JP2005095144A - 生物学的分子に結合した化学基を測定する方法 - Google Patents
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Abstract
【解決手段】 サンプル中の生物学的分子に結合した、化学基、特にリン酸基の有無の測定方法を提供する。ここでかかる分子は蛍光マーカーをタグ付加され、かかる蛍光マーカーはサンプルを光で照射することによって活性化される。該方法は以下の工程によって特徴付けられる:
a)蛍光マーカーの使用。この蛍光存続期間が生物分子に結合したリン酸基の有無に応じて異なる値を示す;
b)生物分子に結合した、工程a)にしたがって選択された蛍光マーカーの蛍光存続時間の測定;
c)それぞれことなる存続時間に基づく、生物分子に結合したリン酸基の有無による生物分子の分類。
【選択図】なし
Description
サンプル中の生物学的分子に結合したリン酸基の存在または不在を測定する方法であって、該分子は蛍光マーカーをタグ付加されており、該蛍光マーカーはサンプルに光を照射することによって活性化され、ここで該方法は以下の工程を含む:
a)その蛍光存続時間が生物分子に結合したリン酸基の存在または不在に応じて異なる値を示す蛍光マーカーを使用する工程;
b)生物分子に結合した、工程a)で選択された蛍光マーカーの蛍光存続時間を測定する工程;
c)蛍光存続時間の差異に基づき生物分子に結合したリン酸基の存在または不在に応じて生物分子を分類する工程:
によって達成される。本発明による方法の好適な態様および/またはさらなる発明的要素はこの方法から派生する。
本発明の基礎となるメカニズムは完全には理解されていない。しかし、それには蛍光マーカーと荷電残基の間の相互作用が関与していると考えられる。荷電残基は同じ生物学的分子上で蛍光マーカーの結合部位の近くに結合している、および/または蛍光マーカーの空間的範囲内に位置する。フルオレセインが蛍光マーカーであることが判明し、その蛍光存続時間がリン酸基の有無に応答して有意に変化する。しかし、本発明はフルオレセインの使用のみを含むものではない;1または複数の荷電化学残基を生み出す、生物分子が関与するあらゆる化学反応が、蛍光存続時間を測定することによって適切に検出されうるという一般的仮説が立てられる。本発明によると、対応する生物分子に結合した好適な蛍光マーカーの蛍光存続時間が測定されると、その他の酵素反応の存在を確認するためにもこのようなまたは類似の結果が利用できるという仮説が立てられる。
オキシドレダクターゼは酸化還元反応を触媒し、酸化の結果電子が欠損し、還元によって電子が獲得される。したがって、例えば、蛍光存続時間シグナルの変調は、オキシドレダクターゼの活性部位のすぐ近くに近接する蛍光マーカーについて観察され、触媒的遷移の間酵素または基質内の様々なアミノ酸鎖を通る電子の移動が示される。この蛍光鎖は分類Iの酵素においてすでに検出されている。NAD+からNADHへのデヒドロゲナーゼによる還元により、NADHと比較してNAD+は蛍光ではないということが示された。
トランスフェラーゼは1つの基質から他の基質への官能基の転移を触媒する酵素である。官能基の転移は同一分子内のものでも異なる分子間のものでもよい。この分類の典型例はキナーゼであり、ATPをタンパク質またはペプチドに転移させる。以下に記載するホスホキナーゼ反応と同様の蛍光存続時間が関与する効果がチオラーゼ(thiolase)およびその他のトランスフェラーゼについても期待される。
加水分解酵素はカルボン酸エステル、ヘミアセタールエステル(グリコシル化合物)、チオエステル、アミド(ペプチド結合)および酸無水物の加水分解を触媒する酵素である。この分類にはホスファターゼも含まれる。というのは、ホスファターゼはリン酸基を水へと切断するからである。分類Iおよび分類IIについての情報はこの分類にも適用される。
リアーゼは化学基の脱離または付加を触媒する酵素である。1つの例はCO基の除去であり、脱炭酸として知られる。デカルボキシラーゼは一般に脱炭酸反応を触媒するために電子対を産生することから、基質の「電子サイン(electronic signature)」の変化が脱炭酸反応の過程で起こることが予測されるため、この分類の反応および/または酵素も存続時間蛍光定量法を用いて分析することができる。
イソメラーゼはラセミ化、エピマー化、シス−トランス変換およびエノール−ケト互変異性などの分子内の特定の再編成を触媒する。エノール−ケト互変異性においても大量の電子の移動が予測されることから、この場合においても蛍光存続時間の変化を測定することが可能である。
リガーゼはATP(または類似のヌクレオシド三リン酸)の切断から得るエネルギーを用いて分子間の結合を触媒する酵素である。この分類には例えば脂肪酸合成酵素およびDNAポリメラーゼが含まれる。同様に、これらの酵素によって生み出される触媒反応の結果、酵素の活性部位の近隣に位置するフルオロフォアの蛍光存続時間が有意に変化する可能性が高いということがこれらの酵素についても予測される。
DNAおよびRNA断片またはオリゴヌクレオチドなどの核酸配列を含む生物学的または合成手段によって生じた分子。
環状アデノシン一リン酸(AMP)またはグアノシン一リン酸(GMP)などの生物学的プロセスの結果得られるかまたはかかるプロセスに役立つその他の分子。
単糖類、多糖類およびその他の巨大分子。
市販の化学物質を用いて実験を行った。このため以下の化学物質を用いた。
トレーサーペプチドとして、PTK Green、濃度2nM、PANVERAからのP-2843(PANVERA, 501 Charmany Drive, Madison WI USA)。これはキット番号P-2873による「グリーン」キナーゼアッセイの一部として用いた。
PTP1Bホスファターゼ、BIOMOLからのSE-332(BIOMOL Research Laboratories, Inc., 5120 Butler Pike, Plymouth Meeting PA USA 19462-1202);
フルオレセインおよびPBSバッファー。
図1は、酵素濃度の関数としてのトレーサーペプチド(生物分子)の一部である蛍光マーカー、フルオレセインの測定蛍光存続時間を示す。さらに補助的な分子(例えば抗体など)がこれら測定結果を得るために必要ではなかったという事実は明確な参照である。酵素PTP1Bのトレーサーペプチドに対する添加の30分後に測定を行った。蛍光存続時間はペプチドリン酸化の状態を反映し、酵素濃度が高いと作用が速く、より脱リン酸化が進んだペプチドが生じる。一方、脱リン酸化されたペプチドに結合するフルオレセインはより短い存続時間を示す。
Claims (14)
- サンプル中の生物学的分子に結合したリン酸基の存在または不在を測定する方法であって、該分子は蛍光マーカーをタグ付加されており、該蛍光マーカーはサンプルに光を照射することによって活性化される、ここで該方法は以下の工程を含む:
a)その蛍光存続時間が生物分子に結合したリン酸基の存在または不在に応じて異なる値を示す蛍光マーカーを使用する工程;
b)生物分子に結合した、工程a)で選択された蛍光マーカーの蛍光存続時間を測定する工程;
c)蛍光存続時間の差異に基づき生物分子に結合したリン酸基の存在または不在に応じて生物分子を分類する工程。 - 該生物学的分子が、アミノ酸配列を含む群から選択される、請求項1記載の方法。
- アミノ酸配列がタンパク質、ペプチド、糖タンパク質およびリポタンパク質である、請求項2記載の方法。
- 蛍光マーカーが、フルオレセインおよびフルオレセイン誘導体を含む群から選択される、請求項1記載の方法。
- サンプルの生物学的分子が、リン酸化状態の測定の前にホスファターゼまたはホスホキナーゼとともにインキュベートされる、請求項1記載の方法。
- 生物学的分子のマーキング、アッセイの活性化および蛍光存続時間の測定からなる群から選択される1または複数の工程が、複数ウェルプレートで、生物分子またはサンプルをそれぞれ自動的に分類するコンピュータを用いて行われる、請求項1記載の方法。
- 複数ウェルプレートが96、384または1536ウェルを有するマイクロプレートである、請求項6に記載の方法。
- 蛍光存続時間の測定が時間相関一光子計数(TCSPC)または位相変調技術によって行われる、請求項1記載の方法。
- アッセイにおける2種の生物分子の比率が較正によって定量される、請求項1記載の方法。
- 医薬上有効な物質について化学物質を創薬スクリーニングするための請求項1から9のいずれかに記載の方法。
- 医薬組成物を製造するための、化学物質を創薬スクリーニングするための請求項1から9のいずれかに記載の方法。
- ヒトまたは動物の酵素における欠陥を検出するための請求項1から9のいずれかに記載の方法。
- 分類IからVIのいずれかの酵素が関与する反応を検出するための請求項1から9のいずれかに記載の方法。
- 分類IからVIのいずれかの酵素が関与する反応を定量するための請求項1から9のいずれかに記載の方法。
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