Insulin
ist ein Peptidhormon, das eine große Anzahl von Wachstums- und
Stoffwechselwegen beeinflusst, indem es an den Insulinrezeptor bindet
und so dessen intrinsische Tyrosinkinase aktiviert. Dieses Ereignis
führt zur
Phosphorylierung einer Vielzahl von Proteinen, die an den Insulin
Rezeptor (IR) binden können, an
spezifischen Tyrosin Resten. Zu den so phosphorylierten Proteinen
gehört
auch die Familie der Insulinrezeptorsubstrat (IRS) Proteine.
Insulinrezeptorsubstrat
1 (IRS-1) ist ein zelluläres
Protein, welches von einer Vielzahl von Proteinkinasen (tyrosinspezifische
oder serin-/threoninspezifische Proteinkinasen) an Tyrosin- und/oder
Serinresten und oder Threoninresten phosphoryliert werden kann.
Dabei werden je nach Enzym vermutlich unterschiedliche Tyrosin-
oder Serin-/Threoninreste spezifisch phospharyliert werden. Ausser
durch Tyrosinkinasen wie beispielsweise dem Insulinrezeptor (White
2002), dem IGF-1 Rezeptor (White 2002) oder JAK 1/2 (Thirone et
al. 1999) wird IRS-1 bekanntermassen auch noch durch Serin-/Threoninkinasen
wie beispielsweise Kinasen aus der PKC Familie (Schmitz-Peiffer
2002), Inhibitor kappa B kinase Komplex (Gao et al. 2002), c-Jun
NH(2)-terminal kinase (JNK, Aguirre et al. 2000) Proteinkinase A
(Sun et al. 1991), Mitogen aktivierte Proteinkinase (Mothe et al.
1996), Proteinkinase B (Paz et al. 1999), Casein Kinase (Tanasijevic
et al. 1993), Glykogensynthasekinase beta (Eldar-Finkelmann et al.
1997), AMP aktivierte Kinase (Jakobsen et al. 2001) oder Phosphoinositol
3 Kinase (Freund et al. 1995).phosphoryliert. IRS Moleküle sind
Schlüsselmoleküle des Insulin-Signaltransduktionsweges
und spielen eine zentrale Rolle in der Aufrechterhaltung zellulärer Funktionen
wie Wachstum, Überleben
und Stoffwechsel. Phosphorylierte IRS Proteine dienen dabei als "Andock"-Proteine mit einer Vielzahl
von Andockstellen für
den Insulinrezeptor und einem komplexen Netzwerk intrazellulärer Signalmoleküle mit sogenannten
Signal Recognition Complex (SRC) Homologie 2 Domänen (SH2 Domänen). Die
Aktivierung dieser Sh2 Domänen
Proteine aktiviert dabei bestimmte Signalkaskaden, was wiederum
zur Aktivierung verschiedener Effektoren führt, die weiter abwärts in der
Signalkaskade liegen, was ultimativ zur Vermittlung des Insulinsignals
an eine verzweigte Serie anderer intrazellulärer Signalkaskaden führt (zur Übersicht siehe
White 2002).
IRS
gehört
zu einer Gruppe von Phosphoproteinen von 160 bis 185 kDA Größe, die
als Substrat des Insulin Rezeptors dienen. Vier Mitglieder der IRS
Familie (IRS-1, IRS-2, IRS-3 und IRS-4) sind bekannt. Sie unterscheiden
sich in Gewebsverteilung, subzellulärer Lokalisierung, entwicklungsspezifischer
Expression, Art der Bindung an den Insulinrezeptor und der Art der
SH2 Proteine, mit denen sie interagieren. Die vier Mitglieder der
IRS Familie sind in ihrer grundlegenden Proteinstruktur sehr ähnlich aufgebaut:
Alle weisen eine Amino (N)-terminale Plextrin -Homologie Domäne (PH Domäne) auf,
die an Membranphospholipide bindet, eine Phosphotyrosin Bindungs
Domäne
(PTB Domäne),
die sich unmittelbar Carboxy (C) -terminal an die PH Domäne anschliesst
und in die Erkennung der Asp-Pro-Glu Phosphotyrosin (NPEpY) Sequenz
involviert ist, die in der juxtamembranären Region der Insulinrezeptor
beta-Untereinheit lokalisiert ist. Des weiteren weisen sie einen
etwas weniger stark konservierten C-terminalen Teil auf, der verschiedene
potentielle Tyrosin-Phosphorylierungsmotive aufweist, an die spezielle
SH2 Domänen-enthaltende
Proteine binden können.
IRS-1
enthält
21 mögliche
Tyrosin Phosphorylierungsstellen, von denen einige in Aminosäuresequenzmotiven
lokalisiert sind, die an die SH2-Domänen Proteine binden können. IRS-1
enthält
weiterhin 30 potentielle Serin/Threonin Phosphorylierungsstellen
in Motiven, die durch verschiedene Kinasen erkannt werden können wie
beispielsweise Kinasen aus der PKC Familie (Schmitz-Peiffer 2002),
Inhibitor kappa B kinase Komplex (Gao et al. 2002), c-Jun NH(2)-terminal
kinase (JNK, Aguirre et al. 2000) Proteinkinase A (Sun et al. 1991),
Mitogen aktivierte Proteinkinase (Mothe et al. 1996), Proteinkinase
B (Paz et al. 1999), Casein Kinase (Tanasijevic et al. 1993), Glykogensynthasekinase
beta (Eldar-Finkelmann
et al. 1997), AMP aktivierte Kinase (Jakobsen et al. 2001) oder
Phosphoinositol 3 Kinase (PI3 Kinase, Freund et al. 1995). Inhibitorische
Effekte auf den Insulinrezeptor Signalweg können zumindest teilweise durch
die kürzlich
entdeckte Rolle der Serin/Threonin Phosphorylierung von IRS-1 erklärt werden,
die in Verbindung gebracht wird mit einer Verschlechterung der Interaktion
mit dem Insulinrezeptor und/oder einer Reduzierung der der Tyrosinphosphorylierung von
IRS-1 und/oder einer Verschlechterung der Interaktion mit nachfolgenden
Signalproteinen, die an Tyrosinphosphorylioertes IRS-1 binden können (zur Übersicht
siehe White 2002). Für
verschiedene Kinasen beispielsweise Kinasen aus der PKC Familie
(Schmitz-Peiffer 2002), Inhibitor kappa B kinase Komplex (Gao et al.
2002), c-Jun NH(2)-terminal kinase (JNK, Aguirre et al. 2000) Proteinkinase
A (Sun et al. 1991), Mitogen aktivierte Proteinkinase (Mothe et
al. 1996), Proteinkinase B (Paz et al. 1999), Casein Kinase (Tanasijevic
et al. 1993), Glykogensynthasekinase beta (Eldar-Finkelmann et al.
1997) oder Phosphoinositol 3 Kinase (Freund et al. 1995).konnte
bislang demonstriert werden, dass sie IRS-1 in vitro direkt phosphorylieren.
Dabei inhibierte in jedem Fall eine gesteigerte Kinaseaktivität in intakten
Zellen die Aktivität
des Insulin Signaltransduktionsweges. Des weiteren wurde die in
vitro Phosphorylierung von IRS-1 an Serin/Threonin Resten in einigen
Studien in direkten Zusammenhang gebracht mit der verminderten Tyrosinphosphorylierung
durch den Insulinrezeptor (Le Marchand-Brustel 1999)).
Die
Sequenzen von IRS-1, 2, 3 und 4 sind öffentlich zugänglich.
Die kodierenden Polynukleotidsequenzen und die zugehörigen Proteinsequenzen
dieser Gene sind unter den Nummern NM_005544 (IRS-1 hs), XM:007095
(IRS-2 hs), NM:032074 (IRS-3 rat), NM:003604 (IRS-4 hs) bei der
NCBI Nucleotide-Database abrufbar. NCBI ist das National Center
for Biotechnology Information (Postadresse: National Center for
Biotechnology Information, National Library of Medicine, Building
38A, Bethesda, MD 20894, USA; Web-Adresse: www.ncbi.nhm.nih.gov).
Die Klonierung des IRS-1 Gens wurde unter anderem beschrieben in
Araki et al. 1993 und Siemeister et. al, 1996; die Klonierung von
IRS-2 bis 4 wurde durch Araki et al 1994, Lavan et al. 1997a und
Lavan et al. 1997b beschrieben.
Zur
Bestimmung der Fähigkeit
und zur Messung der Aktivität
verschiedener Kinasen, IRS-1 zu phosphorylieren, sind verschiedene
Verfahren im Stand der Technik bekannt, die entweder auf radioaktiven
Nachweisverfahren (z.B. Übertragung
von radioaktiv markiertem Phosphat auf das Substrat) oder nicht-radioaktiven Nachweisverfahren
basieren.
So
ist es bekannt, die Phosphorylierung von IRS-1 an IRS-1 Protein
voller Länge,
Fragmenten oder Peptiden davon, welche noch mindestens eine Phosphorylierungsstelle
aufweisen, durch ein Verfahren zu bestimmen, bei dem durch Inkubation
mit radioaktiv markiertem ATP und der zu testenden Kinase in Abhängigkeit
von der Fähigkeit
der Kinase, IRS-1 zu phosphorylieren, radioaktive Phosphatreste
auf IRS-1 übertragen werden.
Anschliessend erfolgt eine chromatographische oder elektrophoretische
Auftrennung des IRS-1 und Nachweis der Menge übertragenen Phosphates durch
Durchflußscintillation
oder Autoradiographie (wie z.B beschrieben für das komplette IRS-1 Protein
und Glykogensynthasekinase 3 beta in Eldar-Finkelman et al. 1997,
für ein
Fragment von IRS-1 (Aminosäure
516 – 777)
und Insulinrezeptor, IGF-1 Rezeptor oder rekombinanter Insulinrezeptorkinase
in Siemeister et al. 1995 oder ein IRS-1 Peptid (Aminosäure 601 – 616) mit Zell-Lysaten,
die aktivierte Proteinkinase aus der PKC Familie enthalten in De
Fea et al. 1997. Des weiteren ist es aus Siemeister et al. 1995
die Fähigkeit
IRS-1 Fragmente beispielsweise ein Fragment von IRS-1 (Aminosäure 516 – 777) und
Insulinrezeptor, IGF-1 Rezeptor oder rekombinanter Insulinrezeptorkinase
zu phosphorylieren, durch Inkubation mit radioaktiv markiertem ATP,
Auftropfen des Substrates auf eine positiv geladene Membran (Nitrozellulose
oder ähnlichem
Material), Waschen und Nachweis des gebundenen radioaktiv markierten
Substrates mittels Autoradiographie oder Messung der radioaktiven
Strahlung, zu bestimmen.
Die
Inkubation eines biotinylierten IRS-1 Peptides (Aminosäure 601 – 616) mit
radioaktiv markiertem ATP, Auftropfen des Substrates auf eine Streptavidinbeschichtete
Membran, waschen und Nachweis des gebundenen radioaktiv markierten
Substrates durch Autoradiographie oder Messung der radioaktiven
Strahlung, ist eine weitere Methode, die Fähigkeit von Kinasen, IRS-1
zu phosphorylieren, zu bestimmen (s.De Fea et al. 1997).
Der
Nachteil der vorstehend beschriebenen radioaktiven Testverfahren
liegt auf der Hand, da der Umgang mit Radioaktivität erhebliche
Gefahren in sich birgt, sehr kostenintensiv und somit insbesondere
für Hochdurchsatzverfahren
(HTS Verfahren) wenig geeignet ist.
Der
Nachteil der vorstehend beschriebenen, auf der Verwendung von kurzen
Peptiden beruhenden, Verfahren besteht darin, dass diese Peptide
ungünstige
kinetische Konstanten (Vmax, Km) aufweisen und sich zudem die räumliche
Struktur bei Peptiden stark von der der physiologischen Enzym-Substrate
unterscheidet. Dies manifestiert sich zum einen in einer völlig unterschiedlichen
Faltung, so dass bestimmte biologische Räume nicht vorhanden sind, die
die Spezifität
der Enzym-Substrat
Interaktion ausmachen, was entweder in einer fehlenden Erkennung
(und somit Modifizierung) oder in einer unspezifischen Erkennung
(und somit Modifizierung) resultiert und ultimativ falsche Ergebnisse
hervorbringt. Zudem weisen Peptide wegen ihrer Kürze nur eine oder wenige Phosphorylierungsstellen
auf, so dass für
die Untersuchung der Phosphorylierungs-Modifikation eines bestimmten
Substrats durch verschiedene Enzyme unterschiedliche Peptide benötigt werden. Auch
dies resultiert wiederum in erhöhten
Kosten und einer nur bedingten Anwendbarkeit für Verfahren im HTS Format.
Die
Aufgabe der Erfindung besteht daher in der Bereitstellung einer
Möglichkeit,
die Aktivität
von Protein-phosphorylierenden und/oder -dephosphorylierenden Enzymen
zu bestimmen, die die oben genannten Nachteile nicht aufweist.
Diese
Aufgabe wird gelöst
durch die Verwendung eines Polypeptids (Def GGs zum Peptid) zur
Bestimmung der Fähigkeit
eines Enzyms, eines funktionellen Fragments oder Derivats davon,
den Phosphorylierungsstatus eines Polypeptides zu modulieren, dadurch
gekennzeichnet, dass das Polypeptid biotinyliert ist.
Die
Erfindung beruht auf Ergebnissen der Erfinder, die überraschenderweise
zeigten, dass auch bei Polypeptiden oder Proteinen voller Länge keine
sterische Behinderung der Biotin-Bindung durch Streptavidin erfolgte
und die Biotinylierung auch nicht mit der Phosphorylierung des untersuchten
Substrats durch Kinasen interferierte.
Mit
der Bezeichnung Polypeptid ist im Rahmen der vorliegenden Erfindung
ein durch Peptidbindungen verknüpften
Aminosäuren
enthaltendes Molekül
gemeint, welches mindestens 50 auf diese Weise linear verknüpfte Aminosäuren aufweist.
Kürzere
Moleküle
dieser Art werden als Peptide bezeichnet. Die Bezeichnung Protein
bezieht sich auf Moleküle,
die mindestens eine Polypeptidkette umfassen, aber auch aus mehreren miteinander
assoziierten oder verknüpften
Polypeptidketten bestehen können.
Der Terminus Protein umfasst somit die Bezeichnung Polypeptid.
Gemäß einer
bevorzugten Ausführungsform
der verschiedenen Aspekte der vorliegenden Erfindung weist das Polypeptid
eine Länge
von 50 Aminosäuren
und mehr, vorzugsweise 50-300 auf.
Gemäß einer
weiteren bevorzugten Ausführungsform
der verschiedenen Aspekte der Erfindung weist das Polypeptid eine
Größe von 1
kda und mehr, vorzugsweise 1 bis 100 kDa und besonders bevorzugt
10 bis 50 kDa auf.
Als
Substrat eines Enzyms wird vorliegend jedes Molekül verstanden,
dass geeignet ist, durch das Enzym modifiziert zu werden. Natürliche Substrate
sind im Rahmen der vorliegenden Erfindungen Moleküle, die derartig
ausgestaltet sind wie sie im physiologischen oder pathologischen
Kontext in der Natur vorkommen und fähig sind durch das betreffende
Enzym modifiziert zu werden.
Die
Modulierung des Phosphorylierungszustandes durch das Enzym bezeichnet
die Art der Modifikation eines Substrates durch ein Enzym, bei der
mindestens eine Phosphatgruppe auf das Substrat übertragen oder entfernt wird.
Die für
die vorliegende Erfindung relevanten Enzyme weisen daher die Fähigkeit
auf, die eine und/oder die andere Reaktion zu katalysieren. Sie
weisen somit mindestens diese Fähigkeit
der Kinasen und/oder der Phosphatasen auf, können darüberhinaus aber noch weitere
enzymatische Eigenschaften (z.B. Protease-Eigenschaften, etc.) aufweisen.
Die verschiedenen Enzymkategorien und deren Eigenschaften sind dem
zuständigen
Fachmann hinlänglich
bekannt.
Ein
funktionelles Fragment eines Enzyms, ist vorliegend jedes Fragment
des Enzyms (also ein gegenüber
der natürlich
vorkommenden Form verkleinertes bzw. Verkürztes Molekül), dass noch die Fähigkeit
aufweist, den Phosphorylierungszustand mindestens eines Polypeptides
zu modulieren. Der Terminus „funktionelles
Derivat" eines Enzyms
umfasst dabei jede Art der Modifikation des Enzyms gegenüber der
in der Natur vorkommenden Form, die keine Verkürzung darstellt, wobei das
Derivat des Enzyms noch die Fähigkeit
aufweist, den Phosphorylierungszustand mindestens eines Polypeptids
zu modulieren. Die vorliegende Erfindung bezieht sich dabei auch
auf funktionelle Derivate von Fragmenten von Enzymen, die den Phosphorylierungszustand
mindestens eines Polypeptids modulieren können.
Die
Bestimmung der Fähigkeit
des Enzyms, den Phosphorylierungszustand des Polypeptids zu modulieren
kann dabei sowohl qualitativ als auch quantitativ (also als quantifizierbare
Messung) erfolgen.
Die
erfindungsgemäße Verwendung
weist den Vorteil auf, dass die so erzielten Ergebnisse aufgrund der
Länge der
verwendeten Substrate aussagekräftiger
sind, da sie eine Tertiärstruktur
einnehmen, die eher den physiologischen Gegebenheiten entspricht.
Darüberhinaus
weisen die verwendeten Polypeptide im Gegensatz zu den im Stand
der Technik bekannten Peptiden gute kinetische Konstanten auf (z.B.
bei IRS-1: Km 19 μM:
im Vergleich zu Peptiden: > 200 μM vgl. Siemeister
et al. 1995) und es ist bei der Analyse von Substraten mit mehreren
Phosphorylierungsstellen nur ein Substrat nötig, mit dem z.B. die Fähigkeit
auch verschiedener Enzyme bestimmt werden kann.
Eine
bevorzugte Ausführungsform
betrifft eine Verwendung, bei der die Fähigkeit eines Enzyms, das Polypeptid
zu phosphorylieren bestimmt wird.
Besonders
zweckmäßige Arten
von Enzymen mit Kinaseaktivität
für die
verschiedenen Aspekte der vorliegenden Erfindung betreffen Serin/Threonin
oder Tyrosin-Kinasen. Besonders geeignete Beispiele von Kinasen
umfassen u. a. den Insulinrezeptor, IGF-1 Rezeptor, trK-Rezeptor,
EGF-Rezeptor, Casein Kinase II, Mitglieder der Protein Kinase C
Familie, Protein Kinase B/Akt, Mitogen Aktivierte Protein Kinase
(MAP Kinase), GSK-3 beta, ERK1/2, IKK beta Kinase, AMP- Kinase,
PI3 Kinase oder JNK.
Darüberhinaus
eignet sich die erfindungsgemäße Verwendung
ebenso zur Bestimmung der Fähigkeit eines
Enzyms, das Polypeptid zu dephosphorylieren.
Ein
weiterer Aspekt der Erfindung betrifft ein Verfahren zur Bestimmung
der Fähigkeit
eines Enzyms, eines funktionellen Fragments oder Derivats davon,
den Phosphorylierungsstatus eines biotinylierten Polypeptids zu
modulieren.
Geeignete
Verfahren zur Bestimmung des Phosphorylierungsgrades biotinylierter
Polypeptide betreffen zum Beispiel Verfahren, die bekanntermassen
geeignet sind, den Phosphporylierungsgrad kurzer Peptide zu bestimmen.
Diese sind dem Fachmann geläufig.
Gemäß einer
bevorzugten Ausführungsform
betrifft das erfindungsgemäße Verfahren
ein Verfahren, bei dem die Fähigkeit
eines Enzyms, eines funktionellen Fragments oder Derivats davon,
das Polypeptid zu phosphorylieren mit den folgenden Schritten bestimmt
wird:
- a) In Kontakt Bringen des Enzyms oder
funktionellen Fragments oder Derivats mit dem biotinylierten Polypeptid
und Starten der Phosphorylierungsreaktion in einem geeigneten Reaktionsansatz,
- b) In Kontakt Bringen des Reaktionsansatzes mit einem an einen
Träger
gekoppelten Mittel, das fähig
ist, an das biotinylierte Polypeptid zu binden,
- c) Bestimmung des Phosphorylierungszustandes des an das Mittel
gebundenen Polypeptids.
Eine
weitere bevorzugte Ausführungsform
der Erfindung betrifft ein Verfahren zur Bestimmung der Fähigkeit
eines Enzyms, eines funktionellen Fragments oder Derivats davon,
das Polypeptid zu dephosphorylieren mit den Schritten
- a) In Kontakt Bringen des Enzyms oder funktionellen Fragments
oder Derivats mit dem biotinylierten Polypeptid, welches mindestens
einen Phosphatrest aufweist und Starten der Phosphorylierungsreaktion
in einem geeigneten Reaktionsansatz,
- b) In Kontakt Bringen des Reaktionsansatzes mit einem an einen
Träger
gekoppelten Mittel, das fähig
ist, das biotinylierte Polypeptid zu binden,
- c) Bestimmung des Phosphorylierungszustandes des an das Mittel
gebundenen Polypeptids.
Das
Mittel kann dabei jede Art von Molekül oder supramolekularem Zusammenschluss
(z.B. Körper oder
Vorrichtung) sein, die geeignet ist, das biotinylierte Polypeptid
zu binden. Die Bindung kann dabei an den Biotin-Anteil oder das
Polypeptid selbst erfolgen, wobei bei einer Bindung an das Polypeptid
selbst eine vom Phosphorylierungszustand abhängige Bindung bevorzugt ist
(z.B. Bindung nur im phosphorylierten oder unphosphorylierten Zustand
mit Bezug auf einzelne oder mehrere Phosphorylierungsstellen). Bevorzugte
Ausführungsformen
des Mittels betreffen daher Streptavidin oder phosphospezifische
Antikörper
(also Antikörper, die
die Phosphorylierung bestimmter Reste am Polypeptid erkennen und
spezifisch an das dort phosphorylierte Polypeptid binden können).
Der
im Rahmen der verschiedenen Aspekte der Erfindung verwendete Reaktionsansatz
kann dabei biochemischer (d.h. in vitro) oder zellulärer Art
sein. Die Zusammensetzung biochemischer Ansätze hängt dabei von den Erfordernissen
des zu untersuchenden Enzyms ab, geeignete Bestandteile und Zusammensetzungen,
z.B. ATP, ein Puffer zur Einstellung eines gewünschten pH- Milieus und einer
gewünschten
Salzkonzentration zur Gewährleistung
der Enzymaktivität
sind dem zuständigen
Fachmann jedoch bekannt. Bei biochemischen Ansätzen können Enzym und oder Polypeptid
rekombinant und/oder als aus natürlichen
Quellen teil- oder
vollständig
aufgereinigtes Molekül
und/oder in Form von Extrakten aus biologischem Material, insbesondere
Zell- oder Gewebeextrakten vorliegen.
Biologisches
Material kann unter anderem umfassen: die Zellen eines Gewebes oder
Organs (z.B. Gehirn, Blut, Leber, Milz, Niere, Herz, Blutgefäße), vorzugsweise
die eines Wirbeltiers einschliesslich des Menschen, oder Zellen
aus einer Zellkultur. Im Rahmen der Erfindung verwendete Zellen
umfassen dabei alle Arten von Zellen, z.B. eukaryontische oder prokaryontische
einzellige Organismen (wie Bakterien, z.B. E. Coli oder Hefen, z.B.
S. pombe oder s. cerevisiae) oder Zellinien, die von vielzelligen
Organismen abgeleitet sind (wie z.B. HeLA, COS, NIH-3T3, CHO, etc.),
Säuger-Zellinien
bevorzugt sind. Zellen eines Gewebeverbandes oder Organs eines Wirbeltiers
einschliesslich des Menschen können
durch gängige
Techniken wie Blutentnahme, Gewebepunktion oder operative Techniken
gewonnen werden. Die Herstellung derartiger rekombinanter Moleküle, die
Aufreinigung natürlich
vorkommender Moleküle
aus Zellen oder Geweben und die Herstellung von Zell- oder Gewebeextrakten
ist dem Fachmann hinlänglich
bekannt (s. auch nachstehend aufgeführte Beispiele der Standardliteratur).
Für die Verwendung
im Rahmen der verschiedenen Aspekte geeignete zelluläre Systeme
sind dem Fachmann ebenfalls bekannt und umfassen vorzugsweise isolierte
Zellen, die ursprünglich
Gewebeverbänden entstammen
(vorzugsweise aus Wirbeltieren, besonders bevorzugt Säugetieren
und insbesondere dem Menschen), besonders bevorzugt in Form kultivierter
Zellinien; sie umfassen weiterhin einzellige Lebewesen (Eukaryonten
oder Prokaryonten), wie beispielsweise Hefe- oder Bakterienzellen,
insbesondere in Form kultivierter Stämme.
Träger können alle
Arten von Molekülen
oder supramolekularen Zusammenschlüssen (z.B. Körper oder
Vorrichtungen) sein, die sich dazu eignen, das über die Biotin-Streptavidin
Interaktion an sie gekoppelte Peptid aus dem Reaktionsansatz zu
entfernen oder dieses zu markieren. Geeignete Vorrichtungen sind
z.B. Membranen, Platten oder Körper
verschiedenster Formgebung (vorliegend allgemein als Bead bezeichnet), aus
verschiedenen Materialien die im Stand der Technik hinlänglich bekannt
sind. Die Art des Trägers
hängt dabei
von dem Verfahrensziel (z.B. diagnostisch, Wirkstoffindung oder
Entdeckung neuer Interaktionspartner) und der Art der Detektion
ab, die Auswahl geeigneter Träger
liegt dabei im Bereich fachmännischen
Könnens.
Gemäß einer
Ausführungsform
des erfindungsgemäßen Verfahrens
ist dem Reaktionsansatz radioaktiv markiertes γ32P-ATP zugefügt, und
die Bestimmung des Phosphorylierungszustandes erfolgt durch Messung
der auf dem Träger,
vorzugsweise der Membran oder Platte verbleibenden Radioaktivität nach Durchführung mindestens
eines Waschschrittes. Auf diese Weise können einfach die nicht an das
Streptavidin gebundenen Bestandteile des Reaktionsansatzes einschliesslich
freier Radioaktivität
entfernt werden, so dass der Phosphorylierungszustand des Polypeptids
einfach anhand der auf dem Träger
immobilisierten Radioaktivität bestimmt
werden kann. Als Mittel zur Bindung des biotinylierten Polypeptids
eignet sich in diesem Fall besonders Streptavidin.
Gemäß einer
weiteren bevorzugten Ausführungsform
des erfindungsgemäßen Verfahrens
wird dem Reaktionsansatz ein Antikörper (BSP) zugefügt, der
fähig ist,
spezifisch an das phosphorylierte Polypeptid zu binden. Der Antikörper kann
dabei sowohl selbst das Mittel darstellen als auch zusätzlich zum
Mittel zugefügt werden
(wobei dieses dann vorzugsweise kein phosphospezifischer Antikörper und
besonders bevorzugt Streptavidin ist). Die Bestimmung des Phosphorylierungszustandes
erfolgt hier durch die Bestimmung der Menge des an das Polypeptid
gebundenen Antikörpers.
Geeignete Massnahmen zur Markierung und Detektion des Antikörpers sind
dem Fachmann bekannt. So können
einerseits geeignet markierte Erstantikörper eingesetzt werden, die
direkt detektierbar sind oder es werden gegen den FC (Chrystalizing
Fragment) Anteil des Erstantikörpers
gerichtete, geeignet markierte Zweitantikörper eingesetzt, was die Spezifität der Detektion
erhöht.
Der
Begriff Antikörper
umfasst dabei sowohl monoklonale Antikörper als auch polyklonale Antiseren, rekombinant
hergestellte Antikörper
und rekombinant hergestellte single-chain Antikörper. Die Auswahl und Herstellung
derartiger Antikörper
liegt im Bereich fachmännischen
Könnens,
hierzu sei ferner auf die nachfolgend aufgeführte Standardliteratur verwiesen.
Auch geeignete Markierungen derartiger Antikörper sind im Stand der Technik
bekannt und umfassen z.B. enzymatische Markierungen wie CIP (Calf
intestinal phosphatase) oder HRP (Horseraddish Peroxidase), fluoreszierende
Moleküle,
die bei Anregung durch Bestrahlung mit Licht bestimmter Wellenlänge ein
detektierbares Signal erzeugen wie Texas Red, Cy3, FITC (Fluorescein
Isothiocyanat), oder bekannten fluoreszierenden Proteinen. Die Auswahl
geeigneter Markierungen entspricht ebenfalls dem fachmännischen
Können.
Geeignete markierte oder unmarkierte Erst- und Zweit-Antikörper, sowie deren Herstellung
sind bekannter Stand der Technik, überdies sind derartige Antikörper durch
verschiedene Anbieter kommerziell erhältlich. Erst- und Zweitantikörper sind
beispielsweise durch Becton Dickinson, Pharmacia oder Santa Cruz
Biotech erhältlich.
Gemäß einer
bevorzugten Ausführungsform
des vorstehenden Verfahrens erfolgt die Bestimmung der Menge des
an das Polypeptid gebundenen Antikörpers durch die Bestimmung
der Menge des auf dem Träger, vorzugsweise
der Membran oder Platte verbleibenden Antikörpers nach Durchführung mindestens
eines Waschschrittes.
Gemäß einer
weiteren bevorzugten Ausführungsform
des erfindungsgemäßen Verfahrens,
ist der an das Mittel gekoppelte Träger ein erster Träger, der
einen ersten Signalerzeuger umfasst und das Polypeptid an einen
zweiten Träger
gekoppelt ist, der einen zweiten Signalerzeuger umfasst, wobei die
zwei Signalerzeuger fähig
sind, ein detektierbares Signal zu erzeugen, wenn sie sich in unmittelbarer
Nähe zueinander
befinden und die Bestimmung des Phosphorylierungszustandes anhand
der Bestimmung erfolgt, ob ein detektierbares Signal erzeugt wurde.
Vorzugsweise sind die Träger
hierbei Beads. Vorzugsweise ist das Mittel hier ein phosphospezifischer
Antikörper.
Der Träger
kann dabei direkt oder indirekt mit dem Antikörper verbunden sein, vorzugsweise
indirekt durch ProteinA, welches an den Träger gekoppelt ist. Der zweite
Träger
kann dabei direkt oder indirekt an das Polypeptid gebunden sein,
vorzugsweise indirekt durch den Biotin-Anteil des biotinylierten Polypeptids;
dies erfolgt vorzugsweise über
an den Träger
gekoppeltes Streptavidin.
Ein
Signalerzeuger kann dabei jede Art von Mittel oder Molekül sein,
das geeignet ist, detektierbare Signale zu erzeugen; Beispiele umfassen
Fluorophore, die nach Anregung durch Energieeinwirkung Licht emittieren,
welches direkt oder nach Signalverstärkung durch geeignete Mittel,
die im Stande der Technik bekannt sind, detektierbar ist. Die Signalerzeuger
sind dabei im Rahmen der vorliegenden Erfindung so gewählt, dass
nur dann ein Signal generiert wird, wenn eine direkte Interaktion
des Mittels (also vorzugsweise des phosphospezifischen Antikörpers) mit
dem Polypeptid erfolgt. Geeignete Träger und Signalerzeuger (z.B.
in Form des ALPHAScreenTM, oder LANCETM, Perkin-Elmer Life Sciences; HTRFTM, CIS Bio International)) sind bekannt.
Hierbei ist die unmittelbare Nähe
der Träger
zueinander ausschlaggebend für
die Signalerzeugung. Es ist daher sehr überraschend, dass sich diese
Art des Verfahrens zum Einsatz in Verbindung mit Polypeptiden eignet,
obwohl diese deutlich größer als
die im Stand der Technik verwendeten Peptide sind.
Das
Polypeptid ist im Rahmen der verschiedenen Gegenstände der
vorliegenden Erfindung dabei vorzugsweise das natürliche Substrat
des Enzyms, vorzugsweise in unverkürzter Länge.
Besonders
geeignete Polypeptide umfassen alle Substrate der Insulinrezeptor
Kinase. Besonders bevorzugt sind hierbei Polypeptide der Familie
Insulin Rezeptor Substrat (IRS), vorzugsweise IRS-1, 2, 3 oder 4 und
besonders bevorzugt IRS-1 oder funktionelle Fragmente oder Derivate
davon ist. Also Fragmente oder Derivate (bzw. Derivate von Fragmenten),
die die Fähigkeit
aufweisen, durch den Insulinrezeptor phosphoryliert zu werden. Weiterhin
ist es bevorzugt, wenn das IRS humanes IRS ist. Desweiteren ist
der Einsatz von IRS-1, insbesondere humanes IRS-1 mit der Sequenz
gemäß SEQ ID
No.1 ist durch die Sequenz gemäß SEQ ID No.2
kodiertes humanes IRS-1 im Rahmen der verschiedenen Aspekte der
vorliegenden Erfindung besonders bevorzugt. Die vorgenannten Polypeptide
eignen sich dabei besonders zur Bestimmung der Fähigkeit des Insulinrezeptors,
sie zu phosphorylieren.
Ein
bevorzugtes IRS-1 Fragment ist ein Polypeptid mit der Aminosäuresequenz
gemäß SEQ ID
No.3.
Die
verschiedenen Aspekte der Erfindung können auf unterschiedlicher
Ebene zum Einsatz kommen. Zweckmäßig ist
ihr Einsatz besonders bei der Identifizierung von Substanzen, die
die Fähigkeit
des Enzyms oder funktionellen Fragments oder Derivats davon, den
Phosphorylierungszustand des Polypeptid zu modulieren, modifizieren.
Geeignete
analytische Verfahren oder Systeme, sogenannte Assays, die die Aktivität oder die
Konzentration bzw. Menge bestimmter Zielmoleküle des Körpers (sogenannte „Targets", in diesem Fall
den Phosphorylierungszustand des Polypeptids), als Parameter der
Wirksamkeit potentieller Wirkstoffe messen, sind im Stande der Technik
bekannt. Diese können
beispielsweise in vitro Assays, also biochemische Assays mit isolierten
oder teil-isolierten Komponenten, die zu einem Reaktionsgemisch
zusammengesetzt werden, darstellen, anhand derer sich die Wirksamkeit
potentieller Wirkstoffe messen lässt.
Darüber
hinaus können
dies auch zelluläre
Testsysteme (Assays) sein, in denen die Aktivität des Zielproteins (also vorliegend
des Enzyms) und die Wirksamkeit potentieller Wirkstoffe auf die
Aktivität
dieses Zielmoleküs
im zellulären
Umfeld bestimmt werden kann.
Ein
Assay ist dabei jede Art analytischer Methode, anhand derer ein
biologischer Prozess überwacht werden
kann. Dabei werden herkömmlicherweise
molekulare Abläufe
und Signalkaskaden, die Teile physiologischer Stoffwechselwege und
Regelmechanismen, aber auch pathologischer Zustände darstellen in zellulären oder
biochemischen Systemen nachgestellt. Die pharmakologische Aktivität eines
Wirkstoffes kann dann anhand seiner Fähigkeit, in diese Wege und
Mechanismen einzugreifen, bestimmt werden.
Zum
Einsatz im Rahmen der Wirkstoffindung, insbesondere des Hochdurchsatzscreenings
nach Wirkstoffen, muss der Assay reproduzierbar sein und ist vorzugsweise
auch skalierbar und robust (also wenig anfällig gegen äussere Einflüsse). Der
Assay sollte vorzugsweise für
das Hochdurchsatzscreening chemischer Substanzen nach ihrer Fähigkeit,
sich auf die Aktivität
von Zielmolekülen
auszuwirken, geeignet sein. Die Art des Assays hängt dabei unter anderem von
der Art des verwendeten Zielmoleküls (z.B. genauer Typ oder Art von
biochemischem Grundmolekül.,
z.B. Polypeptid oder Polynukleotid) und dem "read out", d.h. die Parameter, anhand der die
Aktivität
des Zielmoleküls
bestimmt wird, ab.
Im
Stand der Technik sind verschiedene Assaytypen bekannt und großteils auch
kommerziell von gewerblichen Anbietern erhältlich.
Zur
Messung der Interaktion zweier Bindungspartner geeignete Assays
umfassen z.B. Radioisotopische oder Fluroreszierende Assays, z.B.
Fluoreszenzpolarisierungsassays, wie z.B. kommerziell von Panvera, Perkin-Elmer Life Sciences
(NEN, LANCETM, AlphaScreenTM)
oder CIS Bio International (HTRFTM) erhältlich. Weitere
Beispiele von Assays umfassen zelluläre Assays, in denen eine Zellinie
stabil (induzierbar oder konstitutiv; chromosomal oder episomal)
oder transient ein rekombinantes Protein nach Wunsch exprimiert.
Diese Assays umfassen z.B. Reportergen Assays, in denen die Regulation
eines bestimmten Promotors oder die Regulation eines Signaltransduktionsweges
oder eines Mitgliedes einer Signaltransduktionskaskade anhand der Aktivität eines
Reporterenzyms gemessen wird, desen Expression unter der Kontrolle
des betreffenden Promotors steht. Für diese Art von Assay ist es
notwendig, eine rekombinante Zellinie zu generieren, die das Reportergen
unter der Kontrolle eines definierten Promotors exprimiert, der
selbst zur Untersuchung steht oder der durch die zu untersuchende
Signaltransduktionskaskade reguliert wird. Geeignete Reporterenzyme
sind dem zuständigen
Fachmann allgemein bekannt und umfassen Glühwürmchen Luziferase, Renilla
Luziferase (beide kommerziell z.B. durch Packard Reagents erhältlich), β-Galaktosidase,
etc. Die Auswahl geeigneter Zellinien ist dem zuständigen Fachmann
bekannt und hängt
u. a. vom Ziel des Assays oder dem „read out" ab. In der Regel sind dies Zellinien,
die einfach zu kultivieren und zu transfizieren sind, so wie z.B.
HeLA, COS, CHO oder NIH-3T3 Zellen.
Zur
Messung der Proteinphosphorylierung bzw. der Kinaseaktivität eignen
sich z.B. die Fluoreszenzpolarisierung, z.B. kommerziell erhältlich durch
Panvera, Homogeneous Time Resolved Fluorescence (HTRFTM,
Cis Bio International) oder LANCETM Assays
(Perkin-Elmer Life Sciences) oder der Amplified Luminescent Proximity
Homogeneous Assay (ALPHAScreenTM von Perkin-Elmer
Life Sciences).
Die
im Rahmen der vorliegenden Erfindung besonders zweckmäßige Messung.
der Kinaseaktivität mittels
ALPHAScreenTM von Perkin-Elmer Life Sciences
erfolgt beispielsweise, indem die zu untersuchende Kinase ein biotinyliertes
Peptid in einem biochemischen Ansatz in Anwesenheit von ATP phosphoryliert.
Das phosphorylierte Peptid wird dann durch einen spezifischen anti-Phospho
Antikörper
gebunden, an den Protein-A-konjugierte Akzeptorbeads oder mit geeigneten
Zweitantikörpern
versehene gekoppelt sind. Im selben Ansatz befinden sich Streptavidin-gekoppelte
Donorbeads, die den Biotin Anteil des Peptids binden. Durch die Bindung
an das Peptid kommen Akzeptor- und Donorbeads in unmittelbare Nähe, was
eine Kaskade von chemischen Reaktionen in Gang setzt, die ein stark
amplifiziertes, detektierbares Lumineszenzsignal generieren: Durch
Laseranregung wird ein Photosensitizer im Donorbead angeregt, Umgebungssauerstoff
in einen Singlet Status zu versetzen. Der Singulett Sauerstoff diffundiert
dann zum Akzeptorbead, wo er ein Thioxenderivat anregt, welches
so eine Chemilumineszenz mit Wellenlänge von 370nm abgibt, die ihrerseits
weitere Fluorophore im Akzeptorbead anregt, Licht mit Wellenlängen von
520 bis 620 nm zu lumineszieren. Da die Anregung der Fluorophore
durch den Singulettsauerstoff nur dann erfolgt, wenn sich Donor-
und Akzeptorbead in enger Nähe
befinden, werden nur dann detektierbare Signale generiert.
Andere
Arten von Assays und andere Arten des „read outs" sind dem Zuständigen Fachmann ebenfalls hinlänglich bekannt.
Hierbei
ist besonders der Einsatz in Form von Hochdurchsatzverfahren (HTS,
High Throughput Screen) bevorzugt, durch die in kürzester
Zeit eine große
Anzahl von Substanzen analysiert werden kann.
Je
nach Zielsetzung kann die Modifizierung der Modulierung dabei eine
Inhibition oder Aktivierung der Modulierung durch das Enzym bedeuten.
Die Art der Modifizierung umfasst dabei alle möglichen Einflüsse, die sich
letztlich auf den Enzym-katalysierten Phosphorylierungszustand des
Polypeptids auswirken, wie der Modifizierung der Enzym-Substrat
Interaktion oder der Modifizierung der katalytischen Aktivität des Enzyms,
aber auch (vorzugsweise bei der Analyse mittels zellulärer Reaktionsansätze) der
Modifizierung der Enzymexpression, etc.
Ein
weiterer Aspekt der Erfindung bezieht sich auf ein Verfahren zur
Identifizierung von Substanzen, die die Fähigkeit eines Enzyms oder funktionellen
Fragments oder Derivats davon, den Phosphorylierungszustand eines
Polypeptids zu modulieren, modifizieren mit den Schritten
- a) Bestimmung der Fähigkeit des Enzyms oder funktionellen
Fragments oder Derivats davon, den Phosphorylierungszustand des
Polypeptids zu modulieren gemäß einem
der vorstehend genannten erfindungsgemäßen Verfahren wobei dem Reaktionsansatz
die zu testende Substanz nicht zugefügt ist,
- b) Bestimmung der Fähigkeit
des Enzyms oder funktionellen Fragments oder Derivats davon, den
Phosphorylierungszustand des Polypeptids zu modulieren nach einem
der vorstehend beschriebenen erfindungsgemäßen Verfahren, wobei dem Reaktionsansatz
die zu testende Substanz zugefügt
ist,
- c) Vergleich der Fähigkeit
nach a) mit der nach b).
Die
erfindungsgemäßen Verfahren
eignen sich dabei insbesondere zur Identifizierung von pharmakologisch
wirksamen Substanzen zur Behandlung des nicht Insulin-abhängigen Diabetes
mellitus (NIDDM), in der Onkologie (IGFRK) oder zur Behandlung inflammatorischer
Prozesse (IKK Kinase) Die Erfindung wird nachfolgend anhand verschiedener
Figuren und Beispiele nähere
erläutert,
ohne den Gegenstand der Erfindung dadurch einzuschränken.
Beispiel 1:
Verwendetes IRS-1 Fragment
Für die Demonstration
der Möglichkeit,
ein Polypeptid Substrat aus dem Insulinsignalweg zu biotinylieren
und dieses für
die erfindungsgemäße Verwendungen
und Verfahren einzusetzen, wurde ein 262 Aminosäuren großes Fragment aus dem humanen
IRS-1 gewählt
(aa516-aa777), welches zentrale potentielle Tyrosin- (fett) als
auch Serinphosphorylierungsstellen (unterstrichen) beinhaltet (Siemeister
et al. J.Biol.Chem. 1995). Das Fragment beinhaltet fünf potentielle
Tyrosin Phosphorylierungsstellen, die in 3 hervorgehoben und nachfolgend mitsamt
ihrer Motive fett dargestellt sind.
Die
Serine 612, 632, 662 und 731, welche vier mögliche Serinkinasen Phosphorylierungsstellen
in YMXMSP Motiven darstellen, sind nahe der Tyrosin Phosphorylierungsstellen
des Insulinrezeptors lokalisiert, die in Bindungsstellen für SH2 Somänen untergebracht
sind. Die Mutation dieser Serin Reste zu Alanin führt zu einem
Anstieg der IRS-1-vermittelten Aktivität der Phosphatidyl-Insositol
Trisphosphat- Kinase (PI3K), (Mothe et al. 1996), was darauf hindeutet,
dass ihnen eine inhibierende Funktion zukommt. Es ist aber nicht
auszuschließen,
dass noch weitere Serinphosphorylierungsstellen vorhanden sind,
die zur Zeit noch nicht bekannt sind.
Beispiel 2:
Klonierung und Biotinylierung
von hIRS-1-p30
Zur
Untersuchung wurde die 262 Aminosäuren lange Domäne D516-P777
(hIRS-1-p30) des
humanen IRS-1 zunächst
in E-coli wie beschrieben in Siemeister et al., 1995 exprimiert.
Die Expressionsvektoren wurden dabei durch Insertion des Polynukleotids
mit der Sequenz gemäß SEQ ID
No. 10 (cDNA Sequenz von hIRS-1-p30)
in das Plasmid pET3d (kommerziell erhältlich unter der Bestellnummer
69421 bei Novagen) durch übliche
Verfahren hergestellt. Dazu wurde zunächst der Leervektor mit den
Enzymen Ncol (kommerziell erhältlich
bei Roche Diagnostics GmbH Mannheim unter Bestellnummer 835315)
und BamHI (kommerziell erhältlich bei
Roche Diagnostics GmbH Mannheim unter Bestellnummer 656275) unter
Standardbedingungen verdaut und unter Verwendung von Spin Columns
(kommerziell erhältlich
bei Qiagen, Hilden unter Bestellnummer 28104) aufgereinigt.
Die
Biotinylierung erfolgte dabei auftragsgemäß durch den kommerziellen Anbieter
N-Zyme, Darmstadt, Deutschland mittels gängiger Techniken. Die Expression
der hIRS-1-p30 Insulinrezeptor Fragments erfolgte dabei wie beschrieben
in Siemeister et al., 1995. Zur Überprüfung des
Expressionsergebnisses wurden Proteinextrakte aus E. coli (Stamm:
E. coli BL21, kommerziell erhältlich
bei Novagen unter der Bestellnummer 69451-3) hergestellt, durch
SDS-PAGE unter Standardbedingungen (siehe z.B. nachfolgend aufgeführte Standard
Literatur) aufgetrennt und unter Anfärbung mit Coomassie Färbelösung nach
Standardbedingungen (siehe z.B. nachfolgend aufgeführte Standard
Literatur) dargestellt. Die Aufreinigung von hIRS-1-p30 erfolgte ebenfalls
nach Siemeister et. al. Die Biotinylierung von hIRS-1-p30 erfolgte
enzymatisch unter Verwendung von Transglutaminase.
Beispiel 3
ALPHAScreenTM:
Phosphorylierung von biotinyliertem IRS-1 Fragment durch Weizenkeimlektin-affinitätsgereinigten
Insulinrezeptor aus Rattenleber.
In
dem Experiment, dessen Ergebnis in 4 dargestellt
ist, wurde Weizenkeimlektin-affinitätschromatografisch gereinigter
Insulinrezeptor aus Rattenleber (WGA-IR, SEQACC Number NP_058767
oder kommerziell erhältlich
bei Sigma unter Bestellnummer 70543) mit verschiedenen Konzentrationen
an humanem Insulin (z.B. kommerziell erhältlich bei Sigma unter Bestellnummer
I-9266) und 85 nM biotinyliertem IRS Fragment für 10 Minuten bei 4°C in 50 mM
Tris-Puffer, pH 7,4, 8 mM MgCl2, 2 mM MnCl2 inkubiert, woran sich
eine 30 minütige
Inkubation nach Zugabe von ATP (Endkonzentration 50μM) bei 30°C anschloss.
Die Reaktion wurde anschliessend durch Zugabe von EDTA zu einer
Endkonzentration von 20 mM abgestoppt und die Phosphorylierung von
IRS-1 durch Verwendung eines direkt an den Akzeptor gekoppelten
p-Tyr spezifischen Antikörpers
(kommerziell erhältlich durch
Perkin-Elmer Life Sciences unter Bestellnummer 6760601 C) detektiert, was
in dem in 4 dargestellten
Readout resultierte. Mit Hilfe dieses Verfahrens konnte der EC50
für Insulin zu
10 nM bestimmt werden.
Beispiel 4
ALPHAScreenTM:
Phosphorylierung von biotinyliertem IRS-1 Fragment durch PKC und
rekombinante Insulinrezeptorkinase.
Der
ALPHAScreenTM von Perkin-Elmer Life Sciences
ermöglicht
die Detektion der Interaktion zwischen dem phosphorylierten IRS-1
Fragment und Antikörpern,
die phosphorylierte Serin oder Tyrosin Reste erkennen (p-Ser/p-Tyr
Antikörper).
Das biotinylierte IRS-1 wird dabei an den Streptavidin Donor und
der Antikörper
durch Akzeptor-gekoppeltes Protein A oder einen geeigneten, an den
Akzeptor gebundenen Zweitantikörper
gebunden. Wenn eine Interaktion stattfindet, gelangt und bleibt
der Akzeptor in der unmittelbaren Nähe des Donors, so dass Singulett
Sauerstoffatome, die durch den Donor erzeugt werden, durch Diffusion
zu chemilunineszenten Gruppen im Akzeptor Bead gelangen können, was
ultimativ in der Emission detektierbaren Lichts resultiert.
Die
in Form von Säulendiagrammen
in 5A und B dargestellten in dem vorgenannten
Assay generierten Lichtintensitäten
(der sog. „Readout") wurden nach 30
minütiger
Inkubation von IRS-1 mit Proteinkinase C und ATP und anschliessender
Zugabe von p-Ser Antikörpern
(kommerziell erhältlich
bei Biosource, Belgien unter Bestellnummer 44-550) und weiterer
Inkubation für
120 Minuten durch Messung mit einem Perkin-Elmer Fusion oder AlphaQuest
Instrument detektiert und quantifiziert. Der Vergleich der erzeugten
Lichtintensitäten in
Anwesenheit und in Abwesenheit von PKC ist in 11A dargestellt.
Bei dem Experiment, dessen Ergebnis in 11B dargestellt
ist, wurde rekombinante Insulin Rezeptor Kinase (IRK, Aminosäure 941-1343,
NCBI Zugangsnummer NM_000208) durch Inkubation mit Polylysin für 10 Minuten
bei 30°C
in 50 mM Tris-Puffer,
pH 7,4, 8 mM MgCl2, 50μM ATP Reaktionspuffer aktiviert
und anschliessend das IRK Substrat IRS zugegeben, woran sich eine
30 minütige
Inkubation bei 30°C
anschloss. Die Phosphorylierung von IRS-1 wurde unter Verwendung
eines eines direkt an den Akzeptor gekoppelten p-Tyr spezifischen
Antikörpers
(kommerziell erhältlich
durch Perkin-Elmer Life Sciences unter Bestellnummer 6760601 C)
detektiert, was in dem in 11B dargestellten
Readout resultierte.
Durch
die vorgenannten Studien konnte erstmals demonstriert werden, dass
biotinylierte Polypeptide. durch Kinasen phosphoryliert werden können. Dies
wurde anhand eines 28kDA großen
Fragments des hIRS-1 demonstriert, das im biotinylierten Zustand
durch die Serinkinase PKCδ und
durch die Tyrosinkinase des Insulinrezeptors phosphoryliert werden
kann. Die Detektion durch phosphospezifische Antikörper war
dabei ebenfalls erfolgreich, ohne dass eine sterische Behinderung
durch die Größe des Polypeptides
in Verbindung mit dem Biotinrest die Detektionsreaktion störte. Dadurch
konnte, basierend auf dem Prinzip des ALPHAScreensTM,
ein homogenes Assaysystem generiert werden, mit dem der Phosphorylierungszustand
von Polypeptiden unter Nutzung der durch die Biotinylierung möglichen
Aufreinigungs- und Detektionstechniken bestimmbar ist. Dieses Assay
Prinzip wurde hier erstmals auf ein Proteinfragment der Größe eines
Polypeptids (genauer 28kDa) angewandt. Dies ermöglicht die verbesserte Suche
nach pharmalologisch wirksamen Substanzen, welche mit der Phosphorylierungs- und Dephosphorylierungsmaschinerie
der Zelle interagieren/die Diagnose von phosphorylierungs-abhängigen Erkrankungen/die
Identifizierung neuer Proteinkinasen für spezielle Polypeptide an
großen,
sogar strukturell intakten physiologischen Substraen, was die Spezifität der diesen
Untersuchungen zugrunde liegenden Phosphorylierungen oder Dephosphorylierungen
und somit die Aussagekraft der so generierten Daten wesentlich erhöht. In dem
hier verwendeten Assaysystem war der Readout zudem nicht-radioaktiv,
sondern lumineszent, was einen Vorteil für den Einsatz in High Throughput
Screening (HTS) Verfahren darstellt. Der hier dargestellte Assay
kann somit für
das HTS aller den Phosphorylierungsstatus von Polypeptiden und Proteinen
modulierenden Enzyme, wie Kinasen und Phosphatasen, zur Identifizierung
neuartiger Wirkstoffe oder Verifizierung bekannter Wirkstoffe eingesetzt
werden. Ebenso eignet er sich für
andere Verfahren, wie die vorgenannten Verfahren zur Suche nach
neuen Enzymen, die bestimmte Polypeptide phosphorylieren, so zum
Beispiel neue IRS-1 phosphorylierende Kinasen in Ganzzellysaten.
Figurenbeschreibung
1 Proteinsequenz von IRS
1 – IRS
4 (SEQ ID No. 1 bis 4). Die Sequenzzugangsnummern (NCBI Protein
Database) der vier Familienmitglieder sind NM_005544 (IRS-1 hs),
:M:007095 (IRS-2 hs), NM:032074 (IRS-3 rat), NM_003604 (IRS-4 hs).
2 Kodierende DNA-Sequenz
von IRS 1 – IRS
4 (SEQ ID No. 5 bis 8). Die Sequenzzugangsnummern (NCBI Nucleotide
Database der vier Familienmitglieder sind NM_005544 (IRS-1 hs),
:M:007095 (IRS-2 hs), NM:032074 (IRS-3 rat), NM_003604 (IRS-4 hs).
3 Die 262 Aminosäuren umfassende
Domäne
des IRS-1 Proteins (hIRS-1-p30), welche für die vorliegenden Studien
eingesetzt wurde. Die Serine 612, 632, 662 und 731 sind unterstrichen
dargestellt. YXXM Tyrosin Phosphorylierungs Motive sind fett dargestellt.
4 Ergebnisse des ALPHAScreens
unter Verwendung von Weizenkeimlektinaffinitätschromatografisch gereinigtem
Insulinrezeptor
5 Ergebnisse des ALPHAScreensTM
6 Übersichtsabbildung
der Interaktionen von Insulinrezeptor, IRS-1 und Serinkinasen
7 Übersichtsabbildung
der möglichen
molekularen Mechanismen der inhibitorisch wirksamen Serinphosphorylierung
Literatur
- White, M. F. (2002) IRS proteins and the common path to
diabetes. Am. J. Physiol. Endocrinol. Metab. 283, E413-422
- Thirone AC, Carvalho CR, Saad MJ. (1999) Growth hormone stimulates
the tyrosine kinase activity of JAK2 and induces tyrosine phosphorylation
of insulin receptor substrates and Shc in rat tissues. Endocrinology
140, 55-62
- Schmitz-Peiffer C, Craig DL, Biden TJ. (2002) Ceramide generation
is sufficient to account for the inhibition of the insulin-stimulated
PKB pathway in C2C12 skeletal muscle cells pretreated with palmitate.
Ann. N. Y. Acad. Sci. 967, 146-157
- Gao Z, Hwang D, Bataille F, Lefevre M, York D, Quon MJ, Ye J.
(2002) Serine phosphorylation of insulin receptor substrate 1 by
inhibitor kappa B kinase complex. J. Biol. Chem. 277, 48115-48121
- Aguirre V, Werner ED, Giraud J, Lee YH, Shoelson SE, White MF.
(2000) Phosphorylation of Ser307 in insulin receptor substrate-1
blocks interactions with the insulin receptor and inhibits insulin
action. J. Biol. Chem. 275, 9047-9054
- Sun XJ, Rothenberg P, Kahn CR, Backer JM, Araki E, Wilden PA,
Cahill DA, Goldstein BJ, White MF. (1991) Structure of the insulin
receptor substrate IRS-1 defines a unique signal transduction protein.
Nature 352, 73-77
- Mothe I, Van Obberghen E. (1996) Phosphorylation of insulin
receptor substrate-1 on multiple serine residues, 612, 632, 662,
and 731, modulates insulin action. J. Biol. Chem. 271, 11222-11227
- Tanasijevic MJ, Myers MG Jr, Thoma RS, Crimmins DL, White MF,
Sacks DB. (1993) Phosphorylation of the insulin receptor substrate
IRS-1 by casein kinase II. J. Biol. Chem. 268, 18157-18166
- Paz K, Liu YF, Shorer H, Hemi R, LeRoith D, Quan M, Kanety H,
Seger R, Zick Y. (1999) Phosphorylation of insulin receptor substrate-1
(IRS-1) by protein kinase B positively regulates IRS-1 function.
J. Biol. Chem. 274, 28816-28822
- Eldar-Finkelman H, Krebs EG. (1997) Phosphorylation of insulin
receptor substrate 1 by glycogen synthase kinase 3 impairs insulin
action. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94, 9660-9664
- Jakobsen SN, Hardie DG, Morrice N, Tornqvist HE. (2001) 5'-AMP-activated protein
kinase phosphorylates IRS-1 on Ser-789 in mouse C2C12 myotubes in
response to 5-aminoimidazole-4-carboxamide riboside. J. Biol. Chem.
276, 46912-46916
- Freund GG, Wittig JG, Mooney RA. (1995) The PI3-kinase serine
kinase phosphorylates its p85 subunit and IRS-1 in PI3-kinase/IRS-1 complexes.
Biochem Biophys Res Commun 206, 272-278
- Le Marchand-Brustel Y. (1999) Molecular mechanisms of insulin
action in normal and insulin-resistant states. Exp. Clin. Endocrinol.
Diabetes 107, 126-132
- Araki E, Sun XJ, Haag BL 3rd, Chuang LM, Zhang Y, Yang-Feng
TL, White MF, Kahn CR. (1993) Human skeletal muscle insulin receptor
substrate-1. Characterization of the cDNA, gene, and chromosomal
localization. Diabetes 42, 1041-1044
- Siemeister G, al-Hasani H, Klein HW, Kellner S, Streicher R,
Krone W, Muller-Wieland
D. (1995) Recombinant human insulin receptor substrate-1 protein.
Tyrosine phosphorylation and in vitro binding of insulin receptor
kinase. J. Biol. Chem. 270, 4870-4874
- Araki E, Lipes MA, Patti ME, Bruning JC, Haag B 3rd, Johnson
RS, Kahn CR. (1994) Alternative pathway of insulin signalling in
mice with targeted disruption of the IRS-1 gene. Nature 372, 186-190.
- Lavan BE, Lane WS, Lienhard GE. (1997) The 60-kDa phosphotyrosine
protein in insulin-treated adipocytes is a new member of the insulin
receptor substrate family. J. Biol. Chem. 272, 11439-11443
- Lavan BE, Lane WS, Lienhard GE. (1997) A novel 160-kDa phosphotyrosine
protein in insulin-treated embryonic kidney cells is a new member
of the insulin receptor substrate family. J. Biol. Chem. 272, 21403-21407
- De Fea K, Roth RA. (1997) Protein kinase C modulation of insulin
receptor substrate-1 tyrosine phosphorylation requires serine 612
Biochemistry 36, 12939-12947 Standardliteratur für Labormethoden
- Sambrook et al. (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual.
Second edition. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring
Harbor, NY. 545 pp;
- Current Protocols in Molecular Biology; regularly updated, e.g.
Volume 2000; Wiley & Sons,
Inc; Editors: Fred M. Ausubel, Roger Brent, Robert Eg. Kingston,
David D. Moore, J.G. Seidman, John A. Smith, Kevin Struhl.
- Current Protocols in Human Genetics; regularly uptdated; Wiley & Sons, Inc; Editors:
Nicholas C. Dracopoli, Honathan L. Haines, Bruce R. Korf, Cynthia
C. Morton, Christine E. Seidman, J.G. Seigman, Douglas R. Smith.
- Current Protocols in Protein Science; regularly updated; Wiley & Sons, Inc; Editors:
John E. Coligan, Ben M. Dunn, Hidde L. Ploegh, David W. Speicher,
Paul T. Wingfield.
- Molecular Biology of the Cell; third edition; Alberts, B., Bray,
D., Lewis, J., Raff, M., Roberts, K., Watson, J.D.; Garland Publishing,
Inc. New York & London,
1994;
- Short Protocols in Molecular Biology, 5th edition, by Frederick
M. Ansubel (Editor), Roger Brent (Editor), Robert E. Kingston (Editor),
David D. Moore (Editor), J.G. Seidman (Editor), John A. Smith (Editor),
Kevin Struhl (Editor), October 2002, John Wiley & Sons, Inc., New York"
Materialien
und Methoden
Falls
nicht anders dargestellt, stellen die genannten Verfahren dem zuständigen Fachmann
bekannte Standardverfahren dar und können beispielsweise in der
oben aufgeführten
Literatur, insbesondere der Literatur zu Standardmethoden (im vorliegenden
Text auch als Standardliteratur bezeichnet) entnommen werden.
Abkürzungen
Für Aminosäuren (allgemein
auch abgekürzt
als AA oder AS) wurden der Drei- oder Ein- Buchstaben Code verwendet
(s. auch die angegebene Standardliteratur); Für Nukleotide wurden die allgemein üblichen einbuchstabigen
Abkürzungen
verwendet (s. auch die angegebene Standardliteratur).
