KR20060015290A - 단백질-인산화 효소의 활성을 측정하기 위한바이오티닐화된 폴리펩타이드의 용도 - Google Patents

Abstract

본 발명은 폴리펩타이드의 인산화 상태를 조절하기 위한 효소, 이의 기능적 단편 또는 유도체의 능력을 측정하기 위한 폴리펩타이드의 용도에 관한 것으로서, 본 발명은 당해 폴리펩타이드가 바이오티닐화됨을 특징으로 한다.

인산화 상태, 바이오티닐화, 인슐린 수용체 기질, 티로신 키나제

Description

단백질-인산화 효소의 활성을 측정하기 위한 바이오티닐화된 폴리펩타이드의 용도{Use of a biotinylated polypeptide for determining the activity of protein-phosphorylating enzymes}

본 발명은 폴리펩타이드의 인산화 상태를 조절하는 효소의 능력을 측정하기 위한 폴리펩타이드의 용도에 관한 것이다. 본 발명의 추가 양상은 이러한 활성을 측정하는 방법 및 이러한 효소의 활성을 조절하는 물질을 확인하는 방법에 관한 것이다.

인슐린은 인슐린 수용체에 결합하여 이의 고유한 티로신 키나제를 활성화시킴으로써 다수의 성장 및 대사 경로에 영향을 미치는 펩타이드 호르몬이다. 이러한 사건은 특정 티로신 잔기에 대한, 인슐린 수용체(IR)에 결합할 수 있는 다수의 단백질의 인산화를 유도한다. 인슐린 수용체 기질(IRS) 단백질의 계열도 이러한 방식으로 인산화되는 단백질에 속한다.

인슐린 수용체 기질 1(IRS-1)은 티로신 및/또는 세린 잔기 및/또는 트레오닌 잔기가 다수의 단백질 키나제(트레오닌-특이적 또는 세린/트레오닌-특이적 단백질 키나제)에 의해 인산화될 수 있는 세포성 단백질이다. 이와 관련하여, 세포에 따라서 상이한 티로신 또는 세린/트레오닌 잔기의 특이적 인산화가 있는 것으로 예상된다. 예를 들어, 인슐린 수용체[참조: White 2002], IGF-1 수용체[참조: White 2002] 또는 JAK 1/2[참조: Thirone et al. 1999]와 같은 티로신 키나제의 인산화 이외에, IRS-1은 세린/트레오닌 키나제, 예를 들어, PKC 계열의 키나제[참조: Schmitz-Peiffer 2002], 억제제 카파 B 키나제 복합체[참조: Gao etal. 2002], c-Jun NH(2)-말단 키나제(JNK, 참조: Aguirre et al. 2000), 단백질 키나제 A[참조: Sun et al. 1991], 유사분열원-활성화된 단백질 키나제[참조: Mothe et al. 1996], 단백질 키나제 B[참조; Paz et al.1999], 카제인 키나제[참조: Tanasijevic et al. 1993], 글리코겐 신타제 키나제 베타[참조: Eldar-Finkelmann et al. 1997], AMP-활성화된 키나제[참조: Jakobsen et al. 2001] 또는 포스포이노시톨 3 키나제[참조: Freund et al. 1995]에 의해서도 인산화되는 것으로 공지되어 있다. IRS 분자는 인슐린 시그날 전달 경로에서 주요 분자로서, 성장, 생존 및 대사와 같은 세포 기능의 유지에서 중심적 역할을 한다. 이와 관련하여, 인산화된 IRS 단백질은 인슐린 수용체에 대한 다수의 도킹(docking) 부위, 및 세포내 시그날 분자와 소위 시그날 인식 복합체(SRC) 상동성 2 도메인(SH2 도메인)와의 복합적 네트워크를 갖는 "도킹" 단백질로서 작용한다. 또한, 이들 Sh2 도메인 단백질의 활성화는 특정한 시그날 캐스케이드를 활성화시키고, 이는 이어서 시그날 캐스케이드의 보다 하류에 위치하는 다양한 이펙터의 활성화를 유도하여, 결국에는 인슐린 시그날을 분기된 일련의 다른 세포내 시그날 캐스케이드로 전달한다[검토를 위해, 참조: White 2002].

IRS는 크기가 160 내지 185kDa이고 인슐린 수용체의 기질로서 작용하는 인단백질 그룹에 속한다. IRS 계열의 네가지 구성원(IRS-1, IRS-2, IRS-3 및 IRS-4)이 공지되어 있다. 이들은 조직 분포, 아세포 국재화, 발달-특이적 발현, 인슐린 수용체에 결합하는 성질 및 이들이 상호작용하는 SH2 단백질의 성질이 서로 다르다. IRS 계열의 네가지 구성원은 이들의 기본적 단백질 구조 측면에서 매우 유사한 구조를 갖고 있는데, 즉 모두, 막 인지질에 결합하는 아미노 (N)-말단 플렉스트린 상동성 도메인(PH 도메인)과, PH 도메인의 카복시(C) 말단에 직접 연결되어 있으며 인슐린 수용체 베타 서브유닛의 막주변 영역에 위치하는 Asp-Pro-Glu 포스포티로신(NPEpY) 서열의 인식에 관여하는 포스포티로신-결합 도메인 도메인(PTB 도메인)을 갖고 있다. 또한, 이들은 특이적 SH2 도메인-함유 단백질이 결합할 수 있는 다양한 잠재적 티로신 인산화 모티프를 갖는 다소 덜 강하게 보존된 C-말단 부분을 갖고 있다.

IRS-1은 21개의 가능한 티로신 인산화 부위를 포함하며, 이들 부위 중 일부는 SH2 도메인 단백질에 결합할 수 있는 아미노산 서열 모티프에 위치한다. IRS-1은 다양한 키나제, 예를 들어, PKC 계열의 키나제[참조: Schmitz-Peiffer 2002], 억제제 카파 B 키나제 복합체[참조: Gao et al. 2002], c-Jun NH(2)-말단 키나제[JNK, 참조: Aguirre et al. 2000], 단백질 키나제 A[참조: Sun et al. 1991], 유사분열원-활성화된 단백질 키나제[참조: Mothe et al. 1996], 단백질 키나제 B[참조; Paz et al.1999], 카제인 키나제[참조: Tanasijevic et al. 1993], 글리코겐 신타제 키나제 베타[참조: Eldar-Finkelmann et al. 1997], AMP-활성화된 키나제[참조: Jakobsen et al. 2001] 또는 포스포이노시톨 3 키나제[PI3 키나제, 참조: Freund et al. 1995]에 의해 인식될 수 있는, 모티프내의 30개의 잠재적 세린/트레 오닌 인산화 부위를 추가로 포함한다. 인슐린 수용체 시그날 경로에 대한 억제 효과는 최근에 발견된 IRS-1의 세린/트레오닌 인산화의 역할에 의해 적어도 부분적으로 설명될 수 있으며, 이러한 역할은 인슐린 수용체와의 상호작용의 손상 및/또는 IRS-1의 티로신 인산화의 감소 및/또는 티로신-인산화된 IRS-1에 결합할 수 있는 후속적 시그날 단백질과의 상호작용의 손상과 연관되는 것으로 사료된다[검토를 위해, 참조: White 2002]. 현재까지, 다양한 키나제, 예를 들어, PKC 계열의 키나제[참조: Schmitz-Peiffer 2002], 억제제 카파 B 키나제 복합체[참조: Gao etal. 2002], c-Jun NH(2)-말단 키나제(JNK, 참조: Aguirre et al. 2000), 단백질 키나제 A[참조: Sun et al. 1991], 유사분열원-활성화된 단백질 키나제[참조: Mothe et al. 1996], 단백질 키나제 B[참조; Paz et al.1999], 카제인 키나제[참조: Tanasijevic et al. 1993], 글리코겐 신타제 키나제 베타[참조: Eldar-Finkelmann et al. 1997] 또는 포스포이노시톨 3 키나제[참조: Freund et al. 1995]가 시험관내에서 IRS-1을 직접 인산화시킨다는 것을 입증할 수 있었다. 게다가, 모든 경우에 온전한 세포에서의 증가된 키나제 활성은 인슐린 시그날 전달 경로의 활성을 억제하였다. 또한, 시험관내에서 세린/트레오닌 잔기상의 IRS-1의 인산화는 일부 연구에서 인슐린 수용체에 의한 티로신 인산화의 감소와 직접적으로 연관되는 것으로 사료되었다[참조: Le Marchand-Brustel 1999]. IRS-1, 2, 3 및 4의 서열은 공개적으로 입수할 수 있다. 이들 유전자의 암호화 폴리뉴클레오타이드 서열 및 관련 단백질 서열은 NCBI 뉴클레오타이드 데이타베이스로부터 번호 NM_005544(IRS-1 hs), XM:007095(IRS-2 hs), NM:032074(IRS-3 랫트), NM:003604(IRS-4 hs)하에 접근할 수 있다. NCBI는 국립생물정보 센터(National Center for Biotechnology Information, 우편 주소: National Center for Biotechnology Information, National Library of Medicine, Building 38A, Bethesda, MD 20894, USA; 웹 주소: www.ncbi.nhm.nih.gov)이다. IRS-1 유전자의 클로닝은 특히 문헌[참조: Araki et al. 1993] 및 문헌[참조: Siemeister et. al, 1996]에서 기술되었으며, IRS-2 내지 IRS-4의 클로닝은 문헌[참조: Araki et al 1994, Lavan et al. 1997a] 및 문헌[참조: Lavan et al. 1997b]에 기술되었다.

IRS-1을 인산화시키는 다양한 키나제의 능력을 측정하고 이들의 활성을 측정하기 위한 각종 종래 기술 방법이 공지되어 있으며, 이 방법들은 방사성 검출 방법(예를 들어, 방사선 표지된 포스페이트의 기질로의 전달) 또는 비방사성 검출 방법에 근거한다. 따라서, 방사성 표지된 ATP 및 시험될 키나제와 항온처리함으로써 방사성 포스페이트 잔기를 IRS-1로 전달하는 방법에 의해서, 여전히 하나 이상의 인산화 부위를 갖는 전체길이 IRS-1 단백질, 이의 단편 또는 펩타이드의 인산화를 IRS-1을 인산화시키는 키나제의 능력의 함수로서 측정하는 것은 공지되어 있다. 이어서, IRS-1의 크로마토그래피 또는 전기영동 분획화를 수행하고 유동 신틸레이션(flow scintillation) 또는 자가방사선술에 의해 전달된 포스페이트의 양을 검출한다(예를 들어, 완전한 IRS-1 단백질 및 글리코겐 신타제 키나제 3 베타에 대해서는 문헌[참조: Eldar-Finkelman et al. 1997]에, IRS-1의 단편(아미노산 516번 내지 777번) 및 인슐린 수용체, IGF-1 수용체 또는 재조합 인슐린 수용체 키나제에 대해서는 문헌[참조: Siemeister et al. 1995]에, 또는 IRS-1 펩타이드(아미노산 601번 내지 616번)와 활성화된 PKC 계열의 단백질 키나제를 함유하는 세포 용해물에 대해서는 문헌[참조: De Fea et al. 1997]에 기술된 바와 같다). 또한, 문헌[참조: Siemeister et al. 1995]로부터 IRS-1 단편, 예를 들어, IRS-1의 단편(아미노산 516번 내지 777번) 및 인슐린 수용체, IGF-1 수용체 또는 재조합 인슐린 수용체 키나제를 인산화시키는 능력을, 방사성 표지된 ATP와 항온처리하고, 기질을 양으로 하전된 막(니트로셀룰로즈 또는 유사 물질)에 적가하고, 세척하고, 결합된 방사성 표지된 기질을 자가방사선술 또는 방사성 방출의 측정에 의해 검출함으로써 측정하는 것이 기술되어 있다.

바이오티닐화된 IRS-1 펩타이드(아미노산 601번 내지 616번)와 방사성 표지된 ATP를 항온처리하고, 기질을 스트렙타비딘-피복된 막에 적가하고, 세척하고, 결합된 방사성 표지된 기질을 자가방사선술 또는 방사성 방출의 측정에 의해 검출하는 것은 IRS-1을 인산화시키는 키나제의 능력을 측정하는 또 다른 방법이다[참조: De Fea et al. 1997].

상기한 방사성 분석 방법의 단점은 명백한데, 그 이유는 방사성의 취급이 상당히 위험하고, 매우 값비싸므로 특히 고처리량 방법(HTS 방법)에 대한 적합성이 낮기 때문이다. 소형 펩타이드의 사용에 기초하는 상기한 방법의 단점은 이들 펩타이드가 불리한 반응속도 상수(Vmax, Km)를 가지며 게다가 펩타이드의 3차원 구조가 생리학적 효소 기질의 3차원 구조와 크게 다르다는 것이다. 한편으로, 이는 효소-기질 상호작용의 특이성을 결정하는 특정한 생물학적 공간이 존재하지 않않을 정도로 완전히 상이한 폴딩에 의해 나타나는데, 이로 인해 인식의 결여(및 이로 인 한 변형) 또는 비특이적 인식(및 이로 인한 변형)이 야기되고 결국에는 부정확한 결과가 초래된다. 또한, 펩타이드의 소형화는 이 펩타이드가 오직 1개 또는 소수개의 인산화 부위를 가져서, 상이한 효소에 의한 특정 기질의 인산화 변형을 조사하기 위해서는 다양한 펩타이드들이 필요함을 의미한다. 이는 또한 비용을 증가시키고 HTS 포맷의 방법을 오직 조건부적으로만 적용하게 한다.

따라서, 본 발명의 목적은 상기한 단점이 없는, 단백질-인산화 및/또는 탈인산화 효소의 활성을 측정하는 가능한 방법을 제공하는 것이다.

당해 목적은 바이오티닐화된 폴리펩타이드(펩타이드에 대한 Def GG)를 사용하여 당해 펩타이드의 인산화 상태를 조절하는 효소, 이의 기능적 단편 또는 유도체의 능력을 측정함으로써 달성된다.

본 발명은, 놀랍게도, 폴리펩타이드 또는 전체길이 단백질을 사용하더라도, 스트렙타비딘에 의한 바이오틴 결합의 입체 장애가 없었고 바이오티닐화가 조사한 기질의 키나제에 의한 인산화를 간섭하지 않았음을 보여준 본 발명자들의 결과에 기초한다. 폴리펩타이드란 용어는 본 발명의 목적상 펩타이드 결합에 의해 연결된 아미노산을 포함하고 이러한 방식으로 선형으로 연결된 50개 이상의 아미노산을 갖는 분자를 의미한다. 상기 유형의 보다 짧은 분자는 펩타이드로 지칭된다. 단백질이란 용어는 하나 이상의 폴리펩타이드 쇄를 포함하지만 함께 부착되었거나 연결된 다수의 폴리펩타이드 쇄로 이루어질 수도 있는 분자를 의미한다. 따라서, 단백질이란 용어에는 폴리펩타이드란 용어가 포함된다.

본 발명의 다양한 양상의 바람직한 양태에서, 폴리펩타이드는 길이가 50개 이상, 바람직하게는 50 내지 300개의 아미노산이다. 본 발명의 다양한 양상의 추가의 바람직한 양태에서, 폴리펩타이드는 크기가 1kDa 이상, 바람직하게는 1 내지 100kDa, 특히 바람직하게는 10 내지 50kDa이다.

효소의 기질은 본원에서 효소에 의한 변형에 적합한 모든 분자를 의미한다. 천연 기질은 본 발명의 목적상 생리학적 또는 병리학적 환경에서 자연적으로 발생하며 관련 효소에 의해 변형될 수 있도록 배열되어 있는 분자이다.

효소에 의한 인산화 상태의 조절은 하나 이상의 포스페이트 그룹이 기질로 전달되거나 제거되는 성질의 효소에 의한 기질 변형을 의미한다. 따라서, 본 발명과 관련된 효소는 하나 및/또는 다른 반응을 촉매하는 능력을 갖는다. 따라서, 이들 효소는 적어도 이러한 키나제 및/또는 포스파타제의 능력을 갖지만, 추가의 효소적 특성(예: 프로테아제 특성 등)도 가질 수 있다. 다양한 효소 카테고리 및 이의 특성은 당해 분야의 숙련가에게 충분히 공지되어 있다.

효소의 기능적 단편은 본원에서 하나 이상의 폴리펩타이드의 인산화 상태를 조절하는 능력을 여전히 지닌, 효소의 임의의 단편(즉, 천연 형태와 비교하여 크기가 감소되었거나 절두된(truncated) 분자)이다. 이와 관련하여 효소의 "기능적 유도체"란 용어는 절두를 나타내지 않는 천연의 형태와 비교하여 효소의 모든 유형의 변형을 포함하며, 여기서 효소의 유도체는 하나 이상의 폴리페타이드의 인산화 상태를 조절하는 능력을 여전히 갖는다. 이와 관련하여, 본 발명은 또한 하나 이상의 폴리펩타이드의 인산화 상태를 조절할 수 있는 효소의 단편의 기능적 유도체에 관한 것이다.

이와 관련하여, 폴리펩타이드의 인산화 상태를 조절하는 효소 능력은 정성적으로 그리고 정량적으로(즉, 정량할 수 있는 측정법으로서) 측정할 수 있다.

본 발명에 따른 사용은, 사용되는 기질의 길이로 인해서, 달성된 결과가 보다 많은 정보를 제공한다는 이점이 있는데, 그 이유는 상기 기질이 생리학적 환경에 상응하는 경향이 있는 3차 구조를 포함하기 때문이다. 또한, 사용되는 폴리펩타이드는 종래 기술에 공지되어 있는 펩타이드와 대조적으로, 우수한 반응속도 상수(예를 들어, 200μM을 초과하는 펩타이드와 비교하여 IRS-1: Km 19μM, 참조: Siemeister et al. 1995)를 갖고, 오직 1개의 기질만이, 다수의 인산화 부위를 갖는 기질을 분석하기 위해 필요하고, 예를 들어, 상이한 효소들의 능력을 측정하는데 사용될 수 있다. 바람직한 양태는 폴리펩타이드를 인산화시키는 효소의 능력을 측정하는 용도에 관한 것이다. 본 발명의 다양한 양상에 있어 키나제 활성을 갖는 특히 적절한 유형의 효소는 세린/트레오닌 또는 티로신 키나제에 관련된다. 키나제의 특히 적합한 예로는 특히, 인슐린 수용체, IGF-1 수용체, trK 수용체, EGF 수용체, 카제인 키나제 II, 단백질 키나제 C 계열의 구성원, 단백질 키나제 B/Akt, 유사분열원-활성화 단백질 키나제(MAP 키나제), GSK-3 베타, ERK 1/2, IKK 베타 키나제, AMP 키나제, PI3 키나제 또는 JNK가 포함된다. 본 발명에 따른 용도는 또한 펩타이드를 탈인산화시키는 효소의 능력을 측정하기에 동등하게 적합하다. 본 발명의 추가의 양상은 바이오티닐화된 폴리펩타이드의 인산화 상태를 조절하는 효소, 이의 기능적 단편 또는 유도체의 능력을 측정하는 방법에 관한 것이다.

바이오티닐화된 폴리펩타이드의 인산화 정도를 측정하기에 적합한 방법은 예 를 들어, 소형 펩타이드의 인산화 정도를 측정하기에 적합한 것으로 공지된 방법과 관련된다. 이는 당해 분야의 숙련가에게 친숙한 것이다.

바람직한 양태에서, 본 발명의 방법은 폴리펩타이드를 인산화시키는 효소, 이의 기능적 단편 또는 유도체의 능력을 다음 단계들을 사용하여 측정하는 방법에 관한 것이다:

(a) 효소 또는 이의 기능적 단편 또는 유도체를 바이오티닐화된 폴리펩타이드와 접촉시키고, 적합한 반응 혼합물에서 인산화 반응을 개시하는 단계,

(b) 상기 반응 혼합물을, 담체에 커플링되고 바이오티닐화된 폴리펩타이드에 결합할 수 있는 수단과 접촉시키는 단계 및

(c) 상기 수단에 결합된 폴리펩타이드의 인산화 상태를 측정하는 단계.

본 발명의 추가의 바람직한 양태는 폴리펩타이드를 탈인산화시키는 효소, 이의 기능적 단편 또는 유도체의 능력을 다음 단계들을 사용하여 측정하는 방법에 관한 것이다:

(a) 효소 또는 이의 기능적 단편 또는 유도체를 하나 이상의 포스페이트 잔기를 갖는 바이오티닐화된 폴리펩타이드와 접촉시키고, 적합한 반응 혼합물에서 인산화 반응을 개시하는 단계,

(b) 상기 반응 혼합물을, 담체에 커플링되고 바이오티닐화된 폴리펩타이드에 결합할 수 있는 수단과 접촉시키는 단계 및

(c) 상기 수단에 결합된 폴리펩타이드의 인산화 상태를 측정하는 단계.

이와 관련하여 당해 수단은 바이오티닐화된 폴리펩타이드와 결합하기에 적합 한 어떠한 유형의 분자 또는 초분자적 연합(예; 물체 또는 장치)일 수 있다. 이러한 경우에 결합은 바이오틴 부분 또는 폴리펩타이드 자체에서 일어날 수 있으며, 폴리펩타이드 자체에 결합하는 경우, 인산화 상태에 의존하는 결합(예를 들어, 단일 또는 다수의 인산화 부위와 관련하여 오직 인산화된 상태 또는 인산화되지 않은 상태에서만의 결합)이 바람직하다.

따라서, 수단의 바람직한 양태는 스트렙타비딘 또는 인-특이적 항체(즉, 폴리펩타이드 상의 특정 잔기의 인산화를 인식할 수 있고 인산화된 폴리펩타이드에 특이적으로 결합할 수 있는 항체)에 관련된다.

또한, 본 발명의 다양한 양상의 목적을 위해 사용되는 반응 혼합물은 생화학적(즉, 시험관내) 또는 천연의 세포성일 수 있다. 이와 관련하여, 생화학적 혼합물의 조성은 조사하고자 하는 효소의 요건에 따라 좌우되지만, 적합한 성분 및 조성, 예를 들어, ATP, 목적하는 pH 환경을 조정하기에 바람직한 완충액 및 효소 활성을 보장하기에 바람직한 염 농도는 당해 분야의 숙련가에게 공지되어 있다. 생화학적 혼합물의 경우, 효소 및/또는 폴리펩타이드는 재조합적으로 및/또는 천연 공급원으로부터 부분적으로 또는 완전히 정제된 분자로서 및/또는 생물학적 물질로부터의 추출물 형태, 특히 세포 또는 조직 추출물로서 존재할 수 있다.

생물학적 물질로는 특히, 조직 또는 기관(예: 뇌, 혈액, 간, 비장, 신장, 심장, 혈관)의 세포, 바람직하게는 사람을 포함한 척추동물의 세포 또는 세포 배양물로부터의 세포가 포함될 수 있다. 이와 관련하여 본 발명의 목적을 위해 사용되는 세포로는 모든 유형의 세포, 예를 들어, 진핵 또는 원핵 단세포 유기체[예: 세균, 예를 들어, 이. 콜라이(E. coli) 또는 효모, 예를 들어, 에스. 폼베(S. pombe) 또는 에스. 세레비시애(S. cerevisiae)] 또는 다세포 유기체로부터 유래된 세포주(예: HeLA, COS, NIH-3T3, CHO 등)가 포함되며, 포유동물 세포주가 바람직하다. 사람을 포함한 척추동물의 조직 집합체 또는 기관은 채혈, 생검 또는 외과술 기법과 같은 통상의 기법에 의해 수득될 수 있다. 이러한 재조합 분자의 제조, 세포 또는 조직으로부터 천연 분자의 정제 및 세포 또는 조직 추출물의 제조는 당해 분야의 숙련가에게 충분히 공지되어 있다(이후에 열거된 표준 문헌의 예를 참조).

다양한 양상의 목적을 위해 사용하기에 적합한 세포 시스템도 마찬가지로 당해 분야의 숙련가에게 공지되어 있으며, 바람직하게는, 특히 바람직하게는 배양된 세포주의 형태인 조직 집합체(바람직하게는 척추동물, 특히 바람직하게는 포유동물, 특히 사람 유래)로부터 본래 유래된 세포를 포함한다; 이는 추가로 단세포 생명체 형태(진핵생물 또는 원핵생물), 예를 들어, 특히 배양된 균주의 형태인 효소 또는 세균 세포를 추가로 포함한다.

담체는 바이오틴-스트렙타비딘 상호작용을 통해 반응 혼합물로부터 이러한 담체에 커플링된 펩타이드를 제거하기에 적합한 또는 이러한 펩타이드를 표지하기에 적합한 모든 유형의 분자 또는 초분자적 연합(예; 물체 또는 장치)일 수 있다. 적합한 장치는 예를 들어, 막, 플레이트 또는 당해 분야에 익히 공지된 다양한 물질로 제조된 매우 다양한 모양을 갖는 물체(일반적으로 본원에서는 비이드로 지칭됨)이다. 이와 관련하여 담체의 성질은 방법의 목적(예; 진단용, 활성 물질을 찾아내거나 신규한 상호작용 파트너를 발견하기 위한 목적)과 검출 방식에 따라 좌우 되며, 적합한 담체는 당해 분야의 숙련가의 능력내에 있다.

본 발명의 방법의 한 양태에서, 방사성 표지된 γ32P-ATP를 반응 혼합물에 첨가하고, 1회 이상의 세척 단계를 수행한 후에 인산화 상태를 담체, 바람직하게는 막 또는 플레이트상에 잔류하는 방사성을 측정함으로써 측정한다. 이러한 방식으로, 유리 방사성을 포함하여 스트렙타비딘에 결합하지 않은 반응 혼합물의 성분들을 간단히 제거하여, 폴리펩타이드의 인산화 상태를 담체상에 고정화된 방사성에 근거하여 간단히 측정할 수 있다. 이러한 경우에, 바이오티닐화된 폴리펩타이드에 결합하기에 적합한 수단은 특히 스트렙타비딘이다.

본 발명의 추가의 바람직한 양태에서, 인산화된 폴리펩타이드에 특이적으로 결합할 수 있는 항체(BSP)를 반응 혼합물에 첨가한다. 이러한 경우에 상기 항체는 수단 자체를 나타낼 수 있으며 상기한 수단들에 더하여 첨가될 수도 있다(이 경우에 당해 수단은 바람직하게는 인-특이적 항체가 아니며, 특히 바람직하게는 스트렙타비딘이다). 이 경우에 인산화 상태의 측정은 폴리펩타이드에 결합한 항체의 양을 측정함으로써 수행한다. 항체를 표지하고 검출하기에 적합한 과정은 당해 분야의 숙련가에게 공지되어 있다. 따라서, 한편으로 직접 검출할 수 있는 적합하게 표지된 제1 항체 또는 제1 항체의 FC(결정화 단편)에 대해 지시된 적합하게 표지된 제2 항체를 사용하여 검출 특이성을 증가시킬 수 있다.

이와 관련하여 항체란 용어에는 모노클로날 항체 및 폴리클로날 항혈청 둘다, 재조합에 의해 제조된 항체 및 재조합에 의해 제조된 일본쇄 항체가 포함된다. 이러한 항체의 선별 및 제조는 당해 분야의 숙련가의 능력내에 있으며, 이와 관련 하여 이후에 열거된 표준 문헌을 참조할 수도 있다. 이러한 항체에 적합한 표지는 종래 기술에 공지되어 있으며, 예를 들어, CIP(송아지 장 포스파타제) 또는 HRP(서양고추냉이 퍼옥시다제)와 같은 효소적 표지, 특정 파장의 광 조사에 의해 여기시 검출가능한 시그날을 생성하는 형광성 분자, 예를 들어, Texas Red, Cy3, FITC(플루오레세인 이소티오시아네이트) 또는 공지된 형광성 단백질을 포함한다. 적합한 표지의 선별도 마찬가지로 당해 분야의 숙련가의 능력에 따른다. 적합한 표지된 또는 비표지된 제1 및 제2 항체 및 이의 제조는 종래 기술에 공지되어 있으며, 또한 이러한 항체는 다양한 공급업자를 통해서 시판되고 있다. 제1 및 제2 항체는 예를 들어, Becton Dickinson, Pharmacia 또는 Santa Cruz Biotech를 통해서 입수할 수 있다.

상기한 방법의 바람직한 양태에서, 폴리펩타이드에 결합한 항체의 양은 1회 이상의 세척 단계를 수행한 후에 담체, 바람직하게는 막 또는 플레이트에 잔류하는 항체의 양을 측정함으로써 측정한다.

본 발명의 방법의 추가의 바람직한 양태에서, 수단에 커플링된 담체는 제1 시그날 생성기를 포함하는 제1 담체이고, 폴리펩타이드는 제2 시그날 생성기를 포함하는 제2 담체에 커플링되는데, 이들 2개의 시그날 생성기는 서로 인접해 있는 경우에 검출가능한 시그날을 생성할 수 있으며, 인산화 상태는 검출가능한 시그날이 생성되었는지를 측정함으로써 측정한다. 이러한 경우에 담체는 바람직하게는 비이드이다. 본원에서 수단은 바람직하게는 인-특이적 항체이다. 이러한 경우에 담체는 항체에 직접적으로 또는 간접적으로, 바람직하게는 담체에 커플링되는 단백 질 A를 통해서 간접적으로 연결될 수 있다. 이러한 경우에 제2 담체는 폴리펩타이드에 직접적으로 또는 간접적으로, 바람직하게는 바이오티닐화된 폴리펩타이드의 바이오틴 부분을 통해서 간접적으로 연결될 수 있다; 이러한 연결은 바람직하게는 담체에 커플링된 스트렙타비딘을 통해서 일어난다.

이러한 경우에 시그날 생성기는 검출가능한 시그날을 생성하기에 적합한 어떠한 유형의 수단 또는 분자라도 될 수 있으며, 예로는 에너지에의 노출에 의해 여기된 후, 직접적으로 검출될 수 있거나 종래 기술에 공지된 적합한 수단에 의한 시그날 증폭 후에 검출될 수 있는 광을 방출하는 형광발색단이 포함된다. 이러한 경우에 시그날 생성기는 본 발명의 목적상 시그날이 오직 수단(즉, 바람직하게는 인-특이적 항체)과 폴리펩타이드의 직접적 상호작용이 일어나는 경우에만 생성되도록 선택된다. 적합한 담체 및 시그날 생성기(예를 들어, ALPHAScreen^TM, 또는 LANCE^TM, Perkin-Elmer Life Sciences; HTRF^TM, CIS Bio International)은 공지되어 있다. 이러한 경우들에서, 시그날 생성을 위해 담체가 서로 인접해 있는 것이 중요하다. 따라서, 매우놀랍게도, 폴리펩타이드가 종래 기술에서 사용되는 펩타이드에 비해 명백히 크다해도 당해 유형의 방법은 폴리펩타이드와 함께 사용하기에 적합하다.

본 발명의 다양한 양상의 목적상 폴리펩타이드는 바람직하게는 비절두된 길이의 효소의 천연 기질인 것이 바람직하다. 특히 적합한 폴리펩타이드로는 인슐린 수용체 키나제의 모든 기질이 포함된다. 이와 관련하여 인슐린 수용체 기질(IRS) 계열, 바람직하게는 IRS-1, 2, 3 또는 4가 특히 바람직하고, IRS-1 또는 이의 기 능적 단편 또는 유도체가 특히 바람직하다. 이는 인슐린 수용체에 의해 인산화될 수 있는 능력을 갖는 단편 또는 유도체(또는 단편의 유도체)를 의미한다. IRS가 사람 IRS인 것이 또한 바람직하다. 또한, IRS-1, 특히 서열번호 2에 제시한 서열에 의해 암호화되는 사람 IRS-1인, 서열번호 1에 제시한 서열을 갖는 사람 IRS-1을 사용하는 것이 본 발명의 다양한 양상의 목적상 특히 바람직하다. 상기한 폴리펩타이드는 또한 이들 폴리펩타이드를 인산화시키는 인슐린 수용체의 능력을 측정하는데 특히 적합하다. 바람직한 IRS-1 단편은 서열번호 3에 제시한 아미노산 서열을 갖는 폴리펩타이드이다.

본 발명의 다양한 양상은 다양한 수준에서 사용될 수 있다. 이의 사용은 폴리펩타이드의 인산화 상태를 조절하는 효소 또는 이의 기능적 단편 또는 유도체의 능력을 변형시키는 물질의 확인시에 특히 적절하다. 잠재적 활성 물질의 활성 매개변수로서 물체의 특정 표적 분자("표적"이라 지칭됨, 이 경우에는 폴리펩타이드의 인산화 상태)의 활성 또는 농도 또는 양을 측정하는, 분석법으로 지칭되는 적합한 분석 방법 또는 시스템은 종래 기술에 공지되어 있다. 이의 가능한 예로는 시험관내 분석법, 즉 배합되어 반응 혼합물을 제공하고 잠재적 활성 물질의 활성을 측정할 수 있도록 하는 근거가 되는 분리된 또는 부분적으로 분리된 성분을 이용한 생화학적 분석법이 있다. 추가의 가능성은 또한, 표적 단백질(즉 당해 경우에는 효소)의 활성 및 세포 환경에서 이러한 표적 분자의 활성에 대한 잠재적 활성 물질의 활성을 측정할 수 있는 세포 분석 시스템(분석법)이다.

이와 관련하여 분석법은 생물학적 과정을 모니터링할 수 있는 근거가 되는 모든 유형의 분석 방법이다. 이는 생리학적 대사 경로의 일부분을 나타내고 기작을 조절하는 분자적 과정 및 시그날 캐스케이드 뿐만 아니라 세포 또는 생물학적 시스템에서 재생되는 병리학적 상태를 통상적으로 수반한다. 이어서, 활성 물질의 약리학적 활성을 이러한 경로와 기작들에 간섭하는 이의 능력에 기초하여 측정할 수 있다.

활성 물질 발견의 목적, 특히 활성 물질의 고처리량 스크리닝의 목적으로 사용하기 위해, 당해 분석법은 재현가능해야 하며, 바람직하게는 측정가능하고 강건(즉, 외부 영향에 거의 민감하지 않은)하다. 당해 분석법은 바람직하게는 표적 분자의 활성에 효과를 미치는 능력에 대한 화학 물질의 고처리량 스크리닝에 적합해야 한다. 이와 관련하여 분석법의 성질은 특히 사용되는 표적 분자의 성질(예를 들어, 기본적인 생화학적 분자, 예를 들어, 폴리펩타이드 또는 폴리뉴클레오타이드의 정확한 유형 또는 성질), 및 "판독결과", 즉 표적 분자의 활성을 측정하는 근거가 되는 매개변수에 따라 좌우된다.

다양한 유형의 분석법은 종래 기술에 공지되어 있으며 이들 대부분은 또한 상업적 공급업체로부터 시판되고 있다. 두 결합 파트너의 상호작용을 측정하기에 적합한 분석법으로는 예를 들어, 방사성동위원소 또는 형광 분석법, 예를 들어, Panvera, Perkin-Elmer Life Sciences(NEN, LANCE^TM, AlphaScreen^TM) 또는 CIS Bio International(HTRF^TM)로부터 시판되는 형광 편광 분석법이 포함된다. 분석법의 추가 예로는 세포주가 목적하는 단백질을 안정하게(유도적으로 또는 지속적으로; 염 색체에 의해 또는 에피좀에 의해) 또는 일시적으로 발현하는 세포 분석법이 포함된다. 이러한 분석법으로는 예를 들어, 특정 프로모터의 조절, 또는 시그날 전달 경로 또는 시그날 전달 캐스케이드의 구성원의 조절을 발현이 관련 프로모터의 조절하에 있는 리포터 효소의 활성에 기초하여 측정하는 리포터 유전자 분석법이 포함된다. 이러한 유형의 분석법에 있어, 그 자체로 조사될 예정이거나 조사될 시그날 전달 캐스케이드에 의해 조절되는 정의된 프로모터의 조절하에 리포터 유전자를 발현하는 재조합 세포주를 생성시키는 것이 필수적이다. 적합한 리포터 효소는 일반적으로 당해 분야의 숙련가에게 공지되어 있으며 반딧불이 루시페라제, 레닐라 루시페라제(둘다 예를 들어, Packard Reagents에서 시판되고 있음), β-갈락토시다제 등을 포함한다. 적합한 세포주의 선별은 당해 분야의 숙련가에게 공지되어 있으며 특히 분석법의 목적 또는 판독결과에 따라 좌우된다. 적합한 세포주는 일반적으로 배양하고 형질전환시키기가 간편한 세포주, 예를 들어, HeLA, COS, CHO 또는 NIH-3T3 세포이다.

예를 들어, Panvera에서 시판하는 형광 편광, 균질한 시간 분해성 형광(HTRF^TM, Cis Bio Internation) 또는 LANCE^TM 분석법(시판원: Perkin-Elmer Life Sciences) 또는 증폭된 발광 근접 균질 분석법(ALPHAScreen^TM 시판원: Perkin-Elmer Life Sciences)이 단백질 인산화 또는 키나제 활성을 측정하기에 적합하다. 본 발명의 목적에 특히 적절한 ALPHAScreen^TM을 사용한 키나제 활성의 측정은 예를 들어, ATP의 존재하에 생화학적 혼합물 중에서 바이오티닐화된 펩타이드를 인산화시키는 조사될 키나제에 의해 수행한다. 이어서, 인산화된 펩타이드를 단백질 A-접합된 수용 비이드 또는 적합한 제2 항체가 제공된 비이드에 커플링되는 특이적 항-인 항체에 의해 결합된다. 동일한 혼합물은 펩타이드의 바이오틴 부분에 결합하는 스트렙타비딘-커플링된 공여 비이드를 함유한다. 펩타이드에 결합됨으로써 수용 비이드와 공여 비이드가 인접하게 되어 고도로 증폭된 검출가능한 발광 시그날을 생성하는 화학반응의 캐스케이드가 시작된다: 공여 비이드에서의 감광성은 주변의 산소를 일중항 상태(singlet status)로 전환시키는 레이저 여기에 의해 여기된다. 이어서, 일중항 산소는 수용 비이드로 확산되고, 여기서 티옥센 유도체를 여기시키고 이로써 370nm의 파장을 갖는 화학발광이 방출되고 이는 다시 수용 비이드의 형광발색단을 추가로 여기시켜 520 내지 620nm의 파장을 갖는 광을 발광한다. 일중항 산소에 의한 형광발색단의 여기는 공여 비이드와 수용 비이드가 인접해있는 경우에만 일어나기 때문에 비로소 검출가능한 시그날이 생성된다.

다른 유형의 분석법 및 다른 유형의 "판독결과"도 마찬가지로 당해 분야의 숙련가에게 익히 공지되어 있다.

이와 관련하여 다수의 물질들이 가장 짧은 시간내에 분석될 수 있는 고처리량 방법(HTS, 고처리량 스크린)의 형태로 사용하는 것이 특히 바람직하다.

목적에 따라서, 조절의 변형은 효소에 의한 조절의 억제 또는 활성화를 의미할 수 있다. 이와 관련하여 변형의 성질은 궁극적으로 폴리펩타이드의 효소-촉매된 인산화 상태에 효과를 미치는 모든 가능한 간섭, 예를 들어, 효소-기질 상호작용의 변형 또는 효소의 촉매 활성의 변형 뿐만 아니라 (바람직하게는 세포성 반응 혼합물을 사용한 분석의 경우에) 효소 발현의 변형 등을 포함한다.

본 발명의 추가의 양상은

(a) 폴리펩타이드의 인산화 상태를 조절하는 효소 또는 이의 기능적 단편 또는 유도체의 능력을 반응 혼합물에 시험될 물질을 첨가하지 않고 상기한 방법들 중 하나에 따라서 측정하는 단계,

(b) 폴리펩타이드의 인산화 상태를 조절하는 효소 또는 이의 기능적 단편 또는 유도체의 능력을 반응 혼합물에 시험될 물질의 첨가하에 상기한 방법들 중 하나에 따라서 측정하는 단계 및

(c) 단계(a)로부터의 효소 능력과 단계(b)로부터의 효소 능력을 비교하는 단계를 사용하여, 폴리펩타이드의 인산화 상태를 조절하는 효소 또는 이의 기능적 단편 또는 유도체의 능력을 변형시키는 물질을 확인하는 방법에 관한 것이다.

본 발명의 방법은 인슐린 비의존성 진성 당뇨병(NIDDM)의 치료를 위해, 종양학에서(IGFRK) 또는 면역 과정의 치료를 위해(IKK 키나제) 약리학적 활성 물질을 확인하는데 특히 적합하다. 본 발명은 이로써 본 발명의 주제 대상을 제한하지 않는 다양한 도면 및 실시예에 의해 하기에서 보다 상세히 설명된다.

실시예 1

사용되는 IRS-1 단편

인슐린 시그날 경로로부터의 폴리펩타이드 기질의 바이오티닐화 가능성 및 본 발명의 용도 및 방법을 위한 이의 사용 가능성을 입증하기 위해, 크기가 262개 아미노산인, 사람 IRS-1로부터의 단편을 선택하였는데(aa516-aa777), 이는 중심적 인 잠재적 티로신(볼드체) 및 세린 인산화 부위(밑줄친 부분)을 암호화한다[참조: Siemeister et al. J. Biol. Chem. 1995]. 상기 단편은 도 3에 강조되어 있으며 하기에 이의 모티프와 함께 볼드체로 나타낸 5개의 잠재적 티로신 인산화 부위를 포함한다.

YMXMSP 모니프내의 4개의 가능한 세린 키나제 인산화 부위를 나타내는 세린 612, 632, 662 및 731은 SH2 도메인에 대한 결합 부위내에 제공되어 있는 인슐린 수용체의 티로신 인산화 부위 근처에 위치한다. 이들 세린 잔기의 알라닌으로의 돌연변이는 포스파티딜-이노시톨 트리포스페이트 키나제(PI3K)의 IRS-1 매개된 활성을 증가시키는데[참조: Mothe et al. 1996], 이는 이들 세린 잔기가 억제 기능을 갖고 있음을 나타낸다. 그러나, 추가의 세린 인산화 부위가 또한 존재하지만 아직 공지되지 않았음은 배제될 수 없다.

실시예 2

hIRS-1-p30의 클로닝 및 바이오티닐화

조사를 위해, 사람 IRS-1의 262개 아미노산 길이의 도메인 D516-P777(hIRS-1-p30)을 문헌[참조: Siemeister et al., 1995]에 기재된 바와 같이, 먼저 이. 콜라이에서 발현시켰다. 상기 경우에 발현 벡터는 서열번호 10에 제시된 서열(hIRS- 1-p30의 cDNA 서열)을 갖는 폴리뉴클레오타이드를 플라스미드 pET3d(주문번호 69421하에 노바겐(Novagen)으로부터 시판되고 있음)내로 삽입하여 통상의 방법으로 제조하였다. 이러한 목적을 위해, 먼저 공(empty) 벡터를 표준 조건하에 NcoI(주문번호 835315하에 Roche Diagnostics GmbH Mannheim으로부터 시판되고 있음) 및 BamHI(주문번호 656275하에 Roche Diagnostics GmbH Mannheim으로부터 시판되고 있음)에서 효소로 분해시키고 스핀 컬럼(주문번호 28104하에 Qiagen, Hilden으로부터 시판되고 있음)을 사용하여 정제하였다.

당해 경우에 상업적 공급업체 N-Zyme(독일 다름슈타트 소재)와의 계약하에 통상의 기법을 사용하여 바이오티닐화를 수행하였다. hIRS-1-p30 인슐린 수용체 단편의 발현을 문헌[참조: Siemeister et al., 1995]에 기재된 바와 같이 수행하였다. 발현 결과를 점검하기 위해, 이. 콜라이(균주 이. 콜라이 BL21, 주문번호 69451-3하에 노바겐으로부터 시판되고 있음)로부터의 단백질 추출물을 제조하고, 표준 조건(예를 들어, 하기 열거한 표준 문헌 참조)하에 SDS-PAGE로 분획화시키고, 표준 조건(예를 들어, 하기 열거한 표준 문헌 참조)하에 쿠마시 염색 용액으로 염색하여 입증하였다. hIRS-1-p30의 정제를 마찬가지로 문헌[참조: Siemeister et al., 1995]에 따라서 수행하였다. hIRS-1-p30의 바이오티닐화를 트랜스글루타미나제를 사용하여 효소적으로 수행하였다.

실시예 3

ALPHAScreen^TM: 밀 배아 렉틴 친화성-정제된 랫트 간 인슐린 수용체에 의한 바이오티닐화된 IRS-1 단편의 인산화.

그 결과가 도 4에 도시된 실험에서는, 밀 배아 렉틴 친화성 크로마토그래피에 의해 정제된 랫트 간 인슐린 수용체(WGA-IR, SEQACC 번호 NP_058767 또는 주문번호 70543하에 시그마(Sigma)로부터 시판되고 있음)를 4℃에서 10분 동안 50mM Tirs 완충액, pH 7.4, 8mM MgCl₂, 2mM MnCl₂ 중에서 다양한 농도의 사람 인슐린(예를 들어, 주문번호 I-9266하에 시그마로부터 시판되고 있음) 및 85nM 바이오티닐화된 IRS 단편과 함께 항온처리한 다음, ATP(최종 농도 50μM)를 첨가한 후에 30℃에서 30분 동안 항온처리하였다. 이어서, EDTA를 최종 농도가 20mM이 되도록 첨가하여 반응을 종결시키고, IRS-1의 인산화를 수용체 p-Tyr(주문번호 6760601C하에 Perkin-Elmer Life Sciences로부터 시판되고 있음)에 직접 커플링된 특이적 항체를 사용하여 검출하였는데, 이 판독결과는 도 4에 도시한다. 당해 방법을 사용함으로써 인슐린에 대한 EC50이 10nM임을 측정할 수 있었다.

실시예 4

ALPHAScreen^TM: PKC 및 재조합 인슐린 수용체 키나제에 의한 바이오티닐화된 IRS-1 단편의 인산화.

ALPHAScreen^TM(시판원: Perkin-Elmer Life Sciences)는 인산화된 IRS-1 단편과, 인산화된 세린 또는 티로신 잔기를 인식하는 항체(p-Ser/p-Tyr 항체) 간의 상호작용을 검출할 수 있게 한다. 이러한 경우에 바이오티닐화된 IRS-1은 스트렙타비딘 공여체에 결합되며, 항체는 수용체-커플링된 단백질 A 또는 수용체에 결합된 적합한 제2 항체에 의해 결합된다. 상호작용이 일어나면, 수용체는 이탈하여 공여 체에 인접한 상태를 유지하게 되어, 상기 공여체에 의해 생성된 일중항 산소 원자가 확산에 의해 수용체 비이드내의 화학발광성 그룹에 도달할 수 있고, 궁극적으로 검출가능한 광의 방출이 야기된다.

IRS-1을 단백질 키나제 C 및 ATP와 함께 30분 동안 항온처리하고 이어서 p-Ser 항체(주문번호 44-550하에 Biosource(벨기에 소재)로부터 시판되고 있음)를 첨가하고 추가로 120분 동안 항온처리한 후에, 상기한 분석법에서 생성되었고 도 5A 및 5B에 막대 그래프의 형태로 도시한 광 강도(이른바 "판독결과")를 Perkin-Elmer Fusion 또는 AlphaQueset 장치를 이용하여 측정하여 검출하고 정량하였다. PKC의 존재 및 부재하의 생성된 광 강도의 비교는 도 11A에 도시되어 있다. 결과가 도 11B에 도시된 실험에서는, 재조합 인슐린 수용체 키나제(IRK, 아미노산 941 - 1343, NCBI 접근번호 NM_000208)를 30℃에서 10분 동안 50mM Tris 완충액, pH 7.4, 8mM MgCl2, 50μM ATP 반응 완충액 중에서 폴리리신과 함께 항온처리하여 활성화시킨 다음, IRK 기질 IRS를 첨가하고 이어서 30℃에서 30분 동안 항온처리하였다. IRS-1의 인산화를 수용체에 직접 커플링된 p-Tyr 특이적 항체(주문번호 6760601C하에 Perkin-Elmer Life Sciences로부터 시판되고 있음)를 사용하여 검출한 결과, 도 11B에 도시된 판독결과가 야기되었다. 상기한 연구로 바이오티닐화된 폴리펩타이드가 키나제에 의해 인산화될 수 있음이 최초로 입증되었다. 이는 바이오티닐화된 상태에서 세린 키나제 PKCδ 및 인슐린 수용체의 티로신 키나제에 의해 인산화될 수 있는 크기가 28kDa인 hIRS-1 단편을 사용하여 입증되었다. 이러한 경우에 바이오틴 잔기와 함께 폴리펩타이드의 크기로 인한 입체 장애가 검출 반응을 간섭함이 없이 인-특이적 항체에 의한 검출도 마찬가지로 성공적이었다. 이로써, ALPHAScreen^TM의 원리에 기초하여, 바이오티닐화로 인해서 가능한 정제 및 검출 기법을 사용하여 폴리펩타이드의 인산화 상태를 측정할 수 있는 균질성 분석 시스템을 생성시킬 수 있었다. 이러한 분석법의 원리는 본원에서 최초로 폴리펩타이드 크기를 갖는 단백질 단편(보다 엄밀히 28kDa)에 적용되었다. 이는 세포의 인산화 및 탈인산화 기구와 상호작용하는 약리학적 활성 기질에 대한 개선된 조사- 인산화 의존적 장애의 진단/대형 및 심지어 구조적으로 온전한 생리학적 기질상의 특이적 폴리펩타이드에 대한 신규 단백질 키나제의 확인을 가능하게 함으로써, 이러한 조사가 기초로 하는 인산화 또는 탈인산화의 특이성을 증가시켜 이러한 방식으로 생성된 데이타에 의해 제공된 정보를 증가시킨다. 또한, 본원에서 사용된 분석 시스템에서의 판독결과는 비방사성이나 발광성으로서, 고처리량 스크리닝(HTS) 방법에서 사용하기에 유리하다. 따라서, 본원에서 기술하는 분석법을 신규한 활성 물질의 확인 또는 공지된 활성 물질의 유효성 입증을 위해 키나제 및 포스파타제와 같은 단백질 및 폴리펩타이드의 인산화 상태를 조절하는 모든 효소의 HTS용으로 사용할 수 있다. 당해 분석법은 전체 세포 용해물 중에서 특정 폴리펩타이드를 인산화시키는 신규 효소, 예를 들어, 신규 IRS-1 인산화 키나제를 조사하기 위한 상기한 방법들과 같은 기타 방법에도 적합하다.

도 1A 및 1B

IRS-1 내지 IRS-4의 단백질 서열(서열번호 1 내지 4). 4개의 계열 구성원의 서열 접근 번호(NCBI 단백질 데이타베이스)는 NM_005544(IRS-1 hs):M:007095(IRS-2 hs), NM:032074(IRS-3 랫트), NM_003604(IRS-4 hs)이다.

도 2A 내지 2E

IRS-1 내지 IRS-4의 암호화 DNA 서열(서열번호 5 내지 8). 4개의 계열 구성원의 서열 접근 번호(NCBI 뉴클레오타이드 데이타베이스)는 NM_005544(IRS-1 hs), :M:007095(IRS-2 hs), NM:032074(IRS-3 랫트), NM_003604(IRS-4 hs)이다.

도 3

본 연구를 위해 사용된 IRS-1 단백질의 262개 아미노산을 포함한 도메인. 세린 612, 632, 662 및 731은 밑줄로 나타낸다. YXXM 티로신 인산화 모티프는 볼드체로 나타낸다.

도 4

밀 배아 렉틴 친화성 크로마토그래피로 정제된 인슐린 수용체를 사용한 ALPHAScreen의 결과

도 5A 및 5B

ALPHAScreen^TM의 결과

도 6

인슐린 수용체, IRS-1 및 세린 키나제의 상호작용을 요약한 도면

도 7

억제 효과를 갖는 세린 인산화의 가능한 분자적 기작을 요약한 도면

참조문헌

재료 및 방법

달리 기술하지 않는 한, 언급한 방법은 당해 분야의 숙련가에게 공지된 표준 방법이며, 예를 들어, 상기 인용된 문헌, 특히 표준 방법에서의 문헌(본원에서 표준문헌으로서도 지칭됨)에서 찾아볼 수 있다.

약어

아미노산의 경우에 삼문자 또는 일문자 코드가 사용되었다(일반적으로 AA로 도 약칭됨)(또한 언급된 표준 문헌 참조); 뉴클레오타이드의 경우에 일반적으로 통상의 일문자 약어가 사용되었다(또한 언급된 표준 문헌 참조).

<110> SANOFI-AVENTIS DEUTSCHLAND GMBH <120> Use of a biotinylated polypeptide for determining the activity of protein-phosphorylating enzymes <130> DEAV2003/0045 <150> DE 103 23 081.5 <151> 2003-05-22 <160> 9 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 1242 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 1 Met Ala Ser Pro Pro Glu Ser Asp Gly Phe Ser Asp Val Arg Lys Val 1 5 10 15 Gly Tyr Leu Arg Lys Pro Lys Ser Met His Lys Arg Phe Phe Val Leu 20 25 30 Arg Ala Ala Ser Glu Ala Gly Gly Pro Ala Arg Leu Glu Tyr Tyr Glu 35 40 45 Asn Glu Lys Lys Trp Arg His Lys Ser Ser Ala Pro Lys Arg Ser Ile 50 55 60 Pro Leu Glu Ser Cys Phe Asn Ile Asn Lys Arg Ala Asp Ser Lys Asn 65 70 75 80 Lys His Leu Val Ala Leu Tyr Thr Arg Asp Glu His Phe Ala Ile Ala 85 90 95 Ala Asp Ser Glu Ala Glu Gln Asp Ser Trp Tyr Gln Ala Leu Leu Gln 100 105 110 Leu His Asn Arg Ala Lys Gly His His Asp Gly Ala Ala Ala Leu Gly 115 120 125 Ala Gly Gly Gly Gly Gly Ser Cys Ser Gly Ser Ser Gly Leu Gly Glu 130 135 140 Ala Gly Glu Asp Leu Ser Tyr Gly Asp Val Pro 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agtccacata gctatgccag catcaagttc tagaactttc 1680 agaagatagg ggaggagaac caagcattgg ttagggaaga gaggaaaaga agagaaaacc 1740 ttagcactgt tcagctcagc ttctgcacat aggagccagg gactctgagg ccttgtgagg 1800 tgctatgctg cccccttgcc tgctctgtct cttccagctg taccgcctca gaaacacctc 1860 aggaagaagt gctccaaaga aattagactc ttaagagaaa gtactagaac atctctctgc 1920 acccccaccc caaacccaaa caacaaacaa ataaaacacc tacagaacc 1969 <210> 8 <211> 3939 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 8 ggtcagggta gttccccaac cctccctttc gtgaattccc cctcgtcctc gctcacctta 60 aaaccatcgt gcatcaccat ggcgagttgc tccttcactc gcgaccaagc gacaagaaga 120 ctaagaggtg cagcagcggc ggcagcggca gctctagcag cagtggtgac caccccgctt 180 ctttcctcgg gaaccccgac cgcactcatt gggaccgggt cgtcttgtcc gggagccatg 240 tggctctcca cggccactgg ctcccggtca gactccgagt ccgaagagga ggacctgccc 300 gtcggggagg aagtctgcaa acgcggctac ctgcggaaac agaagcatgg gcacaggcgc 360 tacttcgtgc tcaaactcga gactgctgac gccccagctc ggctggaata ctacgaaaat 420 gccaggaagt tccggcacag tgtccgcgcc gcggcggctg cagcagcggc ggccgcctct 480 ggcgccgcga tccccccgct cattccaccg cggcgcgtga tcaccctata ccagtgcttt 540 tccgtgagcc agcgagcaga tgcaaggtac cgacacctca ttgctctttt cacccaagac 600 gaatacttcg cgatggtggc cgagaacgag tcggagcagg aaagctggta cttgctgctc 660 agccgcctca tcctcgagag caagcgccgc cgctgcggca cgctcggcgc gcagccggac 720 ggagagccgg ccgcgctggc ggcggcagcg gcggcggagc cacccttcta taaagatgtg 780 tggcaggtaa tagtcaaacc cagggggctg gggcacagaa aagagctgag cggcgtgttc 840 cggctgtgtc taaccgacga ggaggtcgtg tttgtgaggc tgaacaccga agtggccagc 900 gtggtcgtcc agctcctgag catccgtcgc tgtggacact cggagcagta tttcttcttg 960 gaagtaggca ggtccactgt catcggtccg ggagagctct ggatgcaggt cgatgactgt 1020 gtggttgccc aaaacatgca tgagctgttt ttggagaaga tgagagcctt gtgtgcagac 1080 gaatacagag cccgctgccg cagctacagc atcagcatcg gcgcccacct gttaaccctg 1140 ctgtccgcta ggaggcacct gggcttggtg ccgctcgagc cgggaggctg gctcagaagg 1200 tcccgctttg agcagttttg ccacctcagg gccatcggcg acggggaaga cgagatgctt 1260 ttcaccaggc gcttcgtaac acccagcgag cctgtggccc actccaggcg aggaagactg 1320 cacctgccca gagggcgcag gtcaaggaga gcggtttcag tgccggccag cttttttcgc 1380 cgcttagcac ccagcccagc acgtccccgg caccctgcag aagccccgaa caatggagct 1440 cgcctgtctt ctgaagtgtc tggttctggc tctggcaact ttggggagga aggcaatccc 1500 cagggcaaag aagatcagga aggaagcgga ggtgactaca tgcctatgaa caattggggc 1560 tcaggaaatg gccggggctc aggaggtggc cagggctcaa atggccaagg ctccagtagc 1620 catagctcgg gaggaaacca gtgttcaggc gagggacagg gatcccgagg tggtcagggc 1680 tcaaatggcc agggctcagg aggaaaccag tgctctagag atggccaggg caccgcaggt 1740 gggcacggtt caggtggtgg ccagagacct ggaggtgggc atggctcagg tggtggccag 1800 ggacctggag atggccatgg ctcaggtggt ggcaagaact ctgggggggg caaaggctca 1860 ggaagtggga aaggatccga tggtgatggt gaacgtggaa aatctctgaa gaaaagatcc 1920 tattttggca aattaactca aagcaagcaa cagcaaatgc caccacctcc accacctcct 1980 cctccacccc caccagctgg aggaactggt ggaaaaggga agtctggggg aagattcaga 2040 ctttattttt gtgttgacag aggagccacg aaagaatgca aagaagccaa agaagtgaaa 2100 gatgcagaga tcccagaagg tgcagctcga ggtccccaca gagccagagc ttttgatgaa 2160 gatgaggatg acccatacgt gccaatgagg ccaggggtgg ccacccctct tgtaagctcc 2220 agtgattata tgccaatggc tcctcaaaat gtctctgctt caaaaaagcg ccactctcga 2280 tccccttttg aagattcaag agggtacatg atgatgtttc ccagagtgag cccaccacct 2340 gctccgagtc ctccaaaagc acctgatact aataaagagg atgactcaaa ggacaatgac 2400 agtgagagtg actacatgtt tatggctcct ggagccggtg caattccaaa aaaccccaga 2460 aatcctcagg gtggctcttc ctccaaaagt tggagctcct acttctctct accaaaccct 2520 tttcggagct cacctttggg acagaatgac aacagtgagt atgtgccaat gttacctgga 2580 aagttcctgg ggaggggcct agacaaagaa gtctcctata actgggaccc caaagatgca 2640 gcttcaaagc cttcaggtga gggatcattc tcaaagcctg gagatggggg atcaccttca 2700 aagccttcag atcatgagcc cccaaagaat aaagctaaga gacctaaccg actttctttt 2760 attacaaaag gatataaaat caagccaaaa ccacaaaagc ccacacatga gcagagagaa 2820 gctgacagct ctagtgacta cgtcaacatg gacttcacta aaagagagag caatacacca 2880 gctccctcta ctcaaggact accagattcg tggggcataa ttgctgaacc cagacagtca 2940 gccttttcta attatgtgaa tgttgagttt ggagtgccat ttccaaatcc agcaaacgac 3000 ctctcagatc ttttaagagc tataccacgt gccaacccct tatctctgga cagtgctagg 3060 tggccacttc ctccccttcc cctcagtgct acaggtagca atgctattga ggaagagggt 3120 gactacattg aagtaatttt caactcagca atgacaccag ccatggctct tgctgacagt 3180 gccattcgct atgatgctga aacaggtcga atctatgtgg tcgacccatt ttctgagtgc 3240 tgtatggata tttctctctc ccccagccga tgttctgaac caccacctgt agctaggctg 3300 ctgcaggaag aagagcagga gagaagacgc ccacaaagcc gttctcaaag tttctttgca 3360 gcagccagag ccgctgtctc tgcttttcca acagacagcc tcgagagaga cctttcccca 3420 tcctcagccc cggctgtcgc ttcggctgca gagccgactt tagccctcag ccaagttgta 3480 gctgcggcct ccgcgctcgc cgcagccccg ggcatcggcg cagcagccgc agctgctgga 3540 tttgactccg cctctgcccg ctggtttcaa cctgttgcta atgctgctga tgccgaagca 3600 gtaaggggag cccaagacgt tgccggtggc tcgaaccctg gagcccacaa cccatctgca 3660 aaccttgcca gaggtgataa ccaggctggc ggggctgccg ctgcagctgc cgctccggaa 3720 ccaccacctc gcagtcgccg ggtgccaaga cccccggaga gagaagattc tgacaacgac 3780 gacgacactc acgtgagaat ggattttgcc agacgtgata atcagttcga ctctcccaaa 3840 agaggtcggt aattttagaa ttaatttccc taaagtgaat ggtcattgtc taatgattcg 3900 atgcgctaca gtctacagtg ttagggtata tttcattaa 3939 <210> 9 <211> 262 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 9 Asp Leu Asp Asn Arg Phe Arg Lys Arg Thr His Ser Ala Gly Thr Ser 1 5 10 15 Pro Thr Ile Thr His Gln Lys Thr Pro Ser Gln Ser Ser Val Ala Ser 20 25 30 Ile Glu Glu Tyr Thr Glu Met Met Pro Ala Tyr Pro Pro Gly Gly Gly 35 40 45 Ser Gly Gly Arg Leu Pro Gly His Arg His Ser Ala Phe Val Pro Thr 50 55 60 Arg Ser Tyr Pro Glu Glu Gly Leu Glu Met His Pro Leu Glu Arg Arg 65 70 75 80 Gly Gly His His Arg Pro Asp Ser Ser Thr Leu His Thr Asp Asp Gly 85 90 95 Tyr Met Pro Met Ser Pro Gly Val Ala Pro Val Pro Ser Gly Arg Lys 100 105 110 Gly Ser Gly Asp Tyr Met Pro Met Ser Pro Lys Ser Val Ser Ala Pro 115 120 125 Gln Gln Ile Ile Asn Pro Ile Arg Arg His Pro Gln Arg Val Asp Pro 130 135 140 Asn Gly Tyr Met Met Met Ser Pro Ser Gly Gly Cys Ser Pro Asp Ile 145 150 155 160 Gly Gly Gly Pro Ser Ser Ser Ser Ser Ser Ser Asn Ala Val Pro Ser 165 170 175 Gly Thr Ser Tyr Gly Lys Leu Trp Thr Asn Gly Val Gly Gly His His 180 185 190 Ser His Val Leu Pro His Pro Lys Pro Pro Val Glu Ser Ser Gly Gly 195 200 205 Lys Leu Leu Pro Cys Thr Gly Asp Tyr Met Asn Met Ser Pro Val Gly 210 215 220 Asp Ser Asn Thr Ser Ser Pro Ser Asp Cys Tyr Tyr Gly Pro Glu Asp 225 230 235 240 Pro Gln His Lys Pro Val Leu Ser Tyr Tyr Ser Leu Pro Arg Ser Phe 245 250 255 Lys His Thr Gln Arg Pro 260

Claims (23)

1. 바이오티닐화된 폴리펩타이드의 인산화 상태를 조절하는 효소, 이의 기능적 단편 또는 유도체의 능력을 측정하기 위한 바이오티닐화된 폴리펩타이드의 용도.
2. 제1항에 있어서, 폴리펩타이드를 인산화시키는 효소의 능력을 측정하기 위한 용도.
3. 제1항에 있어서, 폴리펩타이드를 탈인산화시키는 효소의 능력을 측정하기 위한 용도.
4. 바이오티닐화된 폴리펩타이드의 인산화 상태를 조절하는 효소, 이의 기능적 단편 또는 유도체의 능력을 측정하는 방법.
5. 제4항에 있어서,

   (a) 효소 또는 이의 기능적 단편 또는 유도체를 바이오티닐화된 폴리펩타이드와 접촉시키고, 적합한 반응 혼합물에서 인산화 반응을 개시하는 단계,

   (b) 상기 반응 혼합물을, 담체에 커플링되고 바이오티닐화된 폴리펩타이드에 결합할 수 있는 수단과 접촉시키는 단계 및

   (c) 상기 수단에 결합된 폴리펩타이드의 인산화 상태를 측정하는 단계를 사 용하여, 폴리펩타이드를 인산화시키는 효소, 이의 기능적 단편 또는 유도체의 능력을 측정하는 방법.
6. 제4항에 있어서,

   (a) 효소 또는 이의 기능적 단편 또는 유도체를 하나 이상의 포스페이트 잔기를 갖는 바이오티닐화된 폴리펩타이드와 접촉시키고, 적합한 반응 혼합물에서 인산화 반응을 개시하는 단계,

   (b) 상기 반응 혼합물을, 담체에 커플링되고 바이오티닐화된 폴리펩타이드에 결합할 수 있는 수단과 접촉시키는 단계 및

   (c) 상기 수단에 결합된 폴리펩타이드의 인산화 상태를 측정하는 단계를 사용하여, 폴리펩타이드를 탈인산화시키는 효소, 이의 기능적 단편 또는 유도체의 능력을 측정하는 방법.
7. 제4항 내지 제6항 중의 어느 한 항에 있어서, 담체가 막 또는 플레이트인 방법.
8. 제4항 내지 제7항 중의 어느 한 항에 있어서, 수단이 스트렙타비딘 또는 인-특이적 항체인 방법.
9. 제7항 또는 제8항에 있어서, 방사성 표지된 γ32P-ATP를 반응 혼합물에 첨가 하고, 인산화 상태를 1회 이상의 세척 단계 후에 막 또는 플레이트에 잔류하는 방사성을 측정함으로써 측정하는 방법.
10. 제4항 내지 제8항 중의 어느 한 항에 있어서, 인산화된 폴리펩타이드에 특이적으로 결합할 수 있는 항체를 반응 혼합물에 첨가하고, 인산화 상태를 상기 폴리펩타이드에 결합된 항체의 양을 측정함으로써 측정하는 방법.
11. 제10항에 있어서, 폴리펩타이드에 결합된 항체의 양을 1회 이상의 세척 단계 후에 막 또는 플레이트에 잔류하는 항체의 양을 측정함으로써 측정하는 방법.
12. 제10항에 있어서, 스트렙타비딘에 커플링된 담체가 제1 시그날 생성기를 포함하는 제1 담체이고, 폴리펩타이드가 제2 시그날 생성기를 포함하는 제2 담체에 커플링되고, 상기 2개의 시그날 생성기가 이들이 서로 인접한 경우에 검출가능한 시그날을 생성할 수 있으며, 인산화 상태가 시그날이 생성되었는지를 결정함으로써 측정되는 방법.
13. 폴리펩타이드의 길이가 50개 아미노산, 보다 바람직하게는 50개 내지 300개 아미노산인, 제1항 내지 제3항 중의 어느 한 항에 따른 용도 또는 제4항 내지 제12항 중의 어느 한 항에 따른 방법.
14. 폴리펩타이드의 크기가 1kDa, 보다 바람직하게는 1 내지 100kDa, 특히 바람직하게는 10 내지 50kDa, 특히 25 내지 35kDa인, 제1항 내지 제3항 중의 어느 한 항에 따른 용도 또는 제4항 내지 제12항 중의 어느 한 항에 따른 방법.
15. 효소가 키나제, 바람직하게는 티로신 키나제인, 제1항 내지 제3항 또는 제14항 중의 어느 한 항에 따른 용도 또는 제4항, 제5항 또는 제7항 내지 제14항 중의 어느 한 항에 따른 방법.
16. 폴리펩타이드가 바람직하게는 절두되지 않은 길이의, 효소의 천연 기질인, 제1항 내지 제3항 또는 제12항 내지 제15항 중의 어느 한 항에 따른 용도 또는 제4항 내지 제15항 중의 어느 한 항에 따른 방법.
17. 폴리펩타이드가 인슐린 수용체 기질(IRS), 바람직하게는 IRS-1, 2, 3 또는 4, 특히 바람직하게는 IRS-1 또는 이들의 기능적 단편 또는 유도체인, 제1항 내지 제3항 또는 제12항 내지 제16항 중의 어느 한 항에 따른 용도 또는 제4항 내지 제16항 중의 어느 한 항에 따른 방법.
18. 제17항에 있어서, IRS-1이 서열번호 1의 서열을 갖는 사람 IRS-1이거나 서열번호 2의 서열에 의해 암호화되는 용도 또는 방법.
19. 제18항에 있어서, IRS-1 단편이 서열번호 3의 아미노산 서열을 갖고 바람직하게는 이러한 서열로 이루어지는 용도 또는 방법.
20. 효소가 인슐린 수용체, IGF-1 수용체, trK 수용체, EGF 수용체, 카제인 키나제 II, 단백질 키나제 C, 단백질 키나제 B/Akt, 유사분열원-활성화된 단백질 키나제(MAP 키나제), GSK-3, ERK 또는 JNK 중에서 선택된 키나제 또는 이의 기능적 단편 또는 유도체 중 하나인, 제1항 내지 제3항 또는 제12항 내지 제19항 중의 어느 한 항에 따른 용도 또는 제4항 내지 제19항 중의 어느 한 항에 따른 방법.
21. 폴리펩타이드의 인산화 상태를 조절하는 효소 또는 이의 기능적 단편 또는 유도체의 능력을 변형시키는 물질을 확인하기 위한, 제1항 내지 제3항 또는 제12항 내지 제20항 중의 어느 한 항에 따른 용도 또는 제4항 내지 제20항 중의 어느 한 항에 따른 방법.
22. (a) 폴리펩타이드의 인산화 상태를 조절하는 효소 또는 이의 기능적 단편 또는 유도체의 능력을, 반응 혼합물에 시험될 물질을 첨가하지 않고 제3항 내지 제21항 중의 어느 한 항에 청구된 방법에 의해서 측정하는 단계,

    (b) 폴리펩타이드의 인산화 상태를 조절하는 효소 또는 이의 기능적 단편 또는 유도체의 능력을 반응 혼합물에 시험될 물질을 첨가하면서 제3항 내지 제21항 중의 어느 한 항에 청구된 방법에 의해서 측정하는 단계 및

    (c) 단계(a)로부터의 효소 능력과 단계(b)로부터의 효소 능력을 비교하는 단계를 사용하여, 폴리펩타이드의 인산화 상태를 조절하는 효소 또는 이의 기능적 단편 또는 유도체의 능력을 변형시키는 물질을 확인하는 방법.
23. 인슐린 비의존성 진성 당뇨병(NIDDM)의 치료용 약리학적 활성 물질을 확인하기 위한, 제21항에 따른 용도 또는 제21항 또는 제22항에 따른 방법.

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