneter Wellenlängen aktiviert
wird und die nachfolgend eine kovalente Bindung mit einer benachbarten
Einheit bildet. Beispiele von photoreaktiven Markern umfassen Ethidiummonoazid
(Molecular Probes), Arylazide (Bronk, K.S. und Walt, D.R., Anal.
Chem., (1994), 66(20), 3519–20),
Azidorhodamin (Daoud, R. et al., Biochemistry, (2000), 39(50), 15344–52) und
Carbocyaninnitrophenylazid (Hahn, K.M. et al., J. Histochem. Cytochem.,
(1993), 41(4), 631–4).
Die Verwendung derartiger Marker im Verfahren der Erfindung können durch
den photoreaktiven Molekülen Aussetzen
der Zellen bei Vorhandensein einer bemusterten Bestrahlung einer
geeigneten Wellenlänge
erreicht werden, um die Aktivierung und das Markieren zu verursachen,
gefolgt von Entfernung der nicht gekoppelten photoreaktiven Moleküle durch Waschen,
um ein Muster von markierten Zellen zu ergeben.
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Um
das Prinzip und die Funktion der Erfindung zu klären, wird nun Bezug auf die
beigefügten Zeichnungen
und Figuren genommen, in denen:
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1 eine
schematische Darstellung einer mit Licht aktivierten Bemusterung
von Zellen und einer nachfolgenden Analyse der Zellverteilung ist;
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2 eine
Darstellung ist, die die Analyse der Zellverteilung nach der Zellmigration
zeigt;
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3 ein
elektronisches Bild ist, das die HeLa-Zellen zeigt, die mit einem
Käfig-Fluoreszenzmarker
markiert sind und unter Verwenden von UV-Licht bemustert sind;
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4 (A
und B) ein elektronisches Bild ist, das die HeLa-Zellen zeigt, die
mit einem bei UV-Bestrahlung fluoreszierenden Käfig-Stoff beladen sind und
unter Verwenden von UV-Licht bemustert sind.
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5 (A,
B und C) HeLa-Zellen zeigt, die mit einem bei UV-Bestrahlung fluoreszierenden
Käfig-Stoff
beladen sind und unter Verwenden von UV-Licht bemustert sind.
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6 (A,
B und C) HeLa-Zellen zeigt, die mit einem bei UV-Bestrahlung fluoreszierenden
Käfig-Stoff
beladen, unter Verwenden von UV-Licht bemustert sind und auf ihre
Fluoreszenz-Verteilung nach 0 und 24 h analysiert sind.
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Der
folgende Aspekt der vorliegenden Erfindung wird mit Bezugnahme auf
die 1 und 2 beschrieben. Zellen, die auf
einer Oberfläche
wachsen (dargestellt durch das schwarze Quadrat der 1A)
werden mit einer nicht-detektierbaren Marker-Substanz markiert. Eine Subpopulation
von Zellen wird nachfolgend mit Licht einer ersten Wellenlänge bestrahlt,
im folgenden bezeichnet λ1,
wobei λ1 ausgewählt ist,
um eine geeignete Wellenlänge
für die
Aktivierung des Markers durch Verursachen der Umwandlung des Markers
von einem nicht-detektierbaren Zustand zu einem detektierbaren Zustand
zu sein, wobei die Zellen-Subpopulation sich in einem definierten
Muster, das durch das Gebiet der Bestrahlung begrenzt ist (repräsentiert
durch die grauen Streifen in 1A),
befindet. Die nachfolgende Bestrahlung desselben Gebiets von Zellen
(repräsentiert
durch das schwarze Quadrat in 1B) mit
Licht der Wellenlänge λ2, wobei λ2 eine längere Wellenlänge als λ1 ist, zeigt
das Muster des detektierbaren Markers (weiße Streifen in 1B),
verursacht durch die bemusterte Bestrahlung bei λ1. Nachfolgend können die
Zellen nach einem oder mehreren oder mehr vorbestimmten Zeitintervallen
wieder untersucht werden durch Bestrahlung desselben Gebiets von
Zellen (repräsentiert
durch das schwarze Quadrat in 1C)
mit Licht der Wellenlänge λ2. Dies wird
zu einem unterschiedlichen Mus ter des detektierbaren Markers führen (wie
durch die breiteren Schatten-Streifen in 1C repräsentiert),
falls eine Veränderung
in einer Zellposition aufgetreten ist. So werden Zellen, die anfänglich dem
Licht der Wellenlänge λ1 ausgesetzt
waren, als von ihrer ursprünglichen Position
wegbewegt gezeigt, wie belegt durch ein verbreitetes oder auf andere
Art geändertes
Muster des detektierbaren Markers, verglichen mit dem Muster, das
durch die anfängliche
Bestrahlung der Subpopulation von Zellen unter Verwenden von Licht
bei einer Wellerlänge λ1 erzeugt
wurde. Die Wellenlänge des
bestrahlenden Lichtes, λ2,
wird ausgewählt,
damit es für
die Detektion der Markersubstanz geeignet ist, und wird nur jene
Zellen zeigen, in denen die Markersubstanz dem Licht der ersten
Wellenlänge λ1 ausgesetzt
war.
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Der
Grad der Veränderung
in der Zellbewegung und/oder Zellform kann auf einfache Weise durch
Vergleichen des Verteilungsmusters von Zellen bestimmt werden, die
den detektierbaren Marker tragen, durch Vergleichen einer geeigneten
Eigenschaft der Verteilung des Markers. Zum Beispiel wird, wie in 2 dargestellt
ist, das Bestimmen der Verteilung eines Markers entlang einer Linie,
die das bestrahlte Muster durchschneidet (repräsentiert durch Linie X-Y der 1B)
beim Beginn eines Zellmigrations-Assays und Wiederholen dieser Messung
zu einem späteren
Zeitpunkt (repräsentiert
durch die Linie X2-Y2 der 1C) zu einem
klaren Unterschied in Musterprofilen führen, wie in 2 gezeigt
ist, wobei die Zellbewegung zu einer Diffusion und zu einer Verbreiterung
des Intensitätsprofils
des bestrahlten Musters führt.
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Im
Prinzip kann ein beliebiges Muster oder eine Anzahl von Muster-Elementen
für den
Bestrahlungsschritt unter Verwenden von Licht der Wellenlänge λ1 verwendet
werden. Punkte, Linien oder andere geometrische Formen können durch
kontinuierliche oder diskontinuierliche seitliche Bewegung eines
Bestrahlungspunktes in einer oder zwei Richtungen erreicht werden.
Das Bemustern der Bestrahlung kann durch Scannen eines fokussierten
Punktes der Bestrahlung quer über
eine Oberfläche
erreicht werden, entweder durch Bewegen des Bestrahlungspunktes
relativ zur Probe oder vice versa oder durch eine Kombination von
Bewegungen.
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Scanning
Confocal-Mikroskope, z.B. das Zeiss LSM400, scannen einen kleinen
fokussierten Lichtpunkt quer über
die Probe. Durch Steuern der Bewegung des Bestrahlungspunktes oder
durch Beschränkung
der Bewegung des Bestrahlungspunktes und Bewegen der Probenbühne kann
der Bestrahlungspunkt dazu veranlasst werden, ein definiertes Muster
zu bestrahlen. Alternativ können
nicht-scannende Fluoreszenz-Mikroskope, z.B. das Nikon Diaphot,
die eine fixierte Bestrahlungsquelle verwenden, zum Erzeugen eines
Bestrahlungsmusters auf einer Probe verwendet werden, unter Verwenden
einer Kombination eines Objektivs hoher Vergrößerung und einer teilweise
geschlossenen Bestrahlungs-Iris, um einen kleinen Lichtpunkt auf
die Probe zu projizieren. Die Bewegung der Probenbühne in eine
oder zwei Richtungen kann dann verwendet werden, um praktisch jedes
erwünschte
Muster der Bestrahlung zu erzeugen. Die Aktivierung eines Käfig-Fluoreszenz-Farbstoff-Markers
in HeLa-Zellen durch dieses Verfahren ist in 3 dargestellt.
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In
jedem der Beispiele gemäß der Erfindung können mehrfache
oder wiederholte Muster-Elemente erreicht werden durch Blockieren
oder Ausschalten des Bestrahlungslichtes, während die Probe und/oder der
Bestrahlungspunkt bewegt wird, um die Bestrahlung von nicht-zusammenhängenden
Gebieten zu ermöglichen.
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Andere
Formen der Sanning-Mikroskopie-Instrumentierung, z.B. das Amersham
Biosciences IN Cell Analysis-System, bestrahlen die Probe mit einer Linie
von Licht einer definierten Wellenlänge. Derartige Linien-Scan-Systeme
können
im Verfahren der Erfindung verwendet werden, um ein Muster von parallelen
Linie auf einer Probe zu erzeugen, durch Scannen einer diskontinuierlich
modulierten Linie von Licht quer über die Probe.
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Alternativ
kann ein vorbestimmtes Muster der Bestrahlung erreicht werden durch
Bestrahlung der Probe mit Licht, das durch eine teilweise undurchsichtige
bemusterte Maske derart durchgelassen wird, dass das Maskenmuster
auf die Probe fokussiert wird. Derartige Masken werden im allgemeinen
in photolithographischen Verfahren zum Bemustern von organischen
oder anorganischen Materialien auf Oberflächen genutzt, z. B. bei der
Fabrikation von Halbleitervorrichtungen.
US 5744305 beschreibt die Fabrikation
und Verwendung derartiger Masken für die Photolithographie und
die Licht-gerichtete, räumlich
ansprechbare parallele chemische Synthese.
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In
einem weiteren Aspekt der Erfindung können photochrome Materialien
verwendet werden, um diskrete Muster kultivierter Zellen zu markieren,
zum Studieren von zeitabhängigen
Prozessen, die zur Veränderungen
in der Verteilung eines detektierbaren Markers führen, die nicht von der Migration
von der Zellen von einem diskreten Ort zu einem anderen abhängig sind,
die aber das Ergebnis morphologischer Änderungen in Zellen sind, was
zu einer Ausdehnung oder Migration von Teilen der Zellen führt, außerhalb
der Gebiete, die ursprünglich
von den Zellen besetzt waren.
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Um
das Verfahren der vorliegenden Erfindung auf Neuritauswuchs-Assays
anzuwenden, werden kultivierte neuronale Zellen, z.B. PC-12 Zellen (Koike,
T., Brain Res., (1983), 289 (1–2),
293–303) mit
einer geeigneten photochromen Marker-Substanz markiert und nachfolgend einer
geeigneten Lichtwellenlänge
ausgesetzt, um so die Markersubstanz in einem definierten Muster über eine
Subpopulation von Zellen detektierbar zu machen. Nachfolgende erneute
Untersuchung der Probe in unterschiedlichen Zeitintervallen durch
Bestrahlen der Zellen mit Licht einer Wellenlänge, die für die Detektion der Markersubstanz
geeignet sind, werden das Vorhandensein oder das Nichtvorhandensein
von Neuritauswuchs zeigen, durch Detektieren des Auftauchens des
detektierbaren Markers in Bereichen der Probe, die nicht der bemusterten
Bestrahlung ausgesetzt waren, wobei ein derartiges Auftauchen durch den
Auswuchs von Neuriten aus Zellkörpern
verursacht wird.
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Beispiele
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Beispiel 1
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HeLa-Zellen
wurden in 12-Well-Multiwell-Schalen im DMEM + 10% Serum gezogen.
Die Zellen wurden in PBS gewaschen und Zellenoberflächenproteine
wurden mit CMNB-Käfig-Carboxy-Fluoreszeinsuccinimidylester
(Molecular Probes) bei 0.025 mg/ml 1 Stunde lang bei Raumtemperatur
markiert. Die Zellen wurden dreimal mit PBS und dann einem 330–380 nm – Licht
von einer Quecksilberlampe unter Verwendung eines 20×-Objektivs
auf einem Nikon Diaphot 300-Mikroskop ausgesetzt, wobei die Bestrahlungs-Iris
im maximalen Ausmaß geschlossen
war. Die seitliche Bewegung der Mikroskopbühne wurde verwendet, um das
Carboxy-Fluoreszein in einer Linie quer über die Zellkultur aus dem
Käfig frei zu
geben. Nachfolgendes Verändern
der Anregungswellenlänge
auf 450–490
nm unter Öffnen
der Bestrahlungs-Iris zeigte eine Linie von markierten Zellen, in
denen der Käfig-Marker
zu einer detektierbaren Form umgewandelt worden war, die klar als
hell fluoreszierende Zellen gegen einen Untergrund endogener Zellfluoreszenz
erkennbar waren (3).
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Beispiel 2
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HeLa-Zellen
wurden in 12-Well-Multiwell-Schalen im DMEM + 10% Serum gezogen.
Die Zellen wurden mit 0.1 mg/ml CMNB-Käfig-Fluoreszein (Molecular
Probes) beladen, unter Verwenden eines Influx-Pinocytic-Zellbeladungsreagenz
(Molecular Probes) gemäß der Anleitungen
des Lieferanten. Die Zellen wurden einem 330–380 nm Licht von einer Quecksilberlampe
unter Verwenden eines 10×-Objektivs
auf einem Nikon Diaphot 300-Mikroskop ausgesetzt, wobei die Bestrahlungs-Iris
bis zum maximalen Ausmaß geschlossen
war, um ein kreisförmiges Gebiet
zu bestrahlen (4A, kreisförmiges Phasenkontrastbild).
Nachfolgende Veränderung
der Anregungswellenlänge
auf 450–490
nm und Öffnen
der Bestrahlungs-Iris zeigte ein Gruppe markierter Zellen, in denen
der Käfig-Marker
zu einer detektierbaren Form umgewandelt worden war und die klar
als hell fluoreszierende Zellen sichtbar waren (4B, Fluoreszenzbild).
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Beispiel 3
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HeLa-Zellen
wurden in 24-Well-Platten im DMEM + 10 % Serum gezogen. Die Zellen
wurden mit 1 mg/ml CMNB-Käfig-Fluoreszein
(Molecular Probes) unter Verwenden von Influx-Pinocytic-Zellbeladungsreagenz
(Molecular Probes) gemäß der Anleitungen
des Lieferanten beladen und in ein Hams F-12-Medium geringer Fluoreszenz übertragen.
Die Zellen wurden einem 330–380
nm Licht von einer Quecksilberlampe unter Verwenden eines 10×-Objektivs
auf einem Nikon Diaphot 300-Mikroskop ausgesetzt, wobei die Bestrahlungs-Iris
teilweise geschlossen war, um ein kreisförmiges Gebiet zu bestrahlen.
Nachfolgendes Verändern
der Anregungswellenlänge
auf 450–490
nm und Öffnen
der Bestrahlungs-Iris zeigte eine Gruppe markierter Zellen, in denen
der Käfig-Marker
in eine detektierbare Form umgewandelt worden war und die klar sichtbar
als hell fluoreszierende Zellen mit einem 10×-Objektiv (5B)
und als eine Insel von fluoreszierenden Zellen bei einer geringeren
Vergrößerung unter
Verwenden eines 4×-Objektivs
(5C) sichtbar waren, klar unterscheidbar
von der gesamten Population von Zellen, die nur durch Phasenkontrast-Untersuchung sichtbar
waren (5A).
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Beispiel 4
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HeLa-Zellen
wurden in Wellco-Glasboden-Schalen in Hams F-12 + 10% Serum gezogen. Die
Zellen wurden mit 1 mg/ml CMNB-Käfig-Fluoreszein
(Molecular Probes) unter Verwenden von Influx-Pinocytic-Zellbeladungsreagenz
(Molecular Probes) gemäß der Anleitungen
der Lieferanten beladen. Die Zellen wurden einem 330–380 nm
Licht von einer Quecksilberlampe unter Verwenden eines 20×-Objektivs
auf einem Nikon Diaphot 300-Mikroskop ausgesetzt, wobei die Bestrahlungs-Iris
teilweise geschlossen war, um ein kreisförmiges Gebiet zu bestrahlen.
Ein Bild (6A) wurde sofort aufgenommen
und ein weiteres Bild desselben Gebiets der Kulturschale wurde nach
24 Stunden Inkubation bei 37°C
(6B) aufgenommen. Die Fluoreszenzintensität quer über das
Gebiet wurde entlang der Linie X-Y bestimmt, unter Verwenden einer
Metamorph-Bildanalyse-Software (6C),
was eine klare Abnahme in der Peakintensität und eine erhöhte allgemeine
Fluoreszenz zeigte, konsistent mit der Bewegung von Zellen weg von
dem markierten Gebiet aufgrund einer willkürlichen Zellmigration in den 24
Stunden, die die Bilder trennten.