CN1985171A - 荧光共振能量转移酶底物 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了式(I)的化合物，其中D1是第一染料部分，其荧光特性可被调节，以使其适合在能量转移布置中作为供体或受体；D2是第二染料部分，适合在具有所述第一染料的能量转移布置中作为受体或供体；L是含2－200个连接原子的连接基团，其中所述连接基团可选地包括酶切位点；M是选择用于调节D1的荧光特性的可酶切基团。式(I)的化合物可用作报告分子，用于在使用荧光共振能量转移的实验中检测生物化学切割事件。

Description

荧光共振能量转移酶底物
发明领域
本发明涉及荧光型实验；并涉及测量酶活性的试剂和方法，具体地说是涉及酶切割实验。
发明背景
检测酶活性(具体地说是酶切割活性，例如水解)的实验广泛用于生物学和药学。随着组合化学和高通量筛选的出现，对简单、灵敏和有成本效益的酶活性潜在调节物筛选实验的需求不断增长。其中令制药工业特别感兴趣的是检测蛋白水解酶切割和磷酸切割的方法。
就操作简便性、灵敏度、成本和自动化简易性而言，荧光型实验提供了超越放射化学、ELISA、抗体和更多检测酶切割活性的传统技术的明显优势。荧光底物通常用于均相酶实验，以测定酶活性，或在药物开发中用于测定潜在药物对酶活性的作用。这些酶底物有许多都可以由市场购买获得，或已在文献中有报道。例如，US 4812409(Babb，B.等)公开了可水解的荧光底物，其包含衍生于phenalenone或benzphenalenone的被封闭染料部分，当其在酶水解过程中由底物上被切下时，形成在约530nm以上具有荧光发射的荧光染料。还可基于荧光素和罗丹明的衍生物获得对水解酶有反应的底物。例如，二磷酸荧光素是广泛使用的、非荧光且无色的碱性磷酸酶(PP2A)底物，当其被该酶水解时形成荧光素(Vieytes M等，Anal.Biochem.，(1997)，248，258-64)。但是，基于荧光素的底物通常加入了两个酶切位点，通过首先切割成单取代的荧光类似物，然后切割成游离荧光团，发生两阶段酶动力学。因为单取代荧光底物吸收和发射的波长与游离荧光团相同，所以更加难以阐明酶动力学。业已描述了基于4-甲基伞形酮氟化衍生物的荧光底物，用于β-半乳糖苷酶活性和酸性磷酸酶活性实验(Gee，K.R.等，(1999)， 273，41-8)。
用于荧光型酶实验的许多染料在350-550nm范围内发射。某些确实以较高波长发射的染料(例如试卤灵和DDAO)与硫醇(包括具有硫醇官能团的肽/蛋白)反应，失去了其荧光特性。因此，它们不太可能用于体内用途。具有在光谱的红色或红外区域发射的有用荧光特性的染料的荧光型酶底物是硝基取代的花青染料衍生物(EP 1086179B1：Hamilton，A.等)。这些染料的荧光因分子中存在取代硝基而被猝灭。当硝基还原酶还原硝基时，染料变成发荧光的。这些荧光底物已被证明是有用的，目前用于活细胞实验；但是，它们仅有有限的用途。因此，明确需要以较高波长(红或红外)发射的新荧光酶，其只对目标酶有反应性，且提供高信号∶本底比率。
本发明描述了新荧光酶底物，其是一系列不同酶的底物，以不同的波长(包括红和近红外)发射。本发明还提供用于测定两种酶活性比率的双酶底物。其更适合于体内系统，在体内系统中，不能依靠两种分离的酶底物来检测相对酶活性，原因是各个单独酶底物的吸收、分布和排出特性有差异。最后，本发明还提供测定酶活性的方法，以及在体外或体内测定代谢状态的方法。
因此，本发明的一个目标是提供荧光标记的酶底物，具体地说是荧光共振能量转移(FRET)标记底物，以及检测酶在切割底物时活性的方法，所述底物包含FRET标记和酶切割基团。
本发明的另一个目标是提供可影响酶切活性的测试物的筛选方法。
发明概述
因此，在本发明的第一个方面，提供式(I)的化合物：
M-D1-L-D2
(I)
其中：
D1是第一染料部分，其荧光特性可被调节，以使其适合在能量转移布置中作为供体或受体；
D2是第二染料部分，适合在具有所述第一染料的能量转移布置中作为受体或供体；
L是含2-200个连接原子的连接基团，其中所述连接基团可选地包含酶切位点；以及
M是被选择用于调节D1的荧光特性的可酶切基团。
适宜地，D1和D2通过连接基团L连接，使得在合适的条件下，一个与另一个可发生荧光共振能量转移(FRET)。FRET是一种与距离相关的过程，其中电激发态的两种染料分子相互作用，而没有发射光子。参见Forster，T.，“Intermolecular Energy Transfer andFluorescence”，Ann.Physik.，第2卷，55页，(1948)。该相互作用的一个结果是供体分子的激发增强了受体分子的荧光发射。相应地，减少了供体的荧光量子产额。为发生FRET，供体和受体染料分子必须适宜地紧密相邻(通常在10-100之间)，因为能量转移效率随供体和受体分子之间距离(r)的6次方成反比下降。在本发明中，D1或D2在FRET关系中可适宜地为供体和受体，使得当D1为供体分子时，D2为受体，反之亦然。所谓供体指染料部分能够由光吸收能量并于至少部分处于受体吸收光谱中的波长频率发射光。所谓受体指染料部分能够于吸收供体染料部分发射波长的能量。适宜地，供体染料分子的至少一部分发射光谱与受体染料分子的吸收光谱重叠。适宜地，受体染料最大发射波长长于供体染料最大发射波长。在一种形式中，供体或受体分子之一可为与第二荧光受体或供体荧光团紧密相邻的非荧光(或猝灭)荧光团。当激发非荧光染料时，能量以热而不是荧光能量散发，不能发生共振能量转移或荧光发射。
适宜地，基团M选自这样的可酶切基团：其能够调节D1的荧光特性，使得当M共价连接至D1时，D1处于或者没有或基本没有荧光发射、或者以最大发射波长Emax＝λ1′发射荧光的第一种荧光状态。适宜地，M包含酶底物，使得在M与D1被切开时形成式(I′)的化合物时(参见图1)，引起D1的荧光特性变为第二种荧光状态，使得D1以最大发射波长Emax＝λ1发射荧光。适宜地，D2是荧光发射最大值的荧光染料，Emax＝λ2。适宜地，在式(I)的化合物中，λ1′≠λ1≠λ2。
适宜地，连接基团L包括含2-200个连接原子的基团，其选自碳原子，可选地可包括选自以下的一个或多个基团：-C(O)-、-NR′-、-O-、-S-、-CH＝CH-、-CO-NH-、亚苯基和基团：
Figure A20058001998400091
其中R′选自H和C1-C4烷基，m为1-3的整数。
在一个优选实施方案中，连接基团L包含2-50个连接原子，具有结构：
-{(CHR′)p-Q-(CHR′)r}s-
其中Q选自：-C(O)-、-NR′-、-O-、-S-、-CH＝CH-、-CO-NH-和亚苯基；R′为H或C1-C4烷基，每个p均独立地为0-10，每个r均独立地为0-10，s为1、2或3。
优选Q选自：-C(O)-、-CHR′-、-O-和-CO-NH-，其中R′、p、r和s如上文定义。
在另一个实施方案中，连接基团L还可包含肽或寡核苷酸片段。当接头为肽或包含肽片段时，其可包含2-20个天然或非天然氨基酸或其组合。更优选L包含2-12个氨基酸，最优选包含2-8个氨基酸。当连接基团L为寡核苷酸或包含寡核苷酸片段时，其可包含2-20个核苷碱基或修饰碱基。优选碱基数在4-15的范围内，更优选在4-10的范围内。
接头可包括组分中由荧光色素延伸出来的部分。换句话说，接头连接至染料发色团，但不是其一部分。在本发明的化合物中，接头中没有一个包含允许供体和受体缀合的双键网络。为发生最优能量转移，供体和受体荧光色素的跃迁距以彼此非垂直方向定向，例如一般彼此相对平行或串联定位。在相对较短的接头和最优方向的情况下，即便在光谱重叠变小时，也可能存在有效的共振能量转移。
附图简述
图1是一幅阐述本发明优选实施方案的示意图。
图2图示了制备化合物(V)和(VI)的合成反应流程。
图3显示了碱性磷酸酶处理前和后化合物(II)的UV光谱。
图4显示了碱性磷酸酶处理前和后化合物(III)的UV光谱。
图5显示了碱性磷酸酶处理前和后化合物(IV)的UV光谱。
图6显示了碱性磷酸酶处理前和后于455nm和475nm激发的化合物(II)的发射光谱。
图7显示了碱性磷酸酶处理前和后于455nm和475nm激发的化合物(III)的发射光谱。
图8显示了碱性磷酸酶处理前和后于455nm和475nm激发的化合物(IV)的发射光谱。
优选实施方案的详述
在本发明第一方面的一个实施方案中，D1是供体染料，D2是受体染料。在该实施方案(示于图1A)中，D1的最大发射波长(λ1)小于D2的最大发射波长(λ2)，至少一部分D1的发射光谱与D2的吸收光谱有重叠。当M共价连接至D1时，D1或者没有或基本没有荧光发射，或者发射最大荧光发射波长为λ1′的荧光，其中λ1′小于λ1。在此情况下，D1的发射光谱和D2的吸收光谱之间没有或基本没有重叠，使得D1和D2之间没有能量转移。当M与D1被切开时，引起D1的荧光特性变为第二种荧光状态，使得D1在最大发射波长λ1发射荧光。结果，恢复了D1的发射光谱和D2的吸收光谱之间的重叠，D1和D2之间可发生能量转移。因此，当以合适的激发波长激发供体染料D1时，可检测和/或定量D2的荧光发射增加。
在第二个实施方案中，D2是供体染料，D1是受体染料。在该实施方案(示于图1B)中，D2的最大发射波长(λ2)小于D1的最大发射波长(λ1)，至少一部分D2的发射光谱与D1的吸收光谱有重叠。当M共价连接至D1时，D1或者没有或基本没有荧光发射，或者发射最大荧光发射波长为λ1′的荧光，其中λ1′大于λ1。在此情况下，D2的发射光谱和D1的吸收光谱之间没有或基本没有重叠，使得D2和D1之间没有能量转移。当切开M与D1时，引起D1的荧光特性变为第二种荧光状态，使得D1在最大发射波长λ1发射荧光。结果，恢复了D2的发射光谱和D1的吸收光谱之间的重叠，可发生能量转移。当以合适的激发波长激发供体染料D2时，可检测和/或定量D1的荧光发射增加。
在D2为供体和D1为受体的实施方案中，能量转移可在供体染料和两种荧光状态的受体染料之间交替发生。在此布置中，第一种荧光状态的受体染料以一种波长λ1′发射，当切下M时，产生于第二种波长λ1发射的第二种荧光状态。
在进一步的实施方案中，D1的第一种和第二种荧光状态可以并非因其各自的最大发射波长λ1和λ1′而不同，而是由于两种状态发射的荧光强度而不同。
式(I)的化合物可用作报告分子，用于在使用荧光共振能量转移的实验中检测生物化学切割事件。适宜地，基团M包含切割酶的底物，切割酶优选地选自肽酶、蛋白酶、磷酸酶、脱烷基酶和糖苷酶。在适于引起M与D1被切开的条件下用酶处理底物，可调节D1的荧光特性，由此如上文所述将D1由第一种荧光状态转变为第二种荧光状态。
在一个优选实施方案中，M包含磷酸酯键，其具有一个或多个共价键合至D1的磷酸基团，并具有以下结构：
Figure A20058001998400121
其中n是1-4的整数。在该实施方案中，底物能够被磷酸酶，例如细菌碱性磷酸酶或酸性磷酸酶切割，产生染料D1的醇衍生物和无机磷酸盐。因此，引起D1由第一种荧光状态转变为第二种荧光状态，由此能够在供体和受体部分之间转移激发能量。当以其激发波长激发供体染料时，受体染料激发波长的荧光强度有增加。磷酸酯可为预先合成的底物，或者可通过化学水解或酶催化由具有以下结构的末端磷酸标记的核苷多磷酸转移核苷单磷酸或核苷多磷酸而原位产生：
Figure A20058001998400122
其中R1和R2独立地选自H和OH；Ra是核苷碱基，其选自腺嘌呤、鸟嘌呤、胞嘧啶、胸腺嘧啶、尿嘧啶、次黄嘌呤和黄嘌呤；k是1-6的整数。
在另一个优选实施方案中，M包含至少一个共价键合至D1的肽键(-CO-NH-)。在该实施方案中，M通常具有以下结构：
其中Rb是肽或蛋白的残基。当利用肽酶或蛋白酶水解时，M与荧光能量转移标记被切开。当以其激发波长激发供体部分时，能量在供体和受体染料之间转移，使得可以检测受体荧光发射的增加。
在另一个实施方案中，M包含作为糖苷酶(例如α-糖苷酶(例如α-淀粉酶)、β-糖苷酶(例如β-葡糖苷酶))底物的糖苷键，具有以下结构：
在另一个实施方案中，M包含作为脱烷基酶底物的醚键，具有以下结构：
Rc-O-
其中Rc是C1-C20直链或支链烷基。
在又再一个实施方案中，基团M还包含细胞膜透过性基团，其可选自例如下式的醚、酯、酰胺和磷酸二酯基团：
其中Rd是C1-C10直链或支链烷基(或者未取代或者被一个或多个卤素原子取代)、苯基(或者未取代或者被一个或多个卤素原子取代)或肽链。适宜地，卤素原子可选自F、Cl、Br和I。这样的膜透过性基团的有用实例包括乙酸酯、新戊酰酯、乙酰氧基甲酯、五氟苄基醚、五氟苄基酰胺、五氟苄基酯、苯基磷酸酯、全氟-(C1-C6)烷基醚、全氟-(C1-C6)烷基酯和全氟-(C1-C6)烷基酰胺基团。这样的基团是存在于细胞中的脱烷基酶、酯酶(例如蛋白酶和磷酸二酯酶)的底物，并被这些酶水解。技术人员会意识到报告分子细胞透过性的可变性，并能够测试该可变性。
适宜地，供体染料可选自香豆素染料、苯并香豆素染料、吖啶酮染料、黄嘌呤染料、吩噁嗪染料、罗丹明染料、部花青染料和花青染料，优选黄嘌呤染料和花青染料，其中供体染料能够向受体染料转移能量。
适宜地，受体染料可选自香豆素染料、苯并香豆素染料、吖啶酮染料、黄嘌呤染料、吩噁嗪染料、罗丹明染料、部花青染料和花青染料，其中受体染料能与供体染料进行能量转移。
优选地，供体染料是黄嘌呤染料或花青染料，受体染料是罗丹明染料或花青染料。
在一个优选实施方案中，所述供体和受体染料部分中至少一种是花青染料。在另一个优选实施方案中，供体染料是黄嘌呤染料，受体染料是罗丹明染料。
合适的黄嘌呤染料包括但不限于荧光素及其衍生物，例如5-羧基荧光素、6-羧基荧光素和6-羧基-4′，5′-二氯-2′，7′-二甲氧基荧光素。
合适的花青染料包括但不限于CyA(3-(ε-羧戊基)-3′-乙基-5，5′-二甲基氧杂羰(ethyl-oxa-carbo)花青)、Cy2(3-(ε-羧戊基)-3′-乙基-氧杂-羰花青)、Cy3(3-(ε-羧戊基)-1′-乙基-3，3，3′，3′-四甲基-5，5′-二磺酸基-羰花青)、Cy3.5(3-(ε-羧戊基)-1′-乙基-3，3，3′，3′-四甲基-4，5，4′，5′-(1，3-二磺酸基-)二苯并-羰花青)、Cy5(1-(ε-羧戊基)-1′-乙基-3，3，3′，3′-四甲基-5，5′-二磺酸基-二羰花青、Cy5.5(1-(ε-羧戊基)-1′-乙基-3，3，3′，3′-四甲基-4，5，4′，5′-(1，3-二磺酸基)-二苯并-二羰花青和Cy7(1-(ε-羧戊基)-1′-乙基-3，3，3′，3′-四甲基-5，5′-二磺酸基-三羰花青。
合适的罗丹明受体染料包括但不限于：5-羧基罗丹明(罗丹明110-5)、6-羧基罗丹明(罗丹明110-6)、5-羧基罗丹明-6G(R6G-5或REG-5)、6-羧基罗丹明-6G(R6G-6或REG-6)、N，N，N′，N′-四甲基-5-羧基罗丹明、N，N，N′，N′-四甲基-6-羧基罗丹明(TAMRA或TMR)、5-羧基-X-罗丹明和6-羧基-X-罗丹明(ROX)。其它类型的染料包括BODIPYTM、卟啉染料、对甲氨基酚染料和苝染料。
第一方面的荧光标记酶底物还可包含与其连接的水溶性组分，用于赋予化合物亲水特征。它们优选连接到供体或受体染料部分的芳环系统。或者，连接基团L可包含水溶性基团。适合的溶解性组分可选自酰胺、磺酸盐、硫酸盐、磷酸盐、季铵盐、羟基、胍和膦酸酯。特别优选直接连接至供体和/或受体荧光色素的芳环的磺酸盐或磺酸基团。
本发明的能量转移报告分子的实例示于表1。
表1FRET偶联报告分子的实例
Figure A20058001998400151
Figure A20058001998400171
在实例(II)、(III)和(IV)中，报告分子是一种非荧光能量转移复合物，其分别包含猝灭的荧光素供体染料和Cy5、Cy3以及罗丹明受体染料，荧光素部分具有与其连接的可酶切磷酸基团。可通过磷酸酶的作用切割磷酸基团，由此在以其激发波长激发荧光素时恢复供体染料的荧光。可通过在受体染料的发射波长检测荧光发射，实现切割事件的检测和磷酸酶活性的检测。
在实例(V)和(VI)，报告分子是一种非荧光能量转移复合物，其分别包含猝灭的荧光素供体染料和Cy5以及罗丹明受体染料，荧光素部分具有与其连接的核苷磷酸基团。核苷磷酸转移酶的作用在原位产生磷酸酶底物，该底物在磷酸酶存在下经历磷酸去除。荧光素供体染料的荧光得以恢复。随后向受体染料转移能量，产生红移发射。当核苷磷酸转移酶为核酸聚合酶时，本发明的组合物可用于检测、表征和定量已知和未知的核酸。
在一个实施方案中，L是可切割接头，包括可酶切基团P，其与酶底物基团M不同。P可选自例如醚、酯、酰胺和磷酸二酯基团。这些基团分别为脱烷基酶、酯酶(例如蛋白酶)和磷酸二酯酶的底物，并在水性缓冲介质中分别被这些酶切割。在该实施方案中，优选D2在连接至L时以第一发射波长λ2发射，一旦D2与L被切开，则D2以第二发射波长λ2′发射，其中λ2≠λ2′。该实施方案的报告化合物可用于在难以确保两种单独的酶底物等量传递的体内和细胞系统中检测两种酶的相对活性。还可以是D1在连接至M时以第一发射波长(λ1)发射，当M被切去时D1以不同的波长(λ1′)发射，其中λ1≠λ1′。实例(VII)显示了这样一种用于芳基硫酸酯酶和组织蛋白酶G活性的双酶报告分子，其潜在地用于检测炎症。当不存在酶活性时，以360nm激发实例(VII)的化合物时于610nm有弱发射。以645nm激发未观测到发射。当仅有硫酸酯酶活性时，以645nm激发时于660nm观测到强发射，以360nm激发时于450nm和660nm观测到弱发射。当仅有组织蛋白酶G活性时，以360nm激发时于450nm观测到强发射，以360nm或645nm激发时于660nm未观测到发射。当两种酶都存在时，以360nm激发时于450nm观测到强发射，以645nm激发时于660nm观测到另一强发射。当以360nm激发时未观测到660nm的发射。因此，通过检测660nm和450nm的发射以及通过和已知标准对比，有可能测定两种酶在特定时间点的相对酶活性或在体内系统中的定位。这样的双酶活性底物可用于区分不同病状，以及确定病状的临床阶段或侵蚀性。
MMP-2和MMP-9已成为肿瘤检测和治疗的靶，例如在黑素瘤中，这些蛋白的表达变化显著。尽管在极具侵袭性的肿瘤中MMP-9高水平表达，但在早期肿瘤中未观测到过表达。良性肿瘤未显示出MMP-9活性。同样，MMP-2活性也显著变化，侵袭性肿瘤显示出较高活性。尽管这对大多数患者成立，但并非对所有患者都成立。因此，仅检测MMP-2或MMP-9活性可导致将侵袭性肿瘤误诊为良性。就骨质疏松而言，组织蛋白酶K已被鉴别为治疗靶，因为其在破骨细胞中过表达；但是，在与骨质疏松症不相关的正常骨转换中也观察到该活性。然而，在骨质疏松症中还观察到高水平的MMP-9。但是，检测MMP-9活性并不是骨质疏松症的非常特异性的指标。因此，检测两种活性及其比率提供了比检测单个酶活性更好的诊断工具。
在本发明的第二个方面，提供一种测定酶作用于底物分子的活性的方法，底物包含式(I)的化合物，其中D1、D2和L如前文定义；M包含切割酶的底物。该方法包括以下步骤：i)检测荧光标记底物的荧光强度；ii)在导致M与D1被切开的条件下将活性待测的酶与底物混合；和iii)在步骤ii)的混合之后检测荧光标记的荧光强度变化；其中荧光标记的荧光强度变化用于测定酶活性。
适宜地，式(I)的化合物是活性待测的酶的底物，其中M包含可酶切基团，其优选选自如前文定义的磷酸酯键、至少一个肽键、醚键和糖苷键。优选地，所述酶为水解酶，其选自磷酸酶、肽酶、蛋白酶、脱烷基酶和糖苷酶。
在第二方面的一个优选实施方案中，所述酶是磷酸酶，其选自E.C.分类号3.1，包括PTP酶、PPT酶-2A、PPT酶-2B或PPT酶-2C。实例是：酪氨酸磷酸酶、PP1和PP-2B(丝氨酸/苏氨酸磷酸酶)。
在第二方面的第二个优选实施方案中，所述酶是肽酶，其选自E.C.分类号3.4。实例包括但不限于：血管紧张素转化酶(ACE)、胱天蛋白酶、组织蛋白酶D、胰凝乳蛋白酶、胃蛋白酶、枯草杆菌蛋白酶、蛋白酶K、弹性蛋白酶、中性溶酶、嗜热菌蛋白酶、asp-n、基质金属蛋白酶1-20、木瓜蛋白酶、纤溶酶、胰蛋白酶、肠激酶和尿激酶。
在另一个实施方案中，所述酶为糖苷酶，其优选选自E.C.分类号3.2，例如α-淀粉酶、β-淀粉酶、葡聚糖1，4-α-葡糖苷酶、纤维素酶、内切-1，3-β-葡聚糖酶、寡聚-1，6-葡糖苷酶和溶菌酶。
在另一个实施方案中，所述酶为脱烷基酶，例如细胞色素P-450的不同同工酶。
还可使用其它酶(例如过氧化物酶、β-内酰胺酶、硝基还原酶等)以及合适的M或接头结构。这些酶的荧光底物众所周知，例如AmplexRed、荧光素和6-Cl-7-羟基香豆素取代的头孢菌素，以及硝基花青，例如描述干(EP 1086179B1，Hamilton，A.等)的那些硝基花青。可将相似的结构加入到上述组合物中。
可在高通量筛选应用中按照本发明进行实验，所述高通量筛选应用包括其中筛选测试物对所研究酶反应的抑制作用、增效作用、激动作用或拮抗作用的那些应用。因此，在第二方面的优选实施方案中，提供测试物筛选方法，其中测试物对酶切割底物活性的作用有待测定。该方法包括以下步骤：(a)在有和没有测试物时实施第二方面的方法；和(b)在有和没有该测试物时测定酶活性；其中在有和没有所述测试物时的酶活性差异指示测试物对酶活性的作用。或者，可在测试物存在下实施所述方法，并对比酶活性值与没有测试物时的对照酶活性值，由此进行筛选。对照值可便利地以电子化方式储存为数据库或其它电子格式。
在本发明的第三方面，提供测定两种酶作用于底物分子的相对活性的方法，底物分子包含式(I)的化合物，其中，如前文所述，D1是第一染料部分，D2是第二染料部分，M包含第一种切割酶的底物，L包含可酶切基团P，其是不同于第一种切割酶的第二种切割酶的底物。该方法包括以下步骤：i)测量荧光标记底物的荧光发射强度；ii)在导致M与D1被切开和D2与D1被切开的条件下将第一种和第二种酶和底物混合；iii)在步骤ii)的混合之后测量第一种和第二种染料部分的荧光发射强度；和iv)利用第一种和第二种染料部分的荧光强度变化测定酶的相对活性。
适宜地，第一种和第二种酶可以任一顺序与底物分子序贯混合，或同时与底物分子混合。优选地，第一种和第二种酶选自如前文所述的磷酸酶、肽酶、蛋白酶、脱烷基酶和糖苷酶。
按照本发明第三方面的方法还可用于测定测试物对两种酶作用于底物分子的相对活性的作用，其中在没有和有测试物的情况下实施混合步骤ii)。在有和没有所述测试物时的第一种和第二种酶的相对活性之间的差异指示测试物对第一种和第二种酶的相对活性的作用。
测试物可为例如任何有机或无机化合物，例如合成分子或天然产物(例如肽、寡核苷酸)，或者可为能量形式(例如光或热或其它形式的电磁辐射)。可使用按照优选实施方案的方法检测酶活性的抑制剂；例如，使用本发明方法，可容易地表明已知的抑制剂胃酶抑制剂A抑制组织蛋白酶D的酶活性。因此，在12nM胃酶抑制剂A存在下，组织蛋白酶D活性是没有抑制剂时大约1/5。
适宜地，对没有和有测试物时的酶活性之间的差异标准化，以电子化方式储存，并与参比值对比。因此，例如，活性差异可以抑制百分率(或刺激百分率)储存在电子数据库上，将该值与所研究酶的标准抑制剂的对应值对比。以此方式，只有满足某一预定阈值(例如和参比化合物相比等效或更有效)的测试物才可被选择作为进一步测试的目标。
作为实例，可如下设定检测蛋白水解酶活性的实验。通过混合酶和式(I)的荧光能量转移报告化合物，制备反应混合物，其中基团M包含蛋白水解酶切位点。该实验适宜在多孔板的孔中进行，例如具有24孔、96孔、384孔或更高孔密度的微量滴定板，例如1536个孔。可用最初存在于水性检测缓冲液中的酶底物进行该反应，所述缓冲液适宜地为含5mM MgCl2的10mM MOPs、50mM Tris或50mM HEPES。可选地，在反应混合物中可包含测试物，例如已知或推定的抑制剂。当加入酶时，通常使反应进行至完成，通过观测由荧光受体染料产生的稳态荧光发射来监测进程，所述稳态荧光发射使用分光荧光计记录。或者，可在“终止”条件下进行实验，其中使反应进行预定的时间，然后用终止剂终止，终止剂一般为酶活性抑制剂，经常是非特异性的。终止试剂的实例是EDTA，其用于螯合酶活性一般需要的金属离子。
本发明的方法还可用于测量作用于细胞环境中的底物的酶活性，所述底物包含本发明的化合物。因此，在第二和第三方面的具体实施方案中，该方法在步骤i)前包括将底物加至液体培养基中的一种或多种细胞的步骤。
通常，在适于细胞生长的条件下，在合适的细胞培养基中，将培养的细胞与0.1-100μM浓度的FRET-偶联酶底物温育可为0.5-24小时的时间。按照标准细胞培养技术培养细胞，例如在合适的容器中，在无菌环境下，在含湿润的95％空气/5％CO2气氛的培养箱中于37℃培养细胞。已有可用于不同细胞类型培养的已确立方案。(参见例如Freshney，R.I.，Culture of Animal Cells：A Manual of BasicTechnique，第2版，Alan R.Liss Inc.1987)。当需要将底物引入到在细胞或组织培养基中的细胞中时，只不过将底物加入到培养基中。还可在其对酶活性作用待测的测试物存在下使细胞与底物接触。在该实施方案中，检测步骤可测量测试物对所研究酶的活性的作用。
可使用加入光电倍增管的仪器作为检测器进行荧光强度检测。可利用电荷耦合器件(CCD)成像仪(例如扫描成像仪或面积型成像仪)对微量滴定板的全部孔成像，测量荧光强度变化。LEADseekerTM系统以CCD照相机为特征，允许对高密度微量滴定板一次性荧光成像。成像是定量和快速的，适于成像用途的仪器现在可同时对整个多孔板成像。当实验设计用于测定测试物对酶活性的活性时，实验可在连续检测底物荧光的条件下进行。在该实验形式中，荧光标记底物的强度连续变化。标记的底物不需要与酶反应产物分离，因此可获得反应的时程，使得可实时进行动力学研究。
在本发明的第四个方面，提供测量至少一种酶活性的测试试剂盒，该测试试剂盒包含一种或多种不同的酶底物，每种所述底物都包含式(I)的化合物，其中D1、D2、L如前文定义，M包含切割酶的底物。优选地，测试试剂盒进一步包含至少一种或多种不同的酶，每种酶对不同的所述底物都是专一性的。
可使用技术人员众所周知的直接化学偶联法，通过将荧光能量转移部分D1-L-D2共价连接至基团M，制备式(I)的化合物，其中D1、D2、M和L如前文定义。或者，可通过如实施例阐述的从头合成法制备本发明的化合物。基团M首先可连接至D1，形成中间体化合物M-D1，接着经连接基团L连接D2。在共价连接D2之前，连接基团L可方便地连接至M-D1，或者L可预先连接至D2。可在末端位置，或在一个或多个内部位置，标记用于本发明的肽、蛋白和寡核苷酸底物。关于使用荧光染料标记试剂进行蛋白标记的综述和实例，参见“Non-Radioactive Labelling，a Practical Introduction”，Garman，A.J.Academic Press，1997；“Bioconjugation-Protein Coupling Techniques forthe Biomedical Sciences”，Aslam，M.和Dent，A.，Macmillan ReferenceLtd，(1998)。可用于在合成肽中获得位点特异性标记的方法例如参见Hermanson，G.T.，Bioconjugate Techniques，Academic Press(1996)。
为了阐明本发明的原理和作用，现在参考以下的实施例，这些实施例不应被解释为限制所附权利要求书和本发明的范围。本发明应包括明显由本文所提供的内容得出的任意变化。
实施例
1. FRET-偶联报告分子(化合物(V)和化合物(VI)的制备(参见图2）
1.1 4′(5′)-荧光素二乙醚-酯：化合物(2)
向NaOH(1.44g)的甲醇(145ml)溶液中加入荧光素(6.0g)，获得深色溶液，将其真空浓缩至干。将其与无水DMF(2×50ml)共蒸发，并再溶解在无水DMF(150ml)中。加入碘乙烷(11.6ml，8当量)，于室温过夜搅拌反应物。在浓缩反应混合物后，将其溶解在饱和碳酸氢钠溶液(150ml)中，并用二乙醚清洗。在冷却溶液时形成黄色沉淀，过滤沉淀，最后用二乙醚(2×25ml)和二乙醚/戊烷(1∶1，50ml)清洗。
1.2 4′(5′)-氯乙酰氨基甲基-3′(6′)-乙基荧光素二乙醚-酯：化合物(3)
在5分钟内，向搅拌的乙基荧光素酯(化合物(2)，2.67g)的50ml硫酸溶液中缓慢加入氯乙酰乙酰胺(850mg)。于室温过夜搅拌反应混合物。将反应混合物倾至碎冰上，过滤所形成的沉淀，用冷水清洗。TLC和质量分析表明形成单和双氯乙酰氨基化合物。使用2-15％甲醇的二氯甲烷溶液，通过硅胶柱层析纯化产物。首先洗脱下双烷基化产物，接着洗脱下两种单烷基化产物。较低的单烷基化产物是主产物，其用于进一步的反应。
1.3 4′(5′)-氨基甲基-3′(6′)-乙基荧光素：化合物(5)
用6N HCl(15ml)通过加热2.5小时水解单烷基化主产物(化合物(3)，1g)。用CH2Cl2萃取产物，用水清洗，在经无水硫酸钠干燥后，通过硅胶柱层析纯化，获得500mg纯化合物。MS ES+：390.3。
1.4 4′(5′)-三氟乙酰基酰氨基甲基-3′(6′)-乙基荧光素：化合物(6)
将化合物(5)(390mg)溶解在无水吡啶(5ml)中，并加入TFA-NHS(650mg)。混合物于室温过夜搅拌。在真空浓缩和用二氯甲烷萃取后，通过硅胶层析纯化产物，获得350mg纯产物。MSES+：486.3。
1.5. 4′(5′)-三氟乙酰基酰氨基甲基-3′(6′)-乙基荧光素-6′(3′)-磷酸：化合 物(7)
向化合物(6)(200mg)的乙腈(5ml)溶液中加入POCl3(189mg，3当量)，于室温搅拌反应混合物1小时。加入吡啶(290μl，9当量)，再搅拌反应物2小时。加入TEAB(0.1M，10ml)猝灭反应。1小时后，真空浓缩混合物，使用CH2Cl2/甲醇梯度，通过硅胶层析纯化，获得130mg纯单磷酸。MS ES-：564.5。
1.6 4′(5′)-氨基甲基-3′(6′)-乙基荧光素-6′(3′)-四磷酸-胸腺嘧啶：化合物 (8)
1.6.1 化合物(7)的咪唑烷(imidazolide)衍生物的合成
向化合物(7)(60mg)的无水DMF(2ml)溶液中加入三丁胺(30μl，3当量)，真空浓缩混合物至干。将混合物再溶解在无水DMF(2ml)中，在搅拌下加入羰基二咪唑(85mg，5当量)。于室温搅拌混合物2小时，通过HPLC-MS检查反应完成情况。用甲醇(100μl)猝灭混合物，于室温搅拌1小时，真空浓缩至干，并再溶解在无水DMF(2ml)中。MS ES-：614.6。
1.6.2 向胸腺嘧啶-5′-三磷酸加入化合物(7)的咪唑烷衍生物
将胸腺嘧啶-5′-三磷酸(三乙铵盐，100μmol)与三丁胺(400μmol)在无水DMF(2×2ml)中共蒸发，最后再溶解在无水DMF(2ml)中。
向以上胸腺嘧啶-5′-三磷酸(TTP)的三丁基铵盐溶液中加入咪唑烷衍生物(得自步骤1.6.1)，于室温过夜搅拌混合物。HPLC-MS表明反应完成90％以上。再另外搅拌5小时。
1.6.3浓缩步骤1.6.2的反应混合物并加入NH4OH(30％溶液，10ml)
于室温搅拌混合物2.5小时，并放置在冰箱中过夜。真空浓缩混合物至干，通过阴离子交换层析纯化。用蛇毒磷酸二酯酶(SVD)和碱性磷酸酶过夜处理该混合物(以去除任何未反应的TTP)，进一步通过使用0.1M TEAB(缓冲液A)至25％乙腈的0.1M TEAB溶液的反相层析纯化。收集两个主峰，通过HPLC-MS分析。第一个主峰获得的质量为931.8，第二个主峰获得的质量为所需的932.8。
显然，在三氟乙酰基团水解过程中的氨处理还与螺甾内酯反应，导致形成不想要的酰氨基化合物。真空浓缩峰2至干，与甲醇(2×5ml)共蒸发，并再溶解在H2O(1ml)中。UV检测浓缩物。获得总共5.5μmol纯化合物。
1.7 向化合物(8))中加入受体染料：化合物(V)和(VI)的合成
向化合物(8)(2.2μmol，400μl的5.5mM溶液)的两个单独反应容器中加入400μl的0.5M碳酸钠/碳酸氢钠缓冲液(pH8.5)，并在一个容器中加入5-ROX-NHS酯(5.5mg的2ml DMF溶液)，在另一个容器中加入Cy5-NHS酯(5mg的2ml DMF溶液)。两个反应混合物都于室温过夜搅拌，并通过HPLC-MS监测反应的完成情况。真空浓缩反应混合物，并首先在离子交换柱上使用25％乙腈的0.1M TEAB溶液(缓冲液A)和25％乙腈的1M TEAB溶液(缓冲液B)纯化。真空浓缩含产物的峰，通过反相HPLC柱进一步再纯化。收集正确的流分，真空浓缩，通过UV光谱学定量。化合物(V)：MS ES-：1449；化合物(VI)：MS ES-：1572。
2. 化合物(II)、(III)和(IV)的合成
如以上描述的用于化合物(V)和(VI)的方式进行合成，只是起始物质为4′(5′)-氨基甲基-乙氧基荧光素磷酸(通过用K2CO3的甲醇溶液水解化合物(7)获得)。通过HPLC纯化产物，并通过UV光谱学定量。
化合物(II)：MS ES-：1107.3；
化合物(III)：MS ES-：1342.4；
化合物(IV)：MS ES-：881。
3. 碱性磷酸酶对化合物(II)、(III)和(IV)的作用
(II)：   染料＝Cy5      (VIII)：  染料＝Cy5
(III)：  染料＝Cy3.5    (IX)：    染料＝Cy3.5
(IV)：   染料＝TAMRA    (X)：     染料＝TAMRA
将化合物II、III和IV溶解在25mM HEPES和5mM MgCl2缓冲液(pH8.5)中，并用碱性磷酸酶于室温处理2小时。利用光谱方法跟踪反应，结果表明反应在30分钟内基本完成。
4. 对化合物(II)、(III)、(IV)、(VIII)、(IX)和(X)进行UV、荧光和能 量转移检测
磷酸化染料(化合物(II)、(III)和(IV))和非磷酸化染料(化合物(VIII)、(IX)和(X))的UV和荧光光谱示于图2-8。UV光谱清楚表明，当用碱性磷酸酶处理时，峰出现在约472nm。
本文已描述了本发明的具体的、所需的实施方案，应当认识到，可对其进行修改，而不偏离本发明的预期范围。本发明的真正范围陈述于本文后附的权利要求书。

Claims (29)

1.一种下式的化合物：
M-D1-L-D2
其中：
D1是第一染料部分，其荧光特性可被调节，以使其适合在能量转移布置中作为供体或受体；
D2是第二染料部分，适合在具有所述第一染料的能量转移布置中作为受体或供体；
L是含2-200个连接原子的连接基团，其中所述连接基团可选地包括酶切位点；以及
M是选择用于调节D1的荧光特性的可酶切基团。
2.权利要求1的化合物，其中M包含酶底物。
3.权利要求2的化合物，其中所述酶选自肽酶、蛋白酶、磷酸酶、脱烷基酶和糖苷酶。
4.权利要求1-3的化合物，其中M为以下基团：
其中n为1-4的整数。
5.权利要求1-3中任一项的化合物，其中M包含共价键合至D1的至少一个肽键(-CO-NH-)。
6.权利要求1-3中任一项的化合物，其中M包含作为糖苷酶底物的糖苷键。
7.权利要求1-3中任一项的化合物，其中M包含作为脱烷基酶底物的醚键。
8.权利要求1-3中任一项的化合物，其中M进一步包含细胞膜透过性基团。
9.权利要求8的化合物，其中所述细胞膜透过性基团选自：
Figure A2005800199840003C1
其中Rd是未取代或者被一个或多个卤素原子取代的C1-C10直链或支链烷基、未取代或者被一个或多个卤素原子取代的苯基或肽链。
10.权利要求1-9中任一项的化合物，其中连接基团L选自碳原子，其可选地可包括一个或多个选自以下的基团：-C(O)-、-NR′-、-O-、-S-、-CH＝CH-、-CO-NH-、亚苯基和基团：
Figure A2005800199840003C2
其中R′选自H和C1-C4烷基，m为1-3的整数。
11.权利要求1-9中任一项的化合物，其中连接基团L包含肽片段或寡核苷酸片段。
12.权利要求1-9中任一项的化合物，其中L是可切割接头，包括与酶底物基团M不同的可酶切基团P。
13.权利要求1-12中任一项的化合物，其中所述供体染料选自香豆素染料、苯并香豆素染料、吖啶酮染料、黄嘌呤染料、吩噁嗪染料、罗丹明染料、部花青染料和花青染料，优选黄嘌呤染料和花青染料，其中所述供体染料能够向所述受体染料转移能量。
14.权利要求1-12中任一项的化合物，其中所述受体染料选自香豆素染料、苯并香豆素染料、吖啶酮染料、黄嘌呤染料、吩噁嗪染料、罗丹明染料、部花青染料和花青染料，其中所述受体染料能够与供体染料进行能量转移。
15.权利要求1-12中任一项的化合物，其中所述供体染料为黄嘌呤染料或花青染料，受体染料为罗丹明染料或花青染料。
16.权利要求1-12中任一项的化合物，其中所述供体染料部分和受体染料部分中的至少一种为花青染料。
17.权利要求1-12中任一项的化合物，其中所述供体染料为黄嘌呤染料，所述受体染料为罗丹明染料。
18.前述权利要求中任一项的化合物，其进一步包含与其连接的水溶性组分，所述水溶性组分选自磺酸盐、磺酸、磷酸盐、膦酸盐、季铵盐和羟基。
19.一种测定酶作用于底物分子的活性的方法，所述底物包含式(I)的化合物，其中D1、D2、L如前文定义，M包含切割酶的底物，该方法包括以下步骤：
i)测量荧光标记底物的荧光强度；
ii)在导致M与D1被切开的条件下将活性待测的酶与底物混合；和
iii)在步骤ii)的混合之后测量荧光标记的荧光强度变化；
其中所述荧光标记的荧光强度变化用于测定所述酶的活性。
20.权利要求19的方法，其中M包含可酶切基团，其选自磷酸酯键、至少一个肽键、醚键和糖苷键。
21.权利要求19的方法，其中所述酶为水解酶，其选自磷酸酶、肽酶、蛋白酶、脱烷基酶和糖苷酶。
22.一种筛选测试物的方法，其中所述测试物对酶切割底物活性的作用有待测定，所述方法包括以下步骤：
(a)在有和没有所述测试物时实施权利要求19-21中任一项的方法；和
(b)在有和没有所述测试物时测定酶活性；
其中在有和没有所述测试物时的所述酶活性之间的差异指示所述测试物对所述酶活性的作用。
23.一种筛选测试物的方法，其中所述测试物对酶切割底物活性的作用有待测定，所述方法包括以下步骤：
(a)在有所述测试物时实施权利要求19-21中任一项的方法；和
(b)比较酶活性值和没有测试物时的酶活性对照值。
24.权利要求23的方法，其中所述对照值以电子化方式储存为数据库或其它电子格式。
25.测定两种酶作用于底物分子的相对活性的方法，所述底物分子包含式(I)的化合物，其中，如前所述，D1是第一染料部分，D2是第二染料部分，M包含第一种切割酶的底物，L包含作为第二种切割酶底物的可酶切基团P，其中所述第二种切割酶不同于第一种切割酶；该方法包括以下步骤：
i)检测荧光标记底物的荧光发射强度；
ii)在导致M与D1被切开和D2与D1被切开的条件下将所述第一种酶和第二种酶与所述底物混合；
iii)在步骤ii)的混合步骤之后测量所述第一种染料部分和第二种染料部分的荧光发射强度；和
iv)利用所述第一种染料部分和第二种染料部分的荧光强度变化测定所述酶的相对活性。
26.权利要求25的方法，其中所述第一种酶和所述第二种酶选自磷酸酶、肽酶、蛋白酶、脱烷基酶和糖苷酶。
27.权利要求25或权利要求26的方法，其中所述混合步骤ii)在没有和有测试物的情况下实施，其中所述测试物对所述第一种酶和第二种酶的相对活性的作用有待测定；其中在有和没有所述测试物的情况下所述第一种酶和第二种酶的相对活性之间的差异，指示所述测试物对所述第一种酶和第二种酶的相对活性的作用。
28.一种用于测定酶活性的测试试剂盒，所述试剂盒包含一种或多种不同的酶底物，每种所述底物都包含式(I)的化合物，其中D1、D2、L如前文定义，M包含切割酶的底物。
29.权利要求28的测试试剂盒，其进一步包含一种或多种不同的所述酶，每种酶对不同的所述底物都是专一性的。
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