JP2005523024A - プロテインキナーゼ及びホスファターゼ活性の測定法 - Google Patents
プロテインキナーゼ及びホスファターゼ活性の測定法 Download PDFInfo
- Publication number
- JP2005523024A JP2005523024A JP2003586374A JP2003586374A JP2005523024A JP 2005523024 A JP2005523024 A JP 2005523024A JP 2003586374 A JP2003586374 A JP 2003586374A JP 2003586374 A JP2003586374 A JP 2003586374A JP 2005523024 A JP2005523024 A JP 2005523024A
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- substrate
- enzyme
- measuring
- phosphorylated
- labeled
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Granted
Links
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 128
- 230000000694 effects Effects 0.000 title claims abstract description 87
- 102000001253 Protein Kinase Human genes 0.000 title description 10
- 108060006633 protein kinase Proteins 0.000 title description 10
- 102000045595 Phosphoprotein Phosphatases Human genes 0.000 title description 6
- 108700019535 Phosphoprotein Phosphatases Proteins 0.000 title description 6
- 239000000758 substrate Substances 0.000 claims abstract description 204
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 claims abstract description 116
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 claims abstract description 116
- 239000007850 fluorescent dye Substances 0.000 claims abstract description 69
- 230000026731 phosphorylation Effects 0.000 claims abstract description 55
- 238000006366 phosphorylation reaction Methods 0.000 claims abstract description 55
- 239000000975 dye Substances 0.000 claims abstract description 50
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 claims abstract description 37
- 238000012360 testing method Methods 0.000 claims abstract description 36
- 230000030609 dephosphorylation Effects 0.000 claims abstract description 34
- 238000006209 dephosphorylation reaction Methods 0.000 claims abstract description 34
- FZEYVTFCMJSGMP-UHFFFAOYSA-N acridone Chemical compound C1=CC=C2C(=O)C3=CC=CC=C3NC2=C1 FZEYVTFCMJSGMP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 30
- GDALETGZDYOOGB-UHFFFAOYSA-N Acridone Natural products C1=C(O)C=C2N(C)C3=CC=CC=C3C(=O)C2=C1O GDALETGZDYOOGB-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 28
- NRCMAYZCPIVABH-UHFFFAOYSA-N Quinacridone Chemical group N1C2=CC=CC=C2C(=O)C2=C1C=C1C(=O)C3=CC=CC=C3NC1=C2 NRCMAYZCPIVABH-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 26
- 238000012216 screening Methods 0.000 claims abstract description 14
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 claims description 68
- 108091000080 Phosphotransferase Proteins 0.000 claims description 34
- 102000020233 phosphotransferase Human genes 0.000 claims description 34
- 125000004429 atom Chemical group 0.000 claims description 30
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims description 30
- -1 cyano, amino Chemical group 0.000 claims description 29
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims description 29
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 24
- 150000001408 amides Chemical class 0.000 claims description 20
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 claims description 19
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 claims description 18
- 229910019142 PO4 Inorganic materials 0.000 claims description 17
- 239000010452 phosphate Substances 0.000 claims description 17
- NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K phosphate Chemical compound [O-]P([O-])([O-])=O NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K 0.000 claims description 17
- 108090000412 Protein-Tyrosine Kinases Proteins 0.000 claims description 16
- 102000004022 Protein-Tyrosine Kinases Human genes 0.000 claims description 16
- 102000004160 Phosphoric Monoester Hydrolases Human genes 0.000 claims description 15
- 108090000608 Phosphoric Monoester Hydrolases Proteins 0.000 claims description 15
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims description 14
- NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-N Phosphoric acid Chemical compound OP(O)(O)=O NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 12
- NINIDFKCEFEMDL-UHFFFAOYSA-N Sulfur Chemical compound [S] NINIDFKCEFEMDL-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 12
- QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-N Sulfuric acid Chemical compound OS(O)(=O)=O QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 12
- 125000003118 aryl group Chemical group 0.000 claims description 12
- QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N atomic oxygen Chemical compound [O] QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 12
- 230000008859 change Effects 0.000 claims description 12
- 125000001072 heteroaryl group Chemical group 0.000 claims description 12
- 238000005259 measurement Methods 0.000 claims description 12
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 claims description 12
- 229910052760 oxygen Inorganic materials 0.000 claims description 12
- 239000001301 oxygen Substances 0.000 claims description 12
- 239000011593 sulfur Substances 0.000 claims description 12
- 229910052717 sulfur Inorganic materials 0.000 claims description 12
- 125000003178 carboxy group Chemical group [H]OC(*)=O 0.000 claims description 9
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 claims description 9
- 125000002887 hydroxy group Chemical group [H]O* 0.000 claims description 8
- 125000002915 carbonyl group Chemical group [*:2]C([*:1])=O 0.000 claims description 7
- 230000007423 decrease Effects 0.000 claims description 7
- KAKKHKRHCKCAGH-UHFFFAOYSA-L disodium;(4-nitrophenyl) phosphate;hexahydrate Chemical compound O.O.O.O.O.O.[Na+].[Na+].[O-][N+](=O)C1=CC=C(OP([O-])([O-])=O)C=C1 KAKKHKRHCKCAGH-UHFFFAOYSA-L 0.000 claims description 7
- MTCFGRXMJLQNBG-REOHCLBHSA-N (2S)-2-Amino-3-hydroxypropansäure Chemical compound OC[C@H](N)C(O)=O MTCFGRXMJLQNBG-REOHCLBHSA-N 0.000 claims description 6
- OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N Carbon Chemical compound [C] OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 6
- AYFVYJQAPQTCCC-GBXIJSLDSA-N L-threonine Chemical compound C[C@@H](O)[C@H](N)C(O)=O AYFVYJQAPQTCCC-GBXIJSLDSA-N 0.000 claims description 6
- MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N Serine Natural products OCC(N)C(O)=O MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 6
- AYFVYJQAPQTCCC-UHFFFAOYSA-N Threonine Natural products CC(O)C(N)C(O)=O AYFVYJQAPQTCCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 6
- 239000004473 Threonine Substances 0.000 claims description 6
- 125000000217 alkyl group Chemical group 0.000 claims description 6
- 229910000147 aluminium phosphate Inorganic materials 0.000 claims description 6
- 125000003710 aryl alkyl group Chemical group 0.000 claims description 6
- 229910052799 carbon Inorganic materials 0.000 claims description 6
- 125000004432 carbon atom Chemical group C* 0.000 claims description 6
- 229910052736 halogen Inorganic materials 0.000 claims description 6
- 150000002367 halogens Chemical class 0.000 claims description 6
- 229910052739 hydrogen Inorganic materials 0.000 claims description 6
- 239000001257 hydrogen Substances 0.000 claims description 6
- 125000004435 hydrogen atom Chemical class [H]* 0.000 claims description 6
- 125000001453 quaternary ammonium group Chemical group 0.000 claims description 6
- 125000006850 spacer group Chemical group 0.000 claims description 6
- HNDVDQJCIGZPNO-YFKPBYRVSA-N L-histidine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CN=CN1 HNDVDQJCIGZPNO-YFKPBYRVSA-N 0.000 claims description 5
- HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N histidine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CN=CN1 HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 5
- 102000003886 Glycoproteins Human genes 0.000 claims description 4
- 108090000288 Glycoproteins Proteins 0.000 claims description 4
- 102000004895 Lipoproteins Human genes 0.000 claims description 4
- 108090001030 Lipoproteins Proteins 0.000 claims description 4
- 239000002253 acid Substances 0.000 claims description 4
- 125000005647 linker group Chemical group 0.000 claims description 4
- 125000002467 phosphate group Chemical group [H]OP(=O)(O[H])O[*] 0.000 claims description 4
- DCWXELXMIBXGTH-QMMMGPOBSA-N phosphonotyrosine Chemical group OC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=C(OP(O)(O)=O)C=C1 DCWXELXMIBXGTH-QMMMGPOBSA-N 0.000 claims description 4
- 108091005626 post-translationally modified proteins Proteins 0.000 claims description 4
- 102000035123 post-translationally modified proteins Human genes 0.000 claims description 4
- 239000007787 solid Substances 0.000 claims description 4
- 125000001493 tyrosinyl group Chemical group [H]OC1=C([H])C([H])=C(C([H])=C1[H])C([H])([H])C([H])(N([H])[H])C(*)=O 0.000 claims description 4
- LSNNMFCWUKXFEE-UHFFFAOYSA-M Bisulfite Chemical compound OS([O-])=O LSNNMFCWUKXFEE-UHFFFAOYSA-M 0.000 claims description 3
- 108010072039 Histidine kinase Proteins 0.000 claims description 3
- 101001059454 Homo sapiens Serine/threonine-protein kinase MARK2 Proteins 0.000 claims description 3
- OUYCCCASQSFEME-QMMMGPOBSA-N L-tyrosine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=C(O)C=C1 OUYCCCASQSFEME-QMMMGPOBSA-N 0.000 claims description 3
- ABLZXFCXXLZCGV-UHFFFAOYSA-N Phosphorous acid Chemical compound OP(O)=O ABLZXFCXXLZCGV-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 3
- OAICVXFJPJFONN-UHFFFAOYSA-N Phosphorus Chemical group [P] OAICVXFJPJFONN-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 3
- 102100028904 Serine/threonine-protein kinase MARK2 Human genes 0.000 claims description 3
- 125000004437 phosphorous atom Chemical group 0.000 claims description 3
- 229910052698 phosphorus Chemical group 0.000 claims description 3
- 239000011574 phosphorus Chemical group 0.000 claims description 3
- 125000000542 sulfonic acid group Chemical group 0.000 claims description 3
- 239000013592 cell lysate Substances 0.000 claims description 2
- 239000004615 ingredient Substances 0.000 claims description 2
- 239000007788 liquid Substances 0.000 claims description 2
- 238000004904 shortening Methods 0.000 claims description 2
- OUYCCCASQSFEME-UHFFFAOYSA-N tyrosine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CC=C(O)C=C1 OUYCCCASQSFEME-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- 239000013543 active substance Substances 0.000 claims 2
- 230000002596 correlated effect Effects 0.000 claims 1
- 150000003668 tyrosines Chemical class 0.000 claims 1
- 238000003556 assay Methods 0.000 abstract description 26
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 abstract 1
- BHEPBYXIRTUNPN-UHFFFAOYSA-N hydridophosphorus(.) (triplet) Chemical compound [PH] BHEPBYXIRTUNPN-UHFFFAOYSA-N 0.000 abstract 1
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 35
- 239000000047 product Substances 0.000 description 35
- IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N Dimethylsulphoxide Chemical compound CS(C)=O IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 25
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 20
- 238000002372 labelling Methods 0.000 description 20
- KISWVXRQTGLFGD-UHFFFAOYSA-N 2-[[2-[[6-amino-2-[[2-[[2-[[5-amino-2-[[2-[[1-[2-[[6-amino-2-[(2,5-diamino-5-oxopentanoyl)amino]hexanoyl]amino]-5-(diaminomethylideneamino)pentanoyl]pyrrolidine-2-carbonyl]amino]-3-hydroxypropanoyl]amino]-5-oxopentanoyl]amino]-5-(diaminomethylideneamino)p Chemical compound C1CCN(C(=O)C(CCCN=C(N)N)NC(=O)C(CCCCN)NC(=O)C(N)CCC(N)=O)C1C(=O)NC(CO)C(=O)NC(CCC(N)=O)C(=O)NC(CCCN=C(N)N)C(=O)NC(CO)C(=O)NC(CCCCN)C(=O)NC(C(=O)NC(CC(C)C)C(O)=O)CC1=CC=C(O)C=C1 KISWVXRQTGLFGD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 17
- 239000011347 resin Substances 0.000 description 15
- 229920005989 resin Polymers 0.000 description 15
- 239000007993 MOPS buffer Substances 0.000 description 14
- 102000047918 Myelin Basic Human genes 0.000 description 14
- 101710107068 Myelin basic protein Proteins 0.000 description 14
- DTQVDTLACAAQTR-UHFFFAOYSA-N Trifluoroacetic acid Chemical compound OC(=O)C(F)(F)F DTQVDTLACAAQTR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 12
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 12
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 11
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 11
- WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N Acetonitrile Chemical compound CC#N WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 9
- HKSZLNNOFSGOKW-UHFFFAOYSA-N ent-staurosporine Natural products C12=C3N4C5=CC=CC=C5C3=C3CNC(=O)C3=C2C2=CC=CC=C2N1C1CC(NC)C(OC)C4(C)O1 HKSZLNNOFSGOKW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 9
- 239000011541 reaction mixture Substances 0.000 description 9
- HKSZLNNOFSGOKW-FYTWVXJKSA-N staurosporine Chemical compound C12=C3N4C5=CC=CC=C5C3=C3CNC(=O)C3=C2C2=CC=CC=C2N1[C@H]1C[C@@H](NC)[C@@H](OC)[C@]4(C)O1 HKSZLNNOFSGOKW-FYTWVXJKSA-N 0.000 description 9
- CGPUWJWCVCFERF-UHFFFAOYSA-N staurosporine Natural products C12=C3N4C5=CC=CC=C5C3=C3CNC(=O)C3=C2C2=CC=CC=C2N1C1CC(NC)C(OC)C4(OC)O1 CGPUWJWCVCFERF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 9
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 8
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- 239000007983 Tris buffer Substances 0.000 description 7
- YMWUJEATGCHHMB-UHFFFAOYSA-N Dichloromethane Chemical compound ClCCl YMWUJEATGCHHMB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- RTZKZFJDLAIYFH-UHFFFAOYSA-N Diethyl ether Chemical compound CCOCC RTZKZFJDLAIYFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N Methanol Chemical compound OC OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 6
- 125000000524 functional group Chemical group 0.000 description 6
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 6
- 230000008569 process Effects 0.000 description 6
- 239000007790 solid phase Substances 0.000 description 6
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 6
- 238000006911 enzymatic reaction Methods 0.000 description 5
- 238000003384 imaging method Methods 0.000 description 5
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 5
- 238000000021 kinase assay Methods 0.000 description 5
- LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N tris Chemical compound OCC(N)(CO)CO LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- JGFZNNIVVJXRND-UHFFFAOYSA-N N,N-Diisopropylethylamine (DIPEA) Chemical compound CCN(C(C)C)C(C)C JGFZNNIVVJXRND-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- WCUXLLCKKVVCTQ-UHFFFAOYSA-M Potassium chloride Chemical compound [Cl-].[K+] WCUXLLCKKVVCTQ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 4
- 108090000315 Protein Kinase C Proteins 0.000 description 4
- 102000003923 Protein Kinase C Human genes 0.000 description 4
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 4
- 230000036962 time dependent Effects 0.000 description 4
- 238000002877 time resolved fluorescence resonance energy transfer Methods 0.000 description 4
- 230000032258 transport Effects 0.000 description 4
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical group OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 239000007995 HEPES buffer Substances 0.000 description 3
- 102000036243 Lymphocyte Specific Protein Tyrosine Kinase p56(lck) Human genes 0.000 description 3
- 108010002481 Lymphocyte Specific Protein Tyrosine Kinase p56(lck) Proteins 0.000 description 3
- 102000002727 Protein Tyrosine Phosphatase Human genes 0.000 description 3
- 239000012131 assay buffer Substances 0.000 description 3
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 3
- 210000000170 cell membrane Anatomy 0.000 description 3
- 239000007979 citrate buffer Substances 0.000 description 3
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 3
- 238000010168 coupling process Methods 0.000 description 3
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 3
- 238000001506 fluorescence spectroscopy Methods 0.000 description 3
- 238000004128 high performance liquid chromatography Methods 0.000 description 3
- RAXXELZNTBOGNW-UHFFFAOYSA-N imidazole Natural products C1=CNC=N1 RAXXELZNTBOGNW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 3
- 238000010647 peptide synthesis reaction Methods 0.000 description 3
- 239000012071 phase Substances 0.000 description 3
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 description 3
- 230000009822 protein phosphorylation Effects 0.000 description 3
- 108020000494 protein-tyrosine phosphatase Proteins 0.000 description 3
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 3
- 230000010076 replication Effects 0.000 description 3
- 238000004007 reversed phase HPLC Methods 0.000 description 3
- 238000012552 review Methods 0.000 description 3
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 3
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 3
- ZGYICYBLPGRURT-UHFFFAOYSA-N tri(propan-2-yl)silicon Chemical compound CC(C)[Si](C(C)C)C(C)C ZGYICYBLPGRURT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- JKMHFZQWWAIEOD-UHFFFAOYSA-N 2-[4-(2-hydroxyethyl)piperazin-1-yl]ethanesulfonic acid Chemical compound OCC[NH+]1CCN(CCS([O-])(=O)=O)CC1 JKMHFZQWWAIEOD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- WHUUTDBJXJRKMK-VKHMYHEASA-N L-glutamic acid Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(O)=O WHUUTDBJXJRKMK-VKHMYHEASA-N 0.000 description 2
- 101150018665 MAPK3 gene Proteins 0.000 description 2
- 230000001464 adherent effect Effects 0.000 description 2
- 210000004102 animal cell Anatomy 0.000 description 2
- 230000003197 catalytic effect Effects 0.000 description 2
- 230000008878 coupling Effects 0.000 description 2
- 238000005859 coupling reaction Methods 0.000 description 2
- 239000013058 crude material Substances 0.000 description 2
- 238000010511 deprotection reaction Methods 0.000 description 2
- 238000011161 development Methods 0.000 description 2
- VHJLVAABSRFDPM-QWWZWVQMSA-N dithiothreitol Chemical compound SC[C@@H](O)[C@H](O)CS VHJLVAABSRFDPM-QWWZWVQMSA-N 0.000 description 2
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 2
- 150000002148 esters Chemical class 0.000 description 2
- 238000001917 fluorescence detection Methods 0.000 description 2
- 238000002875 fluorescence polarization Methods 0.000 description 2
- 150000004676 glycans Chemical class 0.000 description 2
- FUZZWVXGSFPDMH-UHFFFAOYSA-N hexanoic acid Chemical compound CCCCCC(O)=O FUZZWVXGSFPDMH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 2
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 2
- 239000003112 inhibitor Substances 0.000 description 2
- 239000003999 initiator Substances 0.000 description 2
- 230000010189 intracellular transport Effects 0.000 description 2
- 238000004949 mass spectrometry Methods 0.000 description 2
- 230000004060 metabolic process Effects 0.000 description 2
- 108091005981 phosphorylated proteins Proteins 0.000 description 2
- 239000000049 pigment Substances 0.000 description 2
- 229920001282 polysaccharide Polymers 0.000 description 2
- 239000005017 polysaccharide Substances 0.000 description 2
- 239000001103 potassium chloride Substances 0.000 description 2
- 235000011164 potassium chloride Nutrition 0.000 description 2
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 description 2
- 125000002924 primary amino group Chemical group [H]N([H])* 0.000 description 2
- 238000002731 protein assay Methods 0.000 description 2
- 238000011002 quantification Methods 0.000 description 2
- 230000002285 radioactive effect Effects 0.000 description 2
- 238000000163 radioactive labelling Methods 0.000 description 2
- 239000011535 reaction buffer Substances 0.000 description 2
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 2
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 2
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 2
- 150000003573 thiols Chemical class 0.000 description 2
- WGJUFIXHTBAMBX-BYPYZUCNSA-N (2s)-2,6,6-triaminohexanoic acid Chemical group NC(N)CCC[C@H](N)C(O)=O WGJUFIXHTBAMBX-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 1
- HMWAJFNEGAJETK-UHFFFAOYSA-N 1-[6-(dimethylamino)naphthalen-2-yl]prop-2-en-1-one Chemical compound C1=C(C(=O)C=C)C=CC2=CC(N(C)C)=CC=C21 HMWAJFNEGAJETK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- IHDBZCJYSHDCKF-UHFFFAOYSA-N 4,6-dichlorotriazine Chemical compound ClC1=CC(Cl)=NN=N1 IHDBZCJYSHDCKF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 1
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 1
- 108010026870 Calcium-Calmodulin-Dependent Protein Kinases Proteins 0.000 description 1
- 102000019025 Calcium-Calmodulin-Dependent Protein Kinases Human genes 0.000 description 1
- BVKZGUZCCUSVTD-UHFFFAOYSA-L Carbonate Chemical compound [O-]C([O-])=O BVKZGUZCCUSVTD-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 241000282693 Cercopithecidae Species 0.000 description 1
- 102000008130 Cyclic AMP-Dependent Protein Kinases Human genes 0.000 description 1
- 108010049894 Cyclic AMP-Dependent Protein Kinases Proteins 0.000 description 1
- IVOMOUWHDPKRLL-KQYNXXCUSA-N Cyclic adenosine monophosphate Chemical compound C([C@H]1O2)OP(O)(=O)O[C@H]1[C@@H](O)[C@@H]2N1C(N=CN=C2N)=C2N=C1 IVOMOUWHDPKRLL-KQYNXXCUSA-N 0.000 description 1
- 241000196324 Embryophyta Species 0.000 description 1
- 241000233866 Fungi Species 0.000 description 1
- 241000282414 Homo sapiens Species 0.000 description 1
- KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N Lysine Natural products NCCCCC(N)C(O)=O KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000004472 Lysine Substances 0.000 description 1
- PEEHTFAAVSWFBL-UHFFFAOYSA-N Maleimide Chemical compound O=C1NC(=O)C=C1 PEEHTFAAVSWFBL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000124008 Mammalia Species 0.000 description 1
- BZQFBWGGLXLEPQ-UHFFFAOYSA-N O-phosphoryl-L-serine Natural products OC(=O)C(N)COP(O)(O)=O BZQFBWGGLXLEPQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010064071 Phosphorylase Kinase Proteins 0.000 description 1
- 102000014750 Phosphorylase Kinase Human genes 0.000 description 1
- 108010065084 Phosphorylase a Proteins 0.000 description 1
- 108010065081 Phosphorylase b Proteins 0.000 description 1
- 241000283984 Rodentia Species 0.000 description 1
- IVOMOUWHDPKRLL-UHFFFAOYSA-N UNPD107823 Natural products O1C2COP(O)(=O)OC2C(O)C1N1C(N=CN=C2N)=C2N=C1 IVOMOUWHDPKRLL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 1
- 230000006978 adaptation Effects 0.000 description 1
- 150000001299 aldehydes Chemical class 0.000 description 1
- 150000001412 amines Chemical class 0.000 description 1
- 239000012062 aqueous buffer Substances 0.000 description 1
- 238000002820 assay format Methods 0.000 description 1
- 230000004071 biological effect Effects 0.000 description 1
- 239000013060 biological fluid Substances 0.000 description 1
- 210000004556 brain Anatomy 0.000 description 1
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 description 1
- 150000001718 carbodiimides Chemical class 0.000 description 1
- 238000000423 cell based assay Methods 0.000 description 1
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 1
- 239000006143 cell culture medium Substances 0.000 description 1
- 238000012832 cell culture technique Methods 0.000 description 1
- 230000032823 cell division Effects 0.000 description 1
- 230000003915 cell function Effects 0.000 description 1
- 230000010261 cell growth Effects 0.000 description 1
- 238000007385 chemical modification Methods 0.000 description 1
- 239000007795 chemical reaction product Substances 0.000 description 1
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 1
- 238000002967 competitive immunoassay Methods 0.000 description 1
- 238000003271 compound fluorescence assay Methods 0.000 description 1
- 210000004748 cultured cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000012258 culturing Methods 0.000 description 1
- 229940095074 cyclic amp Drugs 0.000 description 1
- 229950006137 dexfosfoserine Drugs 0.000 description 1
- 238000000502 dialysis Methods 0.000 description 1
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 1
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 1
- 125000002228 disulfide group Chemical group 0.000 description 1
- AFOSIXZFDONLBT-UHFFFAOYSA-N divinyl sulfone Chemical compound C=CS(=O)(=O)C=C AFOSIXZFDONLBT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 231100000673 dose–response relationship Toxicity 0.000 description 1
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 1
- 230000009977 dual effect Effects 0.000 description 1
- 230000004064 dysfunction Effects 0.000 description 1
- 210000003038 endothelium Anatomy 0.000 description 1
- 239000002532 enzyme inhibitor Substances 0.000 description 1
- 210000000981 epithelium Anatomy 0.000 description 1
- SFNALCNOMXIBKG-UHFFFAOYSA-N ethylene glycol monododecyl ether Chemical compound CCCCCCCCCCCCOCCO SFNALCNOMXIBKG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 210000003527 eukaryotic cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000005281 excited state Effects 0.000 description 1
- 238000002270 exclusion chromatography Methods 0.000 description 1
- 239000012894 fetal calf serum Substances 0.000 description 1
- 238000002060 fluorescence correlation spectroscopy Methods 0.000 description 1
- 238000002795 fluorescence method Methods 0.000 description 1
- 238000012632 fluorescent imaging Methods 0.000 description 1
- 238000001215 fluorescent labelling Methods 0.000 description 1
- 239000007789 gas Substances 0.000 description 1
- 150000004820 halides Chemical class 0.000 description 1
- 210000002216 heart Anatomy 0.000 description 1
- 238000012188 high-throughput screening assay Methods 0.000 description 1
- 238000000099 in vitro assay Methods 0.000 description 1
- 238000010348 incorporation Methods 0.000 description 1
- 150000004001 inositols Chemical class 0.000 description 1
- 230000006525 intracellular process Effects 0.000 description 1
- 150000002500 ions Chemical class 0.000 description 1
- 150000002540 isothiocyanates Chemical class 0.000 description 1
- 150000002576 ketones Chemical class 0.000 description 1
- 210000003734 kidney Anatomy 0.000 description 1
- 150000002632 lipids Chemical class 0.000 description 1
- 210000004185 liver Anatomy 0.000 description 1
- 210000004072 lung Anatomy 0.000 description 1
- 238000012423 maintenance Methods 0.000 description 1
- 125000005439 maleimidyl group Chemical group C1(C=CC(N1*)=O)=O 0.000 description 1
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 1
- 238000001840 matrix-assisted laser desorption--ionisation time-of-flight mass spectrometry Methods 0.000 description 1
- 238000000691 measurement method Methods 0.000 description 1
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 1
- 229910021645 metal ion Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 1
- 238000012544 monitoring process Methods 0.000 description 1
- 150000002772 monosaccharides Chemical class 0.000 description 1
- 238000007837 multiplex assay Methods 0.000 description 1
- 210000003205 muscle Anatomy 0.000 description 1
- 239000006225 natural substrate Substances 0.000 description 1
- 108010091748 peptide A Proteins 0.000 description 1
- 239000008363 phosphate buffer Substances 0.000 description 1
- FDIKHVQUPVCJFA-UHFFFAOYSA-N phosphohistidine Chemical compound OP(=O)(O)NC(C(=O)O)CC1=CN=CN1 FDIKHVQUPVCJFA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 150000003906 phosphoinositides Chemical class 0.000 description 1
- 150000003904 phospholipids Chemical class 0.000 description 1
- 150000003014 phosphoric acid esters Chemical class 0.000 description 1
- BZQFBWGGLXLEPQ-REOHCLBHSA-N phosphoserine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)COP(O)(O)=O BZQFBWGGLXLEPQ-REOHCLBHSA-N 0.000 description 1
- USRGIUJOYOXOQJ-GBXIJSLDSA-N phosphothreonine Chemical compound OP(=O)(O)O[C@H](C)[C@H](N)C(O)=O USRGIUJOYOXOQJ-GBXIJSLDSA-N 0.000 description 1
- DCWXELXMIBXGTH-UHFFFAOYSA-N phosphotyrosine Chemical compound OC(=O)C(N)CC1=CC=C(OP(O)(O)=O)C=C1 DCWXELXMIBXGTH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 1
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 1
- 238000010791 quenching Methods 0.000 description 1
- 230000000171 quenching effect Effects 0.000 description 1
- 238000007420 radioactive assay Methods 0.000 description 1
- 239000012070 reactive reagent Substances 0.000 description 1
- 230000008844 regulatory mechanism Effects 0.000 description 1
- 238000011160 research Methods 0.000 description 1
- 230000002441 reversible effect Effects 0.000 description 1
- 239000012266 salt solution Substances 0.000 description 1
- 238000007423 screening assay Methods 0.000 description 1
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 1
- 125000003607 serino group Chemical group [H]N([H])[C@]([H])(C(=O)[*])C(O[H])([H])[H] 0.000 description 1
- 239000004017 serum-free culture medium Substances 0.000 description 1
- 230000019491 signal transduction Effects 0.000 description 1
- 210000003491 skin Anatomy 0.000 description 1
- 241000894007 species Species 0.000 description 1
- 230000003595 spectral effect Effects 0.000 description 1
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 1
- 239000013076 target substance Substances 0.000 description 1
- 230000002123 temporal effect Effects 0.000 description 1
- 125000003396 thiol group Chemical group [H]S* 0.000 description 1
- 150000003580 thiophosphoric acid esters Chemical class 0.000 description 1
- 231100000027 toxicology Toxicity 0.000 description 1
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 1
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 1
- 238000013519 translation Methods 0.000 description 1
- 230000014616 translation Effects 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/48—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving transferase
- C12Q1/485—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving transferase involving kinase
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/34—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving hydrolase
- C12Q1/42—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving hydrolase involving phosphatase
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Zoology (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Immunology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
- Investigating Or Analysing Materials By The Use Of Chemical Reactions (AREA)
- Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
- Enzymes And Modification Thereof (AREA)
Abstract
【解決手段】 基質は酵素によるリン酸化又は脱リン酸化を受けて産物を生じ得る1以上の部分を含んでなり、蛍光色素で標識されていて、色素標識基質のリン酸化により、又は色素標識リン酸化基質の脱リン酸化により、蛍光強度及び蛍光寿命の変化を示し得るものである。好ましい実施形態において、基質はアクリドン及びキナクリドン群の色素から選択される蛍光色素で標識されている。本発明はまた測定すべき酵素のリン酸化又は脱リン酸化活性に影響を与える試験作用物質のスクリーニング法を提供する。
Description
i)蛍光標識基質の蛍光強度と蛍光寿命を測定する工程;
ii)酵素と基質分子とをリン酸供与体の存在下に結合させる工程;及び
iii)工程ii)の結合に続いて、蛍光標識の蛍光強度と蛍光寿命における変化を測定する工程;
からなり、蛍光標識の蛍光強度と蛍光寿命における変化を酵素のリン酸化活性測定に使用する、方法が提供される。
i)蛍光標識基質の蛍光強度を測定する工程;
ii)酵素と基質分子とをリン酸供与体の存在下に結合させる工程;及び
iii)工程ii)の結合に続いて、蛍光標識の蛍光強度の増加を測定する工程;
からなり、蛍光標識の蛍光強度の増加を酵素のリン酸化活性測定に使用する、方法が提供される。
i)蛍光標識基質の蛍光強度と蛍光寿命を測定する工程;
ii)酵素と基質分子とを結合させて産物を生じさせる工程;及び
iii)工程ii)の結合に続いて、蛍光強度と蛍光寿命における変化を測定する工程;
からなり、蛍光標識の蛍光強度と蛍光寿命における変化を酵素の脱リン酸化活性測定に使用する、方法が提供される。
i)蛍光標識基質の蛍光強度を測定する工程;
ii)酵素と基質分子とを結合させて産物を生じさせる工程;及び
iii)工程ii)の結合に続いて、蛍光強度の低下を測定する工程;
からなり、蛍光標識の蛍光強度の低下を酵素の脱リン酸化活性測定に使用する、方法が提供される。
基R2及びR3はZ1環構造に結合しており、基R4及びR5はZ2環構造に結合している;
Z1及びZ2は独立して1又は2つの縮合環芳香族又はへテロ芳香族系を完結するために必要な原子を表し、各環は複数の炭素原子から選択される5又は6個の原子と選択肢として酸素、窒素及びイオウから選択される2個を超えない原子を有する;
R1、R2、R3、R4及びR5は独立して水素、ハロゲン、アミド、ヒドロキシル、シアノ、アミノ、モノ−もしくはジ−C1〜C4アルキル置換アミノ、スルフィドリル、カルボニル、C1〜C6アルコキシ、アリール、ヘテロアリール、C1〜C20アルキル、アラルキル;基−E−F(ただし、Eは炭素、窒素、酸素、イオウ及びリン原子からなる基から選択される1〜60個の原子鎖をもつスペーサーであり、Fは標的結合基である);及び基−(CH2)nY(ただし、Yはスルホン酸、硫酸、ホスホン酸、リン酸、四級アンモニウム及びカルボキシルから選択され、nはゼロ又は1〜6の整数である)から選択される)
で示される色素である。
基R3及びR4はZ1環構造に結合しており、基R5及びR6はZ2環構造に結合している;
Z1及びZ2は独立して1又は2つの縮合環芳香族又はへテロ芳香族系を完結するために必要な原子を表し、各環は複数の炭素原子から選択される5又は6個の原子と選択肢として酸素、窒素及びイオウから選択される2個を超えない原子を有する;
R1、R2、R3、R4、R5、R6、R7及びR8は独立して水素、ハロゲン、アミド、ヒドロキシル、シアノ、アミノ、モノ−もしくはジ−C1〜C4アルキル置換アミノ、スルフィドリル、カルボニル、カルボキシル、C1〜C6アルコキシ、アリール、ヘテロアリール、C1〜C20アルキル、アラルキル;基−E−F(ただし、Eは炭素、窒素、酸素、イオウ及びリン原子からなる基から選択される1〜60個の原子鎖をもつスペーサーであり、Fは標的結合基である);及び基−(CH2)nY(ただし、Yはスルホン酸、硫酸、ホスホン酸、リン酸、四級アンモニウム及びカルボキシルから選択され、nはゼロ又は1ないし6の整数である)から選択される)
で示される色素である。
i)無細胞環境における蛍光標識基質の蛍光強度と蛍光寿命を測定する工程;
ii)液体培地中1個以上の細胞に基質を加える工程;及び
iii)工程ii)に続いて、蛍光標識の蛍光強度と蛍光寿命を測定する工程;
からなり、蛍光強度と蛍光寿命の変化を基質のリン酸化状態を示すために使用する、方法が提供される。
i)蛍光標識基質それぞれの蛍光強度と蛍光寿命を測定する工程;
ii)リン酸源の存在下に酵素の混合物と各基質分子とを結合する工程;及び
iii)工程ii)に続いて、各蛍光標識の蛍光強度と蛍光寿命の増加を測定する工程;
からなり、各蛍光標識の蛍光強度と蛍光寿命の増加を各酵素のリン酸化活性の定量に使用する、方法が提供される。
i)キナーゼ酵素に対する基質であって、基質が酵素によりリン酸化されてリン酸化産物を生じ得る1以上の部分を含んでなり、かつ基質がアクリドン及びキナクリドン群の色素から選択される蛍光色素で標識されている基質;及び
ii)リン酸供与体及びキナーゼから選択される成分;
を含んでなる組成物が提供される。
i)各基質がリン酸化されて産物を生じ得る部分を含んでなり、かつ各基質がアクリドン及びキナクリドン群の色素から選択される蛍光色素セットの異なる1つにより標識されている1種以上の異なる基質;及び選択肢として、
ii)各酵素が異なる基質に特異的な1種以上の異なる酵素;
を含んでなる試験キットが提供される。
i)各基質が脱リン酸化されて産物を生じ得るリン酸化部分を含んでなり、かつ各基質がアクリドン及びキナクリドン群の色素から選択される蛍光色素セットの異なる1つにより標識されている1種以上の異なる基質;及び選択肢として、
ii)各酵素が異なる基質に特異的な1種以上の異なる酵素;
を含んでなる試験キットが提供される。
本発明は必要とされる工程数を減らすことにより通常のアッセイ方式を簡略化するものである。通常の(放射活性に基づく)キナーゼアッセイにおいて、リン酸供与体の濃度は最適な濃度で利用することができない。例えば、放射活性アッセイにおいて、ATP濃度は多くの場合Kmの1/10であり得る(一般的には1〜10μM)が、一方、キナーゼアッセイは通常ATPのKmの2倍以上で実施することが推奨されている。本発明では、ATP濃度は読み出しに影響することがなく、従って、蛍光読取り方法に関わりなく、アッセイの最適レベルで利用することができる。
1.1 H−Glu−Ala−Ile−Tyr−Ala−Ala−Pro−Phe−Ala−Lys−Lys−Lys−リンク・アミド樹脂;H−Glu−Ala−Ile−Tyr(PO 3 H 2 )−Ala−Ala−Pro−Phe−Ala−Lys−Lys−Lys−リンク・アミド樹脂
H−Glu−Ala−Ile−Tyr−Ala−Ala−Pro−Phe−Ala−Lys−Lys−Lys−リンク・アミド樹脂及びH−Glu−Ala−Ile−Tyr(PO3H2)−Ala−Ala−Pro−Phe−Ala−Lys−Lys−Lys−リンク・アミド樹脂は、市販入手可能なアプライド・バイオシステムズ・モデル433A自動ペプチド合成機とファストモック(FastMoc)(商標)化学を用いて、全工程、機器製造業者の推奨手法に従い合成した。合成は両方とも、0.25ミリモルスケールで実施した。
粗製のペプチドは、95%トリフルオロ酢酸:2.5%水:2.5%トリイソプロピルシランの混合物を用いて脱保護し、固相から切断した。切断反応から得られた粗製のペプチドは常套のC−18逆相HPLCにより、直線勾配の水/アセトニトリル(双方0.1%トリフルオロ酢酸含有)を用いて精製した。精製後、ペプチドを凍結し、マルディ(Maldi)TOFマススペクトル法及びHPLCにより特性化した。
本品はH−Glu−Ala−Ile−Tyr(PO3H2)−Ala−Ala−Pro−Phe−Ala−Lys−Lys−Lys−リンク・アミド樹脂を用い、上記の1.2と同様に調製した。
H−Glu−Ala−Ile−Tyr−Ala−Ala−Pro−Phe−Ala−Lys−Lys−Lys−リンク・アミド樹脂は、N−末端において、固相上、O−(N−スクシニミジル)−6−(9−オキソ−9H−アクリジン−10イル)ヘキサノエート(1.5当量)(アマーシャム・バイオサイエンス)により、ジメチルスルホキシド及びジイソプロピルエチルアミン(4%容量)中、室温で一夜、標識した。樹脂はDMSOと、次いでメタノール、最後にジクロロメタンで洗浄し、次いで、減圧下乾燥した。標識したペプチドは、95%トリフルオロ酢酸:2.5%水:2.5%トリイソプロピルシランの混合物を用いて脱保護し、固相から切断した。粗製物質を冷ジエチルエーテルからの沈殿により単離し、C−18逆相HPLCにより、直線勾配の水/アセトニトリル(双方0.1%トリフルオロ酢酸含有)を用いて精製した。精製後、モノ標識ペプチドを凍結し、マルディTOFマススペクトル法、UV及びHPLCにより特性化した。
本品は上記1.4同様に調製したが、ただし、H−Glu−Ala−Ile−Tyr(PO3H2)−Ala−Ala−Pro−Phe−Ala−Lys−Lys−Lys−リンク・アミド樹脂を使用した。
i)方法1
MBP100mg(100mg;7mg/ml)を0.1mのNaHCO3溶液中、+4℃で一夜、透析した。O−(N−スクシニミジル)−6−(9−オキソ−9H−アクリジン−10イル)ヘキサノエート(10mg)をDMSO(アルドリッチ)1mlに溶かし、透析したMBPサンプルに加えた。得られた混合物を45分間撹拌した。10本のPD10カラム(アマーシャム・バイオサイエンス)を10mlの10mM−MOPS(pH7.2)で平衡化した。標識したMBP(1.3ml分割部)を各カラムに加え、カラムを10mM−MOPS(1ml)で洗浄した。各カラムを3mlの10mM−MOPSで溶出し、溶出液をプールした。最終のタンパク質濃度はBSAを基準(0.1mg/ml)として、バイオラッド・プロテイン・アッセイ(500−006)により決定した。MBPの最終濃度は全容量30mlにおいて1.44mg/mlであった。標識したMBPはアミコン・セントリプレップス(Amicon Centripreps)YM−10(10,000NMWL)(15分間回転)により濃縮した。引続くタンパク質定量では濃度4.5mg/ml(7.1ml)であった。アクリドン標識MBPは、500mM−MOPS(pH7.2)、50mM−MgCl2、1mM−ATP及びPF−H2Oにより、濃度16.6μMに希釈した。
MBP(100mg;7mg/ml)をPBS溶液(0.01Mリン酸バッファー、0.0027M塩化カリウム及び0.137M塩化ナトリウム;pH7.4)(シグマP−4417)中、+4℃で一夜、透析した。O−(N−スクシニミジル)−6−(9−オキソ−9H−アクリジン−10イル)ヘキサノエート(10mg)をDMSO(アルドリッチ)1mlに溶かし、透析したMBPに加えた。この混合物を+4℃で一夜ローラー混合した。10本のPD10カラム(アマーシャム・バイオサイエンス)を10mlの10mM−MOPS(pH7.2)で平衡化した。標識したMBP1.3ml分割部分を各カラムに加え、各カラムをさらに1mlの10mM−MOPSで洗浄した。各カラムを3mlの10mM−MOPSで溶出し、溶出液をプールした。タンパク質濃度はBSAを基準(0.1mg/ml)として、バイオラッド・プロテイン・アッセイ(500−006)により決定した。標識したMBPの濃度は全容量28mlにおいて1.4mg/mlであることが分かった。標識したMBPはアミコン・セントリプレップスYM−10(10,000NMWL)(10分間回転)により濃縮した。引続くタンパク質定量では総容量9.7ml中、3.25mg/mlの濃度を示した。色素標識MBPは、500mM−MOPS(pH7.2)、50mM−MgCl2、1mM−ATP及びPF−H2Oにより、濃度16.6μMに希釈した。
3.1 H−Glu−Pro−Glu−Gly−Ile−Tyr−Gly−Val−Leu−Phe−リンク・アミド樹脂(Lckキナーゼ基質);H−Glu−Pro−Glu−Gly−Ile−Tyr(PO 3 H 2 )−Gly−Val−Leu−Phe−リンク・アミド樹脂
H−Glu−Pro−Glu−Gly−Ile−Tyr−Gly−Val−Leu−Phe−リンク・アミド樹脂及びH−Glu−Pro−Glu−Gly−Ile−Tyr(PO3H2)−Gly−Val−Leu−Phe−リンク・アミド樹脂は、市販入手可能なアプライド・バイオシステムズ・モデル433A自動ペプチド合成機とファストモック (商標)化学を用いて、全工程、機器製造業者の推奨手法に従い合成した。合成は0.25ミリモルスケールで実施した。
H−Glu−Pro−Glu−Gly−Ile−Tyr−Gly−Val−Leu−Phe−リンク・アミド樹脂は、N−末端において、固相上、O−(N−スクシニミジル)−6−(9−オキソ−9H−アクリジン−10イル)ヘキサノエート(1.5当量)(アマーシャム・バイオサイエンス)により、ジメチルスルホキシド及びジイソプロピルエチルアミン(4容量%)中、室温で一夜、標識した。樹脂はDMSOと、次いでメタノール、最後にジクロロメタンで洗浄し、次いで、減圧下乾燥した。標識したペプチドは、95%トリフルオロ酢酸:2.5%水:2.5%トリイソプロピルシランの混合物を用いて脱保護し、固相から切断した。粗製物質を冷ジエチルエーテルからの沈殿により単離し、C−18逆相HPLCにより、直線勾配の水/アセトニトリル(双方0.1%トリフルオロ酢酸含有)を用いて精製した。精製後、モノ標識ペプチドを凍結し、マルディTOFマススペクトル法、UV及びHPLCにより特性化した。
本品は上記3.2同様に調製したが、ただし、H−Glu−Pro−Glu−Gly−Ile−Tyr(PO3H2)−Gly−Val−Leu−Phe−リンク・アミド樹脂を使用した。
これらの合成は実施例3.2に記載した通りに実施したが、ただし、O−(N−スクシニミジル)−6−(9−オキソ−9H−アクリジン−10イル)ヘキサノエート(Ace−14)の代わりにO−(N−スクシニミジル)−6−(2−アセトアミド−9−オキソ−9H−アクリジン−10イル)ヘキサノエート(Ace−17)を使用した。
これらの合成は実施例3.2に記載した通りに実施したが、ただし、H−Thr−Arg−Asp−Ile−Tyr(PO3H2)−Glu−Thr−Asp−リンク・アミド樹脂を使用した。非リン酸化ペプチドは同様の方法で合成した。
リン酸化及び非リン酸化形状のAblペプチドの1μM溶液を10mM−MOPSバッファー(pH7.2)中で調製した。溶液の蛍光強度と寿命を比較した。
2つのペプチド間に明確な差が認められる。非リン酸化ペプチドの強度が約7×104rfuであるのに対し、リン酸化ペプチドの強度は約9×104rfuであった。また、非リン酸化ペプチドの寿命が約10ナノ秒であるのに対し、リン酸化ペプチドの寿命は15ナノ秒であった。図1参照。
Ablの反応混合物は、1mlの反応バッファー(50mMトリス−HCl、10mM−MgCl2、1mM−EGTA、2mMジチオスレイトール(pH7.5、25℃))、10μlの10mM−ATP、2μlの6−(9−オキソ−9H−アクリジン−10イル)ヘキサノエート標識Ablペプチド基質(非リン酸化)(DMSO中500μM)を混合し、調製した。この混合物100μlをブラック平底マイクロタイタープレートのウエルに入れた。予め反応バッファー(50mMトリス−HCl、10mM−MgCl2、1mM−EGTA、2mMジチオスレイトール、0.01%Brij35(pH7.5、25℃))に10μlあたり100単位の濃度に希釈したAblキナーゼ(ニューイングランド・バイオラボ、コードP6050Lロット5)(100,000単位/ml又は100単位/μl)10μlを添加することにより反応を開始した。
図2に示すように、反応の進行は実時間でモニターし得る。特に、生成物の強度変化は、単離ペプチドの検討から予測したように、基質の強度変化よりも大きい。さらに、この反応は分離工程がなくとも実施可能であり、またそれぞれの蛍光寿命に基づいて、基質と生成物を識別することが可能である。
O−(N−スクシニミジル)−6−(9−オキソ−9H−アクリジン−10イル)ヘキサノエートにより標識したミエリン塩基性タンパク質(MBP)(実施例2、方法1により調製)(1ml)を水で10mlに希釈し、50mM−MOPS(pH7.2)、5nM−MgCl2、100μM−ATP及び1.66μM−MBP含有溶液を得た。7部分に分割した反応混合物200μlをそれぞれErk1キナーゼ(1.8mg/ml)5μlと混合した。反応物を室温で様々な時間インキュベートし、100μlの分割部分を引き出し、各分割部分の蛍光を測定した。
この結果を図3に示す。結果は蛍光が時間依存的に増大していることを示す。
O−(N−スクシニミジル)−6−(9−オキソ−9H−アクリジン−10イル)ヘキサノエートにより標識したミエリン塩基性タンパク質(MBP)(実施例2、方法1により調製)(1ml)を水で10mlに希釈し、50mM−MOPS(pH7.2)、5nM−MgCl2、100μM−ATP及び1.66μM−MBP含有溶液を得た。7部分に分割した100μlを、スタウロスポリンに関して0〜100μMの濃度とした。最後に、Erk1キナーゼ(1.8mg/ml)2μlを各反応混合物に加えた。反応混合物を室温で3時間インキュベートし、その後、100mM−EDTA100μl加え、反応を停止させた。次いで、反応の蛍光強度を測定した。
酵素反応は、図4に示すように、スタウロスポリンにより容量依存的に阻害される。
50mM−トリス/10mM−MgCl2/2.5mM−MnCl2(pH7.2)中、50μM−ATPの存在下、N−(6−(9−オキソ−9H−アクリジン−10−イル)−ヘキサノイル)−Glu−Pro−Glu−Gly−Ile−Tyr−Gly−Val−Leu−Phe−アミドの複製(500nM)を100μl容量ずつ、ピペットでブラック96穴マイクロプレート(コースター(Costar)コード3650)のウエルに入れた。12.7ミリ単位のLck酵素(アップステート・バイオテクノロジー(Upstate Biotechnology)コード14−379)を10μl容量ずつ添加し、反応経過を追跡した。反応は1分間隔、外界温で、基質と生成物両方の特性である寿命と強度変化両方についてモニターした。
図5に示すように、結果は生成物の形成が時間依存性であることを示している。
50mM−トリス/10mM−MgCl2/2.5mM−MnCl2(pH7.2)中、種々濃度のATPの存在下、N−(6−(2−アセトアミド−9−オキソ−9H−アクリジン−10−イル)−ヘキサノイル)−Glu−Pro−Glu−Gly−Ile−Tyr−Gly−Val−Leu−Phe−アミドの複製(500nM)を100μl容量ずつ、ピペットでブラック96穴マイクロプレート(コースター、コード3650)のウエルに入れた。12.7ミリ単位のLck酵素(アップステート・バイオテクノロジー、コード14−379)を10μl容量ずつ添加し、反応を開始した。室温で60分間インキュベートした後、各ウエルに0.1Mクエン酸バッファー(pH3.0)(20μl)を加えて反応を停止した。反応は、基質と生成物両方の特性である寿命と強度変化両方につき、モニターした。
結果は図6に示す。図6は生成物の形成がATP濃度に依存することを示している。
50mM−トリス/10mM−MgCl2/2.5mM−MnCl2(pH7.2)中、50μM−ATPの存在下、N−(6−(9−オキソ−9H−アクリジン−10−イル)−ヘキサノイル)−Glu−Pro−Glu−Gly−Ile−Tyr−Gly−Val−Leu−Phe−アミドの複製(500nM)を100μl容量ずつ、ピペットでブラック96穴マイクロプレート(コースター、コード3650)のウエルに入れた。Lck酵素(アップステート・バイオテクノロジー、コード14−379)を10μl容量ずつ添加し、反応を開始した。室温で90分間インキュベートした後、各ウエルに0.1Mクエン酸バッファー(pH3.0)(20μl)を加えて反応を停止した。反応は、基質と生成物両方の特性である寿命と強度変化両方につき、モニターした。
結果は図7に示す。図7は生成物の形成が酵素濃度に依存することを示している。
スタウロスポリン(シグマ、コードS4400、DMSO中1mM)をアッセイバッファー(50mM−トリス/10mM−MgCl2/2.5mM−MnCl2(pH7.2))中に10%(v/v)DMSOで希釈し、以下のスタウロスポリン濃度を調製する:100μM、10μM、1μM、100nM、10nM及び1nM。反応混合物を以下のように調製した:10mlアッセイバッファー+2.5μlのN−(6−(9−オキソ−9H−アクリジン−10−イル)−ヘキサノイル)−Glu−Pro−Glu−Gly−Ile−Tyr−Gly−Val−Leu−Phe−アミド(1mM)+20μlのATP(10mM)。各阻害剤濃度の5つの複製(10μl)をピペットでブラック96穴マイクロプレート(コースター、コード3650)のウエルに入れた。反応混合物(100μl)を各ウエルに添加した。12.7ミリ単位のLck酵素(アップステート・バイオテクノロジー、コード14−379)を10μl容量ずつ添加し、反応を開始した。室温で60分間インキュベートした後、各ウエルに0.1Mクエン酸バッファー(pH3.0)(20μl)を加えて反応を停止した。反応は、基質と生成物両方の特性である寿命と強度変化両方につき、モニターした。
図8の結果はスタウロスポリンによるLckキナーゼ活性の阻害を示す;IC50値は16nMである。パークら(Park et al., Anal. Biochem., (1999), 269, 94−104)は、最終濃度2μMのATPと類似のペプチド配列を用いて、時間分解蛍光フォーマットアッセイにより、IC50値は約10nMであると報告している。
トリスバッファー塩溶液(pH7.6)中、N−(6−(9−オキソ−9H−アクリジン−10−イル)−ヘキサノイル)−Thr−Arg−Asp−Ile−Tyr(PO3H2)−Glu−Thr−Asp−NH2(1μM)100μlずつの複製をピペットでブラック96穴マイクロプレート(コースター、コード3650)のウエルに入れた。88単位のタンパク質−チロシンホスファターゼ酵素(シグマ、コードP9864)を10μl容量ずつ添加して、時間経過を開始した。反応は1分間隔、外界温度で、基質と生成物両方の特性である寿命と強度変化両方につき、モニターした。
図9はこのホスファターゼによる基質の脱リン酸化を示すプロットである。脱リン酸化産物の出現もモニターする。
Claims (45)
- 基質分子に作用する酵素のリン酸化活性を測定する方法であって、基質が酵素によりリン酸化されてリン酸化産物を生じ得る1以上の部分を含んでなり、かつ基質が蛍光色素で標識されているものであり、当該方法が、
i)蛍光標識基質の蛍光強度と蛍光寿命を測定する工程;
ii)酵素と基質分子とをリン酸供与体の存在下に結合させる工程;及び
iii)工程ii)の結合に続いて、蛍光標識の蛍光強度と蛍光寿命における変化を測定する工程;
からなり、蛍光標識の蛍光強度と蛍光寿命における変化を酵素のリン酸化活性測定に使用する、方法。 - 基質がアクリドン及びキナクリドン群の色素から選択される蛍光色素で標識したものである、請求項1記載の方法。
- 基質分子に作用する酵素のリン酸化活性を測定する方法であって、基質が酵素によりリン酸化されてリン酸化産物を生じ得る1以上の部分を含んでなり、かつ基質がアクリドン及びキナクリドン群の色素から選択される蛍光色素で標識されているものであり、当該方法が、
i)蛍光標識基質の蛍光強度を測定する工程;
ii)酵素と基質分子とをリン酸供与体の存在下に結合させる工程;及び
iii)工程ii)の結合に続いて、蛍光標識の蛍光強度の増加を測定する工程;
からなり、蛍光標識の蛍光強度の増加を酵素のリン酸化活性測定に使用する、方法。 - 基質分子が天然のタンパク質(糖タンパク質及びリポタンパク質などの翻訳後修飾タンパク質を含む)及び合成ペプチドから選択される、請求項1乃至請求項3のいずれか1項記載の方法。
- 基質分子がリン酸化を受け得る1以上のアミノ酸を含んでなる、請求項1乃至請求項4のいずれか1項記載の方法。
- リン酸化を受け得るアミノ酸がチロシン、セリン、スレオニン及びヒスチジンから選択される、請求項5記載の方法。
- 基質がチロシンキナーゼ、セリン/スレオニンキナーゼ及びヒスチジンキナーゼから選択される1種以上の酵素によりリン酸化を受け得るものである、請求項1乃至請求項6のいずれか1項記載の方法。
- リン酸化産物が1以上のホスホ−チロシン残基を含んでなる、請求項1乃至請求項7のいずれか1項記載の方法。
- 基質のチロシン残基がチロシンキナーゼによりリン酸化されており、測定工程i)及びiii)がさらに蛍光標識の蛍光寿命測定を含んでなり、その場合に蛍光寿命の延長を使用して非リン酸化基質濃度に相関するリン酸化産物の濃度を測定する、請求項3乃至請求項8のいずれか1項記載の方法。
- 基質がセリン、スレオニン及びヒスチジンから選択される残基でリン酸化される、請求項1乃至請求項5のいずれか1項記載の方法。
- 基質が式:
基R2及びR3はZ1環構造に結合しており、基R4及びR5はZ2環構造に結合している;
Z1及びZ2は独立して1又は2つの縮合環芳香族又はへテロ芳香族系を完結するために必要な原子を表し、各環は複数の炭素原子から選択される5又は6個の原子と選択肢として酸素、窒素及びイオウから選択される2個を超えない原子を有する;
R1、R2、R3、R4及びR5は独立して水素、ハロゲン、アミド、ヒドロキシル、シアノ、アミノ、モノ−もしくはジ−C1〜C4アルキル置換アミノ、スルフィドリル、カルボニル、C1〜C6アルコキシ、アリール、ヘテロアリール、C1〜C20アルキル、アラルキル;基−E−F(ただし、Eは炭素、窒素、酸素、イオウ及びリン原子からなる基から選択される1〜60個の原子鎖をもつスペーサーであり、Fは標的結合基である);及び基−(CH2)nY(ただし、Yはスルホン酸、硫酸、ホスホン酸、リン酸、四級アンモニウム及びカルボキシルから選択され、nはゼロ又は1〜6の整数である)から選択される)
で示される蛍光色素で標識されている、請求項1乃至請求項10のいずれか1項記載の方法。 - 基質が式:
基R3及びR4はZ1環構造に結合しており、基R5及びR6はZ2環構造に結合している;
Z1及びZ2は独立して1又は2つの縮合環芳香族又はへテロ芳香族系を完結するために必要な原子を表し、各環は複数の炭素原子から選択される5又は6個の原子と選択肢として酸素、窒素及びイオウから選択される2個を超えない原子を有する;
R1、R2、R3、R4、R5、R6、R7及びR8は独立して水素、ハロゲン、アミド、ヒドロキシル、シアノ、アミノ、モノ−もしくはジ−C1〜C4アルキル置換アミノ、スルフィドリル、カルボニル、カルボキシル、C1〜C6アルコキシ、アリール、ヘテロアリール、C1〜C20アルキル、アラルキル;基−E−F(ただし、Eは炭素、窒素、酸素、イオウ及びリン原子からなる基から選択される1〜60個の原子鎖をもつスペーサーであり、Fは標的結合基である);及び基−(CH2)nY(ただし、Yはスルホン酸、硫酸、ホスホン酸、リン酸、四級アンモニウム及びカルボキシルから選択され、nはゼロ又は1〜6の整数である)から選択される)
で示される蛍光色素で標識されている、請求項1乃至請求項10のいずれか1項記載の方法。 - 基質がリンカー基により固体支持体に結合している、請求項1乃至請求項10のいずれか1項記載の方法。
- 基質が第二ペプチド又はタンパク質に接合している、請求項1乃至請求項10のいずれか1項記載の方法。
- 試験作用物質が酵素のリン酸化活性に及ぼす作用を測定する試験作用物質のスクリーニング方法であって、
(a)作用物質の存在下及び不存在下に、請求項1乃至請求項14のいずれか1項記載の方法を実施する工程;及び
(b)作用物質の存在下及び不存在下に酵素のリン酸化活性を測定する工程;
からなり、その場合に、作用物質の存在下及び不存在下の酵素のリン酸化活性間の差を酵素のリン酸化活性に対する試験作用物質の作用を示すものであるとする、スクリーニング方法。 - 試験作用物質が酵素のリン酸化活性に及ぼす作用を測定する試験作用物質のスクリーニング方法であって、
(a)試験作用物質の存在下に、請求項1乃至請求項12のいずれか1項記載の方法を実施する工程;及び
(b)試験作用物質の不存在下に酵素のリン酸化活性値と酵素活性の対照値とを比較する工程;
からなるスクリーニング方法。 - 酵素がチロシンキナーゼ、セリン/スレオニンキナーゼ及びヒスチジンキナーゼから選択される、請求項15又は請求項16記載の方法。
- 基質分子に作用する酵素の脱リン酸化活性を測定する方法であって、基質が酵素により脱リン酸化されて産物を生じ得る1以上のリン酸化部分を含んでなり、かつ基質が蛍光色素で標識されているものであり、当該方法が、
i)蛍光標識基質の蛍光強度と蛍光寿命を測定する工程;
ii)酵素と基質分子とを結合させて産物を生じさせる工程;及び
iii)工程ii)の結合に続いて、蛍光強度と蛍光寿命における変化を測定する工程;
からなり、蛍光標識の蛍光強度と蛍光寿命における変化を酵素の脱リン酸化活性測定に使用する、方法。 - 基質がアクリドン及びキナクリドン群の色素から選択される蛍光色素で標識したものである、請求項18記載の方法。
- 基質分子に作用する酵素の脱リン酸化活性を測定する方法であって、基質が酵素により脱リン酸化されて産物を生じ得る1以上のリン酸化部分を含んでなり、かつ基質がアクリドン及びキナクリドン群の色素から選択される蛍光色素で標識されているものであり、当該方法が、
i)蛍光標識基質の蛍光強度を測定する工程;
ii)酵素と基質分子とを結合させて産物を生じさせる工程;及び
iii)工程ii)の結合に続いて、蛍光強度の低下を測定する工程;
からなり、蛍光標識の蛍光強度の低下を酵素の脱リン酸化活性測定に使用する、方法。 - 基質分子が天然のタンパク質(糖タンパク質及びリポタンパク質などの翻訳後修飾タンパク質を含む)及び合成ペプチドから選択される、請求項18乃至請求項20のいずれか1項記載の方法。
- 基質分子が脱リン酸化を受け得る1以上のリン酸化アミノ酸を含んでなる、請求項18乃至請求項21のいずれか1項記載の方法。
- リン酸化アミノ酸がチロシン、セリン、スレオニン及びヒスチジンのリン酸化誘導体から選択されるものである、請求項22記載の方法。
- 酵素が基質におけるホスホ−チロシン残基からリン酸基を除去し、測定工程i)及びiii)がさらに蛍光標識の蛍光寿命測定を含んでなり、その場合に蛍光寿命の短縮を使用して産物の濃度に相関するリン酸化基質の濃度を測定する、請求項20乃至請求項23のいずれか1項記載の方法。
- 基質が式:
基R2及びR3はZ1環構造に結合しており、基R4及びR5はZ2環構造に結合している;
Z1及びZ2は独立して1又は2つの縮合環芳香族又はへテロ芳香族系を完結するために必要な原子を表し、各環は複数の炭素原子から選択される5又は6個の原子と選択肢として酸素、窒素及びイオウから選択される2個を超えない原子を有する;
R1、R2、R3、R4及びR5は独立して水素、ハロゲン、アミド、ヒドロキシル、シアノ、アミノ、モノ−もしくはジ−C1〜C4アルキル置換アミノ、スルフィドリル、カルボニル、C1〜C6アルコキシ、アリール、ヘテロアリール、C1〜C20アルキル、アラルキル;基−E−F(ただし、Eは炭素、窒素、酸素、イオウ及びリン原子からなる基から選択される1〜60個の原子鎖をもつスペーサーであり、Fは標的結合基である);及び基−(CH2)nY(ただし、Yはスルホン酸、硫酸、ホスホン酸、リン酸、四級アンモニウム及びカルボキシルから選択され、nはゼロ又は1〜6の整数である)から選択される)
で示される蛍光色素で標識されている、請求項18乃至請求項24のいずれか1項記載の方法。 - 基質が式:
基R3及びR4はZ1環構造に結合しており、基R5及びR6はZ2環構造に結合している;
Z1及びZ2は独立して1又は2つの縮合環芳香族又はへテロ芳香族系を完結するために必要な原子を表し、各環は複数の炭素原子から選択される5又は6個の原子と選択肢として酸素、窒素及びイオウから選択される2個を超えない原子を有する;
R1、R2、R3、R4、R5、R6、R7及びR8は独立して水素、ハロゲン、アミド、ヒドロキシル、シアノ、アミノ、モノ−もしくはジ−C1〜C4アルキル置換アミノ、スルフィドリル、カルボニル、カルボキシル、C1〜C6アルコキシ、アリール、ヘテロアリール、C1〜C20アルキル、アラルキル;基−E−F(ただし、Eは炭素、窒素、酸素、イオウ及びリン原子からなる基から選択される1〜60個の原子鎖をもつスペーサーであり、Fは標的結合基である);及び基−(CH2)nY(ただし、Yはスルホン酸、硫酸、ホスホン酸、リン酸、四級アンモニウム及びカルボキシルから選択され、nはゼロ又は1〜6の整数である)から選択される)
で示される蛍光色素で標識されている、請求項18乃至請求項24のいずれか1項記載の方法。 - 基質がリンカー基により固体支持体に結合している、請求項18乃至請求項24のいずれか1項記載の方法。
- 基質が第二のペプチド又はタンパク質に融合している、請求項18乃至請求項24のいずれか1項記載の方法。
- 試験作用物質が酵素の脱リン酸化活性に及ぼす作用を測定する試験作用物質のスクリーニング方法であって、
(a)作用物質の存在下及び不存在下に、請求項18乃至請求項28のいずれか1項記載の方法を実施する工程;及び
(b)作用物質の存在下及び不存在下に酵素の脱リン酸化活性を測定する工程;
からなり、その場合に、作用物質の存在下及び不存在下の酵素の脱リン酸化活性間の差を酵素の脱リン酸化活性に対する試験作用物質の作用を示すものであるとする、スクリーニング方法。 - 試験作用物質が酵素の脱リン酸化活性に及ぼす作用を測定する試験作用物質のスクリーニング方法であって、
(a)試験作用物質の存在下に、請求項18乃至請求項28のいずれか1項記載の方法を実施する工程;及び
(b)試験作用物質の不存在下に酵素の脱リン酸化活性値と酵素活性の対照値とを比較する工程;
からなるスクリーニング方法。 - 酵素がホスファターゼである、請求項18乃至請求項30のいずれか1項記載の方法。
- 細胞環境における基質のリン酸化状態を測定する方法であって、基質が細胞性酵素によりリン酸化又は脱リン酸化されて産物を生じ得る1以上のの部分を含んでなり、かつ基質が蛍光色素で標識されているものであり、当該方法が、
i)無細胞環境における蛍光標識基質の蛍光強度と蛍光寿命を測定する工程;
ii)液体培地中1個以上の細胞に基質を加える工程;及び
iii)工程ii)に続いて、蛍光標識の蛍光強度と蛍光寿命を測定する工程;
からなり、蛍光強度と蛍光寿命の変化を基質のリン酸化状態を示すために使用する、方法。 - 基質がキナーゼ基質又はホスファターゼ基質である、請求項32記載の方法。
- 蛍光色素がアクリドン及びキナクリドン群の色素から選択されるものである、請求項31又は請求項32記載の方法。
- 基質が第二のペプチド又はタンパク質に接合している、請求項32乃至請求項34のいずれか1項記載の方法。
- 基質が担体又は輸送ペプチドに接合している、請求項32記載の方法。
- 各酵素が異なる基質に特異的であり、その2種以上の異なる酵素のキナーゼ活性を同時に測定する方法であって、各基質が酵素によりリン酸化されて産物を生じ得る1以上の部分を含んでなり、かつ各基質が蛍光色素セットの異なる1つにより標識されているものであり、当該方法が、
i)蛍光標識基質それぞれの蛍光強度と蛍光寿命を測定する工程;
ii)リン酸源の存在下に酵素の混合物と各基質分子とを結合する工程;及び
iii)工程ii)の結合に続いて、各蛍光標識の蛍光強度と蛍光寿命の増加を測定する工程;
からなり、各蛍光標識の蛍光強度と蛍光寿命の増加を各酵素のリン酸化活性の定量に使用する、方法。 - セット中の蛍光色素がアクリドン及びキナクリドン群の色素から選択される、請求項37記載の方法。
- 酵素が単離酵素である、請求項37又は請求項38記載の方法。
- 1種以上の酵素が細胞溶解液の成分である、請求項38記載の方法。
- 工程ii)の結合を細胞環境中で実施し、異なる基質のそれぞれが担体又は輸送ペプチドに接合している、請求項37記載の方法。
- 測定するキナーゼ活性がチロシンキナーゼである、請求項37乃至請求項41のいずれか1項記載の方法。
- 以下の成分:
i)キナーゼ酵素に対する基質であって、基質が酵素によりリン酸化されてリン酸化産物を生じ得る1以上の部分を含んでなり、かつ基質がアクリドン及びキナクリドン群の色素から選択される蛍光色素で標識されている基質;及び
ii)リン酸供与体及びキナーゼから選択される成分;
を含んでなる組成物。 - 1種以上のの酵素のキナーゼ活性を測定する試験キットであって、
i)各基質がリン酸化されて産物を生じ得る部分を含んでなり、かつ各基質がアクリドン及びキナクリドン群の色素から選択される蛍光色素セットの異なる1つにより標識されている基質;及び選択肢として、
ii)各酵素が異なる基質に特異的な1種以上の異なる酵素;
を含んでなる試験キット。 - 1種以上のの酵素のホスファターゼ活性を測定する試験キットであって、
i)各基質が脱リン酸化されて産物を生じ得るリン酸化部分を含んでなり、かつ各基質がアクリドン及びキナクリドン群の色素から選択される蛍光色素セットの異なる1つにより標識されている基質;及び選択肢として、
ii)各酵素が異なる基質に特異的な1種以上の異なる酵素;
を含んでなる試験キット。
Applications Claiming Priority (2)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
GBGB0208987.8A GB0208987D0 (en) | 2002-04-19 | 2002-04-19 | Methods for measuring protein kinase and phosphatase activity |
PCT/GB2003/001683 WO2003089665A1 (en) | 2002-04-19 | 2003-04-17 | Methods for measuring protein kinase and phosphatase activity |
Publications (3)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JP2005523024A true JP2005523024A (ja) | 2005-08-04 |
JP2005523024A5 JP2005523024A5 (ja) | 2009-12-17 |
JP4615867B2 JP4615867B2 (ja) | 2011-01-19 |
Family
ID=9935150
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP2003586374A Expired - Fee Related JP4615867B2 (ja) | 2002-04-19 | 2003-04-17 | プロテインキナーゼ及びホスファターゼ活性の測定法 |
Country Status (10)
Country | Link |
---|---|
US (1) | US7125682B2 (ja) |
EP (1) | EP1497453B1 (ja) |
JP (1) | JP4615867B2 (ja) |
AT (1) | ATE364715T1 (ja) |
AU (1) | AU2003227872A1 (ja) |
CA (1) | CA2484397C (ja) |
DE (1) | DE60314395T2 (ja) |
GB (2) | GB0208987D0 (ja) |
IL (1) | IL164543A0 (ja) |
WO (1) | WO2003089665A1 (ja) |
Cited By (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JP2005095144A (ja) * | 2003-04-10 | 2005-04-14 | Tecan Trading Ag | 生物学的分子に結合した化学基を測定する方法 |
JP2009513766A (ja) * | 2005-10-28 | 2009-04-02 | アイティーアイ スコットランド リミテッド | 新規な蛍光染料およびその使用 |
Families Citing this family (7)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US20090118139A1 (en) * | 2000-11-07 | 2009-05-07 | Caliper Life Sciences, Inc. | Microfluidic method and system for enzyme inhibition activity screening |
SG147471A1 (en) * | 2003-10-18 | 2008-11-28 | Bayer Healthcare Ag | Direct observation of molecular modifications in biological test systems by measuring fluorescence lifetime |
US20060084128A1 (en) * | 2004-09-22 | 2006-04-20 | Hongye Sun | Enzyme assay with nanowire sensor |
GB0712109D0 (en) * | 2007-06-22 | 2007-08-01 | Edinburgh Instr | Fluorescence lifetime and fluorescence assays |
FI20070508A0 (fi) * | 2007-06-27 | 2007-06-27 | Turun Yliopisto | Peptidisubstraatti ja sen käyttö |
DE102008011578A1 (de) * | 2008-02-28 | 2009-09-03 | Endress + Hauser Conducta Gesellschaft für Mess- und Regeltechnik mbH + Co. KG | Photolumineszenz-Sensor |
GB201122099D0 (en) | 2011-12-22 | 2012-02-01 | Almac Sciences Scotland Ltd | Dyes |
Family Cites Families (8)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US5032381A (en) * | 1988-12-20 | 1991-07-16 | Tropix, Inc. | Chemiluminescence-based static and flow cytometry |
US6803188B1 (en) * | 1996-01-31 | 2004-10-12 | The Regents Of The University Of California | Tandem fluorescent protein constructs |
AU3801997A (en) | 1996-07-16 | 1998-02-09 | Regents Of The University Of California, The | Assays for protein kinases using fluorescent protein substrates |
JP3815051B2 (ja) * | 1997-04-30 | 2006-08-30 | 和光純薬工業株式会社 | 新規なペプチド誘導体 |
ES2192801T3 (es) * | 1997-12-05 | 2003-10-16 | Upjohn Co | Ensayos de criba de alta productividad de proteina quinasas y fosfatasas, basados en fluorescencia. |
JP2001019700A (ja) * | 1999-07-07 | 2001-01-23 | Mitsubishi Chemicals Corp | 蛍光標識ペプチド |
AU6381900A (en) | 1999-07-30 | 2001-02-19 | Bayer Corporation | Chemiluminescent substrates of hydrolytic enzymes such as phosphatases |
EP1264897A3 (en) * | 2001-06-06 | 2003-11-12 | Europäisches Laboratorium Für Molekularbiologie (Embl) | Synthetic sensor peptide for kinase or phosphatase assays |
-
2002
- 2002-04-19 GB GBGB0208987.8A patent/GB0208987D0/en not_active Ceased
-
2003
- 2003-04-17 DE DE60314395T patent/DE60314395T2/de not_active Expired - Lifetime
- 2003-04-17 GB GB0308903A patent/GB2387905B/en not_active Expired - Lifetime
- 2003-04-17 AU AU2003227872A patent/AU2003227872A1/en not_active Abandoned
- 2003-04-17 AT AT03725332T patent/ATE364715T1/de not_active IP Right Cessation
- 2003-04-17 WO PCT/GB2003/001683 patent/WO2003089665A1/en active IP Right Grant
- 2003-04-17 EP EP03725332A patent/EP1497453B1/en not_active Expired - Lifetime
- 2003-04-17 US US10/417,545 patent/US7125682B2/en active Active
- 2003-04-17 CA CA2484397A patent/CA2484397C/en not_active Expired - Fee Related
- 2003-04-17 JP JP2003586374A patent/JP4615867B2/ja not_active Expired - Fee Related
-
2004
- 2004-10-13 IL IL16454304A patent/IL164543A0/xx unknown
Non-Patent Citations (4)
Title |
---|
JPN6009020116, Brian K. McIlroy, et al., ANALYTICAL BIOCHEMISTRY, 1991, 195, p.148−152 * |
JPN6009020118, JOHN H. BAUSTERT, et al., ANALYTICAL BIOCHEMISTRY, 1988, Vol.171, p.393−397 * |
JPN6009020120, Pei−Hua Liu, et al., Journal of Photochemistry and Photobiology A: Chemistry, 2000, Volume 137, Issues 2−3,, p.99−104 * |
JPN6009020121, 大瀬戸文夫, "Topics on Chemistry ペプチドプローブを用いた蛋白リン酸化酵素類の可視化", Dojin news(ドージンニュース), 1998, No.88, p.10−11 * |
Cited By (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JP2005095144A (ja) * | 2003-04-10 | 2005-04-14 | Tecan Trading Ag | 生物学的分子に結合した化学基を測定する方法 |
JP2009513766A (ja) * | 2005-10-28 | 2009-04-02 | アイティーアイ スコットランド リミテッド | 新規な蛍光染料およびその使用 |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
EP1497453B1 (en) | 2007-06-13 |
GB2387905B (en) | 2005-01-12 |
AU2003227872A1 (en) | 2003-11-03 |
GB0208987D0 (en) | 2002-05-29 |
CA2484397A1 (en) | 2003-10-30 |
GB0308903D0 (en) | 2003-05-21 |
WO2003089665A8 (en) | 2004-11-18 |
EP1497453A1 (en) | 2005-01-19 |
US20030228646A1 (en) | 2003-12-11 |
JP4615867B2 (ja) | 2011-01-19 |
DE60314395D1 (de) | 2007-07-26 |
IL164543A0 (en) | 2005-12-18 |
ATE364715T1 (de) | 2007-07-15 |
CA2484397C (en) | 2014-06-17 |
GB2387905A (en) | 2003-10-29 |
US7125682B2 (en) | 2006-10-24 |
WO2003089665A1 (en) | 2003-10-30 |
DE60314395T2 (de) | 2008-02-21 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
Hewitt et al. | Application of lanthanide luminescence in probing enzyme activity | |
US20090035796A1 (en) | Enzyme sensors including environmentally sensitive or fluorescent labels and uses thereof | |
JP4965434B2 (ja) | 蛍光共鳴エネルギー移動酵素基質 | |
Kalesh et al. | The use of click chemistry in the emerging field of catalomics | |
JP4615867B2 (ja) | プロテインキナーゼ及びホスファターゼ活性の測定法 | |
Heal et al. | Getting a chemical handle on protein post-translational modification | |
EP1392870B1 (en) | Screening for enzyme inhibitors | |
US20100304407A1 (en) | Fluorescence Lifetime and Fluorescence Assays | |
JP6770750B2 (ja) | チロシンホスファターゼ及びチロシンキナーゼ活性の測定方法 | |
US20080057527A1 (en) | Methods for carboxypeptidases | |
US20110165603A1 (en) | Small molecule fluorescent sensors for detection of post-translationalmodifications and protein interactions in bioassays | |
JP7058081B2 (ja) | サイクリン依存性キナーゼ基質 | |
Lee et al. | Comparative characterization of direct and indirect substrate probes for on-chip transamidating activity assay of transglutaminases | |
US7901901B2 (en) | Assays for measuring phosphate modification enzyme activity | |
RU2395813C2 (ru) | Применение биотинилированного полипептида для определения активности белок-фосфорилирующих ферментов | |
Casey | Monitoring Cell Signaling Events and Supramolecular Protein Assembly with Peptide-Based Fluorescent Probes | |
Li et al. | Caged Luciferase Inhibitor‐Based Bioluminescence Switching Strategy Enables Efficient Detection of Serum APN Activity and the Identification of Its Roles in Metastasis of Non‐Small Cell Lung Cancer | |
Beck | Probing the phosphoproteome with direct activity sensors: Applications in liver signaling and disease | |
Xu | Peptide-Based Biosensors and Light-Activatable Proteins: Tools for Studying Cell Signaling and Developing Cancer Diagnosis |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
A621 | Written request for application examination |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621 Effective date: 20060414 |
|
A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20090428 |
|
A601 | Written request for extension of time |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A601 Effective date: 20090728 |
|
A602 | Written permission of extension of time |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A602 Effective date: 20090804 |
|
A601 | Written request for extension of time |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A601 Effective date: 20090828 |
|
A602 | Written permission of extension of time |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A602 Effective date: 20090904 |
|
A601 | Written request for extension of time |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A601 Effective date: 20090928 |
|
A602 | Written permission of extension of time |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A602 Effective date: 20091005 |
|
A524 | Written submission of copy of amendment under article 19 pct |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A524 Effective date: 20091028 |
|
RD02 | Notification of acceptance of power of attorney |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A7422 Effective date: 20091028 |
|
RD04 | Notification of resignation of power of attorney |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A7424 Effective date: 20091028 |
|
A02 | Decision of refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A02 Effective date: 20100119 |
|
A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20100519 |
|
A911 | Transfer to examiner for re-examination before appeal (zenchi) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A911 Effective date: 20100712 |
|
A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20100817 |
|
A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20100825 |
|
TRDD | Decision of grant or rejection written | ||
A01 | Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01 Effective date: 20100921 |
|
A01 | Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01 |
|
A61 | First payment of annual fees (during grant procedure) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A61 Effective date: 20101021 |
|
R150 | Certificate of patent or registration of utility model |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R150 |
|
FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20131029 Year of fee payment: 3 |
|
R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
S111 | Request for change of ownership or part of ownership |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R313113 |
|
R350 | Written notification of registration of transfer |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R350 |
|
R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
LAPS | Cancellation because of no payment of annual fees |