JP4965434B2 - 蛍光共鳴エネルギー移動酵素基質 - Google Patents

Description

本発明は、蛍光ベースのアッセイに関し、また酵素活性を測定するための試薬及び方法、特に酵素切断アッセイに関する。

酵素活性、特に加水分解などの酵素切断活性を測定するためのアッセイは、生物科学及び薬学において広く利用される。コンビナトリアルケミストリー及びハイスループットスクリーニングの到来とともに、酵素活性の潜在的なモジュレータをスクリーニングするための簡単で、感度が高く、かつ費用効率の高いアッセイの必要性が高まっている。製薬業界が特に関心があるのは、タンパク分解酵素による切断及びリン酸の切断を検出するための方法である。

蛍光ベースのアッセイは、扱いやすさ、感度、コスト及び自動化の容易さの点で、酵素の切断活性を測定するための放射化学法、ＥＬＩＳＡ、抗体法及びより伝統的な技法に勝る有意な利点を提供する。蛍光原基質を均一系酵素アッセイに定期的に使用して、酵素活性を、あるいは創薬における潜在的な薬物の酵素活性への作用を決定する。これらの酵素の多くの基質が市販され、又は文献で報告されている。例えば、米国特許第４８１２４０９号（Ｂａｂｂ，Ｂ．，ｅｔ ａｌ）は、フェナレノン又はベンズフェナレノンから誘導されるブロックされた色素部分を含んでなる加水分解性蛍光基質を開示している。これらの色素部分は、酵素加水分解中に基質から切断されると、約５３０ｎｍより上の蛍光を有する蛍光色素を形成する。加水分解酵素に対応する基質も、フルオレセイン及びローダミンの誘導体を基に入手可能である。例えば、フルオレセイン二リン酸は、アルカリホスファターゼ（ＰＰ２Ａ）用の、広く使用されている無色の非蛍光基質であり、この酵素によって加水分解されると、フルオレセインを形成する（Ｖｉｅｙｔｅｓ Ｍ．，ｅｔ ａｌ，Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，（１９９７），２４８，２５８−６４）。しかしながら、フルオレセインに基づく基質には、通常２つの酵素切断可能部位が組み込まれており、二相の酵素反応速度が、切断を通して、まずモノ置換蛍光類似体に対して、次いで遊離蛍光体に対して起こる。このモノ置換蛍光基質は、遊離蛍光体と同じ波長を吸収し同じ波長で発光するので、この酵素反応速度の解釈はより難しくなる。４−メチルウンベリフェロンのフッ素化誘導体に基づく蛍光原基質が、β−ガラクトシダーゼ活性及び酸性ホスファターゼ活性のアッセイに関して記載されている（Ｇｅｅ，Ｋ．Ｒ．，ｅｔ ａｌ，（１９９９），２７３，４１−８）。

蛍光ベースの酵素アッセイで使用される色素の多くは、３５０ｎｍ〜５５０ｎｍの範囲で発光する。より高波長で発光する色素のいくつか、例えばレゾルフィンやＤＤＡＯは、チオール類（チオール官能基を有するペプチド類／タンパク類を含む）に対して反応性があり、それらの色素は蛍光特性を失う。したがって、これらの色素は、生体内の用途では有用ではなさそうである。スペクトルの赤又は赤外領域で発光する有用な蛍光特性の色素を有する蛍光ベースの酵素基質は、ニトロ置換されたシアニン色素誘導体である（欧州特許第１０８６１７９号：Ｈａｍｉｌｔｏｎ，Ａ．ｅｔ ａｌ）。これらの色素の蛍光は、分子内の置換ニトロ基の存在により消光される。このニトロ基がニトロ還元酵素により還元されると、色素は蛍光性となる。これらの蛍光原基質が有用であることが判明し、現在は生細胞アッセイで使用されているが、それらは限られた用途しかない。したがって、関心のある酵素に対して以外は非反応性で、高いＳＢＲ（ｓｉｇｎａｌ ｔｏ ｂａｃｋｇｒｏｕｎｄ ｒａｔｉｏ）を提供する、より高波長（赤又は赤外）で発光する新たな蛍光原酵素基質が明らかに必要である。

本発明では、一連の異なる酵素の基質であり、赤及び近赤外を含めた異なる波長で発光する新たな蛍光原酵素基質について説明する。２つの酵素活性の比を決定するための二重酵素基質も提供する。これは、個々の単一酵素基質の吸収特性、分布特性、及び排出特性に差があるために、２つの別々の酵素基質を利用して相対酵素活性を測定することができない生体内システムにより適切である。最後に、酵素活性を決定する方法、ならびに生体外又は生体内の代謝状態を決定する方法も提供する。
米国特許第４８１２４０９号明細書 欧州特許第１０８６１７９号明細書 Ｖｉｅｙｔｅｓ Ｍ．，ｅｔ ａｌ，Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，（１９９７），２４８，２５８−６４ Ｇｅｅ，Ｋ．Ｒ．，ｅｔ ａｌ，（１９９９），２７３，４１−８ Ｆｏｒｓｔｅｒ，Ｔ．，"Ｉｎｔｅｒｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｅｎｅｒｇｙ Ｔｒａｎｓｆｅｒ ａｎｄ Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ"，Ａｎｎ．Ｐｈｙｓｉｋ．，Ｖｏｌ．２，ｐ．５５，（１９４８） Ｆｒｅｓｈｎｅｙ，Ｒ．Ｉ．，Ｃｕｌｔｕｒｅ ｏｆ Ａｎｉｍａｌ Ｃｅｌｌｓ：Ａ Ｍａｎｕａｌ ｏｆ Ｂａｓｉｃ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ，２ｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ａｌａｎ Ｒ．Ｌｉｓｓ Ｉｎｃ．１９８７ "Ｎｏｎ−Ｒａｄｉｏａｃｔｉｖｅ Ｌａｂｅｌｌｉｎｇ，ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ｉｎｔｒｏｄｕｃｔｉｏｎ"，Ｇａｒｍａｎ，Ａ．Ｊ．Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，１９９７ "Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｉｏｎ−Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｃｏｕｐｌｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ｆｏｒ ｔｈｅ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ"，Ａｓｌａｍ，Ｍ．ａｎｄ Ｄｅｎｔ，Ａ．，Ｍａｃｍｉｌｌａｎ Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ Ｌｔｄ，（１９９８） Ｈｅｒｍａｎｓｏｎ，Ｇ．Ｔ．，Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ（１９９６）

したがって、本発明は、蛍光標識酵素基質、特に蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）標識基質、ならびにＦＲＥＴ標識及び酵素切断可能基を含んでなる基質を切断する際の酵素の活性を測定する方法を提供することを一目的とする。

酵素切断活性に影響を及ぼすことがある試験剤をスクリーニングする方法を提供することも本発明の一目的である。

したがって、本発明の第１の態様では、式（Ｉ）の化合物が提供される。

式中、Ｄ_１は第１の色素部分であり、その蛍光特性は、エネルギー移動構成におけるドナー又はアクセプターとして適するよう調節することができ、
Ｄ_２は、前記第１の色素とのエネルギー移動構成においてアクセプター又はドナーとして適切な第２の色素部分であり、
Ｌは、２〜２００個の連結原子を含んでなり、また酵素切断部位を適宜含む連結基であり、
Ｍは、Ｄ_１の蛍光特性を調節するように選択される酵素切断可能基である。

適切には、Ｄ_１とＤ_２は、適切な条件下で蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）が互いに起こるように、連結基Ｌによってリンクされる。ＦＲＥＴは、２種の色素分子の電子励起状態がフォトンの放出なしに相互作用する、距離に関係するプロセスである。Ｆｏｒｓｔｅｒ，Ｔ．，“Ｉｎｔｅｒｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｅｎｅｒｇｙ Ｔｒａｎｓｆｅｒ ａｎｄ Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ”，Ａｎｎ．Ｐｈｙｓｉｋ．，Ｖｏｌ．２，ｐ．５５，（１９４８）を参照のこと。この相互作用による１つの結果は、ドナー分子の励起がアクセプター分子の蛍光発光を促進することである。ドナーの蛍光量子効率は、それに対応して減少する。エネルギー移動効率はドナー分子とアクセプター分子の間の距離（ｒ）の６乗に反比例して減少するので、ＦＲＥＴが起こるためには、適切にはドナー色素分子とアクセプター色素分子が近接近していなければならない（通常１０〜１００Å）。適切には、本発明において、Ｄ_１がドナー分子である場合にＤ_２がアクセプターとなるように、また逆も同様となるように、ＦＲＥＴの関係においてＤ_１又はＤ_２をドナー又はアクセプターとすることができる。ドナーとは、その色素部分が光からのエネルギーを吸収する能力があり、一部分以上がアクセプターの吸収スペクトル内にある波長周波数の光を放出することを意味する。アクセプターとは、その色素部分がドナー色素部分によって放出される波長のエネルギーを吸収する能力があることを意味する。適切には、ドナー色素分子の発光スペクトルの一部分以上とアクセプター色素分子の吸収スペクトルとの間に重なりがある。適切には、アクセプター色素の最大発光波長が、ドナー色素の最大発光波長よりも長い。一形式では、ドナー及びアクセプター分子の一方が、第２の蛍光性アクセプター又はドナー蛍光体に近接近している非蛍光性（又は消光性）の蛍光体であることがある。非蛍光色素が励起されると、蛍光エネルギーではなく熱としてエネルギーが散逸され、共鳴エネルギー移動も蛍光発光も起こり得ない。

ＭがＤ_１と共有結合している場合に、Ｄ_１が蛍光発光しない又は実質的に蛍光発光しない、あるいは最大発光波長Ｅ_ｍａｘ＝λ１’で蛍光発光する第１の蛍光状態となるように、基Ｍは適切にはＤ_１の蛍光特性を調節する能力がある酵素切断可能基から選択される。適切には、ＭをＤ_１から酵素的に切断すると式（Ｉ’）の化合物が形成されるように、Ｍは酵素の基質を含み、（図１参照）、Ｄ_１が最大発光波長Ｅ_ｍａｘ＝λ１で蛍光発光するようにＤ_１の蛍光特性を第２の蛍光状態へと変化させる。適切には、Ｄ_２は最大発光波長がＥ_ｍａｘ＝λ２である蛍光色素である。適切には、式（Ｉ）の化合物において、λ１’≠λ１≠λ２である。

適切には、連結基Ｌは、−Ｃ（Ｏ）−、−ＮＲ’−、−Ｏ−、−Ｓ−、−ＣＨ＝ＣＨ−、−ＣＯ−ＮＨ−、フェニレニル及び下記の基から選択される１種以上の基を適宜含むことができる炭素原子から選択される２〜２００個の連結原子を含有する基を含んでなる。

式中、Ｒ’は水素及びＣ_１〜Ｃ_４アルキルから選択され、ｍは１〜３の整数である。

好ましい一実施形態では、連結基Ｌは２〜５０個の連結原子を含有し、下記構造を有する。

−｛（ＣＨＲ’）_ｐ−Ｑ−（ＣＨＲ’）_ｒ｝_ｓ−
式中、Ｑは、−Ｃ（Ｏ）−、−ＮＲ’−、−Ｏ−、−Ｓ−、−ＣＨ＝ＣＨ−、−ＣＯ−ＮＨ−及びフェニレニル基から選択され、Ｒ’は水素又はＣ_１〜Ｃ_４アルキルであり、各ｐは独立して０〜１０であり、各ｒは独立して０〜１０であり、ｓは１、２、又は３である。

好ましくは、Ｑは−Ｃ（Ｏ）−、−ＣＨＲ’−、−Ｏ−及び−ＣＯ−ＮＨ−から選択され、その場合のＲ’、ｐ、ｒ及びｓは上に定義されている。

別の実施形態では、リンカー基Ｌはペプチド又はオリゴヌクレオチド断片を含むこともできる。このリンカーがペプチドである、又はペプチド断片を含有する場合、リンカーは２〜２０個の自然又は非自然アミノ酸、あるいはそれらの組合せを含有することができる。Ｌは、より好ましくは２〜１２個のアミノ酸を、最も好ましくは２〜８個のアミノ酸を含有する。このリンカー基Ｌがオリゴヌクレオチドである、又はオリゴヌクレオチド断片を含有する場合、リンカー基Ｌは２〜２０個のヌクレオシド塩基又は修飾塩基を含有することができる。好ましくは、塩基の個数は４〜１５個の範囲であり、より好ましくは４〜１０個の範囲である。

このリンカーは、蛍光色素から延びる成分の一部を含むことができる。言い換えると、このリンカーを色素発色団に結合するが、その一部ではない。本発明の化合物では、リンカーはいずれもドナーとアクセプターの共役を可能にする二重結合のネットワークを含んでいない。最適なエネルギー移動が起こるように、ドナー及びアクセプター蛍光色素の遷移モーメントは、互いに垂直でない方向に配向させる、例えば互いに概ね平行又は直列に位置する。比較的短いリンカー及び最適な配向により、スペクトルの重なりが小さくなっても、効率的な共鳴エネルギー移動が起こり得る。

本発明の第１の態様による一実施形態では、Ｄ_１がドナー色素であり、Ｄ_２がアクセプター色素である。この実施形態（図１Ａに示す）では、Ｄ_１の最大発光波長（λ１）がＤ_２の最大発光波長（λ２）よりも小さく、Ｄ_１の発光スペクトルの一部分以上とＤ_２の吸収スペクトルとの間に重なりがある。ＭがＤ１と共有結合している場合には、Ｄ_１が蛍光発光しない又は実質的に蛍光発光しない、あるいは最大蛍光発光波長λ１’で蛍光発光する。ここで、λ１’はλ１よりも小さい。この状態においては、Ｄ_１の発光スペクトルとＤ_２の吸収スペクトルとの間には重なりがなく、又は実質的には重なりがなく、したがってＤ_１とＤ_２との間のエネルギー移動はない。ＭをＤ_１から切断すると、Ｄ_１が最大発光波長λ１で蛍光発光するようにＤ_１の蛍光特性を第２の蛍光状態へと変化させる。その結果、Ｄ_１の発光スペクトルとＤ_２の吸収スペクトルとの間の重なりが再生され、Ｄ_１とＤ_２との間のエネルギー移動が起こり得る。したがって、ドナー色素Ｄ_１を適当な励起波長で励起すると、Ｄ_２からの蛍光発光の増加を検出及び／又は定量化することができる。

第２の実施形態では、Ｄ_２がドナー色素であり、Ｄ_１がアクセプター色素である。この実施形態（図１Ｂに示す）では、Ｄ_２の最大発光波長（λ２）がＤ_１の最大発光波長（λ１）よりも小さく、Ｄ_２の発光スペクトルの一部分以上とＤ_１の吸収スペクトルとの間に重なりがある。ＭがＤ_１と共有結合している場合には、Ｄ_１が蛍光発光しない又は実質的に蛍光発光しない、あるいは最大蛍光発光波長＝λ１’で蛍光発光する。ここで、λ１’はλ１よりも大きい。この状態においては、Ｄ_２の発光スペクトルとＤ_１の吸収スペクトルとの間には重なりがなく、又は実質的には重なりがなく、したがってＤ_２とＤ_１との間のエネルギー移動はない。ＭをＤ_１から切断すると、Ｄ_１が最大発光波長λ１で蛍光発光するようにＤ_１の蛍光特性を第２の蛍光状態へと変化させる。その結果、Ｄ_２の発光スペクトルとＤ_１の吸収スペクトルとの間の重なりが再生され、エネルギー移動が起こり得る。ドナー色素Ｄ_２を適当な励起波長で励起すると、Ｄ_１からの蛍光発光の増加を検出及び／又は定量化することができる。

Ｄ_２がドナー色素であり、Ｄ_１がアクセプターであるこの実施形態においては、エネルギー移動がドナー色素とアクセプター色素の２つの蛍光状態との間で代わりに起こることがある。この構成では、第１の蛍光状態におけるアクセプター色素がある波長λ１’で発光し、Ｍが切断されると、第２の波長λ１で発光する第２の蛍光状態を生じる。

さらなる実施形態では、Ｄ_１の第１及び第２の蛍光状態が、それぞれの最大発光波長λ１及びλ１’によってではなく、これらの２つの状態から放出される蛍光の強度によって異なることがある。

式（Ｉ）の化合物は、蛍光共鳴エネルギー移動を利用するアッセイにおける生化学的切断現象を検出するためのレポーター分子として使用することができる。適切には、基Ｍは、好ましくはペプチダーゼ、プロテアーゼ、ホスファターゼ、デアルキラーゼ及びグリコシダーゼからなる群から選択される切断酵素の基質を含んでなる。ＭをＤ_１から切断するのに適した条件下でこの基質を酵素で処理することにより、Ｄ_１の蛍光特性を調節し、それによりＤ_１を上述したように第１の蛍光状態から第２の蛍光状態へ切り替える。

好ましい一実施形態では、Ｍが、Ｄ_１と共有結合している１つ以上のリン酸基を有し、かつ下記構造を有するリン酸エステル結合を含む。

式中、ｎは１〜４の整数である。この実施形態では、色素Ｄ_１のアルコール誘導体及び無機リン酸を生成するために、細菌アルカリホスファターゼや酸性ホスファターゼなどのホスファターゼによって基質を切断することができる。結果として、Ｄ_１は第１の蛍光状態から第２の蛍光状態へと切り替えられ、それによりドナー部分とアクセプター部分との間で励起エネルギーの移動が可能となる。ドナー色素がその励起波長で励起されると、アクセプター色素の発光波長における蛍光強度が増加する。リン酸エステルは、予め合成した基質でもよいし、あるいは、化学的加水分解によって、又は以下の構造を有する終端リン酸標識ヌクレオシドポリリン酸からの酵素触媒ヌクレオシド一リン酸もしくはヌクレオシドポリリン酸の移動によってその場で生成することもできる。

式中、Ｒ^１及びＲ^２は、独立してＨ及びＯＨから選択され、Ｒ_ａはアデニン、グアニン、シトシン、チミン、ウラシル、ヒポキサチン及びキサチンから選択されるヌクレオシド塩基であり、ｋは１〜６の整数である。

別の好ましい実施形態では、Ｍが、Ｄ_１に共有結合しているペプチド結合（−ＣＯ−ＮＨ−）を１つ以上含む。この実施形態では、Ｍが通常下記構造を有する。

式中、Ｒ^ｂはペプチド又はタンパクの残基である。ペプチダーゼ又はプロテアーゼによって加水分解すると、Ｍが蛍光エネルギー移動標識から切断される。ドナー部分をその励起波長で励起すると、ドナー色素とアクセプター色素との間でエネルギーが移動し、それによりアクセプターからの蛍光発光の増加を検出することが可能となる。

さらなる実施形態では、Ｍはグリコシド結合を含み、α−グリコシダーゼ（例えばα−アミラーゼ）やβ−グリコシダーゼ（例えばβ−グルコシダーゼ）などのグリコシダーゼの基質であり、下記構造を有する。

さらなる実施形態では、Ｍが、デアルキラーゼの基質であり下記構造を有するエーテル結合を含んでなる。

式中、Ｒ^ｃはＣ_１〜Ｃ_２０の直鎖又は分枝鎖アルキルである。

さらなる一実施形態では、基Ｍがさらに細胞膜透過性の基を含んでなり、この基は次式のエーテル、エステル、アミド、ホスホジエステル基などの基から選択することができる。

式中、Ｒ^ｄは、非置換又は１つ以上のハロゲン原子で置換されたＣ_１〜Ｃ_１０の直鎖又は分枝鎖アルキル、非置換又は１つ以上のハロゲン原子で置換されたフェニル、あるいはペプチド鎖である。適切には、ハロゲン原子は、フッ素、塩素、臭素及びヨウ素から選択することができる。このような膜透過性の基の有用な例には、酢酸エステル基、ピバロイルエステル基、アセトキシメチルエステル基、ペンタフルオロベンジルエーテル基、ペンタフルオロベンジルアミド基、ペンタフルオロベンジルエステル基、フェニルリン酸基、パーフルオロ−（Ｃ_１〜Ｃ_６）アルキルエーテル基、パーフルオロ−（Ｃ_１〜Ｃ_６）アルキルエステル基及びパーフルオロ−（Ｃ_１〜Ｃ_６）アルキルアミド基が含まれる。このような基は、デアルキラーゼ、プロテアーゼなどのエステラーゼ、及び細胞内に見られるようなホスホジエステラーゼの基質であり、それらによって加水分解される。レポーター分子の細胞透過性の可変性は当業者によって理解されるであろうし、また当業者が試験することが可能である。

ドナー色素は、適切にはクマリン色素、ベンゾクマリン色素、アクリドン色素、キサンチン色素、フェノキサジン色素、ローダミン色素、メロシアニン色素、及びシアニン色素から、好ましくはキサンチン色素及びシアニン色素から選択することができ、このドナー色素はエネルギーをアクセプター色素に移動させる能力がある。

アクセプター色素は、適切にはクマリン色素、ベンゾクマリン色素、アクリドン色素、キサンチン色素、フェノキサジン色素、ローダミン色素、メロシアニン色素、及びシアニン色素から選択することができ、このアクセプター色素は、ドナー色素と共にエネルギーを移動させる能力がある。

好ましくは、ドナー色素がキサンチン色素又はシアニン色素であり、アクセプター色素がローダミン又はシアニン色素である。

好ましい一実施形態では、前記ドナー及びアクセプター色素部分の１つ以上がシアニン色素である。別の好ましい実施形態では、ドナー色素がキサンチン色素であり、アクセプター色素がローダミン色素である。

適切なキサンチン色素には、５−カルボキシフルオレセイン、６−カルボキシフルオレセイン、６−カルボキシ−４’，５’−ジクロロ−２’，７’−ジメトキシフルオレセインなどのフルオレセイン及びその誘導体が含まれるが、それだけには限らない。

適切なシアニン色素には、ＣｙＡ（３−（ε−カルボキシペンチル）−３’−エチル−５，５’−ジメチルオキサカルボシアニン）、Ｃｙ２（３−（ε−カルボキシペンチル）−３’−エチル−オキサ−カルボシアニン）、Ｃｙ３（３−（ε−カルボキシペンチル）−１’−エチル−３，３，３’，３’−テトラメチル−５，５’−ジスルフォナト−カルボシアニン）、Ｃｙ３．５（３−（ε−カルボキシペンチル）−１’−エチル−３，３，３’，３’−テトラメチル−４，５，４’，５’−（１，３−ジスルフォナト）ジベンゾ−カルボシアニン）、Ｃｙ５（１−（ε−カルボキシペンチル）−１’−エチル−３，３，３’，３’−テトラメチル−５，５’−ジスルフォナト−ジカルボシアニン、Ｃｙ５．５（１−（ε−カルボキシペンチル）−１’−エチル−３，３，３’，３’−テトラメチル−４，５，４’，５’−（１，３−ジスルフォナト）−ジベンゾ−ジカルボシアニン）、及びＣｙ７（１−（ε−カルボキシペンチル）−１’−エチル−３，３，３’，３’−テトラメチル−５，５’−ジスルフォナト−トリカルボシアニンが含まれるが、それだけには限らない。

適切なローダミンアクセプター色素には、５−カルボキシローダミン（ローダミン１１０−５）、６−カルボキシローダミン（ローダミン１１０−６）、５−カルボキシローダミン−６Ｇ（Ｒ６Ｇ−５又はＲＥＧ−５）、６−カルボキシローダミン−６Ｇ（Ｒ６Ｇ−６又はＲＥＧ−６）、Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラメチル−５−カルボキシローダミン、Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラメチル−６−カルボキシローダミン（ＴＡＭＲＡ又はＴＭＲ）、５−カルボキシ−Ｘ−ローダミン、及び６−カルボキシ−Ｘ−ローダミン（ＲＯＸ）が含まれるがそれだけには限らない。他のクラスの色素には、ＢＯＤＩＰＹ（登録商標）、ポルフィリン色素、ｒｈｏｄｏｌ色素及びペリレン色素が含まれる。

この第１の態様による蛍光標識酵素基質は、化合物に親水特性を与えるためにそれら基質に結合した水溶化成分を含むこともできる。それら水溶化成分は、好ましくはドナー又はアクセプター色素部分の芳香族環系に結合する。あるいは、連結基Ｌがこの水可溶化基を含有することもできる。適切な可溶化成分は、アミド、スルホン酸塩、硫酸塩、リン酸塩、四級アンモニウム、ヒドロキシル、グアニジン及びホスホン酸塩からなる群から選択することができる。ドナー及び／又はアクセプター蛍光色素の芳香族環に直接結合したスルホン酸塩又はスルホン酸基が特に好ましい。

本発明によるエネルギー移動レポーター分子の例を表１に示す。

例（ＩＩ）、（ＩＩＩ）及び（ＩＶ）では、レポーターが消光フルオレセインドナー色素を含有し、またＣｙ５、Ｃｙ３及びローダミンアクセプター色素をそれぞれ含有する非蛍光エネルギー移動錯体であり、フルオレセイン部分は、それに結合した酵素的に切断可能なリン酸基を有する。このリン酸基は、ホスファターゼの作用によって切断することができ、それによりドナー色素の蛍光が、フルオレセインをその励起波長で励起すると回復する。この切断現象の検出及びホスファターゼの活性の測定は、アクセプター色素の発光波長での蛍光発光を検出することによって実現することができる。

例（Ｖ）及び（ＶＩ）では、レポーターが、消光フルオレセインドナー色素を含有し、またＣｙ５及びローダミンアクセプター色素をそれぞれ含有する非蛍光エネルギー移動錯体であり、フルオレセイン部分は、それに結合したヌクレオシドポリリン酸塩部分を有する。ヌクレオシジルホスホトランスフェラーゼの作用によりその場でホスファターゼ基質が生成され、ホスファターゼの存在下でリン酸が除去される。フルオレセインドナー色素の蛍光が回復する。続いて起こるアクセプター色素へのエネルギー移動により、赤色にシフトした発光が生じる。このヌクレオシジルホスホトランスフェラーゼ酵素が核酸ポリメラーゼである場合、既知及び未知の核酸の検出、特性決定、定量化に本発明の組成物を使用することができる。

一実施形態では、Ｌが切断可能リンカーであり、酵素基質基Ｍとは異なる酵素切断可能基Ｐを含む。Ｐは、エーテル基、エステル基、アミド基、リン酸ジエステル基などの基から選択することができる。このような基は、それぞれデアルキラーゼ、プロテアーゼなどのエステラーゼ、及びホスホジエステラーゼの基質であり、それらによって水性緩衝媒体中で切断される。この実施形態では、Ｄ_２がＬと結合しているときは第１の発光波長λ２で、Ｄ_２がＬから切断されると第２の発光波長λ２’でＤ_２が発光することが好ましい。ここでλ２≠λ２’である。この実施形態のレポーター化合物は、２つの別々の酵素基質を確実に等しく供給することが困難である生体内及び細胞系内で２つの酵素の相対活性を測定するのに有用である。また、Ｍと結合しているときは第１の発光波長（λ１）で、Ｍが切断されると異なる波長（λ１’）でＤ_１が発光することも可能である。ここでλ１≠λ１’である。例（ＶＩＩ）は、アリルスルファターゼ及びカテプシンＧの活性に対するこのような二重酵素レポーターを示しており、この二重酵素レポーターは、炎症を検出する際には潜在的に有用である。酵素活性がない場合、例（ＶＩＩ）の化合物を３６０ｎｍで励起すると６１０ｎｍで弱い発光がある。６４５ｎｍの励起では発光は認められない。スルファターゼ活性のみの場合、６４５ｎｍで励起すると６６０ｎｍで強い発光が認められ、３６０ｎｍで励起すると４５０ｎｍ及び６６０ｎｍで弱い発光がある。カテプシンＧ活性のみの場合、３６０ｎｍで励起すると４５０ｎｍで強い発光が認められるが、３６０ｎｍ又は６４５ｎｍで励起しても６６０ｎｍでは発光しない。両方の酵素が存在する場合には、３６０ｎｍで励起すると４５０ｎｍで強い発光が認められ、６４５ｎｍで励起すると６６０ｎｍで別の強い発光がある。３６０ｎｍの励起では、６６０ｎｍの発光は認められない。したがって、６６０ｎｍ及び４５０ｎｍでの発光を測定し、既知の基準と比較することにより、生体系内における特定の時点又は位置での両酵素の相対酵素活性を決定することが可能である。このような二重酵素活性用基質は、異なる病状を区別する、ならびに病状の臨床病期又は病原力を決定するのに有用である。

ＭＭＰ−２もＭＭＰ−９も共に腫瘍の検出及び治療を目標としている。例えば、メラノーマでは、これらのタンパクの発現は大きく変化する。非常に攻撃的な腫瘍ではＭＭＰ−９が高レベルで発現するが、早期腫瘍では、過剰発現は認められない。良性腫瘍はＭＭＰ−９活性を示さない。同様に、高い活性を示す湿潤がんではＭＭＰ−２の活性も大きく変化する。これは、患者の大部分に当てはまるが、すべての患者に当てはまるわけではない。したがって、ＭＭＰ−２又はＭＭＰ−９の活性のみを測定すると、攻撃的な腫瘍を良性であると誤診してしまうことがある。骨粗しょう症では、カテプシンＫが、破骨細胞に過剰発現するので、治療標的に認定されているが、この活性は、骨粗しょう症とは関連のない通常の骨代謝回転中にも認められる。骨粗しょう症であっても、高レベルのＭＭＰ−９が認められる。しかしながら、ＭＭＰ−９の活性を測定することは、それほど骨粗しょう症の特異的な指標ではない。したがって、両方の活性及びそれらの比を測定することにより、単一の酵素活性を測定するよりも優れた診断ツールが提供される。

本発明の第２の態様では、基質分子に作用する酵素の活性を決定する方法が提供され、この基質は式（Ｉ）の化合物を含んでなる。式中のＤ_１、Ｄ_２及びＬは上に定義されており、Ｍは切断酵素の基質を含んでなる。この方法は、ｉ）蛍光標識基質の蛍光強度を測定する段階と、ｉｉ）ＭをＤ_１から切断するための条件下で、活性を決定すべき酵素を基質と複合させる段階と、ｉｉｉ）段階ｉｉ）の複合に続いて、蛍光標識の蛍光強度の変化を測定する段階とを含んでなり、蛍光標識の蛍光強度の変化を使用して酵素の活性を決定する。

適切には、式（Ｉ）の化合物は、活性を決定すべき酵素の基質であり、Ｍは、上に定義されているように好ましくはリン酸エステル結合、１つ以上のペプチド結合、エーテル結合及びグリコシド結合から選択される酵素切断可能基を含んでなる。この酵素は好ましくは、ホスファターゼ、ペプチダーゼ、プロテアーゼ、デアルキラーゼ及びグリコシダーゼからなる群から選択される加水分解酵素である。

第２の態様による好ましい一実施形態では、酵素が、ＰＴＰａｓｅ、ＰＰＴａｓｅ−２Ａ、ＰＰＴａｓｅ−２Ｂ、又はＰＰＴａｓｅ−２Ｃを含めた、Ｅ．Ｃ．Ｃｌａｓｓ３．１から選択されるホスファターゼである。例には、チロシンホスファターゼ、ＰＰ１及びＰＰ−２Ｂ（セリン／トレオニンホスファターゼ）がある。

第２の態様による第２の好ましい実施形態では、酵素がＥ．Ｃ．Ｃｌａｓｓ３．４から選択されるペプチダーゼである。例には、アンギオテンシン変換酵素（ＡＣＥ）、カスパーゼ、カテプシンＤ、キモトリプシン、ペプシン、サブチリシン、プロテイナーゼＫ、エラスターゼ、ネプリライシン、サーモライシン、ａｓｐ−ｎ、マトリックスメタロプロテイナーゼ１〜２０、パパイン、プラスミン、トリプシン、エンテロキナーゼ及びウロキナーゼが含まれるが、それだけには限らない。

別の実施形態では、酵素が好ましくはＥ．Ｃ．Ｃｌａｓｓ３．２からなる群から選択されるグリコシダーゼ、例えば、α−アミラーゼ、β−アミラーゼ、グルカン１，４−α−グルコシダーゼ、セルラーゼ、エンド−１，３−β−グルカナーゼ、オリゴ−１，６−グルコシダーゼ、リゾチームである。

さらなる実施形態では、酵素がデアルキラーゼ、例えばシトクロムＰ−４５０の異なるイソ酵素である。

ペルオキシダーゼ、β−ラクタマーゼ、ニトロ還元酵素など他の酵素を、適当なＭ又はリンカー構造とともに使用することもできる。これらの酵素の蛍光原基質、例えば、（欧州特許第１０８６１７９号，Ｈａｍｉｌｙｔｏｎ，Ａ．ｅｔ ａｌ）に記載されているような、Ａｍｐｌｅｘ ｒｅｄ、フルオレセイン及び６−クロロ−７−ヒドロキシクマリン置換セロファロスポリン、ならびにニトロシアニンがよく知られている。同様の構造を、上述の組成物に組み込むこともできる。

調査中の酵素反応への試験剤の阻害作用、増強作用、アゴニスト又はアンタゴニスト作用をスクリーニングする用途を含めたハイスループットスクリーニング用途では、本発明に従ってアッセイを行うことができる。したがって、第２の態様による好ましい実施形態では、基質を切断する際の酵素の活性への作用を決定すべき試験剤をスクリーニングする方法が提供される。この方法は、（ａ）試験剤がある状態とない状態とで第２の態様による方法を実施する段階と、（ｂ）この剤がある状態とない状態とで酵素の活性を決定する段階とを含んでなり、前記剤がある状態とない状態との間の酵素の活性の差は、酵素の活性への試験剤の作用を示す。あるいは、試験剤がある状態でこの方法を行い、酵素の活性の値を試験剤のない状態における酵素活性の対照値と比較することによりスクリーニングを実施することもできる。この対照値は、データベースに又は他の電子形式で都合よく電子的に格納することができる。

本発明の第３の態様では、式（Ｉ）の化合物を含んでなる基質分子に作用する２つの酵素の相対活性を決定する方法が提供される。式中、上に定義されているようにＤ_１は第１の色素部分、Ｄ_２は第２の色素部分であり、Ｍは第１の切断酵素の基質を含んでなり、Ｌは第１の切断酵素とは異なる第２の切断酵素の基質である酵素切断可能基Ｐを含む。この方法は、ｉ）蛍光標識基質の蛍光発光強度を測定する段階と、ｉｉ）ＭをＤ_１から、またＤ_２をＤ_１から切断するための条件下で、第１及び第２の酵素を基質と複合させる段階と、ｉｉｉ）段階ｉｉ）の複合に続いて、第１及び第２の色素部分の蛍光発光強度を測定する段階と、ｉｖ）第１及び第２の色素部分の蛍光強度の変化を利用してこれらの酵素の相対活性を決定する段階とを含んでなる。

適切には、第１及び第２の酵素を、いずれかの順序で経時的に、あるいは同時に基質分子と複合させることができる。好ましくは、第１及び第２の酵素は、上述したように、ホスファターゼ、ペプチダーゼ、プロテアーゼ、デアルキラーゼ及びグリコシダーゼからなる群から選択される。

本発明の第３の態様による方法を使用して、基質分子に作用する２つの酵素の相対活性への試験剤の作用を決定することもできる。その場合、試験剤がない状態とある状態とで複合段階ｉｉ）を実施する。前記剤がある状態とない状態との間の第１及び第２の酵素の相対活性の差は、第１及び第２の酵素の相対活性への試験剤の作用を示す。

この試験剤は、例えば、合成分子や天然物（例えばペプチド、オリゴヌクレオチド）など任意の有機又は無機化合物、あるいはエネルギー形態（例えば光又は熱、あるいは他の形態の電磁放射線）でよい。この好ましい実施形態による方法を用いて、酵素活性の阻害剤を検出することもできる。例えば、公知の阻害剤ペプスタチンＡがカテプシンＤの酵素活性を阻害することは、本発明の方法を用いることで容易に示すことができる。したがって、１２ナノモルのペプスタチンＡがある状態では、カテプシンＤの活性は、阻害剤がない状態の約５分の１である。

適切には、剤がない状態とある状態との間の酵素活性の差は、規格化され、電子的に格納され、基準値と比較される。したがって、例えば、活性の差を阻害率（％）（又は刺激率（％））として電子データベースに格納し、この値を問題となっている酵素の基準阻害剤での対応する値と比較することができる。このようにして、ある所定のしきい値（例えば、基準化合物と同等以上に有効であること）を満たす試験剤のみを、さらなる試験の対象として選択することができる。

一例としては、タンパク分解酵素の活性を検出するためのアッセイを以下のように構成することができる。酵素と式（Ｉ）による蛍光エネルギー移動レポーター化合物を複合させることにより、反応混合物を調製する。式中、基Ｍはタンパク分解酵素切断部位を含んでなる。このアッセイは、２４個、９６個、３８４個又はより高密度のウェル、例えば１５３６個のウェルを有するマルチウェルプレート、例えばマイクロタイタプレートのウェル内で適切に行われる。この反応は、酵素基質が最初に存在する水性アッセイ緩衝液中で、適切には５ｍＭのＭｇＣｌ_２を含有する１０ｍＭのＭＯＰｓ、５０ｍＭのＴｒｉｓ又は５０ｍＭのＨＥＰＥＳ中で行うことができる。既知の又は推定上の阻害剤などの試験剤を、この反応混合物に適宜含めることができる。酵素を添加すると、通常反応を最後まで進行させることができ、蛍光光度計を用いて記録される蛍光性アクセプター色素による定常状態の蛍光発光を観察することにより進行がモニターされる。あるいは、反応を所定の時間進行させ、その後、多くの場合非特異的である停止試薬、通常酵素活性の阻害剤で停止させることができる「停止」条件下で、このアッセイを行うこともできる。停止試薬の例にはＥＤＴＡがあり、この試薬を使用して通常酵素活性に必要とされる金属イオンを分離する。

本発明による方法を利用して、細胞環境における、本発明による化合物を含んでなる基質に作用する酵素の活性を測定することもできる。したがって、第２及び第３の態様による特定の実施形態では、その方法が、流動媒体中の１つ以上の細胞に基質を加える段階を段階ｉ）の前に含んでなる。

通常、培養細胞は、細胞増殖に適した条件下で、０．５時間から２４時間までに及び得るある期間、適切な細胞培養液中０．１〜１００μＭの濃度のＦＲＥＴ結合酵素基質で培養される。細胞は、標準的な細胞培養技術に従って培養される。例えば、加湿した空気９５％／ＣＯ_２５％の雰囲気を含む培養器内の、３７℃の無菌環境における適切な容器内で細胞が培養される。多種多様な細胞型の培養に利用可能なプロトコールが確立されている（例えば、Ｆｒｅｓｈｎｅｙ，Ｒ．Ｉ．，Ｃｕｌｔｕｒｅ ｏｆ Ａｎｉｍａｌ Ｃｅｌｌｓ：Ａ Ｍａｎｕａｌ ｏｆ Ｂａｓｉｃ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ，２^ｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ａｌａｎ Ｒ．Ｌｉｓｓ Ｉｎｃ．１９８７を参照のこと。）。細胞培養又は組織培養において培養される細胞に基質を導入する必要がある場合、基質を単に培養液に添加する。酵素活性への作用を決定すべき試験剤がある状態で、細胞を基質に接触させることもできる。この実施形態では、検出段階により、調査中の酵素の活性への試験剤の作用が測定される。

光電子倍増管が検出器として組み込まれた器具を用いて蛍光強度の測定を行うことができる。荷電結合素子（ＣＣＤ）撮像装置（走査型撮像装置や面走査撮像素子など）によって蛍光強度の変化を測定して、マイクロタイタプレートのウェルのすべてを撮像することができる。ＬＥＡＤｓｅｅｋｅｒ（登録商標）システムは、ＣＣＤカメラを特徴とし、単一パスで高密度マイクロタイタプレートの蛍光画像化を可能にする。画像化は定量的かつ高速であり、画像化用途に適した器具使用により、現在マルチウェルプレート全体を同時に撮像することができる。酵素活性に対する試験剤の活性を検出するためにアッセイの形式を定めようとする場合、基質の蛍光の連続測定下でアッセイを行うことができる。この形式では、蛍光標識基質の強度は連続的に変化する。この標識基質は、酵素反応の生成物から分離する必要がなく、したがって反応の時間経過を得ることができ、反応速度研究をリアルタイムで行うことが可能となる。

本発明の第４の態様では、１種以上の酵素の活性を測定するための試験キットが提供される。この試験キットは１種以上の異なる酵素基質を含んでなり、前記基質の各々は式（Ｉ）の化合物を含んでなり、式中のＤ_１、Ｄ_２、Ｌは上に定義されており、Ｍは切断酵素の基質を含んでなる。好ましくは、この試験キットは、各酵素が異なる前記基質に特異的な１種以上の異なる酵素をさらに含んでなる。

当業者にはよく知られている直接化学結合法を用いて蛍光エネルギー移動部分Ｄ_１−Ｌ−Ｄ_２を基Ｍと共有結合することによって、式（Ｉ）の化合物を調製することができる。ここで、Ｄ_１、Ｄ_２、Ｍ及びＬは上に定義されている。あるいは、実施例に示すようなデノボ合成法によって本発明の化合物を調製することもできる。最初に基ＭをＤ_１に結合して中間化合物Ｍ−Ｄ_１を形成し、続いてリンカー基Ｌを介してＤ_２を結合することができる。Ｄ_２を共有結合する前に、リンカー基ＬをＭ−Ｄ_１に都合よく共有結合してもよく、あるいはＬを前もってＤ_２に結合してもよい。本発明で用いるペプチド、タンパク及びオリゴヌクレオチド基質を終端位置で、あるいは１つ以上の内部位置で標識化することができる。蛍光色素標識試薬を用いたタンパク標識の検討及び例には、“Ｎｏｎ−Ｒａｄｉｏａｃｔｉｖｅ Ｌａｂｅｌｌｉｎｇ，ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ｉｎｔｒｏｄｕｃｔｉｏｎ”，Ｇａｒｍａｎ，Ａ．Ｊ．Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，１９９７、“Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｉｏｎ−Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｃｏｕｐｌｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ｆｏｒ ｔｈｅ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ”，Ａｓｌａｍ，Ｍ．ａｎｄ Ｄｅｎｔ，Ａ．，Ｍａｃｍｉｌｌａｎ Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ Ｌｔｄ，（１９９８）を参照のこと。合成ペプチドにおける部位特異的な標識を得るためのプロトコールが利用可能である。例えば、Ｈｅｒｍａｎｓｏｎ，Ｇ．Ｔ．，Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ（１９９６）を参照のこと。

本発明の原理及び機能を明確化するために、以下の実施例についてこれから言及するが、添付の特許請求の範囲及び本発明の範囲を限定すると解釈すべきではない。本発明は、本明細書に提供した教示から明らかとなる任意の及びすべての変形形態を包含すべきものである。

１． ＦＲＥＴ結合レポーター分子の調製（化合物（Ｖ）及び化合物（ＶＩ）（図２参照）
１．１． ４’（５’）−フルオレセインジエチルエーテル−エステル：化合物（２）
ＮａＯＨ（１．４４ｇ）のメタノール（１４５ｍｌ）溶液に、フルオレセイン（６．０ｇ）を加えて暗色溶液を生成し、この溶液を真空中で濃縮乾燥した。これを無水ＤＭＦ（２×５０ｍｌ）と同時蒸発させ、無水ＤＭＦ（１５０ｍｌ）に再溶解した。ヨウ化エチル（１１．６ｍｌ、８ｅｑ）を加え、反応物を室温で一晩中攪拌した。この反応混合物を濃縮した後、重炭酸ナトリウム飽和溶液（１５０ｍｌ）に溶解し、ジエチルエーテルで洗浄した。この溶液を冷却すると黄色い沈殿物が形成され、この沈殿物をろ過し、最後にエーテル（２×２５ｍｌ）及びエーテル／ペンタン（１：１、５０ｍｌ）で洗浄した。

１．２． ４’（５’）−クロロアセチルアミノメチル−３’（６’）−エチルフルオレセインジエチルエーテル−エステル：化合物（３）
エチルフルオレセインエステル（化合物（２）、２．６７ｇ）の５０ｍｌ硫酸攪拌溶液に、クロロアセチルアセトアミド（８５０ｍｇ）をゆっくりと５分間かけて加えた。この反応混合物を、室温で一晩攪拌した。その反応混合物を砕氷上に注ぎ、形成された沈殿物をろ過し、冷水で洗浄した。ＴＬＣ及び質量分析により、モノ及びビスクロロアセトアミド化合物の形成が示された。これらの生成物を、塩化メチレン中２〜１５％のメタノールを用いたシリカゲルカラムクロマトグラフィーによって精製した。まずビスアルキル化生成物を溶出し、その後２種のモノアルキル化生成物を溶出した。主生成物であるより低い分子量のモノアルキル化生成物をさらなる反応に使用した。

１．３． ４’（５’）−アミノメチル−３’（６’）−エチルフルオレセイン：化合物（５）
主生成物のモノアルキル化生成物（化合物（３）、１ｇ）を、２．５時間の加熱によって６ＮのＨＣｌ（１５ｍｌ）で加水分解した。この生成物をＣＨ_２Ｃｌ_２で抽出し、水で洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥した後、シリカゲルカラムクロマトグラフィーによって精製して５００ｍｇの純粋化合物を得た。ＭＳ ＥＳ＋：３９０．３
１．４． ４’（５’）−トリフルオロアセチルアミドメチル−３’（６’）−エチルフルオレセイン：化合物（６）
化合物（５）（３９０ｍｇ）を無水ピリジン（５ｍｌ）中に入れ、ＴＦＡ−ＮＨＳ（６５０ｍｇ）を加えた。この混合物を室温で一晩攪拌した。真空中で濃縮し、塩化メチレンで抽出した後、この生成物をシリカゲルクロマトグラフィーによって精製して３５０ｍｇの純粋生成物を得た。ＭＳ ＥＳ＋：４８６．３
１．５． ４’（５’）−トリフルオロアセチルアミドメチル−３’（６’）−エチルフルオレセイン−６’（３’）−リン酸：化合物（７）
化合物（６）（２００ｍｇ）のアセトニトリル（５ｍｌ）溶液に、ＰＯＣｌ_３（１８９ｍｇ、３ｅｑ）を加え、この反応混合物を室温で１時間攪拌した。ピリジン（２９０μｌ、９ｅｑ）を加え、この反応物をさらに２時間攪拌した。ＴＥＡＢ（０．１Ｍ、１０ｍｌ）を加えることによってこの反応物を失活させた。１時間後、この混合物を真空中で濃縮し、ＣＨ_２Ｃｌ_２／メタノールのグラジェントを用いたシリカゲルクロマトグラフィーによって精製して１３０ｍｇの一リン酸を得た。ＭＳ ＥＳ⁻：５６４．５
１．６． ４’（５’）−アミノメチル−３’（６’）−エチルフルオレセイン−６’（３’）−四リン酸塩−チミジン：化合物（８）
１．６．１． 化合物（７）イミダゾライド誘導体の合成
化合物（７）（６０ｍｇ）の無水ＤＭＦ（２ｍｌ）溶液に、トリブチルアミン（３０μｌ、３ｅｑ）を加え、この混合物を真空中で濃縮乾燥した。その混合物を無水ＤＭＦ（２ｍｌ）に再溶解し、攪拌しながらカルボニルジイミダゾール（８５ｍｇ、５ｅｑ）を加えた。この混合物を室温で２時間攪拌し、ＨＰＬＣ−ＭＳによって反応終了を確認した。この混合物をメタノール（１００μｌ）で失活させ、室温で１時間攪拌し、真空中で濃縮乾燥し、無水ＤＭＦ（２ｍｌ）に再溶解した。ＭＳ ＥＳ⁻：６１４．６
１．６．２． 化合物（７）イミダゾライド誘導体のチミジン−５’−三リン酸への付加
チミジン−５’−三リン酸（トリエチルアンモニウム塩、１００μｍｏｌ）を、無水ＤＭＦ（２×２ｍｌ）中のトリブチルアミン（４００μｍｏｌ）と同時蒸発させ、最終的に無水ＤＭＦ（２ｍｌ）に再溶解した。

上記チミジン−５’−三リン酸（ＴＴＰ）のトリブチルアンモニウム塩溶液に、イミダゾライド誘導体（段階１．６．１による）を加え、この混合物を室温で一晩攪拌した。ＨＰＬＣ−ＭＳにより、＞９０％の完全な反応であることが示された。これをさらに５時間攪拌した。

１．６．３． 段階１．６．２による反応混合物の濃縮及びＮＨ _４ ＯＨ（３０％溶液、１０ｍｌ）の添加
この混合物を室温で２．５時間攪拌し、冷蔵庫に一晩放置した。その混合物を真空中で濃縮乾燥し、アニオン交換クロマトグラフィーによって精製した。この混合物をヘビ毒ホスホジエステラーゼ（ＳＶＤ）及びアルカリホスファターゼで一晩処理し（未反応ＴＴＰを除去するため）、さらに０．１ＭのＴＥＡＢ中２５％のアセトニトリルに対して０．１ＭのＴＥＡＢ（緩衝液Ａ）を用いた逆相クロマトグラフィーによって精製した。ＨＰＬＣ−ＭＳによって２つの主なピークを収集し、分析した。第１の主なピークは９３１．８で質量を示し、第２のピークでは所要の９３２．８で質量を示した。

トリフルオロアセチル基の加水分解中のアンモニア処理ではスピロラクトンとも反応し、結果として不要なアミド化合物が形成されたことが明らかであった。ピーク２を真空中で濃縮乾燥し、メタノール（２×５ｍｌ）と同時蒸発させ、Ｈ_２Ｏ（１ｍｌ）に再溶解した。その濃度はＵＶによって測定した。全部で５．５μｍｏｌの純粋化合物を得た。

１．７． 化合物（８）へのアクセプター色素の付加：化合物（Ｖ）及び（ＶＩ）の合成
化合物（８）（２．２μｍｏｌ、４００μｌの５．５ｍＭ溶液）２つの別々の反応容器に、４００μｌの０．５Ｍ炭酸ナトリウム／重炭酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ８．５）を加え、一方の容器には５−ＲＯＸ−ＮＨＳエステル（２ｍｌのＤＭＦ中５．５ｍｇ）を、もう一方の容器にはＣｙ５−ＮＨＳエステル（２ｍｌのＤＭＦ中５ｍｇ）を加えた。両方の反応混合物を室温で一晩攪拌し、ＨＰＬＣ−ＭＳによって反応の終了をモニターした。この反応混合物を真空中で濃縮し、０．１ＭのＴＥＡＢ中の２５％アセトニトリル（緩衝液Ａ）及び１ＭのＴＥＡＢ中の２５％アセトニトリル（緩衝液Ｂ）を用いたイオン交換カラムで最初に精製した。生成物を含有するピークを真空中で濃縮し、さらに逆相ＨＰＬＣカラムによって再精製した。正確な画分を収集し、真空中で濃縮し、紫外分光法によって定量化した。化合物（Ｖ）：ＭＳ ＥＳ⁻：１４４９；化合物（ＶＩ）：ＭＳ ＥＳ⁻：１５７２
２． 化合物（ＩＩ）、（ＩＩＩ）及び（ＩＶ）の合成
出発原料が（化合物（７）をメタノール中でＫ_２ＣＯ_３により加水分解することによって得られた）４’（５’）−アミノメチル−エトキシフルオレセインリン酸であることを除いては、化合物（Ｖ）及び（ＶＩ）のための上述のやり方で合成を行った。生成物をＨＰＬＣによって精製し、紫外分光法によって定量化した。

化合物（ＩＩ）：ＭＳ ＥＳ⁻：１１０７．３；
化合物（ＩＩＩ）：ＭＳ ＥＳ⁻：１３４２．４；
化合物（ＩＶ）：ＭＳ ＥＳ⁻：８８１
３． アルキルホスファターゼの化合物（ＩＩ）、（ＩＩＩ）及び（ＩＶ）に対する作用

化合物ＩＩ、ＩＩＩ及びＩＶを、２５ｍＭのＨＥＰＥＳ及び５ｍＭのＭｇＣｌ_２緩衝液（ｐＨ８．５）中に入れ、室温で２時間アルカリホスファターゼにより処理した。反応を分光法で追跡した結果、反応が３０分以内にほとんど終了したことが示された。

４． 化合物（ＩＩ）、（ＩＩＩ）、（ＩＶ）、（ＶＩＩＩ）、（ＩＸ）及び（Ｘ）のＵＶ、蛍光及びエネルギー移動測定
リン酸化色素（化合物（ＩＩ）、（ＩＩＩ）及び（ＩＶ））及び非リン酸化色素（化合物（ＶＩＩＩ）、（ＩＸ）及び（Ｘ））のＵＶ及び蛍光スペクトルを図２〜８に示す。アルカリホスファターゼで処理すると約４７２ｎｍにピークが出現することを、ＵＶスペクトルがはっきりと示している。

本発明の特定の望ましい諸実施形態を本明細書で説明してきたが、企図した本発明の範囲から逸脱することなくそれらの実施形態に変更を加えることができることを理解されたい。本発明の真の範囲は、添付の特許請求の範囲に示される。

本発明の好ましい諸実施形態を示す概略図である。 化合物（Ｖ）及び（ＶＩ）を調製するための合成反応スキームを示す図である。 アルカリホスファターゼによる処理前及び処理後の化合物（ＩＩ）のＵＶスペクトルを示す図である。 アルカリホスファターゼによる処理前及び処理後の化合物（ＩＩＩ）のＵＶスペクトルを示す図である。 アルカリホスファターゼによる処理前及び処理後の化合物（ＩＶ）のＵＶスペクトルを示す図である。 アルカリホスファターゼによる処理前及び処理後の化合物（ＩＩ）の、４５５ｎｍ及び４７５ｎｍ励起による発光スペクトルを示す図である。 アルカリホスファターゼによる処理前及び処理後の化合物（ＩＩＩ）の、４５５ｎｍ及び４７５ｎｍ励起による発光スペクトルを示す図である。 アルカリホスファターゼによる処理前及び処理後の化合物（ＩＶ）の、４５５ｎｍ及び４７５ｎｍ励起による発光スペクトルを示す図である。

Claims (6)

1. 次の式（Ｉ）の化合物。
   式中、Ｄ_１は、エネルギー移動構成におけるドナーとして適するように蛍光特性を調節することができる第１の色素部分であって、クマリン色素、ベンゾクマリン色素、アクリドン色素、キサンチン色素、フェノキサジン色素、ローダミン色素、メロシアニン色素及びシアニン色素から選択されるものであり、
   Ｄ_２は、前記第１の色素とのエネルギー移動構成においてアクセプターとして適した第２の色素部分であって、クマリン色素、ベンゾクマリン色素、アクリドン色素、キサンチン色素、フェノキサジン色素、ローダミン色素、メロシアニン色素及びシアニン色素から選択されるものであり、
   Ｍは、Ｄ _１ の蛍光特性を調節するように選択される酵素切断可能基であって、第１の切断酵素の基質であり、
   Ｌは、２〜２００個の連結原子を含む連結基であって、該連結基が切断可能リンカーであり、第１の切断酵素とは異なる第２の切断酵素の基質である酵素切断可能基Ｐを含むものである。
2. 前記ドナー色素がキサンチン色素又はシアニン色素であり、前記アクセプター色素がローダミン又はシアニン色素である、請求項１記載の化合物。
3. スルホン酸塩、スルホン酸、リン酸塩、ホスホン酸塩、四級アンモニウム及びヒドロキシルからなる群から選択される、当該化合物に結合した水溶化成分をさらに含む、請求項１又は請求項２記載の化合物。
4. 前記第１の酵素が、ペプチダーゼ、プロテアーゼ、ホスファターゼ、デアルキラーゼ及びグリコシダーゼから選択される、請求項１乃至請求項３のいずれか１項記載の化合物。
5. 前記酵素切断可能基Ｐが、エーテル基、エステル基、アミド基、リン酸ジエステル基から選択される、請求項１乃至請求項４のいずれか１項記載の化合物。
6. 前記連結基Ｌが、２〜５０個の連結原子を有する以下の構造のものである、請求項１乃至請求項４のいずれか１項記載の化合物。
   −｛（ＣＨＲ’） _ｐ −Ｑ−（ＣＨＲ’） _ｒ ｝ _ｓ −
   式中、Ｑは、−Ｃ（Ｏ）−、−ＮＲ’−、−Ｏ−、−Ｓ−、−ＣＨ＝ＣＨ−、−ＣＯ−ＮＨ−及びフェニレニル基から選択され、Ｒ’は水素又はＣ _１ 〜Ｃ _４ アルキルであり、各ｐは独立して０〜１０であり、各ｒは独立して０〜１０であり、ｓは１、２、又は３である。