DE60314395T2 - Verfahren zum messen von protein kinase und phosphatase aktivität - Google Patents

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Description

  • Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf Fluoreszenz-basierende Assays zum Messen von Proteinkinase- und Phosphatase-Aktivität.
  • Phosphorylierung und Dephosphorylierung von Proteinen, katalysiert durch Proteinkinasen, bzw. Proteinphosphatasen, sind intrazelluläre Schlüsselprozesse, die zelluläre Funktionen in eukariotischen Zellen regulieren. Die reversible Phosphorylierung von Serin-, Threonin- und Tyrosin-Resten in Proteinen ist ein hochwirksames Mittel zum Regulieren der biologischen Eigenschaften von Proteinen, um so diverse Prozesse, wie Metabolismus, Zellteilung, Transkription und Translation von Genen, und die Signal-Transduktions-Mechanismen in Zellen zu modulieren. Für Überblicke siehe Hunter, T., Cell, (1995), 80, 225-236; Karin, M., Curr. Opin. Cell Biol., (1991), 3, 467-473. So sind Protein-Phosphorylierung und -Dephosphorylierung signifikante Ereignisse in der Erhaltung, Adaptation und Empfindlichkeit eines Körpers gegenüber Krankheit. Dysfunktion in Protein-Phosphorylierungs- und Dephosphorylierungsprozessen können ernsthafte Konsequenzen für zelluläre Regulationsmechanismen besitzen, und aus diesem Grund sind Proteinkinasen und Phosphatasen geeignete Ziele für die Entwicklung von Screening Assays hohen Durchsatzes von Wichtigkeit in der Entwicklung neuer therapeutischer Arzneimittelbehandlungen.
  • Konventionelle Assays für die Detektion und Messung von Kinaseaktivität umfassen jene, die auf radioaktiven Detektionsverfahren basieren, unter Verwenden von [32P]- oder [33P]-markierter ATP als eine Phosphatquelle zum Einbau von Phosphat in ein Zielsubstrat. Verfahren, die radioaktive Isotope einsetzen, beruhen typischerweise auf einem Trennschritt, um das markierte Produkt zu isolieren, vor dem Zählen in einem Scintillationszähler (Songyang, Z. et al, Nature, (1995), 373, 536-539).
  • Alternativ sind Assays, die nicht-radioaktive Detektion beinhalten, eingesetzt worden, z.B. unter Verwenden von Antikörpern, um phosphorylierte Proteine und Peptide zu detektieren. Detektionsmodalitäten umfassen Fluoreszenzpolarisation und Zeitaufgelösten Fluoreszenzresonanz-Energietransfer.
  • WO 99/29894 (Epps et al.) bezieht sich auf Screeningassays hohen Durchsatzes für Proteinkinasen und Phosphatasen, unter Einsetzen von Fluoreszenzdetektion. Die Verfahren nutzen eine kompetetive Immunoassayprozedur, um die Menge des Substrats zu bestimmen, die durch das System phosphoryliert (oder dephosphoryliert) wird. Bestimmung der Enzymaktivität wird erreicht durch Messen einer Fluoreszenzpolarisation eines markierten Antikörper-Produkt-Konjugats. Alternativ kann ein Fluoreszenz-Quenchen oder eine Fluoreszenz-Korrelationsspektroskopie verwendet werden.
  • WO 00/75167 (Sportsman et al) bezieht sich auf Verfahren zum Detektieren der Zugabe oder Entfernung einer Phosphatgruppe an oder von einem Substrat durch In-Kontakt-Bringen eines lumineszierenden Peptids mit einem Bindungspartner, der spezifisch an ein phosporyliertes Peptid bindet.
  • Ein alternatives Fluoreszenzassayverfahren für Proteinkinase C (PKC) ohne Antikörperselektion wurde berichtet von Mcllroy et al (Analytic Biochemistry, 1991), 195, 148-152). In diesem Assay wird von einem Acrytodan-markierten synthetischen 25-Aminosäurenpeptid berichtet, das eine PKC-Phosphorylierungsstelle eingebaut hat, dass sie bei Phosphorylierung eine 20%ige Abnahme der Fluoreszenz durchläuft. Der Assay ermöglicht die Detektion von PKC auf einem Niveau von 0,2 nM, während ähnliche Konzentrationen zyklischer AMP-abhängiger oder Typ-II-Calmodulin-abhängigen Proteinkinasen keine Änderung in der Peptidfluoreszenz erzeugten. JP 2001-19700-A offenbart die Verwendung eines fluorogenen Substrats zum Detektieren von cAMP-abhängiger Proteinkinase-A-Aktivität oder Protein-Dephosphorylierungsaktivität durch Messen von Änderungen in der Fluoreszenzintensität.
  • In jenen Assays, die Zeit-aufgelösten Fluoreszenzresonanz-Energietransfer (TR-FRET) einsetzen, ist mehr als ein Detektionsreagenz erforderlich. Die Herstellung und Zugabe derartiger Reagenzien erfordert oft beträchtliche(n) Zeitaufwand und Kosten. Viele der Assays sind nicht wirklich homogen, insofern als sie die Zugabe von Reagenzien erfordern, nachdem die Reaktion initiiert worden ist. Die Abhängigkeit von TR-FRET von der Entfernung zwischen den Detektionsreagenzien bedeutet, dass Substrate entworfen werden müssen, um dieses Erfordernis zu erfüllen. Außerdem werden viele der Assays mehrfache Marker erfordern. Es ist in den meisten Fällen nicht möglich, das natürliche Substrat zu verwenden, sogar falsch erwünscht, weil die Notwendigkeit zum Biotinylieren von Proteinen und Zugeben von Antikörpern ihre Verwendung ausschließt.
  • Daher gibt es einen Bedarf in der Technik für neue, günstige, schnelle und empfindliche Verfahren zur Bestimmung von Kinase- und Phosphataseaktivitäten, die einfach auszuführen sind, die mit geringer technischer Intervention ausgeführt werden können und die einer Roboterautomatisierung vollständig zugängig sind.
  • In einem ersten Aspekt ist bereitgestellt ein Verfahren zum Bestimmen der Phosphorylierungsaktivität eines Enzyms, das auf ein Substratmolekül wirkt, wobei das Substrat mindestens eine Einheit umfasst, die fähig ist, durch das Enzym phosphoryliert zu werden, um ein phosphoryliertes Produkt zu ergeben, und wobei das Substrat mit einem Fluoreszenzfarbstoff markiert ist, wobei das Verfahren die Schritte umfasst:
    • (i) Messen der Fluoreszenzintensität und der Fluoreszenzlebensdauer des fluoreszierend markierten Substrats;
    • (ii) Kombinieren des Enzyms mit dem Substratmolekül bei Vorhandensein eines Phosphat-Donors, und
    • (iii) Messen einer Änderung in der Fluoreszenzintensität und in der Fluoreszenzlebensdauer des Fluoreszenzmarkers nach der Kombination des Schrittes ii);
    wobei die Änderung in der Fluoreszenzintensität und in der Fluoreszenzlebensdauer des Fluoreszenzmarkers verwendet wird, um die Phosphorylierungsaktivität des Enzyms zu bestimmen.
  • Bevorzugt ist das Substrat markiert mit einem Fluoreszenzfarbstoff, ausgewählt aus den Acridon- und Chinacridon-Farbstoffklassen
  • In einem zweiten Aspekt der Erfindung ist bereitgestellt ein Verfahren zum Bestimmen der Phosphorylierungsaktivität eines Enzyms, das auf ein Substratmolekül wirkt, wobei das Substrat mindestens eine Einheit umfasst, die fähig ist, durch das Enzym phosphoryliert zu werden, um ein phosphoryliertes Produkt zu ergeben, und wobei das Substrat mit einem Fluoreszenzfarbstoff nach Anspruch 3 markiert ist, wobei das Verfahren die Schritte umfasst:
    • (i) Messen der Fluoreszenzintensität des fluoreszierend markierten Substrats;
    • (ii) Kombinieren des Enzyms mit dem Substratmolekül bei Vorhandensein eines Phosphat-Donors, und
    • (iii) Messen eines Anstiegs in der Fluoreszenzintensität des Fluoreszenzmarkers nach der Kombination des Schrittes ii);
    wobei der Anstieg in der Fluoreszenzintensität des Fluoreszenzmarkers verwendet wird, um die Phosphorylierungsaktivität des Enzyms zu bestimmen.
  • Geeigneterweise kann gemäß des ersten und zweiten Aspektes das Substratmolekül ausgewählt sein aus natürlichen Proteinen (einschließlich post-translational modifizierte Proteine wie Glykoproteine und Lipoproteine); und synthetischen Peptiden. In diesen Ausführungsformen umfasst das Substratmolekül mindestens eine Aminosäure, die fähig ist phosphoryliert zu werden.
  • Alternativ kann das Substrat ausgewählt sein aus einem Lipid, wie ein Inositollipid, umfassend Phosphatidyl-mono- oder -bis-phosphat; oder kann ein Mono- oder Polysaccharid sein, in welchem Fall das Substratmolekül mindestens eine Hydroxylgruppe umfasst, die fähig ist phosphoryliert zu werden.
  • In bevorzugten Ausführungsformen ist das Substrat ein Protein oder Peptid und die Aminosäure, die fähig ist phosphoryliert zu werden, ist ausgewählt aus Tyrosin, Serin, Threonin und Histidin. In diesen Ausführungsformen ist das Substrat fähig, phosphoryliert zu werden durch eine Proteinkinase, z.B. eine oder mehrere der Enzyme, ausgewählt aus Tyrosinkinase, Serin/Threonin-Kinase und Histidin-Kinase.
  • In einer Ausführungsform gemäß des zweiten Aspektes, bei dem das Substrat phosphoryliert ist an einen Tyrosin-Rest durch eine Tyrosinkinase, umfasst das phosphorylierte Produkt mindestens einen Phospho-tyrosin-Rest. In dieser Ausführungsform können die Messschritte i) und iii) zusätzlich die Messung der Fluoreszenzlebensdauern des Fluoreszenzmarkers umfassen, wobei ein Anstieg in der Fluoreszenzlebensdauer verwendet wird, um die Konzentration des phosphorylierten Produktes relativ zur Konzentration des nicht-phosphorylierten Substrats zu messen. So kann das Verfahren verwendet werden für eine kontinuierliche Aufnahme der Menge des Substrats in Echtzeit, das während des Verlaufs der enzymatischen Reaktion umgewandelt wird, und des entsprechenden Anstiegs in der Menge des dadurch erzeugten phosphorylierten Produktes.
  • In einer anderen Ausführungsform wird das Substrat phosphoryliert an einem Rest, ausgewählt aus Serin, Threonin und Histidin.
  • In bevorzugten Ausführungsformen gemäß des ersten oder zweiten Aspekts ist bereitgestellt ein Verfahren des Screenens nach einem Testmittel, dessen Effekt auf die Phosphorylierungsaktivität eines Enzyms bestimmt werden soll. Das Verfahren umfasst die Schritte: (a) Ausführen des Verfahrens nach dem ersten oder zweiten Aspekt bei Vorhandensein und in Abwesenheit des Mittels und (b) Bestimmen der Phosphorylierungsaktivität des Enzyms bei Vorhandensein und in Abwesenheit des Mittels; wobei ein Unterschied zwischen der Phosphorylierungsaktivität des Enzyms bei Vorhandensein und in Abwesenheit des Mittels eine Anzeige ist für den Effekt des Mittels auf die Phosphorylierungsaktivität des Enzyms. Alternativ kann das Screenen ausgeführt werden durch Ausführen des Verfahrens bei Vorhandensein eines Testmittels und Vergleichen des Wertes der Phosphorylierungsaktivität des Enzyms mit einem Kontrollwert für die Enzymaktivität in Abwesenheit des Testmittels. Der Kontrollwert kann günstigerweise elektronisch in einer Datenbank oder einem anderen elektronischen Format gespeichert werden.
  • Es ist beabsichtigt, dass der Begriff „Phosphat-Donor" hochenergetische Phosphat-Donoren bedeutet, wie ATP und GTP.
  • In einem dritten Aspekt ist bereitgestellt ein Verfahren zum Bestimmen der Dephosphorylierungsaktivität eines Enzyms, das auf ein Substratmolekül wirkt, wobei das Substrat mindestens eine phosphorylierte Einheit umfasst, die fähig ist, durch das Enzym dephosphoryliert zu werden, um ein Produkt zu ergeben, und wobei das Substrat mit einem Fluoreszenzfarbstoff markiert ist, wobei das Verfahren die Schritte umfasst:
    • i) Messen der Fluoreszenzintensität und Fluoreszenzlebensdauer des fluoreszierend markierten Substrates;
    • ii) Kombinieren des Enzyms mit dem Substratmolekül, um ein Produkt zu ergeben; und
    • iii) Messen einer Änderung in der Fluoreszenzintensität und in der Fluoreszenzlebensdauer nach der Kombination des Schrittes ii);
    wobei die Änderung in der Fluoreszenzintensität und in der Fluoreszenzlebensdauer des Fluoreszenzmarkers verwendet wird, um die Dephosphorylierungsaktivität des Enzyms zu bestimmen.
  • Bevorzugt ist das Substrat markiert mit einem Fluoreszenzfarbstoff, ausgewählt aus den Acridon- und den Chinacridon-Farbstoffklassen.
  • In einem vierten Aspekt der vorliegenden Erfindung ist bereitgestellt ein Verfahren zum Bestimmen der Dephosphorylierungsaktivität eines Systems, das auf ein Substratmolekül wirkt, wobei das Substrat mindestens eine phosphorylierte Einheit umfasst, die fähig ist, durch das Enzym dephosphoryliert zu werden, um ein Produkt zu ergeben, und wobei das Substrat mit einem Fluoreszenzfarbstoff nach Anspruch 3 markiert ist, wobei das Verfahren die Schritte umfasst::
    • i) Messen der Fluoreszenzintensität des fluoreszierend markierten Substrates;
    • ii) Kombinieren des Enzyms mit dem Substratmolekül, um ein Produkt zu ergeben; und
    • iii) Messen einer Abnahme in der Fluoreszenzintensität nach der Kombination des Schrittes ii),
    wobei die Abnahme in der Fluoreszenzintensität des Fluoreszenzmarkers verwendet wird, um die Dephosphorylierungsaktivität des Enzyms zu bestimmen.
  • Geeigneterweise ist das Enzym gemäß des dritten und vierten Aspektes eine Phosphatase.
  • Geeigneterweise kann gemäß des dritten und vierten Aspekts das Substratmolekül ausgewählt sein aus natürlichen Proteinen (einschließlich post-translational modifizierten Proteinen, wie Glykoproteine und Lipoproteine); und synthetischen Peptiden. In diesen Ausführungsformen umfasst das Substratmolekül mindestens eine phosphorylierte Aminosäure, die fähig ist dephosphoryliert zu werden.
  • Alternativ kann das Substrat ausgewählt sein aus einem Phospholipid (wie ein Phosphoinositid), oder kann ein phospholysiertes Derivat eines Mono- oder Polysaccharids sein. In dieser Ausführungsform umfasst das Substratmolekül mindestens eine phosphorylierte Hydroxylgruppe, die fähig ist dephosphoryliert zu werden.
  • In bevorzugten Ausführungsformen ist das Substrat ein phosphoryliertes Protein oder ein phosphoryliertes Peptid und die phosphorylierte Aminosäure, die desphosphoryliert wird, kann ausgewählt sein aus Phospho-tyrosin, Phospho-serin, Phospho-threonin und Phospho-histidin und eine Phosphatase entfernt enzymatisch eine Phosphatgruppe von der phosphorylierten Aminosäure.
  • In einer besonderen Ausführungsform des vierten Aspektes umfasst das Substrat einen phosphorylierten Tyrosin-Rest und das Enzym entfernt eine Phosphatgruppe von einem Phosphotyrosin-Rest in dem Substrat. In dieser Ausführungsform können die Messschritte i) und iii) zusätzlich die Messung der Fluoreszenzlebensdauern des Fluoreszenzmarkers umfassen, wobei eine Abnahme in der Fluoreszenzlebensdauer verwendet wird, um die Konzentration eines phosphorylierten Substrats relativ zur Konzentration des Produktes zu messen. So kann das Verfahren verwendet werden für eine kontinuierliche Aufnahme der Menge des phosphorylierten Substrats in Echtzeit, das umgewandelt wird während des Verlaufs der enzymatischen Reaktion und des entsprechenden Anstiegs in der Menge des dadurch erzeugten Produktes.
  • In bevorzugten Ausführungsformen ist bereitgestellt ein Verfahren zum Screenen nach einem Testmittel, dessen Effekt auf die Dephosphorylierungsaktivität eines Enzyms bestimmt werden soll. Das Verfahren umfasst die Schritte: a) Ausführen des Verfahrens nach dem dritten oder vierten Aspekt bei Vorhandensein oder in Abwesenheit des Mittels; und b) Bestimmung der Dephosphorylierungsaktivität des Enzyms bei Vorhandensein und in Abwesenheit des Mittels; wobei ein Unterschied zwischen der Dephosphorylierunsaktivität des Enzyms bei Vorhandensein und in Abwesenheit des Mittels eine Anzeige ist für den Effekt des Testmittels auf die Dephosphorylierungsaktivität des Enzyms. Alternativ kann das Sreenen ausgeführt werden durch Ausführen des Verfahrens bei Vorhandensein eines Testmittels und Vergleichen des Werts der Dephosphorylierungsaktivität des Enzyms mit einem Kontrollwert für die Enzymaktivität bei Abwesenheit des Testmittes. Der Kontrollwert kann günstigerweise elektronisch in einer Datenbank oder in einem anderen elektronischen Format gespeichert werden.
  • In Ausführungsformen gemäß der Erfindung kann die Kinase oder das Phosphatasesubstrat gebunden sein durch eine Linker-Gruppe an einen festen Träger. In diesen Ausführungsformen können Assays zum Bestimmen der Phosphorylierungs- oder der Dephosphorylierungsaktivität eines Enzyms ausgeführt werden in der festen Phase.
  • In anderen Ausführungsformen können die Kinase oder das Phosphatasesubstrat konjugiert (oder fusioniert sein) an ein zweites Peptid oder Protein, wie ein Träger- oder Transportpeptid, wie beschrieben in US Patent Nr. 5807746 ; WO 99/64455 ; WO 97/12912 ; WO 99/05302 . Siehe auch Rojas, et al, Nature Biotechnology, (1998), 16, 370-375; Hawiger et al, Curr. Opinion Chem. Biol., (1999), 89-94). In derartigen Ausführungsformen kann das Trägerpeptid eingesetzt werden, um die Kinase oder das Phosphatasesubstrat durch eine zelluläre Membran und in eine Zelle zu transportieren, um so das Studium des Phosphorylierungsstatus eines Substrats in einer zellulären Umgebung zu ermöglichen.
  • Wo die Aktivität einer Kinase bestimmt werden soll, wird die Wahl eines natürlichen Proteinkinassubstrats abhängen von der besonderen Kinase, die dem Assay unterzogen werden soll. Eine Substratspezifität von Proteinkinasen variiert beträchtlich und es ist bekannt, dass die lokale Sequenz benachbart zur Phosphorylierungsstelle eine entscheidende Rolle in der Erkennung des Substrats durch Proteinkinasen spielt. So wird die Auswahl eines besonderen Substrats für einen Kinaseassay abhängen von den Phosphorylierungsstellen-Motifs, die in der Sequenz vorhanden sind. Tabelle 1 listet einige bekannte Proteinkinasesubstrate und entsprechende Kinasen auf, die geeignet sind zur Verwendung in dem Assay gemäß der Erfindung. Tabelle 1: Proteinkinasesubstrate
    Kinase Proteinkinasesubstrat
    cAMP-abhängige Proteinkinase Pyruvatkinase Phosphorylasekinase Histon H1
    Caseinkinase 1 Glycogensynthase α-Casein
    Caseinkinase II PKA-Regulationsuntereinheit 1334cdc2 Acetyl-co-enzym-A-carboxylase
    Proteinkinase C EGF-Rezeptor Fibrinogen Glycogensynthase Myelin Basic Protein
    cGMP-abhängige Proteinkinase Histon Phosphorylasekinase
    Phosphorylasekinase Phosphorylase
    V-Abl pp60src
    AMP-aktivierte Proteinkinase Acetyl-co-enzym-A-carboxylase
    Glycogensynthase Glycogensynthasekinase
  • Fortschritte im Wissen in Bezug auf Kinasesubstratspezifität haben es möglich gemacht, mögliche Enzymerkennungsstellen in neu sequenzierten Proteinen zu identifizieren, wie auch synthetische Peptidmodelisubstrate zu konstruieren. Für Überblicke in diesem Gebiet siehe Kennelly, P.J. und Krebs, E.G., J. Biol Chem., (1991), 266, 15555-58; Kemp, B.E. und Pearson, R.B., Trends in Biochemical Sciences, (1990), 343. Geeignete synthetische Peptid-Substrate können hergestellt werden durch Verfahren, die dem Fachmann gut bekannt sind, z.B. mittels Festphasenpeptidsyntheseverfahren durch die sequentielle Zugabe geschützter Aminosäuren, die (ggf. durch eine Linker-Gruppe) an einen Festphasenträger gebunden sind, wie beschrieben in „Solid Phase Peptid Synthesis", Atherton, E. und Sheppard, R.C. IRL Press (1989).
  • Phosphatasen zeigen in vitro allgemein eine breite Substratspezifität (anders als Kinasen), siehe Helps, N.R. et al, Biochem. J., (2000), 349, 509-518; Majeti, R. und Weiss, A., Chem. Rev. (2001), 101, 2441-2448; Cohen, P., J. Cell Science, (2002), 115, 241-256. In vivo ist die katalytische Phosphatase-Domäne assoziiert mit und zielausgerichtet durch eine Regulationsuntereinheit. Diese Kombination bedeutet, dass Phosphatasesubstratspezifität in vivo sehr spezifisch sein kann. Jedoch wird in in-vitro-Assays nur die katalytische Domäne einem Assay unterzogen. Demzufolge sind Phosphatasen in vitro fähig, auf einem weiten Bereich von sowohl Peptid- als auch Proteinsubstraten zu wirken.
  • Das in Kinase- und Phosphataseassays gemäß der Erfindung verwendete Substrat ist markiert mit einem Fluoreszenzfarbstoff, der fähig ist, eine Änderung in der Fluoreszenzintensität und in der Fluoreszenzlebensdauer bei Phosphorylierung des mit einem Farbstoff markierten Substrats zu zeigen, oder bei Dephosphorylierung eines mit Farbstoff markierten phosphorylierten Substrats. So kann es einen Anstieg in der Fluoreszenzintensität und in der Fluoreszenzlebensdauer bei Phosphorylierung des mit Farbstoff markierten Substrats geben. Alternativ kann es eine Abnahme in der Fluoreszenzintensität und in der Fluoreszenzlebensdauer bei Dephosphorylierung des mit Farbstoff markierten phosphorylierten Substrats geben. Farbstoffe, die zur Verwendung in der vorliegenden Erfindung geeignet sind, sind Fluoreszenz-Lebensdauerfarbstoffe. Im Kontext der vorliegenden Erfindung ist beabsichtigt, dass der Begriff „Lebensdauerfarbstoff" einen Farbstoff bedeutet, der eine messbare Fluoreszenzlebensdauer besitzt, definiert als die durchschnittliche Zeitdauer, die der Farbstoff in seinem angeregten Zustand nach der Anregung verbleibt (Lackowicz, J.R., Principles of Fluorescence Spectroscopy, Kluwer Academic/Plenum Publishers, New York, (1999)). Geeigneterweise kann der Fluoreszenzfarbstoff ausgewählt sein aus den Acridon- und den Chinacridon-Farbstoffklassen. Acridon- und Chinacridonderivate zur Verwendung als Marker für Fluoreszenzdetektion von Zielmaterialien sind beschrieben in bspw. WO 02/099424 A2 und WO 021099432 A2 .
  • Acridonfarbstoffe zur Verwendung im Verfahren der Erfindung sind jene mit der allgemeinen Formel (I):
    Figure 00120001
    wobei:
    Die Gruppen R2 und R3 gebunden sind an die Z'-Ringstruktur und die Gruppen R4 und R5 gebunden sind an die Z2-Ringstruktur; Z1 und Z2 unabhängig die Atome repräsentieren, die nötig sind, um einen oder zwei fusionierte aromatische oder heteroaromatische Ringsysteme zu vervollständigen, wobei jeder Ring fünf oder sechs Atome ausgewählt aus Kohlenstoffatomen und ggf. nicht mehr als zwei Atome ausgewählt aus Sauerstoff, Stickstoff und Schwefel besitzt,
    R1, R2, R3, R4 und R5 unabhängig ausgewählt sind aus Wasserstoff, Halogen, Amid, Hydroxyl, Cyano, Amino, mono- oder di-C1-C4-alkyl-substituiertes Amino, Sulfhydryl, Carbonyl, C1-C6-Alkoxy, Aryl, Heteroaryl, C1-C20-Alkyl, Aralkyl; der Gruppe-E-F, wobei E eine Spacergruppe ist mit einer Kette von 1-60 Atomen, ausgewählt aus der Gruppe, die besteht aus Kohlenstoff-, Stickstoff-, Sauerstoff-, Schwefel- und Phosphoratomen und F eine Zielbindungsgruppe ist; und der Gruppe -(CH2-)nY, wobei Y ausgewählt ist aus Sulfonat, Sulfat, Phosphonat, Phosphat, quaternärem Ammonium und Carboxyl und n für 0 oder eine ganze Zahl von 1-6 steht.
  • Chinacridonfarbstoffe zur Verwendung im Verfahren der Erfindung sind jene mit der allgemeinen Formel (II):
    Figure 00130001
    wobei:
    die Gruppen R3 und R4 an die Z1-Ringstruktur gebunden sind und die Gruppen R5 und R6 an die Z2-Ringstruktur gebunden sind; Z1 und Z2 unabhängig die Atome repräsentieren, die zum Vervollständigen eines oder mehrerer kondensierter aromatischer oder heteroaromatischer Ringsysteme nötig sind, wobei jeder Ring aufweist fünf oder sechs Atome, die aus Kohlenstoffatomen ausgewählt sind, und gegebenenfalls nicht mehr als zwei Atome, die aus Sauerstoff, Stickstoff und Schwefel ausgewählt sind;
    R1, R2, R3, R4, R5, R6, R7 und R8 unabhängig ausgewählt sind aus Wasserstoff, Halogen, Amid, Hydroxyl, Cyano, Amino, mono- oder di-C1-C4-alkyl-substituiertem Amino, Sulfhydryl, Carbonyl, Carboxyl, Ci-C6-Alkoxy, Aryl, Heteroaryl, C1-C20-Alkyl, Aralkyl; der Gruppe -E-F, wobei E eine Spacer-Gruppe ist mit einer Kette von 1 bis 60 Atomen, die aus der Gruppe ausgewählt sind, die besteht aus Kohlenstoff-, Stickstoff-, Sauerstoff-, Schwefel- und Phosphoratomen, und F eine Zielbindungsgruppe ist; und der Gruppe -(CH2-)nY, wobei Y ausgewählt ist aus Sulfonat, Sulfat, Phosphonat, Phosphat, quaternärem Ammonium und Carboxyl und n für Null oder eine ganze Zahl von 1 bis 6 steht.
  • Geeigneterweise ist die Zielbindungsgruppe F eine reaktive oder funktionelle Gruppe. Eine reaktive Gruppe der Fluorszenzfarbstoffe gemäß der Formel (I) und der Formel (II) kann unter geeigneten Bedingungen mit einer funktionellen Gruppe des Substrats reagieren; eine funktionelle Gruppe einer Verbindung gemäß Formel (I) und Formel (II) kann unter geeigneten Bedingungen mit einer reaktiven Gruppe des Substrats reagieren. Mittels dieser reaktiven und funktionellen Gruppen können die Fluoreszenzfarbstoffe gemäß Formel (I) und Formel (II) umgesetzt werden und covalent gebunden werden an das Substrat derart, dass das Substrat markiert wird mit dem Fluoreszenzfarbstoff.
  • Bevorzugt ist, wenn F eine reaktive Gruppe ist, sie ausgewählt aus Succinimidylester, Sulfosuccinimidylester, Isothiocyanat, Maleimid, Haloacetamid, Säurehalogenid, Vinylsulfon, Dichlorotriazin, Carbodiimid, Hydrazid und Phosphoramidit. Bevorzugt ist, wenn F eine funktionelle Gruppe ist, sie ausgewählt aus Hydroxy, Amino, Sulfydryl, Imidazol, Carbonyl, einschließlich Aldehyd und Keton, Phosphat und Thiophosphat.
  • Bevorzugte Beispiele von Acridon- und Chinacridonfarbstoffen (und ihre entsprechenden Lebensdauern (nsecs)) sind gezeigt als Verbindungen (III), (IV), (V), (VI) und (VII) in Tabelle 2.
  • Tabelle 2
    Figure 00150001
  • Das mit Farbstoff markierte Protein- und Peptidsubstrat kann hergestellt werden durch direkte chemische Kopplung eines reaktiven Fluoreszenzfarbstoffderivats an das Protein oder Peptid durch Techniken, die dem Fachmann gut bekannt sind. Eine alternative Markierungsstrategie kann beinhalten das Koppeln (oder Ligieren) des Substrats an einen Polypeptidmarker, wie ein fluoreszierendes Polypeptid. Peptid- und Proteinsubstrate zur Verwendung in der Erfindung können markiert werden an einer terminalen Aminosäureposition, oder alternativ an einer oder mehreren inneren Aminosäurepositionen.
  • Die Chemie des Markierens von Proteinen und Peptiden mit Fluoreszenzfarbstoffen ist gut dokumentiert und eine Vielfalt von chemischen Methoden ist verfügbar für die chemische Modifikation von Peptiden. Im Allgemeinen wird die Wahl des Markierungsreagenz bestimmt durch die Aminosäurezusammensetzung des zu markierenden Proteins oder Peptids. Besonders bevorzugt sind Amin-reaktive und Thiol-reaktive Fluoreszenzmarkierungsfarbstoffe. Im ersten Fall ist die funktionelle Gruppe zum Markieren eine primäre Aminogruppe, die abgeleitet werden kann von der ε-Aminogruppe von Lysin, oder alternativ der Amino-Terminus des Peptids oder Proteins. Besondere Beispiele von reaktiven Gruppen zum Markieren von ε-Amino-Lysin-Resten umfassen die Isothiocyanato- und N-Hydroxysuccinimidyl(NHS)-esterderivate eines Fluoreszenzfarbstoffes. Obwohl relativ wenige Proteine und Peptide freie Thiolgruppen besitzen (sie existieren im Allgemeinen als Disulfidgruppen), haben sich Thiol-Markierungsprozeduren als sehr nützlich zum Markieren von Proteinen und Peptiden erwiesen, unter Verwenden von Thiolreaktiven Mittel, z.B. Iodoacetyl- und Maleimidyl-Derivate von Fluoreszenzfarbstoffen. Für Überblicke und Beispiele einer Proteinmarkierung unter Verwenden von Fluoreszenzfarbstoffmarkierungsreagenzien siehe „Non-Radioactive Labelling, a Practical Introduction", Garman, A.J. Academic Press, 1997; „Bioconjugation-Protein Coupling Techniques for the Biomedical Sciences", Aslam, M. und Dent, A. Macmillan Reference Ltd, (1998). Protokolle sind verfügbar, um stellenspezifische Markierung in einem synthetisierten Peptid zu erhalten, z.B. siehe Hermanson, G.T., Bioconjugate Techniques, Academic Press (1996). In einem typischen Beispiel können N-Hydroxysuccinimidyl(NHS)-ester der Acridonfarbstoffe an Polypeptide in einem schwachen Carbonatpuffer bei pH 9 gebunden werden. Man lässt die Reaktion fortschreiten für eine geeignete Zeit, typischerweise im Bereich von 30-60 Minuten. Nicht umgesetzter oder freier Farbstoff kann entfernt werden durch Gel-Exklusionschromatographie oder durch Dialyse. Stellenspezifische Fluoreszenzfarbstoffmarkierung des Substrats kann erhalten werden während der Synthese des Peptids, entweder durch die Verwendung einer markierten Aminosäure im Syntheseprozess oder durch die spezifische Entschützung und Markierung des Restes von Interesse vor der Entschützung anderer möglicherweise reaktiver Reste beim Abschluss der Synthese.
  • Die Assayverfahren gemäß der vorliegenden Erfindung werden geeigneterweise ausgeführt in den Wells einer Multiwell-platte, z.B. einer Mikrotiterplatte mit 24, 96, 384 oder höheren Dichten von Wells, z.B. 1536 Wells. Alternativ können die Assays ausgeführt werden in Assayröhrchen oder in den Mikrokanälen einer Mikrofluidvorrichtung. In einem typischen Kinaseassay gemäß des ersten Aspektes wird eine Kinase mit dem Substratmolekül bei Vorhandensein eines hochenergetischen Phosphat-Donors, wie ATP oder GTP in Kontakt gebracht. Die Reaktion kann ausgeführt werden, während der Substrat- und Phosphat-Donor anfänglich in einem wässrigen Assaypuffer vorhanden ist, geeigneterweise 10 mM MOPs, 50 mM Tris oder 50 mM HEPES, enthaltend 5 mM MgCl2. Der Assay kann ausgeführt werden entweder bei Vorhandensein von oder in Abwesenheit einer Probe eines Testmittels. Geeigneterweise werden die Komponenten der Reaktionsmischung minus dem Initiator in den Wells einer Mikrotiter-Platte vordispensiert. Die Reaktion wird dann initiiert durch die Zugabe des Enzyms. Alternativ kann eine Reaktionsmischung hergestellt werden, die ein Enzym und ein Substrat in einer geeigneten gepufferten Lösung enthält. In diesem Fall wird die Reaktion initiiert durch die Zugabe des Phosphat-Donors.
  • Typischerweise werden Kinaseassays ausgeführt unter „gestoppten" Bedingungen. So lässt man die Reaktion für eine vorbestimmte Zeit voranschreiten und dann wird die Reaktion durch ein Stoppreagenz terminiert, normalerweise ein Inhibitor der Enzymaktivität, das oft nicht-spezifisch ist. Ein Beispiel eines derartigen Stoppreagenz ist EDTA, das verwendet wird, um Metallionen abzusondern, die normalerweise für die enzymatische Aktivität erforderlich sind.
  • Messungen der Fluoreszenzintensität und Fluoreszenzlebensdauer können erfolgen unter Verwenden von Instrumenten, die Photovervielfacher als Detektoren eingebaut haben. Typischerweise können Verfahren zur Messung der Fluoreszenzlebensdauer basieren auf: i) Zeit-korrelierter Einzel-Photonenzählung oder ii) Frequenzdomäne (wie beschrieben in Principles of Fluorescence Spectroscopy von J R Lakowicz, 2. Ausg., 1999, Kapitel 4 und 5 Kluwer/Academic Press, New York), oder durch Zeit-Takten (siehe z.B. Sanders, et al, Analytical Biochemnistry, (1995), 227(2), 302-308). Änderungen in der Fluoreszenzintensität können gemessen werden mittels eines Charge-Coupled-Device(CCD)-Bildgebers (wie ein Scanning-Bildgeber oder einen Gebietsbildgeber), um alle der Wells einer Mikrotiterplatte abzubilden. Das LEADseekerTM-System weist eine CCD-Kamera auf, die eine Fluoreszenzbildgebung von hochdichten Mikrotiterplatten in einem einzelnen Durchlauf ermöglicht. Die Bildgebung ist quantitativ und schnell, und die Instrumentierung, die für Bildgebungsanwendungen geeignet ist, kann nun simultan die Gesamtheit einer Multiwellplatte abbilden.
  • Wo ein Assay zur Bestimmung der Aktivität eines Testmittels auf Kinaseaktivität formatiert werden soll, kann der Assay ausgeführt werden unter kontinuierlicher Messung der Fluoreszenz des Substrats. In diesem Format ändert sich die Intensität des fluoreszierend markierten Substrats kontinuierlich. Das markierte Substrat benötigt keine Trennung vom Produkt der enzymatischen Reaktion und so kann ein Zeitverlauf der Reaktion erhalten werden, was ermöglicht, dass kinetische Studien in Echtzeit ausgeführt werden.
  • In einer besonderen Ausführungsform des ersten oder zweiten Aspektes ist dss Enzym eine Tyrosinkinase und das Substrat ist ein Peptidsubstrat, das für jenes Enzym spezifisch ist, wie Abl-Peptid. Der Assay kann ausgeführt werden in einer Mikrotiterplatte unter wässrigen Bedingungen, unter Verwenden von entweder HEPES, Tris oder MOPs-Puffer bei einem pH von 7-8. Typischerweise wird die Pufferkonzentration ungefähr 50 mM betragen. Abhängig von dem Enzym, dessen Aktivität gemessen werden soll, können Salze, wie Natrium- oder Kaliumchlorid zugegeben werden. Der bevorzugte Phosphat-Donor ist ATP, der typischerweise vorhanden ist bei einer Konzentration von 2 × Km, d.h. im Bereich von 30-200 μM. Das Enzymsubstrat sollte vorhanden sein mit einer optimalen Konzentration von bei oder unterhalb Km was typischerweise im Bereich 1-100 μM sein wird. Zusätzliche Kofaktoren, wie Mg2+-Ionen können auch vorhanden sein bei einer geeigneten Konzentration für das gegebene Enzym, typischerweise im Bereich von 1-90 mM.
  • Das Substrat wird markiert mit einem Farbstoff, ausgewählt aus der Acridon-Farbstoffklasse, bevorzugt O-(N-Succinimidyl)-6-(9-oxo-9H-acridin-10yl)-hexanoat. Das nicht-phosphorylierte Peptidsubstrat kann unterschieden werden von der phosphorylierten Form des Substrats durch Detektieren und Messen von Unterschieden zwischen der Lebensdauer des Farbstoffs, der an das nicht-phosphorylierte Substrat gebunden ist, und der Lebensdauer des Farbstoffs der an das phosphorylierte Substrat gebunden ist. So können Änderungen sowohl in der Intensität als auch der Lebensdauer simultan überwacht werden, wodurch eine duale Parametermessung des Assays ermöglicht wird. Dies ergibt eine Anzahl von Vorteilen. Zuerst kann die Biologie der Assays durch das Erscheinungsbild der Lebensdauer bestätigt werden, die für das Produkt der enzymatische Reaktion charakteristisch ist und die Intensität des Produktes kann simultan überwacht werden. Zweitens kann die Entfernung des Substrats durch ihre charakteristische Fluoreszenzlebensdauer überwacht werden, und es kann beobachtet werden, dass die Fluoreszenzintensität des mit Farbstoff markierten Substrats abfällt. Drittens wird es möglich sein, eine quantitative Beziehung zwischen der Intensität jeder Spezies zu bestimmen; dies kann direkt in Konzentrationseinheiten für on-line-, Echtzeit-Überwachung der Reaktion umgewandelt werden.
  • Wo die Aktivität einer Phosphatase bestimmt werden soll, wird zuerst ein phosphoryliertes Substrat hergestellt. Ein Peptidsubstrat kann synthetisiert und dann phosphoryliert werden, oder alternativ kann eine oder mehrere phosphorylierte Aminosäuren in die Peptidkette während der Synthese eingebaut werden. Phosphorylierte Aminosäuren, die für den Einbau in chemisch synthetisierte Peptide geeignet sind, können kommerziell erhalten werden, z.B. von Bachem A.G. Fluoreszenzfarbstoffmarkierung eines phosphorylierten Peptids kann ausgeführt werden wie oben während der Synthese des Peptids, entweder durch die Verwendung einer markierten Aminosäure im Syntheseprozess oder durch die spezifische Entschützung und Markierung des Restes von Interesse vor der Entschützung anderer möglicherweise reaktiver Reste beim Abschluss der Synthese. Proteinphosphatasesubstrate müssen zuerst in einer geeigneten phosphorylierten Form vorliegen oder dazu umgewandelt werden, zur Verwendung in den Assays gemäß der Erfindung. Z.B. kann die Phosphorylase b (dephosphorylierte Form) an einem einzelnen Serinrest unter Verwenden von Phosphorylasekinase phosphoryliert werden, um Phosphorylase a zu erhalten. Das phosphorylierte Substrat wird dann markiert mit einem Fluoreszenzfarbstoffmarkierungsreagenz, bevorzugt ein Acridon oder Chinacridon.
  • Assayverfahren für Phosphatasen können auch ausgeführt werden in einem wässrigen gepufferten Medium, wobei der Puffer typischerweise im Bereich 10-200 mM bei pH 7-8 vorliegt, z.B. 50 mM Tris pH 7,2 (oder alternativ HEPES oder MOPS). Zusätzlich können Salze wie Natriumchlorid, im Bereich 10-100 mM zugegeben werden. Andere Faktoren wie DTT, 1-5 mM, EDTA, 100 μM – 2 mM und 0,05-0,1% BrijTM können auch in der Assaymischung enthalten sein. Das mit Farbstoff markierte phosphorylierte Substrat ist vorhanden im Bereich von 10-200 μM. Reaktionen werden initiiert durch die Zugaben von Phosphatase. Im Allgemeinen werden Reaktionen inkubiert für 30-60 Minuten bei 30°C und dann beendet durch Zugabe eines Stoppreagenz wie zuvor.
  • Die Verfahren gemäß der vorliegenden Erfindung können auch eingesetzt werden, um den Phosphorylierungsstatus eines Kinase- und Phosphatasesubstrats, das in einer zellulären Umgebung vorhanden ist, mittels auf Zellen basierender Assays zu messen.
  • So ist in einem fünften Aspekt der vorliegenden Erfindung bereitgestellt ein Verfahren zum Bestimmen des Phosphorylierungsstatus eines Substrats in einer zellulären Umgebung, wobei das Substrat mindestens eine Einheit umfasst, die fähig ist, durch ein zelluläres Enzym phosphoryliert oder dephosphoryliert zu werden, um ein Produkt zu ergeben, und wobei das Substrat mit einem Fluoreszenzfarbstoff markiert ist, wobei das Verfahren die Schritte umfasst:
    • i) Messen der Fluoreszenzintensität und der Fluoreszenzlebensdauer des fluoreszierend markierten Substrates in einer Zellen-freien Umgebung;
    • ii) Zugeben des Substrates zu einer oder mehreren Zellen in einem fluiden Medium; und
    • iii) Messen der Fluoreszenzintensität und der Fluoreszenzlebensdauer des Fluoreszenzmarkers nach dem Schritt ii);
    wobei eine Änderung in der Fluoreszenzintensität und der Fluoreszenzlebensdauer verwendet wird, um den Phosphorylierungsstatus des Substrates anzuzeigen.
  • Geeigneterweise ist das Substrat gemäß des fünften Aspektes ein Kinasesubstrat oder ein Phosphatasesubstrat.
  • Bevorzugt ist der Fluoreszenzfarbstoff ausgewählt aus den Acridon- und den Chinacridon-Farbstoffklassen wie zuvor beschrieben.
  • Geeigneterweise ist das Substrat konjugiert (oder fusioniert) an ein zweites Peptid oder Protein, wie ein Träger- oder Transportpeptid, was den Transport des Substrates durch die zelluläre Membran und in die Zelle vereinfacht.
  • Typischerweise werden kultivierte Zellen mit dem Konjugat bei einer Konzentration von 0,1-100 μM in einem geeigneten Zellkulturmedium unter Bedingungen inkubiert, die für das Zellwachstum geeignet sind, und für eine Zeit, die reichen kann von 0,5 bis 24 Stunden. Zellen werden kultiviert gemäß Standard-Zellkulturtechniken, z.B. werden Zellen in einem geeigneten Gefäß in einer sterilen Umgebung bei 37°C in einem Inkubator kultiviert, der eine Atmosphäre aus 95% befeuchtete Luft/5% CO2 enthält. Gefäße können enthalten gerührte oder stationäre Kulturen. Verschiedene Zellkulturmedien können verwendet werden, einschließlich Medien, die undefinierte biologische Fluide enthalten, wie fötales Kalbsserum, wie auch Medien, die vollständig definiert sind, wie Serum-freies 293 SFM II-Medium (Life Technologies Ltd., Paisely, UK). Es gibt etablierte Protokolle, die für die Kultur diverser Zelltypen erhältlich sind. (Siehe z.B. Freshney, R.1., Culture of Animal Cells: A Manual of Basic Technique, 2nd Edition, Alan R. Liss Inc. 1987).
  • Das Verfahren der Erfindung kann verwendet werden mit einem beliebigen anhaftenden oder nicht-anhaftenden Zelltypus, der kultiviert werden kann in Standardgewebekultur-Plastikware. Derartige Zelltypen umfassen alle Zellen, abgeleitet von einer beliebigen erkannten Quelle, z.B. Säuger, Pflanze, bakteriell, viral oder fungal und mit Bezug auf Spezies (z.B. menschlich, Nagetier, affenartig), Gewebequelle (z.B. Hirn, Leber, Lunge, Herz, Nierenhaut, Muskel) und Zelltyp (z.B. epithelial, endothelial). Wenn das Substrat erforderlich ist, um an Zellen geliefert zu werden, die in Zell- oder Gewebekultur gewachsen sind, wird das Konjugat einfach zum Kulturmedium gegeben.
  • In einer besonderen Ausführungsform des fünften Aspektes können die Zellen in Kontakt gebracht werden mit dem Konjugat bei Vorhandensein einer Substanz, deren Effekt aus dem Phosphorylierungsstatus des Substrats bestimmt werden soll.
  • In dieser Ausführungsform liefert der Detektionsschritt eine Messung des Effektes der Testsubstanz auf den Phosphorylierungsstatus und kann angewandt werden auf eine Verbindung, deren Metabolismus und Toxikologie gegenüber einem besonderen Zelltypus untersucht wird, z.B. Arzneimittel, Enzyminhibitoren und dergleichen.
  • Die Fluoreszenzfarbstoffe von jeder der Acridon- und Chinacridon-Farbstoffklassen können unterschieden werden voneinander mittels ihrer verschiedenen Lebensdauern. So können zwei oder mehrere verschiedene Substrate, jeweils markiert mit einem unterschiedlichen eines Satzes von Acridonfarbstoffen (oder mit einem unterschiedlichen eines Satzes von Chinacridonfarbstoffen) verwendet werden in Multipiexassays, in denen die Messung der Kinaseaktivitäten verschiedener Enzyme simultan ausgeführt werden kann.
  • In einem sechsten Aspekt der vorliegenden Erfindung ist bereitgestellt ein Verfahren des gleichzeitigen Messens der Kinaseaktivitäten zweier oder mehrerer unterschiedlicher Enzyme, wobei jedes Enzym für ein unterschiedliches Substrat spezifisch ist, wobei jedes Substrat mindestens eine Einheit umfasst, die fähig ist, durch ein Enzym phosphoryliert zu werden, um ein Produkt zu ergeben, und wobei jedes Substrat mit einem unterschiedlichen eines Satzes von Fluoreszenzfarbstoffen markiert ist, wobei das Verfahren die Schritte umfasst:
    • i) Messen der Fluoreszenzintensität und der Fluoreszenzlebensdauer jedes der fluoreszierend markierten Substrate;
    • ii) Kombinieren einer Mischung der Enzyme mit jedem der Substratmoleküle bei Vorhandensein einer Phosphatquelle; und
    • iii) Messen eines Anstiegs in der Fluoreszenzintensität und in der Fluoreszenzlebensdauer von jedem der Fluoreszenzmarker nach der Kombination des Schrittes ii);
    wobei der Anstieg in der Fluoreszenzintensität und in der Fluoreszenzlebensdauer von jedem der Fluoreszenzmarker verwendet wird, um die Phosphorylierungsaktivität jedes der Enzyme zu bestimmen.
  • Bevorzugt sind die Fluoreszenzfarbstoffe in dem Satz ausgewählt aus den Acridon- und Chinacridon-Farbstoffklassen wie zuvor beschrieben.
  • In einer Ausführungsform gemäß des sechsten Aspektes kann das Verfahren ausgeführt werden in vitro, entweder unter Verwenden von isolierten Enzymen oder alternativ kann eines oder mehrere der Enzyme eine Komponente eines Zelllysats sein.
  • In einer anderen Ausführungsform gemäß des sechsten Aspektes kann das Verfahren ausgeführt werden in einer zellulären Umgebung. In dieser Ausführungsform wird jedes der verschiedenen Substrate konjugiert (oder fusioniert) an ein zweites Peptid oder Protein, wie ein Träger- oder Transportpeptid, was den Transport des Substrates durch die zelluläre Membran und in die Zelle wie beschrieben vereinfacht.
  • Bevorzugt ist die Messung der Kinase, deren Aktivität gemessen wird, eine Tyrosinkinase.
  • In einem siebten Aspekt ist bereitgestellt eine Zusammensetzung umfassend:
    • i) ein Substrat für ein Kinaseenzym, wobei das Substrat mindestens eine Einheit umfasst, die fähig ist, durch das Enzym phosphoryliert zu werden, um ein phosphoryliertes Produkt zu ergeben, und wobei das Substrat markiert ist mit einem Fluoreszenzfarbstoff nach Anspruch 3; und
    • ii) eine Komponente ausgewählt aus einem Phosphat-Donor und der Kinase.
  • In einem achten Aspekt ist bereitgestellt ein Test-Kit zum Messen der Kinaseaktivität mindestens eines Enzyms, wobei das Test-Kit umfasst:
    • i) ein oder mehrere unterschiedliche Substrate, wobei jedes Substrat eine Einheit umfasst, die fähig ist, phosphoryliert zu werden, um ein Produkt zu ergeben, wobei jedes der Substrate markiert ist mit einem unterschiedlichen eines Satzes von Fluoreszenzfarbstoffen nach Anspruch 3; und ggf.
    • ii) ein oder mehrere unterschiedliche Enzyme, wobei jedes Enzym für ein unterschiedliches Substrat spezifisch ist.
  • In einem neunten Aspekten ist bereitgestellt ein Test-Kit zu Messen der Phosphataseaktivität mindestens eines Enzyms, wobei das Test-Kit umfasst:
    • i) ein oder mehrere unterschiedliche Substrate, wobei jedes der Substrate eine phosphorylierte Einheit umfasst, die fähig ist, dephosphoryliert zu werden, um ein Produkt zu ergeben, und wobei jedes der Substrate mit einem unterschiedlichen eines Satzes von Fluoreszenzfarbstoffen nach Anspruch 3 markiert ist; und ggf.
    • ii) ein oder mehrere unterschiedliche Enzyme, wobei jedes Enzym für ein unterschiedliches Substrat spezifisch ist.
  • Vorteile der vorliegenden Erfindung
  • Die vorliegende Erfindung vereinfacht herkömmliche Assaymethodiken durch eine verringernde Anzahl von erforderlichen Schritten. Außerdem kann in herkömmlichen (auf Radioaktivität basierenden) Kinaseassays die Konzentration des Phosphat-Donors nicht genutzt werden bei einer optimalen Konzentration. Z.B. kann in radioaktiven Assays die ATP-Konzentration of bei 1/10 von Km liegen, dies wird typischerweise 1-10 μM sein, wohingegen es üblicherweise empfohlen ist, Kinaseassays bei zweifacher oder höherer Km für ATP auszuführen. In der vorliegenden Erfindung beeinflusst die Konzentration von ATP nicht das Auslesen und kann deshalb genutzt werden bei optimalen Niveaus für den Assay, unabhängig von der Auslese-Fluoreszenztechnologie.
  • Gemäß des Verfahrens der vorliegenden Erfindung ist es möglich, beliebige Reagenzien zu der Mischung in einer beliebigen Reihenfolge zuzugeben, während eine entscheidende Komponente weggelassen wird. So kann eine Reaktionsmischung hergestellt werden unter Weglassen von ATP, aber enthaltend alle anderen Komponenten der Reaktion. Vor dem Zugeben des ATP (Initiator) kann die Reaktion überwacht werden auf nicht-spezifische Effekte. Es ist auch möglich, eine Mischung ohne Enzym für weitere Kontrollen zu konstruieren. Aufgrund der Natur der Reaktionen ist es dann möglich, die Endkomponente zuzugeben und Änderungen entweder in Echtzeit oder durch Stoppen der Reaktion nach dem Initiationsschritt zu überwachen.
  • Außerdem können Fluoreszenzlebensdauer-Messungen, die in der vorliegenden Erfindung genutzt werden können, signifikante Vorteile gegenüber herkömmlichen Fluoreszenztechniken bieten, die nur auf der Quantifizierung der Fluoreszenzintensität basieren. Fluoreszenzlebensdauer wird bestimmt aus demselben spektral aufgelösten Intensitätssignal, ist aber zusätzlich aufgelöst in der Zeitdomäne. Fluoreszenzlebensdauertechniken liefern eine größere Empfindlichkeit, weil das Signal größtenteils durch „Untergrundrauschen" nicht beeinflusst ist. Ein weiterer Vorteil mit dieser Technik ist, dass verschiedene unterschiedliche Ereignisse gleichzeitig gemessen werden können durch Auswählen von Labels mit unterscheidbaren Lebensdauern, was so das Multiplexen ermöglicht. Zusätzlich sind die Messungen der Fluoreszenzlebensdauer nicht beeinflusst von Konzentrationseffekten und Photobleichen.
  • Die vorliegende Erfindung wird weiter veranschaulicht mit Bezugnahme auf die vorliegenden Figuren und Beispiele, in denen:
  • 1 die Unterschiede in den Lebensdauern und Intensitäten darstellt, die bei der Phosphorylierung eines Abl-Peptids gemäß Beispiel 5 beobachtet werden;
  • 2 die Phosphorylierung eines Peptids durch die Proteintyrosinkinase Abl gemäß Beispiel 6 darstellt;
  • 3 ein Plot ist, der die zeitabhängige Phosphorylierung des Myelin-Basic-Proteins durch Erk-Kinase gemäß Beispiel 7 zeigt;
  • 4 ein Plot ist, der die Inhibierung der Erk-Kinase durch Staurosporin gemäß Beispiel 8 zeigt;
  • 5 ein Zeitverlauf für die Phosphorylierung durch die Tyrosinkinase Lck gemäß Beispiel 9 ist;
  • 6 ein Plot ist, der die ATP-Abhängigkeit der Phosphorylierung durch die Tyrosinkinase Lck gemäß Beispiel 10 darstellt;
  • 7 ein Plot ist, der die Enzymabhängigkeit der Phosphorylierung durch die Tyrosinkinase Lck gemäß Beispiel 11 zeigt;
  • 8 ein Plot ist, der die Inhibierung der Lck-Kinaseaktivität durch Staurosporin gemäß Beispiel 12 zeigt;
  • 9 ein Zeitverlauf für eine Dephosphorylierungsreaktion durch Protein-Tyrosinphosphatase gemäß Beispiel 13 ist.
  • Beispiele
  • Beispiel 1: Markieren von H-Glu-Ala-IIe-Tyr-Ala-Ala-Pro-Phe-Ala-Lys-Lys-Lys-NH2 mit O-(N-Succinimidyl)-6-(9-oxo-9H-acridin-10yl)hexanoat
  • 1.1 H-Glu-Ala-Ile-Tyr-Ala-Ala-Pro-Phe-Ala-Lys-Lys-Lys-Rink-Amid-Harz: H-Glu-Ala-Ile-Tyr(PO3H2)-Ala-Ala-Pro-Phe-Ala-Lys-Lys-Lys-Rink-Amid-Harz
  • H-Glu-Ala-Ile-Tyr-Ala-Ala-Pro-Phe-Ala-Lys-Lys-LysrRink-Amid-Harz und H-Glu-Ala-Ile-Tyr(PO3H2)-Ala-Ala-Pro-Phe-Ala-Lys-Lys-Lys-Rink-Amid-Harz wurden synthetisiert unter Verwenden eines kommerziell erhältlichen automatisierten Peptidsynthetisierers Applied Biosystems Model 433A und FastMocTMChemie, durchgehend den vom Instrumentenhersteller empfohlenen Prozeduren folgend. Beide Synthesen wurden ausgeführt auf einer 0,25 millimolaren Skala.
  • 1.2 Synthese von H-Glu-Ala-lle-Tyr-Ala-Ala-Pro-Phe-Ala-Lys-Lys-Lys-NH2 (Abl Kinasesubstrat)
  • Das rohe Peptid wurde entschützt und gespalten von der festen Phase unter Verwenden einer Mischung von 95% Trifluoressigsäure: 2,5% Wasser: 2,5% Triisopropylsilan. Das rohe Peptid, das aus der Spaltreaktion erhalten wurde, wurde durch herkömmliche C-18-Reversphasen-HPLC gereinigt unter Verwenden eines linearen Gradienten von Wasser/Acetonitril (beide enthaltend 0,1% Trifluoressigsäure). Nach der Reinigung wurde das Peptid lyophilisiert und charakterisiert durch Maldi TOF-Massenspektroskopie und HPLC.
  • 1.3 Synthese von H-Glu-Ala-Ile-Tyr(PO3H2)-Ala-Ala-Pro-Phe-Ala-Lys-Lys-Lys-NH2
  • Dies wurde hergestellt wie in 1.2 oben unter Verwenden von H-Glu-Ala-Ile-Tyr(PO3H2)-Ala-Ala-Pro-Phe-Ala-Lys-Lys-Lys-Rink-Amid-Harz.
  • 1.4 Markieren von H-Glu-Ala-Ile-Tyr-Ala-Ala-Pro-Phe-Ala-Lys-Lys-Lys-NH2 mit O-(N-Succinimidyl)-6-(9-oxo-9H-acridin-10yl)hexanoat (Ace-14)
  • H-Glu-Ala-Ile-Tyr-Ala-Ala-Pro-Phe-Ala-Lys-Lys-Lys-Rink-Amid-Harz wurde markiert am N-Terminus auf Festphase mit O-(N-Succinimidyl)-6-(9-oxo-9H-acridin-10yl)hexanoat (1,5 eq) (Amersham Biosciences) in Dimethylsulfoxid und Diisopropylethylamin (4 Volumen-%) über Nacht bei Raumtemperatur. Das Harz wurde gewaschen mit DMSO, gefolgt von Methanol und schließlich mit Dichlormethan und dann getrocknet in vacuo. Das markierte Peptid wurde entschützt und gespalten von der festen Phase unter Verwendung einer Mischung von 95% Trifluoressigsäure: 2,5% Wasser: 2,5% Triisopropylsilan. Das Rohmaterial, das durch Präzipitation aus kaltem Diethyleter isoliert wurde und gereinigt wurde durch C-18-Reversphasen-HPLC unter Verwenden eines linearen Gradienten von Wasser/Acetonitril (beide enthaltend 0,1% Trifluoressigsäure). Nach der Reinigung wurde das mono-markierte Peptid lyophilisiert und charakterisiert durch Maldi-TOF-Massenspektroskopie, UV und HPLC.
  • 1.5 Markieren von H-Glu-Ala-Ile-Tyr(PO3H2)-Ala-Ala-Pro-Phe-Ala-Lys-Lys-Lys-NH2 mit O-(N-Succinimidyl)-6-(9-oxo-9H-acridin-10yl)hexanoat (Ace-14)
  • Dies wurde hergestellt wie in 1.4 oben, mit der Ausnahme, dass H-Glu-Ala-Ile-Tyr(PO3H2)-Ala-Ala-Pro-Phe-Ala-Lys-Lys-Lys-Rink-Amid-Harz verwendet wurde.
  • Beispiel 2: Markieren von Myelin-Basic-Protein (MBP) mit O-(N-Succinimidyl)-6-(9-oxo-9H-acridin-10yl)hexanoat (Ace-14)
  • i) Verfahren 1
  • 100 mg MBP (100 mg; 7 mg/ml) wurde dialysiert über Nacht bei +4°C in 0,1 m NaHCO3-Lösung, O-(N-Succinimidyl)-6-(9-oxo-9H-acridin-10yl)hexanoat (10 mg) wurde aufgelöst in 1 ml DMSO (Aldrich) und zu der Probe von dialysiertem MBP gegeben. Die resultierende Mischung wurde 45 Minuten lang gerührt. 10 PD10-Säulen (Amersham Biosciences) wurden ins Gleichgewicht gebracht mit 10 ml 10 mM MOPS pH 7,2. Markiertes MBP (1,3 ml Aliquote) wurde zu jeder Säule gegeben und die Säulen wurden gewaschen mit 10 mM MOPS (1 ml). Jede Säule wurde eluiert mit 3 ml 10 mM MOPS und die Eluanten gesammelt. Die Endproteinkonzentration wurde bestimmt unter Verwenden des Biorad-Protein-Assays (500-006) mit BSA als ein Standard (0,1 mg/ml). Die Endkonzentration von MBP betrug 1,44 mg/ml in einem Gesamtvolumen von 30 ml. Das markierte MBP wurde konzentriert unter Verwenden von Amicon Centripreps YM-10 (10.000 NMWL) (verwirbelt für 15 Minuten). Nachfolgende Proteinbestimmung ergab eine Konzentration von 4,5 mg/ml (7,1 ml). Das mit Acridon markierte MBP wurde verdünnt mit 500 mM MOPS pH 7,2, 50 mM MgCl2, 1 mM ATP und PF-H2O auf eine Konzentration von 16,6 μM.
  • ii) Verfahren 2
  • MBP (100 mg; 7 mg/ml) wurde über Nacht bei +4°C in einer PBS-Lösung (0,01 M Posphatpuffer, 0,0027 M Kaliumchlorid und 0,137 M Natriumchlorid, pH 7,4) Sigma P-4417 dialysiert. O-(N-Succinimidyl)-6-(9-oxo-9H-acridin-10yl)hexanoat (10 mg) wurde aufgelöst in 1 ml DMSO (Aldrich) und zugegeben zum dialysiertem MBP. Die Mischung wurde durch Rollen gemischt über Nacht bei +4°C. 10 PD10-Säulen (Amersham Biosciences) wurden ins Gleichgewicht gebracht mit 10 ml 10 mM MOPS pH 7,2. Aliquote von 1,3 ml markiertem MBP wurden zugegeben zu jeder Säule, jede Säule wurde mit einem weiteren 1 ml 10 mM MOPS gewaschen. Jede Säule wurde dann eluiert mit 3 ml 10 mM MOPS und die Eluaten wurden gesammelt. Die Proteinkonzentration wurde bestimmt unter Verwenden des Biorad-Protein-Assays (500-006) mit BSA als ein Standard bei 0,1 mg/ml. Die Konzentration des markierten MBP wurde als 1,4 mg/ml in einem Gesamtvolumen von 28 ml gefunden. Das markierte MBP wurde wieder konzentriert unter Verwenden von Amicon Centripreps YM-10 (10.000 NMWL) (verwirbelt für 10 Minuten). Nachfolgende Proteinbestimmung ergab eine Konzentration von 3,25 mg/ml in einem Gesamtvolumen von 9,7 ml. Das mit Farbstoff markierte MBP wurde verdünnt mit 500 mM MOPS pH 7,2, 50 mM MgCl2, 1 mM ATP und PF-H2O auf eine Konzentration von 16,6 μM.
  • Beispiel 3: Markieren von H-Glu-Pro-Glu-Gly-Ile-Tyr-Gly-Val-Leu-Phe-NH2 mit O-(N-Succinimidyl)-6-(9-oxo-9H-acridin-10yl)hexanoat
  • 3.1 H-Glu-Pro-Glu-Gly-Ile-Tyr-Gly-Val-Leu-Phe-Rink-Amid-Harz (Lck Kinasesubstrat); H-Glu-Pro-Glu-Gly-Ile-Tyr(PO3H2)-Gly-Val-Leu-Phe-Rink-Amid-Harz
  • H-Glu-Pro-Glu-Gly-Ile-Tyr-Gly-Val-Leu-Phe-Rink-Amid-Harz und H-Glu-Pro-Glu-Gly-Ile-Tyr(PO3H2)-Gly-Val-Leu-Phe-Rink-Amid-Harz wurden synthetisiert unter Verwenden eines kommerziell erhältlichen automatisierten Peptidsynthetisierers Applied Biosystems Model 433A und FastMocTM Chemie, durchweg den vom Instrumentenhersteller empfohlenen Prozeduren folgend. Die Synthesen wurden ausgeführt auf einer 0,25 millimolaren Skala.
  • 3.2 Markieren von H-Glu-Pro-Glu-Gly-Ile-Tyr-Gly-Val-Leu-Phe-NH2 mit O-(N-Succinimidyl)-6-(9-oxo-9H-acridin-10yl)hexanoat (Ace-14)
  • H-Glu-Pro-Glu-Gly-Ile-Tyr-Gly-Val-Leu-Phe-Rink-Amid-Harz wurde markiert am N-Terminus auf fester Phase mit O-(N-Succinimidyl)-6-(9-oxo-9H-acridin-10yl)hexanoat (1,5 eq) (Amersham Biosciences) in Dimethylsulfoxid und Diisopropylethylamin (4 Volumen-%) über Nacht bei Raumtemperatur. Das Harz wurde gewaschen mit DMSO, gefolgt von Methanol und schließlich mit Dichlormethan und dann getrocknet in vacuo. Das markierte Peptid wurde entschützt und gespalten von der festen Phase unter Verwendung einer Mischung von 95% Trifluoressigsäure: 2,5% Wasser: 2,5% Triisopropylsilan. Das Rohmaterial, das durch Präzipitation aus kaltem Diethyleter isoliert wurde und gereinigt wurde durch C-18-Reversphasen-HPLC unter Verwenden eines linearen Gradienten von Wasser/Acetonitril (beide enthalten 0,1% Trifluoressigsäure). Nach der Reinigung wurde das mono-markierte Peptid lyophilisiert und charakterisiert durch Maldi-TOF-Massenspektroskopie, UV und HPLC.
  • 3.3 Markieren von H-Glu-Pro-Glu-Gly-Ile-Tyr(PO3H2)-Gly-Val-Leu-Phe-NH2 mit O-(N-Succinimidyl)-6-(9-oxo-9H-acridin-10yl)hexanoat
  • Dies wurde hergestellt wie beschrieben in 3.2 oben mit Ausnahme, dass H-Glu-Pro-Glu-Gly-Ile-Tyr(PO3H2)-Gly-Val-Leu-Phe-Rink-Amid-Harz verwendet wurde.
  • 3.4 Markieren von H-Glu-Pro-Glu-Gly-Ile-Tyr-Gly-Val-Leu-Phe-NH2 mit O-(N-Succinimidyl)-6-(2-acetamido-9-oxo-9H-acridin-10yl)hexanoat (Ace-17)
  • Diese Synthesen wurden ausgeführt wie beschrieben im Beispiel 3,2 mit Ausnahme, dass O-(N-Succinimidyl)-6-(2-acetamido-9-oxo-9H-acridin-10yl)hexanoat (Ace-17) anstelle von O-(N-Succinimidyl)-6-(9-oxo-9H-acridin-10yl)hexanoat (Ace-14) verwendet wurde.
  • Beispiel 4: Markieren von H-Thr-Arq-Asp-Ile-Tyr(PO3H2)-Glu-Thr-Asp-NH2 mit O-(N-Succinimidyl)-6-(9-oxo-9H-acridin-10yl)hexanoat (Ace-14)
  • Diese Synthese wurde ausgeführt wie im Beispiel 3.2, mit Ausnahme, dass das H-Thr-Arg-Asp-Ile-Tyr(PO3H2)-Glu-Thr-Asp-Rink-Amid-Harz verwendet wurde. Das nicht-phosphorylierte Peptid wurde synthetisiert auf eine ähnliche Weise.
  • Beispiel 5: Detektion von phosphorylierten und nicht-phosphorylierten Peptiden unter Verwenden von Abl-Peptiden
  • 1 μM-Lösungen der phosphorylierten und nicht-phosphorylierten Formen des Abl-Peptids wurden hergestellt in 10 mM MOPs-Puffer pH 7,2. Die Fluoreszenzintensitäten und Lebensdauern der Lösung wurden verglichen.
  • Ergebnisse
  • Klare Unterschiede können gesehen werden zwischen den zwei Peptiden. Die Intensität des nicht-phosphorylierten Peptids betrug annähernd 7 × 104 rfu, während jene des phosphorylierten Peptids annähernd 9 × 104 rfu betrug. Die Lebensdauer des nicht-phosphorylierten Peptids betrug ungefähr 10 nsec, wohingegen jene des phosphoylierten Peptids 15 nsecs betrugen. Siehe 1.
  • Beispiel 6: Assay von Tyrosinkinase-Abl
  • Eine Abl-Reaktionsmischung wurde hergestellt durch Mischen von 1 ml Reaktionspuffer (50 mM Tris-HCl, 10 mM MgCl2, 1 mM EGTA, 2 mM Dithiothreitol (pH 7,5 bei 25°C)), 10 μl 10 mM ATP, 2 μl mit 6-(9-oxo-9H-acridin-10yl)hexanoatmarkiertem Abl-Peptid-Substrat (nicht–phosphorylisiert) (500 μM in DMSO). 100 μl dieser Mischung wurden angeordnet in den Wells einer schwarzen Steh-Mikrotiterplatte. Die Reaktion wurde initiiert durch die Zugabe von 10 μl Abl-Kinase (New England Biolabs, Code P 6050L Lot 5), (100.000 Einheiten/ml oder 100 Einheiten/μl), die in Reaktionspuffer (50 mM Tris-HCl, 10 mM MgCl2, 1 mM EGTA, 2 mM Dithiothreitol, 0,01% Brij 35 (pH 7,5 bei 25°C) auf eine Konzentration von 100 Einheiten pro 10 μl verdünnt worden war.
  • Die Reaktion wurde überwacht in 30 Sekunden-Intervallen, sowohl auf Lebensdauer als auch Intensitätsänderungen, die für das Produkt und das Substrat charakteristisch sind.
  • Ergebnisse
  • Wie in 2 gezeigt ist, kann der Fortschritt der Reaktion in Echtzeit überwacht werden. Insbesondere sind die Änderungen in der Produktintensität größer als jene des Substrats, was aus der Studie der isolierten Peptide vorhergesagt würde. Außerdem ist es möglich, diese Reaktion ohne involvierten Trennschritt auszuführen, und das Substrat und das Produkt auf der Basis ihrer entsprechenden Fluoreszenzlebensdauern zu unterscheiden.
  • Beispiel 7: Zeit-abhängige Phosphorylierunq von Myelin-Basic-Protein durch Erk-Kinase
  • Myelin-Basic-Protein (MBP), markiert mit O-(N-Succinimidyl)-6-(9-oxo-9H-acridin-10yl)hexanoat (hergestellt gemäß Beispiel 2, Verfahren 1) (1 ml), wurde verdünnt auf 10 ml mit Wasser, was eine Lösung ergab, die 50 mM MOPS, pH 7,2, 5 nM MgCl2, 100 μm ATP und 1,66 μM MBP enthielt. Sieben Aliquote von 200 μl der Reaktionsmischung wurden jeweils gemischt mit 5 μl der Erk-1 Kinase (1,8 mg/ml). Die Reaktionen wurden inkubiert bei Raumtemperatur für verschiedene Zeiten, 100 μl Aliquote wurden entzogen und die Fluoreszenz jedes Aliquots wurde gemessen.
  • Ergebnisse
  • Die Ergebnisse sind in 3 gezeigt und zeigen einen Zeit-abhängigen Anstieg in der Fluoreszenz an.
  • Beispiel 8: Inhibierung der Erk-Kinase durch Staurosporin
  • Myelin-Basic-Protein (MBP), markiert mit O-(N-Succinimidyl)-6-(9-oxo-9H-acridin-10yl)hexanoat (hergestellt gemäß Beispiel 2, Verfahren 1) (1 ml), wurde verdünnt auf 10 ml mit Wasser, was eine Lösung ergab, die 50 mM MOPS, pH 7,2, 5 nM MgCl2 100 μm ATP und 1,66 μM MBP enthielt. Sieben Aliquote von 100 μl wurden zusammengestellt auf eine Konzentration von 0-100 μM in Bezug auf Staurosporin. Schließlich wurden 2 μl Erk-1-Kinase (1,8 mg/ml) zu jeder Reaktionsmischung gegeben. Die Reaktionsmischungen wurden bei Raumtemperatur für drei Stunden inkubiert, wonach 100 μl 100 mM EDTA zugegeben wurden, um die Reaktionen zu stoppen. Fluoreszenzintensitäten der Reaktionen wurden dann bestimmt.
  • Ergebnisse
  • Die Enzymreaktion wird inhibiert in einer Dosis-abhängigen Weise durch Staurosporin, wie in 4 gezeigt ist.
  • Beispiel 9: Zeitverlauf für die Phosphorylierung durch die Tyrosinkinase LcK
  • Wiederholungen von N-(6-(9-oxo-9H-acridin-10yl)-hexanoyl)-Glu-Pro-Glu-Gly-Ile-Tyr-Gly-Val-Leu-Phe-Amid (500 nM) in 50 mM TRIS/10 mM MgCl2/2,5 mM MnCl2, pH 7,2 bei Vorhandensein von 50 μM ATP in einem Volumen von 100 μl wurden in die Wells einer schwarzen 96-Well-Mikroplatte (Costar, Code 3650) pipettiert. Der Zeitverlauf wurde initiiert durch die Zugabe von 12,7 milli-Einheiten des Lck-Enzyms (Upstate Biotechnology, Code 14-379) in einem Volumen von 10 μl. Die Reaktion wurde überwacht in Ein-Minuten-Intervallen bei Umgebungstemperatur auf sowohl Lebensdauer- als auch Intensitätsänderungen, die sowohl für das Substrat als auch für das Produkt charakteristisch sind.
  • Ergebnisse
  • Die Ergebnisse, wie sie in 5 gezeigt sind, zeigen an, dass die Bildung des Produktes von der Zeit abhängig ist.
  • Beispiel 10: ATP-Abhängigkeit der Phosphorvlierung durch die Tyrosinkinase Lck
  • Wiederholungen von N-(6-(2-acetamido-9-oxo-9H-acridin-10yl)-hexanoyl)-Glu-Pro-Glu-Gly-Ile-Tyr-Gly-Val-Leu-Phe-Amid (500 nM) in 50 mM TRIS/10 mM MgCl2/2,5 mM MnCl2, pH 7,2 und bei Vorhandensein verschiedener Konzentrationen von ATP in einem Volumen von 100 μl wurden pipettiert in die Wells einer schwarzen 96-Well-Mikroplatte (Costar, Code 3650). Die Reaktionen wurden initiiert durch Zugabe von 12,7 milli-Einheiten des Lck-Enzyms (Upstate Biotechnology, Code 14-379) in einem Volumen von 10 μl. Nach der Inkubation bei Raumtemperatur für 60 Minuten wurden die Reaktionen gestoppt durch Zugabe von 0,1 M Citrat-Puffer pH 3,0 (20 μl) zu jedem Well. Die Reaktionen wurden überwacht auf sowohl Lebensdauer- als auch Intensitätsänderungen, die sowohl für das Substrat als auch das Produkt charakteristisch sind.
  • Ergebnisse
  • Die Ergebnisse sind in 6 gezeigt, die anzeigt, dass die Bildung des Produktes von der ATP-Konzentration abhängig ist.
  • Beispiel 11: Enzymabhängigkeit der Phosphorvlierung durch die Tyrosinkinase Lck
  • Wiederholungen von N-(6-(9-oxo-9H-acridin-10yl)-hexanoyl)-Glu-Pro-Glu-Gly-Ile-Tyr-Gly-Val-Leu-Phe-Amid (500 nM) in 50 mM TRIS/10 mM MgCl2/2,5 mM MnCl2, pH 7,2 und bei Vorhandensein verschiedener Konzentrationen von ATP in einem Volumen von 100 μl wurden pipettiert in die Wells einer schwarzen 96-Well-Mikroplatte (Costar, Code 3650). Die Reaktionen wurden initiiert durch Zugabe von Mengen des Lck-Enzyms (Upstate Biotechnology, Code 14-379) in einem Volumen von 10 μl. Nach der Inkubation bei Raumtemperatur für 90 Minuten wurden die Reaktionen gestoppt durch Zugabe von 0,1 M Citrat-Puffer pH 3,0 (20 μl) zu jedem Well. Die Reaktionen wurden überwacht auf sowohl Lebensdauer- als auch Intensitätsänderungen, die sowohl für das Substrat als auch das Produkt charakteristisch sind.
  • Ergebnisse
  • Die Ergebnisse in 7 zeigen, dass die Bildung des Produktes abhängig ist von der Enzymkonzentration.
  • Beispiel 12: Staurosporin-Inhibitionskurve mit Tyrosinkinase Lck
  • Staurosporin (Sigma, Code S4400, 1 mM in DMSO) wurde verdünnt mit 10 %-igem (V/V) DMSO in Assaypuffer (50 mM TRIS/10 mM MgCl2/2,5 mM MnCl2, pH 7,2), um die folgenden Konzentrationen von Staurosporin herzustellen – 100 μM, 10 μM, 1 μM 100 nM, 10 nM, 1 nM. Die Reaktionsmischung wurde hergestellt: 10 ml Assaypuffer + 2,5 μl N-(6-(9-Oxo-9H-acridin-10-yl)hexanoyl)-Glu-Pro-Glu-Gly-Ile-Tyr-Gly-Val-Leu-Phe-Amid (1 mM) + 20 μl ATP (10 mM). Fünf Wiederholungen (10 μl) jeder Inhibitorkonzentration wurden in die Wells einer schwarzen 96-well-Mikroplatte (Costar, Code 3650) pipettiert. Die Reaktionsmischung (100 μl) wurde in jedes Well gegeben. Die Reaktionen wurden initiiert durch Zugabe von 12,7 milli-Einheiten Lck-Enzym (Upstate Biotechnology, Code 14-379) in einem Volumen von 10 μl. Nach der Inkubation bei Raumtemperatur für 60 Minuten wurden die Reaktionen durch Zugabe von 0,1 M Citratpuffer pH 3,0 (20 μl) in jedes Well gestoppt. Die Reaktionen wurden überwacht auf sowohl Lebensdauer- als auch Intensitätsänderungen, die sowohl für das Substrat als auch für das Produkt charakteristisch sind.
  • Ergebnisse
  • Die Ergebnisse in 8 zeigen die Inhibierung der Lck-Kinase-Aktivität durch Staurosporin; der IC50-Wert beträt 16 nM. Park et al (Anal. Biochem., (1999), 269, 94-104) berichteten einen IC50-Wert von ungefähr 10 nM unter Verwenden von ATP bei 2 μM Endkonzentration und einer ähnlichen Peptidsequenz in einem zeitaufgelösten Fluoreszenzformatassay.
  • Beispiel 13: Zeitverlauf für die Dephosphorylierungsreaktion durch Protein-Tvrosin-Phosphatase
  • Wiederholungen von N-(6-(9-Oxo-9H-acridin-10-yl)hexanoyl)-Thr-Arg-Asp-Ile-Tyr(PO3H2)-Glu-Thr-Asp-NH2 (1 μM) in IRIS-gepufferter Salzlösung, pH 7,6 in einem Volumen von 100 μl wurden pipettiert in die Wells einer schwarzen 96-Well-Mikroplatte (Costar, Code 3650). Der Zeitverlauf wurde initiiert durch die Zugabe von 88 Einheiten Protein-Tyrosin-Phosphataseenzym (Sigma, Code P9864) in einem Volumen von 10 μl. Die Reaktion wird überwacht in Ein-Minuten-Intervallen bei Umgebungstemperatur auf sowohl Lebensdauer- als auch Intensitätsänderungen, die sowohl für das Substrat als auch das Produkt charakteristisch sind.
  • Ergebnisse
  • 9 ist ein Plot, der die Dephosphorylierung des Substrats durch diese Phosphatase zeigt. Das Erscheinen des dephosphorylierten Produktes wird auch überwacht. Sequenzliste
    Figure 00380001
    Figure 00390001
    Figure 00400001
    Figure 00410001
    Sequenzliste
    Figure 00420001
    Figure 00430001
    Figure 00440001
  • LITERATURSTELLEN, DIE IN DER BESCHREIBUNG ZITIERT SIND
  • Diese Liste von Literaturstellen, die vom Anmelder zitiert sind, dienen nur zum Nutzen des Lesers. Sie bilden nicht Teil des europäischen Patendokumentes. Sogar obwohl große Sorgfalt aufgebracht wurde, die Literaturstellen zu erarbeiten, können Irrtümer oder Unterlassungen nicht ausgeschlossen werden und das EPA erkennt keinerlei Haftung in dieser Hinsicht an.
  • Patentdokumente, zitiert in der Beschreibung
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    • • WO 0075167 A , Sportsman [0006]
    • • JP 2001019700 A [0007]
    • • US 5807746 A [0029]
    • • WO 9964455 A [0029]
    • • WO 9712912 A [0029]
    • • WO 9905302 A [0029]
    • • WO 02099424 A2 [0033]
    • • WO 021099432 A2 [0033]
    • • GB 0301683 A [0101]
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Claims (42)

  1. Verfahren zum Bestimmen der Phosphorylierungsaktivität eines Enzyms, das auf ein Substratmolekül wirkt, wobei das Substrat mindestens eine Einheit umfasst, die fähig ist, durch das Enzym phosphoryliert zu werden, um ein phosphoryliertes Produkt zu ergeben, und wobei das Substrat mit einem Fluoreszenzfarbstoff markiert ist, wobei das Verfahren die Schritte umfasst: (iv) Messen der Fluoreszenzintensität und der Fluoreszenzlebensdauer des fluoreszierend markierten Substrats; (v) Kombinieren des Enzyms mit dem Substratmolekül bei Vorhandensein eines Phosphat-Donors, und (vi) Messen einer Änderung in der Fluoreszenzintensität und in der Fluoreszenzlebensdauer des Fluoreszenzmarkers nach der Kombination des Schrittes ii); wobei die Änderung in der Fluoreszenzintensität und in der Fluoreszenzlebensdauer des Fluoreszenzmarkers verwendet wird, um die Phosphorylierungsaktivität des Enzyms zu bestimmen.
  2. Verfahren nach Anspruch 1, wobei das Substrat mit einem Fluoreszenzfarbstoff markiert ist, der ausgewählt ist aus den Acridon- und den Chinacridon-Farbstoffklassen.
  3. Verfahren zum Bestimmen der Phosphorylierungsaktivität eines Enzyms, das auf ein Substratmolekül wirkt, wobei das Substrat mindestens eine Einheit umfasst, die fähig ist, durch das Enzym phosphoryliert zu werden, um ein phosphoryliertes Produkt zu ergeben, und wobei das Substrat markiert ist mit einem Fluoreszenzfarbstoff der Formel:
    Figure 00480001
    oder
    Figure 00480002
    wobei: Z1 und Z2 unabhängig die Atome repräsentieren, die zum Vervollständigen eines oder mehrerer kondensierter aromatischer oder heteroaromatischer Ringsysteme nötig sind, wobei jeder Ring aufweist fünf oder sechs Atome, die aus Kohlenstoffatomen ausgewählt sind, und gegebenenfalls nicht mehr als zwei Atome, die aus Sauerstoff, Stickstoff und Schwefel ausgewählt sind; R1, R2, R3, R4, R5 (und R6, R7 und R8, falls vorhanden) unabhängig ausgewählt sind aus Wasserstoff, Halogen, Amid, Hydroxyl, Cyano, Amino, Mono- oder Di-C1-C4-alkyl-substituiertem Amino, Sulfhydryl, Carbonyl, Carboxyl, C1-C6-Alkoxy, Aryl, Heteroaryl, C1-C20-Alkyl, Aralkyl; der Gruppe -E-F, wobei E eine Spacer-Gruppe ist mit einer Kette von 1 bis 60 Atomen, die aus der Gruppe ausgewählt sind, die besteht aus Kohlenstoff-, Stickstoff-, Sauerstoff-, Schwefel- und Phosphoratomen, und F eine Zielbindungsgruppe ist; und der Gruppe -(CH2-)nY, wobei Y ausgewählt ist aus Sulfonat, Sulfat, Phosphonat, Phosphat, quaternärem Ammonium und Carboxyl und n für Null oder eine ganze Zahl von 1 bis 6 steht; das Verfahren die Schritte umfasst: i) Messen der Fluoreszenzintensität des fluoreszierend markierten Substrates; ii) Kombinieren des Enzyms mit dem Substratmolekül bei Vorhandensein eines Phosphat-Donors; und iii) Messen eines Anstiegs in der Fluoreszenzintensität des Fluoreszenzmarkers nach der Kombination des Schrittes ii); wobei der Anstieg in der Fluoreszenzintensität des Fluoreszenzmarkers verwendet wird, um die Phosphorylierungsaktivität des Enzyms zu bestimmen.
  4. Verfahren nach Anspruch 3, wobei die Messschritte i) und iii) zusätzlich umfassen die Messung der Fluoreszenzlebensdauer des Fluoreszenzmarkers; wobei ein Anstieg in der Fluoreszenzintensität und in der Fluoreszenzlebensdauer bei der Phosphorylierung des Farbstoff-markierten Substrates verwendet wird, um die Phosphorylierungsaktivität des Enzyms zu bestimmen.
  5. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, wobei das Substratmolekül ausgewählt ist aus natürlichen Proteinen (einschließlich post-translational modifizierten Proteinen, wie Glycoproteine und Lipoproteine), und synthetischen Peptiden.
  6. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 5, wobei das Substratmolekül mindestens eine Aminosäure umfasst, die fähig ist, phosphoryliert zu werden.
  7. Verfahren nach Anspruch 6, wobei die Aminosäure, die fähig ist, phosphoryliert zu werden, ausgewählt ist aus Tyrosin, Serin, Threonin und Histidin.
  8. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 7, wobei das Substrat fähig ist, durch eines oder mehrere der Enzyme phosphoryliert zu werden, die ausgewählt sind aus: Tyrosinkinase, Serin-/Threoninkinase und Histidinkinase.
  9. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 8, wobei das phosphorylierte Produkt mindestens einen Phosphor-Tyrosin-Rest umfasst.
  10. Verfahren nach einem der Ansprüche 4 bis 9, wobei das Substrat an einem Tyrosin-Rest durch eine Tyrosinkinase phosphoryliert wird und wobei ein Anstieg in der Fluoreszenzlebensdauer des Fluoreszenzmarkers verwendet wird, um die Konzentration des phosphorylierten Produktes relativ zur Konzentration des nicht-phosphorylierten Substrates zu messen.
  11. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 10, wobei das Substrat durch eine Linker-Gruppe an einen festen Träger gebunden wird.
  12. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 10, wobei das Substrat an ein zweites Peptid oder Protein konjugiert wird.
  13. Verfahren des Screenens nach einem Testmittel, dessen Effekt auf die Phosphorylierungsaktivität eines Enzyms bestimmt werden soll, wobei das Verfahren die Schritte umfasst: (a) Ausführen des Verfahrens nach einem der Ansprüche 1 bis 12 bei Vorhandensein und bei Nichtvorhandensein des Mittels; und (b) Bestimmen der Phosphorylierungsaktivität des Enzyms bei Vorhandensein und Nichtvorhandensein des Mittels, wobei ein Unterschied zwischen der Phosphorylierungsaktivität des Enzyms bei Vorhandensein und bei Nichtvorhandensein des Mittels den Effekt des Testmittels auf die Phosphorylierungsaktivität des Enzyms anzeigt.
  14. Verfahren des Screenens nach einem Testmittel, dessen Effekt auf die Phosphorylierungsaktivität eines Enzyms bestimmt werden soll, wobei das Verfahren die Schritte umfasst: (a) Ausführen des Verfahrens nach einem der Ansprüche 1 bis 12 bei Vorhandensein des Testmittels; und (b) Vergleichen des Wertes der Phosphorylierungsaktivität des Enzyms mit einem Kontrollwert für die Enzymaktivität bei Nichtvorhandensein des Testmittels; wobei der Kontrollwert in einem elektronischen Format gespeichert wird.
  15. Verfahren nach Anspruch 13 oder 14, wobei das Enzym ausgewählt ist aus Tyrosinkinase, Serin-/Threoninkinase und Histidinkinase.
  16. Verfahren zum Bestimmen der Dephosphorylierungsaktivität eines Enzyms, das auf ein Substratmolekül wirkt, wobei das Substrat mindestens eine phosphorylierte Einheit umfasst, die fähig ist, durch das Enzym dephosphoryliert zu werden, um ein Produkt zu ergeben, und wobei das Substrat mit einem Fluoreszenzfarbstoff markiert ist, wobei das Verfahren die Schritte umfasst: i) Messen der Fluoreszenzintensität und Fluoreszenzlebensdauer des fluoreszierend markierten Substrates; ii) Kombinieren des Enzyms mit dem Substratmolekül, um ein Produkt zu ergeben; und iii) Messen einer Änderung in der Fluoreszenzintensität und in der Fluoreszenzlebensdauer nach der Kombination des Schrittes ii); wobei die Änderung in der Fluoreszenzintensität und in der Fluoreszenzlebensdauer des Fluoreszenzmarkers verwendet wird, um die Dephosphorylierungsaktivität des Enzyms zu bestimmen.
  17. Verfahren nach Anspruch 16, wobei das Substrat mit einem Fluoreszenzfarbstoff markiert ist, der ausgewählt ist aus den Acridon- und den Chinacridon-Farbstoffklassen.
  18. Verfahren zum Bestimmen der Dephosphorylierungsaktivität eines Enzyms, das auf ein Substratmolekül wirkt, wobei das Substrat mindestens eine phosphorylierte Einheit umfasst, die fähig ist, durch das Enzym dephosphoryliert zu werden, um ein Produkt zu ergeben, und wobei das Substrat markiert ist mit einem Fluoreszenzfarbstoff der Formel:
    Figure 00520001
    oder
    Figure 00520002
    wobei: Z1 und Z2 unabhängig die Atome repräsentieren, die zum Vervollständigen eines oder mehrerer kondensierter aromatischer oder heteroaromatischer Ringsysteme nötig sind, wobei jeder Ring aufweist fünf oder sechs Atome, die aus Kohlenstoffatomen ausgewählt sind, und gegebenenfalls nicht mehr als zwei Atome, die aus Sauerstoff, Stickstoff und Schwefel ausgewählt sind; R1, R2, R3, R4, R5 (und R6, R7 und R8, falls vorhanden) unabhängig ausgewählt sind aus Wasserstoff, Halogen, Amid, Hydroxyl, Cyano, Amino, Mono- oder Di-C1-C4-alkyl-substituiertem Amino, Sulfhydryl, Carbonyl, Carboxyl, Ci-C6-Alkoxy, Aryl, Heteroaryl, C1-C20-Alkyl, Aralkyl; der Gruppe -E-F, wobei E eine Spacer-Gruppe ist mit einer Kette von 1 bis 60 Atomen, die aus der Gruppe ausgewählt sind, die besteht aus Kohlenstoff-, Stickstoff-, Sauerstoff-, Schwefel- und Phosphoratomen, und F eine Zielbindungsgruppe ist; und der Gruppe -(CH2-)nY, wobei Y ausgewählt ist aus Sulfonat, Sulfat, Phosphonat, Phosphat, quaternärem Ammonium und Carboxyl und n für Null oder eine ganze Zahl von 1 bis 6 steht; das Verfahren die Schritte umfasst: i) Messen der Fluoreszenzintensität des fluoreszierend markierten Substrates; ii) Kombinieren des Enzyms mit dem Substratmolekül, um ein Produkt zu ergeben; und iii) Messen einer Abnahme in der Fluoreszenzintensität nach der Kombination des Schrittes ii) wobei die Abnahme der Fluoreszenzintensität des Fluoreszenzmarkers verwendet wird, um die Dephosphorylierungsaktivität des Enzyms zu bestimmen.
  19. Verfahren nach Anspruch 18, wobei die Messschritte i) und iii) zusätzlich die Messung der Fluoreszenzlebensdauern des Fluoreszenzmarkers umfassen; wobei eine Abnahme in der Fluoreszenzintensität und in der Fluoreszenzlebensdauer bei der Dephosphorylierung des Farbstoff-markierten phosphorylierten Substrates verwendet wird, um die Dephosphorylierungsaktivität des Enzyms zu bestimmen.
  20. Verfahren nach einem der Ansprüche 16 bis 19, wobei das Substratmolekül ausgewählt ist aus natürlichen Proteinen (einschließlich post-translational modifizierten Proteinen, wie Glycoproteinen und Lipoproteinen); und synthetischen Peptiden.
  21. Verfahren nach einem der Ansprüche 16 bis 20, wobei das Substratmolekül mindestens eine phosphorylierte Aminosäure umfasst, die fähig ist dephosphoryliert zu werden.
  22. Verfahren nach Anspruch 21, wobei die phosphorylierte Aminosäure ausgewählt ist aus den phosphorylierten Derivaten von Tyrosin, Serin, Threonin und Histidin.
  23. Verfahren nach einem der Ansprüche 19 bis 22, wobei das Enzym eine Phosphatgruppe von einem Phospho-Tyrosin-Rest in dem Substrat entfernt und wobei eine Abnahme in der Fluoreszenzlebensdauer des Fluoreszenzmarkers verwendet wird, um die Konzentration des phosphorylierten Substrats relativ zur Konzentration des Produktes zu messen.
  24. Verfahren nach einem der Ansprüche 16 bis 23, wobei das Substrat durch eine Linker-Gruppe an einen festen Träger gebunden wird.
  25. Verfahren nach einem der Ansprüche 16 bis 23, wobei das Substrat an ein zweites Peptid oder Protein fusioniert wird.
  26. Verfahren des Screenens nach einem Testmittel, dessen Effekt auf die Dephosphorylierungsaktivität eines Enzyms bestimmt werden soll, wobei das Verfahren die Schritte umfasst: (a) Ausführen des Verfahrens nach einem der Ansprüche 16 bis 25 bei Vorhandensein und bei Nichtvorhandensein des Mittels; und (b) Bestimmen der Dephosphorylierungsaktivität des Enzyms bei Vorhandensein und bei Nichtvorhandensein des Mittels; wobei ein Unterschied zwischen der Dephosphorylierungsaktivität des Enzyms bei Vorhandensein und bei Nichtvorhandensein des Mittels den Effekt des Testmittels auf die Dephosphorylierungsaktivität des Enzyms anzeigt.
  27. Verfahren des Screenens nach einem Testmittel, dessen Effekt auf die Dephosphorylierungsaktivität eines Enzyms bestimmt werden soll, wobei das Verfahren die Schritte umfasst: (a) Ausführen des Verfahrens nach einem der Ansprüche 16 bis 25 bei Vorhandensein des Mittels; und (b) Vergleichen des Wertes der Dephosphorylierungsaktivität des Enzyms mit einem Kontrollwert für die Enzymaktivität bei Abwesenheit des Testmittels; wobei der Kontrollwert in einem elektronischen Format gespeichert wird.
  28. Verfahren nach einem der Ansprüche 16 bis 27, wobei das Enzym eine Phosphatase ist.
  29. Verfahren zum Bestimmen des Phosphorylierungsstatus eines Substrats in einer zellulären Umgebung, wobei das Substrat mindestens eine Einheit umfasst, die fähig ist, durch ein zelluläres Enzym phosphoryliert oder dephosphoryliert zu werden, um ein Produkt zu ergeben, und wobei das Substrat mit einem Fluoreszenzfarbstoff markiert ist, wobei das Verfahren die Schritte umfasst: i) Messen der Fluoreszenzintensität und der Fluoreszenzlebensdauer des fluoreszierend markierten Substrates in einer Zellen-freien Umgebung; ii) Zugeben des Substrates zu einer oder mehreren Zellen in einem fluiden Medium; und iii) Messen der Fluoreszenzintensität und der Fluoreszenzlebensdauer des Fluoreszenzmarkers nach dem Schritt ii); wobei eine Änderung in der Fluoreszenzintensität und der Fluoreszenzlebensdauer verwendet wird, um den Phosphorylierungsstatus des Substrates anzuzeigen.
  30. Verfahren nach Anspruch 29, wobei das Substrat ein Kinase-Substrat oder ein Phosphatase-Substrat ist.
  31. Verfahren nach Anspruch 29 oder 30, wobei der Fluoreszenzfarbstoff ausgewählt ist aus den Acridon- und den Chinacridon-Farbstoffklassen.
  32. Verfahren nach einem der Ansprüche 29 bis 31, wobei das Substrat an ein zweites Peptid oder Protein konjugiert wird.
  33. Verfahren nach Anspruch 32, wobei das Substrat an ein Träger- oder Transportpeptid konjugiert wird.
  34. Verfahren des gleichzeitigen Messens der Kinaseaktivitäten zweier oder mehrerer unterschiedlicher Enzyme, wobei jedes Enzym für ein unterschiedliches Substrat spezifisch ist, wobei jedes Substrat mindestens eine Einheit umfasst, die fähig ist, durch ein Enzym phosphoryliert zu werden, um ein Produkt zu ergeben, und wobei jedes Substrat mit einem unterschiedlichen eines Satzes von Fluoreszenzfarbstoffen markiert ist, wobei das Verfahren die Schritte umfasst: i) Messen der Fluoreszenzintensität und der Fluoreszenzlebensdauer jedes der fluoreszierend markierten Substrate; ii) Kombinieren einer Mischung der Enzyme mit jedem der Substratmoleküle bei Vorhandensein einer Phosphatquelle; und iii) Messen eines Anstiegs in der Fluoreszenzintensität und in der Fluoreszenzlebensdauer von jedem der Fluoreszenzmarker nach der Kombination des Schrittes ii); wobei der Anstieg in der Fluoreszenzintensität und in der Fluoreszenzlebensdauer von jedem der Fluoreszenzmarker verwendet wird, um die Phosphorylierungsaktivität jedes der Enzyme zu bestimmen.
  35. Verfahren nach Anspruch 34, wobei die Fluoreszenzfarbstoffe in dem Satz ausgewählt sind aus den Acridon- und Chinacridon-Farbstoffklassen.
  36. Verfahren nach Anspruch 34 oder 35, wobei das Enzym ein isoliertes Enzym ist.
  37. Verfahren nach Anspruch 34 oder 35, wobei eines oder mehrere der Enzyme eine Komponente eines Zellenlysates ist.
  38. Verfahren nach Anspruch 34, wobei die Kombination des Schrittes ii) in einer zellulären Umgebung ausgeführt wird und wobei jedes der unterschiedlichen Substrate an ein Träger- oder Transportpeptid konjugiert wird.
  39. Verfahren nach einem der Ansprüche 34 bis 38, wobei die Kinaseaktivitäten, die gemessen werden, Tyrosinkinasen sind.
  40. Zusammensetzung umfassend: i) ein Substrat für ein Kinaseenzym, wobei das Substrat mindestens eine Einheit umfasst, die fähig ist, durch das Enzym phosphoryliert zu werden, um ein phosphoryliertes Produkt zu ergeben, und wobei das Substrat markiert ist mit einem Fluoreszenzfarbstoff der Formel:
    Figure 00580001
    oder
    Figure 00580002
    wobei: Z1 und Z2 unabhängig die Atome repräsentieren, die zum Vervollständigen eines oder mehrerer kondensierter aromatischer oder heteroaromatischer Ringsysteme nötig sind, wobei jeder Ring aufweist fünf oder sechs Atome, die aus Kohlenstoffatomen ausgewählt sind, und gegebenenfalls nicht mehr als zwei Atome, die aus Sauerstoff, Stickstoff und Schwefel ausgewählt sind; R1, R2, R3, R4, R5 (und R6, R7 und R8, falls vorhanden) unabhängig ausgewählt sind aus Wasserstoff, Halogen, Amid, Hydroxyl, Cyano, Amino, Mono- oder Di-C1-C4-alkyl-substituiertem Amino, Sulfhydryl, Carbonyl, Carboxyl, C1-C6-Alkoxy, Aryl, Heteroaryl, C1-C20-Alkyl, Aralkyl; der Gruppe -E-F, wobei E eine Spacer-Gruppe ist mit einer Kette von 1 bis 60 Atomen, die aus der Gruppe ausgewählt sind, die besteht aus Kohlenstoff-, Stickstoff-, Sauerstoff-, Schwefel- und Phosphoratomen, und F eine Zielbindungsgruppe ist; und der Gruppe -(CH2-)nY, wobei Y ausgewählt ist aus Sulfonat, Sulfat, Phosphonat, Phosphat, quaternärem Ammonium und Carboxyl und n für Null oder eine ganze Zahl von 1 bis 6 steht; und ii) eine Komponente, ausgewählt aus einem Phosphat-Donor und der Kinase.
  41. Test-Kit zum Messen der Kinaseaktivität mindestens eines Enzyms, wobei das Test-Kit umfasst: i) ein oder mehrere unterschiedliche Substrate, wobei jedes Substrat eine Einheit umfasst, die fähig ist, phosphoryliert zu werden, um ein Produkt zu ergeben, und wobei jedes der Substrate markiert ist mit einem unterschiedlichen eines Satzes von Fluoreszenzfarbstoffen, ausgewählt aus Farbstoffen der Formel:
    Figure 00590001
    oder
    Figure 00590002
    wobei: Z1 und Z2 unabhängig die Atome repräsentieren, die zum Vervollständigen eines oder mehrerer kondensierter aromatischer oder heteroaromatischer Ringsysteme nötig sind, wobei jeder Ring aufweist fünf oder sechs Atome, die aus Kohlenstoffatomen ausgewählt sind, und gegebenenfalls nicht mehr als zwei Atome, die aus Sauerstoff, Stickstoff und Schwefel ausgewählt sind; R1, R2, R3, R4, R5 (und R6, R7 und R8, falls vorhanden) unabhängig ausgewählt sind aus Wasserstoff, Halogen, Amid, Hydroxyl, Cyano, Amino, Mono- oder Di-C1-C4-alkyl-substituiertem Amino, Sulfhydryl, Carbonyl, Carboxyl, C1-C6-Alkoxy, Aryl, Heteroaryl, C1-C20-Alkyl, Aralkyl; der Gruppe -E-F, wobei E eine Spacer-Gruppe ist mit einer Kette von 1 bis 60 Atomen, die aus der Gruppe ausgewählt sind, die besteht aus Kohlenstoff-, Stickstoff-, Sauerstoff-, Schwefel- und Phosphoratomen, und F eine Zielbindungsgruppe ist; und der Gruppe -(CH2-)nY, wobei Y ausgewählt ist aus Sulfonat, Sulfat, Phosphonat, Phosphat, quaternärem Ammonium und Carboxyl und n für Null oder eine ganze Zahl von 1 bis 6 steht; und gegebenenfalls ii) ein oder mehrere unterschiedliche Enzyme, wobei jedes Enzym für ein unterschiedliches Substrat spezifisch ist.
  42. Test-Kit zum Messen der Phosphataseaktivität mindestens eines Enzyms, wobei das Test-Kit umfasst: i) ein oder mehrere unterschiedliche Substrate, wobei jedes der Substrate eine phosphorylierte Einheit umfasst, die fähig ist, dephosphoryliert zu werden, um ein Produkt zu ergeben, und wobei jedes der Substrate mit einem unterschiedlichen eines Satzes von Fluoreszenzfarbstoffen markiert ist, ausgewählt aus Farbstoffen der Formel:
    Figure 00610001
    oder
    Figure 00610002
    wobei: Z1 und Z2 unabhängig die Atome repräsentieren, die zum Vervollständigen eines oder mehrerer kondensierter aromatischer oder heteroaromatischer Ringsysteme nötig sind, wobei jeder Ring aufweist fünf oder sechs Atome, die aus Kohlenstoffatomen ausgewählt sind, und gegebenenfalls nicht mehr als zwei Atome, die aus Sauerstoff, Stickstoff und Schwefel ausgewählt sind; R1, R2, R3, R4, R5 (und R6, R7 und R8, falls vorhanden) unabhängig ausgewählt sind aus Wasserstoff, Halogen, Amid, Hydroxyl, Cyano, Amino, Mono- oder Di-C1-C4-alkyl-substituiertem Amino, Sulfhydryl, Carbonyl, Carboxyl, C1-C6-Alkoxy, Aryl, Heteroaryl, C1-C20-Alkyl, Aralkyl; der Gruppe -E-F, wobei E eine Spacer-Gruppe ist mit einer Kette von 1 bis 60 Atomen, die aus der Gruppe ausgewählt sind, die besteht aus Kohlenstoff-, Stickstoff-, Sauerstoff-, Schwefel- und Phosphoratomen, und F eine Zielbindungsgruppe ist; und der Gruppe -(CH2-)nY, wobei Y ausgewählt ist aus Sulfonat, Sulfat, Phosphonat, Phosphat, quaternärem Ammonium und Carboxyl und n für Null oder eine ganze Zahl von 1 bis 6 steht; und gegebenenfalls, ii) ein oder mehrere unterschiedliche Enzyme, wobei jedes Enzym für ein unterschiedliches Substrat spezifisch ist.
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