DE60015319T2

DE60015319T2 - Test zur gleichzeitigen Messung von verschiedenen enzymischen Aktivitäten

Info

Publication number: DE60015319T2
Application number: DE60015319T
Authority: DE
Inventors: John Colyer; Roger KingdoN Smallwood CRAIG
Original assignee: Cyclacel Ltd
Current assignee: Cyclacel Ltd
Priority date: 1999-02-25
Filing date: 2000-02-25
Publication date: 2005-10-27
Anticipated expiration: 2020-02-26
Also published as: EP1171627B1; DE60015319D1; WO2000050630A2; EP1171627A2; ATE280836T1; AU2813200A; WO2000050630A3

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft Verfahren zur gleichzeitigen Messung der Aktivität von zwei oder mehr Enzymen im selben System, typischerweise in Echtzeit.
Enzyme spielen in den meisten, wenn nicht sogar in allen, zum heutigen Zeitpunkt untersuchten biologischen Prozessen eine entscheidende Rolle. Obwohl eine Vielzahl von Techniken zur Messung der Enzymaktivität existiert, sind diese Techniken nur dazu geeignet, zur gleichen Zeit die Aktivität eines Enzyms zu messen. Als jedoch die Untersuchungen zellulärer Reaktionswege fortschritten, wurde erkennbar, dass dort ein komplexes Zusammenspiel zwischen den verschiedenen Komponenten dieser Reaktionswege vorliegt. Dem entsprechend wäre ein Testsystem zur Messung mehr als einer Enzymaktivität zur gleichen Zeit, insbesondere in komplexen Systemen, wie etwa Ganzzelltests oder in vivo-Untersuchungen, vorteilhaft, da es so möglich wäre, zu messen, wie die Störung eines Systems gleichzeitig die verschiedenen Enzymaktivitäten in diesem System beeinflusst.
Die EP 0 392 808 A beschreibt ein Verfahren zur Bestimmung der Aktivität eines Enzyms in einer Probe. Ein Substrat, das mit einem biolumineszierenden Protein markiert ist, wird mit einer Probe in Kontakt gebracht, von der man annimmt, dass sie das Enzym enthält, welches ein Produkt erzeugt. Ein Rezeptor, der dazu befähigt ist, entweder das markierte Produkt oder das markierte Substrat (jedoch nicht beide) zu binden, wird mit dem Reaktionsmedium gemischt, um einen Komplex zu bilden, und die Gegenwart oder Menge an detektierbarer Markierung wird bestimmt, um die Enzymaktivität zu ermitteln. Abgesehen von biolumineszierenden Markierungen werden andere Arten von Markierungen für die Verwendung in dem in der EP 0 392 808 A beschriebenen Verfahren als nicht geeignet bezeichnet.
Die WO 96/12820 beschreibt ein Verfahren zur Identifizierung einer Verbindung, die eine Interaktion zwischen einer CDC25-Phosphatase und einer Raf-Kinase inhibiert. Das Verfahren beinhaltet das System einer „Interaktionsfalle", das zwei Fusionsproteine umfasst, von denen eines einen Raf-Proteinanteil und das andere einen CDC25-Proteinanteil umfasst. Der Raf-Proteinanteil bindet an den CDC25-Proteinanteil, und das System wird einem mutmaßlichen Inhibitor ausgesetzt. Eine Abnahme der Interaktion des Fusionsproteins in Gegenwart der Kandidaten-Substanz (im Vergleich zu deren Abwesenheit) zeigt an, dass die Test-Substanz ein Inhibitor der Interaktion ist.
Wir haben nun, unter Verwendung markierter Reporter-Polypeptide, deren Interaktion durch posttranslationale Modifikation eines oder beider Polypeptide moduliert wird, gezeigt, dass es möglich ist, im selben Reaktionsgefäß gleichzeitig die Aktivität zweier verschiedener Enzyme zu messen.
Dementsprechend stellt die vorliegende Erfindung ein Verfahren zum gleichzeitigen Messen der Aktivität eines ersten Enzyms und eines zweiten Enzyms in einem System bereit, wobei das Verfahren folgendes umfasst:

(a) in Kontaktbringen einer ersten Bindungsdomäne und eines ersten Bindungspartners davon mit dem ersten Enzym und in Kontaktbringen einer zweiten Bindungsdomäne und eines zweiten Bindungspartners davon mit dem zweiten Enzym, wobei (i) die erste Bindungsdomäne und/oder der Bindungspartner eine Stelle umfassen, die einer posttranslationalen Modifikation durch das erste Enzym unterworfen wird, (ii) eine Modifikation der Stelle durch das erste Enzym die Wechselwirkung zwischen der ersten Bindungsdomäne und dem ersten Bindungspartner beeinflusst, (iii) die zweite Bindungsdomäne und/oder der Bindungspartner eine Stelle umfassen, die einer posttranslationalen Modifikation durch das zweite Enzym unterworfen wird, und (iv) eine Modifikation der Stelle durch das zweite Enzym die Wechselwirkung zwischen der zweiten Bindungsdomäne und dem zweiten Bindungspartner beeinflusst und
(b) gleichzeitiges Messen der Wechselwirkung zwischen der ersten Bindungsdomäne und dem ersten Bindungspartner und Messen der Wechselwirkung zwischen der zweiten Bindungsdomäne und dem zweiten Bindungspartner.

Vorzugsweise umfassen die erste Bindungsdomäne und der erste Bindungspartner jeweils eine detektierbare Markierung in der Weise, dass, wenn die erste Bindungsdomäne und der erste Bindungspartner miteinander wechselwirken, eine erste detektierbare physikalische Eigenschaft von einer oder beiden der Markierungen verändert wird, und umfassen die zweite Bindungsdomäne und der zweite Bindungspartner jeweils eine detektierbare Markierung in der Weise, dass, wenn die zweite Bindungsdomäne und der zweite Bindungspartner miteinander wechselwirken, eine zweite detektierbare physikalische Eigenschaft von einer oder beiden der Markierungen verändert wird, und es wird eine Messung der Wechselwirkung zwischen der ersten Bindungsdomäne und dem ersten Bindungspartner durch Messen von Veränderungen in der ersten physikalischen Eigenschaft durchgeführt und ein Messen der Wechselwirkung zwischen der zweiten Bindungsdomäne und dem zweiten Bindungspartner durch Messen von Veränderungen in der zweiten physikalischen Eigenschaft durchgeführt, wobei die erste physikalische Eigenschaft von der zweiten physikalischen Eigenschaft unterscheidbar ist.
Vorzugsweise ist die physikalische Eigenschaft Lichtemission oder -Absorption. Bevorzugter ist die physikalische Eigenschaft Fluoreszenzlichtemission. Vorzugsweise ist die detektierbare Markierung ein Fluorophor wie etwa ein Fluoreszenzprotein oder eine Fluoreszenzchemikalie.
Vorzugsweise werden das erste Enzym und/oder das zweite Enzym ausgewählt unter einer Kohlenhydrattransferase, einem Ubiquitin-aktivierenden Enzym E1, einem Ubiquitinkonjugierenden Enzym E2, einem Ubiquitin-konjugierenden Enzym Ubc9, einer Ubiquitinproteinligase E3, einer Poly-(ADP-Ribose)-Polymerase, einer Fettsäuretransferase, einer NAD:Arginin-ADP-Ribosyltransferase, einer Protease, einer Proteinkinase und einer Proteinphosphatase.
Das erste und das zweite Enzym können dieselbe Art von chemischer Modifikation ausführen (d.h. beide können z.B. Proteinkinasen sein) oder verschiedene Arten chemischer Modifikation ausführen (z.B. kann das erste Enzym eine Kinase und das zweite Enzym eine Protease sein).
Bei einer bevorzugten Ausführungsform umfasst das Verfahren weiterhin den Schritt, dass vor, während oder nach dem Messen der ersten und zweiten physikalischen Eigenschaft das erste Enzym und/oder das zweite Enzym mit einer Verbindung in Kontakt gebracht werden, welche die Aktivität des ersten und/oder des zweiten Enzyms moduliert.
Die vorliegende Erfindung stellt weiterhin ein Verfahren bereit, um eine Verbindung zu identifizieren, die in der Lage ist, die Aktivität eines ersten Enzyms und/oder eines zweiten Enzyms zu modulieren, wobei das Verfahren folgendes umfasst:

(i) in Kontaktbringen des ersten und/oder zweiten Enzyms mit einer Kandidatensubstanz,
(ii) Messen der Aktivität des ersten Enzyms und/oder des zweiten Enzyms nach dem Verfahren von Anspruch 1 und
(iii) Bestimmen, ob die Aktivität des ersten und/oder zweiten Enzyms beeinflusst wird.

Eine nach dem obigen Verfahren identifizierte Verbindung, die dazu befähigt ist, die Aktivität eines ersten Enzyms und/oder zweiten Enzyms zu modulieren, kann für die Therapie verwendbar sein.
Bei einer weiteren Ausführungsform stellt die vorliegende Erfindung einen Satz von zwei oder mehr Polypeptidpaaren bereit, wobei jedes Paar folgendes umfasst:

(a) eine Bindungsdomäne und einen Bindungspartner davon, umfassend (i) eine Stelle, die posttranslationaler Modifikation durch ein Enzym unterworfen wird, wobei eine Modifikation der Stelle durch das Enzym die Wechselwirkung zwischen der Bindungsdomäne und dem Bindungspartner beeinflusst, und (ii) eine detektierbare Markierung an der Bindungsdomäne und dem Bindungspartner in der Weise, dass, wenn die Bindungsdomäne und der Bindungspartner miteinander wechselwirken, eine detektierbare physikalische Eigenschaft von einer oder beiden der Markierungen verändert wird, wobei für jedes Paar das Enzym, welches die Wechselwirkung zwischen der Bindungsdomäne und dem Bindungspartner beeinflusst, verschieden ist und die detektierbare physikalische Eigenschaft von derjenigen des anderen Paares unterschieden werden kann.

Ebenfalls bereitgestellt wird die Verwendung des Satzes von Polypeptidpaaren in einem Verfahren zum gleichzeitigen Messen der Aktivität von zwei oder mehr Enzymen.
Wir beschreiben außerdem ein Kit, das einen Satz von Polypeptidpaaren gemäß obiger Definition umfasst. Weiterhin beschrieben sind ein Satz von Nukleinsäuresequenzen, der den Satz von Polypeptidpaaren codiert, eine Wirtszelle, die den Satz von Nukleinsäuresequenzen beinhaltet und ein transgener Organismus, der den Satz von Nukleinsäuresequenzen beinhaltet.
Definitionen
Wenn nicht anders definiert, haben alle hier verwendeten technischen und wissenschaftlichen Begriffe dieselbe Bedeutung, in der sie üblicherweise vom Durchschnittsfachmann (z.B. im Bereich Zellkultur, Molekulargenetik, Nukleinsäurechemie, Hybridisierungstechniken und Biochemie) verstanden werden. Es werden Standardtechniken für die molekularen, genetischen und biochemischen Verfahren (siehe allgemein, Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2. Auflage (1989), Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. und Ausubel et al., Short Protocols in Molecular Biology (1999), 4. Auflage, John Wiley & Sons, Inc.), chemischen Verfahren, pharmazeutischen Formulierungen und die Verabreichung und Behandlung bei Patienten verwendet.
Wie hier verwendet, beinhaltet der Begriff „Protein" einkettige Polypeptid-Moleküle ebenso wie aus mehreren Polypeptiden bestehende Komplexe, bei denen einzelne Polypeptid-Bestandteile auf kovalente oder nicht-kovalente Weise miteinander verbunden sind. Wie hier verwendet, beziehen sich die Begriffe „Polypeptid" und „Peptid" auf ein Polymer, bei dem die Monomere Aminosäuren sind und durch Peptid- oder Disulfid-Bindungen miteinander verknüpft sind. Die Begriffe „Untereinheit" und „Domäne" können sich auch auf Polypeptide und Peptide beziehen, die eine biologische Funktion besitzen. Ein für die Erfindung nützliches Peptid wird zumindest eine Bindungsfähigkeit besitzen, d.h. im Hinblick auf die Bindung als Bindungspartner oder an einen Bindungspartner, und es kann außerdem eine weitere biologische Funktion besitzen, die eine biologische Funktion des Proteins oder der Domäne ist von der die Peptidsequenz abgeleitet wurde. „Fragment hiervon" bezieht sich typischerweise auf eine ausgewählte Region eines Polypeptids, die in einem Bindungstest von Interesse ist, und für die ein Bindungspartner bekannt oder bestimmbar ist. „Fragment hiervon" bezieht sich somit auf eine Aminosäuresequenz, die einen Teil eines Polypeptids voller Länge darstellt, umfassend zwischen etwa 8 und etwa 1000 Aminosäuren Länge, bevorzugt etwa 8 bis etwa 300 Aminosäuren, bevorzugter etwa 8 bis etwa 200 Aminosäuren, und noch bevorzugter etwa 10 bis etwa 50 oder 100 Aminosäuren Länge. „Peptid" bezeichnet eine kurze Aminosäuresequenz, die 10 bis 40 Aminosäuren lang ist, bevorzugt 10 bis 35 Aminosäuren.
„Natürlich vorkommend", wie hier verwendet, wie auf ein Polypeptid oder Polynukleotid bezogen, bezieht sich darauf, dass das Polypeptid oder Polynukleotid in der Natur zu finden ist. Ein Beispiel hierfür ist eine Polypeptid- oder Polynukleotidsequenz, die in einem Organismus (einschließlich eines Virus) vorhanden ist, der aus einer natürlichen Quelle gewonnen werden kann.
Wie hier verwendet, beziehen sich die Begriffe „Protein", Untereinheit" und „Domäne" auf eine lineare Sequenz von Aminosäuren, die eine biologische Funktion aufweist. Diese lineare Sequenz beinhaltet Aminosäuresequenzen voller Länge (z.B. solche, die durch Gene oder Polynukleotide voller Länge codiert werden) oder einen Teilbereich oder ein Fragment davon, vorausgesetzt, dass der Teilbereich oder das Fragment die biologische Funktion beibehält. Die Begriffe „Untereinheit" und „Domäne" können sich auch auf Polypeptide und Peptide mit biologischer Funktion beziehen. Ein für die Erfindung nützliches Peptid wird zumindest eine Bindungsfähigkeit besitzen, d.h. im Hinblick auf die Bindung als Bindungspartner oder an einen Bindungspartner, und es kann außerdem eine weitere biologische Funktion besitzen, die eine biologische Funktion des Proteins oder der Domäne ist, von der die Peptidsequenz abgeleitet wurde.
„Polynukleotid" bezieht sich auf eine polymere Form von Nukleotiden mit einer Länge von wenigstens 10 Basen und bis zu 1000 Basen oder sogar mehr, entweder mit Ribonukleotiden oder Desoxyribonukleotiden oder einer modifizierten Form dieser beiden Nukleotidtypen. Der Begriff schließt ein- und doppelsträngige Formen von DNA ein.
Ein „System" bezieht sich auf das Medium bzw. die Umgebung, in der die Enzyme vorliegen. Beispielsweise kann das System eine Zelle sein, sodass die Enzyme, deren Aktivität durch die Verwendung des Tests der Erfindung gleichzeitig gemessen werden soll, in derselben Zelle vorliegen, oder es kann ein Reaktionsgefäß sein, sodass die Enzyme im selben Reaktionsgefäß vorliegen, wie etwa in einem Röhrchen oder der Probenvertiefung einer Mikrotiterplatte. Die Situation, in der die Enzyme in getrennten Reaktionsgefäßen oder Zellen vorliegen, und ihre Aktivität getrennt gemessen wird, selbst wenn dies gleichzeitig erfolgt, wird spezifisch von der Definition von „in einem System" oder „im selben System" ausgenommen.
A. Bindungsdomänen und Bindungspartner
Reportermoleküle können in Verfahren zur Messung der Aktivität von Proteinmodifizierenden Enzymen verwendet werden, indem man die Wechselwirkungen zwischen den Reportermolekülen misst, wobei die Wechselwirkungen durch die Aktivität der Proteinmodifizierenden Enzyme moduliert werden. Diese Reporter-Moleküle sind typischerweise natürlich vorkommende Polypeptide, die natürliche Bindungsdomänen, natürliche Bindungssequenzen und natürliche Bindungs-Polypeptide einschließen, jeweils wie oben definiert, die in Tests der Erfindung in Kombination mit Polypeptid-Bindungspartnern, ebenfalls wie oben definiert, verwendet werden. Jedoch wird auch die Verwendung von Derivaten oder Varianten ins Auge gefasst, z.B. um die Auswirkung von Mutationen in der Aminosäuresequenz auf die Funktion der Polypeptide zu untersuchen.
In solchen Tests umfassen einer oder beide von den Bindungsdomänen, Bindungssequenzen oder Bindungspolypeptiden und deren Bindungspartnern typischerweise eine detektierbare Markierung unter Einschluss, jedoch nicht unter Beschränkung auf eine fluoreszierende oder eine andere Licht-emittierende Markierung, die z.B. ein Polypeptid sein kann, das mit der Bindungsdomäne oder mit dem Bindungspartner verbunden ist. Dadurch, dass Veränderungen der Signalemission während eines physiologischen Prozesses, wie etwa einer Reaktion auf eine biologisch aktive Verbindung, gemessen werden, kann das Ausmaß der Assoziation bestimmt werden. Wo diese Assoziation von einer posttranslationalen Modifikation abhängt, kann auch die Aktivität des für die Modifikation verantwortlichen zellulären Enzyms bestimmt werden. Ein wichtiges Merkmal der Erfindung ist, dass solche Messungen (z.B. eine Verschiebung in FRET oder ein anderes, von einer detektierbaren Markierung emittiertes Signal) in Echtzeit durchgeführt werden können. Dies ermöglicht eine empfindliche Analyse der Reaktionskinetik auf Basis der Änderungsrate der von der Proteinbindung abhängigen Signalemission oder -Absorption durch die Markierung(en).
Wie hier verwendet, bezieht sich der Begriff „Bindungsdomäne" in einem dreidimensionalen Sinn auf die Aminosäurereste eines ersten Polypeptids, die für die Modifikations-abhängige Bindung zwischen dem ersten Polypeptid und seinem Bindungspartner benötigt werden. Die Aminosäuren einer „Bindungsdomäne" können entweder zusammenhängend oder nicht zusammenhängend vorliegen und können eine Bindungstasche für eine Modifikations-abhängige Bindung ausbilden. Eine Bindungsdomäne umfasst typischerweise mindestens 6 oder mehr, bevorzugt 10 oder mehr Aminosäuren, die zusammenhängend oder nicht zusammenhängend sein können, die jedoch notwendig für die Modifikations-abhängige Bindung an den Bindungspartner sind und ein Protein voller Länge einschließen können.
Eine Bindungsdomäne, die für die Erfindung von Nutzen ist, ist typischerweise eine „natürliche Bindungsdomäne", d.h. eine Bindungsdomäne, die in der Natur vorkommt. Insbesondere zeigt die Bindungsdomäne vorzugsweise in der Natur eine Modifikationsabhängige Bindung an einen Bindungspartner. Eine Bindungsdomäne, die für die Erfindung nutzbar ist, kann als einzelne Polypeptid-Domäne verwendet werden oder kann im Zusammenhang eines größeren Polypeptidmoleküls vorliegen {das noch andere Aminosäuren als jene der natürlichen Bindungsdomäne enthält), wie etwa im Kontext seines natürlichen Polypeptids.
Wie hier im Hinblick auf die Modifikation eines Polypeptids verwendet, beziehen sich die Begriffe „Stelle" und „Stelle hinreichend für die Anfügung von" auf eine Aminosäuresequenz, die erkannt wird von (d.h. ein Signal darstellt für) ein modifizierendes Enzym zum Zweck einer posttranslationalen Modifikation (d.h. einer Anfügung oder Entfernung eines „Restes" gemäß unten stehender Definition) des Polypeptids oder eines Teils davon. „Stelle" bezieht sich außerdem auf die einzelne Aminosäure, die modifiziert wird. Es wird davon ausgegangen, dass eine „Stelle" eine kleine Anzahl an Aminosäuren umfasst, lediglich eine, jedoch typischerweise 2 bis 10, weniger oft bis zu 30 Aminosäuren, und weiterhin, dass eine „Stelle" weniger Aminosäuren umfasst als die Gesamtzahl der in dem Polypeptid vorliegenden Aminosäuren.
Eine „Stelle" für die posttranslationale Modifikation kann entweder bei jeweils einem oder beiden von Bindungsdomäne und zugehörigem Bindungspartner vorliegen, bevorzugt bei beiden. Wenn solche Stellen sowohl bei der Bindungsdomäne als auch bei dem Bindungspartner vorliegen, kann die Bindung zwischen der natürlichen Bindungsdomäne und ihrem Bindungspartner vom Modifikationszustand entweder jeweils einer oder beider Stellen abhängig sein. Da, wo Stellen sowohl bei der Bindungsdomäne als auch bei dem Bindungspartner vorhanden sind, können die Stellen gleich oder verschieden sein. Die Bindungsdomäne und/oder der Bindungspartner können mehr als eine Stelle aufweisen. Wiederum können die Stellen gleich oder verschieden sein.
Wenn eine einzelne Polypeptidkette die Bindungsdomäne und deren Bindungspartner (oder zwei natürliche Bindungsdomänen) umfasst, wird der Zustand der posttranslationalen Modifikation einer oder beider Stellen bestimmen, ob eine Bindung zwischen den beiden Domänen erfolgt.
Wie hier verwendet, beziehen sich die Begriffe „Modifikation" oder „posttranslationale Modifikation" typischerweise auf die Anfügung oder Entfernung einer chemischen „Gruppierung", wie hier beschrieben, an bzw. von einer Stelle an der Polypeptidkette. Jedoch ist auch eine proteolytische Spaltung der Bindungsdomäne und/oder ihres Partners bevorzugt in die Bedeutung dieser Begriffe einbezogen. Oft ist die posttranslationale Modifikation reversibel, so dass wiederholte Zyklen der Addition und Entfernung einer modifizierenden Gruppe beobachtet werden können.
Wie hier in austauschbarer Weise verwendet, beziehen sich die Begriffe „Rest" und „Gruppe" bzw. „Gruppierung" auf eine der posttranslational angefügten oder entfernten Gruppen, auf die hier Bezug genommen wird: d.h. auf eine Ubiquitin-Gruppierung, eine Glycosyl-Gruppierung, eine Fettsäure-Gruppierung, eine Sentrin-Gruppierung, eine ADP-Ribosyl-Gruppierung oder eine Phosphat-Gruppierung.
Wie hier verwendet, bezieht sich der Begriff „Bindungspartner" auf ein Polypeptid oder ein Fragment davon (ein Peptid), das an eine Bindungsdomäne, -Sequenz oder ein Bindungspolypeptid gemäß vorliegender Definition bindet, bevorzugt in einer Weise, die vom Modifikationszustand einer Stelle zur posttranslationalen Modifikation abhängt, wobei diese Stelle wenigstens bei der Bindungsdomäne, Bindungssequenz oder dem Bindungspolypeptid vorhanden ist; der Bindungspartner selbst kann optional auch eine derartige Stelle beinhalten, und die Bindung zwischen der Bindungsdomäne, dem Bindungsfragment oder Bindungspolypeptid und seinem zugehörigen Bindungspartner kann optional von der Modifikation dieser Stelle abhängen. Ein Bindungspartner muss nicht notwendigerweise eine Stelle zur posttranslationalen Modifikation beinhalten, wenn eine solche Stelle nicht bei diesem erforderlich ist, um eine modifikationsabhängige Bindung zwischen sich und einer Bindungsdomäne, einer Bindungssequenz oder einem Bindungspolypeptid zu gewährleisten. Nutzbare Bindungspartner für die Erfindung sind typischerweise solche, die in der Natur zu finden sind, oder Derivate hiervon, und diese zeigen eine natürliche, modifikationsabhängige Bindung an eine Bindungsdomäne, Bindungssequenz oder ein Bindungspolypeptid der Erfindung gemäß vorliegender Definition. Bei einer Ausführungsform der Erfindung ist ein Bindungspartner kürzer (d.h. um wenigstens eine N-terminate oder C-terminate Aminosäure) als das natürliche Polypeptid voller Länge.
Wie hier verwendet, beziehen sich die Begriffe „assoziieren" oder „binden" auf eine Bindungsdomäne, wie hier beschrieben, und deren Bindungspartner, die eine Bindungskonstante besitzen, die hinreichend stark ist, um die Detektion der Bindung durch FRET oder eine andere Nachweisform zu erlauben, und die in physikalischem Kontakt zueinander stehen und daher typischerweise eine Dissoziationskonstante (Kd) von etwa 10 μM oder weniger aufweisen. Die Kontaktregion kann alles oder einen Teil der beiden Moleküle beinhalten. Daher beziehen sich die Begriffe „weitgehend dissoziiert" und „dissoziiert" oder „weitgehend ungebunden" und „ungebunden" auf die Abwesenheit oder den Verlust des Kontakts zwischen solchen Regionen, sodass sich die Bindungskonstante um ein Ausmaß verringert, das eine erkennbare Veränderung in einem Signal im Vergleich zu dem gebundenen Zustand hervorruft. Hier eingeschlossen sind auch die totale Abwesenheit bzw. der totale Verlust des Kontakts, sodass die Proteine vollständig voneinander getrennt sind, ebenso wie eine partielle Abwesenheit bzw. ein partieller Verlust des Kontakts, so dass die Anordnung der Proteine sich nicht länger in engem Kontakt zueinander befindet, jedoch noch immer zusammengehalten oder anderweitig lose verbunden sein kann, und somit typischerweise eine Dissoziationskonstante (Kd) größer 10 μM vorliegt. In vielen Fällen wird die Kd im mM-Bereich liegen. Die Begriffe „Komplex", „Dimer", „Multimer" und „Oligomer", wie hier verwendet, beziehen sich auf die Bindungsdomäne und deren Bindungspartner im assoziierten oder gebundenen Zustand. Mehr als ein Molekül eines jeden der beiden oder mehr Proteine können in einem Komplex, Dimer, Multimer oder Oligomer gemäß den Verfahren der Erfindung vorliegen.
Wie hier verwendet, bezieht sich der Begriff „Bindungssequenz" auf denjenigen Teil eines Polypeptids, der wenigstens 4 oder 6 Aminosäuren, bevorzugt wenigstens 10, 20, 100 oder 1000 zusammenhängende (d.h. kovalent durch Peptidbindungen verknüpfte) Aminosäurereste oder sogar ebenso viele Reste wie sie im Protein voller Länge vorhanden sind, umfasst, wobei diese Aminosäurereste hinreichend sind, eine modifikationsabhängige Bindung an einen Bindungspartner zu bewirken. Eine Bindungssequenz kann in einem Polypeptidmolekül vorkommen, das nur aus Aminosäureresten der Bindungssequenz besteht, oder sie kann stattdessen im Kontext einer größeren Polypeptidkette (d.h. einer Polypeptidkette, die noch andere Aminosäuren als diejenigen der Bindungssequenz umfasst) vorkommen.
Wie hier im Bezug auf diejenigen Bindungssequenzen verwendet, die für die Erfindung von Nutzen sind, bezeichnet der Begriff „natürliche Bindungssequenz" eine Bindungssequenz gemäß obiger Definition, die aus einer Aminosäuresequenz besteht, die in der Natur zu finden ist, und die natürlicher Weise abhängig ist vom Modifikationszustand einer in ihr befindlichen Stelle für die posttranslationale Modifikation zur Bindung an einen Bindungspartner. Eine „natürliche Bindungssequenz" kann entweder isoliert oder im Kontext eines größeren Polypeptidmoleküls vorkommen, wobei dieses Molekül natürlich vorkommend oder rekombinant sein kann. Wenn sie vorhanden sind, können die Aminosäuren außerhalb der Bindungssequenz entweder natürlich sein, d.h. von der gleichen Polypeptidsequenz stammen, aus der das Fragment stammt, oder nicht-natürlich, d.h. von einem anderen (verschiedenartigen) Polypeptid stammen bzw. nicht-natürlich in dem Sinne sein, dass die Sequenz aus keinem bekannten Polypeptid stammt. Eine Bindungssequenz und deren Bindungspartner werden jedoch im Allgemeinen auf zwei verschiedenen Polypeptidketten vorliegen.
Jedoch müssen die hier beschriebenen Verfahren nicht notwendigerweise ausschließlich Gebrauch von natürlich vorkommenden Sequenzen einschließlich allelischer Varianten machen. Es können Modifikationen an der Aminosäuresequenz der Bindungsdomäne und/oder des Bindungspartners, wie etwa Substitutionen, Deletionen und/oder Insertionen vorgenommen werden. Insbesondere können solche Modifikationen durchgeführt werden, um wichtige Regionen des Moleküls im Hinblick z.B. auf Protein-Protein-Interaktionen zu identifizieren.
Wie hier verwendet, bezieht sich der Begriff „Bindungspolypeptid" auf ein Molekül, das mehrere Bindungssequenzen umfasst, wie oben definiert, wobei diese Sequenzen aus einem einzigen, natürlich vorkommenden Polypeptidmolekül stammen und sowohl notwendig, als auch, in Kombination, hinreichend sind, um eine vom Modifikationszustand abhängige Bindung des Bindungspolypeptids an dessen Bindungspartner, wie oben beschrieben, zu erlauben, wobei die Sequenzen des Bindungspolypeptids entweder zusammenhängend oder nicht zusammenhängend sind. Wie hier im Bezug auf die zusammengesetzten Bindungssequenzen eines Bindungspolypeptids verwendet, bezieht sich der Begriff „nicht zusammenhängend" auf Bindungssequenzen, die durch dazwischen liegende natürlich vorkommende Aminosäuresequenzen, wie hier definiert, miteinander verbunden sind. Die Aminosäuren eines Polypeptids, die nicht in wesentlichem Maße zu der vom Modifikationszustand abhängigen Bindung dieses Polypeptids an dessen Bindungspartner beitragen, können diejenigen Aminosäuren sein, die natürlicher Weise vorhanden sind und die Bindungssequenzen in einem Bindungspolypeptid verbinden, oder sie können von einem anderen Polypeptid stammen. Ein Bindungspolypeptid und dessen Bindungspartner gemäß vorliegender Definition (bei dem es sich selbst um eine Bindungsdomäne, Bindungssequenz oder ein Bindungspolypeptid handeln kann), werden typischer Weise auf zwei verschiedenen Polypeptidketten vorliegen.
Es ist bevorzugt, dass die Bindungsdomäne und/oder der Bindungspartner eine Sequenz umfassen, die die Modifikation einer Stelle an der Bindungsdomäne und/oder dem Bindungspartner durch eines oder mehrere der folgenden Enzyme lenkt: eine Kohlenhydrattransferase (z.B. eine UDP-N-Acetylglucosamin-Dolichylphosphat-N-acetylglucosaminphosphotransferase oder eine O-GIcNAc-Transferase), ein Ubiquitinaktivierendes Enzym E1, ein Ubiquitin-konjugierendes Enzym E2, ein Ubiquitin-konjugierendes Enzym Ubc9, eine Ubiquitinproteinligase E3, eine Poly-(ADP-Ribose)-Polymerase, eine Fettsäuretransferase (z.B. eine Glycylpeptid-N-tetradecanoyltransferase (Peptid-N-myristoyltransferase)), eine NAD:Arginin-ADP-Ribosyltransferase, eine Protease, eine Proteinkinase oder eine Phosphatase.
Es ist außerdem bevorzugt, wenn die Stelle die Addition einer chemischen Gruppierung erlaubt, die z.B. eine Ubiquitin-Gruppierung, eine Glycosyl-Gruppierung, eine ADP-Ribosyl-Gruppierung, eine Fettsäuregruppierung, eine Sentrin-Gruppierung oder eine Phosphatgruppe sein kann, und die Addition die Bindung der Bindungsdomäne an den Bindungspartner verhindert.
Wie hier verwendet, bezieht sich der Begriff „verhindert Bindung" oder „verhindert Assoziation" auf die Befähigung wenigstens einer Ubiquitin-Gruppierung, einer Glycosyl- Gruppierung, einer Fettsäuregruppierung, einer Sentrin-Gruppierung, einer ADP-Ribosyl-Gruppierung oder einer Phosphatgruppe, die Assoziation, wie oben definiert, zwischen einer Bindungsdomäne und einem Bindungspartner davon um wenigstens 10%, bevorzugt um 25 bis 50%, hoch bevorzugt um 75 bis 90% und, am meisten bevorzugt, um 95 bis 100% gegenüber der in Abwesenheit einer solchen Modifikation unter den selben Versuchsbedingungen beobachteten Assoziation zu inhibieren.
Gemäß einer weiteren bevorzugten Ausführungsform erlaubt die Stelle die Anfügung einer chemischen Gruppierung, die z.B. eine Ubiquitin-Gruppierung, eine Glycosyl-Gruppierung, eine ADP-Ribosyl-Gruppierung, eine Fettsäuregruppierung, eine Sentrin-Gruppierung oder eine Phosphatgruppe sein kann, wobei die Anfügung die Bindung der Bindungsdomäne an den Bindungspartner fördert.
Wie hier verwendet, bezieht sich der Begriff „fördert Bindung" darauf, dass ein Anstieg der Bindung der natürlichen Bindungsdomäne und deren Bindungspartner um wenigstens das zweifache, bevorzugt um das 10- bis 20-fache, hoch bevorzugt um das 50- bis 100-fache, bevorzugter um das 200- bis 1000-fache, und, am stärksten bevorzugt, um das 200- bis 10.000-fache bewirkt wird.
Vorzugsweise erlaubt die Stelle die Entfernung einer chemischen Gruppierung, die eine Ubiquitin-Gruppierung, eine Glycosyl-Gruppierung, eine ADP-Ribosyl-Gruppierung, eine Fettsäuregruppierung, eine Sentrin-Gruppierung oder eine Phosphatgruppe sein kann, wobei die Entfernung die Bindung der Bindungsdomäne an den Bindungspartner verhindert.
Es ist außerdem bevorzugt, dass die Stelle die Entfernung einer chemischen Gruppierung erlaubt, die eine Ubiquitin-Gruppierung, eine Glycosyl-Gruppierung, eine ADP-Ribosyl-Gruppierung, eine Fettsäuregruppierung, eine Sentrin-Gruppierung oder eine Phosphatgruppe sein kann, und dass die Entfernung die Bindung der isolierten natürlichen Bindungsdomäne an den Bindungspartner fördert.
Eine für die vorliegende Erfindung nützliche Bindungsdomäne wird eine Bindungsstelle umfassen, die es ihr ermöglichen wird, an andere Polypeptide (Bindungspartner) zu binden, um einen Komplex zu bilden. Es ist bekannt, dass Polypeptide dazu befähigt sind, in einer Vielzahl von Arten zu assoziieren, und Domänen, die die Assoziation von Polypeptiden vermitteln, sind in der Technik bekannt. Beispielsweise sind „coiled coils", „acid patches", Zinkfinger, Calciumhände, WD40-Motive, SH2/SH3-Domänen und Leucin-Zipper sämtlich Polypeptid- Domänen, die dafür bekannt sind, dass sie Protein-Protein-Interaktionen vermitteln, ebenso wie weitere Domänen, die Fachleuten bekannt sind.
Die Bindungsdomänen und Bindungspartner werden typischerweise als Satz bereitgestellt, da sie dafür vorgesehen sind, die Aktivität von zwei oder mehr verschiedenen Enzymen zu detektieren. Daher umfasst ein Satz von Reporter-Polypeptiden zur Anwendung in den Verfahren der Erfindung im allgemeinen wenigstens eine erste Bindungsdomäne und einen Bindungspartner davon, zur Verwendung bei der Detektion eines ersten Enzyms, und wenigstens eine zweite Bindungsdomäne und einen Bindungspartner davon, zur Verwendung bei der Detektion eines zweiten Enzyms. Das Testverfahren ist jedoch nicht auf die Messung der Aktivität von zwei Enzymen zur selben Zeit beschränkt, sondern kann verwendet werden, um eine Vielzahl von Enzymaktivitäten zu messen. Entsprechend kann der Satz eine Vielzahl von Reporter-Polypeptidpaaren umfassen, die in geeigneter Weise so ausgewählt werden, dass die Aktivität eines jeden interessierenden Enzyms unterschieden werden kann.
Polypeptide zur Verwendung als Reporter können durch eine Vielzahl von in der Technik bekannten Verfahren, wie etwa Festphasensynthese oder rekombinante Expression, hergestellt werden. Solche Polypeptide können optional Reste oder chemische Gruppierungen enthalten, um die Immobilisierung eines oder mehrerer Reporter-Polypeptide an einer Festphase zu unterstützen. Beispielsweise können Reporter-Polypeptide Fusionspolypeptide sein, die eine heterologe Sequenz umfassen, die durch rekombinante Techniken mit dem Rest des Polypeptids fusioniert wurde. Beispiele für Fusionspolypeptide beinhalten einen Hexahistidin-Tag, GAL4, beta-Galactosidase und Epitop-Tags. Reporter-Polypeptide können außerdem, wie unten dargestellt, eine detektierbare Markierung umfassen.
Bei einer bevorzugten in vitro-Ausführungsform wird wenigstens einer von der Bindungsdomäne oder dem Bindungspartner an einem festen Träger immobilisiert. Geeignete Träger beinhalten Kügelchen (Beads), Chips, Harze, Matrizes, Gele und das Material, das die Wände eines Gefäßes bildet. Matrizes, und insbesondere Gele, wie etwa Agarosegele, können leicht in Säulen gepackt werden. Ein besonderer Vorteil der Immobilisierung an Festphasen besteht darin, dass die Reagenzien leicht aus dem Kontakt mit dem/den Polypeptiden) entfernt werden können.
Sätze von Reporter-Polypeptiden können an festen Trägermaterialien immobilisiert werden, um Peptid-Anordnungen zu erzeugen. Die Reporter-Polypeptide werden typischerweise an oder in abgegrenzten Bereichen eines festen Trägermaterials immobilisiert. Das Trägermaterial kann porös sein, um eine Immobilisierung in dem Trägermaterial zu erlauben, oder im Wesentlichen unporös, wobei die Sensorelemente hier typischerweise auf der Oberfläche des Trägermaterials immobilisiert werden. Das feste Trägermaterial kann aus einem beliebigen Material bestehen, an das Polypeptide entweder direkt oder indirekt binden können. Beispiele für geeignete feste Trägermaterialien beinhalten Flachglas, Silikonwaffeln, Glimmer, Keramikmaterialien und organische Polymere, wie etwa Kunststoffe einschließlich Polystyrol und Polymethacrylat. Es kann auch möglich sein, semipermeable Membranen, wie etwa Nitrocellulose- oder Nylonmembranen zu verwenden, die problemlos erhältlich sind. Die semipermeablen Membranen können auf einer stabileren festen Oberfläche, wie etwa Glas, angebracht werden. Die Oberflächen können optional mit einer Metallschicht, wie etwa Gold, Platin oder einem anderen Übergangsmetall, beschichtet werden. Ein spezielles Beispiel für einen geeigneten festen Träger ist der kommerziell erhältliche BIACore^TM-Chip (Pharmacia Biosensors). Ein weiteres Beispiel ist eine Mikrotiterplatte oder eine ähnliche Anordnung.
Der feste Träger wird praktischerweise in Sektoren unterteilt. Dies kann durch Techniken wie Lichtätzen oder durch die Applikation hydrophober Tinten, z.B. Teflon-basierter Tinten (Celline, USA), erfolgen. Die Anheftung der Reporter-Polypeptide an das Trägermaterial kann auf kovalente oder nicht kovalente Weise erfolgen. Die Reporter-Polypeptide können über eine Schicht von Molekülen an dem Trägermaterial befestigt werden, an welche die Sensorelemente binden. Beispielsweise können die Sensorelemente mit Biotin markiert und das Trägermaterial mit Avidin und/oder Streptavidin beschichtet werden. Ein praktisches Merkmal bei der Verwendung biotinylierter Sensorelemente besteht darin, dass die Effektivität der Bindung an das feste Trägermaterial leicht bestimmt werden kann. Da die Sensorelemente möglicherweise nur schwach an bestimmte feste Trägermaterialien binden, ist es oft notwendig, eine chemische Zwischenschicht zwischen dem festen Trägermaterial (wie etwa im Fall von Glas) und dem Sensorelement bereitzustellen. Beispiele für geeignete chemische Zwischenschichten beinhalten organo-funktionale Silane und langkettige Thiolalkane mit endständigen aktivierbaren Gruppen, wie etwa endständigen Carbonsäure-Gruppen. Ein weiteres Beispiel ist die Verwendung von Polylysin-beschichtetem Glas, wobei das Polylysin dann unter Verwendung von Standardverfahren chemisch modifiziert wird, um einen Affinitäts-Liganden, wie etwa Nitrilotriacetat (NTA), einzuführen. Weitere Verfahren zur Anheftung von Molekülen an die Oberflächen von Sensor-Chips unter Verwendung von Kupplungsmitteln sind in der Technik bekannt (siehe z.B. WO 98/49557).
Es ist erstrebenswert, die Effektivität der Kupplung unter Verwendung von Standardtechniken zu bestätigen, um die Menge an Sensorelementen, die an jeder Zelle auf dem festen Trägermaterial gebunden sind, zu definieren. Diese Information kann verwendet werden, um die Ergebnisse zu normalisieren, die an verschieden Positionen des Array erhalten wurden.
Beispielhaft nutzt ein geeignetes Protokoll die Verwendung von mit Hexahistidin-Tag versehenen Polypeptiden, die an Mikrotiterplatten immobilisiert werden. Der Nitrilotriessigsäure-Ligand wird gemäß Herstelleranweisung an die Plattenoberfläche gebunden. Zuerst wird die Platte mit PBS-Puffer, enthaltend 50 μM EDTA (genug, um verunreinigende Metallionen zu entfernen, ohne dabei das Ni²⁺ abzulösen), gewaschen, dann werden die Platten mit Ni²⁺ (100 μM in PBS-Puffer) beladen. Peptide (0,01–100 mM in PBS-Puffer) werden zu den Probenvertiefungen der Mikrotiterplatte hinzugegeben (die Bindungskapazität wird anhand des Ausmaßes der Derivatisierung von Ni-NTA bestimmt) und für 1 bis 2 Stunden bei Raumtemperatur oder über Nacht bei 4°C inkubiert. Das nicht-gebundene Peptid wird dann durch Absaugen entfernt, gefolgt von einem gründlichen Waschschritt mit einem Puffer-Überschuss. Der Überschuss an Waschpuffer wird durch sanftes Ausklopfen der umgedrehten Platten auf Papiertüchern entfernt.
B. Detektierbare Markierungen
Bei einer besonders bevorzugten Ausführungsform umfasst wenigstens eine, bevorzugt beide, von der Bindungsdomäne und dem Bindungspartner eine detektierbare Markierung. Die Markierung kann optisch, z.B. fluoreszierend, ein absorptives farbiges Partikel oder ein Farbstoff, radioaktiv, sodass sie für die Verwendung in Nährungstests mit Szintillationsmessung oder einer Szintillationsemulsion geeignet sein kann, enzymatisch, wie etwa bei einem Glucoseoxidase-Sensor oder einem anderen Redoxsystem, oder eine immobilisierte chemische Kaskade, oder massenbasiert sein, wie es bei einem auf Oberflächenplasmonresonanz basierenden Test verwendbar wäre, bei dem entweder das Protein oder der Bindungspartner von hohem Molekulargewicht sein müssen. Vorzugsweise ist die Markierung fluoreszierend. Fluoreszenzmarkierungen werden unten im Detail beschrieben.
„Detektierbare Markierung" bedeutet im Kontext der vorliegenden Erfindung eine Gruppierung, proteinisch oder andersartig, deren physikalische Eigenschaften sich in Abhängigkeit von ihrem molekularen Kontext auf detektierbare Weise verändern, so etwa, wenn das Polypeptid, an der sie gebunden ist, an ein anderes Polypeptid bindet. Es ist besonders bevorzugt, wenn die detektierbare Markierung in einer nicht invasiven Weise detektierbar ist, welche die Zerstörung des zellulären Materials nicht erforderlich macht. Somit sind also z.B. Markierungen bevorzugt, die nicht die Extraktion und Zerlegung zellulärer Komponenten erfordern und eine in situ-Messung erlauben.
Bei einer Ausführungsform kann die detektierbare Markierung Untereinheiten oder Fragmente von Enzymen umfassen, die funktionell sind, wenn sie miteinander verbunden sind. Beispielsweise kann β-Galactosidase in zwei Fragmente (Δα und Δω) gespalten werden, die, wenn sie zusammen exprimiert werden, ein funktionelles Enzym bilden (siehe Sambrook et al., ibidem). Ein derartiges System ist bei intakter Hefe verwendet worden, um Protein-Protein-Interaktionen zu messen (Rossi et al., 1997, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94: 8405–8410). Ebenso kann bakterielle Luciferase in Form von zwei Fragmenten hergestellt werden, die, wenn sie zusammen exprimiert werden und assoziieren, ein funktionelles Enzym bilden (Almashanu et al., 1996, Protein Eng. 9: 803–9).
Detektierbare Markierungen beinhalten auch Gruppierungen, die dazu dienen können, die Größe des Reporterpolypeptids zu erhöhen und damit die Verwendung in Nachweistechniken, die eine Größenzunahme eines Komplexes messen, zu ermöglichen. Somit kann eine geeignete Gruppierung z.B. Streptavidin beinhalten, das über eine Biotin-Gruppierung an das Reporter-Polypeptid gebunden wird. Die Biotinylierung von Peptiden ist in der Technik wohlbekannt. Eine Biotin/Streptavidin-Gruppierung ist in den Beispielen beschrieben, wo die verwendete Messtechnik Fluoreszenzpolarisation war, die die Geschwindigkeit der Taumelbewegung von Makromolekülen misst. Wenn das an Biotin/Streptavidin gekoppelte Reporter-Polypeptid an einen fluoreszierend markierten Bindungspartner bindet, verändert sich der Polarisationswert des fluoreszierend markierten Bindungspartners als Ergebnis der massiven Größenzunahme des Komplexes.
Da bei den Tests der vorliegenden Erfindung zwei oder mehr Enzymaktivitäten gemessen werden, ist es wichtig, die detektierbaren Markierungen so auszuwählen, dass das Signal, das von den Reporter-Polypeptiden erzeugt wird, die auf ein Enzym von Interesse reagieren, von dem Signal oder den Signalen unterschieden werden kann, die von Reporter-Polypeptiden erzeugt werden, die auf irgendwelche anderen Enzyme von Interesse reagieren.
Wenn beispielsweise die Polypeptide der Bindungsdomänen-Markierung und der Bindungspartner-Markierung von lebenden Zellen exprimiert werden, wie etwa bei transgenen Organismen und ausgehend von einem Konstrukt, das im Genom des Organismus vorhanden ist, so wird die Markierung in Form eines Polypeptids vorliegen, dessen Aminosäurebestandteile natürlich vorkommende Aminosäuren sind, einschließlich solcher, die aus posttranslationalen Modifikationen hervorgehen. Die Nukleinsäurekonstrukte, die diese Polypeptide codieren, können unter Verwendung von Standardtechniken in das Genom des Organismus eingeführt werden. Typischerweise sind die Bindungsdomäne und der Bindungspartner dadurch mit der detektierbaren Markierung verbunden, dass sie in Form eines Fusionsproteins exprimiert werden. Jedoch können die Bindungsdomäne und/oder der Bindungspartner durch jedes physiologisch verwendbare Mittel mit ihrer detektierbaren Markierung verbunden werden. Beispielsweise können sie Teil eines Multiprotein-Komplexes sein, der durch Disulfid-Bindungen oder durch nicht-kovalente Bindung, wie etwa elektrostatische Wechselwirkungen, hydrophobe Wechselwirkungen und/oder van der Waal'sche Kräfte zusammengehalten wird.
Vorzugsweise können die sich verändernden physikalischen Eigenschaften in lebenden Zellen unter Verwendung nicht-invasiver Techniken wie etwa FRET detektiert werden. Bei einer bevorzugten Ausführungsform ist die detektierbare Markierung daher ein Fluoreszenzprotein.
„Fluoreszenzprotein" bezieht sich auf jedwedes Protein, das fluoresziert, wenn es mit geeigneter elektromagnetischer Strahlung angeregt wird. Dies schließt Proteine ein, deren Aminosäuresequenzen entweder natürlich oder künstlich hergestellt sind. Ein „Fluoreszenzprotein" ist ein fluoreszierendes Protein voller Länge oder ein fluoreszierendes Fragment davon.
Es können jedoch, insbesondere bei in vitro-Testsystemen, auch nicht-proteinische Fluoreszenzmarkierungen verwendet werden. Die Auswahl der Fluoreszenzmarkierung wird so erfolgen, dass markierte Peptide, wenn sie assoziiert sind, bei Lichtanregung einen optimalen Energietransfer zwischen den Fluorophoren zeigen. In Gegenwart eines Proteinmodifizierenden Enzyms, das die in der natürlichen Bindungsdomäne und, optional im Bindungspartner, vorliegende Stelle für die Proteinmodifikation erkennt, werden die natürliche Bindungsdomäne und deren Bindungspartner aufgrund einer strukturellen oder elektrostatischen Veränderung, die, wie beschrieben, als Folge der Anfügung oder Entfernung einer chemischen Gruppierung an/von der Enzym-Erkennungsstelle auftritt, dissoziieren, was dadurch zu einer Abnahme der Energieübertragung und zu einer gesteigerten Lichtemission durch den Donor-Fluorophor führt. Auf diese Weise kann der Zustand der Polypeptidmodifikation überwacht und in Echtzeit quantifiziert werden.
Wie hier verwendet, beziehen sich die Begriffe „Fluorophor" und „Fluorochrom" in austauschbarer Weise auf ein Molekül, das in der Lage ist, Energie bei einem Wellenlängenbereich zu absorbieren und Energie bei einem anderen Wellenlängenbereich als dem Absorptionsbereich wieder abzugeben. Der Begriff „Anregungswellenlänge" bezieht sich auf den Wellenlängenbereich, bei dem ein Fluorophor Energie absorbiert. Der Begriff „Emissionswellenlänge" bezieht sich auf den Wellenlängenbereich, mit dem der Fluorophor Energie abgibt oder fluoresziert.
Eine nicht abschließende Liste für die Erfindung nutzbarer chemischer Fluorophore ist zusammen mit deren Anregungs- und Emissions-Wellenlängen in Tabelle 1 dargestellt.
Tabelle 1
Es ist außerdem anzumerken, dass da, wo die verwendete Fluoreszenztechnik sowohl ein Donormolekül als auch ein Akzeptormolekül erfordert, natürlich vorkommende oder künstlich eingefügte Tryptophan-Reste in der Bindungsdomäne und/oder im Bindungspartner geeignet als Donor sind und daher in diesem Fall nur eines der Moleküle mit einem Fluoreszenzmolekül markiert werden muss.
Beispiele für Fluoreszenzproteine, die sich untereinander hinsichtlich ihrer Anregungs- und Emissionsmaxima unterscheiden, sind in Tabelle 1 der WO 97/28261 aufgelistet. Diese in Nanometern angegebenen Wellenlängen (jeweils gefolgt von ihrem [Anregungsmaximum/Emissionsmaximum]) beinhalten wildtypisches Green Fluorescent Protein [395(475)/508] und die klonierten Mutanten des Green Fluorescent Protein in Form der Varianten P4 [383/447], P4-3 [381/445], W7 (433(453)/475(501)], W2 [432(453)/480], S65T [489/511], P4-1 [504(396)/480], S65A [471/504], S65C [479/507], S65L [484/510], Y66F [360/442], Y66W [458/480], 10c [513/527], W1B [432(453)/476(503)], Emerald [487/508] und Sapphire [395/511]. Diese Liste ist für in der Technik bekannte fluoreszierende Proteine nicht erschöpfend, weitere Beispiele finden sich in den öffentlichen Datenbanken Genbank und SwissProt. Weitere Beispiele sind beschrieben in Matz et al., 1999 (Nature Biotech 17: 969-973) und beinhalten Red Fluorescent Protein aus Discosoma sp. (drFP583).
Bei Verwendung in einem FRET-Assay werden die fluoreszierenden Markierungen so ausgewählt, dass das Anregungsspektrum der einen Markierung (der Akzeptor-Markierung) mit dem Emissionsspektrum der angeregten Fluoreszenzmarkierung (der Donor-Markierung) überlappt. Die Donor-Markierung wird durch Licht geeigneter Intensität im Anregungsspektrum des Donors angeregt. Der Donor emittiert dann einen Teil der aufgenommenen Energie als Fluoreszenzlicht und leitet etwas von dieser Energie durch FRET auf die Akzeptor-Fluoreszenzmarkierung über. Die von ihm erzeugte Fluoreszenzenergie wird durch die Akzeptor-Fluoreszenzmarkierung ausgelöscht („gequencht"). FRET kann als Verminderung der Intensität des Fluoreszenzsignals des Donors, als Verminderung der Zeitspanne seines Anregungszustandes und als Re-Emission von Fluoreszenzlicht bei den längeren Wellenlängen (mit geringerer Energie), die für den Akzeptor charakteristisch sind, festgestellt werden. Wenn die Donor- und Akzeptor-Markierungen räumlich voneinander getrennt werden, wird FRET vermindert oder aufgehoben.
Man kann dadurch Nutzen aus dem FRET ziehen, der bei einer Bindungsdomäne und deren Bindungspartner, die jeweils mit unterschiedlichen Fluoreszenzmarkierungen markiert sind (dabei Verbindung eines der Elemente mit einer Donor-Markierung, und Verbindung des anderen Elements mit einer Akzeptor-Markierung) erfolgt, dass man Protein-Protein-Wechselwirkungen gemäß der vorliegenden Erfindung überwacht. Ein einziges Polypeptid kann eine blaue Fluoreszenz-Donormarkierung und eine grüne Fluoreszenz-Akzeptormarkierung umfassen, wobei jede Markierung mit einer unterschiedlichen Assay-Komponente fusioniert ist (d.h. in der Art, dass eine Markierung an die Bindungsdomäne und die andere Markierung an deren Bindungspartner angefügt ist); ein derartiges Konstrukt wird hier als „Tandem"-Fusionsprotein bezeichnet.
Alternativ können zwei getrennte Polypeptide („einzelne" Fusionsproteine), von denen eines eine natürliche Bindungsdomäne und das andere deren Bindungspartner umfasst, in unterschiedlicher Weise mit den Donor- bzw. Akzeptor-Fluoreszenzprotein-Markierungen markiert werden. Die Konstruktion und Verwendung von Tandem-Fusionsproteinen bei der Erfindung kann gegenüber der Verwendung einzelner Fusionsproteine eine erhebliche Verminderung der molaren Konzentrationen der Peptide erlauben, die notwendig sind, um eine Assoziation zwischen unterschiedlich markierten Polypeptid-Assay-Komponenten zu bewirken. Die Herstellung der markierten Bindungsdomäne, Bindungssequenz oder des Bindungspolypeptids und/oder deren jeweiligen Bindungspartnern kann typischerweise durchgeführt werden unter Verwendung chemischer Synthesetechniken wie etwa Festphasensynthese oder der in vitro- oder in vivo-Expression (z.B. in einem transgenen Tier) rekombinanter Nukleinsäuremoleküle, enthaltend eine im Leseraster liegende Fusion der Sequenzen, die für ein solches Polypeptid und eine Proteinmarkierung codieren.
Ein für die Erfindung verwendbares rekombinantes Nukleinsäuremolekül kann mittels in der Technik wohlbekannter molekularer Verfahren konstruiert und exprimiert werden. Es kann zusätzlich Sequenzen umfassen, die, ohne hierauf beschränkt zu sein, solche einschließen, die einen Tag (z.B. einen Histidin-Tag) codieren, um eine einfache Reinigung zu ermöglichen, ein Sekretionssignal, ein Kernlokalisationssignal oder ein anderes primäres Sequenzsignal, das in der Lage ist, das Konstrukt an eine bestimmte zelluläre Position zu leiten, falls dies so gewünscht ist. Nukleinsäuresequenzen können beispielsweise infolge der Degeneration des genetischen Codes modifiziert werden, um die Codon-Nutzung zu optimieren und Codon-Einschränkungen bei einem gegebenen transgenen Organismus von Interesse zu berücksichtigen.
Die Werkzeuge, mittels derer eine Bindungsdomäne und deren Bindungspartner unter Verwendung fluoreszierender Proteinmarkierungen gemäß der Erfindung auf eine Assoziation hin getestet werden, können kurz wie folgt zusammengefasst werden:
Unabhängig davon, ob die natürliche Bindungsdomäne und deren Bindungspartner auf einem einzigen Polypeptidmolekül vorliegen oder nicht, kann eines davon mit einem grünen Fluoreszenzprotein markiert sein, während das andere bevorzugt mit einem roten, oder, alternativ, mit einem blauen Fluoreszenzprotein markiert ist. Nützliche Donor:Akzeptor-Paare von Fluoreszenzproteinen (siehe WO 97/28261) beinhalten, ohne hierauf beschränkt zu sein,
Donor: S72A, K79R, Y145F, M153A und T203I (Anregung 395 nm; Emission 511 nm)
Akzeptor: S65G, S72A, K79R und T203Y (Anregung 514 nm; Emission 527 nm), oder T203Y/S65G, V68L, Q69K oder S72A (Anregung 515 nm; Emission 527 nm).
Ein Beispiel für eine Blau:Grün-Paarung ist P4-3 (dargestellt in Tabelle 1 der WO 97/28261) als Donor-Markierung und S65C (ebenfalls in Tabelle 1 der WO 97/28261) als Akzeptor-Markierung. Die natürliche Bindungsdomäne, Bindungssequenz oder das Bindungspolypeptid und der zugehörige Bindungspartner werden Licht, z.B. mit einer Wellenlänge von 368 nm, was nahe dem Anregungsmaximum von P4-3 liegt, ausgesetzt. Diese Wellenlänge regt S65C nur minimal an. Bei Anregung wird ein gewisser Anteil der von der blauen Fluoreszenzprotein-Markierung aufgenommenen Energie mittels FRET auf die Akzeptor-Markierung übertragen, wenn sich die natürliche Bindungsdomäne, Bindungssequenz oder das Bindungspolypeptid und der zugehörige Bindungspartner in enger Verbindung befinden. Als Resultat dieses Quenchens ist das von dem blauen Fluoreszenzprotein emittierte blaue Fluoreszenzlicht weniger hell, als es bei isoliertem Vorliegen des blauen Fluoreszenzproteins zu erwarten wäre. Die Akzeptor-Markierung (S65C) kann die Energie als längere Wellenlänge, in diesem Fall als grünes Fluoreszenzlicht, wieder abgeben.
Beispielsweise werden sich nach einem Ereignis, wie etwa einem intrazellulären Ereignis, das in der Modifikation eines oder beider der natürlichen Bindungsdomäne und deren Bindungspartner durch ein Protein-modifizierendes Enzym resultiert, die natürliche Bindungsdomäne und deren Bindungspartner (und damit das grüne und rote, oder, weniger bevorzugt, das grüne und blaue Fluoreszenzprotein) physikalisch von einander trennen oder assoziieren, wodurch FRET entsprechend inhibiert oder gefördert wird. Wenn die Aktivität des modifizierenden Enzyms z.B. in der Dissoziation eines Protein:Protein-Komplexes resultiert, so nimmt die Intensität des durch das blaue Fluoreszenzprotein emittierten sichtbaren blauen Fluoreszenzlichts zu, während die Intensität des sichtbaren grünen Lichts, das als Ergebnis von FRET durch das grüne Fluoreszenzprotein emittiert wird, abnimmt).
Ein solches System ist nutzbar, um die Aktivität von Enzymen zu überwachen, die eine Stelle für die posttranslationale Modifikation einer Bindungsdomäne und, optional, deren Bindungspartner, an die Fluoreszenzprotein-Markierungen angekoppelt werden, modifizieren und ebenso für die Untersuchung der Aktivität von Protein-modifizierenden Enzymen und Modulator-Kandidaten derselben.
Vorteile von Einzel- und Tandem-Fluoreszenzproteinen/Polypeptiden mit einer Bindungsdomäne, die an ein Fluoreszenzprotein fusioniert ist, beinhalten den größeren Extinktionskoeffizienten und die größere Quantenausbeute von vielen dieser Proteine im Vergleich mit den Werten für nicht-peptidische Fluorophore.
Folglich sind bei einer bevorzugten Ausführungsform die Substrate des Enzyms von Interesse (d.h. die Bindungsdomäne und, optional, der zugehörige Bindungspartner) und die Reaktionsprodukte, (d.h. die Bindungsdomäne und, optional, der zugehörige Bindungspartner nach der Modifikation), beide fluoreszierend, jedoch mit unterschiedlichen Fluoreszenzeigenschaften.
Insbesondere zeigen das Substrat und die modifizierten Produkte verschiedene Verhältnisse der emittierten Lichtmengen der Donor- und Akzeptor-Markierungen. Daher misst das Verhältnis zwischen den beiden Fluoreszenzen das Ausmaß der Umwandlung von Substrat zu Produkten, und zwar unabhängig von der absoluten Menge eines jeden, der optischen Dichte der Probe, der Helligkeit der Anregungslampe, der Empfindlichkeit des Detektors etc. Weiterhin haben aus Aequorea abgeleitete oder damit verwandte Fluoreszenzproteinmarkierungen die Neigung, proteaseresistent zu sein. Daher ist es wahrscheinlich, dass sie ihre Fluoreszenzeigenschaften während des Verlaufs eines Versuchs beibehalten.
Wie oben beschrieben, ist die Donor-Fluoreszenzprotein-Markierung dazu in der Lage, ein Photon aufzunehmen und Energie an eine andere Fluoreszenzmarkierung zu übertragen. Die Akzeptor-Fluoreszenzprotein-Markierung ist dazu in der Lage, Energie aufzunehmen und ein Photon zu emittieren. Falls nötig, kann ein Linker die natürliche Bindungsdomäne und deren Bindungspartner entweder direkt oder indirekt durch eine intermediäre Bindung mit einer oder beiden der Donor- und Akzeptor-Fluoreszenzprotein-Markierungen verbinden. Unabhängig von der relativen Anordnung der Bindungsdomäne, von deren Bindungspartner und den Donor- und Akzeptor-Fluoreszenzprotein-Markierungen an einem Polypeptidmolekül, ist es essentiell, dass durch den Linker und/oder durch die Bindungsdomäne und deren Bindungspartner ein hinreichender Abstand zwischen dem Donor und dem Akzeptor gewahrt wird, um sicherzustellen, dass kein FRET auftritt, solange die Bindungsdomäne und deren Bindungspartner nicht aneinander binden. Wie in der WO 97/28261 in größerem Detail beschrieben, ist es wünschenswert, eine Donor-Fluoreszenzprotein-Markierung mit einem Emissionsspektrum auszuwählen, das mit dem Anregungsspektrum einer Akzeptor-Fluoreszenzprotein-Markierung überlappt. Bei einigen Ausführungsformen der Erfindung unterstützt die Überlappung der Emissions- und Anregungsspektren FRET. Ein Fluoreszenzprotein mit Nutzbarkeit für die Erfindung beinhaltet, zusätzlich zu denjenigen mit intrinsischen Fluoreszenzeigenschaften, Proteine, die aufgrund intramolekularer Umordnungen oder aufgrund der Zugabe von die Fluoreszenz unterstützenden Co-Faktoren fluoreszieren.
Beispielsweise können die grünen Fluoreszenzproteine („GFPs") von Cnidariern, die als deren Energie-Übertragungs-Akzeptoren bei der Biolumineszenz fungieren, für die Erfindung verwendet werden. Ein grünes Fluoreszenzprotein, wie hier verwendet, ist ein Protein, das mit grünem Licht fluoresziert, und ein blaues Fluoreszenzprotein ist ein Protein, das mit blauem Licht fluoresziert. GFPs sind aus der Qualle Aequorea victoria („Pacific Northwest Jellyfish"), der Weichkoralle Renilla reniformis und aus Phialidium gregarium isoliert worden (Ward et al., 1982, Photochem. Photobiol., 35: 803–808; Levine et al., 1982, Comp. Biochem. Physiol., 72B: 77–85). Siehe auch Matz, et al., 1999, ibidem, für kürzlich aus Anthoza-Arten isolierte Fluoreszenzproteine (Zugangsnummern AF168419, AF168420, AF168421, AF168422, AF168423 und AF168424).
Es ist eine Vielzahl von Aequorea-verwandten GFPs mit nützlichen Anregungs- und Emissionsspektren durch die Modifizierung der Aminosäuresequenz eines natürlich vorkommenden GFP aus Aequorea victoria erzeugt worden (Prasher et al., 1992, Gene, 111:229–233; Heim et al., 1994, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 91: 12501–12504; PCT/US95/14692). Wie hier verwendet, ist ein Fluoreszenzprotein ein Aequorea-verwandtes Fluoreszenzprotein, wenn eine beliebige zusammenhängende Sequenz des Fluoreszenzproteins, die 150 Aminosäuren umfasst, eine wenigstens 85%ige Sequenzidentität mit einer Aminosäuresequenz, entweder zusammenhängend oder nicht zusammenhängend, aus dem wildtypischen grünen Fluoreszenzprotein von Aequorea (SwissProt Zugangsnummer P42212) besitzt. Bevorzugter ist ein Fluoreszenzprotein ein Aequorea-verwandtes Fluoreszenzprotein, wenn eine beliebige zusammenhängende Sequenz des Fluoreszenzproteins, die 200 Aminosäuren umfasst, eine wenigstens 95%ige Sequenzidentität mit einer Aminosäuresequenz, entweder zusammenhängend oder nicht zusammenhängend, aus dem wildtypischen grünen Fluoreszenzprotein von Aequorea mit der SwissProt Zugangsnummer P42212 besitzt. Entsprechend und unter Verwendung der gleichen Standards kann das Fluoreszenzprotein mit den wildtypischen Fluoreszenzproteinen aus Renilla oder Phialidium in Verwandtschaftsbeziehung gesetzt werden.
Aequorea-verwandte Fluoreszenzproteine beinhalten z.B. wildtypisches (natives) Aequorea victoria-GFP, dessen Nukleotidsequenzen und abgeleitete Aminosäuresequenzen in „Genbank" unter den Zugangsnummern L29345, M62654, M62653 dargestellt sind, und andere Aequorea-verwandte, durch Bearbeitung hergestellte Versionen des „Green Fluorescent Protein", von denen einige oben aufgelistet sind. Mehrere von diesen, d.h. P4, P4-3, W7 und W2 fluoreszieren bei einer merklich kürzeren Wellenlänge als der Wildtyp.
C. Herstellung von Polypeptiden zur Verwendung bei der Erfindung
Ein Polypeptid, bestehend aus oder umfassend eine natürliche Bindungsdomäne oder einen Bindungspartner derselben, kann durch Fmoc- oder Tboc-Chemie gemäß in der Technik bekannter Verfahren (siehe z.B. Atherton et al., 1981, J. Chem. Soc. Perkin I, 1981, (2): 538-546; bzw. Merrifield, 1963, J. Am. Chem. Soc., 85: 2149–2154) synthetisiert werden. Nach der Entschützung und der Abspaltung von dem Harz werden die Peptide durch Gelfiltrations-Chromatographie entsalzt und mittels Massenspektroskopie, HPLC, Edman-Abbau und/oder andere Verfahren, wie sie unter Verwendung von Standardmethodik in der Technik zur Proteinsequenzierung bekannt sind, analysiert.
Alternativ können Nukleinsäuresequenzen, die für solche Proteine codieren, entweder in Zellen, einschließlich der Zellen eines intakten mehrzelligen Organismus, oder in einem in vitro-Transkriptions-/Translations-System exprimiert werden. Optional können die Proteine durch in der Technik wohlbekannte Verfahren gereinigt werden.
Markierung einer natürlichen Bindungsdomäne und/oder eines Bindungspartners davon mit einer detektierbaren Markierung
Viele Aminosäurereste besitzen eine Chemie, die die Markierung mit kommerziell erhältlichen Fluoreszenzmarkierungen oder anderen Markierungen erlaubt. Die nützlichsten von diesen sind solche mit ionisierbaren Seitenketten, wie Asparaginsäure, Glutaminsäure, Lysin, Arginin, Cystein, Histidin und Tyrosin. Das Markierungsreagenz kann eine Gruppe sein, die die gewünschte Eigenschaft, wie etwa Fluoreszenz, verleiht, und bevorzugt eine Gruppe enthält, die an der Konjugation der Markierung mit dem Zielpolypeptid beteiligt ist. Die am gebräuchlichsten genutzten funktionellen Gruppen in diesem Zusammenhang sind solche, die entweder durch Acylierung oder Alkylierung mit Aminen reagieren. Diese beinhalten Isothiocyanate, Isocyanate, Acylazide, NHS-Ester und viele andere. Ebenfalls gebräuchlich ist die Verwendung von auf Thiol ausgerichteten Gruppen, wie etwa Halogenacetaten und Maleimiden. Diese markieren primär an der freien Sulfhydrylgruppe von Cystein-Resten.
Es ist eine Anzahl von Protokollen entworfen worden, um eine Markierung an einer spezifischen Stelle in einem synthetisierten Peptid zu erreichen. Diese sind Fachleuten wohlbekannt, und viele sind detailliert beschrieben in Bioconjugate Techniques, G.T. Hermanson, Academic Press, 1996. Es ist möglich, Reaktionen zu beeinflussen, um eine spezifische Markierung an einer funktionellen Gruppe zu erreichen und wahllose Reaktionen der Markierung mit anderen Stellen in dem Polypeptid zu reduzieren. Alternativ kann die Markierung des Moleküls simultan mit der Synthese erfolgen. Dies kann entweder durch die Verwendung einer markierten Aminosäure bei dem Syntheseprozess oder durch die spezifische Entschützung und Markierung des gewünschten Restes vor der Entschützung der anderen potentiell reaktiven Reste bei der Fertigstellung der Synthese erfolgen.
Beispielsweise kann eine natürliche Bindungsdomäne oder ein Bindungspartner hiervon dementsprechend mit Thiol-reaktiven Derivaten von Fluorescein und Tetramethylrhodamin (Isothiocyanat- oder Iodacetamid-Derivate, Molecular Probes, Eugene, OR, USA) unter Verwendung von Techniken markiert werden, wie sie von Hermanson G.T., 1996, Bioconjugate Techniques, Academic Press, London, beschrieben worden sind. Alternativ können auf primäre Amine ausgerichtete Konjugationsreaktionen verwendet werden, um Lysin-Seitenketten oder den freien Peptid-N-Terminus zu markieren (Hermanson, 1996, supra). Fluoreszierende Peptide werden durch Gelfiltrations-Chromatographie, Reversphasen-HPLC oder Gleichgewichtsdialyse von nicht umgesetzten Fluorophoren abgetrennt.
Rekombinante Expression von Reporter-Polypeptiden – Reporter-Polypeptid-Konstrukte
Wie oben angemerkt, sind rekombinante Nukleinsäurekonstrukte von besonderem Nutzen für die Erfindung typischerweise solche, die im Leseraster liegende Fusionen von Sequenzen, die eine Bindungsdomäne oder einen Bindungspartner derselben codieren, und ein Markierungsprotein, wie etwa ein Fluoreszenzprotein, umfassen. Wenn beispielsweise eine fluoreszierend markierte Bindungsdomäne und deren Bindungspartner als Teil eines einzigen Polypeptids exprimiert werden sollen, so codiert das Nukleinsäuremolekül zusätzlich mindestens eine Donor-Fluoreszenzprotein-Markierung fusioniert an dem einen, eine Akzeptor-Fluoreszenzprotein-Markierung fusioniert an dem anderen, einen Linker, der beide verbindet und von hinreichender Länge und Flexibilität ist, um die Faltung des Polypeptids und die Paarung der natürlichen Bindungsdomäne, Bindungssequenz oder des Bindungspolypeptids mit dem Bindungspartner zu erlauben, sowie genregulatorische Sequenzen, die operativ mit der die Fusion codierenden Sequenz verbunden sind. Wenn stattdessen einzelne Fusionsproteine codiert werden (egal, ob nun durch ein oder mehrere Nukleinsäuremoleküle), so muss jedes Nukleinsäuremolekül nur eine Bindungsdomäne oder einen Bindungspartner hiervon codieren, fusioniert entweder mit einer Donor- oder einer Akzeptor-Fluoreszenzprotein-Markierung, und operativ verbunden mit genregulatorischen Sequenzen.
Vorzugsweise werden das Fusionsprotein, das die Bindungsdomäne umfasst und das Fusionsprotein, das den Bindungspartner umfasst, von getrennten Nukleinsäurekonstrukten codiert.
„Operativ verbunden" bezieht sich auf Polynukleotidsequenzen, die notwendig sind, um die Expression der codierenden und nicht-codierenden Sequenzen, an die sie ligiert sind, zu bewirken. Die Natur dieser Kontrollsequenzen unterscheidet sich in Abhängigkeit vom Wirtsorganismus; in Prokaryoten beinhalten solche Kontrollsequenzen im allgemeinen Promotor, Ribosomenbindungsstelle und Transkriptionsterminationssequenz; bei Eukaryoten umfassen solche Kontrollsequenzen im allgemeinen Promotoren und eine Transkriptionsterminationssequenz. Der Begriff „Kontrollsequenzen" soll wenigstens diejenigen Komponenten einschließen, deren Anwesenheit die Expression beeinflussen kann; er kann außerdem zusätzliche Komponenten umfassen, deren Anwesenheit vorteilhaft ist, z.B. Leader-Sequenzen und Fusionspartner-Sequenzen.
Besonders bevorzugte regulatorische Sequenzen sind solche, die eine gewebespezifische oder induzierbare Expression verleihen. Eine gewebespezifische Expression kann verwendet werden, um die Expression der Bindungsdomäne und/oder des Bindungspartners auf einen Zelltyp oder ein Gewebe/Organ von Interesse zu begrenzen. Eine induzierbare Expression erlaubt es dem Forscher, zu bestimmen, wann die Expression der Polypeptide stattfindet. So kann beispielsweise ein transgener Organismus in Abwesenheit der Expression der Bindungsdomäne und/oder des Bindungspartners erzeugt und gekreuzt werden, und die Expression wird erst dann induziert, wenn es gewünscht ist, die Interaktion zwischen der Bindungsdomäne und dem Bindungspartner zu untersuchen, z.B. durch die Verabreichung einer Verbindung, die die Expression, ausgehend von dem induzierbaren regulatorischen Konstrukt, heraufreguliert.
Wenn die Nukleinsäurekonstrukte in das Wirtsgenom integriert werden sollen, ist es wichtig, Sequenzen einzubeziehen, die die Expression von Polypeptiden in einem bestimmten genomischen Kontext erlauben. Ein möglicher Ansatz kann darin bestehen, homologe Rekombination zu verwenden, um das endogene Gen, das das Bindungsprotein oder den Bindungspartner codiert, durch eine Sequenz zu ersetzen, die das entsprechende Polypeptid in Fusion mit einer detektierbaren Markierung codiert. Dies soll sicherstellen, dass das Fusionspolypeptid den gleichen transkriptionellen Regulationsmechanismen unterworfen ist wie das endogene Gen. Alternativ kann homologe Rekombination in einer entsprechenden Weise, jedoch außerdem unter Austausch der regulatorischen Sequenzen, verwendet werden, sodass das Fusionspolypeptid einer anderen Art der Regulation unterworfen ist – so etwa einer induzierbaren Expression in Anwesenheit einer exogen zugeführten Verbindung.
Wenn das Konstrukt jedoch an anderer Stelle im Genom eingesetzt wird, ist es möglich, dass das Chromatin in dieser Region transkriptionell ruhend ist und sich in einem kondensierten Zustand befindet. Wenn dies geschieht, so wird das markierte Polypeptid nicht exprimiert werden – diese Faktoren werden als „positionsabhängige Effekte" bezeichnet. Um dieses Problem zu überwinden, kann es wünschenswert sein, Locuskontrollregionen (LCRs) einzubeziehen, die das beeinflussende Chromatin in einer transkriptionell kompetenten, offenen Konformation halten. LCRs (auch bekannt als Gerüstanheftungsregionen (scaffold attachment regions, SARs) oder Matrixanheftungsregionen (matrix attachment regions (MARs)) sind in der Technik wohlbekannt; ein Beispiel hierfür ist das Lysozym A-Element des Huhns (Stief et al., 1989, Nature 341: 343), das um ein exprimierbares Gen von Interesse herum angeordnet werden kann, um eine Zunahme der allgemeinen Expression des Gens zu bewirken und positionsabhängige Effekte beim Einbau in das Genom eines Organismus zu vermindern (Stief et al., 1989, supra). Ein anderes Beispiel ist das CD2-Gen LCR, das beschrieben wurde in Lang et al. 1991, Nucl. Acid. Res. 19: 5851–5856.
D. Verfahren, um Protein:Protein-Bindung in Tests der Erfindung zu detektieren
Gemäß der Erfindung wird die Assoziation der Bindungsdomäne und deren Bindungspartner unter Verwendung von Detektionstechniken gemessen, die die Bildung oder Zerstörung von Protein:Protein-Komplexen bestimmen können. Die Tests können in vitro, in Ganzzell-Testformaten oder in vivo durchgeführt werden. In vitro-Tests und Ganzzelltests können vorteilhafter Weise in Hochdurchsatztests verwendet werden, wenn es beabsichtigt ist, Modulatoren der Enzymaktivität zu identifizieren. Ein wichtiger Aspekt der vorliegenden Erfindung besteht darin, dass die Aktivität von mehr als einem Enzym in einem gegebenen System zur gleichen Zeit gemessen werden kann. Es ist daher möglich, die Aktivität von zwei oder mehr verschiedenen Enzymen gleichzeitig in derselben Zelle oder im selben Reaktionsgefäß zu messen.
In der Technik sind Detektionsverfahren ohne die Verwendung von Markierung bekannt. Diese beinhalten die Detektion unter Verwendung von Oberflächenplasmonresonanz, um Veränderungen hinsichtlich der Masse des immobilisierten Polypeptids zu detektieren, die erfolgen wird, wenn die Bindung des Partnerpolypeptids zunimmt oder abnimmt. Derartige Messungen können z.B. unter Verwendung einer BIAcore-Maschine durchgeführt werden. Alternativ kann Massenspektroskopie verwendet werden, um die Anwesenheit und Masse einer gebundenen Spezies, die mit einem immobilisierten Peptid interagiert, zu detektieren.
Es ist jedoch bevorzugt, markierte Bindungsdomänen und Bindungspartner zu verwenden, sodass daher typischerweise Techniken verwendet werden, die physikalische Parameter messen, die sich aus solchen Markierungen ergeben. Von besonderem Nutzen für die Erfindung sind solche Verfahren, die eine Fluoreszenzmarkierung der Bindungsdomäne und/oder deren Bindungspartner beinhalten, sowie die nachfolgende Detektion von Veränderungen der Fluoreszenz, sei es nun hinsichtlich der Frequenz oder der Höhe, wenn die Bindungsdomäne mit ihrem Bindungspartner interagiert. Verschiedene derartige Prozeduren sind unten kurz zusammengefasst.
Es wird eine Anzahl von Parametern der Fluoreszenzabgabe betrachtet, einschließlich

1. Messung der Fluoreszenz, die bei den Emissionswellenlängen des Akzeptors (A) und des Donors (D) emittiert wird und Bestimmung des Ausmaßes des Energietransfers anhand des Verhältnisses von deren Emissionsamplituden;
2. Messung der Fluoreszenzdauer von D;
3. Messung der Rate der Lichtausbleichung von D; 4. Messung der Anisotropie von D und/oder A oder
5. Messung des Stokes Shift Monomers; Excimer Fluoreszenz

Fluoreszenzresonanz-Eneraietransfer (FRET)
Ein Werkzeug, mittels dem der Abstand zwischen zwei Molekülen (ob nun Protein oder Nukleinsäure) oder zwischen zwei Positionen im selben Molekül untersucht werden kann, wird durch die Technik des Fluoreszenzresonanz-Energietransfers (FRET) bereitgestellt, die in der Technik wohlbekannt ist (siehe Übersichtsartikel von Matyus, 1992, J. Photochem. Photobiol. B: Biol., 12: 323–337). FRET ist ein strahlungsfreier Prozess, bei dem Energie von einem angeregten Donormolekül auf ein Akzeptormolekül übertragen wird; der Wirkungsgrad dieser Übertragung ist, wie unten beschrieben, abhängig vom Abstand zwischen dem Donormolekül und dem Akzeptormolekül. Da die Rate des Energietransfers umgekehrt proportional zur sechsten Potenz des Abstandes zwischen dem Donor und dem Akzeptor ist, ist der Wirkungsgrad des Energietransfers außerordentlich empfindlich gegenüber Abstandsveränderungen. Man sagt, dass der Energietransfer mit detektierbarem Wirkungsgrad im Abstandbereich von 1–10 nm erfolgt, jedoch für vorteilhafte Donor-Akzeptor-Paare typischerweise 4–6 nm beträgt.
Strahlungsloser Energietransfer basiert auf den biophysikalischen Eigenschaften von Fluorophoren. Diese Prinzipien sind an anderer Stelle in Übersichtsdarstellungen beschrieben (Lakowicz, 1983, Principles of Fluorescence Spectroscopy, Plenum Press, New York; Jovin und Jovin, 1989, Cell Structure and Function by Microspectrofluorometry, Herausgeber E. Kohen und J.G. Hirschberg, Academic Press). Kurz dargestellt, absorbiert ein Fluorophor Lichtenergie bei einer charakteristischen Wellenlänge. Diese Wellenlänge ist auch als Anregungswellenlänge bekannt. Die von einem Fluorochrom absorbierte Energie wird anschließend über verschiedene Wege wieder freigesetzt, wovon einer die Emission von Photonen ist, die Fluoreszenz erzeugt. Die emittierte Lichtwellenlänge ist als Emissionswellenlänge bekannt und stellt eine inhärente Eigenschaft eines bestimmten Fluorophors dar. Strahlungslose Energieübertragung ist der quantenmechanische Prozess, durch den die Energie des angeregten Zustands des einen Fluorophors ohne tatsächliche Photonenemission auf einen zweiten Fluorophor übertragen wird. Diese Energie kann dann nachfolgend bei der Emissionswellenlänge des zweiten Fluorophors freigesetzt werden. Der erste Fluorophor wird allgemein als Donor (D) bezeichnet und besitzt einen Anregungszustand von höherer Energie als der zweite Fluorophor, der als Akzeptor (A) bezeichnet wird. Die wesentlichen Merkmale des Prozesses bestehen darin, dass das Emissionsspektrum des Donors mit dem Anregungsspektrum des Akzeptors überlappt, und dass der Donor und der Akzeptor hinreichend nah zueinander sind. Die Distanz, über die der strahlungsfreie Energietransfer wirksam ist, hängt von vielen Faktoren ab, einschließlich des Fluoreszenz-Quantenwirkungsgrades des Donors, dem Extinktionskoeffizienten des Akzeptors, dem Ausmaß der Überlappung ihrer jeweiligen Spektren, dem Brechungsindex des Mediums und der relativen Orientierung der Übergangszustände der beiden Fluorophoren. Zusätzlich zum Vorliegen einer optimalen Überlappung des Emissionsbereichs mit der Anregungswellenlänge des anderen Fluorophors muss der Abstand zwischen D und A hinreichend klein sein, um den strahlungsfreien Energietransfer zwischen den Fluorophoren zu erlauben.
FRET kann entweder in vivo oder in vitro durchgeführt werden. Gemäß der Erfindung sind die Bindungsdomäne, Bindungssequenz oder das Bindungspolypeptid und der zugehörige Bindungspartner, enthalten entweder auf demselben oder auf verschiedenen Polypeptidmolekülen, unterschiedlich markiert, einer mit einem Donor und der andere mit einem Akzeptor, und es werden Unterschiede bei der Fluoreszenz unter verschiedenen Bedingungen unter Verwendung eines Fluorimeters oder eines Laser-Scanner-Mikroskops gemessen. Es wird Fachleuten ersichtlich sein, dass die Anregungs-/Detektionsmittel durch Einbau von Photo-Multiplikatoreinrichtungen gesteigert werden können, um die Empfindlichkeit der Detektion zu erhöhen. Die unterschiedlichen Markierungen können entweder zwei verschiedene Fluoreszenzmarkierungen oder eine Fluoreszenzmarkierung und ein Molekül, das bekanntermaßen dessen Signal quencht, beinhalten; Unterschiede hinsichtlich der Nähe der natürlichen Bindungsdomäne zu ihrem Bindungspartner unter verschiedenen Bedingungen können auf Basis eines Unterschiedes im beobachteten Fluoreszenzspektrum oder der beobachteten Fluoreszenzintensität gemessen werden.
Diese Kombination von Protein-Markierungsverfahren und -Vorrichtungen ermöglicht insofern einen wesentlichen Vorteil gegenüber früheren Verfahren zur Bestimmung der Assoziation von Polypeptiden, optional in Abhängigkeit von der Aktivität Protein-modifizierender Enzyme gemäß obiger Beschreibung, als die Ergebnisse aller Messungen in Echtzeit (d.h. als Reaktionsfortschritt) erhalten werden. Dies ist von entscheidendem Vorteil, da es sowohl eine schnelle Sammlung von Daten ermöglicht und ebenso Informationen hinsichtlich der Reaktionskinetik unter verschiedenen Bedingungen erbringt.
Eine gemäß der Erfindung getestete Probe umfasst daher ein Gemisch bei einem Gleichgewicht zwischen der markierten natürlichen Bindungsdomäne und deren Bindungspartner, das, wenn es im Zustand der Dissoziation voneinander vorliegt, bei einer Frequenz fluoresziert, und, wenn es im Zustand des Komplexes vorliegt, bei einer anderen Frequenz fluoresziert; oder sie umfasst alternativ Moleküle, die entweder in Abhängigkeit davon fluoreszieren oder nicht fluoreszieren, ob eine Assoziation vorliegt oder nicht vorliegt.
Die Bindungsdomäne und/oder der Bindungspartner davon werden typischerweise so modifiziert, dass sie einen chemischen Fluorophor enthalten oder, wie unten beschrieben, im Leseraster mit einem Fluoreszenzprotein fusioniert sind. Die Auswahl der Fluoreszenzmarkierung wird so sein, dass bei Lichtanregung markierte Peptide, die assoziiert sind, einen optimalen Energietransfer zwischen den Fluorophoren zeigen. In Gegenwart eines Protein-modifizierenden Enzyms, das die Stelle zur Proteinmodifizierung erkennt, die in der natürlichen Bindungsdomäne und, optional, im Bindungspartner vorhanden ist, werden die natürliche Bindungsdomäne und deren Bindungspartner aufgrund einer strukturellen oder elektrostatischen Veränderung dissoziieren, die infolge der Anfügung oder Entfernung einer chemischen Gruppierung an/von der Enzym-Erkennungsstelle auftritt, wie hier beschrieben, wodurch eine Abnahme der Energieübertragung und eine Steigerung der Lichtemission durch den Donor-Fluorophor auftreten. Auf diese Weise können der Zustand der Polypeptidassoziation/-Modifikation in Echtzeit überwacht und quantifiziert werden.
Alternative Fluoreszenztechniken, die für die Untersuchung der Protein-Protein-Bindung in Tests der Erfindung geeignet sind
Eine Ausführungsform der Technologie kann Monomer-Excimer-Fluoreszenz als Abgabeform verwenden.
Wie dargestellt, zeigt das Fluorophor Pyren, wenn es einzeln vorkommt, eine Fluoreszenzemission von einer bestimmten Wellenlänge, die wesentlich kürzer als diejenige ist, die auftritt, wenn zwei Pyrene ein planares Dimer (Excimer) bilden. Wie oben wird die Anregung bei einer einzigen Wellenlänge (vermutlich 340 nm) verwendet, um die Excimer-Fluoreszenz (470 nm) gegenüber der Fluoreszenz des Monomers (375 nm) zu prüfen, um das Verhältnis von Assoziation zu Dissoziation des Reportermoleküls zu quantifizieren.
Weitere Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung sind nicht von FRET abhängig. Beispielsweise kann die Erfindung von der Fluoreszenz-Korrelationsspektroskopie (FCS) Gebrauch machen, die auf der Messung der Diffusionsgeschwindigkeit einer Markierung basiert (siehe Elson und Magde, 1974 Biopolymers, 13: 1–27; Riger et al., 1992, in Fluorescence Spectroscopy: New Methods and Apalications; Springer Verlag, S. 13–24; Eigen und Rigler, 1994, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 91: 5740-5747; Kinjo und Rigler, 1995, Nucleic Acids Res., 23: 1795–1799).
Bei der FCS bestrahlt ein fokussierter Laserstrahl ein sehr kleines Lösungsvolumen in der Größenordnung von 10^–15 Litern, das zu jedem gegebenen Zeitpunkt nur ein Molekül von den vielen zu analysierenden Molekülen enthält. Die Diffusion von Einzelmolekülen durch das bestrahlte Volumen resultiert über den Zeitverlauf in Entladungen von Fluoreszenzlicht, da die Markierungen der Moleküle durch den Laser angeregt werden. Jede einzelne Entladung, jeweils stammend von einem einzelnen Molekül, kann registriert werden.
Ein markiertes Polypeptid wird, wenn es groß ist, mit niedrigerer Geschwindigkeit diffundieren als ein kleines Polypeptid. Daher werden multimerisierte Polypeptide langsame Diffusionsgeschwindigkeiten zeigen, was zu einer geringeren Anzahl von Fluoreszenz-Entladungen bei jeder gegebenen Zeitspanne führt, während markierte Polypeptide, die nicht multimerisiert sind oder von einem Multimer abdissoziiert sind, schneller diffundieren werden. Das Bindeverhalten der Polypeptide kann direkt aus den Diffusionsgeschwindigkeiten durch das bestrahlte Volumen berechnet werden.
Wenn FCS anstelle von FRET verwendet wird, ist es nicht notwendig, mehr als ein Polypeptid zu markieren. Vorzugsweise wird ein einziges Polypeptid-Mitglied des Multimers markiert. Das markierte Polypeptid dissoziiert als Ergebnis der Modifikation von dem Multimer ab und verändert damit die FCS-Messung für die Fluoreszenzmarkierung.
Eine weitere Detektionstechnik, die in dem Verfahren der vorliegenden Erfindung verwendet werden kann, ist die Messung der zeitabhängigen Abnahme der Fluoreszenz-Anisotropie. Dies wird z.B. beschrieben in Lacowicz, 1983, Principles of Fluorescence Spectroscopy, Plenum Press, New York, das hier durch Referenz in Bezug genommen wird (siehe z.B. Seite 167).
Fluoreszenz-Anisotropie basiert auf der Messung der Rotation von fluoreszierenden Gruppen. Größere Multimere von Polypeptiden rotieren langsamer als Monomere, was es erlaubt, die Bildung von Multimeren zu überwachen.
Eine weitere wohlbekannte Technik ist die Fluoreszenz-Polarisation (Lynch et al., 1999, Analytical Biochemistry 275: 62–67; Pin et al., 1999, Analytical Biochemistry 275: 156–161 und darin enthaltene Referenzstellen), die in den Beispielen beschrieben ist.
Nicht fluoreszenzbasierte Verfahren zur Detektion der Protein-Protein-Bindung gemäß der Erfindung
Die Erfindung kann so umgesetzt werden, dass sie eine Anzahl nicht-fluoreszierender Markierungen nutzt. Bei einer ersten Ausführungsform bilden die Bindungsdomäne und der Bindungspartner davon im verbundenen Zustand ein aktives Enzym, das befähigt ist, an einer Enzym-Substrat-Reaktion mit detektierbarem Endpunkt teilzunehmen. Das Enzym kann zwei oder mehr Polypeptidketten oder Regionen einer Einzelkette beinhalten, sodass bei Bindung der Bindungsdomäne an den Bindungspartner, die entweder auf zwei verschiedenen Polypeptidketten oder in zwei verschiedenen Regionen einer einzelnen Polypeptidkette vorliegen, durch den Zusammenbau dieser Komponenten ein funktionelles Enzym gebildet wird. Die Enzymfunktion kann durch eine Reihe von Verfahren, einschließlich Szintillationszählung und Photospektroskopie, bestimmt werden. Bei einer weiteren Ausführungsform kann die Erfindung so angeordnet sein, dass die Markierung ein Redoxenzym ist, z.B. Glukose-Oxidase, und dass das durch die Markierung erzeugte Signal ein elektrisches Signal ist.
Die erfindungsgemäße Modifikation der Bindungsdomäne und, optional von deren Bindungspartner, wird benötigt, um die Bindung und damit den Zusammenbau der Enzymkomponenten zu inhibieren und dadurch die Enzymaktivität zu reduzieren.
Bei einem anderen Testformat wird ein Enzym zusammen mit einem Modulator der Enzymaktivität, wie etwa einem Inhibitor oder einem Co-Faktor, verwendet. Bei einem solchen Test ist einer von Enzym, bzw. Inhibitor oder Co-Faktor eine natürliche Bindungsdomäne, der andere dessen Bindungspartner. Die Bindung des Enzyms an seinen Inhibitor oder Co-Faktor resultiert in der Modulation der enzymatischen Aktivität, die durch konventionelle Mittel (wie etwa der Überwachung der Substratumsetzung zum Produkt für ein gegebenes Enzym) bestimmbar ist.
Ein Beispiel für ein BIAcore Testsystem unter Verwendung immobilisierter Peptide ist im Folgenden beschrieben.
Ein Ni-NTA-derivatisierter Sensor-Chip (der Chip ist kommerziell erhältlich bei BIAcore, Uppsala, Schweden; der NTA-Ligand ist erhältlich bei der Qiagen GmbH) wird zunächst mit Elutionspuffer, enthaltend 10 mM HEPES, 150 mM NaCl, 50 mM EDTA, 0,005% Tensid P20, pH 7,4, gewaschen, gefolgt von der Einspritzung von 20 μl an 500 μM NiCl₂ bei einer Fließgeschwindigkeit von 20 μl/Minute, um das NTA mit Ni²⁺ zu sättigen. Nachfolgend wird ein Reporter-Polypeptid (0,01–100 mM in HEPES-Puffer), das einen Polyhistidin-Tag besitzt, auf den Sensorchip gebracht. Dieser bindet spezifisch an den Ni-NTA-Träger. Das Sensorgramm zeigt einen Anstieg, der anzeigend für die Massenzunahme ist und daher eine neue Basislinie definiert. Sobald diese Basislinie stabil ist, wird Zell-Lysat (solubilisiert in HEPES-Puffer), das auf Phosphorylierungsaktivität hin getestet werden soll, für Zeitspannen von 5 Sekunden bis 30 Minuten über den Sensorchip geleitet. Wiederum zeigt das Sensorgramm einen Anstieg, der für die Massenzunahme anzeigend ist und einen neuen stabilen Zustand erreicht. Die Probe wird durch Waschen mit HEPES-Puffer entfernt und das Sensorgramm-Signal fällt auf eine Basislinie ab, die sich geringfügig von der vorigen Basislinie unterscheidet.
Sobald dieses Signal stabil ist, wird das Partner-Peptid (0,01–100 mM in HEPES-Puffer) auf den Sensorchip aufgebracht. In diesem Stadium wird das Sensorgramm im Hinblick auf Massenveränderungen aufgezeichnet. Wenn das immobilisierte Peptid phosphoryliert ist, kann der Peptidpartner daran binden, was somit einen Massenanstieg ergibt, der über ein positives Signal des Sensorgramms beobachtet wird. Dies zeigt die Aktivität einer Kinase an, die eine Stelle an dem immobilisierten Bindungspartner phosphoryliert.
Wenn die Tests der Erfindung unter Verwendung eines alternativen Ausgabeverfahrens, wie etwa FRET, durchgeführt werden sollen, kann eine Anzahl allgemeiner Techniken und Testverfahren verwendet werden. Diese sind unten dargestellt und finden Anwendung in anderen Ausführungsformen von Tests dieses Typs.
Fluoreszenzmessungen der Proteinmodifikation in vitro und in Echtzeit
Mit Donor- und Akzeptor-Fluorophor markierte natürliche Bindungsdomänen und die entsprechenden Bindungspartner für beliebige derartige natürliche Moleküle (molare Äquivalente von Fluorophor-markiertem Polypeptid oder ein molarer Überschuss an Akzeptormarkiertem Polypeptid) werden zuerst gemischt (wenn die beiden auf verschiedenen Polypeptiden vorliegen). Die Proben werden in einem Fluorimeter unter Verwendung von Anregungswellenlängen analysiert, die für die Donor-Fluoreszenzmarkierung relevant sind, und unter Verwendung von Emissionswellenlängen, die sowohl für die Donor- als auch für die Akzeptor-Markierungen relevant sind. Es wird ein Verhältnis der Emission des Akzeptors gegenüber der Emission des Donors nach Anregung bei einer einzigen Wellenlänge verwendet, um den Wirkungsgrad des Fluoreszenzenergie-Transfers zwischen den Fluorophoren und damit deren räumliche Nähe zu bestimmen. Typischerweise werden die Messungen bei 0–37°C als Funktion der Zeit nach Zugabe des modifizierenden Enzyms (und optional eines Modulators oder Modulator-Kandidaten der Funktion dieses Enzyms) zu dem System durchgeführt; dies erfolgt in 50 mM Histidin pH 7,0, 120 mM KCl, 5 mM MgSO₄, 5 mM NaF, 0,05 mM EGTA und 0,2 mM ATP oder in einem Puffer, der für das verwendete Enzym optimal ist. Der Test kann bei einer höheren Temperatur durchgeführt werden, wenn diese Temperatur mit dem/den zu testenden Enzymen) kompatibel ist.
Alternative zellfreie Testsysteme der Erfindung
Ein zellfreies Testsystem muss ermöglichen, dass die Bindung einer natürlichen Bindungsdomäne an ihren Bindungspartner in einer Modifikations-abhängigen Weise erfolgt. Wie hier angezeigt, kann ein solches System einen Puffer niedriger Ionenstärke (z.B. ein physiologisches Salz, wie etwa einfache Kochsalzlösung oder Phosphat- und/oder Trisgepufferte Saline), ein Zellkulturmedium, von dem viele in der Technik bekannt sind, sowie ein vollständiges oder fraktioniertes Zell-Lysat enthalten. Die Komponenten des Tests bzw. der posttranslationalen Modifikation eines Polypeptidmoleküls können dem Puffer, Medium oder Lysat zugegeben werden; ebenso können sie in den Zellen exprimiert worden sein, aus denen das Lysat gewonnen wird. Alternativ kann ein zellfreies Transkriptions- und/oder Translations-System verwendet werden, um dem Testsystem eine oder mehrere dieser Komponenten zu liefern. Nukleinsäuren zur Verwendung in zellfreien Expressionssystemen sind unten für in vivo-Tests beschrieben.
Ein Test der Erfindung kann in einem Standardsystem zur in vitro-Transkription/Translation unter Bedingungen durchgeführt werden, die die Expression eines rekombinanten oder andersartigen Gens erlauben. Das „TNT^® T7 Quick Coupled Transcription/Translation System" (Katalognr. # L1170; Promega) enthält alle Reagenzien, die für die in vitro-Transkription/Translation benötigt werden, mit Ausnahme der DNA von Interesse und der Detektionsmarkierung, wie unten diskutiert. Eine natürliche Bindungsdomäne und/oder deren Bindungspartner können durch Expression von Konstrukten erhalten werden, in denen die entsprechenden codierenden Sequenzen im Leseraster an Sequenzen fusioniert sind, die Fluoreszenzproteine codieren. Die „TNT^® Coupled Reticulocyte Lysate"-Systeme (enthaltend ein Retikulozyten-Lysat des Kaninchens) umfassen: TNT^® T3 Coupled Reticulocyte Lysate System (Katalognr. # L4950; Promega); TNT^® T7 Coupled Reticulocyte Lysate System (Katalognr. # L4610; Promega); TNT^® SP6 Coupled Reticulocyte Lysate System (Katalognr. # L4600; Promega); TNT^® T7/SP6 Coupled Reticulocyte Lysate System (Katalognr. # L5020; Promega); TNT^® T7/T3 Coupled Reticulocyte Lysate System (Katalognr. # L5010; Promega).
Ein Test, an dem ein Zell-Lysat oder eine Ganzzelle beteiligt ist, kann in einem Zell-Lysat oder einer Ganzzelle, bevorzugt von eukaryotischer Natur (wie etwa aus Hefe, Pilz, Insekt (z.B. Drosophila), Maus oder Mensch) durchgeführt werden. Ein Test, bei dem ein Zell-Lysat verwendet wird, wird in einem Standard-in vitro-System unter Bedingungen durchgeführt, die Genexpression erlauben. Ein Kaninchen-Retikulozyten-Lysat alleine ist ebenfalls bei Promega erhältlich, entweder Nuklease-behandelt (Katalognr. # L4960) oder unbehandelt (Katalognr. # L4151).
In vivo-Tests der enzymatischen Aktivität
Es werden auch Verfahren bereitgestellt, um die Enzymaktivität über den Effekt der Interaktionen zwischen einer Bindungsdomäne und einem Bindungspartner derselben in vivo zu messen. Beispielsweise können transgene vielzellige Organismen hergestellt werden, die in derselben Zelle sowohl die Bindungsdomäne als auch den Bindungspartner exprimieren. Die Bindung der Bindungsdomäne und des Bindungspartners aneinander kann mittels einer detektierbaren Markierung an wenigstens einem der Polypeptide, typischerweise an beiden, bestimmt werden. Die physikalischen Eigenschaften der Markierungen verändern sich in einer messbaren Weise in Abhängigkeit von der molekularen Umgebung, in der sich die Polypeptide befinden. Somit werden sich die physikalischen Eigenschaften der Markierungen insbesondere in Abhängigkeit davon verändern, ob die Bindungsdomäne und ihr Bindungspartner aneinander gebunden sind. Die Messung der physikalischen Eigenschaften der Markierungen wird eine Bestimmung des Ausmaßes der Bindung erlauben. Die Verwendung nicht-invasiver Messtechniken wird es ermöglichen, die Wechselwirkung in lebenden Zellen über den Zeitverlauf zu verfolgen, wie etwa in situ in einem intakten vielzelligen Organismus und/oder in einer biologischen Probe, die einem vielzelligen Organismus entnommen wurde. Die erhaltenen Ergebnisse können verwendet werden, um physiologisch relevante Informationen, wie etwa kinetische und/oder räumliche Informationen, über die Natur der Interaktion zwischen der Bindungsdomäne und dem Bindungspartner zu erhalten.
Natürlich wird die Bindung in einer in vivo-Situation durch eine Anzahl von Faktoren beeinflusst werden, so etwa durch konkurrierende Polypeptide und Stimuli, die auf Signaltransduktionswege einwirken, die z.B. zu posttranslationalen Modifikationen, insbesondere zu Phosphorylierung, führen. Eine wichtige Anwendung des Verfahrens der Erfindung besteht somit darin, die Auswirkung von Substanzen, die Zellen in einem transgenen Organismus stimulieren, so etwa von Rezeptoragonisten und Rezeptorantagonisten, auf die Bindung der Bindungsdomäne an den Bindungspartner zu untersuchen.
Beispielsweise kann für eine Verbindung bekannt sein, dass sie in vitro einen inhibitorischen Effekt auf die Aktivität einer Proteinkinase besitzt. Proteinkinasen sind typischerweise dafür bekannt, dass sie phosphorylieren und die Bindung einer Bindungsdomäne an einen Bindungspartner fördern. Wenn die Verbindung somit einem transgenen Tier verabreicht wird, das die Bindungsdomäne und den Bindungspartner exprimiert, welcher) mit einer detektierbaren Markierung versehen ist/sind, so kann die erfolgende Wirkung auf die Assoziation der Bindungsdomäne und des Bindungspartners in situ untersucht werden, insbesondere in einer Reihe verschiedener Gewebe, um zu bestimmen, ob die Wirkung auf bestimmte Zelltypen begrenzt ist.
Das Testsystem kann in einem intakten, lebenden, vielzelligen Organismus, wie etwa einem Insekt oder einem Säuger, verwendet werden. Verfahren zur Erzeugung transgener Drosophila, Mäuse und anderer Organismen, sowohl transient als auch stabil, sind in der Technik wohlbekannt; die Detektion von Fluoreszenz, die aus der Expression des Green Fluorescent Protein in lebender Drosophila resultiert, ist in der Technik wohlbekannt. Wenn die Expression der Nukleotidkonstrukte unter der Kontrolle eines Induktors steht, so lässt man nach der Applikation des Induktormoleküls nötigenfalls genügend Zeit verstreichen, um die Genexpression, die Bindung einer Bindungsdomäne an ihren Bindungspartner und die Reifung des Chromatophors zu erlauben (z.B. reift das Green Fluorescent Protein über einen Zeitraum von etwa 2 Stunden vor der Fluoreszenz), bevor die Fluoreszenz oder eine anderweitige Emission von der detektierbaren Markierung gemessen wird. Eine Reaktionskomponente (insbesondere ein Modulatorkandidat der Enzymfunktion), der nicht als Nukleinsäuremolekül appliziert wird, kann durch ein aus den unten beschriebenen Verfahren ausgewähltes Verfahren zugeführt werden.
In vivo-Tests können in situ oder unter Verwendung einer oder mehrerer Zellen, die dem transgenen Organismus entnommen wurden, durchgeführt werden. Die eine oder die mehreren Zelle(n) können von jeder Untergruppe von Geweben des Organismus erhalten werden. Verfahren zum Sichtbarmachen von Biolumineszenz in lebenden Säugern sind beschrieben in Contag et al., 1997, Photochemistry and Photobiology 66: 523–531, bzw. in einem Übersichtsartikel dargestellt in Contag et al., 1998, Nature Medicine 4: 245–247 (siehe auch darin angeführte Referenzstellen).
Alternativ oder zusätzlich können in vitro-Tests der Interaktionen zwischen der Bindungsdomäne und dem Bindungspartner durchgeführt werden, wobei hierfür Extrakte aus einer biologischen Probe, umfassend eine oder mehrere Zellen, die einem transgenen Tier entnommen wurden, oder Körperflüssigkeiten, verwendet werden können, um die Aktivität eines rekombinanten Proteins oder eines in der Natur zu findenden Proteins zu testen. Die Verwendung eines Rohzellextrakts und/oder von Körperflüssigkeiten ermöglicht eine schnelle Testung vieler Proben, was insbesondere bei Hochdurchsatz-Testverfahren, z.B. für Modulatorkandidaten der Wechselwirkung zwischen Bindungsdomäne und Bindungspartner, potentielle Anwendung findet. Jedoch ist es im allgemeinen beabsichtigt, dass die in vitro-Tests als Vorläufer oder Bestätigung für die in vivo-Tests verwendet werden.
Wie hier verwendet, bezieht sich der Begriff „biologische Probe" auf eine Untergruppe der Gewebe eines biologischen Organismus, dessen Zellen oder Bestandteile (z.B. Körperflüssigkeiten, einschließlich, jedoch nicht beschränkt auf Blut, Schleim, Lymphflüssigkeit, Synovialflüssigkeit, Zerebrospinalflüssigkeit, Speichel, Amnionflüssigkeit, Nabelschnurblut, Urin, Vaginalflüssigkeit und Samenflüssigkeit). „Biologische Probe" und „biologische Präparation" beziehen sich weiterhin auf Homogenate, Lysate oder Extrakte, die aus einem Gesamtorganismus oder einer Untergruppe seiner Gewebe, Zellen oder Bestandteile hergestellt wurden, oder auf eine Fraktion oder einen Anteil davon.
Sätze unterschiedlich markierter Paare aus Bindungsdomäne und Bindungspartner werden den Zellen entweder durch direkte Einführung der Polypeptide unter Verwendung von Techniken wie etwa Mikroinjektion zugeführt, oder, unter Verwendung von Standardtechniken, durch Einführung von Nukleinsäurekonstrukten, die die Polypeptide exprimieren. Das Verhältnis der Emission des/der markierten Moleküle kann z.B. unter Verwendung einer Photomultiplikator-Röhre in Fokussierung auf eine einzelne Zelle gemessen werden.
E. Proteinmodifikationen in Tests der Erfindung
Die Erfindung stellt Verfahren zum in vivo -Test der Aktivität von Enzymen bereit, die posttranslationale Modifikationen an Proteinen durchführen. Tabelle 2 listet einige nicht limitierende Beispiele für posttranslationale Modifikationen auf.
Tabelle 2
Phosphorylierung - Kinasen und Phosphatasen
Eine besonders wichtige posttranslationale Modifikation, für die eine große Anzahl an Enzymen und Zielen identifiziert wurde, sind Phosphorylierung bzw. Dephosphorylierung. In der Technik gibt es eine übergroße Zahl von Artikeln über diese Enzyme, d.h. über Proteinkinasen und Phosphatasen und deren Ziele, einschließlich Konsensusmotiven der Phosphorylierung (wie etwa -SQ- oder -TQ- für die DNA-abhängige Proteinkinase (DNA-PK).
Einige nicht limitierende Beispiele für Kinasen und deren Stellen der posttranslationalen Modifikation sind in Tabelle 3 angegeben (Phosphorylierung/Dephosphorylierung). Tabelle 3
X bezeichnet eine beliebige Aminsäure. Die Konsensussequenzen wurden aus Trends Biochem. Sci. (1990) 15: 342–346 entnommen.
Weitere Beispiele für derzeit identifizierte Proteinkinasen beinhalten die Protein-Tyrosinkinase-Subfamilie (wie etwa PDGF-Rezeptoren, EGF-Rezeptoren, die Kinase der src-Familie (siehe Brown und Cooper, 1996, Biochimica and Biophysica Acta 1287: 121–149 als Übersichtsartikel), die JAK-Kinasefamilie (wie etwa JAK1, JAK2 und tyk2), Erb B2, Bcr-Abl, Alk, Trk, Res/Sky – für eine detaillierte Übersicht siehe Al-Obeidi et al., 1998, Biopolymers (Peptide Science), Vol 47: 197–223), die Subfamilie des MAP-Kinase Pathway (wie etwa die MAP-Familie, die ERK-Familie, die MEK-Familie, die MEKK-Familie, RAF-1 und JNK), die Cyclinabhängige Kinase-Subfamilie (wie etwa p34^cdc2 und cdk2 – siehe Nigg, 1995, Bioessays 17: 471–480 als Übersicht), Wee1/Myt1, polo-artige Kinasen (wie etwa plk1, Plx1, POLO, Snk, Fnk/Prk, Sak-a, Sak-b – siehe Lane und Nigg, 1997, Trends in Cell Biol. 7: 63–68), die Rezeptor-Serinkinase-Subfamilie, Proteinkinase C (PK-C), cAMP-abhängige Kinase (PK-A), cGMPabhängige Kinase (PKG), Ca²⁺/Calmodulin-abhängige Kinasen (wie etwa CaM-Kinase I, II und IV), DNA-abhängige Proteinkinase, Phosphoinositid-3-Kinasen (P13K), PDK-1, die Familie der p21-aktivierten Proteinkinasen (PAKs), wie etwa Pak1, Pak2 und Pak3 – siehe Sells und Chernoff, 1997, Trends in Cell Biol. 7: 162–167), p70 S6-Kinase, IkB-Kinase, Caseinkinase II, Glycogensynthase-Kinasen (GSK3).
Eine Diskussion spezieller Kinase-Pathways, die an der Signaltransduktion beteiligt sind, ist in Kapitel 35 von Lewin, 1997, Gene VI, Oxford University Press zu finden.
Details bezüglich der Erkennungs- und Bindungsdomänen für eine Vielzahl von Kinasen sind in Kuriyan und Cowburn, 1997, Annu. Rev. Biophys. Biomol. Struc. 26:259–288 angegeben.
Einige spezielle Beispiele für Kinasen, deren Aktivität unter Verwendung der Verfahren der Erfindung untersucht werden kann, beinhalten die src-Familie-Tyrosin-Kinasen Lck und Fyn, die die TCR ξ-Kette phosphorylieren, und von denen bekannt ist, dass sie an der mit T-Zellrezeptor-Stimulierung assoziierten Signaltransduktion beteiligt sind. Die TCR ξ-Kette umfasst spezifische Tyrosinreste, die bei Immunrezeptor-Tyrosin-basierten Aktivierungsmotiven (ITAMs) vorkommen, die durch Lck und Fyn phosphoryliert werden (Kuriyan und Cowburn, 1997, ibidem). Die SH2-Domäne einer anderen Tyrosinkinase, ZAP70, bindet an phosphoryliertes TCR ξ. Daher stellen TCR ξ ITAM und ZAP70 SH2 Bindedomänen und Bindungspartner dar, die von Interesse sein können, um die Aktivität der Kinasen Lck und Fyn zu untersuchen (siehe Elder et al., 1994, Science 264: 1596–1599 und Chan et al., 1994, Science 264: 1599–1601.
Ein weiteres Beispiel besteht in der IgE-Rezeptor γ-Untereinheit und der SH2-Domäne von Syk, die verwendet werden können, um die Aktivität der Kinase Lyn zu untersuchen.
Die Beispiele für derzeit identifizierte Phosphatasen untergliedern sich in drei Hauptfamilien (für einen Übersichtsartikel siehe: Barford et al., 1998, Annu. Rev. Biophys.
Biomol. Struc. 27: 133–164). Die PPP-Familie beinhaltet die folgenden katalytischen Untereinheiten: PP1c, PP2Ac, PP2B, PPP1, PPP2A und PPP5 und die folgenden regulatorischen Untereinheiten: NIPP-1, RIPP-1, p53BP2, γ₁34.5, PR65, PR55, PR72, PTPA, SV40 kleines T-Antigen, PPY, PP4, PP6 und PP5.
Die PPM-Familie beinhaltet Pyruvat-Dehydrogenase-Phosphatase und Arabidopsis ABI1.
Die Protein-Tyrosin-Phosphatasefamilie beinhaltet PTP1B, SHP-1, SHP-2 (zytosolische Nicht-Rezeptorformen), CD45 (siehe Thomas und Brown, 1999, Trends in Immunol, 20: 406 und Ashwell und D'Oro, 1999, Trends in Immunol, 20: 412 für weitere Details), RPTP (Rezeptor-artig, Transmembranformen) und cdc25, Kinase-assoziierte Phosphatase und MAP-Kinase-Phosphatase-1 (Phosphatasen dualer Spezifität). PTP1B ist dafür bekannt, dass sie in vivo mit dem Insulinrezeptor assoziiert (Bandyopadhyay et al., 1997, J. Biol. Chem. 272: 1639-1645).
Ein einfacher FRET-Assay, basierend auf diesen Modifikationen an der Stelle zur posttranslationalen Modifikation, die an einer natürlichen Bindungsdomäne befindlich ist, kann gemäß unten stehender Darstellung durchgeführt werden.
wobei NBD = natürliche Bindungsdomäne; M = Modifikation; F1 = Donor-Fluorophor und F2 = Akzeptor-Fluorophor.
Alternativ kann ein auf FRET basierender Test einem Format wie dem folgenden entsprechen:
Tabelle 4 stellt eine nicht erschöpfende Liste von Enzymen dar, die für einige der Klassen modifizierender Enzyme repräsentativ sind, die hier als geeignet für einen Test der Erfindung diskutiert werden.
Tabelle 4
Die verschiedenen Typen der oben dargestellten posttranslationalen Modifikation werden unten in gewissem Detail diskutiert werden, zusammen mit Tests unter Verwendung natürlicher Bindungsdomänen und deren Bindungspartnern, um die Enzyme zu testen, die solche Modifikationen durchführen.
ADP-Ribosylierung
Mono-ADP-Ribosylierung ist eine posttranslationale Modifikation von Proteinen, von der zurzeit angenommen wird, dass sie eine fundamentale Rolle bei zellulären Signalprozessen spielt. Es ist eine Anzahl von Mono-ADP-Ribosyltransferasen identifiziert worden, einschließlich endogener Enzyme sowohl aus bakteriellen als auch aus eukaryotischen Quellen und bakteriellen Toxinen. Ein Mono-ADP-ribosylierendes Enzym, das als Substrate das zu modifizierende Protein und Nikotinamid-Adenin-Dinukleotid (NAD⁺) verwendet, ist NAD:Arginin-ADP-Ribosyltransferase (Zolkiewska et al., 1992, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 89: 11352-11356). Die Reaktionen, die von bakteriellen Toxinen, wie etwa Cholera- und Keuchhusten-Toxin, katalysiert werden, sind gut verstanden; die Aktivität dieser Toxine resultiert in der dauerhaften Modifikation heterotrimerer G-Proteine. Man nimmt an, dass auch endogene Transferasen G-Proteine modifizieren, und daher eine Rolle bei der Signaltransduktion in der Zelle spielen (de Murcia et al., 1995, Trends Cell Biol., 5: 78–81). Das Ausmaß der Wirkungen, die die ADP-Ribosylierung in der Zelle vermitteln kann, wird am Beispiel von Brefeldin A, einem Pilztoxin-Metaboliten der Palmitinsäure, veranschaulicht. Dieses Toxin induziert die Mono-ADP-Ribosylierung von BARS-50 (einem am Transmembrantransport beteiligten G-Protein) und der Glyceraldehyd-3-phosphat-Dehydrogenase. Die zellulären Wirkungen von Brefeldin A beinhalten die Blockierung der konstitutiven Proteinsekretion und eine ausgedehnte Zerrüttung des Golgi-Apparates. Es ist gezeigt worden, dass Inhibitoren der Brefeldin A Mono-ADP-Ribosyltransferase-Reaktion dem durch das Toxin induzierten Zerfall des Golgi-Apparates entgegenwirken können (Weigert et al., 1997, J. Biol. Chem., 272: 14200–14207). Es ist für eine Anzahl von Aminosäureresten in Proteinen gezeigt worden, dass sie als Akzeptoren von ADP-Ribose fungieren. Es sind bakterielle Transferasen identifiziert worden, die Arginin, Asparagin, Cystein und Diphthamid-Reste in Zielproteinen modifizieren. Es sind auch endogene eukaryotische Transferasen bekannt, die diese Aminosäuren modifizieren; zusätzlich gibt es Anhaltspunkte, dass Serin-, Threonin-, Tyrosin-, Hydroxyprolin- und Histidin-Reste als Akzeptoren der ADP-Ribose fungieren könnten, jedoch sind die relevanten Transferasen noch nicht identifiziert worden (Cervantes-Laurean et al., 1997, Methods Enzymol., 280: 275–287 und darin genannte Referenzen).
Man nimmt an, dass die Poly-ADP-Ribosylierung eine wichtige Rolle bei Ereignissen wie etwa DNA-Reparatur, -Replikation, -Rekombination und -Verpackung, sowie bei der Dekondensation von Chromosomen spielt. Das Enzym, das für die Poly-ADP-Ribosylierung von an diesen Prozessen beteiligten Proteinen verantwortlich ist, ist die Poly-(ADP-Ribose)-Polymerase (PARP; für Drosophila melanogaster PARP, siehe Genbank Zugangsnummern D13806, D13807, D13808). Die Entdeckung eines Leucin-Zippers in der Auto-Poly(ADP-ribosyl)ierungs-Domäne der Säuger-PARP (Uchida et al., 1993, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 90: 3481–3485) legt nahe, dass diese Region für die Dimerisierung von PARP und auch für deren Interaktion mit anderen Proteinen bedeutend sein könnte (Mendoza-Alvarez et al., 1993, J. Biol. Chem., 268: 22575–22580).
Spezifische Beispiele für ADP-Ribosylierungsstellen sind diejenigen, die an Cys₃ und Cys₄ (unterstrichen) des Proteins B-50 gefunden wurden (Coggins et al., 1993, J. Neurochem., 60: 368–371; SwissProt Zugangsnummer P06836): MLCCMRRTKQVEKNDDD und Pγ (die γ-Untereinheit der cCMP-Phosphodiesterase; Bondarenko et al., 1997, J. Biol. Chem., 272: 15856–15864; Genbank Zugangsnummer X04270): FKQRQTRQFK.
Glykosylierung
N-gebundene Glykosylierung ist eine posttranslationale Modifikation von Proteinen, die im endoplasmatischen Retikulum und im Golgi-Apparat stattfindet und die bei einige Proteinen verwendet wird, die sich auf dem Sekretionsweg befinden oder für die Expression an der Zelloberfläche oder in einer anderen Organelle vorgesehen sind. Der Kohlenhydratrest wird an Asn-Reste in den nicht-zytoplasmatischen Domänen der Zielproteine angefügt, und die Konsensus-Sequenz (Shakineshleman, 1996, Trends Glycosci. Glycotech., 8: 115–130) für eine Glykosylierungsstelle ist NxS/T, wobei x nicht Prolin oder Asparaginsäure sein kann.
N-gebundene Zucker besitzen einen gemeinsamen Kern aus fünf Resten, bestehend aus zwei GIcNAc-Resten und drei Mannose-Resten infolge des Biosyntheseweges. Dieser Kern wird durch eine Vielzahl von Golgi-Enzymen modifiziert, um drei allgemeine Klassen von Kohlenhydraten zu ergeben, die als Oligomannosyl-, Hybrid- und Lactosamin-enthaltende oder komplexe Strukturen (Zubay, 1998, Biochemistry, Wm. C. Brown Publishers) bekannt sind. Ein Enzym, das dafür bekannt ist, dass es die N-Glykosylierung am initialen Syntheseschritt der Dolichyl-P-P-oligosaccharide vermittelt, ist UDP-N-Acetylglucosamin-Dolichylphosphat-N-acetylglucosamin-Phosphotransferase (für die Maus, siehe Genbank Zugangsnummern X65603 und S41875).
Sauerstoff-gebundene Glykosylierung erfolgt ebenfalls in der Natur unter Anheftung verschiedener Zucker-Gruppierungen an Ser- oder Thr-Reste (Hansen et al., 1995, Biochem. J., 308: 801–813). Die komplexe O-gebundene Glykosylierung kann in wenigstens sechs Klassen unterteilt werden: Mucin-Typ, Ser-1-GIcNAc; Proteoglycan-Typ, Ser-Gal-Gal-Xyl-Kern; Collagen-Typ, Hydroxylys-Gal-Glc; Gerinnungsfaktor-Typ, Ser-Xyl-Glc oder Ser-Xyl-Xyl-Glc-Kern; Pilz-Typ, Ser-Man; Pflanzentyp, Hydroxypro-Ara oder Ser-Gal (wobei GlcNAc = N-Acetylglucosamin, Gal = Galaktose, Xyl = Xylose, Glc = Glukose, Man = Mannose und Ara = Arabinose; Hansen et al., 1995, supra). Intrazelluläre Proteine gehören durch die dynamische Anheftung und Entfernung von O-N-Acetyl-D-Glucosamin (O-GlcNAc; im Überblick dargestellt von Hart, 1997, Ann. Rev. Biochem., 66: 315–335) zu den Zielen der O-Glykosylierung. Proteine, die bekannter Maßen O-glykosyliert werden, beinhalten Cytoskelett-Proteine, Transkriptionsfaktoren, den Proteinkomplex der Kernporen und Tumorsuppressor-Proteine (Hart, 1997, supra). Häufig sind diese Proteine auch Phosphoproteine, und es gibt die Theorie, dass O-GlcNAc und die Phosphorylierung eines Proteins umgekehrte Rollen spielen. Es ist weiterhin vorgeschlagen worden, dass die Glykosylierung eines einzelnen Proteins die Protein-Protein-Wechselwirkungen reguliert, an denen es beteiligt ist.
Spezifische Stellen für die Anfügung von O-GlcNAc finden sich z.B. an Ser₂₇₇, Ser₃₁₆ und Ser₃₈₃ von p67^SRF (Reason et al., 1992, J. Biol. Chem., 267: 16911–16921; Genbank Zugangsnummer J03161). Die Erkennungssequenzen, die diese Reste umfassen, sind unten dargestellt:
Die Identität der Stellen für O-GlcNAc ist zusätzlich für eine kleine Anzahl von Proteinen bekannt, einschließlich c-myc (Thr₅₈, auch eine Phosphorylierungsstelle; Chou et al., 1995, J. Biol. Chem., 270: 18961–18965), das Kernporenprotein p62 (siehe Reason et al., 1992, supra): MAGGPADTSDPL und Bande 4.1 des Erythrozyt (siehe Reason et al., 1992, supra): AQTITSETPSSTT.
Die Stelle, an der die Modifikation erfolgt, ist in jedem Fall unterstrichen. Die Reaktion wird durch O-GlcNAc-Transferase (Kreppe) et al., 1997, J. Biol. Chem., 272: 9308–9315) vermittelt.
Prenylierung (Acylierung mit Fettsäureresten)
Die posttranslationale Modifikation von Proteinen mit Fettsäuren beinhaltet die Anheftung von Myristinsäure an die primäre Aminogruppe eines N-terminalen Glycinrests (Johnson et al., 1994, Ann. Rev. Biochem., 63: 869–914) und die Anheftung von Palmitinsäure an Cysteinreste (Milligan et al., 1995, Trends Biochem. Sci., 20: 181–186).
Die Fettsäure-Acylierung von Proteinen ist eine dynamische posttranslationale Modifikation, die für die biologische Aktivität vieler Proteine und ebenso für deren Interaktion mit anderen Proteinen und mit Membranen entscheidend ist. So kann für eine große Zahl von Proteinen die Lokalisation des Proteins in der Zelle durch den Zustand von dessen Prenylierung (Fettsäure-Modifikation) kontrolliert werden, ebenso wie seine Fähigkeit, mit Effektor-Enzymen (ras und MAP-Kinase, Itoh et al., 1993, J. Biol. Chem., 268: 3025-; ras und Adenylatcyclase in Hefe, Horiuchi et al., 1992, Mol. Cell. Biol., 12:4515) oder mit regulatorischen Proteinen (Shirataki of al., 1991, J. Biol. Chem, 266: 20672–20677) zu interagieren. Der Prenylierungs-Zustand von ras ist wichtig für dessen onkogene Eigenschaften (Cox, 1995, Methods Enzymol., 250: 105–121); daher wird die Einwirkung auf den Prenylierungs-Zustand von ras als wertvolle Anti-Tumor-Strategie betrachtet (Hancock, 1993, Curr. Biol., 3: 770).
Sentrinisierung
Sentrin ist ein neuartiges 101-Aminosäuren-Protein, das eine 18%ige Identität und eine 48%ige Ähnlichkeit zu humanem Ubiquitin besitzt (Okura et al., 1996, J. Immunol., 157: 4277-4281). Dieses Protein ist unter einer Reihe anderer Namen bekannt, einschließlich SUMO-1, UBL1, PIC1, GMP1 und SMT3C und ist eines aus einer Anzahl Ubiquitin-artiger Proteine, die kürzlich identifiziert wurden. Sentrin wird in allen Geweben exprimiert (wie gezeigt durch Northern Blot-Analyse), jedoch sind die entsprechenden mRNA-Konzentrationen im Herzen, im Skelettmuskel, den Hoden, den Eierstöcken und dem Thymus höher.
Man nimmt an, dass die Sentrinisierung von Proteinen unter Beteiligung des Ubiquitinkonjugierenden Enzyms Ubc9 erfolgt (Gong et al., 1997, J. Biol. Chem, 272: 28198–28201). Die Interaktion zwischen diesen beiden Proteinen ist im Hefe Zwei-Hybrid-Test sehr spezifisch, was nahe legt, dass es sich hier um ein biologisch relevantes Phänomen handelt. Die Interaktion ist abhängig von der Gegenwart der konservierten C-terminalen Reste Gly-Gly, die in Sentrin vorkommen (Gong, et al., 1997, supra). Die Konjugation von Sentrin an andere Proteine über Gly₉₇ erfordert die Abspaltung der vier C-terminalen Aminosäuren des Proteins, His-Ser-Thr-Val.
Ein wichtiges Protein, für das eine Modifikation durch Anheftung von Sentrin gezeigt wurde, ist das Ran-spezifische GTPase aktivierende Protein, RanGAP1, das am Kernimport von Proteinen beteiligt ist, die Kern-Lokalisationssignale tragen (Johnson und Hochstrasser, 1997, Trends Cell Biol., 7: 408–413). Die Konjugation von RanGAP1 durch Sentrin ist sowohl dafür essentiell, RanGAP1 zu seinem Bindungspartner am Kernporen-Komplex (NPC) zu lenken, als auch dafür, den Kernimport von Proteinen zu ermöglichen. Sentrin selbst bindet nicht mit hoher Affinität an den NPC, und es ist daher wahrscheinlich, dass es entweder bei RanGAP1 eine konformative Änderung auslöst, die eine Bindungsstelle freilegt, oder, alternativ, dass die Bindungsstelle unter Nutzung sowohl von Sentrin- als auch von RanGAP1-Sequenzen ausgebildet wird. Es gibt Anhaltspunkte, anzunehmen, dass die Konjugation von Sentrin an RanGAP1 notwendig für die Bildung anderer sentrinisierter Proteine ist (Kamitani et al., 1997, J. Biol. Chem., 272: 14001–14004) und dass die Mehrheit dieser sentrinisierten Proteine im Zellkern zu finden ist.
Es ist für Sentrin gezeigt worden, dass es in Hefe-Zwei-Hybridtests mit einer Anzahl anderer Proteine interagiert, so etwa mit den Death-Domänen von Fas/APO1 und den TNF-Rezeptoren, PML, RAD51 und RAD52 (Johnson und Hochstrasser, 1997, supra). Diese Interaktionen implizieren die Bedeutung von Sentrin in einer Anzahl wichtiger Prozesse. Fas/APO1 und TNF-Rezeptoren sind daran beteiligt, das Apoptose-Signal über ihre Death-Domänen weiterzuleiten. Die Anbindung von Fas an die Zelloberfläche resultiert in der Bildung eines Komplexes über die Death-Domänen und die Death-Effektor-Domänen, was die Induktion der Apoptose antreibt. Die Überexpression von Sentrin schützt Zellen sowohl vor anti-Fas/APO als auch vor TNF-induziertem Zelltod (Okura et al., 1996, supra). Es ist nicht klar, ob dieser Schutz einfach dadurch erreicht wird, dass die Bindung weiterer Proteine an diese Death-Domänen verhindert wird, oder ob ein komplexerer Prozess beteiligt ist, möglicherweise ein Prozess, an dem der Ubiquitin-Pathway beteiligt ist.
Die Interaktion von Sentrin mit PML (einem RING-Finger-Protein) ist wichtig, da sie auf einen Krankheitszustand hindeutet, bei dem dieses Protein eine Rolle spielen könnte. In normalen myeloiden Zellen befindet sich PML in einem nukleären Multiprotein-Komplex, der als nukleärer Körper (nuclear body) bekannt ist. Diese nukleären Körper werden bei der akuten promyelozytären Leukämie, bei der eine chromosomale Translokation eine Fusion zwischen Regionen des Retinsäure-Rezeptors und PML erzeugt, auseinander gebrochen. Dieses Auseinanderbrechen kann durch Behandlung mit Retinsäure (Vitamin A-Säure) umgekehrt werden. Es ist gezeigt worden, dass PML an mehreren Stellen durch Mitglieder der Sentrin-Proteinfamilie (jedoch nicht durch Ubiquitin oder NEDD8) kovalent modifiziert wird. Es sind zwei abweichende Formen des Fusionsproteins identifiziert worden, von denen keine durch Sentrin modifiziert wird. Es wird daher angenommen, dass die differentielle Sentrinisierung der normalen und abweichenden Formen von PML in dem Prozess, der der akuten promyelozytären Leukämie zugrunde liegt, wichtig und bei dem Verständnis der biologischen Rolle des PML-Proteins hilfreich sein könnte (Kamitani et al., 1998, J. Biol. Chem., 273: 3117-3120).
Proteasen
Wie oben angemerkt, beinhaltet die Empfindlichkeit gegenüber Modifikation die Möglichkeit, dass das Polypeptid einer proteolytischen Spaltung unter geeigneten Bedingungen unterzogen werden kann, was bei einer bevorzugten Ausführungsform bedeutet, dass das Polypeptid durch eine Protease an einer Erkennungsstelle für das Proteaseenzym gespalten wird. Alternativ kann das Polypeptid jedoch auch für einen vom N- oder C-Terminus ausgehenden Abbau durch eine Exoprotease empfindlich sein.
Wenn künstlich hergestellte Polypeptide verwendet werden, sollten diese so konstruiert sein, dass die Protease-Spaltstelle derart positioniert ist, dass deren Spaltung die Bindung des Polypeptids im Kontext des Multimers bricht. Somit sollten Polypeptide, die einer Protease-Spaltung unterworfen wurden, von dem Multimer abdissoziieren. Vorzugsweise spaltet die Protease das Polypeptid nicht in einer solchen Weise, dass die Markierung davon abgelöst wird, ohne die zugehörigen Bindungseigenschaften zu zerstören. Die Position der Protease-Spaltstelle kann empirisch bestimmt werden. Als Leitgedanke jedoch, sollte die Stelle in oder nahe der Bindungsdomäne positioniert werden, die für die Multimerisierung des Polypeptids verantwortlich ist.
Im Falle von Coiled coil-Bindungsdomänen berichten Lumb et al. (Subdomain folding of the coiled coil leucin zipper from the bZIP transcriptional activator GCN4; Lumb, K.J., Carr, C.M. & Kim, P.S., Biochemistry (1994) 33 7361–7367), dass der Verlust von zehn Resten vom N-Terminus oder von sieben Resten vom N-Terminus und sechs Resten vom C-Terminus hinreichend ist, die als GCN4-pl bekannte Coiled coil-Peptidsequenz zu destabilisieren (Evidence that the leucine zipper is a coiled coil, O'Shea, E.K., Rutkiowski, R. & Kim, P.S. (1989) Science 243 538–542). Su et al. liefern Daten, die anzeigen, dass ein scharfer Abfall hinsichtlich der Stabilität eines konstruierten Coiled coils bei einer Verminderung der Kettenlänge von 23 auf 19 Reste auftritt (Su, J.Y., Hodges, R.S. & Kay, C.M., Biochemistry (1994) 33 15501–15510). Dementsprechend können Spaltstellen so positioniert werden, dass der Coiled coil in einem Ausmaß aufgebrochen wird, das es nicht länger erlaubt, Multimerisierung zu steuern.
Eine Anzahl von Proteasen und ihre Spaltstellen sind in der Technik bekannt; eine entsprechende Übersicht findet sich in Tabelle 5.
Tabelle 5
Release of proteins and peptides from fusion proteins using a recombinant plant virus proteinase, Parks, T.D., Keuther, K.K., Howard, E.D., Johnston, S.A. & Dougherty, W.G., Analytical Biochemistry (1994) 216: 413–417; Life Technologies Ltd.
Die vorstehenden oder andere Stellen können in oder nahe bei den Bindungsdomänen von Polypeptiden eingefügt werden, die in den Verfahren der Erfindung verwendet werden.
Bei einem bevorzugten Aspekt der vorliegenden Erfindung ist es wünschenswert, Spezifität in das Polypeptid einzubauen, sodass es nur von der gewünschten Protease und nur an der beabsichtigten Protease-Spaltstelle gespalten wird. Dies kann z.B. durch die Verwendung von D-Isomeren der Aminosäuren beim Aufbau des Polypeptids erreicht werden. D-Aminosäuren sind resistent gegenüber Protease-Spaltung, und ein Polypeptid, das aus D-Aminosäuren hergestellt wird, wird dem Angriff durch Proteasen widerstehen. Darüber hinaus wirkt sich die Verwendung von D-Aminosäuren nicht nachteilig auf die an der Multimerisierung beteiligte Protein-Protein-Interaktion, wie etwa auf die Interaktion von Protein-Bindungsdomänen, aus, insbesondere im Falle von Coiled coil-Domänen, vorausgesetzt, dass bei beiden Mitgliedern eines Bindungspaares D-Aminosäuren verwendet werden.
Um den Verdau durch das beabsichtigte Proteaseenzym zu ermöglichen, enthalten die D-Aminosäure-Konstrukte der Polypeptide einen oder mehrere Teile, die aus L-Aminosäuren konstruiert sind, oder die anderweitig empfindlich gegenüber proteolytischer Spaltung gemacht wurden. Beispielsweise umfassen Coiled coils, die aus D-Aminosäuren konstruiert wurden, vorzugsweise Inserts, die vollständig oder teilweise aus L-Aminosäuren hergestellt wurden, und die die Protease-Spaltstelle umfassen. Das L-Aminosäure-Insert kann von jeder beliebigen Größe sein, und kann zwischen wiederholten Coiled coils oder zwischen Resten eines Coiled coils positioniert werden. Bevorzugt sind Insertionen an den Positionen b-c, e-f und f-g. Das Insert wird kovalent an das Coiled coil angebunden, und zwar durch eine kovalente Verbindung mit dem Rückgrat oder über eine Seitenkette.
Das Insert kann lediglich eine Spaltstelle oder ein vollständiges Polypeptid umfassen. Funktionell gesehen, ist das Insert hinreichend flexibel, um es dem Coiled coil zu erlauben, effizient an sein Ziel zu binden, wenn das Insert intakt ist. Beispielsweise kann das Insert einen flexiblen Linker umfassen, wie etwa einen Gly-Gly-Linker. Moleküle, die D-Aminosäuren beinhalten, werden vorteilhafter Weise bei in vitro-Tests verwendet.
Inserts gemäß obiger Beschreibung können in D-Aminosäure-basierten Coiled coils, in konventionellen, L-Aminosäure-basierten Coiled coils oder in Coiled coils verwendet werden, die im Aufbau partiell D und partiell L sind. Beispielsweise kann ein Coiled coil so konstruiert werden, dass es auf der einen Seite des Inserts aus L-Aminosäuren und auf der anderen Seite des Inserts aus D-Aminosäuren besteht.
Modulator-Kandidaten für Protein-modifizierende Enzyme im Test gemäß der Erfindung
Ob nun im Rahmen von in vitro- oder in vivo-Systemen, die Erfindung umfasst Verfahren, mittels derer Zusammensetzungen realisiert werden können, die die Aktivität eines Proteinmodifizierenden Enzyms steigern, inhibieren, oder unbeeinflusst lassen können (z.B. in einem Kreuz-Testverfahren, bei dem es das Ziel ist, zu bestimmen, ob ein für einen Zweck vorgesehenes Mittel zusätzlich allgemeine Zellfunktionen beeinflusst, für die Proteinmodifikation ein Beispiel ist).
Es können Modulator-Kandidatenverbindungen aus großen Bibliotheken synthetischer oder natürlicher Verbindungen durchgetestet werden. Es werden derzeit zahlreiche Ansätze für die zufällige und zielgerichtete Synthese von Saccharid-, Peptid-, und Nukleinsäure-basierten Verbindungen verwendet. Synthetische Verbindungs-Bibliotheken sind bei einer Anzahl von Firmen, einschließlich Maybridge Chemical Co. (Trevillet, Cornwall, UK), Comgenex (Princeton, NJ), Brandon Associates (Merrimack, NH) und Microsource (New Milford, CT), kommerziell erhältlich. Eine Bibliothek seltener Chemikalien ist bei Aldrich (Milwaukee, WI) erhältlich. Kombinatorische Bibliotheken sind erhältlich, bzw. können hergestellt werden. Alternativ sind Bibliotheken natürlicher Verbindungen in Form bakterieller, aus Pilzen stammender, pflanzlicher und tierischer Extrakte z.B. bei Pan Laboratories (Bothwell, WA) oder bei MycoSearch (NC) erhältlich oder können mittels in der Technik wohlbekannter Verfahren problemlos hergestellt werden. Zusätzlich lassen sich natürlich und synthetisch hergestellte Bibliotheken und Verbindungen leicht durch konventionelle chemische, physikalische und biochemische Mittel modifizieren.
Nützliche Verbindungen können in zahlreichen chemischen Klassen gefunden werden, obwohl es typischerweise organische Verbindungen einschließlich kleiner organischer Verbindungen sind. Kleine organische Verbindungen besitzen ein Molekulargewicht von über 50, jedoch von weniger als etwa 2.500 Dalton, bevorzugt von weniger als etwa 750, bevorzugter von weniger als etwa 500 Dalton. Beispielhafte Klassen beinhalten Heterozyklen, Peptide, Saccharide, Steroide, und dergleichen. Die Verbindungen können modifiziert werden, um die Wirksamkeit, Stabilität, pharmazeutische Verträglichkeit und dergleichen zu verbessern. Die Strukturbestimmung eines Mittels kann verwendet werden, um zusätzliche Mittel zu identifizieren, zu erzeugen oder durchzutesten. Wenn beispielsweise Peptidmittel identifiziert werden, können diese in einer Vielzahl von Wegen modifiziert werden, um deren Stabilität zu erhöhen, so etwa unter Verwendung einer nicht-natürlichen Aminosäure, wie etwa einer D-Aminosäure, insbesondere D-Alanin, durch Funktionalisierung des Amino- oder Carboxy- Terminus, z.B. für die Aminogruppe durch Acylierung oder Alkylierung, und für die Carboxylgruppe durch Veresterung oder Amidierung oder dergleichen.
Modulator-Kandidaten, die gemäß den Verfahren der Erfindung durchgetestet werden können, beinhalten Rezeptoren, Enzyme, Liganden, Regulationsfaktoren und Strukturproteine. Modulator-Kandidaten beinhalten außerdem Kernproteine, zytoplasmatische Proteine, mitochondriale Proteine, sekretierte Proteine, Plasmalemma-assoziierte Proteine, Serumproteine, virale Antigene, bakterielle Antigene, Protozoen-Antigene und Parasiten-Antigene. Modulator-Kandidaten umfassen weiterhin Proteine, Lipoproteine, Glykoproteine, Phosphoproteine und Nukleinsäuren (z.B. RNAs wie etwa Ribozyme oder Antisense-Nukleinsäuren). Proteine oder Polypeptide, die unter Verwendung der Verfahren der vorliegenden Erfindung durchgetestet werden können, beinhalten Hormone, Wachstumsfaktoren, Neurotransmitter, Enzyme, Gerinnungsfaktoren, Apolipoproteine, Rezeptoren, Arzneistoffe, Onkogene, Tumor-Antigene, Tumor-Suppressoren, Strukturproteine, virale Antigene, Parasiten-Antigene, bakterielle Antigene und Antikörper (siehe unten).
Modulator-Kandidaten, die gemäß der Erfindung durchgetestet werden können, beinhalten außerdem Substanzen, für die eine Testzelle oder ein Testorganismus defizient sein können oder solche, die in einer Konzentration, die höher als normal ist, klinisch wirksam sein könnten, ebenso wie solche, die dazu ausgestaltet sind, die Translation unerwünschter Proteine zu eliminieren. Nutzbare Nukleinsäuren sind nicht auf die Codierung der oben beschriebenen Modulator-Kandidaten beschränkt, sondern können Produkte eliminieren oder codieren, die schädliche Proteine beseitigen. Derartige Nukleinsäuresequenzen sind antisense-RNA und Ribozyme, und ebenso DNA-Expressionskonstrukte, die diese codieren. Es ist anzumerken, dass antisense-RNA-Moleküle, Ribozyme oder Gene, die diese codieren, einer Testzelle oder einem Organismus durch ein in der Technik bekanntes Verfahren der Nukleinsäureübertragung zugeführt werden können, wie unten beschrieben. Inaktivierende Nukleinsäuresequenzen können ein Ribozym oder antisense-RNA codieren, das/die für die Ziel-mRNA spezifisch ist. Ribozyme der Hammerkopf-Klasse sind die kleinsten bekannten Beispiele; sie eignen sich sowohl für die in vitro-Produktion als auf für die Verabreichung an Zellen.
Bestimmung der Aktivität eines Modulator-Kandidaten der Protein-Protein-Interaktion oder eines Protein-modifizierenden Enzyms
Ein Modulator-Kandidat für die Interaktion zwischen einer Bindungsdomäne und einem Bindungspartner, der gemäß der Erfindung, wie hier beschrieben, getestet wird, wird als wirksam bestimmt, wenn seine Anwendungsergebnisse einen Unterschied von etwa 10% oder mehr gegenüber Kontrollen aufweisen, in denen er nicht enthalten ist (siehe unten), und zwar im Bezug auf FRET oder ein anderes Signal, das von einer detektierbaren, für die Erfindung nutzbaren Markierung ausgeht und aus der Assoziation einer natürlichen Bindungsdomäne und deren Bindungspartner resultiert.
Der Grad der Aktivität eines Modulator-Kandidaten kann unter Verwendung beliebiger geeigneter Grenzwerte, z.B. über die folgende Formel quantifiziert werden:
wobei Index_Kontrolle das quantitative Ergebnis darstellt (z.B. die Stärke oder Geschwindigkeit einer Änderung der Fluoreszenz bei einer gegebenen Frequenz, die Geschwindigkeit der molekularen Rotation, FRET, die Änderungsrate von FRET oder einen anderen Anzeigewert der Modifikation, einschließlich, jedoch nicht begrenzt auf, Enzymhemmung oder Enzymaktivierung), das in Tests erhalten wird, bei denen der Modulator-Kandidat fehlt (d.h. in unbehandelten Kontrollen), und Index_Probe das Messergebnis der gleichen Messung in Tests darstellt, die den Modulator-Kandidaten enthalten. Wie hier beschrieben, werden Kontrollmessungen nur mit einer differentiell markierten, natürlichen Bindungsdomäne und deren zugehörigem Partner durchgeführt, bzw. mit diesen Molekülen plus einem Proteinmodifizierenden Enzym, das eine natürliche Stelle für die posttranslationale Proteinmodifikation erkennt, die sich an der Bindungsdomäne und, optional, an dem Bindungspartner befindet.
Eine derartige Berechnung wird entweder bei in vitro- oder bei in vivo-Tests verwendet, die gemäß der Erfindung durchgeführt werden.
Gemäß der Erfindung können Tests auf Aktivität Protein-modifizierender Enzyme unter Verwendung von Zell-Rohextrakten durchgeführt werden, um die Aktivität sowohl eines rekombinanten als auch um die Aktivität eines in der Natur zu findenden Proteins zu testen, so etwa bei einem Protein aus einer biologischen Probe, erhalten aus einer Test-Zelllinie oder einem Tier oder aus einem klinischen Patienten. Im erstgenannten Fall erlaubt die Verwendung eines Zell-Rohextrakts ein schnelles Testen vieler Proben, was z.B. im Bezug auf Modulator-Kandidaten der Protein-modifizierenden Enzymaktivität potentiell eine spezifische Anwendung bei Hochdurchsatz-Testverfahren findet. Im letztgenannten Fall erleichtert die Verwendung eines Rohextrakts mit dem markierten Reporter-Polypeptid, dieses umfassend eine natürliche Bindungsdomäne und, für wenigstens ein Mitglied eines Paares von Bindungspartnern, eine natürliche Stelle zur posttranslationalen Proteinmodifikation, eine leichte und schnelle Bestimmung der Aktivität eines Enzyms von Interesse bei einem diagnostischen Verfahren, z.B. bei einem Verfahren, das darauf ausgerichtet ist, zu bestimmen, ob ein Protein-modifizierendes Enzym auf einem physiologisch angemessenem Niveau aktiv ist, oder bei einem Verfahren, das dazu vorgesehen ist, die Wirksamkeit einer Therapie zu bestimmen, die auf die Modulierung der Aktivität eines bestimmten Enzyms abzielt.
Die vorliegende Erfindung wird nun unter Bezugnahme auf die folgenden Beispiele erklärt, die nur der Veranschaulichung dienen sollen und nicht begrenzend sind. Die Beispiele nehmen Bezug auf die Figuren.
Beschreibung der Figuren
1: Homodimer-basierter PKA FRET-Test
2: Heterodimer-FRET-Signal
3: Schematische Darstellung eines Heterodimer-basierten FRET-Tests, bei dem entweder eine von beiden oder beide Peptide Modifikationsstellen aufweisen
4: PKA FRET-Test unter Verwendung von Coiled-coil-Heterodimer-Substraten
5: Heterodimer-basierter Fluoreszenzpolarisationstest für PKA.
6: Vergleich der anfänglichen Reaktionsraten eines PKA-Tests unter Verwendung von FRET- oder FP-Anzeigen
7: Inhibition eines PKA FRET-Tests im Hinblick auf ein PKA-Inhibitorprofil, gemessen unter Verwendung einer FRET-Anzeige
8: FRET-basierter Test auf CaMK-11
9: Inhibition der CaMK II durch Ca²⁺/CaMK-Inhibitor, 281–301-Inhibitor unter Verwendung eines FRET-basierten Tests
10: FP-Test von CaMK 11
11: Gleichzeitiger PKA- und TEV-Test
12: Gleichzeitiger Test von CaMK und PKA mit FP-Anzeige
13: Gleichzeitiger Test von Chk1 und PKA. Zugabe der Enzyme nach 10-minütiger Gleichgewichtseinstellung.
BEISPIELE
Referenzbeispiel 1 – Test auf Kinaseaktivität unter Verwendung von FRET und FP
Materialien und Methoden
Homodimer-basierter Kinase-Test (Figur 1)
Coiled-coil-Reporter-Peptide, die Phosphorylierungsstellen für PKA enthalten, wurden mit Fluorescein (F) oder Tetramethylrhodamin (R) markiert. Die markierten Peptide (3,2 μM Gesamtpeptid, 6:1-Verhältnis bei der R:F-Markierung) wurden bei 30°C in 50 mM Histidin pH 7,0, 5 mM MgSO₄, 120 mM KCl, 5 mM NaF, 0,2 mg/ml BSA und 1 mM ATP in einem Gesamtvolumen von 100 μl in einer Mikrotiterplatte inkubiert. Die Phosphorylierung wurde gestartet durch Zugabe von PKA (3 pmol) und über den Zeitverlauf durch Messen der Fluoreszenzemission von Fluorescein (bei 520 nm; Anregung bei 485 nm) verfolgt.
Verwendete Peptide:
Heterodimer-basierter Kinase-Test
(A) Heterodimer PKA FRET-Test (Figuren 4, 6, 7)
Coiled-coil-Reporterpeptide, die Phosphorylierungsstellen für PKA enthalten, wurden mit Fluorescein (F) oder mit Tetramethylrhodamin (R) markiert. Die markierten Peptide (3,2 μM Gesamtpeptid, 1:1-Verhältnis der R:F-Markierung) wurden bei 30°C in 50 mM Histidin pH 7,0, 5 mM MgSO₄, 120 mM KCl, 5 mM NaF, 0,2 mg/ml BSA und 1 mM ATP in einem Gesamtvolumen von 100 μl in einer Mikrotiterplatte inkubiert. Die Phosphorylierung wurde gestartet durch Zugabe von PKA (3 pmol) und über den Zeitverlauf durch Messen der Fluoreszenzemission von Fluorescein (bei 520 nm; Anregung bei 485 nm) verfolgt.
Verwendete Peptide:
Fos/Jun-Paar
Molekulares Velcro-Paar
(B) Heterodimer PKA FP-Test (Figuren 5, 6)
Coiled-coil-Reporterpeptide, die Phosphorylierungsstellen für PKA enthalten, wurden mit Fluorescein (F) oder mit Biotin (B) markiert. Die markierten Peptide (3,2 μM Gesamtpeptid, 1:1-Verhältnis der B:F-Markierung) wurden bei 30°C in 50 mM Histidin pH 7,0, 5 mM MgSO₄, 120 mM KCl, 5 mM NaF, 0,2 mg/ml BSA und 1 mM ATP in einem Gesamtvolumen von 100 μl in einer Mikrotiterplatte inkubiert. Es wurde Streptavidin (0,1 U) zu jeder Probenvertiefung hinzugegeben, und die Proben wurden für 30 Minuten bei 30°C inkubiert. Die Phosphorylierung wurde gestartet durch Zugabe von PKA (3 pmol) und über den Zeitverlauf durch Messen der Fluoreszenzpolarisation (Anregung bei 485 nm, Emission bei 520 nm) verfolgt.
Verwendete Peptide:
PKA Fos/Jun
PKA Mol. Velcro
(C) CaMK FRET-Test – Heterodimer (Figuren 8, 9)
Coiled-coil-Reporterpeptide, die Phosphorylierungsstellen für Calmodulin-abhängige Kinase II enthalten, wurden mit Fluorescein (F) oder mit Tetramethylrhodamin (R) markiert. Die markierten Peptide (5 bis 20 μM Gesamtpeptid, 4:1-Verhältnis der R:F-Markierung) wurden bei 30°C in 50 mM MOPS pH 7,2, 5 mM MgCl₂, 0,4 mM DTT, 0,1 mM CaCl₂, 0,1 mg/ml BSA, 0,5 μM Calmodulin und 1 mM ATP in einem Gesamtvolumen von 100 μl in einer Mikrotiterplatte inkubiert. Die Phosphorylierung wurde gestartet durch Zugabe von Calmodulin-abhängiger Kinase II (1 pmol) und über den Zeitverlauf durch Messen der Fluoreszenzemission der Fluorescein-Markierung bei 520 nm (Anregung bei 485 nm) verfolgt.
Verwendete Peptide:
CaMK Mol. Velcro
(D) CaMK Fluoreszenzpolarisations-Test – Heterodimer (Figur 10)
Coiled-coil-Reporterpeptide, die Phosphorylierungsstellen für CaMK II enthalten, wurden mit Fluorescein (F) oder mit Biotin (B) markiert. Die markierten Peptide (5 μM Gesamtpeptid, 4:1-Verhältnis der B:F-Markierung) wurden bei 30°C in 50 mM MOPS pH 7,2, 5 mM MgCl₂, 0,4 mM DTT, 0,1 mM CaCl₂, 0,1 mg/ml BSA, 0,5 μM Calmodulin und 1 mM ATP in einem Gesamtvolumen von 100 μl in einer Mikrotiterplatte inkubiert. Es wurde Streptavidin (0,16 U) zu jeder Probenvertiefung hinzugegeben und die Proben wurden für 5 min bei 30°C inkubiert. Die Phosphorylierung wurde gestartet durch Zugabe von CaMK (1 pmol) und über den Zeitverlauf durch Messen der Fluoreszenzpolarisation (Anregung bei 485 nm, Emission bei 520 nm) verfolgt.
Verwendete Peptide:
CaMK Mol. Velcro
Ergebnisse PKA-Homodimer-basierter Kinase-Test
Wir haben zuvor Tests auf Proteinkinase A-Aktivität unter Verwendung von GCN4-Homodimer-Peptidsubstraten unter Verwendung von GCN4-Homodimer-Peptidsubstraten entwickelt, die eine eingeführte Modifikationsstelle für die Phosphorylierung durch das Enzym beinhalten. Diese Coiled coil-Peptidsubstrate sind erfolgreich verwendet worden, um die Aktivität von PK-A in einer FRET-Anordnung zu messen (siehe 1), bei der ein Peptidpartner mit Fluorescein (Donor) und das Partnerpeptid mit Rhodamin (Akzeptor) markiert ist.
Heterodimer-basierter Kinase-Test
Eine verbesserte Version des Tests basiert auf der Verwendung bekannter natürlicher oder künstlich entworfener Heterodimere als Peptid-Reportersubstrate, bei denen ein Partner eine posttranslationale Modifikationsstelle umfasst. Das bei dieser Anordnung erhaltene Testsignal ist wesentlich verbessert. Beispielsweise resultiert die Zugabe des Akzeptor-Peptids zu dem Donor-Peptid in einem Verhältnis von 1:1 in etwa 80% FRET (ein Peptid wird mit Fluorescein, der Partner mit Rhodamin markiert) – siehe 2. Jedoch war bei Zugabe des modifizierenden Enzyms kein Zusammenbruch der Coiled coil-Partnerschaft zu beobachten, wie er durch das Fehlen oder die Aufhebung des FRET-Signals angezeigt worden wäre.
Die Einführung einer Modifikationsstelle an beiden Peptiden resultierte in der Aufhebung des FRET-Signals. Diese Beobachtungen sind schematisch in 3 zusammengefasst.
Beispiele, bei denen diese Modifikation verwendet wurde, beinhalten die Phosphorylierungsstellen für PKA und CaMK-II.
(A) PKA-Heterodimer-FRET-Tests
Coiled coil-Reporterpeptide (auf Basis von Fos/Jun oder Molecular Velcro), jedes enthaltend eine Phosphorylierungsstelle für PKA, wurden mit Fluorescein (F) oder Tetramethylrhodamin (R) markiert. Fluorescein-markiertes Peptid (Donor, 1,6 μM) wurde bei 30°C in 50 mM Histidin pH 7,0, 5 mM MgSO₄, 120 mM KCl, 5 mM NaF, 0,2 mg/ml BSA und 1 mM ATP in einem Gesamtvolumen von 100 μl in einer Mikrotiterplatte inkubiert. Sobald sich das Signal stabilisiert hatte (ca. 2 min), wurde das Rhodamin-markierte Peptid (Akzeptor, 1,6 μM) hinzugegeben, was aufgrund von FRET eine Auslöschung des Fluoresceins von etwa 60% ergab. Die Phosphorylierung wurde dann durch die Zugabe von 3 pmol PKA gestartet und die Enzymaktivität über den Zeitverlauf durch Verfolgung der erneuten Zunahme der Fluoreszenzemission durch Fluorescein beobachtet, da das Peptidpaar als Funktion der Modifikation dissoziiert (4).
(B) PKA-FP-Tests
PKA-Tests unter Verwendung dieser Heterodimersubstrate wurden außerdem im Modus der Fluoreszenzpolarisation durchgeführt.
Bei diesem Typ des Tests wird nur ein Peptid mit Fluorescein markiert, während das Partner-Peptid mit Biotin markiert wird. Die Methodik der Fluoreszenzpolarisation basiert auf der Detektion der Taumelgeschwindigkeit von Makromolekülen, wobei große Moleküle nur eine sehr langsame Taumelbewegung zeigen und dadurch einen hohen Polarisationswert besitzen und kleine Moleküle eine sehr schnelle Taumelbewegung zeigen und folglich einen niedrigen Polarisationswert besitzen. Die Biotinylierung eines Peptids wurde für die Anheftung eines Streptavidin-Moleküls durchgeführt, um dadurch die Größe des Komplexes zu erhöhen. Das Konzept basiert auf der Tatsache, dass es bei Phosphorylierung des Coiled coils durch PKA zu einer Dissoziation der Partner kommt, was ein kleines Peptid mit einem niedrigen Polarisationswert ergibt (5).
Coiled-coil-Reporterpeptide, die Phosphorylierungsstellen für PKA enthalten, wurden mit Fluorescein (F) oder Biotin (B) markiert. Markierte Peptide (3,2 μM Gesamtpeptid, 1:1-Verhältnis der B:F-Markierung) wurden bei 30°C in 50 mM Histidin pH 7,0, 5 mM MgSO₄, 120 mM KCl, 5 mM NaF, 0,2 mg/ml BSA und 1 mM ATP in einem Gesamtvolumen von 100 μl in einer Mikrotiterplatte inkubiert. Es wurde Streptavidin (0,1 U) zu jeder Probenvertiefung hinzugegeben, und die Proben wurden bei 30°C für 30 min inkubiert. Sobald sich das Signal stabilisiert hatte, wurde die Phosphorylierung durch Zugabe von 3 pmol PKA gestartet und die enzymatische Aktivität durch Beobachten der Abnahme der Fluoreszenzpolarisation als Anzeige für die Dissoziation der Coiled coils verfolgt.
Ein Testvergleich unter Verwendung des FRET- und FP-Detektionsmodus zeigte, dass beide Anzeigen hinsichtlich der Empfindlichkeit identisch sind (6 – Volumina reduziert auf 20 μl (FRET) bzw. 50 μl (FP), die Zugabe der PKA wurde in geeigneter Weise angepasst, um die gleiche Konzentration in den Probenvertiefungen zu ergeben).
Kinetische Parameter und Inhibitionsprofile der PKA-Aktivität wurden auch unter Verwendung des spezifischen Peptidinhibitors DKA Inhibitor Amid 6-22 (Calbiochem) und ebenso mittels eines allgemeinen, nicht-peptidischen Inhibitors (Staurosporin) bestimmt ( 7).
(C) CaMK-II-FRET-Tests
Die erfolgreiche Erstellung von Heterodimer-Coiled coil-Peptidsubstraten für PKA führte zur Herstellung von Stellen für andere Kinasen wie etwa Calmodulin-abhängiger Proteinkinase II und Caseinkinase I.
Unter Bedingungen, die denen ähnlich sind, die oben für PKA beschrieben wurden, wurden Peptide mit Phosphorylierungsstellen für CaMK-11 mit Fluorescein und Rhodamin markiert und ergaben, wenn sie in einem 1:1-Verhältnis zusammengemischt wurden, etwa 70% FRET. Wenn das Enzym zugegeben wird, wird FRET aufgehoben, was die Dissoziation der Coiled coil-Partner anzeigt (8).
Es wurden auch für die CaMK-11 Inhibitionsprofile erstellt, wobei ein spezifischer Peptidinhibitor, Ca²⁺/Calmodulinkinase II-Inhibitor 201–301 (Calbiochem), verwendet und die kinetischen Parameter bestimmt wurden (9).
(D) CaMK-II-Fluoreszenzpolarisationstests
Diese Tests wurden in einer ähnlichen Weise durchgeführt wie diejenigen, die oben für PKA beschrieben wurden, wobei Fluorescein-markiertes Peptid zu einem biotinylierten Peptidpartner zugegeben wurde, der mit Streptavidin verbunden war. In Abwesenheit des Enzyms zeigt der Komplex hohe Polarisationswerte, wogegen nach Zugabe des Enzyms ein Abfall der Polarisation beobachtet wurde, der die Dissoziation der Coiled coils anzeigt ( 10).
NB. Es ist für alle einzelnen Kinase-Tests gezeigt worden, dass diese bei verschiedenen Temperaturen (20–37°C) arbeiten.
Referenzbeispiel 2 – Proteasetest
Fluoreszenzpolarisations-TEV-Test
Coiled coil-Reporterpeptide, die Schnittstellen für TEV enthalten, wurden mit Fluorescein (F) oder mit Biotin (B) markiert. Markierte Peptide (10 μM Gesamtpeptid, 6:1-Verhältnis der B:F-Markierung) wurden für 30 min bei 30°C in 50 mM Tris pH 8,0, 0,5 mM EDTA, 1 mM DTT und 0,2 mg/ml BSA in einem Gesamtvolumen von 100 μl in einer Mikrotiterplatte inkubiert. Die proteolytische Spaltung wurde durch die Zugabe von TEV (30U) gestartet und durch Messung der Fluoreszenzpolarisation (Anregung 485 nm, Emission 520 nm) über den Zeitverlauf verfolgt.
Verwendete Peptide:
TEV
Die erhaltenen Ergebnisse zeigen, dass es möglich ist, die Aktivität von Proteasen unter Verwendung von Reporter-Polypeptiden im Modus der Fluoreszenzpolarisation zu messen.
Beispiel 1 – Gleichzeitige Tests
Materialien und Methoden
Gleichzeitiger Test mit PKA und TEV (Homodimere) (Figur 11)
Coiled coil-Peptide, die PKA-Phosphorylierungsstellen enthalten, wurden mit Cumarin oder Biotin markiert. Coiled coil-Peptide, die TEV-Proteasespaltstellen enthalten, wurden mit Fluorescein oder Biotin markiert. Die markierten Peptide (4 μM PKA und 8 μM TEV, jeweils 6:1-Verhältnis von B:F) wurden bei 30°C in 50 mM Tris pH 7,8, 5 mM MgSO₄, 120 mM KCl, 5 mM NaF, 0,2 mg/ml BSA, 0,14 Unit Streptavidin und 1 mM ATP in einem Gesamtvolumen von 100 μl in einer Mikrotiterplatte inkubiert. Die Reaktionen wurden durch die Zugabe von PKA (0,75 pmol) und TEV (30 Unit) zu den Probenvertiefungen gestartet. Die Enzymaktivitäten wurden über den Zeitverlauf durch Messung der Fluoreszenzpolarisation von Cumarin (Anregung 390 nm, Emission 450 nm) und Fluorescein (Anregung 485 nm, Emission 520 nm) verfolgt.
Verwendete Peptide:
für TEV
PKA Mol. Velcro
PKA (Heterodimer) und CaMK (Heterodimer) (Figur 12)
Coiled coil-Peptide, die PKA-Phosphorylierungsstellen enthalten, wurden mit Fluorescein oder Biotin markiert. Coiled coil-Peptide, die CaMK II-Phosphorylierungsstellen enthalten, wurden mit Biotin oder Cumarin markiert. Die markierten Peptide (jeweils 6 μM, 4:1-Verhältnis von B:C bei CaMK, 3:1-Verhältnis von B:F bei PKA) wurden bei 30°C in 50 mM MOPS pH 7,2, 10 mM MgSO₄, 0,4 mM DTT, 0,1 mM CaCl₂, 0,1 mg/ml BSA, 0,5 μM Calmodulin, 0,45 Unit Streptavidin und 1 mM ATP in einem Gesamtvolumen von 100 μl in einer Mikrotiterplatte inkubiert. Die Reaktionen wurden durch Zugabe von PKA (0,75 pmol) und CaMK (1 pmol) zu den Probenvertiefungen gestartet. Die Enzymaktivität wurde über den Zeitverlauf durch Messung der Fluoreszenzpolarisation für Cumarin (Anregung 390 nm, Emission 450 nm) und für Fluorescein (Anregung 485 nm, Emission 520 nm) verfolgt.
Verwendete Peptide:
PKA Fos/Jun
CaMK Mol. Velcro
Ergebnisse
Die Optimierung zweier einzelner, oben beschriebener Kinase-Tests in dem Referenzbeispiel veranlasste uns dazu, zu prüfen, ob wir die Aktivität von wenigstens zwei Enzymen in einem einzigen Test würden überwachen können.
Die in 11 dargestellten Ergebnisse zeigen, dass es möglich ist, die Aktivitäten von zwei verschiedenen Klassen von Enzymen (einer Kinase, PKA und einer Protease, TEV) zu überwachen. Diese Tests wurden unter Verwendung des FP-Detektionsmodus durchgeführt.
Bei diesem Test wurden TEV-Reporterpeptide mit Biotin:Streptavidin und Fluorescein markiert und dann gemischt, um Coiled coil-Partner in einem Endvolumen von 100 μl zu bilden. Zu diesem Gemisch wurden PKA-Reporterpeptide hinzu gegeben, die mit Biotin:Streptavidin und Cumarin markiert waren.
Um die Reaktionen zu starten, wurden 30 Units an TEV und 0,75 pmol PKA nacheinander dem Gemisch zugegeben. Die Enzymaktivitäten von TEV und PKA wurden gleichzeitig unter Messung der Abnahme der Polarisation bei geeigneten Anregungs- und Emissionswellenlängen (390, 450 nm für PKA und 485, 520 nm für TEV) bestimmt.
Unter Verwendung des gleichen Ansatzes haben wir die Möglichkeit getestet, die Aktivitäten von zwei verschiedenen Kinasen, PKA und CaMK-II, in einer einzigen Probenvertiefung zu überwachen. Die in 12 dargestellten Ergebnisse zeigen, dass dies tatsächlich möglich ist.
Bei diesem Test wurden PKA-Reporterpeptide mit Biotin:Streptavidin und Fluorescein markiert und dann gemischt, um als Coiled coil-Partner in einem Endvolumen von 100 μl zu fungieren. Zu diesem Gemisch wurden CaMK-Reporterpeptide hinzu gegeben, die mit Biotin:Streptavidin und Cumarin markiert waren. Die Reaktionen wurden durch Zugabe von 0,75 pmol an PKA und 1 pmol an CaMK gestartet. Die Aktivitäten von PKA und CaMK wurden unter Messung der Abnahme der Polarisation bei geeigneten Anregungs- und Emissionswellenlängen (PKA: 485, 520 nm, CaMK II 390, 450 nm) verfolgt.
Wir haben somit auch gezeigt, dass es möglich ist, die Aktivität zweier verschiedener Kinasen gleichzeitig zu messen.
Beispiel 2 – Gleichzeitiger Test auf zwei Serin-Threonin-Kinasen, Chk1 und cAMP-abhängige Proteinkinase (PKA), mittels FP
Die Serin-Threonin-Kinasen PKA und Chk1 können gleichzeitig bestimmt werden, wobei hierzu die unten beschriebenen natürlichen Bindungspartner-Reporter für Chk1 und ein Peptidbasierter Bindungspartner-Test für PKA (WO 99/11774) verwendet wurden.
Verfahren
Quellen der Reagenzien
Chk1-Enzym und „Chktide" stammen von Upstate Biotechnology. Chktide, Sequenz des Substratpeptids von Chk1:
Markierung von Chktide mit Fluorescein
Chktide wird markiert, indem es für 2 Stunden bei einer Konzentration von 0,185 mM in 100 mM NaHCO₃ pH 8,3 und 0,37 mM Fluorescein-5EX (Molecular Probes) bei Raumtemperatur inkubiert wird. Das markierte Peptid wird dann gegen drei frische Volumina an 50 mM Tris-HCl pH 7,4, 150 mM NaCl (200 ml) für eine Gesamtdauer von 18 Stunden dialysiert.
Produktion von 14-3-3 ε
Unter der Kontrolle des T7-Promotors, enthält der Vektor FS121 DNA, die, für das Protein 14-3-3 ε (Genbank Zugangsnummer U54778) codiert und im Leseraster mit DNA verbunden ist, die einen N-terminalen Hexa-His-Tag codiert. Frische Transformanten von pFS121 in BRL(DE3) pLysS werden verwendet, um 3 ml LB/Ampicillin (100 μg/ml) anzuimpfen. Die Starterkultur wird über Nacht unter Schütteln bei 37°C inkubiert. Von diesen Starterkulturen wird 1 ml verwendet, um 400 ml Terrific Broth/Ampicillin (100 μg/ml) in einem 2 l Baffle-Kolben anzuimpfen. Die Kulturen werden bei 37°C bei 200 rpm für etwa 4 Stunden inkubiert, bis die OD_600nm 0,5Abs. Einheiten erreicht hat. An diesem Punkt werden die Kulturen durch Zugabe von IPTG bei einer Konzentration von 1 mM induziert und für 4 Stunden bei 37°C weiter inkubiert.
Die Bakterien werden durch Zentrifugation bei 3000 rpm für 20 min geerntet. Das Bakterienpellet wird in 25 ml Lysepuffer (50 mM Phosphat pH 7,0, 300 mM NaCl, 2% Proteinase-Inhibitor-Cocktail (Sigma), 0,75 mg/ml Lysozym) resuspendiert. Die Lyse der resuspendierten Zellen wird durch sanftes Rühren für 30 min bei Raumtemperatur eingeleitet. Nonidet P-40 wird auf eine Endkonzentration von 1 % zugegeben und die Lyse für weitere 20 min bei Raumtemperatur fortgesetzt. Das partiell lysierte Gemisch wird drei Zyklen des Gefrierens und Auftauens in flüssigem Stickstoff unterzogen. Abschließend werden die Zellen auf Eis und unter Verwendung einer 10 mm-Sonde bei hoher Energie einer Ultraschallbehandlung unterzogen. Die Ultraschallbehandlung erfolgt mit einer Pulseinstellung für eine Zeitspanne von 4 min. Dieses Rohlysat wird bei 15.000 rpm für 30 min zentrifugiert, um Zelltrümmer zu entfernen. Mit Hexa-His-Tag versehene Proteine werden unter Verwendung des TALON^®-Harzes (Clontech) aus dem geklärten Lysat isoliert. Die Proteine werden in einer Chargen-artigen Weise durch sanftes Schütteln bei Raumtemperatur für 30 min an das Harz gebunden. Nicht mit His-Tag versehene Proteine werden entfernt, indem das Harz mindestens zweimal mit dem 10fachen Bettvolumen des Waschpuffers (50 mM Natriumphosphat pH 7,0, 300 mM NaCl, 5 mM Fluoreszenz-freies Imidazol) gewaschen wird. Das gewaschene Harz wird auf eine 2 ml-Säule geladen, und die gebundenen Proteine werden mit Elutionspuffer (50 mM Natriumphosphat pH 7,0, 300 mM NaCl, 150 mM Fluoreszenz-freies Imidazol) freigesetzt. Die Elution erfolgt normalerweise innerhalb von 5 ml. Die gereinigten Proteine werden nach Schockgefrieren in flüssigem Stickstoff in Gegenwart von 10% Glycerin bei –80°C gelagert.
PKA-Peptidsequenzen:
Die PKA-Peptide bilden im nicht-phosphorylierten Zustand Coiled coil-Dimere. Jedes Monomer besitzt eine PKA-Phosphorylierungsstelle. Nach der Phosphorylierung durch PKA können sich die Dimere nicht länger bilden. Die Assoziation/Dissoziation kann unter Verwendung eines Fluoreszenz-Polarisationstests gemessen werden, bei dem das PKA-Peptid 1 mit Cumarin und das Peptid 2 mit Biotin markiert und mit Streptavidin verbunden ist. Die Taumelgeschwindigkeit des Cumarin-markierten Peptids 1 ist nach der PKA-Phosphorylierung und dem Abdissoziieren von dem Dimer/Streptavidin-Komplex höher. Zur gleichen Zeit wird die Aktivität von Chk1 anhand der Abnahme der Taumelgeschwindigkeit von phosphoryliertem, Fluorescein-markiertem Chktide-Substrat, das an das 143-3ε-Protein bindet, gemessen.
Die markierten PKA-Peptide (beide mit einer Konzentration von 2,5 μM) werden bei 30°c in einem Gesamtvolumen von 50 μl (auf einer Halbflächen-Platte mit 96 Probenvertiefungen) in 20 mM MOPS pH 7,2, 10 mM MgCl₂, 25 mM β-Glycerophosphat, 5 mM EGTA, 1 mM Natriumortho-Vanadat, 1 mM DTT, sowie 0,1 mM ATP, 3 μl 14-3-3ε und 0,06 U Streptavidin inkubiert. Man lässt die Proben für 5 min äquilibrieren und gibt dann Chk1 (62 mU) und PKA (0,5 pmol) (oder ein entsprechendes Volumen H_ZO bei den Kontrollproben) hinzu. Die Fluoreszenzpolarisation bei 520 nm (Anregung 485 nm) und bei 450 nm (Anregung 340 nm) werden über die Zeit verfolgt, wie dies in 13 dargestellt ist.

Claims

Verfahren zum gleichzeitigen Messen der Aktivität eines ersten Enzyms und eines zweiten Enzyms in einem System, wobei das Verfahren folgendes umfaßt: (a) in Kontaktbringen einer ersten Bindungsdomäne und eines ersten Bindungspartners davon mit dem ersten Enzym und in Kontaktbringen einer zweiten Bindungsdomäne und eines zweiten Bindungspartners davon mit dem zweiten Enzym, wobei (i) die erste Bindungsdomäne und/oder der Bindungspartner eine Stelle umfassen, die einer posttranslationalen Modifikation durch das erste Enzym unterworfen wird, (ii) eine Modifikation der Stelle durch das erste Enzym die Wechselwirkung zwischen der ersten Bindungsdomäne und dem ersten Bindungspartner beeinflußt, (iii) die zweite Bindungsdomäne und/oder der Bindungspartner eine Stelle umfassen, die einer posttranslationalen Modifikation durch das zweite Enzym unterworfen wird, und (iv) eine Modifikation der Stelle durch das zweite Enzym die Wechselwirkung zwischen der zweiten Bindungsdomäne und dem zweiten Bindungspartner beeinflußt und (b) gleichzeitiges Messen der Wechselwirkung zwischen der ersten Bindungsdomäne und dem ersten Bindungspartner und Messen der Wechselwirkung zwischen der zweiten Bindungsdomäne und dem zweiten Bindungspartner.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei die erste Bindungsdomäne und der erste Bindungspartner jeweils eine feststellbare Markierung in der Weise umfassen, daß, wenn die erste Bindungsdomäne und der erste Bindungspartner miteinander wechselwirken, eine erste feststellbare physikalische Eigenschaft von einer oder beiden der Markierungen verändert wird, und die zweite Bindungsdomäne und der zweite Bindungspartner jeweils eine feststellbare Markierung in der Weise umfassen, daß, wenn die zweite Bindungsdomäne und der zweite Bindungspartner miteinander wechselwirken, eine zweite feststellbare physikalische Eigenschaft von einer oder beiden der Markierungen verändert wird, und eine Messung der Wechselwirkung zwischen der ersten Bindungsdomäne und dem ersten Bindungspartner durch Messen von Veränderungen in der ersten physikalischen Eigenschaft durchgeführt wird und ein Messen der Wechselwirkung zwischen der zweiten Bindungsdomäne und dem zweiten Bindungspartner durch Messen von Veränderungen in der zweiten physikalischen Eigenschaft durchgeführt wird, wobei die erste physikalische Eigenschaft von der zweiten physikalischen Eigenschaft unterscheidbar ist.
Verfahren nach Anspruch 2, wobei die physikalische Eigenschaft Lichtemission/-absorption ist.
Verfahren nach Anspruch 3, wobei die physikalische Eigenschaft Fluoreszenzlichtemission ist.
Verfahren nach Anspruch 4, wobei eine oder mehrere der feststellbaren Markierungen ein Fluoreszenzprotein ist.
Verfahren nach Anspruch 4 oder 5, wobei das Verfahren weiterhin umfaßt, daß man die feststellbare(n) Markierungen) anregt und die Fluoreszenzemission überwacht.
Verfahren nach einem der vorangegangenen Ansprüche, wobei das erste Enzym und/oder das zweite Enzym unter einer Kohlenhydrattransferase, einem Ubiquitin-aktivierenden Enzym E1, einem Ubiquitin-konjugierenden Enzym E2, einem Ubiquitin-konjugierenden Enzym Ubc9, einer Ubiquitinproteinligase E3, einer Poly-(ADP-Ribose)-Polymerase, einer Fettsäuretransferase, einer NAD:Arginin-ADP-Ribosyltransferase, einer Protease, einer Proteinkinase und einer Proteinphosphatase ausgewählt ist.
Verfahren nach einem der vorangegangenen Ansprüche, wobei das Verfahren vor, während oder nach dem Messen der Wechselwirkung zwischen der ersten Bindungsdomäne und dem ersten Bindungspartner und/oder der Wechselwirkung zwischen der zweiten Bindungsdomäne und dem zweiten Bindungspartner weiterhin die Stufe umfaßt, bei der man das erste Enzym und/oder das zweite Enzym mit einer Verbindung in Kontakt bringt, welche die Aktivität des ersten und/oder zweiten Enzyms moduliert.
Verfahren zur Identifizierung einer Verbindung, die in der Lage ist, die Aktivität eines ersten Enzyms und/oder eines zweiten Enzyms zu modulieren, wobei das Verfahren folgendes umfaßt: (i) in Kontaktbringer des ersten und/oder zweiten Enzyms mit einer Kandidatensubstanz, (ii) Messen der Aktivität des ersten Enzyms und des zweiten Enzyms in den Zellen nach dem Verfahren von Anspruch 1 und (iii) Bestimmen, ob die Aktivität des ersten und/oder zweiten Enzyms beeinflußt wird.
Satz von zwei oder mehr Polypeptidpaaren, wobei jedes Paar eine Bindungsdomäne und einen Bindungspartner davon umfaßt, mit (i) einer Stelle, die posttranslationaler Modifikation durch ein Enzym unterworfen wird, wobei eine Modifikation der Stelle durch das Enzym die Wechselwirkung zwischen der Bindungsdomäne und dem Bindungspartner beeinflußt, und (ii) einer feststellbaren Markierung an der Bindungsdomäne und dem Bindungspartner in der Weise, daß, wenn die Bindungsdomäne und der Bindungspartner miteinander wechselwirken, eine feststellbare physikalische Eigenschaft von einer oder beiden der Markierungen verändert wird, wobei für jedes Paar das Enzym, welches die Wechselwirkung zwischen der Bindungsdomäne und dem Bindungspartner beeinflußt, verschieden ist und die feststellbare physikalische Eigenschaft von derjenigen des anderen Paares unterschieden werden kann.
Verwendung eines Satzes von Polypeptidpaaren nach Anspruch 10 in einem Verfahren zum gleichzeitigen Messen der Aktivität von zwei oder mehr Enzymen.