DE60029429T2

DE60029429T2 - Verfahren und zusammensetzungen zur überwachung der modifikation von natürlichen bindungspartnern

Info

Publication number: DE60029429T2
Application number: DE60029429T
Authority: DE
Inventors: John Colyer; Roger KingdoN Smallwood CRAIG
Original assignee: Cyclacel Ltd
Current assignee: Cyclacel Ltd
Priority date: 1999-02-25
Filing date: 2000-02-25
Publication date: 2007-02-22
Anticipated expiration: 2020-02-26
Also published as: CA2365042A1; JP2002538088A; AU2813500A; ATE333513T1; WO2000050631A3; EP1163363A2; DE60029429D1; EP1163363B1; WO2000050631A2

Description

Die Erfindung betrifft die Überwachung der posttranslationalen Modifikation eines Proteins.
Die posttranslationale Modifikation von Proteinen ist seit über 40 Jahren bekannt, und seit dem ist sie zu einem ubiquitären Merkmal der Proteinstruktur geworden. Die Addition biochemischer Gruppen an translatierte Polypeptide besitzt weit reichende Auswirkungen auf die Proteinstabilität, die Sekundär-/Tertiärstruktur von Proteinen, die Enzymaktivität und, in allgemeineren Ausdrücken, auf die regulierte Homöostase von Zellen. Solche Modifikationen beinhalten, ohne hierauf beschränkt zu sein, die Addition von Kohlenhydrat (Glykosylierung), ADP-Ribosyl (ADP-Ribosylierung), Fettsäure (Prenylierung, die – ohne hierauf beschränkt zu sein – folgendes beinhaltet: Myristoylierung und Palmitylierung), (Ubiquitin (Ubiquitinierung), Proteinphosphorylierung und – Dephosphorylierung und Sentrin (Sentrinierung; eine der Ubiquitinierung ähnliche Proteinmodifikation).
Phosphorylierung ist ein gut untersuchtes Beispiel einer post-translationalen Modifikation von Proteinen. Es gibt viele Fälle, in denen Polypeptide Tertiärstrukturen höherer Ordnung mit gleichen Polypeptiden (Homo-Oligomere) oder mit andersartigen Polypeptiden (Hetero-Oligomere) ausbilden. Im einfachsten Szenario assoziieren zwei identische Polypeptide, um ein aktives Homodimer auszubilden. Ein Beispiel für diesen Typ der Assoziation ist die natürliche Assoziation von Myosin II-Molekülen beim Zusammenbau von Myosin zu Filamenten.
Die Dimerisierung von Myosin II-Monomeren ist der initiale Schritt beim Start der Ausbildung von Myosinfilamenten. Die initiale Dimerisierung wird durch Phosphorylierung reguliert, deren Auswirkung es ist, eine Konformationsänderung in der Myosin II-Sekundärstruktur zu induzieren, was darin resultiert, dass sich die gefaltete 10S-Monomer-Untereinheit zu einem 6S-Molekül ausdehnt. Dieses aktive Molekül ist in der Lage, zu dimerisieren und nachfolgend Filamente auszubilden. Die Beteiligung der Phosphorylierung von Myosin II an diesem Startereignis ist etwas umstritten. Obwohl die Konformationsänderung bei höheren Eukaryoten von Phosphorylierung abhängig ist, ist die posttranslationale Addition von Phosphat bei Ancanthoamoeba, einem niederen Eukaryoten, nicht erforderlich, um den initialen Dimerisierungsschritt zu bewirken. Es ist zu beachten, dass die Dimerisierungsdomänen in Myosin II von höheren Eukaryoten die Stellen für die Phosphorylierung beinhalten, und es ist wahrscheinlich, dass die Phosphorylierung in dieser Region dafür verantwortlich ist, um Myosin II die Dimerisierung und die nachfolgende Ausbildung von Filamenten zu ermöglichen. Bei Dictyostelium ist diese Situation umgekehrt, und zwar derart, dass die Phosphorylierungsstellen sich außerhalb der Dimerisierungsdomäne befinden und die Phosphorylierung an diesen Stellen benötigt wird, um die Auftrennung der Myosinfilamente zu bewirken. Im Gegensatz zu diesen beiden Beispielen wird Acanthoamoeba-Myosin II in der Dimerisierungsdomäne phosphoryliert, jedoch ist diese Modifikation nicht notwendig, um Myosin II-Monomeren bei dieser Spezies die Dimerisierung zu erlauben.
Das mit Abstand häufigste Beispiel posttranslationaler Modifikation ist die Addition von Phosphat an Polypeptide durch spezifische Enzyme, die als Proteinkinasen bekannt sind. Diese Enzyme sind als wichtige Regulatoren des Phosphorylierungsszustands von Zielproteinen identifiziert worden, und sie sind als wesentliche „Spieler" bei der Regulierung der Zellphysiologie impliziert worden. Beispielsweise wird der Zellteilungszyklus der eukaryotischen Zelle primär reguliert durch den Phosphorylierungsszustand spezifischer Proteine, deren funktioneller Zustand dadurch bestimmt wird, ob das Protein phosphoryliert ist oder nicht. Dies wird durch die relative Aktivität von Proteinkinasen bestimmt, die Phosphat anheften, und durch Proteinphosphatasen, die die Phosphatgruppierung von diesen Proteinen entfernen. Eine klare Fehlfunktion entweder der Kinasen oder der Phosphatasen kann zu einem Erkrankungszustand führen. Dies wird beispielhaft am besten dargestellt durch die unkontrollierte Zellteilung, die von Tumorzellen gezeigt wird. Der regulatorische Stoffwechselweg setzt sich zusammen aus einer großen Anzahl von Genen, die in vivo interagieren, um die Phosphorylierungskaskade zu regulieren, die schließlich bestimmt, ob sich eine Zelle teilen soll oder ob die Zellteilung gestoppt werden soll.
Derzeit gibt es mehrere Ansätze, um den Zustand der Modifikation von Zielproteinen in vivo zu analysieren:

1. in vivo-Einbau markierter (z.B. radioaktiv markierter) Gruppierungen, wie z.B. Fett-Acyl (einschließlich, jedoch nicht beschränkt auf Myristoyl und Palmityl), Sentrin, Methyl, Acetyl, Hydroxyl, lod, Flavin, Phosphat, Ubiquitin oder ADP-Ribosyle, die angefügt werden, um Proteine als Ziel anzusteuern. Gemäß einer gebräuchlichen Prozedur werden intrazelluläre ATP-Pools markiert mit ³²PO₄, welches nachfolgend in das Protein eingebaut wird. Die Analyse modifizierter Proteine erfolgt typischerweise durch Elektrophorese und Autoradiographie, wobei die Spezifität durch die Immunpräzipitation der Proteine von Interesse vor der Elektrophorese erhöht wird.
2. Rückwärtige Markierung: Einbau einer markierten (einschließlich, jedoch nicht in ausschließlicher Weise, mit einer radioaktiven und fluoreszierenden Markierungsgruppe), wie etwa Phosphat (z.B. ³²P) in ein Protein in vitro, um den Modifikationszustand in vivo zu bestimmen.
3. Detektion einer Veränderung der elektrophoretischen Mobilität von modifiziertem Protein (z.B. glykosyliertem oder ubiquitiniertem Protein) im Vergleich zu unmodifiziertem Protein.
4. Dünnschichtchromatographie radioaktiv markierter Fettsäuren, die aus dem Protein von Interesse extrahiert werden.
5. Auftrennung von Protein in eine Detergens-reiche oder eine Detergens-arme Schicht durch Phasentrennung und Wirkungen von Enzymbehandlung des interessierenden Proteins auf die Aufteilung zwischen wässrigen und Detergens-reichen Umgebungen.
6. Verwendung Zellmembran-permeabler Protein-modifizierender Enzyminhibitoren (z.B. Wortmannin, Staurosporin) zum Blockieren der Modifikation von Zielproteinen und vergleichbare Inhibitoren von Enzymen, die an anderen Formen der Proteinmodifikation teilnehmen (oben), z.B. der Phosphorylierung von Zielproteinen.
7. Antikörpererkennung der modifizierten Form des Proteins (z.B. unter Verwendung eines Antikörpers, der gegen Ubiquitin oder Kohlenhydrat-Epitope gerichtet ist), z.B. durch Western Blot oder entweder 1- oder 2-dimensionale Gele, die Testproteinproben tragen, bei denen die Detektion von Phosphorylierung unter Verwendung von Antikörpern erfolgt, die für die phosphorylierten Formen von Zielproteinen spezifisch sind.
8. Lektin-Protein-Interaktion im Western Blot-Format als ein Test auf Gegenwart bestimmter Kohlenhydratgruppen (definiert durch die Spezifität des in Gebrauch befindlichen Lektins).
9. Ausnutzung eukaryotischer mikrobieller Systeme zur Identifizierung von Mutationen in Protein-modifizierenden Enzymen, wie etwa Proteinkinasen und/oder Proteinphosphatasen.

Diese Strategien haben bestimmte Einschränkungen. Die Überwachung von Modifikationszuständen durch Puls- oder Stationärzustand-Markierung ist lediglich eine beschreibende Strategie, um zu zeigen, welche Proteine modifiziert werden, wenn Proben durch Gelelektrophorese aufgetrennt und durch Autoradiographie sichtbar gemacht werden. Dies ist aufgrund der Unfähigkeit, viele der Proteine, die modifiziert werden, zu identifizieren, nicht zufriedenstellend. Ein Maß an Spezifität wird durch diese Technik gewährt, wenn diese mit Immunpräzipitation kombiniert wird; dies ist jedoch durch die Verfügbarkeit von Antikörpern gegen Zielproteine natürlich begrenzt. Darüber hinaus sind nur hochgradig exprimierte Proteine unter Verwendung dieser Technik leicht detektierbar, was dazu führen kann, dass viele Proteine geringer Häufigkeit nicht identifiziert werden, die potentiell wichtige Regulatoren zellulärer Funktionen sind.
Die Verwendung von Enzyminhibitoren zum Blockieren der Aktivität ist ebenfalls problematisch. Beispielsweise besitzen sehr wenige Enzyminhibitoren eine adäquate Spezifität, um eine eindeutige Korrelation eines gegebenen Enzyms mit einer spezifischen Modifikationsreaktion zu erlauben. Tatsächlich besitzen viele Inhibitoren ein breites inhibitorisches Spektrum.
Beispielsweise ist Staurosporin ein potenter Inhibitor Phospholipid/Ca2+-abhängiger Kinasen. Wortmannin ist etwas spezifischer und auf die Phosphatidylinositol-3-Kinase-Familie beschränkt. Dies ist klar unbefriedigend, da mehr als ein biochemischer Weg während der Behandlung beeinflusst werden kann, was eine Zuordnung der Wirkungen nahezu unmöglich macht.
Monoklonale Antikörper, die gegen phosphorylierte Epitope gerichtet sind, zeigen, außer in spezifischen Fällen, eine Begrenzung der Spezifität, die mit derjenigen vergleichbar ist, die beobachtet wird, wenn eine in vivo-Markierung vorgenommen wird. Immunologische Verfahren können phosphorylierte Proteine nur allgemein detektieren (z.B. wird ein Anti-Phosphotyrosin-Antikörper alle Proteine mit phosphoryliertem Tyrosin detektieren), und sie können nur einen stationären Zustand beschreiben, anstatt eine Echtzeit-Bestimmung von Protein-Protein-Interaktionen zu liefern. Solche Tests benötigen außerdem eine beträchtliche Arbeitskraft zur Durchführung.
Schließlich ist Hefe (Saccharomyces cerevisiae und Schizosaccharomyces pombe) als Modellorganismus für die Identifizierung der Genfunktion unter Verwendung rezessiver Mutationen genutzt worden. Es liegt an der Erforschung der Wirkungen dieser Mutationen, dass die funktionellen Spezifitäten vieler Protein-modifizierender Enzyme aufgeklärt wurden. Jedoch sind diese molekulargenetischen Techniken nicht leicht auf höhere Eukaryoten übertragbar, die diploid sind, und daher genetisch nicht so bearbeitbar wie diese niederen Eukaryoten.
Ein nicht-einschränkendes Beispiel posttranslationaler Modifikation wird von den Ras-Proteinen geliefert, die eine konservierte Gruppe von Polypeptiden darstellen, die sich an der Plasmamembran befinden, und die entweder in einem GTP-gebundenen aktiven Zustand oder in einem GDP-gebundenen inaktiven Zustand vorkommen. Diese Proteinfamilie wirkt bei Signaltransduktionswegen, die Zellwachstum und -Differenzierung regulieren. Bei höheren Eukaryoten ist Ras ein Schlüsselregulator, der die Signaltransduktion von Zelloberflächentyrosinkinase-Rezeptoren zum Zellkern über die Aktivierung der MAP-Kinase-Kaskade vermittelt. Jüngste Studien haben gezeigt, dass Ras direkt eine Serin/Threonin-Kinase, Raf-1, bindet, die ein Produkt des c-raf-1 Proto-Onkogens ist, und dass diese Assoziation zur Stimulierung der Aktivität von Raf-1 führt, um MAP-Kinase-Kinase (MEK) zu phosphorylieren.
Eine wichtige posttranslationale Modifikation ist die Addition von Ubiquitin an ausgewählte Polypeptide. Dies liefert einen Schlüsselmechanismus, um die Häufigkeit wichtiger regulatorischer Proteine zu kontrollieren, z.B. von G1 und mitotischen Zyklinen, sowie des p53-Tumorsuppressor-Proteins. Ubiquitin ist ein hochgradig konserviertes, zelluläres 76-Aminosäure-Polypeptid. Die Rolle von Ubiquitin bei der Zielsteuerung von Proteinen in den Abbau beinhaltet die spezifische Anknüpfung von Ubiquitin an die Gruppe von Lysinresten in Proteinen, die abzubauen oder von der Plasmamembran zu internalisieren sind. Das Ubiquitin-Anhängsel bestimmt das Schicksal des Proteins und resultiert in dessen selektiver Proteolyse. Jüngst ist eine Anzahl von Faktoren isoliert worden, und es ist für diese gezeigt worden, dass sie am Ubiquitinierungsprozess beteiligt sind.
Der Anfangsschritt der Anfügung von Ubiquitin an ein Protein ist die Aktivierung von Ubiquitin durch das Ubiquitin-aktivierende Enzym E1. Dies ist ein ATP-abhängiger Schritt, der in der Bildung einer Thioesterbindung zwischen dem carboxy-terminalen Glycin von Ubiquitin und dem Cysteinrest der aktiven Stelle von E1 resultiert. Aktiviertes Ubiquitin interagiert dann mit einem zweiten Faktor, dem E2-Protein. Es wird eine Thioesterbindung zwischen dem aktivierten Glycinrest von Ubiquitin und einem Cysteinrest in einem spezifischen E2-Protein ausgebildet. Die E2-Proteine repräsentieren eine Familie von nahe miteinander verwandten Proteinen, die von verschiedenen Genen codiert werden, und die Spezifität im proteolytischen Prozess verleihen. Die Ligation von Ubiquitin an Zielproteine erfolgt durch die Beteiligung eines weiteren Faktors, einer Ubiquitin-Ligase, E3, von der eine Anzahl bekannt ist (in Hefe, übersichtsartig dargestellt von Haas und Siepmann, 1997, FASEB J., 11: 1257-1268; beim Menschen, siehe Honda et al., 1997, FEBS Lett., 420: 25-27). E3 vervollständigt den letzten Schritt der Ubiquitinierung durch Anheften von Ubiquitin über die Aminogruppe an Lysinresten in Proteinen, die für den Abbau zu bestimmen sind. Darüber hinaus ist E3 in der Lage, Ubiquitin an Ubiquitinmoleküle zu addieren, die bereits an Zielproteine angeheftet sind, was so zu polyubiquitinierten Proteinen führt, die schließlich durch das Multi-Untereinheit-Proteasom abgebaut werden. Jüngste Studien bezüglich der Stellen der Proteinphosphorylierung haben eine Anzahl sequenzspezifischer Motive aufgedeckt, die, wenn sie phosphoryliert oder dephosphoryliert werden, die Interaktion mit ausgewählten Zielproteinen fördern, um entweder bei dem phosphorylierten Polypeptid oder bei dem Zielpolypeptid Aktivität zu induzieren oder zu inhibieren.
Beispielsweise, und nicht im Sinne von Ausschließlichkeit, ist für viele an der intrazellulären Signaltransduktion beteiligte Proteine gezeigt worden, dass sie eine Domäne enthalten, die eine Sequenz von etwa 100 Aminosäuren umfasst; diese Sequenz wird als Src-Homologie 2 (SH2)-Domäne bezeichnet. SH2-Domänen binden Zielpolypeptide, die phosphoryliertes Tyrosin enthalten. Diese Bindung ist abhängig von der primären Aminosäuresequenz um das Phosphotyrosin in dem Zielprotein, und mehrere Peptidsequenzen, die, wenn sie phosphoryliert sind, an eine SH2-Domäne binden, sind identifiziert worden (siehe z.B. Songyang et al., 1993, Cell, 72: 767-778). Nicht-limitierende Beispiele solcher Sequenzen beinhalten FLPVPEYINQSV, eine Sequenz, die sich in humanem ECF-Rezeptor findet, und AVGNPEYLNTVQ, eine Sequenz, die sich in humanem EGF-Rezeptor findet, von denen beide autophosphorylierte Wachstumsfaktorrezeptoren darstellen, die die biochemischen Signalwege stimulieren, die die Genexpression, die Zytoskelettarchitektur und den Zellstoffwechsel kontrollieren. Beide dieser Sequenzen interagieren mit den SH2-Domänen, die sich in Sen-5-Adapter-Protein finden.
Das Tumorsuppressor-Protein p53 wird in Reaktion auf einen DNA-Schaden durch einen Transkriptionsfaktor aktiviert. Eine DNA-abhängige Proteinkinase (DNA-PK), die in Reaktion auf Brüche in der DNA aktiviert wird, ist, so wie angenommen wird, ein Regulator der p53-Aktivität (Woo et al., 1998, Nature, 394: 700-704). Die von Woo et al. beschriebenen Daten zeigen an, dass die Phosphorylierung von p53 durch DNA-PK insofern einem doppelten Zweck dient, als die Phosphorylierung die Bindung von p53 an DNA unterstützt und außerdem die p53-Inaktivierung durch MDM2 verhindert. Eine von p53 abgeleitete Peptidsequenz, EPPLSQEAFADLWKK, wird als Phosphorylierungsstelle in p53 identifiziert, die (wenn sie phosphoyliert ist) die Interaktion von p53 mit MDM2 verhindert.
Ein Beispiel für eine Heterodimerassoziation ist in der Patentanmeldung Nr. WO 92/00388 beschrieben. Diese beschreibt eine von 3:5-cyclischem Adenosinmonophosphat (cAMP) abhängige Proteinkinase, die ein Vier-Untereinheiten-Enzym ist, das aus zwei katalytischen Polypeptiden (C) und zwei regulatorischen Polypeptiden (R) zusammengesetzt ist. In der Natur assoziieren die Polypeptide in einer Stöchiometrie von R₂C₂. In Abwesenheit von cAMP assoziieren die R- und C-Untereinheiten, und der Enzymkomplex ist inaktiv. In Anwesenheit von cAMP fungiert die R-Untereinheit als Ligand für cAMP, was in der Dissoziation des Komplexes und der Freisetzung von aktiver Proteinkinase resultiert. Die in der WO 92/00388 beschriebene Erfindung nutzt diese Assoziation durch die Addition von Fluorochromen an die R- und C-Untereinheiten.
Die Polypeptide werden mit Fluorophoren markiert (bzw. mit Tags aus diesen versehen), die unterschiedliche Anregungs-/Emissions-Wellenlängen besitzen. Die Anregung und Emission eines derartigen Fluorophors bewirkt ein zweites Anregungs-/Emissions-Ereignis bei dem zweiten Fluorophor. Durch Überwachen der Fluoreszenzemission jedes Fluorophors, die die Anwesenheit oder Abwesenheit von Fluoreszenzenergietransfer zwischen den beiden widerspiegelt, ist es möglich, die Konzentration von cAMP als Funktion des Ausmaßes der Assoziation zwischen den R- und C-Untereinheiten abzuleiten. Daher ist die natürliche Affinität der C-Untereinheit für die R-Untereinheit ausgenutzt worden, um die Konzentration eines spezifischen Metaboliten, nämlich cAMP, zu überwachen.
Der Stand der Technik lehrt, dass intakte, mit Fluorophor markierte Proteine als Reportermoleküle für die Überwachung der Ausbildung von Multi-Untereinheit-Komplexen aus Proteinmonomeren fungieren können; diese Technik beruht jedoch in jedem Fall auf der natürlichen Fähigkeit der Proteinmonomere, zu assoziieren.
Tsien et al. (WO 97/28261) lehren, dass fluoreszente Proteine mit den richtigen Emissions- und Anregungsspektren, die in enge physikalische Nähe zueinander gebracht werden, Fluoreszenzresonanzenergietransfer („FRET") zeigen können. Die Erfindung der WO 97/28261 nutzt diese Entdeckung, um Tandem-Konstrukte fluoreszenter Proteine bereitzustellen, in denen zwei fluoreszente Proteinmarkierungen, die befähigt sind, FRET zu zeigen, über einen Linker gekoppelt werden, um ein Tandemkonstrukt auszubilden. In den Tests von Tsien et al., wird Proteaseaktivität unter Verwendung von FRET überwacht, um den Abstand zwischen Fluorophoren zu bestimmen, kontrolliert über einen Peptid-Linker und nachfolgende Hydrolyse desselben. Andere Anwendungen basieren auf einer Veränderung der intrinsischen Fluoreszenz des Proteins, wie in dem Kinase-Assay der WO 98/06737.
Die vorliegende Erfindung umfasst stattdessen die Überwachung der Assoziation von Polypeptiden, wie hier beschrieben, die mit fluoreszenten Markierungen (Protein und chemisch) markiert werden. FRET, ein nicht limitierendes Beispiel eines Detektionsverfahrens zur Verwendung bei der Erfindung, zeigt die Nähe der beiden markierten Polypeptid-Bindungspartner an, wobei die markierten Partner entweder in Anwesenheit oder in Abwesenheit einer gegebenen posttranslationalen Modifikation an einer Stelle, die in der natürlichen Bindungsdomäne, und, optional, im Bindungspartner, nicht jedoch im Fluorophor, vorhanden ist, assoziieren. Dies spiegelt den Modifikationszustand eines oder beider der Bindungspartner wider, und folglich das Ausmaß an Aktivität eines Protein-modifizierenden Enzyms. Wir beschreiben außerdem Verfahren, die nicht-fluoreszente Markierungen verwenden, einschließlich, ohne hierauf beschränkt zu sein, radioaktive Markierungen. Zusätzlich beschreiben wir Verfahren, die keine detektierbaren Markierungen verwenden. Solche Verfahren beinhalten, ohne hierauf beschränkt zu sein, die Detektion der Inhibition oder Wiederherstellung der enzymatischen Aktivität, wobei die Inhibition oder Wiederherstellung aus einer Modifikations-abhängigen Bindung oder Dissoziation zwischen einer natürlichen Bindungsdomäne und einem Bindungspartner hierfür resultiert.
Es gibt in der Technik einen Bedarf für effiziente Mittel der Überwachung und/oder Modulation posttranslationaler Proteinmodifikation. Weiterhin gibt es einen Bedarf, eine Technik zu entwickeln, durch die die Anfügung/Entfernung einer modifizierenden Gruppe während Echtzeit kontinuierlich überwacht werden kann, um ein dynamisches Testsystem bereitzustellen, das auch die Fähigkeit besitzt, räumliche Informationen aufzulösen.
Die EP-A-0392808 beschreibt ein Verfahren zur Bestimmung der Anwesenheit oder des Aktivitätsniveaus eines Enzyms in einer Probe. Ein markiertes Substrat für das Enzym wird mit einer Enzym enthaltenden Probe in Kontakt gebracht, um ein Produkt herzustellen. Ein Rezeptor, der spezifisch entweder an das Substrat oder an das Produkt bindet (jedoch nicht an beide), wird dann mit dem Reaktionsmedium in Kontakt gebracht. Die Bindung zwischen den beiden wird dann durch die Anwesenheit oder Menge an Markierung in dem Komplex oder der nicht-komplexierten Einheit bestimmt. Das Substrat wird mit einem biolumineszenten Protein markiert, und die EP-A-0392808 postuliert, dass andere Typen der Markierung, die keine biolumineszenten Proteine darstellen, nicht funktionieren würden.
Wir beschreiben natürliche Bindungsdomänen, Sequenzen und Polypeptide, ebenso wie Kits, die diese Moleküle umfassen und Tests für die Enzymfunktion, in denen diese als Reportermoleküle verwendet werden. Wie hier im Bezug auf eine Polypeptidkomponente der Tests der Erfindung verwendet, bezieht sich der Begriff „natürlich" sowohl auf das Vorhandensein einer solchen Aminosäuresequenz, ob nun zusammenhängend oder nicht zusammenhängend, in der Natur, und ebenso auf die von Phosphorylierung abhängige Bindung dieser Komponente an ein zweites Polypeptid oder einen Bindungspartner, und er bezieht sich auf keine anderen Eigenschaften eines solchen Polypeptids als eine solche Bindung.
Die Erfindung nutzt eine natürliche Bindungsdomäne und einen Bindungspartner hierfür, wobei die natürliche Bindungsdomäne eine Stelle für die posttranslationale Modifikation beinhaltet und den Bindungspartner hierfür in einer Weise bindet, die von der Modifikation der Stelle abhängig ist. Wenigstens einer von den natürlichen Bindungsdomänen und den Bindungspartnern ist mit einer fluoreszenten Markierung markiert.
Die Erfindung stellt auch ein Verfahren bereit, um die Aktivität eines Enzyms zu überwachen, umfassend das Durchführen eines Detektionsschritts zur Detektion der Bindung einer natürlichen Bindungsdomäne und eines Bindungspartners hierfür als Ergebnis des Inkontaktbringens eines oder beider der natürlichen Bindungsdomäne und des Bindungspartners mit dem Enzym, wobei die natürliche Bindungsdomäne eine Stelle für die posttranslationale Modifikation beinhaltet und den Bindungspartner in einer Weise bindet, die von der Modifikation der Stelle abhängig ist, und wobei die Detektion der Bindung der natürlichen Bindungsdomäne und des Bindungspartners als Ergebnis des Inkontaktbringens die Enzymaktivität anzeigt, wobei wenigstens einer von der natürlichen Bindungsdomäne und dem Bindungspartner mit einer fluoreszenten Markierung markiert ist.
Ein gemäß der Erfindung zu messendes Enzym kann z.B. ausgewählt werden aus einer Kohlenhydrat-Transferase, Deglykosidase, einem Ubiquitin-aktivierenden Enzym E1, einem Ubiquitin-konjugierenden Enzym E2, einem Ubiquitin-konjugierenden Enzym Ubc9, einer Ubiquitin-Protein-Ligase E3, einer Poly (ADP-Ribose)-Polymerase, einer Fettacyl-Transferase, einer NAD:Arginin-ADP-Ribosyltransferase, einer Protease, einer Proteinkinase und einer Protein-Phosphatase.
Die Erfindung umfasst zusätzlich ein Verfahren zur Überwachung der Aktivität eines Enzyms, umfassend das Durchführen eines Detektionsschritts zum Detektieren der Dissoziation einer natürlichen Bindungsdomäne von einem Bindungspartner hierfür als Ergebnis des Inkontaktbringens einer oder beider der natürlichen Bindungsdomäne und des Bindungspartners mit dem Enzym, wobei die natürliche Bindungsdomäne eine Stelle für die posttranslationale Phosphorylierung beinhaltet und den Bindungspartner in einer Weise bindet, die von der Phosphorylierung der Stelle abhängig ist, und wobei die Detektion der Dissoziation der natürlichen Bindungsdomäne von dem Bindungspartner als Ergebnis des Inkontaktbringens die Enzymaktivität anzeigt, wobei wenigstens einer von der natürlichen Bindungsdomäne und dem Bindungspartner mit einer fluoreszenten Markierung markiert ist.
Ein weiterer Aspekt der Erfindung ist ein Verfahren zur Überwachung der Aktivität eines Enzyms, umfassend die Durchführung eines Detektionsschritts zum Detektieren der Dissoziation einer natürlichen Bindungsdomäne von einem Bindungspartner hierfür als Ergebnis des Inkontaktbringens eines oder beider der natürlichen Bindungsdomäne und des Bindungspartners mit dem Enzym, wobei die natürliche Bindungsdomäne eine Stelle für die posttranslationale Modifikation enthält und den Bindungspartner in einer Weise bindet, die von der Modifikation der Stelle abhängig ist, und wobei die Detektion der Dissoziation der natürlichen Bindungsdomäne von dem Bindungspartner als Ergebnis des Inkontaktbringens die Enzymaktivität anzeigt, wobei wenigstens einer von der natürlichen Bindungsdomäne und dem Bindungspartner mit einer fluoreszenten Markierung markiert ist.
Wie hier verwendet, bezieht sich der Begriff „Bindungsdomäne" in einem dreidimensionalen Sinne auf diejenigen Aminosäurereste eines ersten Polypeptids, die für die modifikationsabhängige Bindung zwischen dem ersten Polypeptid und dessen Bindungspartner erforderlich sind. Die Aminosäuren einer „Bindungsdomäne" können entweder zusammenhängend oder nicht-zusammenhängend sein und können eine Bindungstasche für die Modifikations-abhängige Bindung ausbilden. Eine Bindungsdomäne muss wenigstens 1 Aminosäure beinhalten und kann 2 oder mehr Aminosäuren beinhalten, bevorzugt wenigstens 4 Aminosäuren, die zusammenhängend oder nicht-zusammenhängend sind, jedoch notwendig sind für die Modifikations-abhängige Bindung an den Bindungspartner. Eine Bindungsdomäne wird kein natürliches Polypeptid voller Länge beinhalten, sondern wird eine Untergruppe der Aminosäuren eines Polypeptids voller Länge beinhalten, wobei die Untergruppe eine Aminosäurezahl beinhalten kann, die so hoch sein kann wie eines weniger als die Länge eines gegebenen natürlichen Polypeptids voller Länge.
Eine Bindungsdomäne, die für die Erfindung von Nutzen ist, ist eine „natürliche Bindungsdomäne" (d.h. eine Bindungsdomäne, die Modifikations-abhängige Bindung an einen Bindungspartner in der Natur zeigt). Eine natürliche Bindungsdomäne von Nutzen für die Erfindung kann isoliert werden oder kann im Kontext eines größeren Polypeptidmoleküls vorhanden sein (d.h. einem, das andere bzw. weitere Aminosäuren enthält als diejenigen der natürlichen Bindungsdomäne), wobei das Molekül entweder natürlich vorkommend oder rekombinant sein kann, und, im Falle des letztgenannten, entweder natürliche oder nicht-natürliche Aminosäuresequenzen außerhalb der Bindungsdomäne umfassen kann.
Wie hier im Bezug auf die Modifikation eines Polypeptids verwendet, beziehen sich die Begriffe „Stelle" und „Stelle, hinreichend für die Addition von" auf eine Aminosäuresequenz einer natürlichen Bindungsdomäne oder eines Bindungspartners, die durch ein modifizierendes Enzym erkannt wird (d.h. ein Signal für dieses darstellt), zum Zwecke der posttranslationalen Modifikation (d.h. der Anfügung oder Entfernung einer „Gruppierung", wie unten definiert) des Polypeptids oder eines Teils hiervon. Eine „Stelle" bezieht sich zusätzlich auf eine einzelne Aminosäure, die modifiziert wird. Es wird erwogen, dass eine Stelle eine kleine Anzahl von Aminosäuren umfassen kann, lediglich eine, jedoch typischer Weise 2 bis 10, seltener bis zu 30 Aminosäuren, und weiterhin, dass eine Stelle weniger als die Gesamtzahl der Aminosäuren, die in dem Polypeptid vorhanden sind, umfasst.
Bei einem Enzymtest der Erfindung kann eine „Stelle" für die posttranslationale Modifikation an einem von beiden oder beiden einer natürlichen Bindungsdomäne und deren Bindungspartner vorhanden sein. Wenn solche Stellen sowohl an der natürlichen Bindungsdomäne als auch am Bindungspartner vorhanden sind, kann die Bindung zwischen der natürlichen Bindungsdomäne und deren Bindungspartner von dem Modifikationszustand einer der beiden oder beider Stellen abhängig sein. Wenn eine einzige Polypeptidkette die natürliche Bindungsdomäne und deren Bindungspartner umfasst (oder zwei natürliche Bindungsdomänen), so wird der Zustand der posttranslationalen Modifikation einer oder beider Stellen bestimmen, ob eine Bindung zwischen den beiden Domänen stattfindet.
Wie hier verwendet, bezieht sich der Begriff „Modifikation" oder „posttranslationale Modifikation" auf die Anfügung oder Entfernung einer chemischen „Gruppierung", wie hier beschrieben, an oder von einer Stelle an der Polypeptidkette und bezieht sich nicht auf andere posttranslationale Ereignisse, die keine Anfügung oder Entfernung einer solchen Gruppierung, wie hier beschrieben, beinhalten; er beinhaltet daher keine einfache Spaltung des Reportermolekül-Polypeptidrückgrats durch Hydrolyse einer Peptidbindung, beinhaltet jedoch die Hydrolyse einer Isopeptidbindung (z.B. bei der Entfernung von Ubiquitin).
Wie hier miteinander austauschbar verwendet, beziehen sich die Begriffe „Gruppierung" und „Gruppe" auf eine der posttranslational angefügten oder entfernten Gruppen, auf die hier Bezug genommen wird, d.h. auf eine von einer Ubiquitingruppierung, einer Glykosylgruppierung, einer Fettacylgruppierung, einer Sentringruppierung, einer Phosphatgruppierung oder einer ADP-Ribosyl-Gruppierung.
Wie hier verwendet, bezieht sich der Begriff „Bindungspartner" auf ein Polypeptid oder Fragment hiervon (ein Peptid), das an eine Bindungsdomäne, eine Bindungssequenz oder ein Bindungspolypeptid, wie hier definiert, bindet, auf eine Weise, die abhängig ist vom Modifikationszustand einer Stelle für die posttranslationale Modifikation, die zumindest auf der Bindungsdomäne, der Sequenz oder dem Polypeptid vorhanden ist. Der Bindungspartner selbst kann optional eine solche Stelle umfassen, und die Bindung zwischen der Bindungsdomäne, dem Fragment oder Polypeptid mit dessen entsprechendem Bindungspartner kann optional von der Modifikation dieser Stelle abhängen. Die Bindung zwischen der natürlichen Bindungsdomäne und dem Bindungspartner oder zwischen zwei natürlichen Bindungsdomänen kann vom Phosphorylierungs- oder Dephosphorylierungszustand entweder einer oder beider Stellen abhängen. Wenn eine einzige Polypeptidkette die natürliche Bindungsdomäne und den Bindungspartner (oder zwei natürliche Bindungsdomänen) umfasst, so wird der Zustand der Phosphorylierung oder Dephosphorylierung einer oder beider Stellen bestimmen, ob eine Bindung stattfindet.
Eine Stelle, die für die Addition oder Entfernung einer Phosphatgruppierung geeignet ist, ist in einer natürlichen Bindungsdomäne oder in deren Bindungspartner an einer Position in der Weise enthalten, dass die Ausbildung eines Komplexes zwischen der natürlichen Bindungsdomäne und deren Bindungspartner von der Anwesenheit oder Abwesenheit der Phosphatgruppierung abhängt; diese Position überlappt dabei bevorzugt nicht mit einer Aminosäure, die Teil eines Fluoreszenz-Tags oder Quenchers ist.
Entsprechend kann die Aminosäure, die eine Phosphatgruppierung beinhaltet, an beliebiger Stelle in der natürlichen Bindungsdomäne positioniert sein, sodass die Bindung der natürlichen Bindungsdomäne und deren Bindungspartner abhängig ist von der Anwesenheit oder Abwesenheit der Phosphatgruppierung.
Wie hier verwendet, beziehen sich „Phosphorylierung" und „Dephosphorylierung" auf die Addition bzw. Entfernung einer Phosphatgruppierung an/von einem Polypeptid. Wie hier verwendet, bezieht sich der Begriff „posttranslationale Modifikation" auf die Anfügung oder Entfernung einer chemischen Gruppierung, beinhaltet jedoch nicht die einfache Spaltung des Reportermolekül-Polypeptidrückgrats durch Hydrolyse einer Peptidbindung.
Wie hier verwendet, beinhaltet der Begriff „Gruppierung" eine posttranslational angefügte oder entfernte Phosphat (PO₄)-Gruppe; die Begriffe „Gruppierung" und „Gruppe" werden miteinander austauschbar verwendet.
Wie hier verwendet, bezieht sich der Begriff „Bindungspartner" auf ein Polypeptid oder Fragment hiervon (ein Peptid), das an eine Bindungsdomäne, eine Bindungssequenz oder ein Bindungspolypeptid, wie hier definiert, bindet, auf eine Weise, die abhängig ist vom Phosphorylierungszustand einer Stelle für die Phosphorylierung oder Dephosphorylierung, die zumindest auf der Bindungsdomäne, der Sequenz oder dem Polypeptid vorhanden ist. Der Bindungspartner selbst kann optional eine solche Stelle umfassen, und die Bindung zwischen der Bindungsdomäne, dem Fragment oder Polypeptid mit dessen entsprechendem Bindungspartner kann optional von der Modifikation dieser Stelle abhängen. Ein Bindungspartner muss nicht notwendigerweise eine Stelle für die posttranslationale Modifikation enthalten, wenn die Anwesenheit einer solchen Stelle hierin nicht erforderlich ist für die Modifikations-abhängige Assoziation zwischen ihm und der Bindungsdomäne, der Bindungssequenz oder dem Bindungspolypeptid. Bindungspartner zur Verwendung bei der Erfindung sind solche, die sich in der Natur finden und eine natürliche Modifikations-abhängige Bindung an eine natürliche Bindungsdomäne, Bindungssequenz oder ein Bindungspolypeptid der Erfindung, wie hier definiert, zeigen. Bei einer Ausführungsform der Erfindung ist ein Bindungspartner kürzer (d.h. um wenigstens eine N-terminale oder C-terminale Aminosäure) als das natürliche Polypeptid voller Länge.
Wie hier verwendet, bezieht sich der Begriff „assoziiert" oder „bindet" auf eine natürliche Bindungsdomäne, wie hier beschrieben, und deren Bindungspartner, mit einer Bindungskonstante, die hinreichend stark ist, um die Detektion der Bindung durch FRET oder andere Detektionsmittel zu erlauben, wobei die Partner miteinander in physikalischem Kontakt stehen und eine Dissoziationskonstante (Kd) von etwa 10 μM oder weniger besitzen. Die Kontaktregion kann die Gesamtheit oder Teile der beiden Moleküle beinhalten. Daher beziehen sich die Begriffe „weitestgehend dissoziiert" und „dissoziiert" oder „weitestgehend ungebunden" und „ungebunden" auf die Abwesenheit oder den Verlust von Kontakt zwischen solchen Regionen, sodass die Bindungskonstante um ein Ausmaß reduziert wird, das im Vergleich zum gebundenen Zustand eine erkennbare Veränderung bei einem Signal erzeugt, einschließlich einer völligen Abwesenheit oder einem vollständigen Verlust von Kontakt, sodass die Proteine vollständig getrennt werden, ebenso wie einer teilweisen Abwesenheit oder einem teilweisen Verlust von Kontakt, sodass die Proteinkörper sich nicht länger in enger Nähe zueinander befinden, jedoch nach wie vor aneinandergeheftet oder anderweitig lose verbunden sein können und somit eine Dissoziationskonstante (Kd) von größer 10 μM besitzen. In vielen Fällen wird sich die Kd im mM-Bereich bewegen. Die Begriffe „Komplex", „Dimer", „Multimer" und „Oligomer", wie hier verwendet, beziehen sich auf die natürliche Bindungsdomäne und deren Bindungspartner im assoziierten oder gebundenen Zustand. Mehr als ein Molekül jedes der zwei oder mehr Proteine kann in einem Komplex, Dimer, Multimer oder Oligomer gemäß den Verfahren der Erfindung vorhanden sein.
Wie hier im Bezug auf eine natürliche Bindungsdomäne oder andere Polypeptide verwendet, bezieht sich der Begriff „isoliert" auf ein Molekül oder eine Population von Molekülen, die weitgehend rein ist (d.h. frei von kontaminierenden Molekülen andersartiger Aminosäuresequenz).
Wie hier im Bezug auf die Reinheit eines Moleküls oder einer Population hiervon verwendet, bezieht sich der Begriff „weitestgehend" auf das, was wenigstens 50%, bevorzugt 60-75%, bevorzugter 80-95%, und, am bevorzugtesten, 98-100% rein bedeutet.
„Natürlich vorkommend", wie hier verwendet, und wie angewendet auf ein Polypeptid oder Polynukleotid, bezieht sich auf die Tatsache, dass das Polypeptid oder Polynukleotid in der Natur zu finden ist. Ein solches Beispiel ist eine Polypeptid- oder Polynukleotidsequenz, die in einem Organismus (einschließlich eines Virus) vorkommt, der aus einer Quelle in der Natur isoliert werden kann.
Der Begriff „synthetisch", wie er hier verwendet wird, ist definiert im Hinblick auf jedwede Aminosäure- oder Nukleinsäuresequenz, die über chemische Synthese produziert wird.
Bei einem Assay der Erfindung ist die posttranslationale Modifikation reversibel, sodass sich wiederholende Zyklen der Addition und Entfernung einer modifizierenden Gruppierung beobachtet werden können, obwohl solche Zyklen bei einer lebenden, in der Natur zu findenden Zelle möglicherweise nicht auftreten.
Ein Vorteil der Assays der Erfindung besteht darin, dass diese, wenn gewünscht, in „Echtzeit" durchgeführt werden können. Wie hier im Bezug auf die Überwachung, die Messungen oder Beobachtungen bei Tests der Erfindung verwendet, bezieht sich der Begriff „Echtzeit" auf das, was gleichzeitig mit den überwachten, gemessenen oder beobachteten Ereignissen durchgeführt wird, und was dem Durchführenden ein Ergebnis der Überwachung, Messung oder Beobachtung zeitgleich oder faktisch zeitgleich mit dem Auftreten eines überwachten, gemessenen oder beobachteten Ereignisses liefert. Somit beinhaltet ein Echtzeit-Test oder eine Echtzeit-Messung nicht nur das gemessene und quantifizierte Ergebnis, wie etwa Fluoreszenz, sondern drückt dies in Echtzeit aus, d.h. in Stunden, Minuten, Sekunden, Millisekunden, Nanosekunden, Picosekunden etc. Kürze Zeiten übersteigen die Fähigkeiten der Instrumentenausstattung; weiterhin wird die Auflösung auch begrenzt durch die Faltungs- und Bindungs-Kinetiken der Polypeptide.
Wie hier verwendet, bezieht sich der Begriff „Bindungssequenz" auf denjenigen Teil eines Polypeptids, der wenigstens 4, jedoch bis zu 8, 10, 100 oder sogar 1000 zusammenhängende (d.h. kovalent durch Peptidbindungen verbundene) Aminosäurereste umfasst, der hinreichend für die Modifikations-abhängige Bindung an einen Bindungspartner ist. Eine Bindungssequenz wird kein natürliches Polypeptid voller Länge beinhalten, sondern eine Untergruppe der Aminosäuren eines Polypeptids voller Länge, wobei die Untergruppe eine Anzahl von Aminosäuren beinhalten kann, die so hoch ist, dass sie nur um eines kleiner ist als der Länge eines gegebenen natürlichen Polypeptids voller Länge.
Wie hier im Bezug auf die Bindungssequenzen verwendet, die für die Erfindung von Nutzen sind, bezieht sich der Begriff „natürliche Bindungssequenz" auf eine Bindungssequenz, wie oben definiert, die aus einer Aminosäuresequenz besteht, die sich in der Natur findet, und die für die Bindung an einen Bindungspartner in natürlicher Weise abhängig ist vom Modifikationszustand einer in ihr befindlichen Stelle für die posttranslationale Modifikation. Eine „natürliche Bindungssequenz" kann entweder isoliert oder im Kontext eines größeren Polypeptidmoleküls vorhanden sein, wobei dieses Molekül natürlich vorkommend oder rekombinant sein kann. Wenn vorhanden, können die Aminosäuren außerhalb der Bindungssequenz entweder natürlich sein, d.h. von der gleichen Polypeptidsequenz sein wie diejenigen, aus denen das Fragment stammt, oder nicht-natürlich sein, d.h. aus einem anderen (abweichenden) Polypeptid oder aus einer Sequenz, die nicht von irgendeinem bekannten Polypeptid abgeleitet ist, bestehen. Bei den Tests der Erfindung können eine Bindungssequenz und deren Bindungspartner entweder auf zwei verschiedenen Polypeptidketten oder auf einer einzigen Polypeptidkette vorliegen.
Wie hier verwendet, bezieht sich der Begriff „Bindungspolypeptid" auf ein Molekül, das multiple Bindungssequenzen, wie oben definiert, umfasst. Ein Bindungspolypeptid zur Verwendung bei der Erfindung ist ein „natürliches Bindungspolypeptid", bei dem die zusammengesetzten Bindungssequenzen natürliche Bindungssequenzen sind, wie oben definiert (z.B. da, wo die Bindungssequenzen von einem einzigen, natürlich vorkommenden Polypeptidmolekül abgeleitet sind), und sowohl notwendig als auch, in Kombination, hinreichend sind, um die vom Modifikationszustand abhängige Bindung des Bindungspolypeptids an dessen Bindungspartner, wie oben definiert, zu erlauben, wobei die Sequenzen des Bindungspolypeptids entweder zusammenhängend oder nicht-zusammenhängend sind. Wie hier im Bezug auf die zusammengesetzten Bindungssequenzen eines Bindungspolypeptids verwendet, bezieht sich der Begriff „nicht-zusammenhängend" auf Bindungssequenzen, die, wie hier definiert, durch dazwischen liegende, natürlich vorkommende oder nicht-natürliche Aminosäuresequenzen oder durch andere chemische oder biologische Linkermoleküle, wie die in der Technik Bekannten, verbunden werden. Die Aminosäuren eines Polypeptids, die nicht signifikant zu der vom Modifikationszustand abhängigen Bindung dieses Polypeptids an seinen Bindungspartner beitragen, können solche Aminosäuren sein, die natürlich vorkommen und die Bindungssequenzen in einem Bindungspolypeptid verbinden, oder sie können von einem andersartigen natürlichen Polypeptid stammen oder in der Natur vollständig unbekannt sein. Bei den Assays der Erfindung können ein Bindungspolypeptid und dessen Bindungspartner (das selber eine Bindungsdomäne, Bindungssequenz oder ein Bindungspolypeptid, wie hier definiert, sein kann) auf zwei verschiedenen Polypeptidketten oder auf einer einzigen Polypeptidkette vorkommen. Gemäß der Erfindung ist ein natürliches Bindungspolypeptid, wie etwa ein Polypeptid gemäß obiger Definition, keine natürliche Polypeptidkette voller Länge, sondern umfasst stattdessen eine Untergruppe, umfassend bis zu einem weniger als der Gesamtzahl an Aminosäuren in einer natürlichen Polypeptidkette.
Wie hier verwendet, beziehen sich die Begriffe „Polypeptid" und „Peptid" auf ein Polymer, bei dem die Monomere Aminosäuren sind und durch Peptid- oder Disulfidbindungen miteinander verbunden sind. Die Begriffe Untereinheit und Domäne können sich auch auf Polypeptide und Peptide beziehen, die biologische Funktion besitzen. Ein für die Erfindung nützliches Peptid wird wenigstens eine Bindungsbefähigung besitzen, d.h. im Hinblick auf die Bindung als oder an ein(en) Bindungspartner, und es kann außerdem eine weitere biologische Funktion haben, die eine biologische Funktion eines Proteins oder einer Domäne ist, von der die Peptidsequenz abgeleitet ist. „Polypeptid" bezieht sich auf eine natürlich vorkommende Aminosäurekette, umfassend eine Untergruppe der Aminosäuren eines Proteins voller Länge, wobei die Untergruppe wenigstens eine Aminosäure weniger umfasst als das Protein voller Länge, oder ein „Fragment hiervon" oder ein „Peptid", wie etwa eine ausgewählte Region des Polypeptids, die von Interesse bei einem Bindungstest ist, und für die ein Bindungspartner bekannt oder ermittelbar ist. „Fragment hiervon" bezieht sich somit auf eine Aminosäuresequenz, die einen Teil eines Polypeptids voller Länge darstellt, zwischen etwa 8 und etwa 1000 Aminosäuren in der Länge, bevorzugt von etwa 8 bis etwa 300, bevorzugter von etwa 8 bis etwa 200 Aminosäuren, und noch bevorzugter von etwa 10 bis etwa 50 oder 100 Aminosäuren in der Länge. „Peptid" bezieht sich auf eine kurze Aminosäuresequenz, die 10-40 Aminosäuren lang ist, bevorzugt 10-35 Aminosäuren. Zusätzlich können nicht natürliche Aminosäuren, z.B. -Alanin, Phenylglycin und Homoarginin einbezogen sein. Gebräuchlich anzutreffende Aminosäuren, die nicht gencodiert sind, können ebenfalls bei der vorliegenden Erfindung verwendet werden. Alle bei der vorliegenden Erfindung verwendeten Aminosäuren können entweder optische D- oder L-Isomere sein. Die L-Isomere sind bevorzugt. Zusätzlich können auch andere Peptidomimetika nützlich sein, z.B. in den Linkersequenzen von Polypeptiden der vorliegenden Erfindung (siehe Spatola, 1983, in Chemistry and Biochemistry of Aminoacids, Peptides and Proteins, Weinstein, Herausgeber Marcel Dekker, New York, S. 267).
Wie hier verwendet, beziehen sich die Begriffe „Protein", „Untereinheit" und „Domäne" auf eine lineare Sequenz von Aminosäuren, die biologische Funktion zeigt. Diese lineare Sequenz beinhaltet keine Aminosäuresequenzen voller Länge (z.B. diejenigen, die von einem Gen voller Länge oder von einem Polynukleotid voller Länge codiert werden), beinhaltet jedoch einen Teil oder ein Fragment hiervon, mit der Maßgabe, dass die biologische Funktion von diesem Teilstück oder Fragment aufrechterhalten bleibt. Die Begriffe „Untereinheit" und „Domäne" können sich außerdem auf Polypeptide und Peptide mit biologischer Funktion beziehen. Ein für die Erfindung nützliches Peptid wird wenigstens eine Bindungsbefähigung besitzen, d.h. im Hinblick auf die Bindung als oder an ein(en) Bindungspartner, und es kann außerdem eine weitere biologische Funktion haben, die eine biologische Funktion eines Proteins oder einer Domäne ist, von der die Peptidsequenz abgeleitet ist.
„Polynukleotid" bezieht sich auf eine polymere Form von Nukleotiden von wenigsten 10 Basen Länge und bis zu 1.000 Basen oder sogar mehr, entweder Ribonukleotide oder Desoxyribonukleotide oder eine modifizierte Form eines der Nukleotidtypen. Der Begriff beinhaltet einzel- und doppelsträngige Formen von DNA.
Bevorzugt ist es im Hinblick auf die natürliche Bindungsdomäne und/oder den Bindungspartner hierfür so, dass die Stelle eine Sequenz umfasst, die die Modifikation durch eines oder mehrere der folgenden Enzyme steuert: eine Kohlenhydrat-Transferase (z.B. eine UDP-N-Actylglucosamin- Dolichyl-Phosphat-N-Acetylglucosamin-Phosphotransferase oder eine O-GlcNAc-Transferase), ein Ubiquitin-aktivierendes Enzym E1, ein Ubiquitin-konjugierendes Enzym E2, ein Ubiquitin-konjugierendes Enzym Ubc9, eine Ubiquitin-Protein-Ligase E3, eine Poly(ADP-Ribose)-Polymerase, eine Fettacyl-Transferase (z.B. eine Glycylpeptid-N-tetradecanoyltransferase (Peptid-N-Myristoyltransferase)) und eine NAD:Arginin-ADP-Ribosyltransferase.
Es ist bevorzugt, dass die Phosphorylierung der Stelle die Bindung der natürlichen Bindungsdomäne an den Bindungspartner verhindert.
Wie hier verwendet, bezieht sich der Begriff „verhindert" auf eine Verringerung von wenigstens 10%, bevorzugt 20-40%, bevorzugter 50-75%, und, am bevorzugtesten, von 80-100% der Bindung der natürlichen Bindungsdomäne an den Bindungspartner hierfür.
Es ist zusätzlich bevorzugt, dass die Stelle die Anfügung einer chemischen Gruppierung erlaubt, die folgendes sein kann: eine Ubiquitingruppierung, eine Glykosylgruppierung, eine ADP-Ribosyl-Gruppierung, eine Phosphatgruppierung, eine Fettsäuregruppierung und eine Sentringruppierung, und dass die Anheftung die Bindung der natürlichen Bindungsdomäne an den Bindungspartner verhindert.
Wie hier verwendet, bezieht sich der Begriff „verhindert Bindung" oder „verhindert Assoziation" auf die Fähigkeit von wenigstens einer aus einer Ubiquitingruppierung, einer Glykosylgruppierung, einer Fettacylgruppierung, einer Sentringruppierung, einer Phosphatgruppierung oder einer ADP-Ribosyl-Gruppierung, die Assoziation, wie oben definiert, einer natürlichen Bindungsdomäne und eines Bindungspartners hiervon um wenigstens 10%, bevorzugt um 25-50%, hochgradig bevorzugt um 75-90% und, am bevorzugtesten, um 95-100% in Relation zu der in Abwesenheit einer solchen Modifikation unter den gleichen Versuchsbedingungen beobachteten Assoziation zu inhibieren.
Gemäß einer weiteren bevorzugten Ausführungsform erlaubt die Stelle die Addition einer chemischen Gruppierung, die folgendes sein kann: eine Ubiquitingruppierung, eine Glykosylgruppierung, eine ADP-Ribosylgruppierung, eine Phosphatgruppierung, eine Fettsäuregruppierung und eine Sentringruppierung, wobei die Addition die Bindung der natürlichen Bindungsdomäne an den Bindungspartner unterstützt.
Wie hier verwendet, bezieht sich der Begriff „unterstützt Bindung" auf das, was einen Anstieg der Bindung der natürlichen Bindungsdomäne und deren Bindungspartner wenigstens zweifach, bevorzugt 10-20fach, hochgradig bevorzugt 50-100fach, bevorzugter 200-1000fach, und, am bevorzugtesten, 200-10.000fach, verursacht.
Vorzugsweise erlaubt die Stelle die Entfernung einer chemischen Gruppierung, die folgendes sein kann: eine Ubiquitingruppierung, eine Glykosylgruppierung, eine ADP-Ribosylgruppierung, eine Phosphatgruppierung, eine Fettsäuregruppierung und eine Sentringruppierung, wobei die Entfernung die Bindung der natürlichen Bindungsdomäne an den Bindungspartner verhindert.
Es ist zusätzlich bevorzugt, dass die Stelle die Entfernung einer chemischen Gruppierung erlaubt, die folgendes sein kann: eine Ubiquitingruppierung, eine Glykosylgruppierung, eine ADP-Ribosylgruppierung, eine Fettsäuregruppierung, eine Phosphatgruppierung und eine Sentringruppierung, und dass die Entfernung die Bindung der natürlichen Bindungsdomäne an den Bindungspartner unterstützt.
Der natürliche Bindungspartner und/oder die Bindungsdomäne können mehr als eine Stelle, wie sie oben dargestellt ist, umfassen. Somit können der natürliche Bindungspartner und/oder die Bindungsdomäne beispielsweise zwei oder drei Stellen umfassen, die posttranslationaler Modifikation unterworfen sind.
Wenigstens einer von der natürlichen Bindungsdomäne und dem Bindungspartner umfasst eine detektierbare Markierung, die eine fluoreszente Markierung ist. Wenigstens einer, bevorzugt beide, von der Bindungsdomäne und dem Bindungspartner umfasst eine fluoreszente Markierung.
Es ist bevorzugt, dass einer der natürlichen Bindungsdomäne und des Bindungspartners hiervon einen Quencher für die detektierbare Markierung umfasst.
Eine „fluoreszente Markierung", ein „Fluoreszenz-Tag", oder eine „fluoreszente Gruppe" beziehen sich entweder auf einen Fluorophor oder ein fluoreszentes Protein oder ein fluoreszentes Fragment hiervon. „Fluoreszentes Protein" bezieht sich auf jedwedes Protein, das fluoresziert, wenn es mittels geeigneter elektromagnetischer Bestrahlung angeregt wird. Dies beinhaltet ein Protein, dessen Aminosäuresequenz entweder natürlich oder künstlich hergestellt ist. Ein „fluoreszentes Protein" ist ein fluoreszentes Protein voller Länge oder ein fluoreszentes Fragment hiervon. Im selben Zusammenhang bezieht sich der Begriff „Linker" auf das, was sowohl an Donor- als auch an Akzeptor-Proteinmoleküle gekoppelt wird, wie etwa eine Aminosäuresequenz, die zwei natürliche Bindungsdomänen verbindet, oder eine Disulfidbindung zwischen zwei Polypeptiden.
Es wird erwogen, dass im Hinblick auf die bei FRET verwendeten Fluoreszenzmarkierungen die Reportermarkierungen so ausgewählt werden, dass das Emissionswellenlängenspektrum einer Markierung („Donor") innerhalb des Anregungswellenlängenspektrums der anderen Markierung („Akzeptor") liegt. Im Hinblick auf eine Fluoreszenzmarkierung und einen Quencher, die bei einer Einzelmarkierungs-Detektionsprozedur in einem Assay der Erfindung verwendet werden, wird zusätzlich erwogen, dass der Fluorophor und der Quencher so ausgewählt werden, dass das Emissionswellenlängenspektrum des Fluorophors innerhalb des Absorptionsspektrums des Quenchers liegt, sodass, wenn der verwendete Fluorophor und der verwendete Quencher durch die Bindung der natürlichen Bindungsdomäne, Bindungssequenz oder des Bindungspolypeptids, auf dem eines dieser Elemente vorliegt, mit dem Bindungspartner, der das Gegenstück enthält, in enge Nähe gebracht werden, die Detektion des vom Fluorophor emittierten Fluoreszenzsignals um wenigstens 10%, bevorzugt 20-50%, bevorzugter 70-90% und, am bevorzugtesten, um 95-100%, reduziert wird. Ein typischer Quencher reduziert die Detektion eines Fluoreszenzsignals um etwa 80%.
Wir beschreiben weiterhin ein Kit, umfassend eine natürliche Bindungsdomäne und einen Bindungspartner hierfür, wobei die natürliche Bindungsdomäne eine Stelle für die posttranslationale Modifikation beinhaltet und den Bindungspartner in einer Weise bindet, die abhängig ist von der Modifikation der Stelle, sowie Verpackungsmaterial hierfür.
Es ist bevorzugt, dass das Kit weiterhin einen Puffer umfasst, der die Modifikations-abhängige Bindung der natürlichen Bindungsdomäne und des Bindungspartners erlaubt.
Wie hier verwendet, bezieht sich der Begriff „Puffer" auf ein Medium, das die Aktivität des bei einem Assay der Erfindung verwendeten Protein-modifizierenden Enzyms erlaubt, und dieser ist typischerweise eine Lösung mit niedriger Ionenstärke oder eine andere biokompatible Lösung (z.B. Wasser, das eines oder mehrere von physiologischem Salz, wie etwa einfache Saline, und/oder einen schwachen Puffer, wie etwa Tris oder Phosphat, oder andere hier im Folgenden Beschriebene enthält), ein Zellkulturmedium, von dem zahlreiche in der Technik bekannt sind, oder ein vollständiges oder fraktioniertes Zelllysat. Ein solcher Puffer erlaubt die Dimerisierung einer nicht-ubiquitinierten und/oder nicht-prenylierten und/oder nicht-sentrinierten und/oder nicht-ADP-ribosylierten und/oder nicht-glykosylierten und/oder nicht-phosphorylierten natürlichen Bindungsdomäne und eines Bindungspartners hierfür, und er inhibiert bevorzugt den Abbau und erhält die biologische Aktivität der Reaktionskomponenten aufrecht. Inhibitoren des Abbaus, wie etwa Protease-Inhibitoren (z.B. Pepstatin, Leupeptin, etc.) und Nuklease-Inhibitoren (z.B. DEPC) sind in der Technik wohlbekannt. Schließlich kann ein Puffer eine stabilisierende Substanz, wie etwa Glycerol, Sucrose oder Polyethylenglykol, enthalten.
Wie hier verwendet, bezieht sich der Begriff „physiologischer Puffer" auf ein flüssiges Medium, das das Salzgleichgewicht und den pH des Zytoplasmas einer Zelle oder des extrazellulären Milieus imitiert, sodass die posttranslationalen Proteinmodifikationsreaktionen und die Protein-Protein-Bindung in dem Puffer stattfinden können, als wäre es in vivo.
Bevorzugt erlaubt der Puffer zusätzlich die Modifikation der Stelle für die Proteinmodifizierung durch eines oder mehrere der folgenden Enzyme: eine Kinase, eine Phosphatase, eine Kohlenhydrat-Transferase (z.B. eine UDP-N-Acetylglucosamin-dolichyl-phosphat-N-acetylglucosamin-Phosphotransferase oder eine O-GlcNAc-Transferase), ein Ubiquitin-aktivierendes Enzym E1, ein Ubiquitin-konjugierendes Enzym E2, ein Ubiquitin-konjugierendes Enzym Ubc9, eine Ubiquitin-Protein-Ligase E3, eine poly-(ADP-Ribose)-Polymerase, eine Fettacyl-Transferase (z.B. eine Glycylpeptid-N-tetradecanoyltransferase (Peptid-N-Myristoyltransferase)) und eine NAD:Arginin-ADP-Ribosyltransferase.
Es ist bevorzugt, dass das Kit weiterhin eines oder mehrere der folgenden Enzyme enthält:
Kohlenhydrat-Transferase (z.B. eine UDP-N-Acetylglucosamin-Dolichyl-phosphat-N-acetylglucosamin-Phosphotransferase oder eine O-GlcNAc-Transferase), eine Kinase, eine Phosphatase, ein Ubiquitin-aktivierendes Enzym E1, ein Ubiquitin-konjugierendes Enzym E2, ein Ubiquitin-konjugierendes Enzym Ubc9, eine Ubiquitin-Protein-Ligase E3, eine poly-(ADP-Ribose)-Polymerase, eine Fettacyl-Transferase (z.B. eine Glycylpeptid-N-tetradecanoyltransferase (Peptid-N-Myristoyltransferase)) und eine NAD:Arginin-ADP-Ribosyltransferase.
Es ist zusätzlich bevorzugt, dass das Kit weiterhin ein Substrat für das Enzym umfasst, das folgendes sein kann: Ubiquitin, Sentrin, Nicotinamid-Adenin-Dinukleotid (NAD⁺), Uridin-diphosphat-N-acetylglucosamin-dolichyl-phosphat (UDP-N-Acetylglucosamin-dolichyl-phosphat), Palmityl-CoA, Myristoyl-CoA, UDP-N-Acetylglucosamin oder MgATP.
Es wird erwogen, dass wenigstens ein Teil eines Substrats eines Enzyms, das bei einem Assay der Erfindung von Nutzen ist, auf eine Modifikationsstelle auf einem isolierten Polypeptid übertragen wird. Wie hier verwendet, bezieht sich der Begriff „wenigstens ein Teil eines Substrats" auf einen Teilabschnitt (z.B. ein Fragment einer Aminosäuresequenz, einer Gruppierung oder Gruppe, wie hier definiert), der weniger als die Gesamtheit des Substrats für das Enzym umfasst, wobei die Übertragung dieses Teilbereichs auf eine Modifikationsstelle auf einem isolierten Polypeptid, beide, wie oben definiert, durch das Enzym katalysiert wird.
Es ist zusätzlich bevorzugt, dass das Kit weiterhin einen Co-Faktor für eine oder beide von Kinase oder Phosphatase umfasst. Cofaktoren von Nutzen für die Erfindung beinhalten, ohne hierauf beschränkt zu sein, cAMP, Phosphatidylserin, Diolein, und Mn²⁺. Bevorzugt umfasst das Kit weiterhin einen Cofaktor für das Enzym.
Ein Enzym (z.B. eine Proteinkinase oder -Phosphatase) von Nutzen für die Erfindung kann natürlich oder rekombinant sein, oder es kann alternativ chemisch synthetisiert werden. Wenn es entweder natürlich oder rekombinant ist, kann es weitgehend rein sein (d.h. in einer Molekülpopulation vorhanden sein, in der es zu wenigstens 50% homogen vorliegt), partiell aufgereinigt sein (d.h. wenigstens 1% unter den Molekülen darstellen, die in einer Fraktion eines Zelllysats vorhanden sind), oder es kann in einer biologischen Rohprobe vorliegen.
Wie hier verwendet, bezieht sich der Begriff „Probe" auf eine Ansammlung anorganischer, organischer oder biochemischer Moleküle, die sich entweder in der Natur findet (z.B. in einem biologischen oder anderen Präparat) oder in einer künstlich hergestellten Ansammlung, wie etwa Mitteln, die gefunden und/oder im Labor gemischt werden können. Eine solche Probe kann entweder heterogen oder homogen sein.
Wie hier verwendet, beziehen sich die austauschbaren Begriffe „biologisches Präparat" und „biologische Probe" auf einen Gesamtorganismus oder eine Untergruppe von dessen Geweben, Zellen oder Komponententeilen (z.B. Körperflüssigkeiten, einschließlich, ohne hierauf beschränkt zu sein, Blut, Schleim, Lymphflüssigkeit, Synovialflüssigkeit, Cerebrospinalflüssigkeit, Speichel, Amnionflüssigkeit, Nabelschnurblut, Urin, Vaginalflüssigkeit und Sperma). „Biologische Probe" und „biologisches Präparat" beziehen sich weiterhin auf ein Homogenisat, Lysat oder einen Extrakt, der aus einem Gesamtorganismus oder einer Untergruppe von dessen Geweben, Zellen oder Komponententeilen präpariert wurde, oder eine Fraktion oder einen Teil hiervon. Schließlich bezieht sich „biologische Probe" auf ein Medium, wie etwa eine Nährbrühe oder ein Gel, in dem ein Organismus vermehrt worden ist, und das zelluläre Bestandteile, wie etwa Proteine oder Nukleinsäuremoleküle, enthält.
Wie hier verwendet, bezieht sich der Begriff „Organismus" auf alle zellulären Lebensformen, wie etwa Prokaryoten und Eukaryoten, ebenso wie auf nicht-zelluläre, Nukleinsäure enthaltende Einheiten, wie etwa Bakteriophagen und Viren.
Bei dem oben beschriebenen Verfahren wird wenigstens einer von der natürlichen Bindungsdomäne und dem Bindungspartner mit einer fluoreszenten Markierung markiert.
Bei einer bevorzugten Ausführungsform dient der Detektionsschritt zur Detektion einer Veränderung bei der Signalemission durch die Fluoreszenzmarkierung.
Es ist bevorzugt, dass das Verfahren weiterhin das Anregen der Fluoreszenzmarkierung und die Überwachung der Fluoreszenzemission umfasst.
Bevorzugt ist das Enzym eines der folgenden Enzyme: eine Kinase, eine Phosphatase, eine Kohlenhydrat-Transferase (z.B. eine UDP-N-Acetylglucosamin-dolichyl-phosphat-N-acetylglucosamin-Phosphotransferase oder eine O-GlcNAc-Transferase), ein Ubiquitin-aktivierendes Enzym E1, ein Ubiquitin-konjugierendes Enzym E2, ein Ubiquitin-konjugierendes Enzym Ubc9, eine Ubiquitin-Protein-Ligase E3, eine poly-(ADP-Ribose)-Polymerase, eine Fettacyl-Transferase (z.B. eine Glycylpeptid-N-tetradecanoyltransferase (Peptid-N-Myristoyltransferase)) und eine NAD:Arginin-ADP-Ribosyltransferase.
Es ist zusätzlich bevorzugt, dass das Verfahren weiterhin vor oder nach dem Detektionsschritt den Schritt umfasst, die natürliche Bindungsdomäne und den Bindungspartner mit einem Mittel in Kontakt zu bringen, das die Aktivität des Enzyms moduliert.
Wie hier im Hinblick auf ein biologisches oder chemisches Mittel verwendet, bezieht sich der Begriff „moduliert" auf die Verstärkung oder Inhibition der Aktivität eines Protein-modifizierenden Enzyms bei einem Test der Erfindung; eine solche Modulation kann direkt sein (z.B. einschließlich, ohne hierauf beschränkt zu sein, der Spaltung oder kompetitiven Bindung eines weiteren Substrats des Enzyms), oder indirekt (z.B. durch Blockieren der anfänglichen Produktion oder, falls erforderlich, der Aktivierung des modifizierenden Enzyms).
„Modulation" bezieht sich auf die Befähigung, eine messbare funktionelle Eigenschaft einer biologischen Aktivität oder eines biologischen Prozesses (z.B. Enzymaktivität oder Rezeptorbindung) entweder zu steigern oder herabzusetzen, z.B. um wenigstens 10%, 15%, 20%, 25%, 50%, 100% oder mehr; eine solche Steigerung oder Herabsetzung kann beschränkt sein auf das Auftreten eines spezifischen Ereignisses, wie etwa der Aktivierung eines Signaltransduktionswegs und/oder kann nur bei bestimmten Zelltypen manifest sein.
Der Begriff „Modulator" bezieht sich auf eine chemische Verbindung (natürlich vorkommend oder nicht-natürlich vorkommend), wie etwa ein biologisches Makromolekül (z.B. eine Nukleinsäure, ein Protein, Nicht-Peptid oder ein organisches Molekül) oder auf einen Extrakt, der aus biologischen Materialien hergestellt wird, wie etwa aus Bakterien, Pflanzen, Pilzen oder Tier- (insbesondere Säuger-)Zellen oder Geweben, oder sogar ein anorganisches Element oder Molekül. Modulatoren werden auf ihre potentielle Aktivität als (direkte oder indirekte) Inhibitoren oder Aktivatoren eines biologischen Prozesses oder biologischer Prozesse (z.B. als Agonist, partieller Antagonist, partieller Agonist, Antagonist, antineoplastisches Mittel, zytotoxisches Mittel, Inhibitor neoplastischer Transformation oder Zellproliferation, als Zellproliferation stimulierendes Mittel, und dergleichen) getestet, indem man sie in die hier beschriebenen Screening-Tests einbezieht. Die Aktivitäten (oder Aktivität) eines Modulators kann bekannt, unbekannt oder teilweise bekannt sein. Solche Modulatoren können unter Verwendung der hier beschriebenen Verfahren durchgetestet werden.
Der Begriff „Kandidaten-Modulator" bezieht sich auf eine Verbindung, die durch eines oder mehrere der Testverfahren der Erfindung als putativer Modulator zu testen ist. Für gewöhnlich werden verschiedene, vorab festgelegte Konzentrationen für die Durchmusterung verwendet, wie etwa 0,01 μM, 0,1 μM, 1,0 μM und 10,0 μM, wie hier im Folgenden vollständiger beschrieben. Die Kontrollen der Testverbindungen können die Messung eines Signals in Abwesenheit der Testverbindung oder den Vergleich mit einer Verbindung, für die bekannt ist, dass sie das Ziel moduliert, beinhalten.
Die Erfindung stellt zusätzlich ein Verfahren bereit, um einen Kandidatenmodulator der enzymatischen Aktivität für eines oder mehrere der folgenden Enzyme durchzutesten: eine Kohlenhydrat-Transferase (z.B. eine UDP-N-Acetylglucosamin-dolichyl-phosphat-N-acetylglucosamin-Phosphotransferase oder eine O-GlcNAc-Transferase), ein Ubiquitin-aktivierendes Enzym E1, ein Ubiquitin-konjugierendes Enzym E2, ein Ubiquitin-konjugierendes Enzym Ubc9, eine Ubiquitin-Protein-Ligase E3, eine poly-(ADP-Ribose)-Polymerase, eine Fettacyl-Transferase (z.B. eine Glycylpeptid-N-tetradecanoyltransferase (Peptid-N-Myristoyltransferase)), eine NAD:Arginin-ADP-Ribosyltransferase, und eine Kinase oder eine Phosphatase, wobei das Verfahren folgendes umfasst: Inkontaktbringen einer natürlichen Bindungsdomäne, eines Bindungspartners hierfür und eines Enzyms mit einem Kandidatenmodulator des modifizierenden Enzyms, wobei die natürliche Bindungsdomäne eine Stelle für die posttranslationale Modifikation beinhaltet und den Bindungspartner in einer Weise bindet, die abhängig von der Modifikation dieser Stelle durch das Enzym ist, und wobei wenigstens einer von der natürlichen Bindungsdomäne und dem Bindungspartner eine detektierbare Markierung umfasst, und Überwachen der Bindung der natürlichen Bindungsdomäne an den Bindungspartner, wobei die Bindung oder Dissoziation der natürlichen Bindungsdomäne und des Bindungspartners als Ergebnis des Inkontaktbringens eine Modulation der enzymatischen Aktivität durch den Kandidatenmodulator des Enzyms anzeigt. Die Markierung umfasst eine fluoreszente Markierung.
Es ist bevorzugt, dass die Überwachung die Messung einer Veränderung des Energietransfers zwischen einer detektierbaren Markierung, die auf der natürlichen Bindungsdomäne vorliegt, und einer detektierbaren Markierung, die sich auf dem Bindungspartner befindet, umfasst.
Ein letzter Aspekt der Erfindung ist ein Verfahren zum Durchtesten auf einen Kandidatenmodulator der Enzymaktivität für eines oder mehrere der folgenden Enzyme: eine UDP-N-Acetylglucosamin-dolichyl-phosphat-N-acetylglucosamin-Phosphotransferase, eine O-GlcNAc-Transferase, ein Ubiquitin-aktivierendes Enzym E1, ein Ubiquitin-konjugierendes Enzym E2, ein Ubiquitin-konjugierendes Enzym Ubc9, eine Ubiquitin-Protein-Ligase E3, eine poly-(ADP-Ribose)-Polymerase, eine Glycylpeptid-N-tetradecanoyltransferase (Peptid-N-Myristoyltransferase), eine NAD:Arginin-ADP-Ribosyltransferase, und eine Kinase oder eine Phosphatase, wobei das Verfahren folgendes umfasst: Inkontaktbringen eines Assay-Systems mit einem Kandidatenmodulator der enzymatischen Aktivität eines solchen Enzyms und Überwachen der Bindung einer natürlichen Bindungsdomäne und eines Bindungspartners hierfür in dem Assay-System, wobei die natürliche Bindungsdomäne eine Stelle für die posttranslationale Modifikation beinhaltet und den Bindungspartner in einer Weise bindet, die abhängig ist von der Modifikation dieser Stelle durch wenigstens ein derartiges Enzym in dem Assay-System, wobei wenigstens einer von der natürlichen Bindungsdomäne und dem Bindungspartner eine detektierbare fluoreszente Markierung umfasst, und wobei die Bindung oder Dissoziation der natürlichen Bindungsdomäne und des Bindungspartners als Ergebnis des Inkontaktbringens die Modulation der Enzymaktivität durch den Kandidatenmodulator eines solchen Enzyms anzeigt.
Es ist hochgradig bevorzugt, dass bei jedem der obigen Verfahren das Verfahren eine Echtzeitbeobachtung der Assoziation einer natürlichen Bindungsdomäne mit deren Bindungspartner umfasst.
Weitere Merkmale und Vorteile der Erfindung werden in der folgenden Beschreibung der Ausführungsformen und der Zeichnungen hiervon, sowie aus den Ansprüchen, voll ersichtlich werden.
Detaillierte Beschreibung
Die Erfindung basiert auf der Entdeckung, dass eine natürliche Bindungsdomäne, eine Bindungssequenz oder ein Bindungspolypeptid, wie oben definiert, mit einem Bindungspartner assoziiert, um einen Komplex auszubilden, oder von einem Bindungspartner dissoziiert, in einer Weise, die abhängig ist von der Gegenwart oder Abwesenheit einer chemischen Gruppierung, und dass dies in einer hochempfindlichen Weise, die eine Beobachtung in Echtzeit erlaubt, detektiert und gemessen werden kann.
Polypegtide zur Verwendung bei der Erfindung
Es werden Reportermoleküle für die Tests zur Messung der Aktivität Protein-modifizierender Enzyme verwendet. Diese Reportermoleküle sind natürlich vorkommende Polypeptide, die natürliche Bindungsdomänen, natürliche Bindungssequenzen und natürliche Bindungspolypeptide, jeweils wie oben definiert, beinhalten, und die in Tests der Erfindung in Kombination mit Polypeptidbindungspartnern, ebenfalls wie oben definiert, verwendet werden.
Minimal umfasst oder besteht ein solches Reportermolekül aus einer natürlichen Bindungsdomäne. Die Aminosäuren einer natürlichen Bindungsdomäne sind solche, die notwendig für die Phosphorylierungs-abhängige Bindung des Moleküls, das aus der natürlichen Bindungsdomäne besteht oder diese umfasst, an einen Bindungspartner sind, egal, ob ein solcher Partner auf derselben oder auf einer anderen Polypeptidkette wie die natürliche Bindungsdomäne liegt. Solche Aminosäuren können Punkte des direkten Kontakts zwischen der Domäne und dem Bindungspartner beinhalten; solche, die erkannt und/oder durch ein Enzym modifiziert (z.B. phosphoryliert oder dephosphoryliert) werden und solche, die die dreidimensionale Struktur oder Ladung der Bindungsdomäne in einer Weise aufrecht erhalten, die die Modifikation und abhängige Bindung der Domäne an den Bindungspartner erlauben. Die Aminosäuren einer natürlichen Bindungsdomäne können zusammenhängend sein oder können durch Nicht-Domänen- Aminosäuren getrennt sein; solche Nicht-Domänen-Reste können entweder diejenigen sein, die natürlicher Weise zwischen den Aminosäuren der natürlichen Bindungsdomäne vorhanden sind, oder solche, die nicht-natürlich sind. In Fällen, in denen nicht-natürliche Aminosäuren eingestreut zwischen den Aminosäuren einer natürlichen Bindungsdomäne zu finden sind, werden solche nicht-natürlichen Reste Reste sein, die die natürliche Phosphorylierungs-abhängige Bindung der natürlichen Bindungsdomäne an ihren Bindungspartner nicht wesentlich (d.h. messbar) verändern.
Ein zweites Reportermolekül von Nutzen bei der Erfindung ist eines, das einen natürlich vorkommenden Abschnitt zusammenhängender Aminosäuren enthält oder aus diesem besteht, die für die Phosphorylierungs-abhängige Bindung an den Bindungspartner, wie oben definiert, hinreichend sind, d.h. wenigstens die Mindestanzahl zusammenhängender Aminosäuren, die benötigt werden, um eine natürliche Bindungsdomäne abzudecken. Die Phosphorylierungsabhängigkeit eines solchen Moleküls, hier als „natürliche Bindungssequenz" bezeichnet, ist selber natürlich. Ein solches Reportermolekül kann entweder aus einer natürlichen Bindungssequenz bestehen oder diese umfassen. Im letzteren Fall beeinflussen die Aminosäuren außerhalb der natürlichen Bindungssequenz nicht wesentlich die Phosphorylierungs-abhängige Bindung der natürlichen Bindungsdomäne an den Bindungspartner.
Schließlich kann ein Reportermolekül von Nutzen für die Erfindung ein „natürliches Bindungspolypeptid" sein, wie oben definiert. Ein solches Polypeptidmolekül umfasst oder besteht aus multiplen natürlichen Bindungsdomänen (siehe oben), wobei diese Domänen entweder individuell sind oder konzertiert miteinander zusammenwirken, und zwar hinreichend, um die natürliche, Phosphorylierungs-abhängige Bindung des natürlichen Bindungspolypeptids an einen Bindungspartner zu erlauben.
Durch Überwachen der Assoziation oder Dissoziation einer natürlichen Bindungsdomäne, Bindungssequenz oder eines Bindungspolypeptids und deren/dessen Bindungspartner in Gegenwart eines bekannten Protein-modifizierenden Enzyms oder eines Kandidaten hierfür, kann die Aktivität eines solchen Enzyms gemessen werden. Bei solchen Assays umfassen einer oder beide der natürlichen Bindungsdomäne, Bindungssequenz oder des Bindungspolypeptids und deren/dessen Bindungspartner eine detektierbare Markierung, die eine fluoreszente Markierung ist, die entweder chemisch oder proteinisch sein kann. Durch Messen von Veränderungen der Signalemission vor und nach der Zugabe des zu untersuchenden Enzyms zu dem Gemisch, das die natürliche Bindungsdomäne, Bindungssequenz oder das Bindungspolypeptid und den zugehörigen Bindungspartner umfasst, kann das Ausmaß der Modifikation berechnet werden. Ein wichtiges Merkmal der Erfindung besteht darin, dass Messungen (z.B. eine Verschiebung in FRET oder ein anderes, von einer detektierbaren Markierung emittiertes Signal) in Echtzeit durchgeführt werden können. Dies erlaubt eine empfindliche Messung der Enzym-Reaktionskinetiken auf Basis der Geschwindigkeit von Veränderungen der von der Proteinbindung abhängigen Signalemission oder – Absorption durch die Markierung(en).
Assays, bei denen die obigen Reportermoleküle gemäß der Erfindung verwendet werden, können entweder im Doppel- oder im Einzelkettenformat durchgeführt werden (17). Beim Doppelkettenformat wird die natürliche Bindungsdomäne, Bindungssequenz oder das Bindungspolypeptid von einer anderen Polypeptidkette umfasst als von derjenigen, die den Bindungspartner umfasst oder darstellt, und ist nicht anderweitig kovalent mit dieser verbunden. Beim Einzelkettenformat ist die natürliche Bindungsdomäne, Bindungssequenz oder das Bindungspolypeptid kovalent mit dem zugehörigen Bindungspartner verbunden, entweder durch eine dazwischen liegende Aminosäuresequenz oder durch einen chemischen Linker.
Der Bindungspartner einer natürlichen Bindungsdomäne, Bindungssequenz oder eines Bindungspolypeptids kann selber eine natürliche Bindungsdomäne, Bindungssequenz oder ein Bindungspolypeptid, wie hier definiert, sein. Wenn dem so ist, kann die Bindung der zwei Moleküle vom Modifikationszustand eines oder beider in einer Weise abhängen, die derjenigen vergleichbar ist, wie sie in der Natur zu finden ist.
Verfahren, durch die die Assays der Erfindung durchgeführt werden, sind in den folgenden Abschnitten und in den Beispielen detailliert beschrieben.
Solange nicht anders definiert, besitzen alle hier verwendeten technischen und wissenschaftlichen Begriffe dieselbe Bedeutung, mit der sie üblicherweise vom Durchschnittsfachmann (z.B. der Zellkultur, Molekulargenetik, Nukleinsäurechemie, Hybridisierungstechnik und Biochemie) verstanden werden. Es werden Standardtechniken für molekulare, genetische und biochemische Verfahren verwendet (siehe allgemein Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual 2 Auflage (1989) Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., welches hier durch Referenz in Bezug genommen wird), sowie für die chemischen Verfahren, pharmazeutischen Formulierungen und die Verabreichung an und die Behandlung von Patienten.
Verfahren zur Detektion von Protein-Protein-Bindung bei den Assays der Erfindung
Gemäß der Erfindung wird die Aktivität eines modifizierenden Enzyms durch Messen der Ausbildung oder Zerstörung von Protein-Protein-Komplexen untersucht, wenn das modifizierende Enzym zusammen mit einer natürlichen Bindungsdomäne und deren zugehörigem Bindungspartner unter Bedingungen vorliegt, die eine modifizierende Aktivität erlauben. Verfahren, die die Detektion von Protein-Protein-Komplexen erlauben (d.h. Verfahren, die es einem Fachmann in der Technik erlauben, zwischen Polypeptid-Paarungspartnern zu unterscheiden, die gebunden vorliegen, und solchen, die ungebunden vorliegen) sind in der Technik bekannt.
Detektionsverfahren ohne die Verwendung von Markierung sind in der Technik bekannt. Diese beinhalten Detektion unter Verwendung von Oberflächenplasmonresonanz zur Detektion von Veränderungen der Masse des immobilisierten Polypeptids, die erfolgen wird, wenn die Bindung des Partnerpolypeptids zunimmt oder abnimmt. Solche Messungen können z.B. unter Verwendung einer BlAcore-Maschine durchgeführt werden. Alternativ kann Massenspektroskopie verwendet werden, um die Anwesenheit und Masse einer gebundenen Spezies zu detektieren, die mit einem immobilisierten Peptid interagiert.
Jedoch werden gemäß der Erfindung markierte Bindungsdomänen und Bindungspartner und daher Techniken verwendet, die physikalische Parameter messen, die sich aus solchen Markierungen ergeben. Somit umfasst typischerweise wenigstens einer von der Bindungsdomäne und dem Bindungspartner eine detektierbare fluoreszente Markierung. Beispiele anderer Markierungen beinhalten optische Markierungen, ein absorbierendes farbiges Teilchen oder einen Farbstoff, radioaktiv, so wie mit möglicher Anwendbarkeit bei einem Nährungs-Szintillationstest oder einer Szintillationsemulsion, enzymatisch, wie etwa ein Glucoseoxidase-Sensor oder ein anderes Redoxsystem, oder eine immobilisierte chemische Kaskade, oder basierend auf der Masse, wie anwendbar bei einem auf Oberflächenplasmonresonanz basierenden Test, wobei in diesem Fall entweder das Protein oder der Bindungspartner von hohem Molekulargewicht sein müssen. Fluoreszente Markierungen werden später detailliert beschrieben.
„Detektierbare Markierung" bedeutet eine Gruppierung, proteinisch oder andersartig, deren physikalische Eigenschaften sich in detektierbarer Weise in Abhängigkeit von ihrem molekularen Kontext verändern, wie etwa dann, wenn das Polypeptid, mit dem sie gekoppelt ist, an ein anderes Polypeptid bindet. Die detektierbare Markierung kann in einer nicht-invasiven Weise detektierbar sein, die keine Zerstörung von zellulärem Material erfordert. Somit können z.B. Markierungen in Betracht gezogen werden, die keine Extraktion und Auftrennung zellulärer Komponenten erfordern und in situ-Messungen erlauben.
Die detektierbare Markierung kann Untereinheiten oder Fragmente von Enzymen umfassen, die funktionell sind, wenn sie assoziiert sind. Beispielsweise kann β-Galactosidase in zwei Fragmente (Δα und Δω) gespalten werden, die, wenn sie zusammen exprimiert werden, ein funktionales Enzym ausbilden (siehe Sambrook et al., ibidem). Ein solches System ist in intakter Hefe verwendet worden, um Potein-Protein-Interaktionen zu überwachen (Rossi et al., 1997, Proc Natl. Acad Sci. USA 94: 8405-8410). Ebenso kann bakterielle Luciferase in Form von zwei Fragmenten produziert werden, die, wenn sie zusammen exprimiert werden und assoziieren, ein funktionelles Enzym ausbilden (Almashanu et al., 1996, Protein Eng. 9: 803-9).
Detektierbare Markierungen beinhalten außerdem Gruppierungen, die dazu dienen können, die Größe eines Reporter-Polypeptids für die Verwendung bei Detektionstechniken zu erhöhen, die eine Größenzunahme eines Komplexes messen. Somit beinhaltet z.B. eine geeignete Gruppierung Streptavidin, das über eine Biotin-Gruppierung an das Reporterpolypeptid angehängt wird. Die Biotinylierung von Peptiden ist in der Technik wohlbekannt. Eine Biotin/Streptavidin-Gruppierung ist in Beispielen beschrieben, bei denen die verwendete Messtechnik Fluoreszenzpolarisation war, die die Taumelgeschwindigkeit von Makromolekülen misst. Wenn das an Biotin/Streptavidin gekoppelte Reporter-Polypeptid an einen fluoreszent markierten Bindungspartner bindet, so ändert sich der Polarisationswert des fluoreszent markierten Bindungspartners als Ergebnis der großen Zunahme hinsichtlich der Größe des Komplexes.
Dort, wo beispielsweise die Bindungsdomäne-Markierungs- und Bindungspartner-Markierungs-Polypeptide von lebenden Zellen exprimiert werden, wird die Markierung typischerweise in Form eines Polypeptids vorliegen, dessen Aminosäurebestandteile natürlich vorkommende Aminosäuren sind, einschließlich solcher, die aus posttranslationalen Modifikationen entstehen. Die Nukleinsäurekonstrukte, die für diese Polypeptide codieren, können unter Verwendung von Standardtechniken in das Genom des Organismus eingeführt werden. Typischer Weise werden die Bindungsdomäne und der Bindungspartner mit der detektierbaren Markierung verbunden, indem sie in Form eines Fusionsproteins exprimiert werden. Jedoch können die Bindungsdomäne und/oder der Bindungspartner durch jedwedes physiologisch anwendbare Mittel mit ihrer detektierbaren Markierung verbunden werden. Beispielsweise können sie Bestandteil eines Multiproteinkomplexes sein, der verbunden ist mittels Disulfidbindung oder durch nicht-kovalente Bindung, wie etwa elektrostatische Wechselwirkungen, hydrophobe Wechselwirkungen und/oder van der Waalsche Kräfte.
Die Erfindung stützt sich auf solche Verfahren, die eine fluoreszente Markierung der natürlichen Bindungsdomäne und/oder von deren Bindungspartner sowie die nachfolgende Detektion von Veränderungen der Fluoreszenz mit sich bringen, ob nun hinsichtlich der Frequenz oder der Stärke, nachdem die Inkubation der markierten Assay-Komponenten mit dem Kandidaten für das modifizierende Enzym erfolgt ist. Mehrere solcher Prozeduren sind unten kurz zusammengefasst. Entsprechend sind Verfahren zur Detektion der Phosphorylierungs-abhängigen Bindung einer natürlichen Bindungsdomäne, Bindungssequenz oder eines Bindungspolypeptids und eines Bindungspartners bei einem Test der Erfindung im nützlichsten Fall, wenn auch nicht ausschließlich, diejenigen, die Licht-emittierende Markierungen verwenden. Mehrere derartige Techniken sind unten beschrieben.
Fluoreszenzresonanzenergietransfer (FRET)
Ein Werkzeug zur Bestimmung des Abstands zwischen einem Molekül und einem anderen (ob nun Protein oder Nukleinsäure) oder zwischen zwei Positionen auf demselben Molekül wird durch die Technik des Fluoreszenzresonanzenergietransfers (FRET) bereitgestellt, der inzwischen in breitem Umfang in der Technik bekannt ist (für einen Übersichtsartikel, siehe Matyus, 1992, J. Photochem. Photobiol. B: Biol., 12: 323-337, der hier durch Referenz in Bezug genommen wird). FRET ist ein strahlungsfreier Prozess, bei dem Energie von einem angeregten Donormolekül auf ein Akzeptormolekül übertragen wird: die Effizienz dieser Übertragung ist abhängig vom Abstand zwischen den Donor- und Akzeptormolekülen, wie unten beschrieben. Da die Energieübertragungsrate umgekehrt proportional zur sechsten Potenz des Abstands zwischen dem Donor und Akzeptor ist, ist die Effizienz der Energieübertragung extrem empfindlich gegenüber Veränderungen des Abstands. Man sagt, dass die Energieübertragung mit einer detektierbaren Effizienz im Bereich von 1-10 nm erfolgt, jedoch für günstige Paare von Donor und Akzeptor typischerweise 4-6 nm beträgt.
Die strahlungsfreie Übertragung von Energie basiert auf den biophysikalischen Eigenschaften von Fluorophoren. Diese Prinzipien sind an anderer Stelle übersichtsartig dargestellt (Lakowicz, 1983, Principles of Fluorescence Spectroscopy, Plenum Press, New York; Jovin und Jovin, 1989, Cell Structure and Function by Microspectrofluorometry Herausgeber E. Kohen und J.G. Hirschberg, Academic Press, die beide durch Referenz in Bezug genommen werden). Kurz dargestellt, absorbiert ein Fluorophor Lichtenergie bei einer charakteristischen Wellenlänge. Diese Wellenlänge ist auch als Anregungswellenlänge bekannt. Die von einem Fluorochrom absorbierte Energie wird nachfolgend über verschiedene Wege freigesetzt, von denen einer die Emission von Photonen ist, um Fluoreszenz zu erzeugen. Die emittierte Lichtwellenlänge ist als Emissionswellenlänge bekannt und ist ein inhärentes Merkmal eines bestimmten Fluorophors. Strahlungsfreie Energieübertragung ist der quantenmechanische Prozess, durch den die Energie des angeregten Zustands eines Fluorophors ohne tatsächliche Photonenemission auf einen zweiten Fluorophor übertragen wird. Diese Energie kann dann nachfolgend bei der Emissionswellenlänge des zweiten Fluorophors freigesetzt werden. Der erste Fluorophor wird allgemein als Donor (D) bezeichnet und besitzt einen angeregten Zustand höherer Energie als der zweite Fluorophor, der als Akzeptor (A) bezeichnet wird. Die essentiellen Merkmale des Prozesses bestehen darin, dass das Emissionsspektrum des Donors mit dem Anregungsspektrum des Akzeptors überlappt, und dass Donor und Akzeptor hinreichend nah zueinander sind. Der Abstand, über den der strahlungsfreie Energietransfer wirksam ist, hängt von vielen Faktoren ab, einschließlich der Fluoreszenzquanteneffizienz des Donors, dem Extinktionskoeffizienten des Akzeptors, dem Ausmaß der Überlappung ihrer jeweiligen Spektren, dem Brechungsindex des Mediums und der relativen Orientierung der Überleitungsmomente der beiden Fluorophore. Zusätzlich zu einem optimalen Emissionsbereich, der die Anregungswellenlänge des anderen Fluorophors überlappt, muss der Abstand zwischen D und A hinreichend klein sein, um die strahlungsfreie Übertragung von Energie zwischen den Fluorophoren zu erlauben.
FRET kann entweder in vivo oder in vitro durchgeführt werden. Proteine werden entweder in vivo oder in vitro durch in der Technik bekannte Verfahren markiert. Gemäß der Erfindung werden eine natürliche Bindungsdomäne, Bindungssequenz oder ein Bindungspolypeptid und deren/dessen Bindungspartner, enthalten entweder auf demselben oder auf verschiedenen Polypeptidmolekülen, unterschiedlich markiert, eines mit einem Donor und das andere mit einem Akzeptor, und die Unterschiede der Fluoreszenz zwischen einem Testassay, der ein Protein-modifizierendes Enzym enthält, und einer Kontrolle, in der das modifizierende Enzym fehlt, werden unter Verwendung eines Fluorimeters oder eines Laser-Scan-Mikroskops gemessen. Es wird Fachleuten auf dem Gebiet ersichtlich sein, dass die Anregungs-/Detektionsmittel durch den Einbau von Photomultiplikatoreinrichtungen verstärkt werden können, um die Detektionsempfindlichkeit zu erhöhen. Die verschiedenen Markierungen können entweder zwei verschiedene fluoreszente Markierungen (z.B. fluoreszente Proteine, wie unten beschrieben, oder die Fluorophore Rhodamin, Fluorescein, SPQ und andere, wie in der Technik bekannt) oder eine fluoreszente Markierung und ein Molekül, für das bekannt ist, dass es dieses Signal quencht, beinhalten; Unterschiede bei der Nähe der natürlichen Bindungsdomäne, der Bindungssequenz oder dem Bindungspolypeptid zu ihrem/seinem Bindungspartner mit und ohne das Protein-modifizierende Enzym können auf Basis eines Unterschieds im beobachteten Fluoreszenzspektrum oder der beobachteten Fluoreszenzintensität gemessen werden.
Diese Kombination von Proteinmarkierungsverfahren und -Vorrichtungen liefert einen deutlichen Vorteil gegenüber zum Stand der Technik gehörenden Verfahren zum Bestimmen der Aktivität Protein-modifizierender Enzyme, wie oben beschrieben, und zwar in soweit, als Ergebnisse aller Messungen in Echtzeit beobachtet werden können (d.h. als Reaktionsfortschritte). Dies ist von signifikantem Vorteil, da es sowohl eine schnelle Datensammlung erlaubt, als auch Informationen hinsichtlich der Reaktionskinetik unter verschiedenen Bedingungen erbringt.
Eine Probe, ob nun in vitro oder in vivo, die gemäß der Erfindung gemessen wird, umfasst daher ein Gleichgewichtsgemisch der markierten natürlichen Bindungsdomäne, Bindungssequenz oder des Bindungspolypeptids und deren/dessen Bindungspartners, die, wenn sie voneinander dissoziiert sind, bei einer Frequenz fluoreszieren, und wenn sie miteinander komplexiert sind, bei einer anderen Frequenz fluoreszieren, oder alternativ, von Molekülen, die in Abhängigkeit davon, ob sie assoziiert sind oder nicht, entweder fluoreszieren oder nicht fluoreszieren oder eine verringerte Fluoreszenz zeigen.
Die natürliche Bindungsdomäne, Bindungssequenz oder das Bindungspolypeptid wird modifiziert, um die Anheftung einer fluoreszenten Markierung an die Oberfläche dieses Moleküls zu erlauben, oder es wird im Leseraster mit einem fluoreszenten Protein fusioniert, wie unten beschrieben. Die Auswahl der fluoreszenten Markierung wird so sein, dass markierte Peptide, die assoziiert sind, bei Anregung mit Licht einen optimalen Energietransfer zwischen den Fluorophoren zeigen werden. In Gegenwart eines Protein-modifizierenden Enzyms, das die Stelle für die Proteinmodifikation erkennt, die auf der natürlichen Bindungsdomäne, und, optional, dem Bindungspartner, vorhanden ist, dissoziieren die natürliche Bindungsdomäne und ihr Bindungspartner aufgrund einer strukturellen oder elektrostatischen Änderung, die, wie hier beschrieben, als Folge einer Anfügung oder Entfernung einer chemischen Gruppierung an/von der Enzymerkennungsstelle erfolgt, was somit zu einer Abnahme der Energieübertragung und einer verstärkten Emission von Licht durch den Donor-Fluorophor führt. Auf diese Weise kann der Status einer Polypeptidmodifikation überwacht und in Echtzeit quantifiziert werden. Dieses Schema, das die breiteste Ausführungsform der Erfindung darstellt, ist in 18 dargestellt.
Wie hier verwendet, beziehen sich die Begriffe „Fluorophor" und „Fluorochrom" in austauschbarer Weise auf ein Molekül, das befähigt ist, Energie in einem Wellenlängenbereich zu absorbieren, und Energie in einem Wellenlängenbereich abzugeben, der von dem Absorptionsbereich (Extinktionsbereich) verschieden ist. Der Begriff „Anregungswellenlänge" bezieht sich auf den Bereich von Wellenlängen, bei dem der Fluorophor Energie absorbiert. Der Begriff „Emissionswellenlänge" bezieht sich auf den Wellenlängenbereich, bei dem der Fluorophor Energie abgibt oder fluoresziert.
Eine nicht-limitierende Liste chemischer Fluorophore, die für die Erfindung von Nutzen sind, zusammen mit ihren Anregungs- und Emissionswellenlängen, ist in Tabelle 1 dargestellt.
Tabelle 1
Es sollte auch gesagt werden, dass dort, wo die verwendete Fluoreszenztechnik sowohl ein Donormolekül als auch ein Akzeptormolekül erfordert, natürlich vorkommende oder künstlich erzeugte Tryptophanreste innerhalb der Bindungsdomäne und/oder des Partners geeignet als Donor sind und daher in dieser Situation nur eines der Moleküle mit einem fluoreszenten Molekül markiert werden muss.
Beispiele fluoreszenter Proteine, die hinsichtlich ihrer Anregungs- und Emissionsmaxima untereinander variieren, sind in Tabelle 1 der WO 97/28261 aufgelistet. Diese (jeweils gefolgt von [Anregungsmax./Emissionsmax.] Wellenlängen, ausgedrückt in Nanometern) beinhalten wildtypisches Grünes Fluoreszenzprotein [395(475)/508] und klonierte Mutanten von Grünem Fluoreszenzprotein, Varianten P4 [383/447], P4-3 [381/445], W7 [433(453)/475(501)], W2 [432(453)/480], S65T [489/511], P4-1 [504(396)/480], S65A [471/504], S65C [479/507], S65L [484/510], Y66F [360/442], Y66W [458/480], 10c [513/527], W1B [432(453)/476(503)], Emerald [487/508] und Sapphire [395/511]. Diese Liste ist für die in der Technik bekannten Fluoreszenzproteine nicht erschöpfend; weitere Beispiele finden sich in den öffentlichen Datenbanken Genbank und SwissProt. Weitere Beispiele sind beschrieben in Matz et al., 1999 (Nature Biotech 17: 969-973) und beinhalten rotes Fluoreszenzprotein von Discosoma sp. (drFP583).
Es wird eine Anzahl von Parametern für die Fluoreszenz-Ausgabe ins Auge gefasst, einschließlich:

1) Messung der Fluoreszenz, die bei der Emissionswellenlänge des Akzeptors (A) und des Donors (D) emittiert wird und Bestimmung des Ausmaßes an Energietransfer über das Verhältnis ihrer Emissionsamplituden;
2) Messung der Fluoreszenzlebensdauer von D;
3) Messung der Rate der Photoausbleichung von D;
4) Messung der Anisotropie von D und/oder A; oder
5) Messung des Stokes Shift-Monomer; Excimer-Fluoreszenz.

Bestimmte dieser Techniken werden unten dargestellt.
Alternative Fluoreszenztechniken, die geeignet sind für die Überwachung von Protein-Protein-Bindung bei Tests der Erfidung
Eine Ausführungsform der Technik kann Monomer:Excimer-Fluoreszenz als Ausgabe verwenden. Die Assoziation einer natürlichen Bindungsdomäne mit einem Bindungspartner in diesem Format ist in 19 dargestellt.
Der Fluorophor Pyren, wenn es als Einzelkopie vorhanden ist, zeigt eine Fluoreszenzemission einer bestimmten Wellenlänge, die signifikant kürzer ist, als dann, wenn zwei Kopien von Pyren ein planares Dimer (Excimer) ausbilden, wie abgebildet. Wie oben wird die Anregung bei einer Einzelwellenlänge (voraussichtlich 340 nm) verwendet, um die Excimer-Fluoreszenz (470 nm) gegenüber der Monomer-Fluoreszenz (375 nm) zu überprüfen, um Zusammenbau:Abbau des Reportermoleküls zu quantifizieren.
Weitere Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung sind nicht von FRET abhängig. Beispielsweise kann die Erfindung Gebrauch von Fluoreszenz-Korrelations-Spektroskopie (FCS) machen, die auf der Messung der Diffusionsrate einer Markierung basiert (siehe Elson und Magde, 1974 Biogolymers, 13: 1-27; Rigler et al., 1992, in Fluorescence Spectroscopy: New Methods and Applications, Springer Verlag, S. 13-24; Eigen und Rigler, 1994, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 91: 5740-5747; Kinjo und Rigler, 1995, Nucleic Acids Res., 23: 1795-1799).
Bei FCS bestrahlt ein fokussierter Laserstrahl ein sehr kleines Volumen einer Lösung in der Größenordnung von 10^–15 Litern, der zu jedem gegebenen Zeitpunkt nur ein Molekül der Vielen unter Analyse enthält. Die Diffusion einzelner Moleküle durch das bestrahlte Volumen über die Zeit resultiert in Ausbrüchen von Fluoreszenzlicht, da die Markierungen der Moleküle durch den Laser angeregt werden. Jeder einzelne Ausbruch, resultierend von einem einzelnen Molekül, kann registriert werden.
Ein markiertes Polypeptid wird, wenn es groß ist, mit langsamerer Geschwindigkeit diffundieren, als wenn es klein ist. Somit werden multimerisierte Polypeptide langsame Diffusionsgeschwindigkeiten zeigen, was zu einer niedrigeren Anzahl an Fluoreszenzausbrüchen in einem beliebigen Zeitrahmen führt, wogegen markierte Polypeptide, die nicht multimerisiert sind oder die von einem Multimer abdissoziiert sind, schneller diffundieren werden. Die Bindung von Polypeptiden gemäß der Erfindung kann direkt aus den Diffusionsraten durch das bestrahlte Volumen berechnet werden.
Wenn FCS anstelle von FRET verwendet wird, ist es nicht notwendig, mehr als ein Polypeptid zu markieren. Bevorzugt wird ein einziges Polypeptidmitglied des Multimers markiert. Das markierte Polypeptid dissoziiert von dem Multimer als Ergebnis der Modifikation ab und verändert damit die FCS-Ablesung für die fluoreszente Markierung.
Eine weitere Detektionstechnik, die bei dem Verfahren der vorliegenden Erfindung verwendet werden kann, ist die Messung des zeitabhängigen Abfalls der Fluoreszenz-Anisotropie. Dies wird z.B. beschrieben in Lacowicz, 1983, Principles of Fluorescence Spectroscopv, Plenum Press, New York, das hier durch Referenz in Bezug genommen wird (siehe z.B. Seite 167).
Fluoreszenz-Anisotropie basiert auf der Messung der Rotation von fluoreszenten Gruppen. Größere Multimere von Polypeptiden rotieren langsamer als Monomere, was es erlaubt, die Ausbildung von Multimeren zu überwachen.
Nicht-fluoreszente Detektionsverfahren
Wir beschreiben Verfahren, die eine Anzahl nicht-fluoreszenter Markierungen verwenden. Die natürliche Bindungsdomäne und der Bindungspartner hierfür können dazu, wenn sie gebunden sind, ein aktives Enzym ausbilden, das befähigt ist, an einer Enzym-Substratreaktion teilzunehmen, die einen detektierbaren Endpunkt besitzt. Das Enzym kann zwei oder mehr Polypeptidketten oder Regionen einer Einzelkette umfassen, sodass bei der Bindung der natürlichen Bindungsdomäne an den Bindungspartner, wobei diese entweder auf zwei verschiedenen Polypeptidketten oder in zwei verschiedenen Regionen einer einzigen Polypeptidkette vorliegen, ein Zusammenbau dieser Komponenten erfolgt, um ein funktionelles Enzym auszubilden. Die Enzymfunktion kann mittels einer Reihe von Verfahren gemessen werden, einschließlich Szintillationszählung und Photospektroskopie. Bei einer weiteren Ausführungsform kann der Test so angeordnet sein, dass die Markierung ein Redoxenzym ist, z.B. Glukoseoxidase, und dass das von der Markierung erzeugte Signal ein elektrisches Signal ist.
Die Modifikation der natürlichen Bindungsdomäne und, optional, von deren Bindungspartner wird benötigt, um die Bindung zu inhibieren, und demzufolge den Zusammenbau der Enzymkomponenten, was somit die Enzymaktivität reduziert.
Bei einem anderen Testformat wird ein Enzym zusammen mit einem Modulator der Enzymaktivität verwendet, wie etwa einem Inhibitor oder einem Cofaktor. Bei einem solchen Test ist einer von dem Enzym und dem Inhibitor oder Cofaktor eine natürliche Bindungsdomäne, der andere ist ihr Bindungspartner. Die Bindung des Enzyms an seinen Inhibitor oder Cofaktor resultiert in einer Modulation der enzymatischen Aktivität, die durch konventionelle Mittel detektierbar ist (wie etwa durch die Überwachung der Umwandlung von Substrat zu Produkt für ein gegebenes Enzym).
Fluoreszente Proteinmarkierungen in Assays der Erfindung
Die hier beschriebenen Verfahren können FRET verwenden. Bei einem FRET-Assay werden die fluoreszenten Proteinmarkierungen so ausgewählt, dass das Anregungsspektrum einer der Markierungen (des Akzeptors) mit dem Emissionsspektrum der angeregten Fluoreszenzmarkierung (des Donors) überlappt. Die Donormarkierung wird durch Licht geeigneter Intensität im Anregungsspektrum des Donors angeregt. Der Donor emittiert dann einen Teil der absorbierten Energie als Fluoreszenzlicht und leitet einen Teil der Energie durch FRET an die fluoreszente Akzeptor-Markierung ab. Die von ihm produzierte Fluoreszenzenergie wird durch die fluoreszente Akzeptor-Proteinmarkierung gequencht. FRET kann sich manifestieren als Verringerung der Intensität des Fluoreszenzsignals des Donors, als Verringerung der Lebensdauer von dessen angeregtem Zustand, sowie als erneute Emission von Fluoreszenzlicht bei den längeren Wellenlängen (geringeren Energien), die für den Akzeptor charakteristisch sind. Wenn die Donor- und die Akzeptor-Markierung räumlich getrennt werden, wird FRET abgeschwächt oder eliminiert.
Man kann aus FRET, der von einer natürlichen Bindungsdomäne, Bindungssequenz oder einem Bindungspolypeptid und dessen Bindungspartner gezeigt wird, die mit verschiedenen fluoreszenten Proteinen markiert sind, wobei eines mit einem Donor- und das andere mit einem Akzeptor-Fluoreszenzprotein verbunden ist, Nutzen ziehen, indem man Proteinmodifikationen gemäß der vorliegenden Erfindung überwacht. Ein einziges Polypeptid kann einen blauen Fluoreszenzprotein-Donor und einen grünen Fluoreszenzprotein-Akzeptor umfassen, wobei jeder mit einer anderen Testkomponente fusioniert ist (d.h. wobei einer mit der natürlichen Bindungsdomäne, Bindungssequenz oder dem Bindungspolypeptid, der andere dagegen mit dem zugehörigen Bindungspartner fusioniert ist): ein solches Konstrukt wird hier als „Tandem"-Fusionsprotein bezeichnet. Alternativ können zwei getrennte Polypeptide („einzelne" Fusionsproteine), eines umfassend eine natürliche Bindungsdomäne, Bindungssequenz oder ein Bindungspolypeptid, und das andere umfassend dessen Bindungspartner, unterschiedlich mit dem Donor- bzw. Akzeptor-Fluoreszenzprotein markiert werden. Die Konstruktion und Verwendung von Tandem-Fusionsproteinen bei der Erfindung kann – im Vergleich zu dem, was benötigt wird, wenn stattdessen einzelne Fusionsproteine verwendet werden – in signifikanter Weise die molare Konzentration der Peptide verringern, die zum Erreichen einer Assoziation zwischen unterschiedlich markierten Polypeptidtestkomponenten benötigt wird. Die markierte natürliche Bindungsdomäne, Bindungssequenz oder das Bindungspolypeptid und/oder deren/dessen Bindungspartner können über die Expression rekombinanter Nukleinsäuremoleküle produziert werden, die eine im Leseraster befindliche Fusion der Sequenzen umfassen, die für ein entsprechendes Polypeptid und eine fluoreszente Proteinmarkierung codieren, wobei die Expression entweder in vitro (d.h. unter Verwendung eines zellfreien Transkriptions-/Translations-Systems, wie unten beschrieben, oder, stattdessen, unter Verwendung kultivierter Zellen, die unter Verwendung in der Technik wohlbekannter Verfahren transformiert oder transfiziert wurden) oder in vivo, z.B. in einem transgenen Tier, einschließlich, jedoch nicht beschränkt auf, Insekten, Amphibien und Säuger, erfolgen wird. Ein rekombinantes Nukleinsäuremolekül von Nutzen für die Erfindung kann durch in der Technik wohlbekannte molekulare Methoden konstruiert und exprimiert werden, und kann zusätzlich Sequenzen umfassen, einschließlich, jedoch nicht beschränkt auf solche, die für ein Tag codieren (z.B. ein Histidin-Tag), um eine einfache Reinigung, ein Sekretionssignal, ein Kern-Lokalisationssignal oder andere primäre Sequenzsignale, die zur Zielsteuerung des Konstrukts an einen bestimmten zellulären Ort befähigt sind, zu realisieren, wenn dies gewünscht ist.
Die Mittel, durch die eine natürliche Bindungsdomäne, Bindungssequenz, oder ein Bindungspolypeptid und deren/dessen Bindungspartner unter Verwendung fluoreszenter Proteinmarkierungen gemäß der Erfindung auf Assoziation untersucht werden, können kurz wie folgt zusammengefasst werden:
Egal, ob die natürliche Bindungsdomäne, Bindungssequenz oder das Bindungspolypeptid und der zugehörige Bindungspartner nun auf einem einzigen Polypeptidmolekül vorliegen oder nicht, so wird eines mit einem grünen Fluoreszenzprotein markiert, während das andere bevorzugt mit einem roten, oder alternativ, mit einem blauen Fluoreszenzprotein markiert wird. Nützliche Donor:Akzeptor-Paare fluoreszenter Proteine (siehe Tsien et al., 1997, supra) beinhalten, ohne hierauf beschränkt zu sein, folgende:

Donor: S72A, K79R, Y145F, M153A und T203I (Anregung 395 nm; Emission 511 nm).
Akzeptor: S65G, S72A, K79R und T203Y (Anregung 514 nm; Emission 527 nm), oder T203Y/S65G, V68L, Q69K oder S72A (Anregung 515 nm; Emission 527 nm).

Ein Beispiel für eine Blau:Grün-Paarung ist P4-3 (dargestellt in Tabelle 1 von Tsien et al., 1997, supra) als Donormarkierung und S65C (ebenfalls aus Tabelle 1 von Tsien et al., 1997, supra) als Akzeptor-Markierung. Die natürliche Bindungsdomäne, Bindungssequenz oder das Bindungspolypeptid und der korrespondierende Bindungspartner werden Licht z.B. bei 368 nm, einer Wellenlänge, die nahe dem Anregungsmaximum von P4-3 ist, ausgesetzt. Diese Wellenlänge regt S65C nur minimal an. Bei der Anregung wird ein Teil der Energie, die von dem blauen Fluoreszenzprotein-Donor absorbiert wurde, über FRET auf den Akzeptor übertragen, wenn die natürliche Bindungsdomäne, Bindungssequenz oder das Bindungspolypeptid und der zugehörige Bindungspartner sich in enger Assoziation befinden. Als Ergebnis dieses Quenchens ist das von dem blauen Fluoreszenzprotein emittierte blaue Fluoreszenzlicht weniger hell, als es erwartet würde, wenn das blaue Fluoreszenzprotein isoliert existiert. Der Akzeptor (S65C) kann die Energie bei einer längeren Wellenlänge erneut emittieren, in diesem Fall als grünes Fluoreszenzlicht.
Nach der Modifikation eines oder beider der natürlichen Bindungsdomäne, Bindungssequenz oder Bindungspolypeptids und des Bindungspartners durch ein Protein-modifizierendes Enzym trennen sich die natürliche Bindungsdomäne, Bindungssequenz oder das Bindungspolypeptid und der zugehörige Bindungspartner (und somit die grünen und roten oder, weniger bevorzugt, die grünen und blauen Fluoreszenzproteine) physikalisch oder assoziieren, was entsprechend FRET inhibiert oder steigert. Wenn beispielsweise die Aktivität des modifizierenden Enzyms in der Dissoziation eines Protein:Protein-Dimers resultiert, so nimmt die Intensität des sichtbaren blauen Fluoreszenzlichts, das von dem blauen Fluoreszenzprotein emittiert wird, zu, während die Intensität des sichtbaren grünen Lichts, das von dem grünen Fluoreszenzprotein als Ergebnis von FRET emittiert wird, abnimmt.
Ein solches System ist nützlich zur Überwachung der Aktivität von Enzymen, die eine Stelle für die posttranslationale Modifikation einer natürlichen Bindungsdomäne, Bindungssequenz oder eines Bindungspolypeptids und, optional, von deren/dessen Bindungspartner, an die jeweils Fluoreszenzprotein-Markierungen fusioniert sind, modifizieren, sowie zur Untersuchung der Aktivität Protein-modifizierender Enzyme oder von Kandidaten-Modulatoren dieser Enzyme.
Insbesondere erwägen wir Tests, bei denen die Menge oder Aktivität eines modifizierenden Enzyms in einer Probe bestimmt wird durch Inkontaktbringen der Probe mit einer natürlichen Bindungsdomäne, Bindungssequenz oder einem Bindungspolypeptid und dessen Bindungspartner, die unterschiedlich mit fluoreszenten Proteinen markiert sind, wie oben beschrieben, und durch Messen von Veränderungen der Fluoreszenz der Donor-Markierung, der Akzeptor-Markierung oder der relativen Fluoreszenz beider. Fusionsproteine, wie oben beschrieben, die entweder einen oder beide von der markierten natürlichen Bindungsdomäne, Bindungssequenz oder des Bindungspolypeptids und von deren/dessen Bindungspartner bei einem Assay der Erfindung umfassen, können unter anderem dafür verwendet werden, um die Aktivität eines Protein-modifizierenden Enzym im Inneren derjenigen Zelle zu überwachen, die das rekombinante Tandemkonstrukt oder zwei verschiedene rekombinante Konstrukte exprimiert.
Vorteile der einzeln oder als Tandem vorliegenden Fluoreszenz-Proteine/Polypeptide, die eine natürliche Bindungsdomäne, Bindungssequenz oder ein Bindungspolypeptid umfassen, die/das mit einem Fluoreszenzprotein fusioniert ist, beinhalten das Potential, die natürliche Bindungsdomäne, Bindungssequenz oder das Bindungspolypeptid in der Zelle zu exprimieren (unter Maßgabe eines geeigneten experimentellen Formats), und zwar bei größerem Extinktionskoeffizienten und größerer Quantenausbeute vieler dieser Proteine im Vergleich zu den Werten des Edan-Fluorophors. Ebenso ist der Akzeptor bei einem solchen Konstrukt oder Paar von Konstrukten selber ein Fluorophor anstelle eines nicht-fluoreszierenden Quenchers wie Dabcyl. Alternativ kann bei Tests mit Einzelmarkierung, egal ob nun die Verwendung eines chemischen Fluorophors oder eines einzelnen fluoreszenten Fusionskonstrukts beteiligt ist, ein solcher nicht-fluoreszenter Quencher verwendet werden. Somit sind sowohl das Substrat des Enzyms (d.h. die natürliche Bindungsdomäne und, optional, der korrespondierende Bindungspartner) als auch die Reaktionsprodukte (d.h. die natürliche Bindungsdomäne und, optional, der korrespondierende Bindungspartner nach der Modifikation) beide fluoreszent, jedoch mit unterschiedlichen Fluoreszenzeigenschaften.
Insbesondere zeigen das Substrat und die modifizierten Produkte unterschiedliche Verhältnisse zwischen den Lichtmengen, die von den Donor- und Akzeptormarkierungen emittiert werden. Daher misst das Verhältnis zwischen den zwei Fluoreszenzen das Ausmaß der Umsetzung von Substrat zu Produkten unabhängig von der absoluten Größe entweder der optischen Dichte der Probe, der Helligkeit der Anregungslampe, der Empfindlichkeit des Detektors, etc. Darüber hinaus neigen von Aequorea abgeleitete oder hiermit verwandte Fluoreszenzproteinmarkierungen dazu, Protease-resistent zu sein. Daher ist es wahrscheinlich, dass sie ihre Fluoreszenzeigenschaften über den Verlauf eines Versuchs behalten.
Reporterpolypeptid-Fusionskonstrukt
Wie oben postuliert, sind rekombinante Nukleinsäurekonstrukte, die bei der Erfindung verwendet werden können, solche, die im Leseraster liegende Sequenzfusionen umfassen, die für eine natürliche Bindungsdomäne, Bindungssequenz oder ein Bindungspolypeptid oder einen Bindungspartner hierfür oder ein fluoreszentes Protein codieren. Wenn eine natürliche Bindungsdomäne, Bindungssequenz oder ein Bindungspolypeptid und deren/dessen Bindungspartner als Teil eines einzigen Polypeptids exprimiert werden sollen, so codiert das Nukleinsäuremolekül zusätzlich zumindest für ein Donor-Fluoreszenzprotein, das mit dem einen fusioniert ist, eine Akzeptor-Fluoreszenzprotein-Markierung, die mit dem anderen fusioniert ist, einen Linker, der die beiden aneinander koppelt und von hinreichender Länge und Flexibilität ist, um die Faltung des Polypeptids und die Paarung der natürlichen Bindungsdomäne, Bindungssequenz oder des Bindungspolypeptids mit dem Bindungspartner zu erlauben, sowie genregulatorische Sequenzen, die funktionsfähig mit der Fusion der codierenden Sequenzen verbunden sind. Wenn stattdessen einzelne Fusionsproteine codiert werden (egal, ob nun durch ein oder mehrere Nukleinsäuremoleküle), so muss jedes Nukleinsäuremolekül nur eine natürliche Bindungsdomäne, Bindungssequenz oder ein Bindungspolypeptid oder einen Bindungspartner hierfür codieren, fusioniert entweder an eine Donor- oder Akzeptor-Fluoreszenzprotein-Markierung und funktionsfähig mit genregulatorischen Sequenzen verbunden.
„Funktionsfähig verbunden" bezieht sich auf Polynukleotidsequenzen, die notwendig sind, um die Expression codierender und nicht-codierender Sequenzen, an die sie ligiert sind, zu bewirken. Die Natur solcher Kontrollsequenzen unterscheidet sich in Abhängigkeit vom Wirtsorganismus; bei Prokaryoten beinhalten solche Kontrollsequenzen im allgemeinen Promotor, Ribosomenbindungsstelle und Transkriptions-Terminationssequenz; bei Eukaryoten beinhalten solche Kontrollsequenzen im allgemeinen Promotoren und Transkriptionsterminationssequenz. Der Begriff „Kontrollsequenzen" soll im Minimum Komponenten beinhalten, deren Gegenwart die Expression beeinflussen kann, und sie können außerdem zusätzliche Komponenten beinhalten, deren Gegenwart vorteilhaft ist, z.B. Leader-Sequenzen und Fusionspartner-Sequenzen.
Wie oben beschrieben, ist die Donor-Fluoreszenzprotein-Markierung befähigt, ein Photon zu absorbieren und Energie auf eine andere fluoreszente Markierung zu übertragen. Die Akzeptor-Fluoreszenzprotein-Markierung ist befähigt, Energie zu absorbieren und ein Photon zu emittieren. Wenn nötig, verbindet der Linker die natürliche Bindungsdomäne, Bindungssequenz oder das Bindungspolypeptid und deren/dessen Bindungspartner entweder direkt oder indirekt über eine intermediäre Verknüpfung mit einem oder beiden von Donor- und Akzeptor-Fluoreszenzprotein-Markierung. Ungeachtet der relativen Anordnung der natürlichen Bindungsdomäne, Bindungssequenz oder des Bindungspolypeptids, dessen Bindungspartners, sowie der Donor- und Akzeptor-Fluoreszenzprotein-Markierungen auf einem Polypeptidmolekül, ist es essentiell, dass durch den Linker und/oder die natürliche Bindungsdomäne, Bindungssequenz oder das Bindungspolypeptid und deren/dessen Bindungspartner hinreichend Abstand zwischen den Donor und den Akzeptor gelegt wird, um sicherzustellen, dass FRET nicht auftritt, solange nicht die natürliche Bindungsdomäne, Bindungssequenz oder das Bindungspolypeptid und der zugehörige Bindungspartner binden. Es ist erstrebenswert, wie in größerem Detail in der WO 97/28261 beschrieben, ein Donor-Fluoreszenzprotein mit einem Emissionsspektrum auszuwählen, das mit dem Anregungsspektrum eines Akzeptor-Fluoreszenzproteins überlappt. Bei einigen Ausführungsformen der Erfindung wird die Überlappung der Emissions- und Anregungsspektren FRET erleichtern. Eine solche Überlappung ist jedoch nicht notwendig, wenn statt FRET die intrinsische Fluoreszenz gemessen wird. Ein Fluoreszenzprotein, das für die Erfindung von Nutzen ist, beinhaltet, zusätzlich zu denen mit intrinsischen Fluoreszenzeigenschaften Proteine, die aufgrund intramolekularer Umordnungen oder der Zugabe von Cofaktoren, die die Fluoreszenz fördern, fluoreszieren.
Beispielsweise können Grüne Fluoreszenzproteine („GFPs") von Cnidariern, die als deren Energie-Transferakzeptoren bei der Biolumineszenz fungieren, bei der Erfindung verwendet werden. Ein grünes Fluoreszenzprotein, wie hier verwendet, ist ein Protein, das mit grünem Licht fluoresziert, und ein blaues Fluoreszenzprotein ist ein Protein, das mit blauem Licht fluoresziert. GFPs sind aus der pazifischen Leuchtqualle Aequorea victoria, aus der Seefeder Renilla reniformis, und aus Phialidium gregarium isoliert worden (Ward et al., 1982, Photochem. Photobiol., 35: 803-808; Levine et al., 1982, Comp. Biochem Physiol., 72B: 77-85).
Es ist eine Vielzahl von mit Aequorea verwandten GFPs mit nützlichen Anregungs- und Emissionsspektren künstlich hergestellt worden, indem man die Aminosäuresequenz eines natürlich vorkommenden GFP aus Aequorea victoria modifiziert (Prasher et al., 1992, Gene, 111: 229-233; Heim et al., 1994, Proc Natl. Acad. Sci. USA., 91: 12501-12504; PCT/US95/14692). Wie hier verwendet, ist ein Aequorea-verwandtes Fluoreszenzprotein gegeben, wenn eine beliebige zusammenhängende Sequenz von 200 Aminosäuren eines solchen Fluoreszenzproteins wenigstens 95% Sequenzidentität mit einer Aminosäuresequenz, entweder zusammenhängend oder nicht-zusammenhängend, aus dem wildtypischen Grünen Aequorea-Fluoreszenzprotein mit der SwissProt-Zugangsnummer P42212 hat. Entsprechend kann das Fluoreszenzprotein unter Verwendung derselben Standards in Verwandtschaftsbeziehung zu Wildtyp-Fluoreszenzproteinen von Renilla oder Phialidium gesetzt werden.
Aequorea-verwandte Fluoreszenzproteine beinhalten z.B. wildtypisches (natives) Aequorea victoria GFP, dessen Nukleotid- und abgeleitete Aminosäuresequenz unter den Genbank-Zugangsnummern L29345, M62654, M62653 dargestellt sind, sowie andere mit Aequorea verwandte, künstlich hergestellte Versionen von GFP, von denen einige oben aufgelistet sind. Mehrere von diesen, d.h. P4, P4-3, W7 und W2 fluoreszieren bei einer merklich kürzeren Wellenlänge als der Wildtyp.
Rekombinante Nukleinsäuremoleküle, die für Einzel- oder Tandemanordnungen von fluoreszentem Protein/Polypeptid codieren, umfassend eine natürliche Bindungsdomäne, Bindungssequenz oder ein Bindungspolypeptid oder einen Bindungspartner hierfür, fusioniert mit einem Fluoreszenzprotein, das für die Erfindung nützlich ist, können für einen in vivo-Assay auf Aktivität eines modifizierenden Enzyms auf die codierten Produkte exprimiert werden. Alternativ können die codierten Fusionsproteine vor dem Test isoliert werden und stattdessen in einem zellfreien in vitro-Assay-System, wie hier an anderer Stelle beschrieben, getestet werden.
Protein-Modifikationen
Wir beschreiben Reagenzien und Verfahren zum Testen der Aktivität von Enzymen, die eine posttranslationale Modifikation von Proteinen durchführen. Die folgende Tabelle 2 listet nicht-limitierende Beispiele posttranslationaler Modifikationen auf.
Tabelle 2:
Phosphorylierung - Kinasen und Phosphatasen
Eine besonders wichtige posttranslationale Modifikation, für die eine große Anzahl von Enzymen und Zielen identifiziert wurde, ist Phosphorylierung und Dephosphorylierung. Die Technik ist voll von Referenzen zu diesen Enzymen, d.h. Proteinkinasen und Phosphatasen und ihren Zielen, einschließlich Konsensus-Phosphorylierungsmotiven (wie etwa -SQ- oder -TQ- für die DNA-abhängige Proteinkinase (DNA-PK)).
Einige nicht-limitierende Beispiele für Kinasen und deren Stellen für die posttranslationale Modifikation sind in Tabelle 2B dargestellt (Phosphorylierung/Dephosphorylierung). Tabelle 2B

X bezeichnet eine beliebige Aminosäure. Die Konsensus-Sequenzen sind entnommen aus Trends Biochem. Sci. (1990) 15: 342-346.

Weitere Beispiele für Proteinkinasen, die bis zum heutigen Zeitpunkt identifiziert sind, beinhalten die Protein-Tyrosinkinase-Subfamilie (wie etwa PDGF-Rezeptoren, EGF-Rezeptoren, src-Familie-Kinasen (siehe Brown und Cooper, 1996, Biochimica and Biophysica Acta 1287: 121-149 zur Übersicht), die JAK-Kinase-Familie (wie etwa JAK1, JAK2 und tyk2), Erb B2, Bcr-Abl, Alk, Trk, Res/Sky – für einen detaillierten Übersichtsartikel siehe Al-Obeidi et al., 1998, Biopolymers (Peptide Science), Band 47: 197-223), die Subfamilie des MAP-Kinase-Wegs (wie etwa die MAP-Familie, die ERK-Familie, die MEK-Familie, die MEKK-Familie, RAF-1 und JNK), die Cyclin-abhängige Kinase-Subfamilie (wie etwa p34^cdc2 und cdk2 – siehe Nigg, 1995, Bioassays 17: 471-480 für einen Übersichtsartikel), Wee1/Myt1, polo-artige Kinasen (wie etwa plk1, Plx1, POLO, Snk, Fnk/Prk Sak-a, Sak-b – siehe Lane und Nigg, 1997, Trends in Cell Biol. 7: 63-68), die Rezeptor-Serinkinase-Subfamilie, Proteinkinase C (PK-C), cAMP-abhängige Kinase (PK-A), cGMP-abhängige Kinase, Ca²⁺/Calmodulin-abhängige Kinasen (wie etwa CaM Kinase I, II und IV), DNA-abhängige Proteinkinase, Phosphoinositid-3-Kinasen, PDK-1, die Familie der p21-aktivierten Proteinkinasen (PAKs), wie etwa Pak1, Pak2 und Pak3 – siehe Sells und Chernoff, 1997, Trends in Cell Biol. 7: 162-167), p70 S6-Kinase, IkB-Kinase, Caseinkinase II, Glycogensynthase-Kinasen.
Eine Diskussion über bestimmte Kinase-Pathways, die an der Signaltransduktion beteiligt sind, findet sich in Kapitel 35 von Lewin, 1997, Gene VI, Oxford University Press.
Details über die Erkennungs- und Bindungsdomänen für eine Vielzahl von Kinasen finden sich in Kuriyan und Cowburn, 1997, Annu. Rev. Biophys. Biomol. Struc. 26:259-288.
Einige spezifische Beispiele von Kinasen, deren Aktivität unter Verwendung der Verfahren der Erfindung untersucht werden kann, beinhalten die src-Familie-Tyrosinkinasen Lck und Fyn, die die TCR ζ-Kette phosphorylieren, und die bekanntermaßen an der mit T-Zellrezeptor-Stimulation assoziierten Signaltransduktion beteiligt sind. Die TCR ζ-Kette umfasst spezifische Tyrosinreste, die in Immunrezeptor-Tyrosin-basierten Aktivierungsmotiven (ITAMs) vorhanden sind, die durch Lck und Fyn phosphoryliert werden (Kuriyan und Cowburn, 1997, ibidem). Die SH2-Domäne einer anderen Tyrosinkinase, ZAP70, bindet an phosphoryliertes TCR ζ. Somit repräsentieren TCR ζ ITAM und ZAP70 SH2 Bindungsdomänen und Bindungspartner, die von Interesse sein können, um die Aktivität der Kinasen Lck und Fyn zu untersuchen (siehe Elder et al., 1994, Science 264: 1596-1599 und Chan et al., 1994, Science 264: 1599-1601).
Ein weiteres Beispiel sind die IgE-Rezeptor-γ-Untereinheit und die SH2-Domäne von Syk, die verwendet werden können, um die Aktivität der Lyn-Kinase zu untersuchen.
Die Beispiele für die derzeit identifizierten Phosphatasen fallen in drei Hauptfamilien (für einen Übersichtsartikel siehe Barford et al., 1998, Annu Rev. Biophys. Biomol. Struc. 27: 133-164). Die PPP-Familie beinhaltet die folgenden katalytischen Untereinheiten: PP1c, PP2Ac, PP2B, PPP1, PPP2A und PPP5 und die folgenden regulatorischen Untereinheiten: NIPP-1, RIPP-1, p53BP2, _γI34.5, PR65, PR55, PR72, PTPA, SV40 kleines T-Antigen, PPY, PP4, PP6 und PP5.
Die PPM-Familie beinhaltet Pyruvat-Dehydrogenase-Phosphatase und Arabidopsis ABI1.
Die Protein-Tyrosin-Phosphatasefamilie beinhaltet PTP1B, SHP-1, SHP-2 (zytosolische Nicht-Rezeptorformen), CD45 (siehe Thomas und Brown, 1999, Trends in Immunol, 20: 406, und Ashwell und D'Oro, 1999, Trends in Immunol, 20: 412 für weitere Details), RPTP (rezeptorartig, Transmembranformen) und cdc25, Kinase-assoziierte Phosphatase und MAP-Kinase-Phosphatase-1 (Phosphatasen mit dualer Spezifität). Für PTP1B ist bekannt, dass es mit dem Insulinrezeptor in vivo assoziiert (Bandyopadhyay et al., 1997, J. Biol. Chem. 272: 1639-1645).
Ein einfacher FRET-Assay, basierend auf diesen Modifikationen an der Stelle für posttranslationale Modifikation, die auf einer natürlichen Bindungsdomäne vorliegt, kann durchgeführt werden, wie unten dargestellt. Es wird erwogen, dass andere auf Licht basierende Detektions-Assays, wie etwa diejenigen, die einzelne Markierungen benutzen, Markierungen und entsprechende Quencher, etc. verwendet werden können.
wobei:

NBD = Natürliche Bindungsdomäne, M = Modifikation,
F1 = Donor-Fluorophor, F2 = Akzeptor-Fluorophor

Alternativ kann ein auf FRET basierender Test einem solchen Format folgen:
Tabelle 3 stellt eine nicht-limitierende Liste von Enzymen bereit, die für die Klassen der hier diskutierten modifizierenden Enzyme repräsentativ und Assays gemäß der Erfindung zugänglich sind.
Tabelle 3
Die mehreren Typen posttranslationaler Modifikation, die oben dargestellt sind, werden unten in einigem Detail diskutiert, zusammen mit Assays, um die Enzyme zu testen, die solche Modifikationen durchführen und dabei natürliche Bindungsdomänen und Bindungspartner hierfür gemäß der Erfindung verwenden.
ADP-Ribosylierung
Mono-ADP-Ribosylierung ist eine posttranslationale Modifikation von Proteinen, von der man derzeit annimmt, dass sie eine grundlegende Rolle bei der zellulären Signalerzeugung spielt. Es ist eine Reihe von Mono-ADP-Ribosyltransferasen identifiziert worden, einschließlich endogenen Enzymen sowohl aus bakteriellen als auch aus eukaryotischen Quellen, sowie bakterielle Toxine. Ein Mono-ADP-ribosylierendes Enzym, das als Substrate das zu modifizierende Protein und Nikotinamid-Adenin-Dinukleotid (NAD⁺) verwendet, ist NAD:Arginin-ADP-Ribosyltransferase (Zolkiewska et al., 1992, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 89: 11352-11356). Die Reaktionen, die von bakteriellen Toxinen, wie etwa Cholera- und Keuchhusten-Toxin, katalysiert werden, sind gut verstanden; die Aktivitäten dieser Toxine resultieren in einer dauerhaften Modifikation heterotrimerer G-Proteine. Von endogenen Transferasen wird ebenfalls angenommen, dass sie G-Proteine modifizieren und daher eine Rolle bei der Signaltransduktion in der Zelle spielen (de Murcia et al., 1995, Trends Cell Biol., 5: 78-81 ). Das Ausmaß der Effekte, die ADP-Ribosylierung in der Zelle vermitteln kann, wird durch das Beispiel von Brefeldin A, einem Pilztoxin-Metaboliten von Palmitinsäure, veranschaulicht. Dieses Toxin induziert die Mono-ADP-Ribosylierung von BARS-50 (einem G-Protein, das am Membrantransport beteiligt ist), sowie von Glyceraldehyd-3-Phosphat-Dehydrogenase. Die zellulären Wirkungen von Brefeldin A beinhalten das Blockieren der konstitutiven Proteinsekretion und die ausgedehnte Zerstörung des Golgi-Apparates. Für Inhibitoren der Brefeldin A Mono-ADP-Ribosyltransferase-Reaktion ist gezeigt worden, dass sie der vom Toxin induzierten Zerlegung des Golgi-Apparates antagonistisch entgegenwirken (Weigert et al., 1997, J. Biol. Chem. 272: 14200-14207). Es ist für eine Anzahl von Aminosäureresten in Proteinen gezeigt worden, dass sie als ADP-Ribose-Akzeptoren fungieren. Es sind bakterielle Transferasen identifiziert worden, die Arginin, Asparagin, Cystein und Diphthamid-Reste in Zielproteinen modifizieren. Es sind endogene eukaryotische Transferasen bekannt, die ebenfalls diese Aminosäuren modifizieren; zusätzlich gibt es Hinweise, dass Serin-, Threonin-, Tyrosin-, Hydroxyprolin- und Histidin-Reste als ADP-Ribose-Akzeptoren wirken können, jedoch sind die relevanten Transferasen noch nicht identifiziert worden (Cervantes-Laurean et al., 1997, Methods Enzymol., 280: 275-287 und Bezugsstellen darin).
Man nimmt an, dass die Poly-ADP-Ribosylierung eine wichtige Rolle bei Ereignissen wie der DNA-Reparatur, -Replikation, -Rekombination und -Verpackung und außerdem bei der Chromosomen-Dekondensation spielt. Das Enzym, das für die Poly-ADP-Ribosylierung von an diesen Prozessen beteiligten Proteinen verantwortlich ist, ist Poly(ADP-Ribose)-Polymerase (PARP; für Drosophila melanogaster PARP, siehe Genbank-Zugangsnummern D13806, D13807 und D13808). Die Entdeckung eines Leucin-Zippers in der Auto-poly(ADP-Ribosyl)ierungs-Domäne der Säuger-PARP (Uchida et al., 1993, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90: 3481-3485) legte nahe, dass diese Region wichtig sein könnte für die Dimerisierung von PARP und ebenso für dessen Interaktion mit anderen Proteinen (Mendoza-Alvarez et al., 1993, J. Biol. Chem, 268: 22575-22580).
Spezifische Beispiele für ADP-Ribosylierungsstellen sind diejenigen, die sich an Cys₃ und Cys₄ (unterstrichen) des Proteins B50 finden (Coggins et al., 1993, J. Neurochem., 60: 368-371; SwissProt-Zugangsnummer P06836):
MLCCMRRTQVEKNDDD
und Pγ (die γ-Untereinheit der cyclischen CMP-Phosphodiesterase; Bondarenko et al., 1997, J. Biol. Chem., 272: 15856-15864; Genbank-Zugangsnummer X04270):
FKQRQTRQFK.
Zwei nicht-limitierende Beispiele von Assays auf enzymatische Aktivität gemäß der Erfindung, wobei diese Assays auf der Detektion von Veränderungen der ADP-Ribosylierungs-abhängigen Protein:Protein-Bindung basieren, werden kurz wie folgt zusammengefasst:
Assay 1:
Dieser Assay verwendet als Reportermoleküle die folgenden:
Die cGMP-Phosphodiesterase γ-Untereinheit der Netzhautstäbchen (Pγ: Gesamtprotein; oder nur die Aminosäuren 19-87, mutiert, um die Phosphorylierungsstelle an Thr₂₂ zu entfernen; Bondarenko, 1997, J. Biol. Chem., 272: 15856-15864; Tsuboi et al., 1994, J. Biol. Chem., 269: 15016-15023; OWL-Zugangsnummer P04972; Genbank-Zugangsnummer X04270).
Die Transducin-α-Untereinheit (Tα; Gesamtprotein oder nur die Aminosäuren 293-314, Acetyl-EDAGNYIKVQFLELNMRRDVKE-Amid; Rarik et al., 1992, Science, 256: 1031-1033; OWL-Zugangsnummer P04695; Genbank-Nr. K03254).
Diese Proteine sind Komponenten des Licht-Antwort-Systems von Vertebraten, welches Transducin (ein heterotrimeres G-Protein), eine cGMP-spezifische Phosphodiesterase (PDE) und Rhodopsin beinhaltet. Analoge Komponenten können bei einer Anzahl G-Protein-gekoppelter Signalsysteme identifiziert werden. Tα-GTP aktiviert seinen Effektor, cGMP-PDE, durch Binden an die inhibitorischen Untereinheiten dieses Proteins und somit durch Aufheben der Inhibition von dessen enzymatischer Aktivität (Stryer, 1986, Ann. Rev. Cell Biol., 2: 391-419). Es ist gezeigt worden, dass die ADP-Ribosylierung von Pγ an Arg₃₃ oder Arg₃₆ erfolgt, wenn Pγ mit Pαβ komplexiert ist, nicht jedoch, wenn es mit Tα komplexiert ist (Bondarenko et al., 1997, supra). Es ist vorgeschlagen worden, dass die Stellen der ADP-Ribosylierung in dem Pγ-Tα-Komplex maskiert sind. Dieser Test auf ADP-Ribosylierung kann angepasst werden, um die De-ADP-Ribosylierung von Pγ zu detektieren. Dabei kommt es zu Problemen, da die Affinität von Pγ für seine alternativen Partner von anderen Faktoren beeinflusst wird, einschließlich des Nukleotids, das an Tα gebunden ist (Tα-GTP besitzt eine höhere Affinität für Pγ als Tα-GDP) und des Phosphorylierungszustands von Pγ. Dies kann überwunden werden, indem man ein Tα-Peptid verwendet, um die Wirkungen des Nukleotid-Austauschs zu vermeiden und durch Verwenden eines Pγ-Peptids, dem die relevante Phosphorylierungsstelle fehlt (Thr₂₂; Tsuboi et al., 1994, supra). Ein 4/6-Loop-Peptid (Aminosäuren 293-314) besitzt hohe Affinität für Pγ (Noel et al., 1993, Nature, 366: 654-663). Die Befähigung dieses Systems, als ein Assay für die ADP-Ribosylierungsreaktion verwendet zu werden, hängt von der Affinität des Tα-Peptids (Aminosäuren 293-314) für Pγ (Aminosäuren 19-87) ab. Wenn die Bindung zu fest ist, kann stattdessen ein kürzeres Peptid verwendet werden, für das ebenfalls berichtet wurde, dass es die PDE-Aktivität stimuliert (d.h. mit Pγ assoziiert; Rarick et al., 1992, supra).
Der Aufbau für einen solchen Test ist wie folgt:
wobei F1 der Donor-Fluorophor und F2 der Akzeptor ist.
Anordnung der chemischen Fluorophoren:
Es gibt mehrere Lysinreste nahe den modifizierten Argininresten in der Pγ-Sequenz. Kandidaten für die Markierung beinhalten K₂₅, K₄₁, K₄₄ und K₄₅. Das Protein besitzt einen einzelnen C-Rest, C₆₈. Die Markierung hier kann die Anfügung eines einzelnen Fluorophors an einer bekannten Stelle erleichtern.
Das Peptid Tα besitzt zwei Lysinreste, die markiert werden können, K₃₀₀ und K₃₁₃. Die geeignetsten Markierungsstellen-Paarungen können auf Basis solcher Strukturinformation, so wie verfügbar, und/oder durch empirisches Testen von Markierungen an verschiedenen Kombinationen von Stellen ausgewählt werden.
Platzierung einer Fluoreszenzprotein-Markierung:
GFP eines weiteren Fluoreszenzproteins kann an eine natürliche Bindungsdomäne, Bindungssequenz oder an ein Bindungspolypeptid und/oder deren/dessen Bindungspartner entweder am C-Terminus oder auch am N-Terminus der beiden Moleküle fusioniert werden, gefolgt von empirischer Detektion der markierten Polypeptide in Kontrollprotein-Bindungsreaktionen.
Assay 2:
Die folgende Komponente wird bei einem Homodimerisierungstest verwendet: Drosophila-PARP (ganzes Protein oder Aminosäuren 369-994, ohne die Zinkfinger-DNA-Bindungsdomäne; Uchida et al., 1993, Proc. Natl. Acad. Sci U.S.A., 90: 3481-3485; OWL-Zugangsnummer P35875; Genbank-Zugangsnummern D13806, D13807 und D13808).
Drosophila PARP besitzt ein Leucin-Zipper-Motiv in der Auto-poly(ADP-Ribosyl)ierungs-Domäne, das sich auch in Sequenzen von Rind, Maus, Huhn und Mensch findet. Es wird vorausgesagt, dass zwei konservierte Glutamatreste Stellen der poly(ADP-Ribosylierungs)-Automodifikation sind. Es ist vorgeschlagen worden, dass die poly(ADP-Ribosylierung) dieser Stellen in der Dissoziation des Dimers aufgrund der großen negativen Ladung des Polymers resultiert (Mendoza-Alvarez et al., 1993, supra). Es wird ein katalytisches Dimer benötigt, damit die Reaktion voranschreiten kann, da für die Automodifikationsreaktion gezeigt wurde, dass diese intermolekular verläuft (Mendoza-Alvarez et al. 1993, supra). Es wird vorhergesagt, dass die Leucin-Zipper-Domäne ebenfalls die Heterodimerisierung von PARP vermittelt; somit können andere Bindungspartner der poly(ADP-Ribosylierung) bei diesem Assay der Erfindung nützlich sein.
Der Test wäre somit:
wobei F1 der Donor-Fluorophor und F2 der Akzeptor ist.
Bei Reportermolekülen eines solchen Assays befinden sich die chemischen Fluorophore an Rest K₄₁₆, gerade außerhalb des Leucin-Zippers, oder an den Resten in den Positionen b, c oder f des Leucin-Zippers (z.B. K₃₈₉). Wenn ein Fluoreszenzprotein (z.B. GFP) verwendet wird, wird es an den N-Terminus des trunkierten PARP-Moleküls platziert.
Ubiquitinierung
Die Ubiquitinierung eines Proteins leitet das Protein zu seiner Zerstörung durch das Proteasom. Dieser Abbauprozess verläuft sehr schnell (t_1/2 ~ 60 Sekunden), und viele Proteine mit schnellen Umsetzungskinetiken werden über diese Route zerstört. Diese beinhalten unter anderem Cycline, p53, Transkriptionsfaktoren und Transkriptions-regulierende Faktoren. Somit ist die Ubiquitinierung wichtig bei Prozessen, wie etwa der Zellzyklus-Kontrolle, dem Zellwachstum, Entzündung, Signaltransduktion; zusätzlich wird das Versagen der Ubiquitinierung von Proteinen in angemessener Weise bei der malignen Transformation impliziert. Ubiquitin ist ein 76-Aminosäuren-Protein, das durch eine Isopeptidbindung zwischen der Aminogruppe eines Lysinrestes und dem C-terminalen Glycinrest von Ubiquitin kovalent an ein Zielprotein angeheftet wird. Eine solche Modifikation ist bekannt als Mono-Ubiquitinierung, und diese kann an vielen Lys-Resten innerhalb eines Zielproteins erfolgen. Nach seiner Anheftung kann das Ubiquitin selber ubiquitiniert werden, was somit verlängerte, verzweigte Ketten von Polyubiquitin ausbildet. Es ist diese spätere Stufe, die die Zerstörung des Zielproteins durch das Proteasom signalisiert. Bei dem Prozess der Zerstörung scheint es so zu sein, dass das polyubiquitinierte Protein über ein molekulares Chaperonprotein zu dem Proteasom gebracht wird, wobei die Ubiquitinmoleküle unbeschädigt entfernt (und recycelt werden) und das Ziel abgebaut wird.
Ubiquitinierung ist ein komplexer Prozess, der die Wirkung von drei Enzymen erfordert: Ubiquitin-aktivierendes Enzym E1 (für den Menschen: Genbank-Zugangsnummer X56976), Ubiquitin-konjugierendes Enzym E2, auch als Ubiquitin-Träger-Protein bezeichnet (für die menschliche 17kDa-Form: Genbank-Zugangsnummer X78140) und Ubiquitin-Proteinligase E3 (UBR1; menschlich, Genbank-Zugangsnummer AF061556). Es gibt mehrere Formen jedes dieser Enzyme in der Zelle, und die obigen Beispiele sind daher nicht-limitierend.
Zwei Beispiele für Ubiquitinierungsstellen aus natürlichen Proteinen, IκB (Dai et al., 1998, J. Biol. Chem., 273: 3562-3573; Genbank-Zugangsnummer M69043) und β-Galactosidase (Johnson et al., 1990, Nature, 346: 287-291) sind wie folgt:
IκB:

NH₃-MFQAARPQEWAMEGPRDGLKKERLLDDRH-COOH

β-Galactosidase

NH₃-HGSGAWLLPVSLVKRKTTLAP-COOH

wobei der ubiquitinierte Lysinrest jeweils unterstrichen ist (z.B. Lys₁₅ und Lys₁₇ für β-Galactosidase).
Gemäß der Erfindung misst ein Ubiquitinierungs-Assay eher die Anfügung von Ubiquitin an als die Zerstörung von einer natürlichen Bindungsdomäne, Bindungssequenz oder einem Bindungspolypeptid.
Ein solcher Assay ist unten kurz zusammengefasst:
Die Testkomponenten sind wie folgt:
NFκB IκB und VCP
NFκB ist ein Transkriptionsfaktor, der durch die feste Assoziation mit einem Inhibitorprotein, IκB, oder durch andere Mitglieder dieser Proteinfamilie im Zytoplasma festgehalten wird (Baldwin, 1996, Ann. Rev. Biochem., 14: 648-681). Eine Vielzahl von Signalen veranlasst die Freisetzung von NFκB von IκB und die nachfolgende Bewegung von NFκB in den Zellkern, wo dieser als Transkriptionsfaktor wirkt. IκB wird zuerst an zwei Resten (Ser₃₂ und Ser₃₆) phosphoryliert, was die Ubiquitinierung von IκB an Lys₂₁ und anderen Resten veranlasst; eine solche Modifikation markiert IκB für die Zerstörung durch das Proteasom (Dai et al., 1998, J. Biol. Chem., 273: 3562-3573). Es ist vorgeschlagen worden, dass nach der Ubiquitinierung von IκB ein molekulares Chaperonprotein, VCP, an IκB bindet und NFκB verdrängt (Dai et al., 1998, supra), wonach vermutet wird, dass VCP IκB für die Zerstörung zu dem Proteasom transportiert. Ein Fragment von IκB (Aminosäuren 1-242) kann an den frühen Stufen des obigen Prozesses teilnehmen (d.h. es wird phosphoryliert und ubiquitiniert und bindet VCP), jedoch wird es dann nicht durch Proteolyse zerstört (Dai et al., 1998, supra).
Ein Test auf Ubiquitinierung in diesem nicht-limitierenden Beispiel unter Verwendung der natürlichen Bindungsdomänen, die sich in diesem Pathway finden, wäre wie folgt: F1-(NFκB)(IκB)-F2 + VCP + ATP + Ub → F1 – (NFκB) – (NFκB) + P, Ub – (IκB) – F2 (VCP) + ADP
F1 ist dabei der Donor-Fluorophor, F2 der Akzeptor, P ist die Phosphorylierung, und Ub ist Ubiquitin.
Wenn der Test unter Verwendung von Fragmenten der Proteine voller Länge konstruiert werden soll, und zwar denjenigen, die die natürlichen Bindungsdomänen umfassen (d.h. solchen, die „Bindungssequenzen" sind, wie oben definiert), so sind die interessierenden Regionen von NFκB und IκB:
Für das NFκB p65:p50-Heterodimer:
p65 (Aminosäuren 12-317), wie beschrieben als befähigt zur Bindung von IκB (Jaffray et al., 1995, Mol. Cell Biol., 15: 2166-2172).
p50 (Aminosäuren 39-364; Ghosh et al., 1995, Nature, 373: 303-310). Dies repräsentiert die murine Sequenz (Zugangsnummer M57999, M37732). Als Alternative kann das humane p50 (Aminosäuren 2-366; Muller et al., 1995, Nature, 373: 311-317) verwendet werden.
Für IκB und VCP:
IκB (Aminosäuren 1-305: wie abgeleitet aus den Daten von Bell et al., 1996, Mol. Cell Biol., 16: 6477-6485). Die Aminosäuresequenz von IκB ist beschrieben worden (Davis et al., 1991, Science, 253: 1268-1271). Die saure Domäne von IκB, die die Reste 275-300 beinhaltet, wird für die effektive Bindung von NFκB benötigt. VCP, das einen „optisch inaktiven" Teil dieses Tests darstellt (d.h. nicht fluoreszent markiert ist), wird als vollständiges Protein verwendet, da eine funktionelle Aufspaltung von VCP bislang noch nicht beschrieben wurde.
Anordnung der Fluorophore (chemisch):
Vor der Verwendung in einem Test der Erfindung sollten eine natürliche Bindungsdomäne und der Bindungspartner, die verwendet werden, um die Ubiquitinierung zu untersuchen, an einer Anzahl von Positionen markiert werden und der Abstand zwischen F1 und F2 empirisch optimiert werden. Dazu können bestehende Reste verwendet werden, die mit fluoreszenten Farbstoffen konjugiert werden können. Alternativ können zum Zwecke einer Konjugation mit fluoreszenten Farbstoffen neue Reste durch positionsspezifische Mutagenese eingeführt werden; solche Veränderungen müssen jedoch an Resten vorgenommen werden, die nicht Teil der natürlichen Bindungsdomäne sind.
Potentielle Markierungsstellen an p50 (humane Sequenz) beinhalten: K₂₇₈, K₂₇₅, K₂₅₂, K₁₄₈. Diese Reste scheinen nahe zu der NLS-Stelle (Bell et al., 1996, supra) zu liegen, von der man annimmt, dass sie einen Teil des IκB-Bindungsmerkmals darstellt, wobei sie jedoch nicht durch die IκB-Bindung geschützt werden; somit sollte eine Modifikation an diesen Positionen, um eine Markierung unterzubringen, nicht störend in die Bindung eingreifen.
Potentielle Markierungsstellen auf IκB: Bindungsstellen für NFκB scheinen innerhalb der Region der Aminosäuren 200-300 von IκB vorzuliegen (Jaffray et al., 1995, supra). Cys- oder Lys-Reste innerhalb dieser Region können für die Anfügung einer Markierung verwendet werden, vorausgesetzt, dass sie nicht innerhalb der sauren Domäne (Reste 275-300) liegen, die bei der Protein:Protein-Bindung mitwirkt. Gute Kandidatenstellen beinhalten K₂₄₂, K₂₄₉ und C₂₁₉.
Wo ein Fluoreszenzprotein anzuheften ist:
Für P50 von NFκB (murine Aminosäuren 39-364, humane Aminosäuren 2-366 oder, alternativ, ein intaktes humanes oder murines Protein) wird das Fluoreszenzprotein an den C-Terminus von P50 fusioniert. Da IκB am C-Terminus von NFκB bindet, muss das Fluoreszenzprotein (z.B. GFP) sich in enger Nähe zu der Bindungsstelle befinden.
Für IκB (vollständiges Protein oder Aminosäuren 1-305) wird das Fluoreszenzprotein am C-Terminus angebracht. NFκB bindet am C-Terminus von IκB; daher sollte das Fluoreszenzprotein sich nahe der Bindungsstelle befinden.
Ein zweiter Assay wird wie folgt angeordnet:
In diesem Fall ist NFκB entweder ein intaktes Protein oder ein partielles Protein, wie oben beschrieben (siehe erster Assay). Es ist bei diesem Assay nicht fluoreszent markiert.
Der Teil von IκB, der bei diesem Assay von Nutzen ist, ist derjenige, der die Aminosäuren 1-242 umfasst, da ein Polypeptid dieser Sequenz ubiquitiniert werden kann, jedoch nicht bis zur Proteasom-Zerstörung voranschreitet (siehe oben; Dai et al., 1998, supra).
Es wird das VCP-Protein voller Länge verwendet.
Positionierung der Fluorophore (chemisch): IκB wird markiert, wie oben in Assay 1 beschrieben. Für VCP müssen die optimalen K- oder C-Reste für die Anheftung der Markierung empirisch bestimmt werden.
Position eines Fluoreszenzproteins: Der C-Terminus von IκB wird mit dem Fluoreszenzprotein wie oben fusioniert.
Für VCP wird die relative Eignung der N-terminalen und C-terminalen Anheftung eines Fluoreszenzproteins (z.B. GFP oder eine Variante hiervon) empirisch bestimmt. Alternativ, da die Strukturanalyse von VCP weiter fortgeschritten ist, kann das Fluoreszenzprotein an Stellen außerhalb der Bindungsdomäne angeheftet werden.
Ein drittes Format, durch das die Ubiquitinierung gemäß der Erfindung untersucht werden kann, beinhaltet die Bindung von (SINA)₂ und PHYL an TTK und die nachfolgende Ubiquitinierung von TTK (und den Abbau; Li et al., 1997, Cell, 90: 469-478). Diese Proteine, die im Zellkern lokalisiert sind, werden in Tests der Erfindung in ganzer Form verwendet.
Glykosylierung
N-gebundene Glykosylierung ist eine posttranslationale Modifikation von Proteinen, die im endoplasmatischen Retikulum und im Golgi-Apparat stattfindet und die bei einigen Proteinen verwendet wird, die sich auf dem Weg zur Sekretion befinden oder für die Expression auf der Zelloberfläche oder in einer anderen Organelle bestimmt sind. Die Kohlenhydratgruppierung wird an Asn-Resten in den nicht-zytoplasmatischen Domänen der Zielproteine angeheftet, und die Konsensus-Sequenz (Shakineshleman, 1996, Trends Glycosci. Glycotech., 8: 115-130) für eine Glykosylierungsstelle ist NxS/T, wobei x nicht Prolin oder Asparaginsäure sein kann. N-gebundene Zucker besitzen aufgrund des Biosynthesewegs einen gemeinsamen Kern von fünf Resten, bestehend aus zwei GlcNAc-Resten und drei Mannose-Resten. Dieser Kern wird durch eine Vielzahl von Golgi-Enzymen modifiziert, um drei allgemeine Klassen von Kohlenhydrat zu ergeben, die bekannt sind als Oligomannosyl, Hybrid und Laktosamin-enthaltende oder komplexe Strukturen (Zubay, 1998, Biochemistry, Wm. C. Brown Publishers). Ein Enzym, das bekanntermaßen die N-Glykosylierung am Anfangsschritt der Synthese von Dolichyl-P-P-Oligosacchariden vermittelt, ist UDP-N-Acetylglucosamin-Dolichyl-phosphat-N-acetylglucosamin-Phosphotransferase (für die Maus, Genbank-Zugangsnummern X65603 und S41875).
Sauerstoff-gebundene Glykosylierung kommt ebenfalls in der Natur vor, unter Anheftung verschiedener Zuckergruppierungen an Ser- oder Thr-Reste (Hansen et al., 1995, Biochem. J., 308: 801-813). Komplexe O-gebundene Glykosylierung kann in wenigstens sechs Klassen aufgeteilt werden: Mucin-Typ, Ser-1-GlcNAc; Proteoglykan-Typ, Ser-Gal-Gal-Xyl-Kern; Kollagen-Typ, Hydroxylys-Gal-Glc; Gerinnungsfaktortyp, Ser-Xyl-Glc- oder Ser-Xyl-Xyl-Glc-Kern; Pilz-Typ, Ser-Man; Pflanzentyp, Hydroxypro-Ara oder Ser-Gal (wobei GlcNAc = N-Acetylglucosamin, Gal = Galactose, Xyl = Xylose; Glc = Glucose, Man = Mannose und Ara = Arabinose; Hansen et al., 1995, supra). Intrazelluläre Proteine sind unter den Zielen der O-Glykosylierung durch die dynamische Anheftung und Entfernung von O-N-Acetyl-D-Glucosamin (O-GlcNAc; Übersichtsdarstellung von Hart, 1997, Ann. Rev. Biochem., 66: 315-335). Proteine, für die bekannt ist, dass sie O-glykosyliert werden, beinhalten Zytoskelettproteine, Transkriptionsfaktoren, den Kernporen-Protein-Komplex und Tumorsuppressor-Proteine (Hart, 1997, supra). Häufig sind diese Proteine auch Phosphoproteine, und es wird vorgeschlagen, dass O-GlcNAc und die Phosphorylierung eines Proteins reziproke Rollen spielen. Es ist weiterhin vorgeschlagen worden, dass die Glykosylierung eines einzelnen Proteins Protein:Protein-Interaktionen reguliert, an denen dieses beteiligt ist.
Spezifische Stellen für die Addition von O-GlcNAc finden sich z.B. in Ser₂₇₇, Ser₃₁₆ und Ser₃₈₃ von p67^SRF (Reason of al., 1992, J. Biol. Chem., 267: 16911-16921; Genbank-Zugangsnummer J03161). Die Erkennungssequenzen, die diese Reste umfassen, sind unten dargestellt:
²⁷⁴GTTSIQTAP
³¹³SAVSSADTVLK
³⁷⁴DSSTDLTQTSSSGTVTLP
Die Identität von Stellen für O-GlcNAc ist zusätzlich für eine kleine Zahl von Proteinen bekannt, einschließlich c-myc (Thr₅₈, auch eine Phosphorylierungsstelle; Chou et al., 1995, J. Bio. Chem., 270: 18961-18965), das Kernporenprotein p62 (siehe Reason of al., 1992, supra);
MAGGPADTSDPL
und Bande 4.1 aus Erythrozyten (siehe Reason et al., 1992, supra):
AQTITSETPSSTT.
Die Stelle, an der die Modifikation stattfindet, ist in jedem Fall unterstrichen. Die Reaktion wird durch o-GlcNAc-Transferase vermittelt (Kreppel et al., 1997, J. Biol. Chem., 272: 9308-9315).
Mehrere nicht-limitierende Beispiele von Assay-Formaten, die gemäß der Erfindung nützlich für die Überwachung glykosylierender Enzyme sind, können wie folgt zusammengefasst werden:
Assay 1:
Die Reporterpolypeptide eines ersten Glykosylierungs-Assays sind:
Hepatisches Lektin aus Huhn (Aminosäuren 49-207, vorhergesagte extrazelluläre Domänen; Burrows et al., 1997, Biochem. J., 324: 673-680; OWL-Zugangsnummer P02707; Genbank-Zugangsnummer M63230).
c-Myc (Aminosäuren 1-143, N-terminale Transaktivierungsdomäne; Chou et al., 1995, J. Biol. Chem., 270: 18961-18965; OWL-Zugangsnummer P01107; Genbank-Zugangsnummer V00568).
Hepatisches Lektin aus Huhn (CHL) ist ein Typ II-Transmembranprotein, das eine nahezu vollständige Spezifität für N-Acetylglucosamin zeigt, wobei es diesen Rest über die C-terminale, extrazelluläre Kohlenhydrat-Erkennungsdomäne (CRD) bindet. Der intakte Rezeptor besteht vermutlich aus einem Trimer von Polypeptiden, stabilisiert durch eine Coiled-Coil-Struktur, die von der Transmembran-Region ausgebildet wird, und den Stiel unmittelbar N-terminal zu der CRD. Molekulare Modellbildung legt jedoch nahe, dass die Zucker-bindende Stelle von einem einzelnen Polypeptid ausgebildet wird (Burrows et al., 1997, supra). Es ist wahrscheinlich, dass glykosyliertes c-Myc an dem O-GlcNAc an Thr₅₈ gebunden wird.
c-Myc ist ein Protoonkogen-Produkt, das eine Rolle bei der Kontrolle der Gentranskription spielt. Eine Mutation oder Fehlregulation der Expression dieses Proteins kann zur malignen Transformation von Zellen beitragen. Man nimmt an, dass die O-GlcNAcylierung von c-Myc an Thr₅₈ reziprok zur Phosphorylierung an dieser Stelle wirkt, die außerdem eine Stelle häufiger Mutation bei humanen Lymphomen ist (Chou et al., 1995, supra).
Zusätzlich zu seiner Nützlichkeit bei enzymatischen Assays der Erfindung kann dieser Assay auf O-Glc-NAcylierung angepasst werden, um die Modifikation bei der großen Anzahl zytoplasmatischer und nukleärer Proteine zu überwachen, von denen man annimmt, dass sie O-Glc-NAcylierung unterworfen sind (Hart, 1997, Ann. Rev. Biochem., 66: 315-35).
Der Test wäre somit:
wobei F1 der Donor-Fluorophor und F2 der Akzeptor-Fluorophor ist.
Platzierung des chemischen Fluorophors:
Ausgehend von der molekularen Modellbildung der Interaktion zwischen CHL und N-Acetylglucosamin (basierend auf der MBP-C-Kristallstruktur, Burrows et al., 1997, supra; Weis et al., 1992, Nature, 360: 127-134) nimmt man an, dass sich die Bindungsstelle in der C-terminalen Region der Domäne befindet. Mögliche Markierungsstellen beinhalten K₁₆₈, E₁₆₇, E₂₀₂ und K₂₀₇.
In Ermangelung vollständiger Strukturdaten für c-Myc müssen die Markierungsstellen empirisch getestet werden. K₅₁ und K₅₂ liegen nahe bei der glykosylierten Stelle, und somit kann die Markierung an diesen Stellen in die Interaktion zwischen c-myc und CHL eingreifen. Andere Kandidatenstellen beinhalten E₃₉, E₄₇, R₆₆, R₈₃, K₁₂₆ und K₁₄₃.
Platzierung eines Fluoreszenzproteins:
Bei Reportermolekülen dieses Glykosylierungs-Assays würde ein Fluoreszenzprotein (z.B. Grünes Fluoreszenzprotein (GFP)) an den C-Terminus der CHL-Domäne platziert und vermutlich an den N-Terminus der Transaktivierungsdomäne von c-Myc. Da die Glykosylierungsstelle in der c- Myc-Transaktivierungsdomäne in der Primärstruktur von den Enden nahezu gleich beabstandet ist, müsste die geeignetste Stelle in Ermangelung von Strukturinformation empirisch bestimmt werden.
Assay 2:
Ein zweiter Glykosylierungs-Assay zur Verwendung bei der Erfindung umfasst die folgenden Reporter-Moleküle:
Tau (Wang of al., 1996, Nature Medicine, 2: 871-875; OWL-Zugangsnummer P10636; Genbank-Zugangsnummer X14474), Galanthus nivalis Agglutinin (Wang et al., 1996, supra; Hester et al., 1995, Nature Structural Biology, 2: 472-479; OWL-Zugangsnummer P30617; Genbank-Zugangsnummer M55556).
Für tau aus dem Gehirn von Patienten mit Alzheimer-Erkrankung (AD) ist gezeigt worden, dass es glykosyliert wird (bestimmt durch Lektin-Bindung auf Western Blots), wogegen tau aus normalem Gehirngewebe kein Anzeichen solcher Glykosylierung zeigt. Für diese anormale posttranslationale Modifikation ist gezeigt worden, dass sie eine Rolle bei der Aufrechterhaltung der helikalen Windungen in gepaarten Helix-Filament (PHF)-Strukturen spielt, die von tau im AD-Neuron ausgebildet werden (Wang et al., 1996, supra); bei dieser Studie wurden verschiedene Lektine verwendet, um verschiedene Kohlenhydratgruppierungen an dem tau-Protein zu identifizieren. Galanthus nivalis Agglutinin (GNA) erkennt primär terminal gebundene Mannosereste. Die Verwendung dieses Proteins als Assay für die Modifikation von Tau erlaubt die Überwachung der Anfügung eines terminalen Mannoserests an eine Kohlenhydratkette an diesem Protein. Gemäß bestimmter Ausführungsformen dieses Assays der Erfindung kann die Anfügung anderer Reste überwacht werden, und zwar durch Austausch von GNA durch andere Lektine mit anderen Zucker-Erkennungsspezifitäten als der von GNA.
Die Kristallstruktur von GNA ist bestimmt worden (Hester et al., 1995, supra); diese zeigt an, dass das Protein aus einem Dimer von Dimeren besteht, wobei die hohe Affinität besitzende Mannose-Bindungsstelle an der Grenzfläche zwischen den Untereinheiten A und D, oder, alternativ, B und C, ausgebildet wird. Diese Bindungsstelle besteht aus Strängen, die von den N- und C-terminalen Regionen einer Untereinheit (Reste 1-6 und 82-101) und außerdem einem C-terminalen Strang der Partneruntereinheit (Reste 102-109) bereitgestellt werden. Es wird vorgeschlagen, dass die Domänenstruktur auf eine kovalente Verbindung zwischen Untereinheiten während der Evolution dieses Tetramers hinweist (Hester et al., 1995, supra). Dieser Assay kann daher so angeordnet werden, dass er die gesamte, zusammengebaute Tetramer-Struktur mit einer fluoreszenten Markierung an nur einer Untereinheit verwendet oder potentiell ein kovalentes Dimer von Untereinheiten, wiederum mit einer Markierung.
Ein Assay dieses Typs wird schematisch wie folgt dargestellt:
wobei F1 der Donor-Fluorophor und F2 der Akzeptor ist. CHO repräsentiert die Glykosylierung von tau vor der Anfügung der terminalen Mannose.
Tau-Protein enthält eine Anzahl von Resten, die markiert werden können, wobei der vorteilhafteste hiervon empirisch bestimmt werden muss.
Es existiert eine Anzahl potentieller Markierungsstellen innerhalb der GNA-Subdomäne, die an der hochaffinen Mannosebindung teilnimmt. Diese beinhalten D₁, K₉₀ (wobei dieser Rest sehr nahe zu der Stelle der Interaktion mit dem Mannoserest liegt), D₁₀₀ und R₁₀₁. Alternativ kann eine kurze C-terminale Verlängerung eine Markierungsstelle tragen.
Wie oben muss die Stelle für die Fusion von GFP an tau empirisch bestimmt werden. Die Markierung der GNA-Subdomäne entweder am C- oder N-Terminus ist gleichermaßen wirkungsvoll.
Prenylierung (Fett-Acylierung)
Die posttranslationale Modifikation von Proteinen mit Fettsäuren beinhaltet die Anheftung von Myristinsäure an die primäre Aminogruppe eines N-terminalen Glycinrests (Johnson et al., 1994, Ann. Rev. Biochem., 63: 869-914) und die Anheftung von Palmitinsäure an Cysteinreste (Milligan et al., 1995, Trends Biochem. Sci., 20: 181-186).
Die Fettacylierung von Proteinen ist eine dynamische posttranslationale Modifikation, die für die biologische Aktivität vieler Proteine entscheidend wichtig ist, sowie außerdem für ihre Interaktionen mit anderen Proteinen und mit Membranen. Somit kann die Position eines Proteins in einer Zelle für eine große Anzahl von Proteinen durch deren Prenylierungszustand (Fettsäure-Modifikation) kontrolliert werden, ebenso wie ihre Fähigkeit zur Interaktion mit Effektor-Enzymen (ras und MAP-Kinase, Itoh et al., 1993, J. Biol. Chem., 268: 3025-; ras und Adenylatcyclase (in Hefe; Horiuchi et al., 1992, Mol. Cell. Biol., 12: 4515-) oder mit regulatorischen Proteinen (Shirataki et al., 1991, J. Biol. Chem., 266: 20672-20677). Der Prenylierungsstatus von ras ist wichtig für dessen onkogene Eigenschaften (Cox, 1995, Methods Enzymol., 250: 105-121); somit wird das Eingreifen in den Prenylierungsstatus von ras als wertvolle Anti-Krebs-Strategie betrachtet (Hancock, 1993, Curr. Biol., 3: 770).
Sentrinierung
Sentrin ist ein neues 101-Aminosäuren-Protein, das 18% Identität und 48% Ähnlichkeit mit humanem Ubiquitin besitzt (Okura et al., 1996, J. Immunol., 157: 4277-4281). Dieses Protein ist durch eine Reihe anderer Namen bekannt, einschließlich SUMO-1, UBL-1, PIC1, GMP1 und SMT3C und ist eines aus einer Reihe von Ubiquitin-artigen Proteinen, die jüngst identifiziert worden sind. Sentrin wird in allen Geweben exprimiert (wie durch Northern Blot-Analyse gezeigt), jedoch sind die mRNA-Spiegel im Herzen, Skelettmuskel, den Hoden, Eierstöcken und dem Thymus höher.
Man nimmt an, dass die Sentrinierung von Proteinen das Ubiquitin-konjugierende Enzym Ubc9 einbezieht (Gong et al., 1997, J. Biol. Chem., 272: 28198-28201). Die Interaktion zwischen diesen beiden Proteinen im Screen durch Hefe-Zwei-Hybrid-System ist sehr spezifisch, was nahelegt, dass dies ein biologisch relevantes Phänomen ist. Die Interaktion ist abhängig von der Anwesenheit der konservierten C-terminalen Gly-Gly-Reste, die in Sentrin vorhanden sind (Gong of al., 1997, supra). Die Konjugation von Sentrin an andere Proteine über Gly97 erfordert die Abspaltung der C-terminalen vier Aminosäuren des Proteins, His-Ser-Thr-Val.
Ein wichtiges Protein, für das gezeigt wurde, dass es durch die Addition von Sentrin modifiziert wird, ist das Ran-spezifische GTPase-aktivierende Protein, RanGAP1, das am Kernimport von Proteinen beteiligt ist, die Kernlokalisationssignale tragen (Johnson und Hochstrasser, 1997, Trends Cell Biol., 7: 408-413). Die Konjugation von RanGAP1 und Sentrin ist essentiell sowohl für die Zielsteuerung von RanGAP1 an seinen Bindungspartner an dem Kernporenkomplex (NPC) als auch für den Kernimport von Proteinen. Sentrin selbst bindet nicht mit hoher Affinität an den NPC, und es ist daher wahrscheinlich, dass es entweder eine Konformationsänderung bei RanGAP1 bewirkt, die eine Bindungsstelle freilegt, oder, alternativ, dass die Bindungsstelle unter Verwendung sowohl von Sentrin- als auch von RanGAP1-Sequenzen ausgebildet wird. Es gibt Anhaltspunkte dafür, anzunehmen, dass die Konjugation von Sentrin an RanGAP1 notwendig ist für die Bildung anderer sentrinierter Proteine (Kamitani et al., 1997, J. Biol. Chem., 272: 14001-14004) und dass sich die Mehrheit dieser sentrinierten Proteine im Zellkern finden.
Für Sentrin ist in Hefe-Zwei-Hybrid-Screens gezeigt worden, dass es mit einer Reihe anderer Proteine interagiert, einschließlich der Death-Domänen von Fas/APO1 und den TNF-Rezeptoren, PML, RAD51 und RAD52 (Johnson und Hochstrasser, 1997, supra). Diese Interaktionen implizieren Sentrin bei einer Anzahl wichtiger Prozesse. Fas/APO1 und TNF-Rezeptoren sind daran beteiligt, das Apoptose-Signal über ihre Death-Domänen zu transduzieren. Die Ligation von Fas an die Zelloberfläche resultiert in der Ausbildung eines Komplexes über Death-Domänen und Death-Effektor-Domänen, was die Apoptose veranlasst und induziert. Die Überexpression von Sentrin schützt Zellen sowohl vor durch anti-Fas/APO als auch durch TNF induziertem Zelltod (Okura et al., 1996, supra). Es ist nicht klar, ob dieser Schutz nur dadurch erreicht wird, dass die Bindung anderer Proteine an diese Death-Domänen verhindert wird, oder ob ein komplexerer Prozess beteiligt ist, möglicherweise einer, an dem der Ubiquitin-Pathway beteiligt ist.
Die Interaktion von Sentrin mit PML (einem RING-Finger-Protein) ist wichtig, da sie auf einen Krankheitszustand deutet, bei dem dieses Protein eine Rolle spielen könnte. Bei normalen myeloiden Zellen ist PML in einem nukleären Multiproteinkomplex zu finden, der als Kernkörper bekannt ist. Diese Kernkörper werden bei der akuten promyelozytären Leukämie aufgespalten, wobei eine chromosomale Translokation eine Fusion zwischen Regionen des Vitamin-A-Säure-Rezeptors und PML erzeugt. Diese Spaltung kann durch die Behandlung mit Vitamin-A-Säure umgekehrt werden. Es ist gezeigt worden, dass PML durch Mitglieder der Sentrin-Familie von Proteinen (nicht jedoch durch Ubiquitin oder NEDD8) an multiplen Stellen kovalent modifiziert wird. Es sind zwei Formen des abnormalen Fusionsproteins identifiziert worden, von denen keine durch Sentrin modifiziert wird. Es wird daher angenommen, dass eine unterschiedliche Sentrinierung der normalen und der abweichenden Formen von PML wichtig bei Prozessen sein könnte, die der akuten promyelozytären Leukämie zu Grunde liegen und beim Verständnis der biologischen Rolle des PML-Proteins helfen könnte (Kamitani et al., 1998, J. Biol. Chem., 273: 3117-3120).
Verfahren zur Detektion von Proteinmodifikation in Echtzeit
i. In vitro-Protein-Modifikation und Detektion hiervon
Modifizierende Enzyme
Die Erfindung erfordert die Gegenwart eines modifizierenden Enzyms, das entweder die Anfügung oder die Entfernung einer modifizierenden Gruppe katalysiert. Eine Reihe von Kinasen, Phosphatasen und anderen modifizierenden Enzymen ist kommerziell erhältlich (z.B. von Sigma, St. Louis, MO; Promega, Madison, WI; Boehringer Mannheim Biochemicals, Indianapolis, IN; New England Biolabs, Beverley, MA; und andere). Alternativ können solche Enzyme durch in der Technik wohlbekannte Verfahren im Labor hergestellt werden.
Die katalytische Untereinheit von Proteinkinase A (c-PKA) kann aus natürlichen Quellen (z.B. Rinderherz) gereinigt werden, oder aus Zellen/Organismen, die künstlich erzeugt wurden, um das Enzym heterolog zu exprimieren. Andere Isoformen dieses Enzyms können durch diese Prozeduren erhalten werden. Die Reinigung wird durchgeführt, wie zuvor aus Rinderherz beschrieben (Peters et al., 1977, Biochemistry, 16: 5691-5697), oder wie aus einer heterologen Quelle (Tsien et al., WO 92/00388), und sie wird in jedem Fall kurz wie folgt zusammengefasst:
Ventrikulärer Herzmuskel des Rindes (2 kg) wird homogenisiert und dann zentrifugiert. Der Überstand wird auf eine starke Anionenaustauschersäule aufgebracht (z.B. Q-Harz, Bio-Rad), äquilibriert in einem Puffer, der 50 mM Tris-HCl, 10 mM NaCl, 4 mM EDTA pH 7,6 und 0,2 mM 2-Mercaptoethanol enthält. Danach erfolgt die Elution des Proteins von dem Harz in einem zweiten Puffer, enthaltend 50 mM Tris-HCl, 4 mM EDTA pH 7,6, 0,2 mM 2-Mercaptoethanol, 0,5 M NaCl. Fraktionen, die PKA enthalten, werden vereint und Ammoniumsulfat wird bis zu 30% Sättigung hinzugegeben. Hierdurch präzipitierte Proteine werden durch Zentrifugation entfernt, und die Ammoniumsulfatkonzentration des Überstandes wird auf 75% Sättigung erhöht. Unlösliche Proteine werden durch Zentrifugation gesammelt (einschließlich c-PKA) und werden in 30 mM Phosphatpuffer pH 7,0, 1 mM EDTA, 0,2 mM 2-Mercaptoethanol gelöst. Diese Proteine werden dann gegen den gleichen Puffer (500 Volumina Überschuss) bei 4°C für zwei Zeitspannen von je 8 Stunden dialysiert. Der pH der Probe wird durch Zugabe von Phosphorsäure auf 6,1 reduziert, und die Probe wird dann aufeinander folgend gemischt mit 5 Chargen von CM-Sepharose (Pharmacia, jeweils ~80 ml Harz), äquilibriert in 30 mM Phosphat pH 6,1, 1mM EDTA, 0,2 mM 2-Mercaptoethanol. Cyclisches AMP (10 M) wird zu dem Material hinzugegeben, das nicht an die CM-Sepharose bindet, und das Proben-cAMP-Gemisch wird mit frischem Harz von CM-Sepharose (100 ml) inkubiert, das wie zuvor äquilibriert wurde. Nach ausgedehntem Waschen in Äquilibrierungspuffer wird c-PKA durch die Zugabe von 30 mM Phosphat pH 6,1, 1 mM EDTA, 1M KCl, 0,2 mM 2-Mercaptoethanol von dieser Säule eluiert. Fraktionen, die c-PKA enthalten, werden vereint und durch Filtration über eine PM-30-Membran (oder ähnlich) konzentriert. Die c-PKA-Probe wird dann Gelfiltrations-Chromatographie auf einem Harz, wie etwa Sephacryl 200HR (Pharmacia), unterzogen.
Die Reinigung rekombinanter c-PKA erfolgt, wie es in der WO 92/00388 beschrieben ist. Allgemeine Verfahren zur Herstellung reiner und teilweise gereinigter rekombinanter Proteine, ebenso wie zellulärer Rohextrakte, die solche Proteine umfassen, sind in der Technik wohlbekannt. Molekulare Verfahren, die nützlich bei der Herstellung rekombinanter Proteine sind – egal, ob nun Proteine, die gemäß der Erfindung zu testende Enzyme oder die markierten Reporter-Polypeptide der Erfindung sind (d.h. die natürliche Bindungsdomäne, Bindungssequenz oder das Bindungspolypeptid und der zugehörige Bindungspartner) – sind in der Technik wohlbekannt (für Verfahren zur Klonierung und Expression klonierter Gene und zur Proteinreinigung, siehe Sambrook et al., 1989, Molecular Clonina. A Laboratory Manual., 2. Auflage, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY; Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, Copyright 1987-1994, Current Protocols, Copyright 1994-1998, John Wiley & Sons, Inc.). Die Sequenzen der katalytischen Untereinheit mehrerer PKA-Moleküle finden sich in der Genbank Datenbank (siehe PKA C, Rind, Genbank-Zugangsnummern X67154 und S49260; PKA C 1, Rind, Genbank-Zugangsnummer J02647; PKA C 2, Rind, M60482, die Form, die gemäß dem oben beschriebenen Protokoll am wahrscheinlichsten aus Rinderherz gereinigt wird).
Gemäß der Erfindung können Assays der Aktivität Protein-modifizierender Enzyme unter Verwendung zellulärer Rohextrakte durchgeführt werden, egal, ob nun die Aktivität eins rekombinanten oder eines in der Natur zu findenden Proteins zu testen ist, so wie etwa in einer biologischen Probe, die von einer Testzelllinie oder einem Tier oder von einem klinischen Patienten erhalten werden soll. Im erstgenannten Fall erlaubt die Verwendung eines zellulären Rohextrakts das rasche Durchtesten vieler Proben, was potentiell spezielle Anwendung bei Hochdurchsatz-Screening-Verfahren findet, z.B. von Kandidaten-Modulatoren Protein-modifizierender Enzymaktivität. Im letztgenannten Fall erleichtert die Verwendung eines Rohextrakts mit dem markierten Reporter-Polypeptid, umfassend eine natürliche Bindungsdomäne, Bindungssequenz oder ein Bindungspolypeptid der Erfindung, die leichte und schnelle Bestimmung der Aktivität eines interessierenden Enzyms bei einer diagnostischen Prozedur, z.B. einer, die darauf abzielt, zu bestimmen, ob ein Protein-modifizierendes Enzym auf einem physiologisch angemessenen Niveau aktiv ist, oder bei einer Prozedur, die dafür konzipiert ist, die Wirksamkeit einer Therapie zu bestimmen, die auf die Modulation der Aktivität eines bestimmten Enzyms abzielt.
Herstellung einer natürlichen Bindungsdomäne. Bindungssequenz oder eines Bindungspolypeptids
Polypeptide, die eine natürliche Bindungsdomäne, Bindungssequenz oder ein Bindungspolypeptid oder einen Bindungspartner hierfür umfassen oder aus diesen bestehen, können durch Fmoc- oder Tboc-Chemie gemäß in der Technik bekannten Verfahren synthetisiert werden (z.B. siehe Atherton et al., 1981, J. Chem. Soc. Perkin I., 1981(2): 538-546 bzw. Merrifield, 1963, J. Am. Chem. Soc., 85: 2149-2154). Nach der Entschützung und Abspaltung von dem Harz werden die Peptide durch Gelfiltrations-Chromatographie entsalzt und mittels Massen-Spektroskopie, HPLC, Edman-Abbau und/oder andere Verfahren analysiert, wie sie in der Technik für Proteinsequenzierung unter Verwendung von Standard-Methodiken bekannt sind.
Alternativ können Nukleinsäuresequenzen, die für solche Peptide codieren, entweder in Zellen oder in einem in vitro-Transkriptions-/Translationssystem (siehe unten) exprimiert werden, und die Proteine werden, ebenso wie die gemäß der Erfindung zu testenden Enzyme, durch in der Technik wohlbekannte Verfahren gereinigt.
Markierung von Polypeptiden mit Fluorophoren
Polypeptide, die natürliche Bindungsdomänen, Bindungssequenzen oder Bindungspolypeptide oder einen Bindungspartner hierfür umfassen oder aus diesen bestehen, werden mit Thiol-reaktiven Derivaten von Fluorescein und Tetramethylrhodamin (Isothiocyanat oder Iodacetamid-Derivate, Molecular Probes, Eugene, OR, USA) oder anderen Fluorophoren, wie sie in der Technik bekannt sind, markiert, wobei Prozeduren verwendet werden, die von Hermanson G.T., 1995, Bioconiugate Technigues, Academic Press, London, beschrieben wurden. Alternativ können über primäre Amine gesteuerte Konjugationsreaktionen verwendet werden, um Lysin-Seitenketten oder den freien Peptid-N-Terminus zu markieren (Hermanson, 1995, supra).
Reinigung fluoreszenter natürlicher Bindungsdomänen und/oder von Bindungspartnern hierfür
Fluoreszente Peptide werden von nicht umgesetzten Fluorophoren durch Gelfiltrations-Chromatographie oder Reversphasen-HPLC abgetrennt.
Phosphorylierung natürlicher Bindungsdomänen und, optional, von Bindungspartnern hierfür in vitro
Natürliche Bindungsdomänen, und, optional, Bindungspartner hierfür (0,01-100,0 μM) werden durch gereinigte c-PKA in 50 mM Histidinpuffer pH 7,0, 5 mM MgSO₄, 1 mM EGTA, 0,1-10,0 μM c-PKA und 0,2 mM [³²P]-ATP (spezifische Aktivität ~2 Bq/pmol) bei 15-40°C für Zeitspannen, die von 0 bis 60 Minuten reichen, phosphoryliert. Da, wo die Chemie des Peptids geeignet ist (d.h., wo dieses eine basische Ladung hat) wird das Phosphopeptid auf einem Kationenaustauschfilterpapier (z.B. Phosphocellulose P81 Papier; Whatman) gebunden, und die Reaktanten werden durch ausgedehntes Waschen in 1% Phosphorsäure (siehe Casnellie, 1991, Methods Enzymol., 200: 115-120) entfernt. Alternativ wird die Phosphorylierung der Proben durch die Zugabe von SDS-Probenpuffer (Lämmli, 1970, Nature, 227: 680-685) abgestoppt, und die Proben werden durch SDS-PAGE-Elektrophorese, Autoradiographie und Szintillationszählung auf Gelstücken analysiert.
Dephosphorylierung einer natürlichen Bindungsdomäne oder eines Bindungspartners hiervon in vitro
Die Dephosphorylierung natürlicher Bindungsdomänen und, optional, von Bindungspartnern hierfür, die wie oben phosphoryliert wurden, wird durch die Entfernung von ATP (durch die Zugabe von 10 mM Glucose und 30 U/ml Hexokinase; Sigma, St. Louis, MO) und durch Zugabe von Protein-Phosphatase-1 (Sigma) untersucht. Der Dephosphorylierung folgt bei 15-40°C die Quantifizierung der verbleibenden Phosphopeptid-Komponente zu verschiedenen Zeitpunkten, bestimmt wie oben.
Fluoreszenzmessungen von Proteinmodifikationen in vitro in Echtzeit
Mit Donor- und Akzeptor-Fluorophor markierte Polypeptide, die natürliche Bindungsdomänen, Bindungssequenzen oder Bindungspolypeptide umfassen oder aus diesen bestehen (molare Äquivalente an Fluorophor-markiertem Polypeptid oder molarer Überschuss an Akzeptor-markiertem Polypeptid), werden zunächst gemischt (wenn die natürlichen Bindungsdomänen, Bindungssequenzen oder Bindungspolypeptide und der zugehörige Bindungspartner auf getrennten Polypeptiden vorliegen). Die Proben werden in einem Fluorimeter unter Verwendung von Anregungswellenlängen analysiert, die für die Donor-Fluoreszenzmarkierung relevant sind, und unter Verwendung von Emissionswellenlängen, die sowohl für die Donor- als auch für die Akzeptor-Markierung relevant sind. Ein Verhältnis von Emission seitens des Akzeptors gegenüber der Emission des Donors nach Anregung bei einer einzigen Wellenlänge wird verwendet, um die Wirksamkeit von Fluoreszenzenergie-Transfer zwischen den Fluorophoren und damit deren räumliche Nähe zu bestimmen. Typischerweise erfolgt die Durchführung der Messungen bei 0–37°C als Funktion der Zeit nach der Zugabe des modifizierenden Enzyms (und optional eines Modulators oder Kandidaten-Modulators der Funktion dieses Enzyms, wie unten beschrieben) zu dem System in 50 mM Histidin pH 7,0, 120 mM KCl, 5 mM MgSO₄, 5 mM NaF, 0,05 mM EGTA und 0,2 mM ATP. Der Assay kann bei einer höheren Temperatur durchgeführt werden, wenn diese Temperatur mit dem/den untersuchten Enzymen) kompatibel ist.
Alternatives zellfreies Assay-System
Es wird ein zellfreies Assay-System benötigt, um die Bindung einer unmodifizierten, markierten natürlichen Bindungsdomäne, Bindungssequenz oder eines Bindungspolypeptids und deren/dessen Bindungspartners stattfinden zu lassen. Wie hier angezeigt, kann ein solches System einen Puffer niedriger Ionenstärke umfassen (z.B. physiologisches Salz, wie etwa einfache Saline oder Phosphat- und/oder Tris-gepufferte Saline oder andere, wie oben beschrieben), ein Zellkulturmedium, von dem viele in der Technik bekannt sind, oder ein ganzes oder fraktioniertes Zelllysat. Die Komponenten eines Assays für die posttranslationale Modifikation eines Polypeptidmoleküls können einem Puffer, Medium oder Lysat zugegeben werden, oder sie können in Zellen exprimiert werden, aus denen ein Lysat gewonnen wird. Alternativ kann ein zellfreies Transkriptions- und/oder Translationssystem verwendet werden, um eine oder mehrere dieser Komponenten für das Testsystem zu liefern. Nukleinsäuren, die bei zellfreien Expressionssystemen von Nutzen sind, sind unten für die in vivo-Assays beschrieben.
Ein solcher Test kann in einem Standard-in vitro-Transkriptions-/Translationssystem unter Bedingungen durchgeführt werden, die die Expression eines rekombinanten oder anderen Gens erlauben. Das TNT^® T7 Quick Coupled Transcription/Translation System (Katalognr. # L1170; Promega) enthält alle Reagenzien, die für die in vitro-Transkription/Translation notwendig sind, mit Ausnahme der DNA von Interesse und der Detektionsmarkierung; wie unten diskutiert, können Polypeptide, die natürliche Bindungsdomänen, Bindungssequenzen oder Bindungspolypeptide oder deren Bindungspartner umfassen, durch Expressionskonstrukte codiert sein, bei denen ihre codierenden Sequenzen im Leseraster an solche Sequenzen fusioniert sind, die für fluoreszente Proteine codieren. Die TNT^® Coupled Reticulocyte Lysate Systeme (umfassend ein Kaninchen-Retikulozyten-Lysat) beinhalten: TNT^® T3 Coupled Reticulocyte Lysate System (Kat. # L4950; Promega); TNT^® T7 Coupled Reticulocyte Lysate System (Kat. # L4610; Promega); TNT^® SP6 Coupled Reticulocyte Lysate System (Kat. # L4600; Promega); TNT^® T7/SP6 Coupled Reticulocyte Lysate System (Kat. # L5020; Promega); TNT^® T7/T3 Coupled Reticulocyte Lysate System (Kat. # L5010; Promega).
Ein Assay, der ein Zelllysat oder eine ganze Zelle (siehe unten) beinhaltet, kann in einem Zelllysat oder in einer ganzen Zelle von bevorzugt eukaryotischer Natur (wie etwa Hefe, Pilz, Insekt, (z.B. Drosophila), Maus oder Mensch) durchgeführt werden. Ein Assay, bei dem ein Zelllysat verwendet wird, wird in einem Standard-in vitro-System unter Bedingungen durchgeführt, die Genexpression erlauben. Ein Kaninchen-Retikulozyten-Lysat alleine ist ebenfalls von Promega erhältlich, entweder mit Nuklease behandelt (Kat # L4960) oder unbehandelt (Kat. # L4151).
Bei einer bevorzugten in vitro-Ausführungsform wird wenigstens einer von der Bindungsdomäne oder einem Bindungspartner auf einem festen Träger immobilisiert. Geeignete Träger beinhalten Beads, „Chips", Harze, Matrizes, Gele und das Material, das die Wände eines Gefäßes ausbildet. Matrizes und insbesondere Gele, wie etwa Agarosegele, können praktischer Weise in Säulen gepackt werden. Ein besonderer Vorteil von Festphasen-Immobilisierung besteht darin, dass die Reagenzien leicht dem Kontakt mit dem/den Polypeptid(en) entzogen werden können.
Sets von Reporterpolypeptiden können an festen Substraten immobilisiert werden, um Peptid-Arrays zu produzieren. Die Reporter-Polypeptide werden typischerweise auf oder in abgetrennten Regionen eines festen Substrats immobilisiert. Das Substrat kann porös sein, um die Immobilisierung im Inneren des Substrats zu erlauben, oder weitgehend unporös, wobei die Sensor-Elemente in diesem Fall typischerweise auf der Oberfläche des Substrats immobilisiert werden. Das feste Substrat kann aus einem beliebigen Material bestehen, an das Polypeptide entweder direkt oder indirekt binden können. Beispiele geeigneter fester Substrate beinhalten Flachglas, Silikonscheiben, Glimmer, Keramik und organische Polymere, wie etwa Kunststoffe, einschließlich Polystyrol und Polymethacrylat. Es kann auch möglich sein, semipermeable Membranen, wie etwa Nitrocellulose- oder Nylonmembranen, zu verwenden, die in breitem Maße verfügbar sind. Die semipermeablen Membranen können auf einer robusteren festen Oberfläche, wie etwa Glas, befestigt werden. Die Oberflächen können optional mit einer Metallschicht beschichtet sein, wie etwa mit Gold, Platin oder einem anderen Übergangsmetall. Ein spezielles Beispiel für ein geeignetes festes Substrat in der kommerziell erhältliche BIAcore^TM Chip (Pharmacia Biosensors). Ein weiteres Beispiel ist eine Mikrotiterplatte oder eine ähnliche Anordnung.
Kandidatenmodulatoren durchzutestender Protein-modifizierender Enzyme
Ob in vitro- oder in vivo-Systeme (siehe unten), wir beschreiben Verfahren zum Durchtesten von Zusammensetzungen, die die Aktivität eines Protein-modifizierenden Enzyms verstärken, inhibieren oder unbeeinflusst lassen können (z.B. bei einem Kreuz-Screening-Verfahren, bei dem es das Ziel ist, zu bestimmen, ob ein für einen Zweck vorgesehenes Mittel zusätzlich allgemeine zelluläre Funktionen beeinflusst, für die Proteinmodifikation ein Beispiel ist).
Es können Kandidatenmodulatorverbindungen aus großen Bibliotheken synthetischer oder natürlicher Verbindungen durchgetestet werden. Es werden derzeit zahlreiche Mittel für die zufällige und gesteuerte Synthese von auf Saccharid, Peptid und Nukleinsäure basierenden Verbindungen verwendet. Bibliotheken synthetischer Verbindungen sind kommerziell bei einer Reihe von Firmen erhältlich, einschließlich Maybridge Chemical Co. (Trevillet, Cornwall, UK), Comgenex (Princeton, NJ), Brandon Associates (Merrimack, NH) und Microsource (New Milford, CT). Eine seltene chemische Bibliothek ist von Aldrich (Milwaukee, WI) erhältlich. Kombinatorische Bibliotheken sind erhältlich und können hergestellt werden. Alternativ sind Bibliotheken natürlicher Verbindungen in Form von bakteriellen, pilzlichen, pflanzlichen und tierischen Extrakten erhältlich z.B. von Pan Laboratories (Bothwell, WA) oder MycoSearch (NC) oder sind durch in der Technik wohlbekannte Verfahren leicht herstellbar.
Zusätzlich werden natürlich und synthetisch hergestellte Bibliotheken und Verbindungen durch konventionelle chemische, physikalische und biochemische Mittel problemlos modifiziert.
Nützliche Verbindungen sind innerhalb zahlreicher chemischer Klassen zu finden, obwohl sie typischerweise organische Verbindungen, einschließlich kleiner organischer Verbindungen, sind. Kleine organische Verbindungen besitzen ein Molekulargewicht von über 50, jedoch von weniger als etwa 2.500 Dalton, bevorzugt von weniger als etwa 750, bevorzugter von weniger als etwa 350 Dalton. Beispielhafte Klassen beinhalten Heterozyklen, Peptide, Saccharide, Steroide und dergleichen. Die Verbindungen können modifiziert werden, um die Wirksamkeit, Stabilität, pharmazeutische Kompatibilität und dergleichen zu erhöhen. Die strukturelle Identifizierung eines Mittels kann verwendet werden, um zusätzliche Mittel zu identifizieren, zu erzeugen oder durchzutesten. Wenn beispielsweise Peptidmittel identifiziert werden, so können diese auf eine Vielzahl von Weisen modifiziert werden, um ihre Stabilität zu erhöhen, wie etwa unter Verwendung einer nicht-natürlichen Aminosäure, wie etwa einer D-Aminosäure, insbesondere von D-Alanin, durch Funktionalisieren des Amino- oder Carboxy-Terminus, z.B. für die Aminogruppe durch Acylierung oder Alkylierung und für die Carboxygruppe durch Veresterung oder Amidierung oder dergleichen.
Kandidatenmodulatoren, die durchgetestet werden können, beinhalten Rezeptoren, Enzyme, Liganden, regulatorische Faktoren und Strukturproteine. Kandidaten-Modulatoren beinhalten außerdem Kernproteine, zytoplasmatische Proteine, mitochondriale Proteine, sekretierte Proteine, mit dem Plasmalemma assoziierte Proteine, Serumproteine, virale Antigene, bakterielle Antigene, Protozoen-Antigene und Parasiten-Antigene. Kandidatenmodulatoren umfassen zusätzlich Proteine, Lipoproteine, Glykoproteine, Phosphoproteine und Nukleinsäuren (z.B. RNAs, wie etwa Ribozyme oder Antisense-Nukleinsäuren). Proteine oder Polypeptide, die durchgetestet werden können, beinhalten Hormone, Wachstumsfaktoren, Neurotransmitter, Enzyme, Gerinnungsfaktoren, Apolipoproteine, Rezeptoren, Arzneistoffe, Onkogene, Tumorantigene, Tumor-Suppressoren, Strukturproteine, virale Antigene, Parasiten-Antigene, bakterielle Antigene und Antikörper (siehe unten).
Kandidaten-Modulatoren, die durchgetestet werden können, beinhalten außerdem Substanzen, für die eine Testzelle oder ein Organismus defizient sein können, oder die in einer über der Normalkonzentration liegenden Konzentration klinisch wirksam sein können, ebenso wie diejenigen, die dafür konzipiert werden, um die Translation unerwünschter Proteine zu eliminieren. Nukleinsäuren, die von Nutzen sind, können nicht nur für die oben beschriebenen Kandidatenmodulatoren codieren, sondern können auch Produkte eliminieren oder codieren, die schädliche Proteine eliminieren. Solche Nukleinsäuresequenzen sind Antisense-RNAs und Riboryme, ebenso wie DNA-Expressionskonstrukte, die für diese codieren. Es ist zu beachten, dass Antisense-RNA-Moleküle, Ribozyme oder Gene, die für diese codieren, einer Testzelle oder einem Organismus durch ein Verfahren der Nukleinsäureübertragung verabreicht werden können, das in der Technik bekannt ist, wie unten beschrieben. Inaktivierende Nukleinsäuresequenzen können für ein Ribozym oder Antisense-RNA codieren, das/die für eine Ziel-mRNA spezifisch ist. Ribozyme der Hammerkopf-Klasse sind die kleinsten bekannten und sind sowohl der in vitro-Produktion als auch der Auslieferung an Zellen zugänglich (zusammengefasst von Sullivan, 1994, J. Invest. Dermatol., 103: 85S–98S; Usman et al., 1996, Curr. Opinion Struct. Biol., 6: 527–533).
Wie oben postuliert, sind Antikörper von Nutzen als Modulatoren (spezifisch als Inhibitoren) Protein-modifizierender Enzyme. Verfahren zur Herstellung von Antikörpern sind in der Technik wohlbekannt und lassen sich kurz wie folgt zusammenfassen:
Es können entweder rekombinante Proteine oder diejenigen, die von natürlichen Quellen abgeleitet sind, verwendet werden, um Antikörper unter Verwendung von Standardtechniken zu erzeugen, die Fachleuten auf dem Gebiet wohlbekannt sind. Beispielsweise werden die Proteine verabreicht, um einen Säuger, wie etwa einen Affen, eine Ziege, ein Kaninchen oder eine Maus zu immunisieren. Die resultierenden Antikörper können als polyklonales Serum gewonnen werden, oder es werden Antikörper-produzierende Zellen von dem immunisierten Tier immortalisiert (z.B. durch Fusion mit einem immortalisierenden Fusionspartner), um monoklonale Antikörper herzustellen.
1. Polyklonale Antikörper
Das Antigenprotein kann an einen konventionellen Träger konjugiert werden, um seine Immunogenität zu steigern, und es wird ein Antiserum gegen das Peptid-Träger-Konjugat erzeugt. Die Kopplung eines Peptids an ein Trägerprotein und die Immunisierungen können durchgeführt werden, wie beschrieben (Dymecki et al., 1992, J. Biol. Chem., 267: 4815–4823). Das Serum wird mittels ELISA (siehe unten) gegen Proteinantigen titriert, oder alternativ mittels Dot- oder Spot-Blot (Boersma und van Leeuwen, 1994, J. Neurosci. Methods, 51: 317). Zur gleichen Zeit kann das Antiserum bei Gewebeschnitten, die wie unten beschrieben, hergestellt werden, verwendet werden.
Für das Serum wird gezeigt, dass es stark mit den geeigneten Peptiden im ELSA reagiert, z.B. nach der Prozedur von Green et al., 1982, Cell, 28: 477–487.
2. Monoklonale Antikörper
Techniken zur Herstellung monoklonaler Antikörper sind wohlbekannt, und monoklonale Antikörper können unter Verwendung eines Kandidatenantigens hergestellt werden, dessen Mengenniveau zu messen ist oder das entweder zu inaktivieren oder einer Affinitätsreinigung zu unterziehen ist, bevorzugt gebunden an einen Träger, wie beschrieben von Arnheiter et al., Nature, 294, 278–280 (1981).
Monoklonale Antikörper werden typischerweise aus Hybridomgewebekulturen oder aus Aszites-Flüssigkeit, gewonnen aus Tieren, in die das Hybridomgewebe eingeführt wurde, erhalten. Nichtsdestoweniger können monoklonale Antikörper so beschrieben werden, als seien sie gegen ein Protein „herangezogen" oder durch ein Protein „induziert" worden.
Monoklonale Antikörper produzierende Hybridome (oder polyklonale Seren) können auf die Antikörperbindung gegen das Zielprotein hin durchgetestet werden. Mit Antikörper beziehen wir Konstrukte ein, die die bindende (variable Region) eines solchen Antikörpers und andere Antikörpermodifikationen verwenden. Somit kann ein Antikörper, der bei der Erfindung nützlich ist, einen ganzen Antikörper, ein Antikörperfragment, ein polyfunktionales Antikörperaggregat, oder, allgemein, eine Substanz umfassen, die ein oder mehrere spezifische Bindungsstellen aus einem Antikörper enthält. Das Antikörperfragment kann ein Fragment, wie etwa ein Fv-, Fab- oder F(ab')₂-Fragment oder ein Derivat hiervon sein, wie etwa ein einzelkettiges Fv-Fragment. Der Antikörper oder das Antikörperfragment kann nicht-rekombinant, rekombinant oder humanisiert sein. Der Antikörper kann einem Immunglobulin-Isotyp entsprechen, z.B. IgG, IgM und so weiter. Zusätzlich kann ein Aggregat, Polymer, Derivat oder Konjugat eines Immunglobulins oder ein Fragment hiervon verwendet werden, wenn angemessen.
Bestimmung der Aktivität eines Kandidaten-Modulators eines Protein-modifizierenden Enzyms
Ein Kandidaten-Modulator der Aktivität eines Protein-modifizierenden Enzyms kann untersucht werden, wie hier beschrieben, und, wenn seine Anwendungsergebnisse bei FRET oder bei einem anderen Signal, das von einer für die Erfindung nützlichen detektierbaren Markierung ausgeht, und das aus der Assoziation einer natürlichen Bindungsdomäne, Bindungssequenz oder eines Bindungspolypeptids und des zugehörigen Bindungspartners in Gegenwart eines Protein-modifizierenden Enzyms resultiert, mit einem Unterschied von etwa 10% größer sind im Vergleich zu Kontrollen, bei denen er nicht vorhanden ist (siehe unten), so wird er als wirksam bestimmt.
Das Ausmaß der Aktivität eines Kandidatenmodulators kann unter Verwendung beliebiger akzeptabler Grenzen z.B. über die folgende Formel quantifiziert werden:
wobei Index_Kontrolle das quantitative Ergebnis ist (d.h. das Ausmaß der Änderungsrate der Fluoreszenz bei einer gegebenen Frequenz, molekularen Rotationsrate, FRET, die Änderungsrate von FRET oder ein anderer Index der Modifikation, einschließlich, jedoch nicht beschränkt auf, Enzyminhibition oder -Aktivierung), das bei Assays erhalten wird, denen der Kandidatenmodulator fehlt (mit anderen Worten: unbehandelte Kontrollen), und Index_Probe die Ergebnisse derselben Messung in Assays repräsentiert, die den Kandidatenmodulator enthalten. Wie unten beschrieben, werden die Kontrollmessungen nur mit den unterschiedlich markierten natürlichen Bindungsdomänen, Bindungssequenzen oder Bindungspolypeptiden und ihren Bindungspartnern durchgeführt, und dann mit diesen Molekülen plus einem Protein-modifizierenden Enzym, das eine natürliche Stelle für die posttranslationale Proteinmodifikation erkennt, die auf der natürlichen Bindungsdomäne, und, optional, dem Bindungspartner, vorliegt.
Eine solche Berechnung wird entweder bei in vitro oder in vivo-Assays verwendet.
ii. in vivo-Assays der enzymatischen Aktivität
Reportergruppen-Protein-Modifikation bei lebenden Zellen
Unterschiedlich markierte natürliche Bindungsdomänen, Bindungssequenzen oder Bindungspolypeptide und ihre entsprechenden Bindungspartner gemäß der Erfindung werden (z.B. durch Mikroinjektion) Zellen zugeführt, wie etwa glatten Muskelzellen (DDT1) oder ventrikulären Herzmuskelzellen, wie zuvor beschrieben (Riabowol et al., 1988, Cold Spring Harbor Symposia on Quantitative Biology, 53: 85–90). Das Emissionsverhältnis des/der markierten Moleküls/Moleküle wird, wie oben beschrieben, über eine Photomultiplikatorröhre, die auf eine Einzelle fokussiert ist, gemessen. Wie hier an anderer Stelle beschrieben, kann ein ADP-ribosylierendes Enzym mit Choleratoxin (G-Protein-Erkennungsmerkmal) oder mit Brefeldin A stimuliert werden.
Die Aktivierung einer Kinase (z.B. von PKA durch die Zugabe von Dibutyryl-cAMP oder adrenerge Agonisten) wird durchgeführt, die nachfolgende Inhibition erfolgt durch Entfernen des Stimulus, sowie durch die Zugabe eines geeigneten Antagonisten (z.B. des cAMP-Antagonisten Rp-cAMPS).
Heterologe Expression von Peptiden
Natürliche Bindungsdomänen, Bindungssequenzen oder Bindungspolypeptide und/oder deren Bindungspartner können über die heterologe Expression von DNA-Sequenzen erzeugt werden, die für diese codieren, oder durch chemische Synthese derselben. Die Expression kann in prokaryotischen oder eukaryotischen Zellen unter Verwendung einer Vielzahl von Plasmidvektoren erfolgen, die befähigt sind, heterologe Expression zu instruieren. Die Reinigung dieser Produkte erfolgt durch mittels Aufbrechen der Zellen (z.B. French Press), gefolgt von der chromatographischen Aufreinigung der Produkte. Diese letztgenannte Prozedur kann vereinfacht werden durch die Einbeziehung eines Affinitäts-Reinigungs-Tags an einem Außenende des Peptids, mit Abtrennung von dem Peptid durch eine Protease-Spaltstelle, wenn nötig.
Verwendung von Zellen oder ganzen Organismen
Bei Durchführung unter Verwendung von Zellen sind die hier beschriebenen Assays in breitem Maße bei einer Wirtszelle anwendbar, die für Transfektion oder Transformation zugänglich ist, einschließlich, ohne hierauf beschränkt zu sein, Bakterien (sowohl grampositiv als auch gramnegativ), kultivierten und explantierten Pflanzen (einschließlich, ohne hierauf beschränkt zu sein, Tabak, Arabidopsis, Nelke, Reis und Linsenzellen oder -Protoplasten), Insekten (z.B. kultivierten Drosophila oder Mottenzelllinien) oder Vertebratenzellen (z.B. Säugerzellen) und Hefe.
Organismen werden derzeit für die Expression von Mitteln, einschließlich DNA, RNA, Proteinen, nicht-proteinischer Verbindungen und Viren, entwickelt. Solche Vektormikroorganismen beinhalten Bakterien, wie etwa Clostridium (Parker et al., 1947, Proc. Soc. Exp. Biol. Med., 66: 461-465; Fox et al., 1996, Gene Therapy, 3: 173-178; Minton et al. 1995, FEMS Microbiol. Rev., 17: 357-364), Salmonella (Pawelek et al., 1997, Cancer Res., 57: 4537-4544; Saltzman et al., 1996, Cancer Biother. Radiopharm., 11: 145-153; Carrier et al., 1992, J. Immunol., 148: 1176-1181; Su et al., 1992, Microbiol. Pathol., 13: 465-476; Chabalgoity et al., 1996, Infect Immunol., 65: 2402-2412), Listeria (Schafer et al., 1992, J. Immunol., 149: 53-59; Pan et al., 1995, Nature Med., 1: 471-477) und Shigella (Sizemore et al., 1995, Science, 270: 299-302), ebenso wie Hefe, Mycobakterien, Schleimpilze (Mitglieder der Taxa Dictyosteliida – wie etwa die Gattungen Polysphondylium und Dictyostelium, z.B. Dictyostelium discoideum – und Myxomycetes – wie etwa die Gattungen Physarum und Didymium) und Mitglieder der Gruppe Arachaea (einschließlich, jedoch nicht beschränkt auf Archebakterien), bei denen damit begonnen wurde, sie bei rekombinanten Nukleinsäurearbeiten zu verwenden, Mitglieder des Stamms Protista, oder andere Zellen aus Algen, Pilzen oder jede beliebige Zelle des Tier- oder Pflanzenreichs.
Pflanzenzellen, die für die Expression nützlicher Polypeptide verwendbar sind, beinhalten, ohne hierauf beschränkt zu sein, Tabak (Nicotiana plumbaginifolia und Nicotiana tabacum), Arabidopsis (Arabidopsis thaliana), Aspergillus niger, Brassica napus, Brassica nigra, Datura innoxia, Vicia narbonensis, Vicia faba, Erbse (Pisum sativum), Blumenkohl, Nelke und Linse (Lens culinaris). Entweder ganze Pflanzen, Zellen oder Protoplasten können mit einer ausgewählten Nukleinsäure transformiert werden. Verfahren zur Pflanzenzell-Transfektion oder stabilen Transformation beinhalten – unter anderen Methoden – die Animpfung mit Zellen von Agrobacterium tumefaciens, die das Konstrukt von Interesse tragen; siehe, unter anderem, Turpen et al., 1993, J. Virol. Methods, 42: 227-239), Verabreichung von Liposom-assoziierten Nukleinsäuremolekülen (Maccarrone et al., 1992, Biochem. Biophys. Res. Commun., 186: 1417-1422) und Mikropartikelinjektion (Johnston und Tang, 1993, Genet. Eng. (NY), 15: 225-236). Ein allgemein nützliches Element zur Transkriptionskontrolle bei Pflanzen ist der Blumenkohlmosaikvirus (CaMV) 35S-Promotor (siehe z.B. Saalbach et al., 1994, Mol. Gen. Genet., 242: 226-236). Nicht-limitierende Beispiele von Nukleinsäurevektoren, die für Pflanzen nützlich sind, beinhalten pGSGLUCI (Saalbach et al., 1994, supra), pGA492 (Perez et al., 1989, Plant Mol. Biol., 13: 365-373), pOCA18 (Olszewski et al., 1988, Nucleic Acids Res., 16: 10765-10782), das Ti-Plasmid (Roussel et al., 1988, Mol. Gen. Genet., 211: 202-209) und pKR612B1 (Balazs et al., 1985, Gene, 40: 343-348).
Säugerzellen sind ebenfalls von Nutzen. Solche Zellen beinhalten, ohne hierauf beschränkt zu sein, neuronale Zellen (diejenigen sowohl primärer Explantate als auch etablierte Zellkulturlinien), Zellen des Immunsystems (wie etwa T-Zellen, B-Zellen und Makrophagen), Fibroblasten, hämatopoetische Zellen und dendritische Zellen. Unter Verwendung etablierter Techniken können Stammzellen (z.B. hämatopoetische Stammzellen) für die Genübertragung nach Anreicherungsprozeduren verwendet werden. Alternativ können nicht aufgetrennte hämatopoetische Zell- und Stammzellpopulationen für die DNA-Aufnahme empfänglich gemacht werden. Die Transfektion hämatopoetischer Stammzellen wird beschrieben in Mannion-Henderson et al., 1995, Exp. Hematol., 23: 1628; Schiffmann et al., 1995, Blood, 86: 1218; Williams, 1990, Bone Marrow Transplant, 5: 141; Boggs, 1990, Int. J. Cell Cloning, 8: 80; Martensson et al., 1987, Eur. J. Immunol., 17: 1499; Okabe et al., 1992, Eur. J. Immunol., 22: 37-43; und Banerji et al., 1983, Cell, 33: 729. Solche Verfahren können vorteilhafterweise verwendet werden.
Nukleinsäurevektoren für die Expression von Assay-Komponenten der Erfindung in Zellen oder mehrzelligen Organismen
Eine Nukleinsäure, die gemäß den Verfahren der Erfindung von Nutzen ist, kann entweder doppel- oder einzelsträngig sein, und entweder nackt oder assoziiert mit Protein, Kohlenhydrat, Proteoglykan und/oder Lipid oder anderen Molekülen vorliegen. Solche Vektoren können modifizierte und/oder unmodifizierte Nukleotide oder Ribonukleotide enthalten. In dem Fall, dass das zu transfizierende Gen ohne seine nativen transkriptionsregulatorischen Sequenzen vorliegt, muss der Vektor solche Sequenzen für das Gen bereitstellen, sodass es, wenn es im Inneren der Zielzelle ist, exprimiert werden kann. Solche Sequenzen können die Transkription in einer gewebespezifischen Weise steuern, wodurch die Expression des Gens auf seine Zielzellpopulation begrenzt wird, selbst wenn dieses von anderen, umgebenden Zellen aufgenommen wurde. Alternativ können solche Sequenzen allgemeine Regulatoren der Transkription sein, wie etwa solche, die Haushaltsgene regulieren, was die Expression des transfizierten Gens in mehr als einem Zelltyp erlauben wird. Dies legt nahe, dass die Mehrheit der Vektormoleküle bevorzugt mit den Zellen desjenigen Gewebes assoziieren wird, in das der Vektor injiziert wurde, und dass ein Übertreten des Vektors in andere Zelltypen für den Empfängerorganismus nicht signifikant schädlich sein wird. Es ist auch möglich, einen Vektor zu erstellen, der das ausgewählte Gen zu einer spezifischen Zeit in den Zielzellen exprimieren wird, indem man einen induzierbaren Promotor verwendet, der die Transkription nicht antreiben wird, bis nicht ein spezifischer Stimulus, wie etwa ein Hitzeschock, appliziert wird.
Ein Gen, das für eine Komponente des Assay-Systems oder für einen Kandidatenmodulator einer Protein-modifizierenden Enzymaktivität codiert, kann unter Verwendung eines viralen oder nicht-viralen DNA- oder RNA-Vektors in eine Zelle oder einen Organismus transfiziert werden, wobei die nicht-viralen Vektoren, ohne hierauf beschränkt zu sein, Plasmide, lineare Nukleinsäuremoleküle, künstliche Chromosomen und episomale Vektoren umfassen. Die Expression heterologer Gene in Säugern ist nach der Injektion von Plasmid-DNA in den Muskel (Wolff J. A. et al., 1990, Science, 247: 1465-1468; Carson D.A. et al., US-Patent Nr. 5,580,859), die Schilddrüse (Sykes et al., 1994, Human Gene Ther., 5: 837-844), Melanom (Vile et al., 1993, Cancer Res., 53: 962-967), Haut (Hengge et al., 1995, Nature Genet., 10: 161-166), Leber (Hickman et al., 1994, Human Gene Therapy, 5: 1477-1483) und nach der Exposition gegenüber Atemwegsepithel (Meyer et al., 1995, Gene Therapy, 2: 450-460) beobachtet worden.
Zusätzlich zu Vektoren der oben beschriebenen breiten Klassen und Fusionsgenexpressionskonstrukten, die für eine natürliche Bindungsdomäne, Bindungssequenz oder ein Bindungspolypeptid codieren, die/das im Leseraster mit einem Fluoreszenzprotein fusioniert ist, wie oben beschrieben (siehe „Fluoreszenzresonanzenergietransfer"), sind mikrobielle Plasmide, wie etwa solche aus Bakterien und Hefe, von Nutzen.
Bakterielle Plasmide:
Von den häufig verwendeten Replikationsursprüngen ist pBR322 nützlich und pUC bevorzugt. Obwohl nicht bevorzugt, sind andere nützliche Plasmide solche, die die Anwesenheit Plasmid-codierter Proteine für die Replikation benötigen, z.B. solche, die pT181, FII- und FI-Replikationsursprünge umfassen.
Beispiele für Replikationsursprünge, die bei Assays der Erfindung in E. coli und S. typhimurium nützlich sind, beinhalten, ohne hierauf beschränkt zu sein, pHETK (Garapin et al., 1981, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 78: 815-819), p279 (Talmadge et al., 1980, Proc. Natl. Acad. Sci USA, 77: 3369- 3373), p5-3 und p21A-2 (beide von Pawalek et al., 1997, Cancer Res., 57: 4537-4544), pMB1 (Bolivar et al., 1977, Gene, 2: 95-113), ColE1 (Kahn et al., 1979, Methods Enzymol., 68: 268-280), p15A (Chang et al., 1978, J. Bacteriol., 134: 1141-1156); pSC101 (Stoker et al., 1982, Gene, 18: 335-341); R6K (Kahn et al., 1979, supra); R1 (temperaturabhängiger Replikationsursprung, Uhlin et al., 1983, Gene, 22: 255-265); Lambda dv (Jackson et al., 1972, Proc. Natl. Acad. Sci USA., 69: 2904-2909); pYA (Nakayama et al., 1988, infra). Ein Beispiel für einen Replikationsursprung, der in Staphylococcus nützlich ist, ist pT181 (Scott, 1984, Microbial Reviews 48: 1-23). Von den oben beschriebenen Replikationsursprüngen sind pMB1, p15A und ColE1 bevorzugt, da diese Ursprünge keine Plasmid-codierten Proteine für die Replikation erfordern.
Hefeplasmide:
Es werden drei Systeme für die rekombinante Plasmidexpression und Replikation in Hefe verwendet:

1. Integration. Ein Beispiel für ein solches Plasmid ist YIp, das mit einer Kopie pro haploidem Genom aufrechterhalten wird und in Mendelscher Weise vererbt wird. Ein solches Plasmid, enthaltend ein Gen von Interesse, einen bakteriellen Replikationsursprung und ein selektierbares Gen (typischerweise einen Antibiotika-Resistenzmarker), wird in Bakterien produziert. Der gereinigte Vektor wird innerhalb des selektierbaren Gens linearisiert und verwendet, um kompetente Hefezellen zu transformieren. Unabhängig vom Typ des verwendeten Plasmids, werden Hefezellen typischerweise durch chemische Verfahren transformiert (z.B. wie beschrieben von Rose et al., 1990, Methods in Yeast Genetics, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY). Die Zellen werden mit Lithiumacetat behandelt, um Transformationseffizienzen von etwa 10⁴ Kolonie-bildenden Einheiten (Transformierten Zellen/μg DNA) zu erreichen. Hefe führt homologe Rekombination durch, sodass der geschnittene selektierbare Marker mit dem mutierten (gewöhnlich mit einer Punktmutation oder einer kleinen Deletion behafteten) Wirtsgen rekombiniert, um die Funktion wieder herzustellen. Transformierte Zellen werden dann auf Selektionsmedium isoliert.
2. ARS-CEN mit niedriger Kopienzahl, wofür YCp ein Beispiel ist. Ein solches Plasmid enthält die autonom replizierende Sequenz (ARS1), eine Sequenz von etwa 700 bp, die, wenn sie auf einem Plasmid getragen wird, die Replikation in Hefe erlaubt, und eine Centromer-Sequenz (CEN4), wobei letztgenannte mitotische Stabilität erlaubt. Diese sind gewöhnlich mit 1-2 Kopien pro Zelle vorhanden. Die Entfernung der CEN-Sequenz ergibt ein YRp-Plasmid, das typischerweise mit 100-200 Kopien pro Zelle vorliegt, jedoch ist dieses Plasmid sowohl mitotisch als auch meiotisch instabil.
3. 2μ-Ringe hoher Kopienzahl. Diese Plasmide enthalten eine Sequenz von etwa 1 kb Länge, die 2 μ-Sequenz, die als Hefe-Replikon fungiert, das zu einer höheren Kopienzahl des Plasmids führt; jedoch sind diese Plasmide instabil und erfordern Selektion für ihre Aufrechterhaltung. Die Kopienzahl wird gesteigert, indem man auf dem Plasmid ein Selektionsgen bereithält, das funktionsfähig mit einem reduzierten Promotor verbunden ist. Dies ist für gewöhnlich das LEU2-Gen mit einem trunkierten Promotor (LEU2-d), sodass niedrige Spiegel an Leu2p-Protein produziert werden; daher erzwingt die Selektion auf einem an Leucin verarmten Medium eine Steigerung der Kopienzahl, um die Menge an Leu2p hinreichend für das Zellwachstum zu machen.

Wie oben vorgeschlagen, beinhalten Beispiele von Hefeplasmiden, die für die Erfindung nützlich sind, die YRp-Plasmide (basierend auf autonom replizierenden Sequenzen oder ARS) und die YEp-Plasmide (basierend auf dem 2μ-Ring), wofür YEp24 und die YEplac-Reihe von Plasmiden Beispiele sind (Gietz und Sugino, 1988, Gene, 74: 527-534). (Siehe Sikorski, „Extrachromosomal cloning vectors of Saccharomyces cerevisiae" in Plasmids, A Practical Approach, Herausgeber K.G. Hardy, IRL Press, 1993; und Yeast Cloning Vectors and Genes, Current Protocols Molecular Biology, Abschnitt II, Unit 13.4, Herausgeber Ausubel et al., 1994).
Zusätzlich zu einem Hefe-Replikationsursprung umfassen Hefe-Plasmidsequenzen typischerweise ein Antibiotikaresistenzgen, einen bakteriellen Replikationsursprung (für die Vervielfältigung in Bakterienzellen) und ein Hefe-Ernährungsgen für die Aufrechterhaltung in Hefezellen. Das Ernährungsgen (oder der „auxotrophe Marker") ist am häufigsten einer der Folgenden (wobei das in Klammern aufgelistete Genprodukt und die angegebenen Größen die codierende Sequenz zusammen mit dem Promotor und Terminatorelementen umfassen, die für die korrekte Expression benötigt werden):

TRP1 (Phospho-ADP-Ribosylanthranilat-Isomerase, die eine Komponente des Tryptophan-Biosynthesewegs ist).
URA3 (Orotidin-5'-Phosphat-Decarboxylase, die am Uracil-Biosyntheseweg teilnimmt).
LEU2 (3-Isopropylmalat-Dehydrogenase, die am Biosyntheseweg von Leucin beteiligt ist).
HIS3 (Imidazolglycerolphosphat-Dehydratase oder IGP-Dehydratase).
LYS2 (-Aminoadipat-Semialdehyd-Dehydrogenase, Teil des Biosynthesewegs von Lysin).

Alternativ kann das Screening System in einem intakten, lebenden, mehrzelligen Organismus, wie etwa einem Insekt, oder einem Säuger, betrieben werden. Verfahren zur Herstellung transgener Drosophila, Mäuse und anderer Organismen, sowohl transient als auch stabil, sind in der Technik wohlbekannt; die Detektion von Fluoreszenz, die aus der Expression von Grünem Fluoreszenzprotein in lebender Drosophila resultiert, ist in der Technik wohlbekannt. Ein oder mehrere Genexpressions-Konstrukte, die für ein oder mehrere einer markierten natürlichen Bindungsdomäne, Bindungssequenz oder eines Bindungspolypeptids, eines Bindungspartners, eines Protein-modifizierenden Enzyms und, optional, eines Kandidatenmodulators hierfür codieren, werden durch in der Technik wohlbekannte Verfahren (siehe auch unten) in den Testorganismus eingeführt. Nach der Applikation des Nukleinsäuremoleküls lässt man hinreichend Zeit verstreichen, um Genexpression, die Bindung einer natürlichen Bindungsdomäne, Bindungssequenz oder eines Bindungspolypeptids an den zugehörigen Bindungspartner und, wenn nötig, Chromophorenreifung (z.B. reift Grünes Fluoreszenzprotein über eine Zeitspanne von etwa 2 Stunden vor der Fluoreszenz) zu erlauben, bevor Fluoreszenz oder eine andere Emission von einer detektierbaren Markierung gemessen wird. Eine Reaktionskomponente (insbesondere ein Kandidatenmodulator der Enzymfunktion), der nicht als Nukleinsäuremolekül verabreicht wird, kann durch ein Verfahren ausgeliefert werden, das aus den unten beschriebenen ausgewählt wird.
Dosierung und Verabreichung einer markierten natürlichen Bindungsdomäne, Bindungssequenz oder eines Bindungspolypepitids, eines Bindungspartners hierfür, eines Protein-modifizierenden Enzyms oder eines Kandidatenmodulators hierfür zur Verwendung bei einem in vivo-Assay
Dosierung
Beispielsweise muss die Menge jeder markierten natürlichen Bindungsdomäne oder jedes Bindungspartners hierfür in die Detektionsgrenzen des verwendeten Fluoreszenzmessgeräts fallen. Die Menge an Enzym oder Kandidatenmodulator hierfür wird typischerweise im Bereich von etwa 1 μg – 100 mg/kg Körpergewicht liegen. Wenn der Kandidatenmodulator ein Peptid oder Polypeptid ist, wird er typischerweise in Bereich von etwa 100 – 500 μg/ml pro Dosis verabreicht. Eine Einzeldosis eines Kandidatenmodulators oder mehrere Dosen einer solchen Substanz, täglich, wöchentlich oder stoßweise, werden ins Auge gefasst.
Ein Kandidatenmodulator wird in einem Konzentrationsbereich getestet, der vom Molekulargewicht des Moleküls und vom Typ des Assays abhängt. Für die Inhibition der Protein/Protein- oder Protein/DNA-Komplex-Bildung oder Transkriptionsinitiation (in Abhängigkeit von dem Mengenniveau, bei dem man annimmt oder anstrebt, dass der Kandidatenmodulator die Aktivität eines Protein-modifizierenden Enzyms gemäß der Erfindung moduliert) können kleine Moleküle (wie oben definiert) beispielsweise in einem Konzentrationsbereich von 1 pg – 100 μg/ml, bevorzugt von etwa 100 pg – 10 ng/ml, getestet werden; große Moleküle, z.B. Peptide, können im Bereich von 10 ng – 100 μg/ml, bevorzugt von 100 ng – 10 μg/ml, getestet werden.
Verabreichung
Allgemein werden Nukleinsäuremoleküle in einer Weise verabreicht, die mit der Dosisformulierung kompatibel ist, und in einer solchen Menge, wie wirksam sein wird. Im Falle einer rekombinanten Nukleinsäure, die für eine natürliche Bindungsdomäne und/oder einen Bindungspartner hierfür codiert, sollte eine solche Menge hinreichend sein, die in der Produktion einer detektierbaren Menge des markierten Proteins oder Peptids, wie oben diskutiert, resultiert. Im Fall eines Protein-modifizierenden Enzyms sollte die durch Expression eines Nukleinsäuremoleküls produzierte Menge hinreichend sein, um sicherzustellen, dass wenigstens 10% der natürlichen Bindungsdomänen oder Bindungspartner hierfür die Modifikation durchmachen, wenn sie eine Zielstelle umfassen, die von dem getesteten Enzym erkannt wird. Schließlich muss die Menge einer Nukleinsäure, die für einen Kandidatenmodulator eines Protein-modifizierenden Enzyms der Erfindung codiert, hinreichend sein, um die Produktion einer Menge des Kandidatenmodulators sicherzustellen, die, wenn sie effizient ist, eine Änderung von wenigstens 10% im Bezug auf die Wirkung des Zielprotein-modifizierenden Enzyms bei FRET oder einer anderen Markierungsemission (resultierend aus der Bindung einer natürlichen Bindungsdomäne an ihren Bindungspartner) hat, oder, wenn sie einem Patienten verabreicht wird, eine Menge, die prophylaktisch und/oder therapeutisch wirksam ist.
Wenn das Endprodukt (z.B. ein Antisense-RNA-Molekül oder Ribozym) direkt verabreicht wird, so ist die zu applizierende Dosis direkt proportional zur Menge, die pro Zelle benötigt wird, und zur Anzahl der zu transfizierenden Zellen, mit einem Korrekturfaktor für die Effizienz der Aufnahme der Moleküle. In Fällen, bei denen ein Gen von den Nukleinsäuremolekülen exprimiert werden muss, muss die Stärke der assoziierten transkriptionsregulatorischen Sequenzen auch im Hinblick auf die Berechnung der Anzahl von Nukleinsäuremolekülen pro Zielzelle, die in angemessenen Spiegeln des codierten Produkts resultieren wird, berücksichtigt werden. Geeignete Dosisbereiche sind in der Größenordnung, bei der ein Genexpressionskonstrukt mit 0,5 – 1 μg, oder 1 – 10 μg, oder, optional, mit 10 – 100 μg an Nukleinsäure in einer Einzeldosis verabreicht wird. Es ist denkbar, dass Dosierungen von bis zu 1 mg vorteilhaft verwendet werden können. Es ist zu berücksichtigen, dass die Anzahl an molaren Äquivalenten pro Zelle mit der Größe des Konstrukts variiert, und dass verwendete absolute Mengen an DNA entsprechend angepasst werden sollten, um eine adäquate Genkopienzahl sicherzustellen, wenn große Konstrukte injiziert werden.
Wenn keine Wirkung (z.B. eines Protein-modifizierenden Enzyms oder eines Inhibitors hiervon) innerhalb von vier Größenordnungen in beiden Richtungen von der Ausgangsdosis aus zu sehen ist, so ist es wahrscheinlich, dass ein Protein-modifizierendes Enzym die Zielstelle der natürlichen Bindungsdomäne (und, optional, von deren Bindungspartner) gemäß der Erfindung nicht erkennt, oder dass der Kandidatenmodulator hiervon gemäß der Erfindung nicht von Nutzen ist. Es ist entscheidend wichtig, anzumerken, dass, wenn hohe Dosen verwendet werden, die Konzentration unterhalb schädlicher Mengenniveaus gehalten werden muss, die bekannt sein können, wenn ein Enzym oder Kandidatenmodulator ein Arzneistoff ist, der für die klinische Verwendung zugelassen wurde. Eine solche Dosis sollte um eine (oder, bevorzugt, um zwei oder mehr) Größenordnungen unterhalb des LD₅₀-Wertes liegen, der für einen Laborsäuger bekannt ist, und bevorzugt unterhalb von Konzentrationen, für die dokumentiert ist, dass sie ernste oder sogar letale Nebenwirkungen hervorrufen.
Komponenten von Screening-Tests der Erfindung können in einem physiologisch akzeptablen Verdünnungsmittel, wie etwa Wasser, Phosphat-gepufferter Saline oder Saline formuliert werden, und sie können weiterhin einen Hilfsstoff (Adjuvans) beinhalten. Adjuvanzien, wie etwa nicht vollständiges Freunds Adjuvans, Aluminiumphosphat, Aluminiumhydroxid oder Alaun, sind Materialien, die in der Technik wohlbekannt sind. Die Verabreichung markierter Polypeptide, die eine natürliche Bindungsdomäne, Bindungssequenz, ein Bindungspolypeptid oder einen Bindungspartner hierfür, ein Protein-modifizierendes Enzym oder einen Kandidaten-Modulator, wie hier beschrieben, umfassen, kann entweder lokalisiert oder systemisch erfolgen.
Lokalisierte Verabreichung:
Die lokalisierte Verabreichung einer Komponente eines Assays der Erfindung erfolgt bevorzugt über Injektion oder mittels einer Tropfvorrichtung, Arzneimittelpumpe oder einer mit Arzneistoff gesättigten festen Matrix, die an der Zielstelle implantiert wird und ausgehend von der die markierte natürliche Bindungsdomäne, Bindungssequenz oder das Bindungspolypeptid, der Bindungspartner hierfür, das modifizierende Enzym oder der Kandidatenmodulator hierfür, oder eine Nukleinsäure, die beliebige von diesen codiert, diffundieren kann. Wenn ein Gewebe, das das Ziel der Auslieferung gemäß der Erfindung ist, sich auf der Oberfläche eines Organismus befindet, so ist eine topische Verabreichung einer pharmazeutischen Zusammensetzung möglich.
Zusammensetzungen mit einer Zusammensetzung oder Verwendung gemäß der Erfindung, die für die topische Applikation geeignet sind, können eine von mehreren physikalischen Formen annehmen, wie unten zusammengefasst:

(i) Eine Flüssigkeit, wie etwa eine Tinktur oder Lotion, die durch Gießen, Tropfen oder „Aufstreichen" (d.h. Verteilen mit der Hand oder mit einer Bürste oder einem anderen Applikator, wie etwa einem Spatel) oder durch Injektion appliziert werden kann.
(ii) Eine Salbe oder Creme, die entweder manuell oder mit einer Bürste oder einem anderen Applikator (z.B. einem Spatel) verteilt werden kann, oder die über eine Düse oder eine andere kleine Öffnung aus einem Behälter, wie etwa einer zusammenklappbaren Tube, extrudiert werden kann.
(iii) Ein trockenes Pulver, das auf ein Zielgewebe geschüttelt oder gesiebt oder, alternativ, als vernebeltes Spray appliziert werden kann.
(iv) Ein Flüssigkeits-basiertes Aerosol, das aus einem Behälter freigesetzt werden kann, der ausgewählt ist aus der Gruppe, umfassend druckgetriebene Sprayflaschen (wie die, die durch Drücken aktiviert werden), natürliche Zerstäuber (oder „Pump-Spray"-Flaschen, die ohne ein komprimiertes Treibmittel arbeiten) oder unter Druck befindliche Kanister.
(v) Eine Carbowax- oder Glycerinpräparation, wie etwa ein Zäpfchen, die für die rektale oder vaginale Applikation einer therapeutischen Zusammensetzung verwendet werden kann.

In einem speziellen Fall ist das Gewebe, an das ein Kandidatenmodulator eines Protein-modifizierenden Enzyms für einen Assay (oder, wenn er als wirksam ermittelt wird, zur therapeutischen Verwendung) auszuliefern ist, die Lunge. In einem solchen Fall erfolgt die Verabreichungsroute über Inhalation, entweder als flüssiges Aerosol oder als zerstäubtes Pulver hiervon. Die Arzneimittelzufuhr über Inhalation, ob für die topische oder systemische Verteilung, ist wohlbekannt in der Technik zur Behandlung von Asthma, Bronchitis und Anaphylaxie. Insbesondere ist gezeigt worden, dass es möglich ist, ein Protein über Aerosol-Inhalation so auszuliefern, dass es seine native Aktivität in vivo behält (siehe Hubbard et al., 1989, J. Clin. Invest., 84: 1349-1354).
Systemische Applikation:
Die systemische Applikation eines Proteins, einer Nukleinsäure oder eines anderen Mittels gemäß der Erfindung kann durch Verfahren der Ganzkörper-Arzneimittelzufuhr durchgeführt werden, die in der Technik wohlbekannt sind. Diese beinhalten, ohne hierauf beschränkt zu sein, intravenöse(n) Tropf oder Injektion, subkutane, intramuskuläre, intraperitoneale, intracraniale und spinale Injektion, Aufnahme über die orale Route, Inhalation, trans-epitheliale Diffusion (wie etwa über ein Arzneistoff-imprägniertes Klebepflaster) oder durch die Verwendung einer implantierbaren, zeitverzögerten Arzneimittel-Abgabevorrichtung, die ein Reservoir an exogen produziertem Protein, Nukleinsäure oder anderem Material umfassen kann, oder stattdessen Zellen umfassen kann, die eine natürliche Bindungsdomäne und/oder einen Bindungspartner hierfür, ein Protein-modifizierendes Enzym oder einen Kandidatenmodulator hierfür produzieren und sekretieren können. Es ist zu beachten, dass die Injektion entweder durch konventionelle Mittel (d.h. unter Verwendung einer Injektionsnadel) oder durch Hypospray (siehe Clarke und Woodland, 1975, Rheumatol. Rehabil., 14: 47-49) durchgeführt werden kann. Die Komponenten von Assays der Erfindung können in Einzel- oder Mehrfachdosen verabreicht werden.
Die Zufuhr einer Nukleinsäure kann unter Verwendung einer Auslieferungstechnik durchgeführt werden, die ausgewählt ist aus der Gruppe, die, ohne hierauf beschränkt zu sein, folgendes beinhaltet: die Verwendung viraler Vektoren und nicht-viraler Vektoren, wie etwa episomaler Vektoren, künstlicher Chromosomen, Liposomen, kationischer Peptide, gewebespezifischer Zelltransfektion und Transplantation, Verabreichung von Genen in allgemeinen Vektoren mit gewebespezifischen Promotoren, etc.
Kits
Kit zur Untersuchung der Aktivität eines Protein-modifizierenden Enzyms
Um eine einfache und weit verbreitete Verwendung der hier beschriebenen Verfahren zu erleichtern, wird ein Kit beschrieben, das die essentiellen Komponenten zum Durchtesten der Aktivität eines Enzyms enthält, das eine Veränderung der Proteinmodifikation vermittelt, wie oben beschrieben. Eine natürliche Bindungsdomäne, Bindungssequenz oder ein Bindungspolypeptid, wie oben definiert, und der entsprechende Bindungspartner werden in einem geeigneten Reaktionspuffer für einen in vitro-Assay, oder, alternativ, für Zellen oder Zelllysate bereitgestellt. Ein Reaktionspuffer, der „geeignet" ist, ist einer, der die Aktivität des zu testenden Enzyms zulässt und die Modifikations-abhängige Bindung der natürlichen Bindungsdomäne an den Bindungspartner erlaubt. Die markierten Polypeptidkomponenten werden als Peptid/Protein oder als Nukleinsäure, umfassend ein Genexpressionskonstrukt, bereitgestellt, das für eines oder mehrere von einem Peptid/Protein, wie oben diskutiert, codiert. Natürliche Bindungsdomänen, Bindungssequenzen und Bindungspolypeptide, ebenso wie ihre zugehörigen Bindungspartner, werden in einem Kit entweder in Lösung (bevorzugt gekühlt oder gefroren), in einem Puffer, der den Abbau hemmt und die biologische Aktivität aufrechterhält, oder in getrockneter Form, z.B. lyophilisiert, bereitgestellt. Im letztgenannten Fall werden die Komponenten vor der Verwendung resuspendiert, und zwar in dem Reaktionspuffer oder einer anderen biokompatiblen Lösung (z.B. Wasser, enthaltend eines oder mehrere von physiologischen Salzen, einem schwachen Puffer, wie etwa Phosphat oder Tris, und einer stabilisierenden Substanz, wie etwa Glycerol, Sucrose oder Polyethylenglykol); im letztgenannten Fall sollte der Resuspendierpuffer die modifikationsabhängige Proteinbindung nicht inhibieren, wenn er dem Reaktionspuffer in einer Menge zugegeben wird, die notwendig ist, um genügend Protein für eine Assay-Reaktion zu liefern. Natürliche Bindungsdomänen, Bindungssequenzen oder Bindungspolypeptide oder deren Bindungspartner, die als Nukleinsäuren bereitgestellt werden, werden in einem Puffer bereitgestellt oder resuspendiert, der entweder die Transfektion/Transformation in eine Zelle oder einen Organismus oder die in vitro-Transkription/Translation, wie oben beschrieben, erlaubt. Jede dieser Komponenten wird separat verpackt oder im Gemisch mit einer oder mehreren der anderen in einem Behälter bereitgestellt, der ausgewählt ist aus der Gruppe, die, ohne hierauf beschränkt zu sein, ein Röhrchen, eine Phiole, eine Spritze oder Flasche beinhaltet.
Optional enthält das Kit Zellen. Eukaryotische oder prokaryotische Zellen, wie oben beschrieben, werden in bzw. auf einem flüssigen oder festen physiologischen Puffer oder Kulturmedium (z.B. in Suspension, in einer Stichkultur oder auf einer Kulturplatte, z.B. einer Petri- Schale) bereitgestellt. Um den Versand zu erleichtern, werden die Zellen typischerweise in einer Flasche, Röhre oder Phiole gekühlt, gefroren oder lyophilisiert. Verfahren der Zellkonservierung sind in der Technik in breitem Maße bekannt; geeignete Puffer und Medien sind in der Technik ebenfalls in breitem Maße bekannt und werden von kommerziellen Anbietern (z.B. Gibco/LifeTechnologies) bezogen oder durch Standardverfahren (siehe z.B. Sambrook et al., 1989, Molecular Cloning. A Laboratory Manual., 2. Auflage, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY) hergestellt.
Ein Enzym, das gemäß der Erfindung untersucht wird, wird dem Assay-System entweder als Protein (isoliert, partiell gereinigt oder in einer Rohpräparation, wie etwa einem Zellextrakt oder sogar einer lebenden Zelle vorliegend) oder als rekombinante Nukleinsäure zugegeben. Verfahren zum Exprimieren einer Nukleinsäure, umfassend ein Enzym oder ein anderes Protein, sind in der Technik wohlbekannt (siehe wiederum oben).
Ein hier beschriebener Assay kann unter Verwendung des Kits gemäß den oben und in den Beispielen beschriebenen Verfahren durchgeführt werden.
Kit zum Durchtesten eines Kandidatenmodulators der Protein-modifizierenden Enzymaktivität
Ein Kandidatenmodulator der posttranslationalen Modifikation kann unter Verwendung eines Kits untersucht werden. Es wird ein Kit gemäß obiger Beschreibung für diese Anwendung verwendet, wobei die Durchführung des Assays weiterhin die Zugabe eines Kandidatenmodulators des modifizierenden Enzyms, das im Reaktionssystem vorliegt, umfasst. Optional wird ein Protein-Modifizierendes Enzym mit dem Kit mitgeliefert, entweder als Protein oder als Nukleinsäure, wie oben beschrieben.
Assays der Proteinaktivität werden durchgeführt, wie oben beschrieben. Es werden mindestens drei Detektionen durchgeführt, eine, bei der die natürliche Bindungsdomäne und der Bindungspartner ohne das modifizierende Enzym oder den Kandidatenmodulator hiervon vorliegen (Kontrollreaktion A), eine, bei der die Polypeptide mit dem modifizierenden Enzym unter Bedingungen inkubiert werden, die es der Modifikationsreaktion erlauben, stattzufinden (Kontrollreaktion B) und eine, bei der das modifizierende Enzym und der Kandidatenmodulator beide mit den markierten Polypeptiden unter Bedingungen inkubiert werden, die es der Modifikationsreaktion erlauben, stattzufinden (Testreaktion). In jedem der Fälle sind die Bedingungen geeignet, um eine Modifikations-abhängige Assoziation der natürlichen Bindungsdomäne, Bindungssequenz oder des Bindungspolypeptids und des Bindungspartners zu erlauben. Das Ergebnis der letzten Detektionsprozedur wird mit denjenigen der zwei Kontrollen verglichen; der Kandidatenmodulator wird als wirksam bewertet, wenn es eine Verschiebung entweder der beobachteten Stärke des Signals (d.h. der Gesamtgröße) oder der Änderungsrate der Fluoreszenz, des FRET, der Masse eines Proteinkomplexes oder der Inhibition oder Aktivierung eines Enzyms mit wenigstens 10% Abweichung von dem Ergebnis gibt, das bei der Kontrollreaktion B gegenüber dem bei Kontrollreaktion A beobachteten Ergebnis festgestellt wurde.
Die vorliegende Erfindung wird nun unter Bezugnahme auf die folgenden Beispiele beschrieben, die rein veranschaulichend und nicht limitierend gedacht sind.
Beschreibung der Figuren
1: FRET zwischen ZAP-GFP und Rhodamin-markiertem, von TCRζ abgeleitetem Peptid. Zugabe von TCR-Peptid nach 9,5 Minuten, Umkehr von FRET, initiiert durch die Zugabe von YOP, nach 25 Minuten.
2: Abhängigkeit der Aktivität von YOP auf verschiedene Konzentrationen von TCRζ-Peptid.
3: Messung der Inhibition von YOP durch Natrium-ortho-Vanadat unter Verwendung des FRET-Assays. Berechnete IC₅₀ = 0,25 μM.
4: Fluoreszenz-Polarisations-Assay zur Detektion der Chk1-Phosphorylierung von Fluorescein-markiertem Chktid, das an 14-3-3ζ bindet.
5: Inhibition der Chk1-Phosphorylierung von Chktid durch EDTA.
6: Assay der Chk1-Aktivität in Echtzeit unter Überwachung der Fluoreszenzpolarisation von Fluorescein-markiertem Chktid-Substrat, das an 14-3-3ζ-Protein bindet.
7: Chk1-Aktivität, gemessen durch Chktid: Die 14-3-3ζ-Bindung ist abhängig von ATP und der Gegenwart von 14-3-3ζ-Protein.
8: Inhibition der Chk1-Phosphorylierung von Fluorescein-markiertem Chktid durch EDTA.
9: Assay der Chk1-Phosphorylierung von Chktid durch 14-3-3ε-Bindung.
10: Messung der Aktivität von Phosphatase λ durch Dephosphorylierung von Fluorescein-markiertem Chktid und Abnahme der Bindung an 14-3-3ζ.
11: Messung der Aktivität von Phosphatase λ durch Dephosphorylierung von Fluorescein-markiertem Chktid und Abnahme der Bindung an 14-3-3ε.
12: Detektion der Phosphorylierung von TCRζ-Peptid durch Src-Kinase unter Verwendung von FRET-Assay zwischen ZAP-GFP und Rhodamin-markiertem TCRζ-Peptid.
13: Detektion der aus SHPS-1 stammenden Peptidphosphorylierung durch Src über Bindung an SHP2-GFP-Partner.
14: Umkehr von FRET zwischen SHP2-GFP und Rhodamin-markiertem, phosphoryliertem SHPS-1-Peptid durch YOP.
15: Detektion der Src-Inhibition durch Staurosporin unter Verwendung eines FRET-Assays zwischen Rhodamin-markiertem SHPS-1 und SHP2-GFP.
16: Assay der Src-Phosphorylierung von SHPS-1-Peptid in Echtzeit unter Verwendung von FRET.
17: Diagramme doppel- und einzelkettiger enzymatischer Assay-Formate der Erfindung.
18: zeigt eine schematische Übersicht von FRET in einem Assay der Erfindung.
19 stellt Monomer-Excimer-Fluoreszenz dar.
BEISPIELE
Beispiel 1 – Verwendung eines Polypeptids, umfassend eine natürliche Bindungsdomäne, als Reporter der Phosphorylierung
Assay 1
Ein Assay dieses Typs beinhaltet die folgenden Komponenten:
ν-Src SH2-Domäne (Aminosäuren 148-246; Waksman et al., 1993, Cell, 72: 779-790; OWL-Datenbank Zugangsnummer M33292), und
Hamster Polyomavirus mittleres T-Antigen (Ag, unten) (321-331, EPQYEEIPIYL; Waksman et al., 1993, supra; OWL-Datenbank-Zugangsnummer P03079).
SH2-Domänen finden sich in Proteinen, die an einer Anzahl von Signalwegen beteiligt sind, und ihre Bindung an spezifische phosphorylierte Tyrosinreste ist ein Schlüssel bei der Vermittlung der Signalübertragung zwischen Tyrosinkinasen und den Proteinen in der Zelle, die auf Tyrosin-Phosphorylierung reagieren (Waksman et al., 1993, supra und darin befindliche Referenzstellen). Einzelne SH2-Domänen erkennen spezifische Sequenzen, und die Sequenzspezifität einer Anzahl von SH2-Domänen ist unter Verwendung einer Phosphopeptid-Bibliothek bestimmt worden (Songyang et al., 1993, supra). Diese Daten liefern eine Anzahl möglicher Domänen/Peptid-Paare, die in Assays der enzymatischen Aktivität gemäß der Erfindung verwendbar sind. Die Kristallstruktur der Src-SH2-Domäne im Komplex mit einem Peptid, das deren spezifisches Erkennungsmotiv aus dem mittleren Hamster-T-Antigen enthält (Ziel-Tyrosin für die Phosphorylierung oben fett dargestellt), ist von Waksman et al. (Cell 72, 779-790) bestimmt worden.
Somit ist der Assay wie folgt:
Dabei ist F1 der Donor-Fluorophor, F2 der Akzeptor-Fluorophor und P bezeichnet die Anfügung einer Phosphatgruppe an den Ziel-Tyrosinrest.
Das Peptid, wie bei der oben beschriebenen Kristallisation verwendet, enthält keine geeigneten Reste für eine komfortable Markierung, und eine Markierung innerhalb dieser kurzen Sequenz wäre zu nah an der Phosphorylierungsstelle. Ein kurzer Linker (z.B. Gly-Gly) wird daher entweder an den C- oder den N-Terminus des Peptids angehängt, mit einem Rest, wie etwa Lys für die Markierung an dem Ende. Die Position dieses Linkers wird von der Position von F1 in der SH2-Domäne abhängen.
Eine Anzahl potentieller Positionen für den Fluorophor in der SH2-Domäne ist auf Basis der Kristallstruktur identifiziert worden:

** Diese Stelle ist nahe zur Stelle der Peptidinteraktion

Wenn ein Fluoreszenzprotein (z.B. Grünes Fluoreszenzprotein, GFP) anstelle eines chemischen Fluorophors verwendet wird, wird es an die N-Termini sowohl der SH2-Domäne als auch des Peptids platziert.
Beispiel 2 – Verwendung eines Polypeptids mit einer natürlichen Bindungsdomäne als Reporter der Phosphorylierung
Assay 2
An diesem Assay sind die folgenden Komponenten beteiligt:
PTB-Domäne von IRS-1 (Aminosäuren 157-267) (Zhou et al., 1996, Nature Structural Biology, 3: 388-393; OWL-Zugangsnummer P35568), und
Interleukin 4-Rezeptor (IL-4R) (Aminosäuren 489-499, LVIAGNPAYRS; Zhou et al., 1996, supra; OWL-Zugangsnummer P24394).
Phosphotyrosin-Bindungs (PTB)-Domänen finden sich in einer Anzahl von Proteinen, die an Signalwegen unter Verwendung von Tyrosin-Phosphorylierung beteiligt sind. Die PTB-Domäne besitzt funktionelle Ähnlichkeiten zur SH2-Domäne, unterscheidet sich jedoch in ihrem Wirkungsmechanismus und ihrer Struktur, sowie außerdem bei der Sequenzerkennung (Laminet et al., 1996, J. Biol. Chem., 271: 264-269; Zhou et al., 1996, supra und darin befindliche Bezugsstellen). Diese zwei Klassen von Domänen besitzen wenig Sequenzidentität. Es ist eine NMR-Strukturanalyse der PTB-Domäne von IRS-1 im Komplex mit dem IL-4-Rezeptorpeptid durchgeführt worden (Zhou et al., 1996, supra).
Das Testformat ist wie folgt:
Dabei ist F1 der Donor-Fluorophor, F2 der Akzeptor-Fluorophor, und P bezeichnet die Addition einer Phosphatgruppe an den Ziel-Tyrosinrest.
Das oben beschriebene Peptid der NMR-Studie enthält keine geeigneten Reste für eine komfortable Markierung mit Ausnahme des Arginins nahe der Phosphorylierungsstelle, und eine Markierung innerhalb dieser kurzen Sequenz kann zu nah an der Zielstelle für die Phosphorylierung liegen. Es kann ein kurzer Linker entweder an den N- oder C-Terminus des Peptids angefügt werden, mit einem Rest für die Markierung am Ende. Die Position eines solchen Linkers hängt von der Position von F1 in der PTB-Domäne ab.
Es sind mehrere potentielle Positionen für den Fluorophor in der PTB-Sequenz aus der NMR-Struktur identifiziert worden:
Wenn GFP anstelle eines chemischen Fluorophors verwendet wird, kann es wiederum im Leseraster entweder an den N- oder C-Terminus sowohl der PTB-Sequenz als auch des Bindungspartners fusioniert werden.
Beispiel 3
Ein Assay analog zu dem aus Beispiel 2 kann gemäß der Erfindung konfiguriert werden, wobei die PTB-Domäne des Proto-Onkogen-Produkts Cbl und ein Peptid, das aus der Zap-70-Tyrosinkinase stammt verwendet werden. Die Cbl-Phosphotyrosin-Bindungsdomäne selektiert ein D(N/D)XpY-Motiv und bindet an die Tyr₂₉₂ negativ regulatorische Phosphorylierungsstelle von ZAP-70 (Lupher et al., 1997, J. Biol. Chem., 272: 33140-33144).
Die Komponenten des Assays sind:
Die Cbl N-terminale Domäne (Aminosäuren 1-357; Lupher et al., 1996, J. Biol. Chem., 271: 24063-24068; OWL-Zugangsnummer P22681), und
Zap-70 (Aminosäuren 284-299, NH₃-IDTLNSDGYTPEPARI-COOH; Lupher et al., 1996, supra; OWL-Zugangsnummer P43403).
Beispiel 4: Verwendung eines Polypeptids mit einer natürlichen Bindungsdomäne als Reporter der Phosphorylierung
Assay 4
Dieser Assay beinhaltet die folgende Komponente:
c-Src (Reste 86-536; Xu et al., 1997, Nature, 385: 595-602; GenBank-Zugangsnummer K03218).
Wie oben postuliert, ist Src ein Mitglied einer Familie von Nicht-Rezeptor-Tyrosin-Kinasen, die an der Regulation von Antworten auf extrazelluläre Signale beteiligt sind. Die Assoziation von src sowohl mit der Plasmamembran als auch mit intrazellulären Membranen wird durch die Myristoylierung am N-Terminus vermittelt. Das Enzym besitzt vier Regionen, die durch die Familie hindurch konserviert sind, die SH2-Domäne, die SH3-Domäne, die Kinase- oder SH1-Domäne und den C-terminalen Schwanz. Zusätzlich gibt es eine singuläre Region, die keine Homologie zwischen den Familienmitgliedern aufweist (Brown und Cooper, 1996, Biochim Biophys. Acta, 1287: 121-149).
Die SH2-Domäne bindet fest an spezifische Tyrosin-phosphorylierte Sequenzen. Diese Affinität spielt eine Rolle bei der Interaktion zwischen src und anderen zellulären Proteinen und außerdem bei der Regulation der Kinase durch Phosphorylierung. Der C-terminale Schwanz von src kann an Tyr₅₃₀ phosphoryliert werden, wobei diese Phosphorylierung zu einer nahezu vollständigen Inhibition der Kinaseaktivität führt. Es gibt starke Anhaltspunkte dafür, dass diese Inhibition durch die Interaktion des C-terminalen Schwanzes mit der SH2-Domäne erreicht wird. Man nimmt an, dass diese Interaktion eine Konformationsänderung zur „geschlossenen" Konformation hin unterstützt, die durch die Beteiligung der SH3- und Kinase-Domänen an intramolekularen Kontakten weiter stabilisiert wird.
Der Assay lässt sich schematisch wie folgt darstellen:
Dabei ist F1 der Donor-Fluorophor, F2 ist der Akzeptor-Fluorophor, und P bezeichnet die Addition einer Phosphatgruppe an den Ziel-Tyrosinrest.
Es gibt mehrere potentielle Stellen für die Markierung in dieser Struktur. Einige Beispiele von Zielresten sind unten dargestellt:
Wenn ein Fluoreszenzprotein in einem Assay wie diesem verwendet wird und eine intramolekulare Interaktion genutzt wird, um eine chemische Modifikation zu verfolgen, so ist es geeignet, GFP unter Verwendung eines flexiblen Linkers zwischen den Domänen zu platzieren, um die Proteindomänen-Interaktionen zu bewahren. Dies erlaubt es den GFP-Varianten, sich enger anzunähern, und steigert die Effizienz des erreichten FRET, wobei dies aber ausbalanciert werden muss, da die Notwendigkeit besteht, einen guten Abstand zwischen den Varianten im Zustand „kein FRET" zu erreichen. Wenn ein hinreichender Abstand zwischen Donor- und Akzeptor-Fluorophoren oder, alternativ, zwischen einem Fluorophor oder einer anderen Markierung und einem Quencher hierfür auf diese Weise nicht erreicht wird, so beinhalten andere Kandidatenpositionen für eine Fluoreszenzproteinfusion, ohne hierauf beschränkt zu sein, den C-Terminus und die Region zwischen der SH2-Domäne und dem SH2-Kinase-Linker.
Beispiel 5 – Lösungs-FRET-Assay für Yersinia Tyrosin-Phosphatase (YOP) unter Verwendung eines natürlichen Bindungspartners, der mit einem Fluoreszenzprotein markiert ist, und eines synthetischen Peptids, das mit einem chemischen Fluorophor markiert ist
Eine FRET-Partnerschaft wird zwischen der SH2-Domäne von ZAP-70 und einem Peptid auf Basis der TCRζ-Kette ausgebildet, vorausgesetzt, beide Partner sind mit geeigneten Fluorophoren markiert, die binden, wenn sich das Peptid in einem phosphorylierten Zustand befindet. Die Entstehung von FRET wird in Echtzeit verfolgt, indem man lediglich die beiden Bindungspartner zusammengibt. Das Abbrechen von FRET kann erreicht werden durch Verwendung einer Phosphatase, die das für die Interaktion der Partner benötigte Phosphat entfernt.
Verfahren:
TCR-Pegtidsequenz

Peptid 1. Phosphorylierte TCRζ-Kette:
RCKFSRSAEPPAYQQGQNQLY_(p)NELNLGRREEY_(p)DVLD

Peptidmarkierung
Peptid 1 wird mit Rhodamin unter milden Bedingungen unter Verwendung Thiol-gesteuerter Chemie markiert. 230 μM Peptid werden in 20 mM TES-Puffer pH 7 in Gegenwart eines dreifachen Überschusses an Rhodamin-6-maleimid (Molecular Probes) markiert. Es wird Dialyse verwendet, um überschüssigen Farbstoff von dem Peptid zu entfernen. Die Markierung wird durch MALDI-TOF MS verifiziert.
ZAP-GFP-Klonierung und Reinigung
DNA-Konstrukte
ZAP-GFP: Es werden Primer auf Basis der veröffentlichten ZAP-70 DNA-Sequenz (Genbank-Zugangsnummer L05148) erstellt. Die SH2-Domäne (Aminosäuren 1-259) von ZAP70 wird mittels PCR unter Verwendung der folgenden Oligonukleotide kloniert:
GGGATCCATATGCCAGACCCCGCGGCGCACCTG
Vorwärts-Primer:
Rückwärts-Primer:
GGAATTCGGGCACTGCTGTTGGGGCAGGCCTCC
Das resultierende PCR-Fragment wird mit BamHI und EcoRI verdaut und in pET28a (Novagen) inseriert, um den Vektor pFS45 zu erzeugen. DNA, die für GFP im Vektor pQBI25-FNI (Quantum) codiert, wird mit MluI verdaut, und der resultierende 5'-Überhang wird unter Verwendung von T4-DNA-Polymerase (NEB) „aufgefüllt". Nachdem die Polymerase durch Hitzebehandlung denaturiert wurde, wird die DNA mit EcoRI weiter verdaut, und die resultierende 850 bp-Bande wird gelgereinigt. Der Vektor pFS45 wird mit HindIII verdaut, und der resultierende 5'-Überhang wird mit T4-DNA-Polymerase aufgefüllt und dann mit EcoRI weiter verdaut. Nachdem der verdaute Vektor gelgereinigt wurde, wird er mit der gereinigten, GFP-codierenden DNA ligiert, um pFS46 zu erzeugen, das dafür konzipiert ist, ein ZAP70-GFP-Fusionsprotein in Bakterien zu exprimieren.
Expressions- und Reinigungsprozedur
Frische Transformanten von ZAP-GFP pET-28a in BRL(DE3) werden verwendet, um 3 ml LB/Kanamycin (100 μg/ml) anzuimpfen. Die Starterkulturen werden über Nacht bei 37°C unter konstantem Schütteln induziert. Von diesen Starterkulturen wird 1 ml verwendet, um 400 ml Terrific Broth/Kanamycin (100 μg/ml) in einem 2I-Baffle-Kolben anzuimpfen. Die Kulturen werden für etwa 5 Stunden bei 37°C und 200 rpm inkubiert, bis die OD_600nm 0,5 abs. Einheiten erreicht. Zu diesem Zeitpunkt werden die Kulturen induziert, indem man IPTG bis zu einer Konzentration von 1 mM hinzu gibt. Man lässt die Kulturen dann bei Raumtemperatur über Nacht unter sanftem Schütteln auf einem Tischrotierer inkubieren.
Die Bakterien werden durch Zentrifugation bei 3000 rpm für 20 min geerntet. Das Bakterienpellet wird in 25 ml Lysepuffer (50 mM Phosphatpuffer pH 7,0, 300 mM NaCl, 2% Proteinaseinhibitor-Cocktail (Sigma), 0,75 mg/ml Lysozym) resuspendiert. Die Lyse der resuspendierten Zellen wird durch sanftes Rühren für 1 h bei Raumtemperatur gestartet. Das partiell lysierte Gemisch wird 2 Zyklen des Gefrierens/Auftauens in flüssigem Stickstoff unterzogen. Schließlich werden die Zellen auf Eis unter Verwendung einer 10 mm-Sonde bei hoher Energie mit Ultraschall behandelt. Die Ultraschallbehandlung erfolgt bei einer Pulseinstellung für eine Zeitspanne von 3 min. Das Rohlysat wird dann bei 15.000 rpm für 30 min zentrifugiert, um Zelltrümmer zu entfernen. Mit hexa-His-Tag versehene Proteine werden unter Verwendung von TALON^®-Harz (Clontech) aus dem klaren Lysat gereinigt. Die Proteine werden chargenweise durch sanftes Schütteln bei Raumtemperatur für 30 min an das Harz gebunden. Nicht mit His-Tag versehene Proteine werden durch mindestens zweifaches Waschen des Harzes mit 10 Bettvolumina an Waschpuffer (50 mM Natriumphosphat pH 7,0, 300 mM NaCl, 5 mM Fluoreszenz-Blindwert Imidazol) entfernt. Das gewaschene Harz wird auf eine 2 ml-Säule geladen, und die gebundenen Proteine werden mit dem Elutionspuffer (50 mM Natriumphosphat pH 7,0, 300 mM NaCl, 150 mM Fluoreszenz-Blindwert Imidazol) freigesetzt. Die Elution wird normalerweise nach den ersten 0,5 ml und innerhalb von 2-3 ml insgesamt erreicht. Die Proteine werden nach Schockgefrieren in flüssigem Stickstoff bei –80°C in Gegenwart von 10% Glycerol gelagert.
Ausbildung der FRET-Partnerschaft
ZAP-GFP wird in YOP-Assay-Puffer (50 mM, HCR Tris-HCl pH 7,2, 10 mM β-Mercaptoethanol, 0,5 mg/ml BSA, 0,015% Brij 35) auf 0,5 μM verdünnt. Es werden 98 μl dieser Lösung pro Assay verwendet. Anfängliche Ablesungen der Fluoreszenz des ZAP-GFP-Konstrukts erfolgen unter Verwendung einer Anregungswellenlänge von 485 nm und einer Emissionswellenlänge von 520 nm. Rhodamin-markiertes Peptid (2 μl einer 115 μM Peptidlösung) wird zu ZAP-GFP hinzugegeben, und die Ausbildung von FRET wird in Echtzeit verfolgt, indem man die Abnahme der Fluoreszenzemission von ZAP-GFP bei 520 nm misst.
YOP-Quelle und Assay-Bedingungen
Yersinia-Protein-Tyrosin-Phosphatase (YOP) wird von Upstate Biotechnology erworben. YOP, 0-12 Units, wird zu der ZAP-GFP/Peptid-FRET-Partnerschaft hinzugegeben, und die Zunahme der Fluoreszenzemission bei 520 nm wird in Echtzeit verfolgt, wenn die Partnerschaft aufgebrochen wird (1). Die Abhängigkeit der YOP-Aktivität von der TCR-Peptidkonzentration und die Km-Bestimmung können unter Verwendung verschiedener Konzentrationen von Rhodamin-markiertem TCRζ-Peptid und 3 Units an YOP gemessen werden (2).
Der Lösungs-FRET-Assay für YOP wird außerdem verwendet, um die IC₅₀ für ortho-Vanadat, einen allgemeinen Inhibitor der Protein-Phosphatase, zu bestimmen. Der YOP-Assay wird durchgeführt wie oben, wobei 3 Units an YOP verwendet werden und das Enzym mit der FRET-Partnerschaft bei 30°C inkubiert wird. Die Dephosphorylierung wird in Echtzeit verfolgt, indem man die Zunahme der Fluoreszenz bei 520 nm misst. Vor der Enzymzugabe wird Natrium-ortho-Vanadat bis auf Endkonzentrationen von 0,03-30 μM zu dem Reaktionsgemisch hinzugegeben. Die Ergebnisse zeigen eine IC₅₀ für Vanadat von 0,25 μM und sind in 3 dargestellt.
Beispiel 6 – Assay von Chk1-Kinase unter Verwendung eines Lösungsphase-FP-Assays mit einem Fluorescein-markierten, von CDC25 abgeleiteten Peptidsubstrat und 14-3-3ζ-Bindungspartner
Chk1-Proteinkinase modifiziert die Aktivität von CDC25-Phosphatase über Serin-Phosphorylierung. Die Phosphorylierung von CDC25 resultiert in der Bindung verschiedener Isoformen des 14-3-3-Proteins und einer nachfolgenden Inhibition der CDC25-Phosphatase-Aktivität. Ein aus CDC25 abgeleitetes Peptid („Chktid"), das mit einem chemischen Fluorophor markiert wird, bindet an die 14-3-3-Isoformen zeta und epsilon, wenn es durch Chk1-Kinase phosphoryliert wird. Die Aktivität von Chk1 wird überwacht, indem man die Änderung der Fluoreszenzpolarisation verfolgt, wenn mit Fluorescein markiertes Chktid an 14-3-3-Protein bindet.
Verfahren
Reagenzienquellen

14-3-3ζ-Protein, Chk1-Enzym und Chktid stammen von Upstate Biotechnology. Chktid, Chk1-Substrat-Peptid-Sequenz:
KVSRSGLYRSPS²¹⁶MPENLNRPR

Markierung von Chktid mit Fluorescein
Chktid wird durch 2-stündige Inkubation bei einer Konzentration von 0,185 mM in 100 mM NaHCO₃ pH 8,3 und 0,37 mM Fluorescein-5EX (Molecular Probes) bei Raumtemperatur markiert. Das markierte Peptid wird dann gegen drei Austauschmengen an 50 mM Tris-HCl pH 7,4, 150 mM NaCl (200 ml) für eine Gesamtzeit von 18 Stunden dialysiert.
Phosphorylierung von Chktid durch Chk1-Protein-Kinase
Ein Peptidsubstrat für Chk1 (Chktid) wird mit Fluorescein markiert. Die markierten Peptide werden dann phosphoryliert, indem man sie bei einer Konzentration von 30 μM für 30 min bei 30°C in 20 mM MOPS pH 7,2, 10 mM MgCl₂, 25 mM β-Glycerophosphat, 5 mM EGTA, 1 mM Natrium-ortho-Vanadat 1 mM DTT, 0,1 mM ATP und 62 mU Chk1 inkubiert. Nicht-phosphorylierte Kontrollproben werden durch Inkubation der markierten Peptide unter identischen Bedingungen in Abwesenheit von Chk1 hergestellt. Die Peptide werden dann bei einer Konzentration von 5 μM in 20 mM MOPS pH 7,2 bei 30°C in einem Gesamtvolumen von 30 μl auf einer Halbflächen-96-Well-Platte inkubiert. Die Fluoreszenzpolarisation der Proben wird bei 520 nm (Anregung 485 nm) nach einer Äquilibrierung von 5 min gemessen. 14-3-3ζ (5 μM) wird zu den Peptidproben hinzugegeben, und die Fluoreszenzpolarisation bei 520 nm (Anregung 485 nm) wird über die Zeit hin überwacht, wie in 4 dargestellt. Die Inhibition der Chk1-Aktivität durch EDTA wird gemessen, indem man der obigen Prozedur folgt und EDTA (10 mM oder 20 mM) vor der Enzymzugabe hinzu gibt, wie in 5 dargestellt.
Die Aktivität von Chk1 kann wie folgt in Echtzeit nachverfolgt werden. Mit Fluorescein markiertes Chktid wird bei 30°C in einem Gesamtvolumen von 30 μl (auf einer Halbflächen-96-Well-Platte) in 20 mM MOPS pH 7,2, 10 mM MgCl₂, 25 mM β-Glycerophosphat, 5 mM EGTA, 1 mM Natrium-ortho-Vanadat, 1 mM DTT und 0,1 mM ATP in Gegenwart von 5 μM 14-3-3ζ inkubiert. Man lässt die Proben für 5 min äquilibrieren, dann wird Chk1 hinzugegeben (oder ein gleiches Volumen an H₂O für Kontrollproben), und die Fluoreszenzpolarisation bei 520 nm (Anregung 485 nm) wird über den Zeitverlauf überwacht, wie in 6 dargestellt. Die Abhängigkeit des gesteigerten Fluoreszenzpolarisationssignals von der Chk1-Aktivität und der 14-3-3ζ-Bindung wird durch das Fehlen von Bindung gezeigt, wenn ATP oder 14-3-3ζ-Protein weggelassen werden, wie in 7 gezeigt. Die Inhibition der Chk1-Aktivität durch EDTA wird gemessen, indem man der obigen Prozedur folgt und EDTA (1 mM, 5 mM oder 20 mM) vor der Zugabe von 21 mU Chk1 zugibt, um die Reaktion zu starten, wie in 8 gezeigt. Die Fluoreszenzpolarisation für jede Probe wird am Ende des linearen Teils der Reaktion bestimmt.
Die Aktivität von Chk1 kann auch gemessen werden, indem man die Bindung von phosphoryliertem Chktid-Peptid an eine alternative Isoform des 14-3-3-Proteins, 14-3-3ε, überwacht.
Produktion von 14-3-3ε
Unter der Kontrolle des T7-Promotors enthält der Vektor FS121 DNA, die codierend ist für das 14-3-3ε (Genbank-Zugangsnummer U54778)-Protein im Leseraster mit DNA, die einen aminoterminalen hexa-His-Tag codiert. Frische Transformanten von pFS121 in BRL(DE3) pLysS werden verwendet, um 3 ml LB/Ampicillin (100 μg/ml) anzuimpfen. Die Starterkulturen werden über Nacht bei 37°C unter Schütteln inkubiert. Von diesen Starterkulturen wird 1 ml verwendet, um 400 ml Terrific Broth/Ampicillin (100 μg/ml) in einem 2I-Baffle-Kolben anzuimpfen. Die Kulturen werden bei 37°C und 200 rpm für etwa 4 Stunden inkubiert, bis die OD_600nm 0,5 abs. Einheiten erreicht hat. Zu diesem Zeitpunkt werden die Kulturen durch die Zugabe von IPTG bis auf eine Konzentration von 1 mM induziert und für 4 Stunden bei 37°C weiter inkubiert.
Die Bakterien werden durch Zentrifugation bei 3000 rpm für 20 min geerntet. Das Bakterienpellet wird in 25 ml Lysepuffer (50 mM Phosphat pH 7,0, 300 mM NaCl, 2% Proteinaseinhibitor-Cocktail (Sigma), 0,75 mg/ml Lysozym) resuspendiert. Die Lyse der resuspendierten Zellen wird durch sanftes Rühren für 30 min bei Raumtemperatur gestartet. Es wird Nonidet P-40 bis zu einer Endkonzentration von 1% hinzugegeben, und die Lyse wird für weitere 20 min bei Raumtemperatur fortgesetzt. Das partiell lysierte Gemisch wird drei Zyklen des Gefrierens/Auftauens in flüssigem Stickstoff unterzogen. Schließlich werden die Zellen auf Eis unter Verwendung einer 10 mm-Sonde bei hoher Energie mit Ultraschall behandelt. Die Ultraschallbehandlung wird bei einer Pulseinstellung für eine Zeitspanne von 4 min durchgeführt. Das Rohlysat wird bei 15.000 rpm für 30 min zentrifugiert, um Zelltrümmer zu entfernen. Mit hexa-His-Tag versehene Proteine werden aus dem geklärten Lysat unter Verwendung von TALON^®-Harz (Clontech) gereinigt. Die Proteine werden chargenweise durch sanftes Schütteln bei Raumtemperatur für 30 min an das Harz gebunden. Nicht mit His-Tag versehene Proteine werden entfernt, indem man das Harz mindestens zweimal mit 10 Bettvolumina an Waschpuffer (50 mM Natriumphosphat pH 7,0, 300 mM NaCl, 5 mM Fluoreszenz-Blindwert Imidazol) wäscht. Das gewaschene Harz wird auf eine 2 ml-Säule geladen, und die gebundenen Proteine werden mit Elutionspuffer (50 mM Natriumphosphat pH 7,0, 300 mM NaCl, 150 mM Fluoreszenz-Blindwert Imidazol) freigesetzt. Die Elution wird normalerweise innerhalb von 5 ml erreicht. Gereinigte Proteine werden bei –80°C in Gegenwart von 10% Glycerol gelagert, nachdem sie in flüssigem Stickstoff schockgefroren wurden.
Endpunkt-Assay der Chk1-Kinase durch die Bindung von 14-3-3ε an phosphoryliertes Chktid
Ein Peptidsubstrat für Chk1 (Chktid) wird mit Fluorescein markiert. Die markierten Peptide werden dann durch Inkubation bei einer Konzentration von 30 μM für 30 min bei 30°C in 100 μl an 20 mM MOPS pH 7,2, 10 mM MgCl₂, 25 mM β-Glycerophosphat, 5 mM EGTA, 1 mM Natrium-ortho-Vanadat, 1 mM DTT, 0,1 mM ATP und 62 mU Chk1 phosphoryliert. Nicht-phosphorylierte Kontrollproben werden durch Inkubation der markierten Peptide unter identischen Bedingungen in Abwesenheit von Chk1 hergestellt. Die Peptide werden dann bei einer Konzentration von 7,5 μM in 20 mM MOPS pH 7,2 bei 30°C in einem Gesamtvolumen von 30 μl auf einer Halbflächen-96-Well-Platte inkubiert. Die Fluoreszenzpolarisation der Proben wird bei 520 nm (Anregung 485 nm) nach 5-minütiger Äquilibrierung gemessen. 14-3-3ε (4 μl) wird zu den Peptidproben hinzugegeben, und die Fluoreszenzpolarisation bei 520 nm (Anregung 485 nm) wird über den Zeitverlauf überwacht, wie in 9 dargestellt.
Beispiel 7 – Lösungsphase-FP-Assay für die Detektion von Phosphatase λ unter Verwendung von mit Fluorescein markiertem, von CDC25 abgeleitetem Peptidsubstrat und 14-3-3ζ-Bindungspartner
Die Reagenzien wurden erhalten und hergestellt, wie in Beispiel 6 oben.
Mit Fluorescein markiertes Chktid wird phosphoryliert durch Inkubieren bei einer Konzentration von 30 μM für 30 min bei 30°C in 20 mM MOPS pH 7,2, 10 mM MgCl₂, 25 mM β-Glycerophosphat, 5 mM EGTA, 1 mM Natrium-ortho-Vanadat, 1 mM DTT, 0,1 mM ATP und 62 mU Chk1. Nicht-phosphorylierte Kontrollproben werden durch Inkubieren der markierten Peptide unter identischen Bedingungen in Abwesenheit von Chk1 hergestellt. Die Peptide werden dann bei einer Konzentration von 7,5 μM in 20 mM MOPS pH 7,2, 2 mM MnCl₂, 1 mM DTT bei 30°C in einem Gesamtvolumen von 30 μl auf einer Halbflächen-96-Well-Platte inkubiert. Die Fluoreszenzpolarisation der Proben wird bei 520 nm (Anregung 485 nm) nach 5 min Äquilibrierung gemessen. 14-3-3ζ (5 μM) wird zu den Peptidproben hinzugegeben, und die Fluoreszenzpolarisation bei 520 nm (Anregung 485 nm) wird über den Zeitverlauf überwacht, wie in 10 gezeigt. Alternativ wird 14-3-3ε (4 μl des gereinigten Proteins, hergestellt wie in Beispiel 2) zu den Peptidproben hinzugegeben, und, nachdem sich die Fluoreszenzpolarisation stabilisiert hat, wird Phosphatase λ (200 U) hinzugegeben. Die Fluoreszenzpolarisation bei 520 nm (Anregung 485 nm) wird über den Zeitverlauf überwacht, wie in 11 dargestellt.
Beispiel 8 – FRET-Assay von Src unter Verwendung von ZAP70-GFP-Bindungspartner und synthetischem, mit Rhodamin markiertem TCRζ-Substrat
Eine FRET-Partnerschaft kann zwischen der SH2-Domäne von ZAP-70 und einem Peptid ausgebildet werden, das auf der TCRζ-Kette basiert, vorausgesetzt beide Bindungspartner sind mit geeigneten Fluorophoren markiert, die in einer Phosphorylierungs-abhängigen Weise binden werden. Src wird verwendet, um das von der TCRζ-Kette abgeleitete Substrat zu phosphorylieren.
Methoden:
TCR-Peptidsequenz

Peptid 1: Phosphorylierte TCRζ-Kette
RCKFSRSAEPPAYQQGQNQLY(p)NELNLGRREEY(p)DVL
Peptid 2: Unphosphorylierte TCRζ-Kette
RCKFSRSAEPPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLD

Peptidmarkierung
Die Peptide 1 & 2 werden unter milden Bedingungen unter Verwendung Thiol-gesteuerter Chemie mit Rhodamin markiert. Es werden 230 μM Peptid in 20 mM TES pH 7 in Gegenwart eines dreifachen Überschusses an Rhodamin-6-maleimid (Molecular Probes) markiert. Es wird Dialyse verwendet, um überschüssigen Farbstoff von dem Peptid zu entfernen. Die Markierung wird mittels MALDI-TOF MS verifiziert.
ZAP-GFP-Klonierung und Reinigung
Wie in Beispiel 5.
Phosphorylierung von Peptid 2
Das mit Rhodamin markierte Peptid 2 wird unter Verwendung von 3 Units an Src-Kinase (Upstate Biotechnology) in einer 40 μl-Reaktion mit 115 μM Peptid, 50 mM Tris-HCl pH 7,2, 1 mM ATP, 10 mM MgCl₂, 10 mM β-Mercaptoethanol, 0,1 mg/ml BSA und 0,015% (v/v) Brij 35 über eine Zeitspanne von 2 Stunden bei 37°C phosphoryliert. Nicht-phosphorylierte Kontrollproben werden unter identischen Bedingungen in Abwesenheit der Kinase hergestellt.
Ausbildung der FRET-Partnerschaft
ZAP-GFP wird in Assay-Puffer (50 mM Tris-HCl pH 7,2, 10 mM β-Mercaptoethanol, 0,5 mg/ml BSA, 0,015% Brij 35) auf 0,5 μM verdünnt. Es werden 98 μl dieser Lösung pro Assay verwendet. Anfängliche Ablesungen der Fluoreszenz des ZAP-GFP-Konstrukts erfolgen unter Verwendung von 485 nm Anregungswellenlänge und 520 nm Emissionswellenlänge. Mit Rhodamin markiertes Peptid (2 μl der obigen Phosphorylierungsreaktionen) wird zu der ZAP-GFP-Lösung hinzugegeben und die Ausbildung von FRET wird in Echtzeit verfolgt, indem man die Abnahme der Fluoreszenzemission von ZAP-GFP bei 520 nm misst, wie in 12 gezeigt.
Beispiel 9 – Lösungsphase-FRET-Assay der Src-Kinase-Aktivität unter Verwendung eines natürlichen Bindungspartners, mit einem Fluoreszenzprotein markiertem SHP-2
Die Interaktion zwischen der Tandem-SH2-Domäne von SHP2 und einem synthetischen Peptid auf Basis von SHPS-1 wird über den Phosphorylierungszustand des Peptids vermittelt. Es kann eine FRET-Partnerschaft zwischen dem phosphorylierten Peptid und der SH2-Domäne etabliert werden, vorausgesetzt beide Partner sind mit geeigneten Fluorophoren markiert, die bei der Interaktion der Bindungspartner in enge Nähe gebracht werden.
Verfahren:
SHP2-Peptidsequenz und Fluoreszenzmarkierung

SHPS-1-Peptidsequenz:
BiotinKQDTNDITYADLNLOKGKKPAPQAAEPNNHTEYASIQTSC

Das SHPS-1 wird unter Verwendung Thiol-gesteuerter Chemie markiert. Es werden 200 μM Peptid mit 600 μM Rhodamin-6-maleimid (Molecular Probes) in 20 mM TES pH 7 über wenigstens 2 Stunden bei Raumtemperatur umgesetzt. Überschüssige Markierung wird unter Verwendung von Dialyse entfernt, und die Markierung wird mittels MALDI-TOF MS verifiziert.
SHP2-GFP-Klonierung und Reinigung
Die Primer basieren auf der veröffentlichten SHP-2-DNA-Sequenz (Genbank-Zugangsnummer L03535). Die SH2-Domäne (Aminosäuren 1-225) von SHP-2 wird mittels PCR kloniert, wofür die folgenden Oligonukleotide verwendet werden:
5'-Primer:
GGGGATCCTCTAGAATGACATCGCGGAGATGGTTTCACCC
3'-Primer:
GGGGAATTCTTTCAGCAGCATTTATACGAGTCG
Das resultierende PCR-Fragment wird mit XbaI und EcoRI verdaut, gelgereinigt und in pET28a (Novagen) ligiert, um den Vektor pFS114 zu erzeugen. Die Korrektheit des Konstrukts wird mittels Sequenzanalyse bestätigt. DNA, die für GFP im Vektor pFS46 codiert, wird durch Verdau mit den Restriktionsenzymen EcoRI und XhoI isoliert, und die resultierende 860 bp-Bande wird mittels Gel gereinigt und in pFS114 ligiert, um einen bakteriellen Expressionsvektor für die Produktion des Fusionsproteins SHP2-GFP zu erzeugen (pFS115).
Das mit hexa-His-Tag versehene SHP2-GFP-Fusionsprotein wird exprimiert und unter Verwendung von TALON^®-Harz gemäß Standardprozeduren gereinigt.
Phosphorylierung des SHPS-1-Peptids
SHPS-1-Peptid, das mit Rhodamin markiert ist, wird unter Verwendung von 3 Units Src-Kinase (Upstate Biotechnology) in einer 40 μl-Reaktion mit 100 μM Peptid, 50 mM Tris-HCl pH 7,2, 1 mM ATP, 10 mM MgCl₂, 10 mM β-Mercaptoethanol, 0,1 mg/ml BSA und 0,015% (v/v) Brij 35 über eine Zeitspanne von 2 Stunden bei 37°C phosphoryliert. Es werden nicht-phosphorylierte Kontrollproben unter identischen Bedingungen in Abwesenheit der Kinase hergestellt.
Ausbildung der FRET-Partnerschaft
SHP2-GFP wird in Assay-Puffer (50 mM Tris-HCl pH 7,2, 10 mM β-Mercaptoethanol, 0,5 mg/ml BSA, 0,015% Brij 35) auf 0,5 μM verdünnt. 98 μl dieser Lösung werden pro Assay verwendet. Die anfänglichen Ablesungen der Fluoreszenz des SHP2-GFP-Konstrukts erfolgen unter Verwendung einer Anregungswellenlänge von 485 nm und einer Emissionswellenlänge von 520 nm. Mit Rhodamin markiertes Peptid (2 μl der obigen Phosphorylierungsreaktionen) wird zu der SHP2-GFP-Lösung hinzugegeben, und die Ausbildung von FRET wird in Echtzeit verfolgt, indem man die Abnahme der Fluoreszenzemission von SHP2-GFP bei 520 nm misst, wie in 13 gezeigt.
Aufbrechen der FRET-Partnerschaft
Die im obigen Abschnitt beschriebene FRET-Partnerschaft wird unter Verwendung des Tyrosin-Phosphatase-Enzyms YOP (Upstate Biotechnology) leicht aufgebrochen. Die FRET-Partnerschaft wird ausgebildet wie im obigen Beispiel, wobei 4 μl des phosphorylierten oder des als Kontrolle dienenden nicht-phosphorylierten SHPS-1-Peptids verwendet werden. Die Zugabe von 3 Units YOP zu der FRET-Partnerschaft resultiert in deren Zerstörung, da die für die Ausbildung der Partnerschaft benötigten Phosphate entfernt werden, wie in 14 gezeigt.
Inhibition durch Staurosporin
Die Phosphorylierung des Peptids wird verhindert, indem man das Enzym, Src, mit dem starken Kinaseinhibitor Staurosporin inhibiert. Die Phosphorylierung des mit Rhodamin markierten SHPS-1-Peptids wird durchgeführt, wie oben beschrieben, in Gegenwart und Abwesenheit von 10 μM Staurosporin, das der Reaktion vor dem Src-Enzym zugegeben wird. Die in Gegenwart des Inhibitors ausgeführten Reaktionen bilden keine FRET-Partnerschaft aus, wie in 15 gezeigt.
Assay der Src-Phosghorylierung von SHPS-1-Peptid in Echtzeit
Die Phosphorylierung des mit Rhodamin markierten SHPS-1-Peptids und die Ausbildung der FRET-Partnerschaft mit SHP2-GFP kann in Echtzeit verfolgt werden, indem man die Abnahme der Fluoreszenzemission bei 520 nm misst. Reaktionen, die 0,5 μM SHP2-GFP, 50 mM Tris-HCl pH 7,2, 1 mM ATP, 10 mM MgCl₂, 10 mM β-Mercaptoethanol, 0,5 mg/ml BSA, 0,015% Brij 35 und 40 μM Peptid enthalten, werden in einer schwarzen Mikrotiterplatte angesetzt. Es wird eine anfängliche Gleichgewichtsmessung durchgeführt, bevor 6 Units an Src-Kinase oder Puffer bei den Kontroll-Wells hinzu gegeben werden. Die Abnahme der Fluoreszenzemission bei 520 nm wird in Echtzeit bei 37°C verfolgt, wie in 16 dargestellt.
VERWENDUNGEN
Die Erfindung ist nützlich bei der Überwachung der Aktivität eines Protein-modifizierenden Enzyms, egal, ob das Protein isoliert, partiell gereinigt, in einer Rohpräparation oder in einer lebenden Zelle vorliegt. Die Erfindung ist weiterhin nützlich beim Untersuchen einer Zelle oder eines Zellextrakts auf Vorhandensein oder Ausmaß der Aktivität eines Protein-modifizierenden Enzyms. Die Erfindung ist zusätzlich nützlich beim Untersuchen der Aktivität natürlich vorkommender (mutanter) oder nicht-natürlicher (künstlich hergestellter) Isoformen bekannter Protein-modifizierender Enzyme, oder, stattdessen, der von neuen (natürlichen oder nicht-natürlichen) Enzymen. Die Erfindung ist von Nutzen bei der Untersuchung der Wirksamkeit von Kandidatenmodulatoren der Aktivität eines Protein-modifizierenden Enzyms beim Inhibieren oder Verstärken der Aktivität dieses Enzyms; darüber hinaus ist sie nützlich, um potentielle therapeutische Wirkstoffe auf ihre Aktivität gegenüber klonierten und/oder gereinigten Enzymen hin durchzutesten, die, wenn sie mutiert sind, wichtige klinische Pathogenitäten besitzen können. Die Erfindung ist weiterhin von Nutzen beim Durchtesten von bioaktiven Kandidatenmitteln (z.B. Arzneistoffen) auf Nebenwirkungen, wobei die Fähigkeit eines solchen Mittels, die Aktivität eines Protein-modifizierenden Enzyms zu modulieren, eine Neigung anzeigen kann, bei einer Therapie oder einem anderen Anwendungsschema, in der/dem das Mittel verwendet werden kann, unerwünschte Nebenwirkungen hervorzurufen.

Claims

Verfahren zum Überwachen der Aktivität eines Enzyms, welches umfaßt, dass man eine Detektionsstufe durchführt zum Feststellen einer Bindung einer natürlichen Bindungsdomäne und eines Bindungspartners dafür als eine Folge des Inkontaktbringens von einem oder beiden der natürlichen Bindungsdomäne und des Bindungspartners mit dem Enzym, wobei die natürliche Bindungsdomäne eine Stelle für posttranslationale Modifikation enthält und den Bindungspartner in einer Art und Weise bindet, die von einer Modifikation der Stelle abhängig ist, und wobei eine Detektion von Bindung der natürlichen Bindungsdomäne und des Bindungspartners als eine Folge des Inkontaktbringens ein Hinweis für Enzymaktivität ist, wobei wenigstens eines der natürlichen Bindungsdomäne und des Bindungspartners mit einer Fluoreszenzmarkierung markiert ist.
Verfahren zur Überwachung von Aktivität eines Enzyms, welches umfaßt, dass man eine Detektionsstufe durchführt zum Feststellen von Dissoziation einer natürlichen Bindungsdomäne von einem Bindungspartner dafür als eine Folge des Inkontaktbringens von einem oder beiden der natürlichen Bindungsdomäne und des Bindungspartners mit dem Enzym, wobei die natürliche Bindungsdomäne eine Stelle für posttranslationale Modifikation umfaßt und den Bindungspartner in einer Art und Weise bindet, die von einer Modifikation der Stelle abhängig ist, und wobei eine Detektion von Dissoziation der natürlichen Bindungsdomäne von dem Bindungspartner als eine Folge des Inkontaktbringens ein Hinweis auf Enzymaktivität ist, wobei wenigstens eines von der natürlichen Bindungsdomäne und dem Bindungspartner mit einer Fluoreszenzmarkierung markiert ist.
Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, wobei das Enzym eines der folgenden Enzyme ist: eine Carbohydrattransferase, ein Ubiquitin aktivierendes Enzym E1, ein Ubiquitin konjugierendes Enzym E2, ein Ubiquitin konjugierendes Enzym Ubc9, eine Ubiquitin-Proteinligase E3, eine Poly-(ADP-Ribose)-Polymerase, eine Fettacyltransferase, eine Kinase, eine Phosphatase und eine NAD:Arginin-ADP-Ribosyltransferase.
Verfahren nach Anspruch 1, 2 oder 3, welches weiterhin vor oder nach der Detektionsstufe die Stufe umfaßt, bei der man die natürliche Bindungsdomäne und den Bindungspartner mit einem Mittel in Kontakt bringt, welches die Aktivität des Enzyms moduliert.
Verfahren zur Durchmusterung eines Kandidaten für einen Modulator von enzymatischer Aktivität für eines oder mehrere der folgenden Enzyme: eine Carbohydrattransferase, ein Ubiquitin aktivierendes Enzym E1, ein Ubiquitin konjugierendes Enzym E2, ein Ubiquitin konjugierendes Enzym Ubc9, eine Ubiquitin-Proteinligase E3, eine Poly-(ADP-Ribose)-Polymerase, eine Fettacyltransferase und eine NAD:Arginin-ADP-Ribosyltransferase, eine Kinase oder eine Phosphatase, wobei das Verfahren folgendes umfaßt (a) Inkontaktbringen einer natürlichen Bindungsdomäne, eines Bindungspartners dafür und eines Enzyms mit einem Kandidaten für einen Modulator des Enzyms, wobei die natürliche Bindungsdomäne eine Stelle für posttranslationale Modifikation umfaßt und den Bindungspartner in einer Art und Weise bindet, die von einer Modifikation der Stelle durch das Enzym abhängig ist, und wobei wenigstens eines der natürlichen Bindungsdomäne und des Bindungspartners eine Fluoreszenzmarkierung enthält, und (b) Überwachen der Bindung der natürlichen Bindungsdomäne an den Bindungspartner, wobei eine Bindung oder Dissoziation der natürlichen Bindungsdomäne und des Bindungspartners als eine Folge des Inkontaktbringens ein Hinweis für eine Modulation von enzymatischer Aktivität durch den Kandidaten für einen Modulator des Enzyms ist.
Verfahren zur Durchmusterung eines Kandidaten für einen Modulator von enzymatischer Aktivität für eines oder mehrere der folgenden Enzyme: eine Carbohydrattransferase, ein Ubiquitin aktivierendes Enzym E1, ein Ubiquitin konjugierendes Enzym E2, ein Ubiquitin konjugierendes Enzym Ubc9, eine Ubiquitin-Proteinligase E3, eine Poly-(ADP-Ribose)-Polymerase, eine Fettacyltransferase und eine NAD:Arginin-ADP-Ribosyltransferase, eine Kinase oder eine Phosphatase, wobei das Verfahren folgendes umfaßt (a) Inkontaktbringen eines Testsystems mit einem Kandidaten für einen Modulator von enzymatischer Aktivität des Enzyms und (b) Überwachen von Bindung einer natürlichen Bindungsdomäne und eines Bindungspartners dafür in dem Testsystem, wobei die natürliche Bindungsdomäne eine Stelle für posttranslationale Modifikation umfaßt und den Bindungspartner in einer Art und Weise bindet, die von einer Modifikation der Stelle durch wenigstens ein Enzym in dem Testsystem abhängig ist, wobei wenigstens eines der natürlichen Bindungsdomäne und des Bindungspartners eine Fluoreszenzmarkierung enthält und wobei eine Bindung oder Dissoziation der natürlichen Bindungsdomäne und des Bindungspartners als eine Folge des Inkontaktbringens ein Hinweis auf eine Modulation von enzymatischer Aktivität durch den Kandidaten für einen Modulator des Enzyms ist.
Verfahren nach einem der vorangegangenen Ansprüche, wobei das Verfahren weiterhin das Anregen der oder jeder Fluoreszenzmarkierung und das Überwachen von Fluoreszenzemission umfaßt.
Verfahren nach einem der vorangegangenen Ansprüche, wobei die Detektionsstufe eine Veränderung in der Signalemission durch die oder jede Fluoreszenzmarkierung feststellt.
Verfahren nach einem der vorangegangenen Ansprüche, wobei das Verfahren eine Echtzeitbeobachtung von einer Assoziation der natürlichen Bindungsdomäne und deren Bindungspartner umfaßt.
Verfahren nach einem der vorangegangenen Ansprüche, wobei die Überwachung oder die Detektionsstufe das Messen einer Veränderung in der Energieübertragung zwischen einer Fluoreszenzmarkierung, die an der natürlichen Bindungsdomäne vorhanden ist, und einer Fluoreszenzmarkierung, die an dem Bindungspartner vorhanden ist, umfaßt.