ES2324721T3 - Sustratos enzimaticos de transferencia de energia de resonancia de fluorescencia. - Google Patents
Sustratos enzimaticos de transferencia de energia de resonancia de fluorescencia. Download PDFInfo
- Publication number
- ES2324721T3 ES2324721T3 ES05736155T ES05736155T ES2324721T3 ES 2324721 T3 ES2324721 T3 ES 2324721T3 ES 05736155 T ES05736155 T ES 05736155T ES 05736155 T ES05736155 T ES 05736155T ES 2324721 T3 ES2324721 T3 ES 2324721T3
- Authority
- ES
- Spain
- Prior art keywords
- dyes
- dye
- group
- enzyme
- substrate
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Active
Links
Classifications
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
- G01N33/536—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with immune complex formed in liquid phase
- G01N33/542—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with immune complex formed in liquid phase with steric inhibition or signal modification, e.g. fluorescent quenching
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/34—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving hydrolase
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Immunology (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Urology & Nephrology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Hematology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Food Science & Technology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- General Physics & Mathematics (AREA)
- Pathology (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
- Investigating Or Analysing Materials By The Use Of Chemical Reactions (AREA)
- Detergent Compositions (AREA)
- Immobilizing And Processing Of Enzymes And Microorganisms (AREA)
- Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
Abstract
Un compuesto de fórmula (I): M-D1-L-D2 en la que D1 es un primer resto de tinte cuyas propiedades de fluorescencia pueden modularse para que sea adecuado como donador en una disposición de transferencia de energía, en la que D1 es capaz de transferir energía a D2, y se selecciona de tintes de cumarina, tintes de benzocumarina, tintes de acridona, tintes de xantina, tintes de fenoxantina, tintes de rodamina, tintes de merocianina y tintes de cianina, preferiblemente tintes de xantina y tintes de cianina; D2 es un segundo resto de tinte que es adecuado como aceptor en una disposición de transferencia de energía con dicho primer tinte, y se selecciona de de tintes de cumarina, tintes de benzocumarina, tintes de acridona, tintes de xantina, tintes de fenoxantina, tintes de rodamina, tintes de merocianina y tintes de cianina; M es un grupo de escisión enzimática elegido para modular las propiedades de fluorescencia de D1, en el que M comprende un sustrato para una primera enzima de escisión; L es un grupo conector que comprende 2-200 átomos enlazados, en el que dicho grupo conector es un conector escindible e incluye el grupo de escisión enzimática P que es un sustrato para una segunda enzima de escisión diferente de dicha primera enzima de escisión.
Description
Sustratos enzimáticos de transferencia de
energía de resonancia de fluorescencia.
La presente invención se refiere a ensayos
basados en la fluorescencia, y a reactivos y procedimientos para
medir la actividad enzimática, en particular ensayos de escisión
enzimática.
Los ensayos para medir la actividad enzimática,
en particular la actividad de escisión enzimática, como la
hidrólisis, se utilizan con amplitud en las ciencias biológicas y
farmacéuticas. Con el advenimiento de la química combinatoria y de
la selección de alta capacidad de procesamiento existe una necesidad
creciente de ensayos sencillos, sensibles y baratos para
seleccionar moduladores potenciales de la actividad enzimática. De
particular interés para la industria farmacéutica resultan los
procedimientos para detectar la escisión enzimática proteolítica y
la escisión de fosfatos.
Los ensayos basados en la fluorescencia ofrecen
ventajas significativas frente a las técnicas radioquímicas, de
ELISA de anticuerpos y otras técnicas más tradicionales para medir
la actividad de escisión enzimática en términos de su sencillez de
manejo, sensibilidad, coste y facilidad de automatización. Los
sustratos fluorogénicos se utilizan habitualmente para ensayos
enzimáticos homogéneos para determinar la actividad enzimática, o el
efecto de fármacos potenciales sobre la actividad enzimática en el
descubrimiento de fármacos. Una serie de estos sustratos
enzimáticos está disponible en el mercado o se ha indicado en la
bibliografía. Por ejemplo, el documento US 4812409 (Babb, B., et
al.) describe sustratos fluorescentes hidrolizables que
comprenden restos de tinte bloqueados derivados de la fenalenona o
de la benzfenalenona, que cuando se escinden del sustrato durante
la hidrólisis enzimática forman tintes fluorescentes que tienen una
emisión de fluorescencia por encima de aproximadamente 530 nm.
También están disponibles sustratos que responden a las enzimas
hidrolíticas, basados en derivados de la fluoresceína y la
rodamina. Por ejemplo, el difosfato de fluoresceína se utiliza con
amplitud, un sustrato no fluorescente e incoloro para la fosfatasa
alcalina (PP2A), que cuando es hidrolizado por esta enzima forma
fluoresceína (Vieytes, M., et al., Anal. Biochem. (1997),
248, 258-264). Sin embargo, los sustratos basados
en fluoresceína normalmente incorporan dos sitios de escisión
enzimática, y se produce una cinética enzimática bifásica a través
de la escisión, en primer lugar para producir un análogo
fluorescente monosustituido, y después para producir el fluoróforo
libre. Debido a que el sustrato fluorescente monosustituido absorbe
y emite en la misma longitud de onda que el fluoróforo libre, la
interpretación de la cinética enzimática es más difícil. Se han
descrito sustratos fluorogénicos basados en derivados fluorados de
4-metilumbeliferona
para el ensayo de actividad \beta-galactosidasa y actividad fosfatasa ácida (Gee, K.R., et al. (1999), 273, 41-48).
para el ensayo de actividad \beta-galactosidasa y actividad fosfatasa ácida (Gee, K.R., et al. (1999), 273, 41-48).
Los documentos US 5795729 y US 2003/0186348
describen sustratos enzimáticos duales fluorescentes de fórmula
M-D_{1}-L-D_{2},
en la que D_{1} representa el aceptor en la disposición de
transferencia de energía de resonancia de fluorescencia, D_{2}
representa el correspondiente donador, M representa un sustrato para
una primera enzima y que es capaz de modular las propiedades de
fluorescencia de D_{1}, y L comprende un grupo de escisión
enzimática que es un sustrato para una segunda enzima diferente.
Muchos de los tintes utilizados en los ensayos
enzimáticos basados en la fluorescencia emiten en el intervalo de
350-550 nm. Algunos de los tintes que emiten a una
longitud de onda mayor, por ejemplo la resorrufina y el DDAO, son
reactivos hacia tioles (incluyendo péptidos/proteínas con
funcionalidades tiol) y pierden sus propiedades de fluorescencia.
Por tanto, no es probable que sean útiles en aplicaciones in
vivo. Los sustratos enzimáticos basados en la fluorescencia que
tienen tintes con propiedades de fluorescencia útiles que emiten en
la región del rojo o del infrarrojo del espectro son derivados de
tintes de cianina sustituidos con nitro (documento EP 1086179 B1;
Hamilton, A., et al.). La fluorescencia de estos tintes es
extinguida por la presencia en la molécula de un grupo nitro
sustituido. Tras la reducción del grupo nitro con una
nitrorreductasa, el tinte se hace fluorescente. Estos sustratos
fluorogénicos han demostrado ser útiles y se utilizan en la
actualidad en ensayos de células vivas; sin embargo, sólo tienen
aplicaciones limitadas. Por tanto, existe una necesidad clara de
nuevos sustratos enzimáticos fluorogénicos con emisión a una
longitud de onda mayor (rojo o infrarrojo) que no sean reactivos
excepto hacia la enzima de interés y que proporcionen una alta
proporción de señal a fondo.
La presente invención describe nuevos sustratos
enzimáticos fluorogénicos que son sustratos para una variedad de
enzimas diferentes y que emiten a diferentes longitudes de onda que
incluyen el rojo y cercano al infrarrojo. Estos sustratos son
sustratos enzimáticos duales para determinar las proporciones de dos
actividades enzimáticas. Esto es más importante para sistemas in
vivo, en los que no es posible confiar en que dos sustratos
enzimáticos distintos midan las actividades enzimáticas relativas,
debido a las diferencias en las propiedades de absorción, de
distribución y de excreción de los sustratos enzimáticos
individuales. Por último, también se proporcionan procedimientos
para determinar la
actividad enzimática, así como procedimientos que son útiles para determinar un estado metabólico in vitro o in vivo.
actividad enzimática, así como procedimientos que son útiles para determinar un estado metabólico in vitro o in vivo.
Por tanto, un objeto de la invención es
proporcionar un sustrato enzimático dual marcado con fluorescencia,
en particular un sustrato marcado de transferencia de energía de
resonancia de fluorescencia (FRET), y un procedimiento para medir
la actividad de dos enzimas para escindir un sustrato, comprendiendo
el sustrato un marcador FRET, un grupo de escisión enzimática y un
conector de escisión enzimática.
\global\parskip0.900000\baselineskip
Un objeto de la invención también es
proporcionar un procedimiento para seleccionar un agente de ensayo
que pueda afectar a la actividad de escisión enzimática.
Por tanto, en un primer aspecto de la invención,
se proporciona un compuesto de fórmula (I):
(I)M-D_{1}-L-D_{2}
en la
que:
D_{1} es un primer resto de tinte cuyas
propiedades de fluorescencia pueden modularse para que sea adecuado
como donador en una disposición de transferencia de energía, en la
que D_{1} es capaz de transferir energía a D_{2}, y se
selecciona de tintes de cumarina, tintes de benzocumarina, tintes de
acridona, tintes de xantina, tintes de fenoxantina, tintes de
rodamina, tintes de merocianina y tintes de cianina, preferiblemente
tintes de xantina y tintes de cianina;
D_{2} es un segundo resto de tinte que es
adecuado como aceptor en una disposición de transferencia de energía
con dicho primer tinte, y se selecciona de de tintes de cumarina,
tintes de benzocumarina, tintes de acridona, tintes de xantina,
tintes de fenoxantina, tintes de rodamina, tintes de merocianina y
tintes de cianina;
M es un grupo de escisión enzimática elegido
para modular las propiedades de fluorescencia de D_{1}, en el que
M comprende un sustrato para una primera enzima de escisión;
L es un grupo conector que comprende
2-200 átomos enlazados, en el que dicho grupo
conector es un conector escindible e incluye el grupo de escisión
enzimática P que es un sustrato para una segunda enzima de escisión
diferente de dicha primera enzima de escisión.
D_{1} y D_{2} están conectados a través del
grupo conector L de forma que, bajo condiciones adecuadas, puede
realizarse la transferencia de energía de resonancia de
fluorescencia (FRET) entre ambos. La FRET es un proceso relacionado
con la distancia, en el que los estados excitados electrónicos de
dos moléculas de tinte interaccionan sin emisión de un fotón. Véase
Forster, T., "Intermolecular Energy Transfer and Fluorescence",
Ann. Physik., vol. 2, p. 55 (1948). Un resultado de esta
interacción es que la excitación de una molécula donadora potencia
la emisión de fluorescencia de una molécula aceptora. El rendimiento
cuántico de fluorescencia del donador disminuye en la misma medida.
Para que se produzca la FRET, de manera adecuada las moléculas de
tinte donador y aceptor deben estar muy cerca (de forma típica entre
10-100 \ring{A}), puesto que la eficacia de la
transferencia de energía disminuye inversamente como la 6ª potencia
de la distancia (r) entre las moléculas donadoras y aceptoras. En
la presente invención, D_{1} es la molécula donadora y D_{2} es
el aceptor en la relación de FRET. Donador significa que el resto
de tinte es capaz de absorber energía de la luz y emite luz a unas
frecuencias de longitud de onda que están, al menos parcialmente,
dentro del espectro de absorción del aceptor. Aceptor significa que
el resto de tinte es capaz de absorber energía a una longitud de
onda emitida por el resto de tinte donador. Hay un solapamiento
entre al menos una porción del espectro de emisión de la molécula
de tinte donadora y el espectro de absorción de la molécula de tinte
aceptora. La longitud de onda del máximo de emisión del tinte
aceptor es más larga que la longitud de onda del máximo de emisión
del tinte donador. En un formato, una de las moléculas donadoras o
aceptoras puede ser un fluoróforo no fluorescente (o de extinción)
que está muy cerca de un segundo fluoróforo aceptor o donador
fluorescente. Tras la excitación del tinte no fluorescente, la
energía se disipa como calor en lugar de
energía de fluorescencia, y la transferencia de energía de resonancia o la emisión de fluorescencia no puede realizarse.
energía de fluorescencia, y la transferencia de energía de resonancia o la emisión de fluorescencia no puede realizarse.
El grupo M se elige entre grupos de escisión
enzimática que sean capaces de modular las propiedades de
fluorescencia de D_{1}, de forma que cuando M se une
covalentemente a D_{1}, D_{1} está en un primer estado de
fluorescencia, sin emisión de fluorescencia o sustancialmente sin
emisión de fluorescencia o, como alternativa, tiene una emisión de
fluorescencia con un máximo de longitud de onda de emisión,
E_{max} = \lambda1'.
M comprende un sustrato para una enzima, de
forma que tras la escisión enzimática de M de D_{1} para formar
el compuesto de fórmula (A') (véase la figura 1), se provoca que las
propiedades de fluorescencia de D_{1} cambien a un segundo estado
de fluorescencia de forma que D_{1} emite fluorescencia a un
máximo de longitud de onda de emisión, E_{max} = \lambda1. De
forma adecuada, D_{2} es un tinte fluorescente que tiene un
máximo de emisión de fluorescencia,
E_{max} = \lambda2. De forma adecuada, en el compuesto de fórmula (I), \lambda1' \neq \lambda1 \neq \lambda2.
E_{max} = \lambda2. De forma adecuada, en el compuesto de fórmula (I), \lambda1' \neq \lambda1 \neq \lambda2.
De forma adecuada, el grupo conector L comprende
un grupo que contiene de 2-200 átomos enlazados
seleccionados de átomos de carbono que incluyen uno o más grupos
seleccionados de -C(O)-, -NR'-, -O-, -S-, -CH=CH-,
-CO-NH-, fenilenilo y el grupo:
en el que R' se selecciona de
hidrógeno y alquilo C_{1}-C_{4}, y m es un
número entero de 1 a
3.
\global\parskip1.000000\baselineskip
En una realización preferida, el grupo conector
L contiene 2-50 átomos enlazados y tiene la
estructura:
-{(CHR')_{p}-Q-(CHR')_{r}}_{s}-
en la que Q se selecciona de
-C(O)-, -NR'-, -O-, -S-, -CH=CH-, -CO-NH- y
grupos fenilenilo; R' es hidrógeno o alquilo
C_{1}-C_{4}, cada p es independientemente
0-10, cada r es independientemente
0-10, y s es 1, 2 ó
3.
Preferiblemente Q se selecciona de
-C(O)-, -CHR'-, -O- y -CO-NH-, en los que R',
p, r y s son como se definió anteriormente en la presente.
En otra realización, el grupo conector L también
puede comprender un péptido o un fragmento oligonucleotídico.
Cuando el conector es un péptido o contiene un fragmento peptídico,
puede contener de 2-20 aminoácidos naturales o no
naturales o una combinación de éstos. Más preferiblemente, L
contiene 2-12 aminoácidos, y lo más preferiblemente
2-8 aminoácidos. Cuando el grupo conector L es un
oligonucleótido o contiene un fragmento oligonucleotídico, puede
contener de 2-20 bases nucleosídicas o bases
modificadas. Preferiblemente, el número de bases estará en el
intervalo de 4-15; más preferiblemente en el
intervalo de 4-10.
El conector puede incluir parte de los
constituyentes que se extienden desde el fluorocromo. En otras
palabras, el conector está unido al cromóforo del tinte pero no es
parte de él. En los compuestos de la presente invención, ninguno de
los conectores incluye una red de dobles enlaces que permita la
conjugación del donador y del aceptor. Para que se produzca una
transferencia de energía óptima, los momentos de transición de los
fluorocromos donadores y aceptores se orientan con relación entre
sí en una dirección no perpendicular, por ejemplo, se colocan en
general paralelos o en tándem con relación entre sí. Con un conector
relativamente corto y una orientación óptima puede producirse una
transferencia de energía de resonancia eficaz incluso cuando el
solapamiento espectral sea pequeño.
La figura 1A es un diagrama esquemático que
ilustra una realización preferida de la invención. La figura 1B
ilustra un ejemplo de referencia.
La figura 2 ilustra el esquema de reacción
sintético para la preparación de los compuestos (V) y (VI).
La figura 3 muestra el espectro de UV del
compuesto (II) antes y después de un tratamiento con fosfatasa
alcalina.
La figura 4 muestra el espectro de UV del
compuesto (III) antes y después de un tratamiento con fosfatasa
alcalina.
La figura 5 muestra el espectro de UV del
compuesto (IV) antes y después de un tratamiento con fosfatasa
alcalina.
La figura 6 muestra el espectro de emisión del
compuesto (II) antes después de un tratamiento con fosfatasa
alcalina mediante una excitación a 455 nm y 475 nm.
La figura 7 muestra el espectro de emisión del
compuesto (III) antes después de un tratamiento con fosfatasa
alcalina mediante una excitación a 455 nm y 475 nm.
La figura 8 muestra el espectro de emisión del
compuesto (IV) antes después de un tratamiento con fosfatasa
alcalina mediante una excitación a 455 nm y 475 nm.
Según el primer aspecto de la invención, D_{1}
es el tinte donador y D_{2} es el tinte aceptor. En esta
realización (que se muestra en la figura 1A), el máximo de longitud
de onda de emisión (A1) de D_{1} es menor que el máximo de
longitud de onda de emisión (\lambda2) de D_{2}, y existe un
solapamiento entre al menos una porción del espectro de emisión de
D_{1} con el espectro de absorción de D_{2}. Cuando M está
unido covalentemente a D_{1}, D_{1} no emite fluorescencia, o
sustancialmente no emite fluorescencia o, como alternativa,
fluoresce con un máximo de longitud de onda de emisión de
fluorescencia \lambda1', en el que \lambda1' es menor que
\lambda1. En este estado, no existe solapamiento, o
sustancialmente no existe solapamiento, entre el espectro de
emisión de D_{1} y el espectro de absorción de D_{2}, de forma
que no se produce transferencia de energía entre D_{1} y D_{2}.
Tras la escisión de M de D_{1}, se provoca un cambio en las
propiedades de fluorescencia de D_{1} hacia un segundo estado de
fluorescencia, de forma que D_{1} emite fluorescencia en el
máximo de longitud de onda de emisión \lambda1. Como resultado, se
restablece el solapamiento entre el espectro de emisión de D_{1}
y el espectro de absorción de D_{2} y puede producirse la
transferencia de energía entre D_{1} y D_{2}. Por tanto, tras la
excitación del tinte donador D_{1} a una longitud de onda de
excitación apropiada, puede detectarse y/o cuantificarse un aumento
en la emisión de fluorescencia desde D_{2}.
En el ejemplo de referencia, D_{2} es el tinte
donador y D_{1} es el tinte aceptor. En este ejemplo (que se
muestra en la figura 1B), el máximo de longitud de onda de emisión
(\lambda2) de D_{2} es menor que el máximo de longitud de onda
de emisión (\lambda1) de D_{1}, y existe un solapamiento entre
al menos una porción del espectro de emisión de D_{2} con el
espectro de absorción de D_{1}. Cuando M está unido
covalentemente a D_{1}, D_{1} no emite fluorescencia, o
sustancialmente no emite fluorescencia o, como alternativa,
fluoresce con un máximo de longitud de onda de emisión de
fluorescencia \lambda1', en el que \lambda1' es mayor que
\lambda1. En este estado, no existe solapamiento, o
sustancialmente no existe solapamiento, entre el espectro de
emisión de D_{2} y el espectro de absorción de D_{1}, de forma
que no se produce transferencia de energía entre D_{2} y D_{1}.
Tras la escisión de M de D_{1}, se provoca un cambio en las
propiedades de fluorescencia de D_{1} hacia un segundo estado de
fluorescencia, de forma que D_{1} emite fluorescencia en el
máximo de longitud de onda de emisión \lambda1. Como resultado, se
restablece el solapamiento entre el espectro de emisión de D_{2}
y el espectro de absorción de D_{1} y puede producirse la
transferencia de energía. Tras la excitación del tinte donador
D_{2} a una longitud de onda de excitación apropiada, puede
detectarse y/o cuantificarse un aumento en la emisión de
fluorescencia desde D_{1}.
En el ejemplo de referencia en que D_{2} es el
tinte donador y D_{1} es el aceptor, la transferencia de energía
puede realizarse, como alternativa, entre el tinte donador y los dos
estados fluorescentes del tinte aceptor. En esta disposición, el
tinte aceptor en el primer estado fluorescente emite a una longitud
de onda \lambda1' y, tras la escisión de M, generará un segundo
estado de fluorescencia que emite a una segunda longitud de onda
\lambda1.
En otra realización, el primer y el segundo
estado de fluorescencia de D_{1} pueden diferir, no en sus
respectivos máximos de longitud de onda de emisión \lambda1 y
\lambda1', sino en la intensidad de fluorescencia emitida por los
dos estados.
Los compuestos de fórmula (I) pueden utilizarse
como moléculas indicadoras para detectar acontecimientos de
escisión bioquímica en ensayos que empleen la transferencia de
energía de resonancia de fluorescencia. El grupo M comprende un
sustrato para una enzima de escisión, preferiblemente seleccionado
del grupo que consiste en una peptidasa, una proteasa, una
fosfatasa, una desalquilasa y una glicosidasa. El tratamiento del
sustrato con una enzima bajo condiciones adecuadas para provocar la
escisión de M de D_{1} modula las propiedades de fluorescencia de
D_{1}, cambiando a D_{1} desde el primer estado de fluorescencia
al segundo estado de fluorescencia como se describió anteriormente
en la presente.
En una realización preferida, M comprende un
enlace éster fosfato que tiene uno o más grupos fosfato unidos
covalentemente a D_{1} y que tiene la estructura:
en la que n es un número entero de
1 a 4. En esta realización, el sustrato es capaz de ser escindido
por una fosfatasa, como una fosfatasa alcalina bacteriana, o una
fosfatasa ácida, para producir un derivado de alcohol del tinte
D_{1}, y fosfato inorgánico. Como consecuencia, se provoca que
D_{1} cambie de un primer estado fluorescente a un segundo estado
fluorescente, permitiendo, con ello, la transferencia de energía de
excitación entre los restos donador y aceptor. Tras la excitación
del tinte donador a su longitud de onda de excitación, se produce
un aumento en la intensidad de fluorescencia a la longitud de onda
de emisión del tinte aceptor. El éster fosfato puede ser un
sustrato presintetizado o puede generarse in situ mediante
hidrólisis química o mediante una transferencia de nucleósido
monofosfato o nucleósido polifosfato catalizada por enzimas, desde
un nucleósido polifosfato marcado en el fosfato terminal que tiene
la
estructura:
en la que R^{1} y R^{2} se
seleccionan independientemente de H y OH; R_{a} es una base
nucleosídica seleccionada de adenina, guanina, citosina, timina,
uracilo, hipoxantina y xantina; y k es un número entero de 1 a
6.
En otra realización preferida, M comprende al
menos un enlace peptídico (-CO-NH-) unido
covalentemente a D_{1}. En esta realización, M de forma típica
tiene la estructura:
en la que R^{b} es un resto de un
péptido o proteína. Tras la hidrólisis mediante una peptidasa o
proteasa, el M se escinde del marcador de transferencia de energía
de fluorescencia. Tras la excitación del resto donador a su
longitud de onda de excitación, la energía se transfiere entre los
tintes donador y aceptor, permitiendo la detección de un aumento en
la emisión de fluorescencia desde el
aceptor.
En otra realización, M comprende un enlace
glicosídico y es un sustrato para una glicosidasa, como
\alpha-glicosidasas (por ejemplo,
\alpha-amilasa),
\beta-glicosidasas (por ejemplo,
\beta-glucosidasa) y tiene la estructura:
En otra realización, M comprende un enlace éter
que es un sustrato para una desalquilasa y tiene la estructura:
R^{c}-O-
en la que R^{c} es una cadena
alquilo C_{1}-C_{20} lineal o
ramificada.
En otra realización, el grupo M comprende además
un grupo permeabilizante de la membrana celular, que puede
seleccionarse de grupos como grupos éter, éster, amida y
fosfodiéster de fórmula:
en la que R^{d} es una cadena
alquilo C_{1}-C_{10} lineal o ramificada, no
sustituida o sustituida con uno o más átomos de halógeno, fenilo,
no sustituido o sustituido con uno o más átomos de halógeno, o una
cadena peptídica. De forma adecuada, los átomos de halógeno pueden
seleccionarse de flúor, cloro, bromo y yodo. Los ejemplos útilies
de estos grupos permeabilizantes de la membrana celular incluyen
grupos éster acetato, pivaloíl éster, acetoximetil éster,
pentrafluorobencil éter, pentrafluorobencilamida, pentafluorobencil
éster, fosfato de fenilo,
perfluoro-alquil(C_{1}-C_{6})
éteres,
perfluoro-alquil(C_{1}-C_{6})
ésteres, y
perfluoro-alquil(C_{1}-C_{10})amida.
Estos grupos son sustratos (y son hidrolizados por éstas) para
desalquilasas, esterasas como proteasas y fosfodiesterasas, tal
como se encuentran en las células. Los expertos en la técnica
apreciarán la variabilidad de la permeabilidad celular de la
molécula indicadora y serán capaces de
ensayarla.
El tinte donador se selecciona de tintes de
cumarina, tintes de benzocumarina, tintes de acridona, tintes de
xantina, tintes de fenoxantina, tintes de rodamina, tintes de
merocianina y tintes de cianina, preferiblemente tintes de xantina
y tintes de cianina, en el que el tinte donador es capaz de
transferir energía al tinte aceptor.
El tinte aceptor se selecciona de tintes de
cumarina, tintes de benzocumarina, tintes de acridona, tintes de
xantina, tintes de fenoxantina, tintes de rodamina, tintes de
merocianina y tintes de cianina.
Preferiblemente, el tinte donador es un tinte de
xantina o un tinte de cianina, y el tinte aceptor es un tinte de
rodamina o de cianina.
En una realización preferida, al menos uno de
dichos restos de tinte donador y aceptor es un tinte de cianina. En
otra realización preferida, el tinte donador es un tinte de xantina
y el tinte aceptor es un tinte de rodamina.
Los tintes de xantina adecuados incluyen, pero
no se limitan a fluoresceína y sus derivados, tales como
5-carboxifluoresceína,
6-carboxifluoresceína y
6-carboxi-4',5'-dicloro-2',7'-dimetoxifluoresceína.
Los tintes de cianina adecuados incluye, pero no
se limitan a CyA
(3-(\varepsilon-carboxipentil)-3'-etil-5,5'-dimetiloxacarbocianina),
Cy2
(3-(\varepsilon-carboxipentil)-3'-etiloxacarbocianina),
Cy3
(3-(\varepsilon-carboxipentil)-1'-etil-3,3,3',3'-tetrametil-5,5'-disulfonatocarbocianina),
Cy3.5
(3-(\varepsilon-carboxipentil)-1'-etil-3,3,3',3'-tetrametil-4,5,4',5'-(1,3-disulfonato)dibenzocarbocianina),
Cy5
(1-(\varepsilon-carboxipentil)-1'-etil-3,3,3',3'-tetrametil-5,5'-disulfonatodicarbocianina),
Cy5.5
(1-(\varepsilon-carboxipentil)-1'-etil-3,3,3',3'-tetrametil-4,5,4',5'-(1,3-disulfonato)dibenzodicarbocianina,
y Cy7
(1-(\varepsilon-carboxi-
pentil)-1'-etil-3,3,3',3'-tetrametil-5,5'-disulfonatotricarbocianina.
pentil)-1'-etil-3,3,3',3'-tetrametil-5,5'-disulfonatotricarbocianina.
Los tintes aceptores de rodamina adecuados
incluyen, pero no se limitan a 5-carboxirrodamina
(rodamina 110-5),
6-carboxirrodamina (rodamina 110-6),
5-carboxirrodamina-6G
(R6G-5 o REG-5),
6-carboxirrodamina-6G
(R6G-6 o REG-6),
N,N,N',N'-tetrametil-5-carboxirrodamina,
N,N,N',N'-tetrametil-6-carboxirrodamina
(TAMRA o TMR),
5-carboxi-X-rodamina
y
6-carboxi-X-rodamina
(ROX). Otras clases de tintes incluyen BODIPY^{TM}, tintes de
porfirina, tintes de rodol y tintes de perileno.
Los sustratos enzimáticos marcados fluorescentes
según el primer aspecto también pueden incluir constituyentes
hidrosolubilizantes unidos a ellos, para conferir una
características hidrófila al compuesto. Están unidos
preferiblemente a los sistemas de anillos aromáticos de los restos
de tinte donador o aceptor. Como alternativa, el grupo conector L
puede contener el grupo hidrosolubilizante. Los constituyentes
solubilizantes adecuados pueden seleccionarse del grupo que
consiste en amida, sulfonato, sulfato, fosfato, amonio cuaternario,
hidroxilo, guanidinio y fosfonato. Se prefieren particularmente los
grupos sulfonato o ácido sulfónico unidos directamente al anillo
aromático de los fluorocromos donadores y/o aceptores.
Los ejemplos de moléculas indicadoras de
transferencia de energía se muestran en la tabla 1.
En los ejemplos (II), (III) y (IV), el indicador
es un complejo de transferencia de energía no fluorescente que
contiene un tinte donador de fluoresceína extinguido y un Cy5, un
Cy3 y un tinte aceptor de rodamina, respectivamente, teniendo el
resto fluoresceína un grupo fosfato enzimáticamente escindible unido
a él. El grupo fosfato puede escindirse mediante la acción de una
fosfatasa, restableciendo, con ello, la fluorescencia del tinte
donandor tras la excitación de la fluoresceína a su longitud de onda
de excitación. La detección del acontecimiento de escisión y la
medida de la actividad fosfatasa puede lograrse detectando la
emisión de fluorescencia a la longitud de onda de emisión del tinte
aceptor.
En los ejemplos (V) y (VI), el indicador es un
complejo de transferencia de energía no fluorescente que contiene
un tinte donador de fluoresceína extinguido y un Cy5 y un tinte
aceptor de rodamina, respectivamente, teniendo el resto
fluoresceína un grupo nucleósido polifosfato unido a él. La acción
de una nucleosidil fosfotransferasa genera un sustrato de fosfatasa
in situ, que en presencia de fosfatasa sufre la eliminación
del fosfato. La fluorescencia del tinte donador de fluoresceína se
restablece. La posterior transferencia de energía al tinte aceptor
genera un emisión desplazada hacia el rojo. Cuando la enzima
nucleosidil fosfotransferasa es una ácido nucleico polimerasa, las
composiciones de la presente invención pueden utilizarse para la
detección, la caracterización y la cuantificación de ácidos
nucleicos conocidos y desconocidos.
Según la invención, L es un conector escindible
e incluye un grupo de escisión enzimática P que es diferente del
grupo de sustrato enzimático M. P puede seleccionarse de grupos como
grupos éter, éster, amida y fosfodiéster. Estos grupos son
sustratos (y son escindidos en un medio tampón acuoso por éstas),
respectivamente, de desalquilasas, esterasas, como proteasas, y
fosfodiesterasas. En esta realización, es preferible que D_{2}
emita a una primer longitud de onda de emisión \lambda2 cuando
está unido a L, y a una segunda longitud de onda de emisión
\lambda2' cuando D_{2} se escinde de L, siendo \lambda2 \neq
\lambda2'. Los compuestos indicadores según la invención son
útiles para medir la actividad relativa de dos enzimas en sistemas
in vivo y celulares, en los que resulta difícil asegurar la
misma administración de dos sustratos enzimáticos distintos. También
es posible que D_{1} emita a una primera longitud de onda de
emisión (\lambda1) cuando está unido a M, y a una longitud de
onda diferente (\lambda1') cuando M se escinde, siendo \lambda1
\neq \lambda1'. El ejemplo (VII) muestra un indicador
enzimático dual para la actividad aril sulfatasa y catepsina G, que
no forma parte de la presente invención pero que es potencialmente
útil para detectar la inflamación. Cuando no hay actividad
enzimática presente, existe una débil emisión a 610 nm cuando el
compuesto del ejemplo (VII) se excita a 360 nm. No se observa
emisión con una excitación a 645 nm. Habiendo sólo actividad
sulfatasa, se observa una fuerte emisión a 660 nm con excitación a
645 nm, y emisiones débiles a 450 nm y 660 nm cuando se excita a
360 nm. Habiendo sólo actividad catepsina G, se observa una fuerte
emisión a 450 nm cuando se excita a 360 nm, y no se observa emisión
a 660 nm tras una excitación a 360 nm o a 645 nm. Cuando ambas
enzimas están presentes se observa una fuerte emisión a 450 nm tras
una excitación a 360 nm, y otra fuerte emisión a 660 nm tras una
excitación a 645 nm. No se observa emisión a 660 nm con una
excitación de 360 nm. Por tanto, midiendo las emisiones a 660 nm y
450 nm, y comparando con patrones conocidos, es posible determinar
las actividades enzimáticas relativas de ambas enzimas a un momento
del tiempo o localización concretos en un sistema in vivo.
Estos sustratos de actividad enzimática dual son útiles para
distinguir entre diferentes estados de enfermedad, así como para
determinar la etapa clínica o la agresividad de un estado de
enfermedad.
Se han utilizado MMP-2 y
MMP-9 para la detección y el tratamiento de tumores,
por ejemplo en melanomas, en que la expresión de estas proteínas
varía significativamente. Mientras que en tumores muy agresivos,
MMP-9 se expresa a altos niveles, no se observa
sobreexpresión en tumores en etapas tempranas. Los tumores benignos
no muestran actividad MMP-9. De forma similar, la
actividad MMP-2 también varía significativamente con
tumores invasivos que muestran mayor actividad. Aunque esto es
cierto para la mayoría de los pacientes, no es verdad para todos.
Por tanto, la medición sólo de la actividad MMP-2 o
MMP-9 puede conducir a un diagnóstico equivocado de
un tumor agresivo como benigno. Para la osteoporosis, la catepsina K
se ha identificado como diana terapéutica puesto que está
sobreexpresada en osteoclastos; sin embargo, esta actividad también
se ha observado durante el recambio óseo normal, que no está
asociado con la osteoporosis. Sin embargo, en la osteoporosis
también se observan niveles elevados de MMP-9. Sin
embargo, la medición de la actividad de MMP-9 no es
un indicador muy específico de la osteoporosis. Por tanto, la
medición de ambas actividades y su proporción ofrece una mejor
herramienta de diagnóstico que la medición de una única actividad
enzimática.
En un segundo aspecto, que no forma parte de la
presente invención, se proporciona un procedimiento para determinar
la actividad de una enzima que actúa sobre una molécula sustrato,
comprendiendo el sustrato un compuesto de fórmula (I), en la que
D_{1}, D_{2} y L son como se definió anteriormente en la
presente; y M comprende un sustrato para una enzima de escisión. El
procedimiento comprende las etapas de: i) medir la intensidad de
fluorescencia del sustrato marcado de modo fluorescente; ii)
combinar una enzima, cuya actividad se va a determinar, con el
sustrato bajo condiciones que producen la escisión de M de D_{1};
y iii) medir el cambio en la intensidad de fluorescencia del
marcador fluorescente después de la combinación de la etapa ii); en
el que el cambio en la intensidad de fluorescencia del marcador
fluorescente se utiliza para determinar la actividad de la
enzima.
De forma adecuada, el compuesto de fórmula (I)
es un sustrato para la enzima cuya actividad se va a determinar, en
la que M comprende un grupo de escisión enzimática seleccionado
preferiblemente de un enlace éster fosfato, al menos un enlace
peptídico, un enlace éter y un enlace glicosídico, como se definió
anteriormente en la presente. Preferiblemente, la enzima es una
enzima hidrolasa seleccionada del grupo que consiste en fosfatasa,
peptidasa, proteasa, desalquilasa y glicosidasa.
En un ejemplo preferido según el segundo
aspecto, la enzima es una fosfatasa, seleccionada de E.C. de clase
3.1, incluyendo PTPasa, PTPasa2A, PTPasa-2B o
PTPasa-2C. Los ejemplos son tirosina fosfatasa, PP1
y PP-2B (serina/treonina fosfatasa).
En un segundo ejemplo preferido según el segundo
aspecto, la enzima es una peptidasa seleccionada de E.C. de clase
3.4. Los ejemplos incluyen, pero no se limitan a la enzima
conversora de angiotensina (ACE), caspasa, catepsina D,
quimotripsina, pepsina, subtilisina, proteinasa K, elastasa,
neprilisina, termolisina, asp-n, metaproteinasa de
matriz-1 a -20, papaína, plasmina, tripsina,
enteroquinasa y uroquinasa.
En otro ejemplo, la enzima es una glicosidasa,
preferiblemente seleccionada del grupo que consiste en E.C. de
clase 3.2, por ejemplo \alpha-amilasa,
\beta-amilasa,
glucan-1,4-\alpha-glucosidasa,
celulasa,
endo-1,3-\beta-glucanasa,
oligo-1,6-glucosidasa y
lisozima.
En otro ejemplo, la enzima es una desalquilasa,
por ejemplo diferentes isoenzimas del citocromo
P-450.
También pueden utilizarse otras enzimas, como
peroxidasas, \beta-lactamasa, nitrorreductasa,
etc., con M o las estructuras conectoras apropiadas. Los sustratos
fluorogénicos para estas enzimas son muy conocidos, por ejemplo,
rojo Amplex, una fluoresceína y cefalosporina sustituida con
6-cloro-7-hidroxicumarina
y nitrocianinas, como los descritos en el documento EP 1086179 B1,
Hamilton, A., et al. Pueden incorporarse estructuras
similares en las composiciones descritas anteriormente.
Pueden realizarse ensayos según la presente
invención en aplicaciones de selección de alta capacidad de
procesamiento, incluyendo aquellas en que se seleccionan agentes de
ensayo por sus efectos inhibidores, efectos de potenciación,
efectos agonistas o antagonistas sobre la reacción enzimática que se
está investigando. Por tanto, en un ejemplo preferido según el
segundo aspecto, se proporciona un procedimiento para seleccionar un
agente de ensayo cuyo efecto sobre la actividad de una enzima para
la escisión de un sustrato se va a determinar. El procedimiento
comprende las etapas de: (a) realizar el procedimiento según el
segundo aspecto en presencia y en ausencia del agente de ensayo; y
(b) determinar la actividad de la enzima en presencia y en ausencia
del agente; en el que una diferencia entre la actividad de la
enzima en presencia y en ausencia de dicho agente es indicativa del
efecto del agente de ensayo sobre la actividad de la enzima. Como
alternativa, la selección puede realizarse llevando a cabo el
procedimiento en presencia de un agente de ensayo y comparando el
valor de la actividad de la enzima con un valor control para la
actividad enzimática en ausencia del agente de ensayo. El valor
control puede almacenarse electrónicamente de manera conveniente en
una base de datos u otro formato electrónico.
En un tercer aspecto de la invención, se
proporciona un procedimiento para determinar las actividades
relativas de dos enzimas que actúan sobre una molécula sustrato,
comprendiendo la molécula sustrato un compuesto de fórmula (I), en
la que D_{1}, D_{2}, M y L son como se definió en el primer
aspecto de la invención. El procedimiento comprende las etapas de:
i) medir la intensidad de emisión de fluorescencia del sustrato
marcado de modo fluorescente; ii) combinar la primera y segunda
enzima con el sustrato bajo condiciones que producen la escisión de
M de D_{1}, y de D_{2} de D_{1}; iii) medir las intensidades
de emisión de fluorescencia del primer y segundo resto de tinte
después de la combinación de la etapa ii); y iv) utilizar el cambio
en las intensidades de fluorescencia del primer y segundo resto de
tinte para determinar las actividades relativas de las enzimas.
\newpage
De forma adecuada, la primera y la segunda
enzima pueden combinarse de modo secuencial, en cualquier orden o,
como alternativa, de modo simultáneo con la molécula sustrato.
Preferiblemente, la primera y segunda enzima se seleccionan del
grupo que consiste en fosfatasa, peptidasa, proteasa, desalquilasa y
glicosidasa, como se describió en la presente anteriormente.
El procedimiento según el tercer aspecto de la
invención también puede utilizarse para determinar el efecto de un
agente de ensayo sobre las actividades relativas de dos enzimas que
actúan sobre una molécula sustrato, en el que la etapa de
combinación ii) se realiza en ausencia y en presencia del agente de
ensayo. Una diferencia entre las actividades relativas de la
primera y la segunda enzima en presencia y en ausencia de dicho
agente es indicativa del efecto del agente de ensayo sobre las
actividades relativas de la primera y segunda enzima.
El agente de ensayo puede ser, por ejemplo,
cualquier compuesto orgánico o inorgánico, como una molécula
sintética o un producto natural (por ejemplo, un péptido, un
oligonucleótido), o puede ser una forma de energía (por ejemplo,
luz o calor u otras formas de radiación electromagnética. Los
inhibidores de la actividad enzimática pueden detectarse utilizando
el procedimiento según la realización preferida, por ejemplo, puede
demostrarse con facilidad que el inhibidor conocido pepstatina A
inhibe la actividad enzimática de la catepsina D utilizando el
procedimiento de la invención. Por tanto, en presencia de 12 nM de
pepstatina A, la actividad catepsina D es aproximadamente 5 veces
menor que en ausencia del inhibidor.
De forma adecuada, la diferencia entre la
actividad de la enzima en ausencia y en presencia del agente se
normaliza, se almacena de manera electrónica y se compara con un
valor de referencia. Así, por ejemplo, la diferencia en la
actividad puede almacenarse como el porcentaje de inhibición (o
porcentaje de estimulación) en una base de datos eletrónica y este
valor puede compararse con el correspondiente valor para un
inhibidor patrón de la enzima en cuestión. De esta manera sólo los
agentes de ensayo que cumplan cierto umbral predeterminado (por
ejemplo, ser tan eficaces o más eficaces que el compuesto de
referencia) pueden seleccionarse por ser de interés para su
posterior ensayo.
Como ejemplo, puede configurarse un ensayo para
la detección de actividad enzimática proteolítica como sigue. Se
prepara una mezcla de reacción combinando una enzima y un compuesto
indicador de la transferencia de energía fluorescente según la
fórmula (I), en la que el grupo M comprende un sitio de escisión
enzimática proteolítica. El ensayo se realiza de forma adecuada en
pocillos de una placa de múltiples pocillos, por ejemplo, una placa
de microvaloración que tiene 24, 96, 384 o densidades mayores de
pocillos, por ejemplo, 1536 pocillos. La reacción puede realizarse
estando el sustrato enzimático inicialmente presente en un tampón de
ensayo acuoso, de manera adecuada MOPs 10 mM, Tris 50 mM o HEPES 50
mM, que contiene MgCl_{2} 5 mM. Un agente de ensayo, como un
inhibidor conocido o putativo, puede incluirse opcionalmente en la
mezcla de reacción. Tras la adición de la enzima, de forma típica
se deja que la reacción se desarrolle hasta que se complete,
controlándose el avance observando la emisión de fluorescencia en
estado estacionario debido al tinte aceptor fluorescente, que se
registra utilizando un espectrofluorímetro. Como alternativa, el
ensayo puede realizarse bajo condiciones "detenidas", en que
se deja que la reacción se desarrolle durante un tiempo
predeterminado y luego se termina con un reactivo de detención,
normalmente un inhibidor de la actividad enzimática, que a menudo no
es específico. Un ejemplo de un reactivo de detención es EDTA, que
se emplea para secuestrar iones metálicos que normalmente son
requeridos para la actividad enzimática.
Los procedimientos según la presente invención
también pueden emplearse para medir la actividad de una enzima que
actúa sobre un sustrato en un entorno celular, comprendiendo el
sustrato un compuesto según la presente invención. Por tanto, en un
ejemplo y realización particulares según el segundo y el tercer
aspecto, respectivamente, el procedimiento comprende, antes de la
etapa i), la etapa de añadir el sustrato a una o más células en un
medio fluido.
De forma típica, se incuban células cultivadas
con el sustrato enzimático acoplado a FRET a una concentración de
0,1 a 100 \muM en un medio de cultivo celular adecuado bajo
condiciones adecuadas para el crecimiento celular y durante un
tiempo que puede variar de 0,5 a 24 horas. Las células se cultivan
según técnicas de cultivo celular convencionales, por ejemplo, las
células se cultivan en un recipiente adecuado en un medio estéril a
37ºC en un incubador que contiene una atmósfera humidificada de 95%
de aire/5% de CO_{2}. Existen protocolos establecidos disponibles
para el cultivo de diversos tipos de células (véase, por ejemplo,
Freshney, R.I., Culture of Animal Cells: A Manual of Basic
Technique, 2ª edición, Alan R. Liss Inc., 1987). Cuando se requiere
introducir el sustrato en las células cultivadas en un cultivo
celular o tisular, el sustrato sencillamente se añade al medio de
cultivo. Las células también se pueden poner en contacto con el
sustrato en presencia de un agente de ensayo cuyo efecto sobre la
actividad enzimática se va a determinar. En esta realización, la
etapa de detección proporciona una medida del efecto del agente de
ensayo sobre la actividad de la enzima que se está
investigando.
Las medidas de la intensidad de fluorescencia
pueden realizarse utilizando instrumentos que incorporen tubos
fotomultiplicadores como detectores. Los cambios en la intensidad de
fluorescencia pueden medirse mediante un dispositivo formador de
imágenes acoplado a carga (CCD) (como un dispositivo formador de
imágenes de barrido o de área) para formar imágenes de todos los
pocillos de una placa de microvaloración. El sistema
LEADseeker^{TM} incluye una cámara CCD que permite la formación
de imágenes de fluorescencia de placas de microvaloración de alta
densidad en una única pasada. La formación de imágenes es
cuantitativa y rápida, y la instrumentación adecuada para las
aplicaciones de formación de imágenes ahora pueden formar imágenes
de manera simultánea de toda la placa de múltiples pocillos. Cuando
se va a dar formato a un ensayo para determinar la actividad de un
agente de ensayo sobre una actividad enzimática, el ensayo puede
realizarse con la medición continua de la fluorescencia del
sustrato. En este formato, la intensidad del sustrato marcado
fluorescente cambia continuamente. No es necesario separar el
sustrato marcado del producto de la reacción enzimática y, por
tanto, puede obtenerse una evolución en el tiempo de la reacción,
permitiendo realizar estudios cinéticos a tiempo real.
En un cuarto aspecto de la presente invención,
se proporciona un kit de ensayo para medir la actividad de la menos
una enzima, comprendiendo el kit de ensayo uno o más sustratos
enzimáticos diferentes, comprendiendo cada uno de dichos sustratos
un compuesto de fórmula (I), en la que D_{1}, D_{2}, L y M son
como se definió anteriormente en la presente. Preferiblemente, el
kit de ensayo comprende además al menos una o más enzimas
diferentes, siendo cada enzima específica para dicho sustrato
diferente.
Los compuestos de fórmula (I) pueden prepararse
mediante la unión covalente del resto de transferencia de energía
de fluorescencia, D_{1}-L-D_{2},
al grupo M, en la que D_{1}, D_{2}, M y L son como se definió
anteriormente en la presente, utilizando procedimientos de
acoplamiento químico directo muy conocidos por los expertos en la
técnica. Como alternativa, los compuestos de la presente invención
pueden prepararse mediante procedimientos sintéticos de
novo, como se ilustra en los ejemplos. El grupo M puede unirse
inicialmente a D_{1} para formar el compuesto intermedio
M-D_{1}, seguido de la unión de D_{2} a través
de un grupo conector L. El grupo conector L puede estar unido, de
modo conveniente, a M-D_{1} antes de la unión
covalente de D_{2} o, como alternativa, L puede estar preunido a
D_{2}. Los sustratos peptídicos, proteicos y oligonucleotídicos
para su uso en la invención pueden estar marcados en una posición
terminal o, como alternativa, en una o más posiciones internas.
Para informes y ejemplos del marcaje de proteínas utilizando
reactivos de marcaje de tinte fluorescente, véase
"Non-Radioactive Labelling, a Practical
Introduction", Garman, A.J., Academic Press, 1997;
"Bioconjugation-Protein Coupling Techniques for
the Biomedical Sciences", Aslam, M. y Dent, A., Macmillan
Reference Ltd. (1998). Están disponibles protocolos para obtener un
marcaje específico de sitio en un péptido sintetizado; por ejemplo,
véase Hermanson, G.T., Bioconjugate Techniques, Academic Press
(1996).
Para aclarar el principio y la función de la
invención se hace referencia a continuación a los siguientes
ejemplos.
A una disolución de NaOH (1,44 g) en metanol
(145 ml) se le añadió fluoresceína (6,0 g) para producir una
disolución de color oscuro que se concentró hasta la sequedad al
vacío. Ésta se coevaporó con DMF anhidra (2 x 50 ml) y se
redisolvió en DMF anhidra (150 ml). Se añadió yoduro de etilo (11,6
ml, 8 eq.) y la reacción se agitó a temperatura ambiente durante la
noche. Después de la concentración de la mezcla de reacción se
disolvió en una disolución de bicarbonato de sodio saturada (150 ml)
y se lavó con dietil éter. Se formó un precipitado amarillo tras el
enfriamiento de la disolución, que se filtró y por último se lavó
con éter (2 x 25 ml) y éter/pentano (1:1, 50 ml).
A una disolución agitada del éster de
etilfluoresceína (compuesto (2), 2,67 g) en 50 ml de ácido sulfúrico
se le añadió cloroacetilacetamida (850 mg) lentamente a lo largo de
5 minutos. La mezcla de reacción se agitó a temperatura ambiente
durante la noche. La mezcla de reacción se vertió sobre hielo
triturado y el precipitado formado se filtró y se lavó con agua
fría. El análisis de TLC y de masas indicó la formación de
compuestos de mono- y bis-cloroacetamida. Los
productos se purificaron mediante una cromatografía en columna de
gel de sílice utilizando metanol al 2-15% en
cloruro de metileno. El producto bis-alquilado se
eluyó primero, seguido de dos productos monoalquilados. El producto
mono-alquilado inferior fue el producto principal,
que se empleó para posteriores reacciones.
El producto monoalquilado principal (compuesto
(3), 1 g) se hidrolizó con HCl 6 N (15 ml) calentando durante 2,5
h. El producto se extrajo con CH_{2}Cl_{2}, se lavó con agua y,
después de secar sobre sulfato de sodio anhidro, se purificó
mediante una cromatografía en columna de gel de sílice para producir
500 mg del producto puro. MS ES^{+}: 390,3.
El compuesto (5) (390 mg) se suspendió en
piridina anhidra (5 ml) y se añadió TFA-NHS (650
mg). La mezcla se agitó durante la noche a temperatura ambiente.
Después de una concentración al vacío y una extracción con cloruro
de metileno, el producto se purificó mediante una cromatografía en
gel de sílice para producir 350 mg del producto puro. MS ES^{+}:
486,3.
A una disolución del compuesto (6) (200 mg) en
acetonitrilo (5 ml) se le añadió POCl_{3} (189 mg, 3 eq.) y la
mezcla de reacción se agitó a temperatura ambiente durante 1 hora.
Se añadió piridina (290 \mul, 9 eq.) y la reacción se agitó
durante 2 h más. La reacción se extinguió añadiendo TEAB (0,1 M, 10
ml). Después de 1 h, la mezcla se concentró al vacío y se purificó
mediante una cromatografía en gel de sílice utilizando un gradiente
de CH_{2}Cl_{2}/metanol para producir 130 mg de monofosfato
puro. MS ES^{-}: 564,5.
A una disolución del compuesto (7) (60 mg) en
DMF anhidra (2 ml) se le añadió tributilamina (30 \mul, 3 eq.) y
la mezcla se concentró hasta la sequedad al vacío. La mezcla se
redisolvió en DMF anhidra (2 ml) y se añadió carbonildiimidazol (85
mg, 5 eq.) con agitación. La mezcla se agitó a temperatura ambiente
durante 2 h y se comprobó que se había completado mediante
HPLC-MS. La mezcla se extinguió con metanol (100
\mul), se agitó a temperatura ambiente durante 1 h, se concentró
hasta la sequedad al vacío y se redisolvió en DMF anhidra (2 ml).
MS ES^{-}: 614,6.
Se coevaporó
timidina-5'-trifosfato (sal de
trietilamonio, 100 \mumol) con tributilamina (400 \mumol) en
DMF anhidra (2 x 2 ml) y por último se redisolvió en DMF anhidra (2
ml).
A la anterior disolución de sal de
tributilamonio de
timidina-5'-trifosfato (TTP) se
añadió el derivado de imidazolida (de la etapa 1.6.1) y la mezcla
se agitó a temperatura ambiente durante la noche. Una
HPLC-MS indicó que la reacción se había completado
en >90%. Ésta se agitó durante 5 h más.
La mezcla se agitó a temperatura ambiente
durante 2,5 h y se dejó en una nevera durante la noche. La mezcla
se concentró hasta la sequedad al vacío y se purificó mediante una
cromatografía de intercambio aniónico. Esta mezcla se trató con
fosfodiesterasa de veneno de serpiente (SVD) y fosfatasa alcalina
durante la noche (para eliminar la TTP sin reaccionar) y se
purificó después mediante una cromatografía en fase inversa
utilizando TEAB 0,1 M (tampón A) hasta acetonitrilo al 25% en TEAB
0,1 M. Se recogieron dos picos principales y se analizaron mediante
HPLC-MS. El primer pico principal produjo masa a
931,8 y el segundo pico produjo masa a 932,8 requeridos.
Resulta evidente que el tratamiento de amoníaco
durante la hidrólisis del grupo trifluoroacetilo también produce
reacción con la espirolactona y da como resultado la formación del
compuesto de amido no deseado. El pico 2 se concentró hasta la
sequedad al vacío, se coevaporó con metanol (2 x 5 ml) y se
redisolvió en H_{2}O (1 ml). La concentración se midió mediante
UV. Se obtuvo un total de 5,5 \mumol del compuesto puro.
A dos recipientes de reacción separados del
compuesto (8) (2,2 \mumol, 400 \mul de una disolución 5,5 mM)
se le añadieron 400 \mul de tampón carbonato de sodio/bicarbonato
de sodio 0,5 M (pH 8,5), y a un recipiente se le añadió éster de
5-ROX-NHS (5,5 mg en 2 ml de DMF) y
al otro recipiente se le añadió éster de Cy5-NHS (5
mg en 2 ml de DMF). Ambas mezclas de reacción se agitaron a
temperatura ambiente durante la noche y se controlaron mediante
HPLC-MS para comprobar si la reacción se había
completado. Las mezclas de reacción se concentraron al vacío y se
purificaron primero sobre una columna de intercambio iónico
utilizando acetonitrilo al 25% en TEAB 0,1 M (tampón A) y
acetonitrilo al 25% en TEAB 1 M (tampón B). El pico que contenía el
producto se concentró al vacío y después se repurificó mediante una
columna de HPLC en fase inversa. Las fracciones correctas se
recogieron y se concentraron al vacío y se cuantificaron mediante
espectroscopía de UV.
Compuesto (V): MS ES^{-}: 1449;
Compuesto (VI): MS ES^{-}: 1572.
La síntesis se realizó de la manera descrita
anteriormente para los compuestos (V) y (VI), excepto que el
material de partida era fosfato de
4'(5')-aminometiletoxifluoresceína (obtenido
mediante la hidrólisis del compuesto (7) con K_{2}CO_{3} en
metanol). Los productos se purificaron mediante HPLC y se
cuantificaron mediante espectroscopía de UV.
Compuesto (II): MS ES^{-}: 1107,3;
Compuesto (III): MS ES^{-}: 1342,4;
Compuesto (IV): MS ES^{-}: 881.
Los compuestos II, III y IV se suspendieron en
tampón HEPES 25 mM y MgCl_{2} 5 mM (pH 8,5) y se trataron con
fosfatos alcalinos durante 2 horas a temperatura ambiente. La
reacción se siguió de forma espectroscópica, lo cual indicó que la
reacción se hubo completado esencialmente en 30 minutos.
Los espectros de UV y de fluorescencia de los
tintes fosforilados (compuestos (II), (III) y (IV)) y no
fosforilados (compuestos (VIII), (IX) y (X)) se muestran en las
figuras 2-8. Los espectros de UV claramente muestran
la aparición de un pico o de picos a aproximadamente 472 nm tras el
tratamiento con fosfatasa alcalina.
Habiendo descrito las realizaciones concretas y
deseadas de la invención en la presente, debe apreciarse que pueden
realizarse modificaciones con la condición de que no se aparten del
alcance verdadero de la invención, tal como se expone en las
reivindicaciones adjuntas.
Claims (19)
1. Un compuesto de fórmula (I):
(I)M-D_{1}-L-D_{2}
en la
que:
D_{1} es un primer resto de tinte cuyas
propiedades de fluorescencia pueden modularse para que sea adecuado
como donador en una disposición de transferencia de energía, en la
que D_{1} es capaz de transferir energía a D_{2}, y se
selecciona de tintes de cumarina, tintes de benzocumarina, tintes de
acridona, tintes de xantina, tintes de fenoxantina, tintes de
rodamina, tintes de merocianina y tintes de cianina, preferiblemente
tintes de xantina y tintes de cianina;
D_{2} es un segundo resto de tinte que es
adecuado como aceptor en una disposición de transferencia de energía
con dicho primer tinte, y se selecciona de de tintes de cumarina,
tintes de benzocumarina, tintes de acridona, tintes de xantina,
tintes de fenoxantina, tintes de rodamina, tintes de merocianina y
tintes de cianina;
M es un grupo de escisión enzimática elegido
para modular las propiedades de fluorescencia de D_{1}, en el que
M comprende un sustrato para una primera enzima de escisión;
L es un grupo conector que comprende
2-200 átomos enlazados, en el que dicho grupo
conector es un conector escindible e incluye el grupo de escisión
enzimática P que es un sustrato para una segunda enzima de escisión
diferente de dicha primera enzima de escisión.
2. Un compuesto según la reivindicación 1, en el
que dicha primera enzima de escisión se selecciona del grupo que
consiste en una peptidasa, una proteasa, una fosfatasa, una
desalquilasa y una glicosidasa.
3. Un compuesto según cualquiera de las
reivindicaciones 1 ó 2, en el que M es el grupo:
en el que n es un número entero de
1 a
4.
4. Un compuesto según cualquiera de las
reivindicaciones 1 ó 2, en el que M comprende al menos un enlace
peptídico (-CO-NH-) unido covalentemente a
D_{1}.
5. Un compuesto según cualquiera de las
reivindicaciones 1 ó 2, en el que M comprende un enlace glicosídico
que es un sustrato para una glicosidasa.
6. Un compuesto según cualquiera de las
reivindicaciones 1 ó 2, en el que M comprende un enlace éter que es
un sustrato para una desalquilasa.
7. Un compuesto según cualquiera de las
reivindicaciones 1 ó 2, en el que M comprende además un grupo
permeabilizante de la membrana celular.
8. Un compuesto según la reivindicación 7, en el
que dicho grupo permeabilizante de la membrana celular se
selecciona de los grupos:
en los que R^{d}
es:
una cadena alquilo
C_{1}-C_{10} lineal o ramificada, no sustituida
o sustituida con uno o más átomos de halógeno; fenilo, no
sustituido o sustituido con uno o más átomos de halógeno; o
una cadena peptídica.
9. Un compuesto según una cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 8, en el que el grupo conector L se selecciona
de átomos de carbono que incluyen uno o más grupos seleccionados de
-C(O)-, -NR'-, -O-, -S-, -CH=CH-, -CO-NH-,
fenilenilo y el grupo:
en el que R' se selecciona de
hidrógeno y alquilo C_{1}-C_{4}, y m es un
número entero de 1 a
3.
10. Un compuesto según una cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 8, en el que el grupo conector L comprende un
péptido o un fragmento oligonucleotídico.
11. Un compuesto según una cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 10, en el que dicho tinte donador es un tinte
de xantina o un tinte de cianina, y el tinte aceptor es un tinte de
rodamina o de cianina.
12. Un compuesto según una cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 10, en el que al menos uno de dichos restos de
tinte donador y aceptor es un tinte de cianina.
13. Un compuesto según una cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 10, en el que dicho tinte donador es un tinte
de xantina, y dicho tinte aceptor es un tinte de rodamina.
14. Un compuesto según cualquiera de las
reivindicaciones anteriores, que comprende además constituyentes
hidrosolubilizantes unidos a él, seleccionándose dichos
constituyentes hidrosolubilizantes del grupo que consiste en
sulfonato, ácido sulfónico, fosfato, fosfonato, amonio cuaternario e
hidroxilo.
15. Un procedimiento para determinar las
actividades relativas de dos enzimas que actúan sobre una molécula
sustrato, comprendiendo dicha molécula sustrato un compuesto de
fórmula I:
M-D_{1}-L-D_{2}
en la que D_{1}, D_{2}, M y L
son como se definió en la reivindicación
1;
comprendiendo el procedimiento las etapas
de:
i) medir la intensidad de emisión de
fluorescencia del sustrato marcado de modo fluorescente;
ii) combinar dichas primera y segunda enzimas
con dicho sustrato bajo condiciones que producen la escisión de M
de D_{1}, y de D_{2} de D_{1};
iii) medir las intensidades de emisión de
fluorescencia de dichos primer y segundo restos de tinte después de
la combinación de la etapa ii); y
iv) utilizar el cambio en las intensidades de
fluorescencia de dichos primer y segundo restos de tinte para
determinar las actividades relativas de dichas enzimas.
16. Un procedimiento según la reivindicación 15,
en el que dichas primera y segunda enzimas se seleccionan del grupo
que consiste en fosfatasa, peptidasa, proteasa, desalquilasa y
glicosidasa.
17. Un procedimiento según la reivindicación 15
o la reivindicación 16, en el que dicha etapa de combinación ii) se
realiza en ausencia y en presencia de un agente de ensayo cuyo
efecto sobre las actividades relativas de dichas primera y segunda
enzimas se va a determinar; en el que una diferencia entre las
actividades relativas de dichas primera y segunda enzimas en
presencia y en ausencia de dicho agente es indicativa del efecto de
dicho agente de ensayo sobre las actividades relativas de dichas
primera y segunda enzimas.
18. Un kit de ensayo para determinar la
actividad de una enzima, comprendiendo dicho kit uno o más sustratos
enzimáticos diferentes, comprendiendo cada uno de dichos sustratos
un compuesto de fórmula (I) como se definió en la reivindicación 1,
en la que D_{1}, D_{2}, L y M se definen como en la
reivindicación 1.
19. Un kit de ensayo según la reivindicación 18,
que comprende además una o más de dichas enzimas diferentes, siendo
cada enzima específica para un dicho sustrato diferente.
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US56492404P | 2004-04-23 | 2004-04-23 | |
| US564924P | 2004-04-23 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| ES2324721T3 true ES2324721T3 (es) | 2009-08-13 |
Family
ID=34966026
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| ES05736155T Active ES2324721T3 (es) | 2004-04-23 | 2005-04-18 | Sustratos enzimaticos de transferencia de energia de resonancia de fluorescencia. |
Country Status (8)
| Country | Link |
|---|---|
| US (2) | US20090162838A1 (es) |
| EP (1) | EP1738171B1 (es) |
| JP (1) | JP4965434B2 (es) |
| CN (1) | CN1985171B (es) |
| AT (1) | ATE428113T1 (es) |
| DE (1) | DE602005013757D1 (es) |
| ES (1) | ES2324721T3 (es) |
| WO (1) | WO2005108994A1 (es) |
Families Citing this family (10)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| GB0421693D0 (en) | 2004-09-30 | 2004-11-03 | Amersham Biosciences Uk Ltd | Method for measuring binding of a test compound to a G-protein coupled receptor |
| JP5541894B2 (ja) * | 2009-09-25 | 2014-07-09 | アイシン精機株式会社 | 色素およびその製造方法 |
| IT1405070B1 (it) * | 2010-10-14 | 2013-12-16 | Univ Bologna Alma Mater | Nanoparticelle di silice drogate con una molteplicita' di coloranti caratterizzate da trasferimento di energia ad elevata efficienza e capaci di stokes-shift modulabile |
| DE12710995T1 (de) * | 2011-03-25 | 2014-04-03 | Almac Sciences (Scotland) Ltd. | Enzymtests |
| US9322051B2 (en) | 2013-10-07 | 2016-04-26 | General Electric Company | Probing of biological samples |
| CN104655596A (zh) * | 2013-11-18 | 2015-05-27 | 李捷 | 一种含红细胞血液样品的质量检测方法及检测试剂盒 |
| CN104109176B (zh) * | 2014-06-06 | 2016-07-06 | 浙江工业大学 | 一种化合物及其应用于碱性磷酸酶活性的荧光检测方法 |
| CN106405111A (zh) * | 2016-09-10 | 2017-02-15 | 天津大学 | 基于弹性蛋白酶荧光底物检测乳腺癌肿瘤标志物ca153的酶联免疫试剂盒制备方法 |
| WO2018159810A1 (ja) * | 2017-03-03 | 2018-09-07 | 国立大学法人東京大学 | アルカリフォスファターゼ検出用蛍光プローブ及びその使用 |
| EP3673076A4 (en) * | 2017-08-24 | 2021-05-26 | Commonwealth Scientific and Industrial Research Organisation | BRET SENSOR MOLECULES FOR DETECTION OF HYDROLASES |
Family Cites Families (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5795729A (en) * | 1996-02-05 | 1998-08-18 | Biometric Imaging, Inc. | Reductive, energy-transfer fluorogenic probes |
| GB0002261D0 (en) * | 2000-02-02 | 2000-03-22 | Amersham Pharm Biotech Uk Ltd | Fluorescent detection method & reagent |
| US20020168641A1 (en) * | 2001-03-09 | 2002-11-14 | Bruce Mortensen | Fluorescein-cyanine 5 as a fluorescence resonance energy transfer pair |
-
2005
- 2005-04-18 EP EP05736155A patent/EP1738171B1/en not_active Not-in-force
- 2005-04-18 WO PCT/US2005/013141 patent/WO2005108994A1/en active Application Filing
- 2005-04-18 ES ES05736155T patent/ES2324721T3/es active Active
- 2005-04-18 CN CN2005800199847A patent/CN1985171B/zh not_active Expired - Fee Related
- 2005-04-18 DE DE602005013757T patent/DE602005013757D1/de active Active
- 2005-04-18 JP JP2007509542A patent/JP4965434B2/ja not_active Expired - Fee Related
- 2005-04-18 US US11/568,193 patent/US20090162838A1/en not_active Abandoned
- 2005-04-18 AT AT05736155T patent/ATE428113T1/de not_active IP Right Cessation
-
2011
- 2011-07-15 US US13/183,518 patent/US20120208223A1/en not_active Abandoned
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| WO2005108994A1 (en) | 2005-11-17 |
| CN1985171B (zh) | 2012-08-08 |
| JP4965434B2 (ja) | 2012-07-04 |
| CN1985171A (zh) | 2007-06-20 |
| JP2007533828A (ja) | 2007-11-22 |
| EP1738171A1 (en) | 2007-01-03 |
| EP1738171B1 (en) | 2009-04-08 |
| DE602005013757D1 (de) | 2009-05-20 |
| ATE428113T1 (de) | 2009-04-15 |
| US20090162838A1 (en) | 2009-06-25 |
| US20120208223A1 (en) | 2012-08-16 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| ES2324721T3 (es) | Sustratos enzimaticos de transferencia de energia de resonancia de fluorescencia. | |
| Li et al. | Imaging γ-Glutamyltranspeptidase for tumor identification and resection guidance via enzyme-triggered fluorescent probe | |
| Li et al. | Monitoring γ-glutamyl transpeptidase activity and evaluating its inhibitors by a water-soluble near-infrared fluorescent probe | |
| US9670476B2 (en) | Enzyme substrate comprising a functional dye and associated technology and methods | |
| Luo et al. | Recent Advances in the Development of Optical Imaging Probes for γ‐Glutamyltranspeptidase | |
| Urano | Novel live imaging techniques of cellular functions and in vivo tumors based on precise design of small molecule-based ‘activatable’fluorescence probes | |
| CN113512579B (zh) | 一种检测尿嘧啶dna糖基化酶的荧光生物传感器及其检测方法和应用 | |
| CN101084437A (zh) | 发光和不发光多重检测 | |
| US7727739B2 (en) | Methods for measuring enzyme activity | |
| WO2015067302A1 (en) | Sensor molecules and uses thereof | |
| Wen et al. | A space‐dependent ‘enzyme‐substrate’type probe based on ‘carboxylesterase‐amide group’for ultrafast fluorescent imaging orthotopic hepatocellular carcinoma | |
| Li et al. | Recent advances in fluorescence imaging of alkaline phosphatase | |
| CN109438326A (zh) | 一种用于检测羧酸酯酶的荧光探针及其制备方法与专用检测试剂盒 | |
| Guo et al. | Fabrication of a water-soluble near-infrared fluorescent probe for selective detection and imaging of dipeptidyl peptidase IV in biological systems | |
| Biswas et al. | Dual colorimetric and fluorogenic probes for visualizing tyrosine phosphatase activity | |
| Casey et al. | Interrogating protein phosphatases with chemical activity probes | |
| Zou et al. | A non-peptide probe for detecting chymotrypsin activity based on protection–deprotection strategy in living systems | |
| CN105524608B (zh) | 一种荧光探针ah及其制备和应用 | |
| Huang et al. | Discovery of non-substrate, environmentally sensitive turn-on fluorescent probes for imaging HDAC8 in tumor cells and tissue slices | |
| McIntyre et al. | Near-infrared optical proteolytic beacons for in vivo imaging of matrix metalloproteinase activity | |
| McIntyre et al. | Optical proteolytic beacons for in vivo detection of matrix metalloproteinase activity | |
| JP2005523024A (ja) | プロテインキナーゼ及びホスファターゼ活性の測定法 | |
| CN105524609B (zh) | 一种荧光探针gh及其制备和应用 | |
| ES2197811B2 (es) | Sintesis de derivados fluorescentes de antiobioticos beta-lactamicos. | |
| 윤혜영 | Reaction-based probe for enzyme activity assay and bioimaging |