CN101084437A - 发光和不发光多重检测 - Google Patents

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Abstract

提供一种在多重发光/不发光实验中检测酶介导反应中的至少一种分子的存在或量的方法。

Description

发光和不发光多重检测
相关申请的交叉参考
本申请要求保护2004年1月22日提交的美国专利申请序号10/762,836的提交日权益，该专利申请的公开内容通过引用结合到本文中。
发明背景
某些生物由于荧光素酶介导的氧化反应而发光。各种各样的大量不同物种的荧光素酶基因，具体地说是萤火虫(Photinus pyralis)和北美萤火虫(Photuris pennsylvanica)、牙买加叩头虫(Pyrophorusplagiophthalamus)、海肾(Renilla renformis)和几种细菌(例如发光致病杆菌(Xenorhabdus luminescens)和弧菌(Vibrio spp))的荧光素酶基因，是极为普及的发光报告基因。萤火虫荧光素酶也是测定ATP浓度的通用报告分子，其借此作用广泛用于检测生物质。其它酶在与某些合成底物(例如碱性磷酸酶和磷酸金刚烷基二氧杂环丁烷或辣根过氧化物酶和鲁米诺)混合时也发光。
由于发光检测的非放射性性质、敏感性和极为线性的范围，荧光素酶基因广泛用作基因报告分子。例如，可检测少至10-20mol的萤火虫荧光素酶。因此，实际上基因活性的荧光素酶检测用于每个实验生物系统，包括原核和真核细胞培养物、转基因植物和动物以及无细胞表达系统。同样，用于测定ATP浓度的荧光素酶检测是高度敏感性的，能检测至10-16mol以下。
荧光素酶可通过氧化酶特异性底物(例如荧光素)而产生光。对于萤火虫荧光素酶和所有其它甲虫荧光素酶来说，在存在镁离子、氧和ATP时出现光发生。对于珊瑚虫荧光素酶(包括海肾荧光素酶)来说，仅需要氧以及底物腔肠素(Coelentrazine)。一般来说，在测定基因活性的发光检测中，将反应底物和其它激发发光的试剂导入到预期表达报告酶的生物系统中。如果有发光，则使用发光计或任何合适的辐射能检测装置检测产生的发光。检测非常快速和敏感，快速且容易地提供基因表达数据，不需要放射性试剂。
荧光素酶是众多报告分子之一，例如萤火虫荧光素酶、海肾荧光素酶、氯霉素乙酰转移酶(CAT)、β-半乳糖苷酶(lacZ)、β-葡糖醛酸酶(GUS)和各种磷酸酶，例如已组合并用作基因活性共同报告分子的分泌性碱性磷酸酶(SEAP)和子宫运铁蛋白(Uf；酸性磷酸酶)。双酶报告分子系统涉及使用、表达和检测单个系统中的两种独立的报告分子酶。在基因报告时，双报告分子检测对在遗传操作以在单个细胞或细胞群(例如分散在培养物、分离组织或整个动物中的细胞)中同时表达两种不同报告基因的检测特别有用。更时常发生是，一种基因活性报告特定实验条件的影响，而第二种报告基因的活性提供了通过其标准化全部实验值集的内控。双酶报告分子技术还可用于无细胞重组系统，例如得自编码实验和对照报告酶的独立遗传材料的同时翻译或偶合其转录与翻译的细胞裂解物。同样，免疫检测可设计用于单个样品中的实验值和对照值二者的双重报告。
任何双酶报告分子检测的性能都基于组成酶化学特征和关联其各自产生的数据集的能力。各种报告酶完全不同的酶动力学、检测化学和温育要求可使两种报告酶组合成一体化单管或单孔双报告分子检测形式复杂化。一种整合双报告分子检测的方法述于美国专利第5,744,320号，其具体公开了用于甲虫和海肾荧光素酶检测的一般性或特异性猝灭剂，并阐述了用于依次测定萤火虫荧光素酶然后海肾荧光素酶发光的代表性双报告分子检测。类似地，美国专利第6,586,196号公开了几种双报告分子检测系统。同公开于′320专利中的双报告分子系统一样，在′196专利中发光是两个反应中的每一个的可检测产物。在Liu等(2000)和Qazi等(2002)中描述了多重化报告分子检测的方法，该方法不仅加入了不同的底物，而且加入了不同的检测技术。例如，Liu等报告了在同一生物中的荧光素酶和GFP活性，其中酶活性以分步方式分别经发光和荧光检测测定。
报告分子还可用于检测细胞或上清液中分子的存在或活性。例如，蛋白酶构成了大且重要的一类酶，其涉及各种不同的生理过程，例如在血液凝集、炎症、生殖、纤维蛋白溶解和免疫反应中的蛋白转换。众多病症起因于或特征在于特定蛋白酶或其抑制剂的活性改变。在研究或临床处置中检测这些蛋白酶的能力对病症的研究、治疗和管理意义重大。例如，胱天蛋白酶-3和胱天蛋白酶-7是半胱氨酸天冬氨酰特异性蛋白酶(也称为天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶“ASCP”)家族的成员，在哺乳动物细胞的细胞死亡中起关键效应子作用(Thornberry等，1992；Nicholson等，1995；Tewari等，1995；和Fernandes-Alnemri等，1996)。
但是，蛋白酶用其天然底物不易检测。而且，许多目前可得到的合成底物昂贵、不敏感且无选择性。
业已使用众多发色和荧光底物检测蛋白酶(Monsees等，1994；Monsees等，1995)，修饰荧光素提供了对荧光指示剂的替代(美国专利第5,035,999和5,098,828号)。Miska和Geiger(1989)首先描述了使用具有水解酶识别位点的修饰荧光素作为前底物(pro-substrate)的方法，其中通过将修饰荧光素与水解酶温育特定的一段时间，然后将等份混合物转移至含荧光素酶的溶液，进行非均相检测。Masuda-Nishimura等(2000)报道了使用β-半乳糖苷酶底物-修饰荧光素的单管(均相)检测的应用。
酶反应的荧光或发光底物或产物业已用于蛋白检测多重化。例如，使用具有多达15种不同细胞因子配体的荧光珠检测两种或更多种不同细胞因子(DeJager等，2003)，使用荧光素二磷酸和酪蛋白BODIPY-FL检测碱性磷酸酶和某些蛋白酶(Nolkrantz等，2002)。
但是，需要的是改进的检测，例如均相检测，以使用不同的检测技术检测两种或更多种蛋白。
发明概述
本发明提供不发光(例如荧光或比色)检测和发光检测的多重检测(例如在同一孔中)，以检测样品中一种或多种成分的量(例如活性)和存在，这些成分包括用于酶反应的辅因子，例如ATP；结合和/或改变分子构象的蛋白(肽或多肽)，例如修饰或切割肽或多肽底物的蛋白；或蛋白结合和/或改变的分子。本文使用的“发光检测”包括其中第一种分子(例如第一种酶的肽或多肽底物)、第一种分子和合适(第一种)蛋白之间的反应产物和/或不同蛋白和第一种反应产物之间的反应产物发光的反应。因此，发光检测可直接或间接检测(例如测量)反应辅因子、蛋白结合和/或改变的分子或该蛋白的量或存在。例如，在一个实施方案中，可在发光检测中使用甲虫荧光素酶和合适的荧光素底物检测ATP浓度，而在另一个实施方案中，可在发光检测中使用经修饰含蛋白酶识别位点(例如经共价键修饰)的荧光素酶底物检测蛋白酶，即在存在荧光素酶时。发光检测包括化学发光和生物发光检测，其包括但不限于使用或检测荧光素酶、β-半乳糖苷酶、β-葡糖醛酸酶、β-内酰胺酶、蛋白酶、碱性磷酸酶或过氧化物酶和合适的对应底物(例如修饰形式的荧光素、腔肠素、鲁米诺、肽或多肽、二氧杂环丁烷、二氧杂环丁烷酮和相关吖啶酯)的检测。本文使用的“发光检测试剂”包括用于发光反应的底物以及辅因子或其它分子，例如蛋白，如酶。在一个实施方案中，发光检测试剂可为Z-DEVD-氨基荧光素、Z-LETD-氨基荧光素、Z-LEHD-氨基荧光素，或者可为连接至氨基荧光素、二氢荧光素、荧光素6′甲醚或荧光素6′氯乙醚的其它底物，例如肽或多肽底物。发光检测是其中发光反应产生的光比对应的不发光检测强至少1％(例如至少10％)的检测。
“不发光检测”包括其中第一种分子(例如蛋白(肽或多肽))、第一种分子和合适(第一种)蛋白(肽或多肽)之间的(第一种)反应产物或不同蛋白和第一种产物之间的反应产物不发光但可用其它方式检测的反应，例如使用直接或间接检测反应辅因子、分子或与该分子相互作用的蛋白的量或存在的荧光或比色实验检测底物和/或产物。例如，可修饰酶底物以含荧光团，该荧光团仅在酶与底物反应且荧光团接触(暴露于)一定波长或波长范围的光后发射一定波长的光，例如(Z-DEVD)2-罗丹明-110是胱天蛋白酶的底物，通过罗丹明-110的荧光可监测胱天蛋白酶切割底物。本文使用的“荧光检测试剂”包括荧光反应的底物以及辅因子或其它分子，例如蛋白。不发光检测是其中不发光反应产生的发光信号为对应发光反应发光信号的约10％以下(例如约1％以下或更少)的检测。
在一个实施方案中，用于本发明检测的分子，例如蛋白结合和/或改变的分子，包括修饰以含报告分子的分子，即例如在一个或多个随后反应后可检测或能够检测的分子。例如，在一个实施方案中，用于本发明发光检测的底物包括待检测的酶底物，该底物共价连接至发光反应底物，而在另一个实施方案中，用于荧光检测的底物可包括待检测的酶底物，该底物共价连接至一个或多个荧光团。在某些实施方案中，蛋白结合和/或改变的分子不包含报告分子。
如本文所述，使用至少两种不同的底物检测样品中一种以上蛋白酶的量或存在，一种底物具有发光示值读数，一种或多种底物具有荧光示值读数。例如，使用更敏感的发光方法，例如用底物Z-LETD-氨基荧光素检测胱天蛋白酶-8，接着使用另一种底物检测另一种蛋白酶(例如用(Z-DEVD)2-罗丹明-110检测胱天蛋白酶-3)，实现低丰度细胞蛋白酶的检测。因此，该检测兼有荧光试剂的强度和荧光素酶介导的发光反应的敏感性。而且，令人惊奇的是，荧光素(一种具有荧光特性并经常以相对大量存在于发光检测中的分子)的存在在组合的荧光/发光检测中未产生明显干扰。此外，令人惊奇的是，在同一反应混合物中检测两种胱天蛋白酶和荧光素酶，混合物包含胱天蛋白酶-8底物(Z-LETD-氨基荧光素)和两种胱天蛋白酶-3底物，即(Z-DEVD)2-罗丹明-110和Ac-DEVD-AMC。本发明因此为要用于多重检测的分子提供了更大的灵活性，例如发光检测底物与荧光检测底物组合。而且，如果两种酶介导的反应具有相容的试剂条件，则检测可为一步检测。
因此，本发明的组合发光/不发光检测形式允许多重检测一种或多种肽或多肽(例如酶)、肽或多肽(例如各种酶的肽或多肽底物)结合和/或改变的一种或多种分子和/或各个检测的一种或多种辅因子或其组合。因此，在一个实施方案中，本发明提供检测第一种酶介导反应的第一种分子的存在或量和第二种酶介导反应的第二种分子的存在或量的方法。该方法包括使预期具有第一种和/或第二种分子的样品与第一种和第二种酶介导反应的反应混合物(其没有第一种和/或第二种分子)接触。然后检测第一种和第二种分子的存在或量。使用包含发光检测的多重检测为使用发光实验检测的分子提供了增加的敏感性。在一个实施方案中，由第一种酶介导的反应产生发光产物，而由第二种酶介导的反应产生不发光产物。在一个实施方案中，提供组合的发光/荧光检测，包括其中一种检测提供内控的检测。本文描述的检测可与其它检测联用，其他检测包括报告分子检测、基于核酸的检测或基于免疫的检测以及其它不相关酶检测。
本发明还提供检测样品中至少一种分子的活性或存在的方法。该方法包括提供可包含酶介导反应的至少一种分子的样品，例如样品可包含酶，使样品和无该分子的酶介导反应的反应混合物(例如含酶底物的反应混合物)接触，以产生反应混合物，其中分子的存在或量能通过发光实验检测。在一个实施方案中，样品和/或反应混合物还与试剂接触，以检测第二种酶介导反应的分子，其中第二种酶介导反应的分子的存在或量能通过不发光检测检测。
在一个实施方案中，本发明提供检测样品中第一种酶和/或该酶介导反应的辅因子的存在或量的方法。该方法包括使样品与第一种酶的第一种底物、第二种酶的第二种底物以及任选的第三种酶接触，以产生反应混合物。在一个实施方案中，至少第一种酶和第二种酶是不相同的，例如基本上不识别相同底物，即它们不结合相同底物，或者如果它们与相同底物结合或反应，则其中一种酶与另一种酶底物的反应达不到相同程度(效率)，即当两种酶的底物都存在时，其中一种酶基本上不与另一种酶底物反应。本文使用的基本上不与第二种酶底物反应的酶(第一种酶)包括这样的酶：在具有第二种酶和等量的第一种酶底物和第二种酶底物的反应中，相对于第一种酶和第一种酶底物之间的反应，其与第二种酶底物的交叉反应不超过25％，例如交叉反应15％、10％或5％或更低。第一种底物、第一种底物和第一种酶之间的反应产物和/或第一种酶和第一种底物的产物与第三种酶之间的反应产物发光。第二种底物、第二种底物和第二种酶之间反应的(第二种)产物和/或另一种酶和第二种产物之间的反应产物不发光但可以其它方式检测。检测或测定第一种酶和/或辅因子的存在或量。在一个实施方案中，还检测或测定第二种酶和/或第二种酶介导反应的辅因子的存在或量。在一个实施方案中，至少第一种酶和第二种酶不相同。待检测的酶可为天然酶或重组酶，例如包括融合蛋白。加入到样品中的任选酶也可为天然酶或重组酶。
在另一个实施方案中，本发明提供检测样品中第一种酶和/或该酶介导反应的辅因子的存在或量的方法。该方法包括使样品与第一种酶的第一种底物、第二种酶的第二种底物以及任选的第三种酶接触，以产生反应混合物，其中任选至少第一种酶和第二种酶不相同。第一种底物、第一种底物和第一种酶之间的反应产物和/或第一种酶和第一种底物的产物与第三种酶之间的反应产物不发光但可以其它方式检测。第二种底物、第二种底物和第二种酶之间反应的第二种产物和/或另一种酶和第二种产物之间的反应产物发光。检测或测定第一种酶和/或辅因子的存在或量。在一个实施方案中，还检测或测定第二种酶的存在或量。在反应混合物中待检测或使用的酶可为天然酶或重组酶。
本发明进一步提供检测酶介导发光反应以检测第一种酶或该酶介导反应的辅因子的方法。该方法包括使样品与第一种酶的第一种底物、第二种酶的第二种底物以及任选的第三种酶接触，以产生反应混合物，其中第一种酶和第二种酶不相同。第一种底物、第一种底物和第一种酶之间的反应产物和/或第一种酶和第一种底物的产物与第三种酶的产物发光。第二种底物、第二种底物和第二种酶之间反应的第二种产物和/或第二种产物和另一种酶之间的反应产物不发光但可以其它方式检测。然后检测发光。该方法可进一步包括检测第二种酶的存在或量，例如通过检测不发光底物或产物的存在或量。在一个实施方案中，第二种酶不与第一种底物结合或反应，而在另一个实施方案中，第一种酶不与第二种底物结合或反应。在一个实施方案中，至少第一种酶和第二种酶不相同。在反应混合物中待检测或使用的酶可为天然酶或重组酶。
本发明还提供检测酶介导发光反应以检测第一种酶或该酶介导反应的辅因子的方法。该方法包括使样品与第一种酶的第一种底物、第二种酶的第二种底物以及第三种酶接触，以产生反应混合物。第一种底物、第一种底物和第一种酶之间的反应产物和/或第一种酶和第一种底物的产物与第三种酶的产物不发光但可以其它方式检测。第二种底物、第二种底物和第二种酶之间反应的第二种产物和/或第二种产物和另一种酶之间的反应产物发光。然后检测发光。该方法可进一步包括检测第一种酶或第一种酶和第一种底物的产物的存在或量。在一个实施方案中，第二种酶基本上不与第一种底物结合或反应，而在另一个实施方案中，第一种酶基本上不与第二种底物结合或反应。在一个实施方案中，至少第一种酶和第二种酶不相同。在反应混合物中待检测或使用的酶可为天然酶或重组酶，例如包括融合蛋白。
本发明进一步提供检测样品中至少两种分子的存在或量的方法。该方法包括使样品与第一种酶的第一种底物、第二种酶的第二种底物以及任选的第三种酶接触，以产生反应混合物，其中至少第一种酶和第二种酶不相同。第一种酶和第一种底物之间的反应或第一种底物和第一种酶之间的反应产物与第三种酶之间的反应产生发光产物。第二种底物、第二种底物和第二种酶之间反应的第二种产物和/或第二种产物和不同酶之间的反应产物不发光。然后检测第一种酶和第二种酶和/或辅因子的存在或量。在一个实施方案中，发光用于检测第一种酶和/或辅因子，荧光或比色用于检测至少一种其它酶和/或辅因子。在一个实施方案中，两种不同酶的底物同时与样品组合，以产生反应混合物。一种底物和一种酶之间的反应直接或间接产生发光信号，而另一种底物和酶之间的反应直接或间接产生荧光信号。在温育期后，使用荧光信号检测一种酶和/或辅因子的存在或量，使用发光信号检测另一种酶和/或辅因子的存在或量。具体缓冲条件可随待检测的酶和/或辅因子变化，可由体外检测(例如酶检测)领域技术人员确定。或者，检测可为两步检测，在第一个和第二个检测之间包含试剂调节。例如，试剂调节可包括加入第一种反应的猝灭剂和/或第二种反应的增强剂。
在一个实施方案中，为检测第一种酶或第一种酶介导反应的辅因子和第二种酶或第二种酶介导反应的辅因子，使样品与第一种底物和第二种底物同时接触。在另一个实施方案中，样品在接触第一种底物前接触第二种底物，或在接触第二种底物前接触第一种底物。在一个实施方案中，可与一种或多种底物一起、在一种或多种底物之前或在一种或多种底物之后加入第三种或不同的酶。
在一个实施方案中，为检测第一种酶介导反应的第一种底物或辅因子和第二种酶介导反应的第二种底物或辅因子，使样品与第一种酶和第二种酶同时接触。在另一个实施方案中，样品在接触第一种酶前接触第二种酶，或在接触第二种酶前接触第一种酶。
在一个实施方案中，为检测第一种酶或第一种酶介导反应的辅因子和第二种酶介导反应的第二种底物或辅因子，使样品与第一种底物和第二种酶同时接触。在另一个实施方案中，样品在接触第一种底物前接触第二种酶，或在接触第二种酶前接触第一种底物。在一个实施方案中，为检测第一种酶介导反应的第一种底物或辅因子和第二种酶或第二种酶介导反应的辅因子，使样品与第一种酶和第二种底物同时接触。在另一个实施方案中，样品在接触第一种酶前接触第二种底物，或在接触第二种底物前接触第一种酶。
用于本发明方法的样品可为细胞裂解物、体外转录/翻译反应物、细胞培养上清液、生理液样品(例如血液、血浆、血清、脑脊髓液、泪液或尿液样品)，并可包括完整细胞。细胞、细胞裂解物或上清液可得自原核细胞或真核细胞。
本发明还提供同时或依次检测第一种和第二种蛋白(例如酶)或其中至少一种蛋白介导反应的辅因子的存在或量，例如提供同时反应或依次反应，任选没有猝灭其中一种反应或增强/加速其中一种反应。在一个实施方案中，将第一种和第二种底物同时加入到样品中，并检测第一种酶和/或辅因子的量或存在，然后检测第二种酶和/或辅因子的量或存在。在另一个实施方案中，将第一种和第二种底物同时加入到样品中，并检测第二种酶和/或辅因子的量或存在，然后检测第一种酶和/或辅因子的量或存在。或者，将第一种和第二种底物同时加入到样品中，并同时检测第一种和第二种酶和/或辅因子的存在或量。优选在单个反应中检测酶和/或辅因子的存在或量，例如所有反应都在单个容器(例如孔)中进行。
在另一个实施方案中，本发明提供检测酶介导反应分子的存在或量的方法，其中所述酶介导反应伴有荧光蛋白(例如绿色荧光蛋白)表达。例如，可通过荧光实验检测瞬时或稳定表达荧光蛋白或可在细胞中被标记而发荧光的蛋白(例如脱卤素酶)的细胞中荧光蛋白的存在或量，以及通过发光实验检测至少一种另外的分子，例如酶、底物或该酶介导反应的辅因子，该分子存在于细胞中或由细胞分泌。在一个实施方案中，还例如在不发光实验中检测或测定不同分子的存在或量。然后可使用由荧光蛋白产生的数据对该分子的存在或量进行标准化。
因此，本发明提供检测第一种酶介导反应的分子的存在或量的方法。该方法包括使含荧光蛋白表达细胞的样品与没有该分子的第一种酶的反应混合物和任选的第二种酶接触。第一种酶介导反应产生发光产物。然后检测分子的存在或量和荧光蛋白的存在或量。
在一个实施方案中，对于产生具有不同特征(例如不同颜色)的产物的发光和/或荧光检测，可使用进一步的多重检测(即用其它底物)。例如，进一步的多重检测可包括使用由基于不同荧光素酶的反应或底物散发的不同颜色或具有不同激发/发射光谱的荧光检测。
本发明还提供测定细胞群(例如细胞培养群)中活细胞和/或死细胞的存在或数目的方法。该方法基于与细胞膜穿透性和完整性相关的差异性蛋白水解活性。该方法的优势包括用于下游多重应用和群响应标准化的检测示值读数的敏感性、简单性、灵活性。基于一种蛋白酶底物的相对不可渗入性和细胞环境释放的蛋白酶的对另一种蛋白酶底物的较差酶活性，预测存活力的差异化检测。用于该实施方案的底物包括外切或内切蛋白酶的底物，包括在N-末端或C-末端被封闭的底物。在一个实施方案中，使用至少两种不同的荧光底物(荧光检测试剂)，其中一种底物基本上不能渗入细胞，并对在胞外环境中有活性的蛋白酶(例如遍在化、保守、释放性蛋白酶)是特异性的。另一种底物基本上可渗入细胞，并对在活细胞中有活性但在存在于胞外环境中时基本无活性的胞内蛋白酶是特异性的。基本上不能渗入细胞的蛋白酶底物是这样的底物：在死细胞检测中一般用于测定终点的时间段内，例如蛋白酶底物加入样品后少于5、4、3、2或1.5小时的时间，在活细胞中不可检出的底物。基本上可渗入细胞的蛋白酶底物是这样的底物：在活细胞检测中一般用于检测终点的时间段内，例如底物加入样品后5、15、30、60或120分钟以上或更长的时间，进入活细胞的底物。在某些条件下基本无活性的蛋白酶是活性在该蛋白酶最佳活性约10％以下的蛋白酶。在一个实施方案中，基本上不能渗入细胞的荧光底物包括三肽或四肽底物。在一个实施方案中，基本上可渗入细胞的荧光底物包括氨基酸或二肽或三肽底物。使样品与两种底物接触，任选用一种或多种测试条件或物质以不会导致细胞裂解或产生细胞裂解物的量(一般来说“非破坏性的”)处理该样品。两种荧光底物中的荧光团具有不同光谱，由与荧光底物接触的样品获得的相对荧光单位(RFLU)使得可以检测样品中的活细胞和死细胞。
在另一个实施方案中，使用荧光蛋白酶底物和发光蛋白酶底物检测或测定样品中活细胞和死细胞的存在或量。一种底物基本上不能渗入细胞，并对在胞外环境中有活性的蛋白酶是特异性的，另一种底物基本上可渗入细胞，并对在活细胞中有活性但在存在于胞外环境中时基本无活性的胞内蛋白酶是特异性的。在一个实施方案中，基本上不能渗入细胞的蛋白酶底物包括三肽或四肽底物。在一个实施方案中，基本上可渗入细胞的蛋白酶底物包括氨基酸或二肽或三肽底物。例如在不存在导致细胞裂解的条件下使样品与两种底物接触，检测由蛋白酶切割产生的荧光产物和发光产物(RFLU和RLU)，这使得可以测定样品中的活细胞和死细胞。例如，可将不引起细胞裂解的荧光素酶检测试剂加入到孔中，与发光底物接触。
例如可使用荧光计或荧光计/发光计设备检测释放和保留的蛋白酶活性在光谱上不同的信号。这样的检测是成反比的，因而是互补的(complimentary)。存活力和细胞毒性检测可用于标准化、控制和改进数据。
如本文所述，将Ala-Ala-Phe-AMC(释放性蛋白酶底物)和Gly-Phe-AFC(活细胞保留蛋白酶)与活细胞和细胞裂解物的一定百分比混合物合并。通过冻/融循环、变性剂处理以及诱导凋亡的物质(例如星形孢菌素、rTRAIL和抗-Fas mAb)处理，损害细胞存活力。而且，细胞存活力的这些检测还与其它细胞存活力检测(CellTiter-GloTM、CellTiter-BlueTM或CytoTox-ONETM)或凋亡细胞毒性的特异性检测(胱天蛋白酶-GloTM 3/7、-8、-9或Apo-ONETM)复合。另如本文所述，其它底物，例如其它荧光底物(如含罗丹明110的荧光底物)或发光底物(如氨基荧光素型底物)，可用于蛋白酶释放和/或蛋白酶保留检测。
因此，本文描述的活细胞和/或死细胞检测的使用提供细胞健康的反向和互补检测，并可用于检测条件改变(例如化合物处理)的作用，而不需要裂解步骤。而且，因为底物具有可忽略或非固有的颜色，所以在成对终点检测中没有可观测的信号猝灭作用。此外，蛋白酶释放和保留活性组分都具有实用敏感性(检测10,000细胞/孔的存活力差异小于2-5％)，此敏感性可在少至15分钟内达到。另外，底物可混合入细胞孔中，而没有急剧改变孔容量，这增加了下一步终点化学的灵活性。例如，使用偶联dsDNA嵌入剂或其它合适终点的活细胞/死细胞检测，可用于检测或测定死细胞相对对照的百分率、活细胞相对对照的百分率、相对于对照的总细胞数和/或细胞死亡机制(胱天蛋白酶活化)或其它终点报告分子检测测定。
因此，本发明提供基于单一非破坏性荧光或非破坏性发光蛋白酶的检测，或基于非破坏性荧光和/或非破坏性发光蛋白酶的活细胞/死细胞检测的多重检测，或基于非破坏性荧光蛋白酶的检测与其它检测的组合(例如在同一孔中)。在一个实施方案中，在活细胞/死细胞检测中待检测或测定的蛋白酶不相同，例如基本上不识别相同底物，即它们不结合相同底物，或者如果它们与相同底物结合或反应，则其中一种蛋白酶与另一种蛋白酶底物的反应达不到相同程度(效率)，即当两种蛋白酶的底物都存在时，其中一种蛋白酶基本上不与另一种蛋白酶的底物反应。
本发明因此提供检测样品中的活细胞和/或死细胞的方法。该方法包括使样品与第一种蛋白酶的底物和第二种蛋白酶的底物接触。由一种蛋白酶介导的与一种底物的反应产生荧光产物，由另一种蛋白酶介导的与另一种底物的反应产生发光或荧光产物。一种底物基本上可渗入细胞，另一种底物基本上不可渗入细胞。然后检测和测定样品中的荧光和/或发光，其再检测或测定样品中活细胞和/或死细胞的数目或存在。
在一个实施方案中，两种不同蛋白酶的底物同时与样品混合。在另一个实施方案中，样品在接触第一种底物前接触第二种底物，或在接触第二种底物前接触第一种底物。在一个实施方案中，检测可为两步检测，任选在第一个和第二个检测之间具有试剂调节。本发明还提供第一种和第二种蛋白酶的存在或量的同时或依次检测。在一个实施方案中，将第一种和第二种底物同时加入到样品中，并检测一种蛋白酶的量或存在，然后检测另一种蛋白酶的量或存在。或者，将第一种和第二种底物同时加入到样品中，并同时检测第一种和第二种蛋白酶的存在或量。优选在单个反应中检测蛋白酶的存在或量，例如所有反应都在单个容器(例如孔)中进行。
本发明提供检测样品中活细胞的方法。该方法包括使样品与基本上可渗入细胞的荧光底物接触，该底物为结合蛋白酶体的蛋白酶、氨肽酶或组织蛋白酶的底物，检测或测定样品中的荧光，由此检测或测定样品中活细胞的数目或存在。
本发明还提供检测样品中死细胞的方法。该方法包括使样品与基本上不能渗入细胞的荧光或发光底物接触，该底物为三肽基肽酶、钙蛋白酶或胰凝乳蛋白酶的底物，检测或测定样品中的荧光或发光，由此检测或测定样品中死细胞的数目或存在。
本发明还提供含一种或多种用于本发明检测的试剂的试剂盒。在一个实施方案中，本发明提供用于检测样品中活细胞和/或死细胞的试剂盒。例如，本发明提供包含组合物和说明书的试剂盒，该组合物具有第一种蛋白酶的基本上不能渗入细胞的第一种荧光或发光底物，以及第二种蛋白酶的基本上可渗入细胞的第二种荧光底物；该说明书用于指导用户使用该组合物检测样品中的活细胞和/或死细胞。在一个实施方案中，组合物为溶液，例如其中底物以0.005至约1.0M(例如0.05至约0.2M)存在于溶剂(例如有机溶剂)中的溶液。在另一个实施方案中，本发明包括含组合物的试剂盒，该组合物包含Ala-Ala-Phe-AMC、(Ala-Ala-Phe)2-R110、Ala-Ala-Phe-氨基荧光素、Gly-Phe-AFC、Gly-Phe-AMC、Gly-Gly-Leu-AMC或其任意组合。在一个实施方案中，组合物为溶液，例如其中底物以0.005至约1.0M(例如0.05至约0.2M)存在的溶液。
本发明的检测还具有作为药物开发工具的用途。许多药物测试化合物具有可干扰荧光/发光多重检测的荧光特性。本发明提供检测假结果的检测。如本文所述，将胱天蛋白酶-3的相同共有底物序列连接至具有不同光谱示值读数的不同报告分子，例如具有荧光示值读数的两种分子和具有发光示值读数的一种分子。在有和没有胱天蛋白酶-3抑制剂或荧光素酶抑制剂的情况下检测胱天蛋白酶-3和荧光素酶。数据表明，三种报告分子之间的干扰非常小，荧光素酶可用于控制假结果的标准化检测。
因此，可使用本发明的多重检测，例如组合的荧光/发光检测，检测酶调节剂(例如抑制剂)的存在或量。在一个实施方案中，该方法包括提供含第一种酶的不发光底物、第一种酶的第二种底物、用于发光检测的第二种酶和测试剂的反应混合物。不发光底物和第一种酶而不是第二种底物和第一种酶的反应产生不发光产物，第二种底物和第一种酶反应产生第二种酶的底物，例如荧光素酶底物。第二种酶的底物和第二种酶反应产生发光产物。比较测试和对比反应中发光产物和不发光产物的存在或量。两个结果的对比表明调节剂对用于发光检测的酶的作用，这可排除假结果。
附图简述
图1A-B。在发光和荧光检测试剂二者存在下检测胱天蛋白酶-3和胱天蛋白酶-8酶活性的多重检测。A)相对光单位(RLU)对时间。B)相对荧光单位(RFU对时间。
图2A-C。胱天蛋白酶-3和胱天蛋白酶-8的多重检测。A)AMC的信号对背景荧光。B)罗丹明-110的信号对背景荧光。C)信号对背景发光。
图3A-C。检测胱天蛋白酶-3、胱天蛋白酶-8和胰蛋白酶活性的三重检测。A)罗丹明-110的RFU；B)AMC的RFU；C)RLU。
图4A-D。检测蛋白酶(胱天蛋白酶-3)和非蛋白酶(β-半乳糖苷酶)的多重检测。A)和C)分别为1/2小时和18小时的RLU。B)和D)分别为2小时和18小时的RFU。
图5A-C。荧光素(A)、氨基荧光素(B)和Z-LETD-氨基荧光素(C)的激发和发射光谱。
图6。在胱天蛋白酶-3检测中三个通道-罗丹明-110、AMC和发光的信号对背景比率。
图7A-D。检测乳酸脱氢酶(LDH)活性和腺苷三磷酸(ATP)的多重荧光和发光检测。A)和C)RLU对ATP浓度。B)和D)RFU对LDH稀释度。
图8A-D。检测LDH和胱天蛋白酶-3的多重荧光和发光检测。A)和C)RLU对胱天蛋白酶-3浓度。B)和D)RFU对LDH稀释度。
图9A-D。检测蛋白激酶A(PKA)和胱天蛋白酶-3的多重荧光和发光检测。A)和C)RLU对胱天蛋白酶-3浓度。B)和D)RFU对PKA浓度。
图10。检测胱天蛋白酶-3和海肾荧光素酶(luc)的多重荧光和发光检测。A)和C)RLU对星形孢菌素浓度。B)和D)RFU对胱天蛋白酶-3浓度。
图11A。RFLU对用变性剂或载体和蛋白酶释放检测试剂处理的HL-60细胞数的作图。
图11B。荧光(AMC)蛋白酶释放检测的敏感性。
图12A。RFLU对用蛋白酶释放检测试剂处理的Jurkat细胞存活百分率的作图。
图12B。荧光((Ala-Ala-Phe)2-R110)蛋白酶释放检测的敏感性。
图13A。发光对用发光蛋白酶释放检测试剂处理的Jurkat细胞存活百分率的作图。
图13B。信噪比对用发光蛋白酶释放检测试剂处理的Jurkat细胞存活百分率的作图。
图14A。在有或没有超声情况下，RLU对用不同蛋白酶释放检测试剂处理的HL-60细胞数的作图。
图14B。用不同底物进行的发光蛋白酶释放检测的敏感性。
图15A。在蛋白酶释放(细胞死亡)检测(AN32504)和CytoTox-ONETM检测中，信号-背景比率对星形孢菌素接触时间的作图。
图15B。RFLU对星形孢菌素接触时间、对LDH释放的作图。
图16。在有或没有裂解和不同pH情况下，RFLU对用蛋白酶释放检测试剂处理的HL-60细胞数的作图。
图17。与Ala-Ala-Phe-氨基荧光素接触，并经受不同裂解处理的HL-60细胞释放的蛋白酶。
图18。ATP发光和蛋白酶保留检测试剂的RFLU对rTRAIL浓度的作图。
图19A。RFLU对用三种不同蛋白酶保留检测试剂处理的Jurkat细胞数的作图。
图19B。三种不同底物在蛋白酶保留检测中的敏感性。
图20。皂苷处理后释放的蛋白酶的蛋白酶活性的半寿期。
图21A。基于蛋白酶的活细胞/死细胞检测。
图21B。在具有活细胞、死细胞或活细胞/死细胞检测的依次多重应用中的ATP存活力检测。
图21C。荧光活细胞或死细胞检测和发光ATP检测的依次多重检测。
图22A。活细胞RFLU和胱天蛋白酶3/7活性的RFLU对SK-MEL-28细胞中离子霉素或星形孢菌素逐渐增加的浓度。
图22B。活细胞RFLU和胱天蛋白酶3/7活性的RFLU对ACHN细胞中星形孢菌素逐渐增加的浓度。
图23。死HeLa细胞发光和活HeLa细胞荧光对他莫昔芬处理小时数的作图。
图24A。用他莫昔芬处理和用PicoGreenTM染色的HeLa细胞的基于蛋白酶的活细胞/死细胞检测。
图24B。用离子霉素处理和用PicoGreenTM染色的Hep2G细胞的基于蛋白酶的活细胞/死细胞检测。
发明详述
本发明提供一种多重检测方法，其中在反应混合物中同时或依次提供至少两种蛋白(例如肽或多肽)结合和/或改变的不同分子，以检测一种或多种成分，包括蛋白(肽或多肽)，例如酶或底物或反应的辅因子。例如，在有效将至少一种酶底物转变成底物和酶之间的反应产物的条件下，进行一种或多种酶介导的反应。优选反应混合物中的每种分子(例如底物)或反应产物都具有与其它分子或产物不同的特征，在一个实施方案中，至少一种分子包括能够直接或间接产生可检测信号的报告分子。产生的信号与待检测分子的存在或量相关。在一个实施方案中，该方法包括在有效将各种底物转变成对应产物的条件下，在至少两种不同酶底物存在下，进行两种或更多种酶反应，其中至少底物或每个反应的产物和/或一种产物和第三种(例如不同的)酶之间反应的产物具有与其它底物和/或产物不同的可检测特征，例如不同的光学特征。在进行反应后，同时或依次检测或测定一种或多种底物或一种或多种反应产物的存在或量。由此可测定对应酶和/或辅因子的存在或量。
因此，设想了两种通用类型的多重检测。首先，检测同一反应混合物中的多种成分，例如一种或多种酶、一种或多种底物和/或酶介导反应的一种或多种辅因子。每种酶都能将至少一种底物转变成对应产物，其中底物和/或对应产物或一种对应产物和另一种酶之间的反应产物具有不同的可检测特征，使底物和/或产物在存在于同一反应混合物中时可单独被检测。本发明检测中加入分子的顺序可改变。因此，可同时或依次启动和/或进行各个反应。如果依次启动和进行，不同的可检测特征可能需要不同的检测方法，和/或可进行反应条件调节(例如试剂浓度、温度或另外的试剂)。例如，可在反应间加入猝灭剂或增强剂(参见例如美国专利第5,774,320和6,586,196号，其公开内容通过引用明确地结合到本文中)。在一个优选实施方案中，在单一反应混合物中同时进行两种或更多种反应，其中每种酶都有效将反应混合物中的一种底物转变成产物。该实施方案例如可用于测定细胞、细胞裂解物或细胞上清液中至少两种不同的酶和/或辅因子的存在或量。另外，反应可包含一种或多种测试剂，例如酶抑制剂或活化剂，和/或不同浓度的抑制剂、活化剂或底物。
任选该检测作为均相检测使用，例如混合一种或多种底物和其它组分，然后将混合物加入到样品中。可在没有另外试剂转移的情况下读出结果。
在第二种检测类型中，串联进行两种或更多种酶介导的反应。可同时或于不同时间进行单独的反应。反应可包含一种或多种相同或不同的酶、一种或多种相同或不同的测试剂(例如酶抑制剂或活化剂)和/或不同浓度的抑制剂、活化剂或底物。在一个实施方案中，每种反应混合物都包含至少两种能够转变成产物的底物，其中底物和/或对应产物和/或一种酶/底物对的产物和不同酶之间的反应产物具有不同的可检测特征。
本发明的检测因此允许检测样品中的多种酶或辅因子，所述样品例如为含真核细胞(例如酵母细胞、鸟类细胞、植物细胞、昆虫细胞或哺乳动物细胞，哺乳动物细胞包括但不限于人、猿、鼠、犬、牛、马、猫、绵羊、山羊或猪细胞)、或原核细胞、或两种或更多种不同生物的细胞、或其细胞裂解物或上清液的样品。细胞可未通过重组技术进行遗传修饰(非重组细胞)，或可为重组细胞，其用重组DNA瞬时转染和/或其基因组用重组DNA稳定增加或其基因组已被修饰以破坏基因，例如破坏了启动子、内含子或读框，或一个DNA片段被另一个置换。重组DNA或置换DNA片段可编码通过本发明方法检测的分子、改变待检测分子的水平或活性的成分和/或与分子或改变分子的水平或活性的成分不相关的基因产物。
在一个实施方案中，本发明方法提供同时或依次检测单个样品(例如等份细胞或其裂解物)中的多种成分(包括酶)的快速高敏感性方法。在一个实施方案中，该方法包括在发光检测中定量第一种酶、底物或辅因子的存在或量(活性)，在不发光检测(例如荧光检测)中定量第二种酶、底物或辅因子的存在或量。在一个实施方案中，可一起或依次加入每个反应的试剂，例如底物。在另一个实施方案中，该方法包括在荧光检测中定量第一种酶、底物或辅因子的存在或量，在发光检测中定量第二种酶、底物或辅因子的存在或量。因此，在另一个实施方案中，该方法包括在发光检测中定量辅因子的存在或量，在不发光检测中定量不同的分子。在再另一个实施方案中，该方法包括在不发光检测中定量辅因子的存在或量，在发光检测中定量不同的分子。发光或不发光信号的强度是相应分子的存在或量的函数。
本发明进一步提供单重或多重检测方法，其中为样品(例如未经历细胞裂解的样品)提供一种或多种外切和/或内切蛋白酶的一种或多种底物，这些底物用于检测或测定样品中活细胞和/或死细胞的数目或存在。
在一个实施方案中，本发明涉及检测单等份细胞或其裂解物中一种或多种酶的存在或量的方法。在一个实施方案中，至少一种酶是内切酶。例如，在一个实施方案中，本发明提供监测含蛋白酶和其它酶的制品中至少一种蛋白酶和任选另一种酶的活性的改进型敏感方法，所述制品包括得自原核细胞或真核细胞的纯化制品、细胞(例如培养的真核细胞，如哺乳动物细胞)的细胞裂解物或上清液。对于在不同细胞区域中存在的酶，例如分泌性蛋白酶和胞内蛋白酶，可将每种酶的底物加入到含完整细胞的孔中。可在检测分泌性蛋白酶的存在或量之后检测胞内蛋白酶，例如在细胞裂解后，例如胞内蛋白酶检测可与分泌性蛋白酶检测在同一容器(例如相同孔)中进行。在一个实施方案中，将胞内蛋白酶的非细胞渗入性底物和分泌性或释放性蛋白酶的底物加入到含细胞的样品中，然后任选裂解细胞。可在细胞裂解前或细胞裂解后检测分泌性或释放性蛋白酶。在另一个实施方案中，将胞内蛋白酶或分泌性或释放性蛋白酶的非细胞渗入性底物和第二种胞内酶的细胞渗入性底物加入到含细胞的样品中。可在不裂解的情况下，检测第二种胞内酶和分泌性或释放性蛋白酶的存在。在再另一个实施方案中，进行三重检测，以检测分泌性或释放性蛋白酶、胞内酶(使用细胞渗入性底物或非细胞渗入性底物)和另一种分子(例如DNA或ATP)或第二种酶(例如胞内酶(使用细胞渗入性底物或非细胞渗入性底物))。在一个实施方案中，使用荧光、发光或分光光度法检测分泌性或释放性蛋白。
本发明方法可用于检测任何分子，包括任意酶或任意酶组。可由任意酶组合(包括重组酶和内源(天然)酶)中选择用于该方法的酶，该酶是待检测的酶或者是用于检测底物或辅因子的酶。在一个实施方案中，所有待检测的酶都是内源酶。在另一个实施方案中，两种待检测的酶是内源酶，另一种酶是重组酶。在另一个实施方案中，一种酶是内源酶，另一种酶是重组酶。其它组合对本领域技术人员是显而易见的，可用于本文教导的本发明检测和方法。所述酶包括但不限于蛋白酶、磷酸酶、过氧化物酶、磷酸酯酶、肽酶和糖苷酶。所述酶可基于催化反应性质来自不同组别，这些组别包括但不限于水解酶、氧化还原酶、裂解酶、转移酶、异构酶、连接酶或合成酶，或者它们可来自相同组别，只要至少一种酶相对与至少一种其它酶具有部分重叠或优选基本不同的底物特异性。特别令人感兴趣的是具有生理意义的酶类别。这些酶包括蛋白激酶、肽酶、酯酶、蛋白磷酸酶、异构酶、糖基化酶、合成酶、蛋白酶、脱氢酶、氧化酶、还原酶、甲基化酶等。目的酶包括参与形成或水解酯(有机酯和无机酯)、糖基化和水解酰胺的酶。在任一种类型中都可进行进一步细分，如对于激酶，激酶可特异性磷酸化肽或蛋白中的丝氨酸、苏氨酸和/或酪氨酸残基。因此，所述酶可为例如不同激酶功能组别的激酶，包括受环状核苷酸调节的蛋白激酶、蛋白激酶C、受Ca2+/CaM调节的激酶、细胞周期蛋白依赖性激酶、ERK/MAP激酶和蛋白-酪氨酸激酶。激酶可为在信号转导通路中有效磷酸化寡肽底物的激酶，例如ERK激酶、S6激酶、IR激酶、P38激酶和AbI激酶。对于这些激酶，底物可包括寡肽底物。其它目的激酶可包括例如Src激酶、JNK、MAP激酶、细胞周期蛋白依赖性激酶、P53激酶、血小板衍生的生长因子受体、表皮生长因子受体和MEK。
具体地说，用于本发明的酶包括任何具有酶活性的蛋白，例如脂酶、磷脂酶、硫酸酯酶、脲酶、肽酶、蛋白酶和酯酶，包括酸性磷酸酶、葡糖苷酶、葡糖醛酸酶、半乳糖苷酶、羧酸酯酶和荧光素酶。在一个实施方案中，一种酶是水解酶。在另一个实施方案中，至少两种酶是水解酶。水解酶的实例包括碱性和酸性磷酸酶、酯酶、脱羧酶、磷脂酶D、P-木糖苷酶、β-D-岩藻糖苷酶、硫葡糖苷酶、β-D-半乳糖苷酶、α-D-半乳糖苷酶、α-D-葡糖苷酶、β-D-葡糖苷酶、β-D-葡糖苷酸酶、α-D-甘露糖苷酶、β-D-甘露糖苷酶、β-D-呋喃果糖苷酶和β-D-葡糖苷酸酶。
任何特定酶介导反应的底物或辅因子都是本领域技术人员所已知的。表1列出了某些蛋白酶的代表性切割位点。
表1
蛋白酶 切割位点
氨肽酶M 由游离N端水解
羧肽酶Y 由C端水解
胱天蛋白酶-1、4、5 W/LEHD-X
胱天蛋白酶-2、3、7 DEHD-X
胱天蛋白酶-6、8、9 L/VEXD-X
胰凝乳蛋白酶 Y-X、F-X、T-X、(L-X、M-X、A-X、E-X)
Xa因子 IEGR-X
胃蛋白酶 除切割其它残基以外还切割F-Z、M-Z、L-Z、W-Z(其中Z是疏水残基)
TEV E(N)XYXQ-S/G
凝血酶 R-X
胰蛋白酶 R-X、K-X
类胰蛋白酶 PRNK-X
β-分泌酶 EISEVK/NM/L-DAEFRHD，例如SEVNL-DAEFR
X是一个或多个氨基酸。
对于碱性磷酸酶，优选底物包括含磷酸的二氧杂环丁烷，例如3-(2′-螺金刚烷)-4-甲氧基-4-(3″-磷酰氧基)苯基-1，2-二氧杂环丁烷二钠盐，或3-(4-甲氧基螺[1，2-二氧杂环丁烷-3，2′(5′-氯)-三环-[3.3.1.13，7]癸]-4-基]苯基磷酸二钠，或2-氯-5-(4-甲氧基螺{1，2-二氧杂环丁烷-3，2′-(5′-氯)-三环{3.3.13，7]癸}-4-基)-1-苯基磷酸二钠或2-氯-5-(4-甲氧基螺{1，2-二氧杂环丁烷-3，2′-三环[3.3.1.13，7]癸}-4-基)-1-苯基磷酸二钠(分别为AMPPD、CSPD、CDP-Star和ADP-StarTM)。
对于半乳糖苷酶，底物优选包括含半乳糖苷酶可切割基团或吡喃半乳糖苷基团的二氧杂环丁烷。检测中的发光由酶切割二氧杂环丁烷底物的糖部分产生。这种底物的实例包括3-(2′-螺金刚烷)-4-甲氧基-4-(3″-β-D-吡喃半乳糖)苯基-1，2-二氧杂环丁烷(AMPGD)、3-(4-甲氧基螺[1，2-二氧杂环丁烷-3，2′-(5′-氯)三环[3.3.1.1 3，7]-癸]-4-基-苯基-β-D-吡喃半乳糖(Galacton)、5-氯-3-(甲氧基螺[1，2-二氧杂环丁烷-3，2′-(5′-氯)三环[3.3.13，7]癸-4-基-苯基-β-D-吡喃半乳糖(Galacton-Plus)和2-氯-5-(4-甲氧基螺[1，2-二氧杂环丁烷-3，2′(5′-氯)-三环-[3.3.1.13，7]癸]-4-基)-苯基-β-D-吡喃半乳糖(Galacton-Star)。
在β-葡糖醛酸酶和β-葡糖苷酶检测中，底物包括含β-葡糖醛酸酶可切割基团(例如葡糖苷酸)的二氧杂环丁烷，例如3-(4-甲氧基螺{1，2-二氧杂环丁烷-3，2′-(5′-氯)-三环[3.3.1.13，7]癸}-4-基)苯基-β-D-葡糖醛酸钠(GlucuronTM)。在羧酸酯酶检测中，底物包含结合至二氧杂环丁烷的合适酯基。在蛋白酶和磷脂酶检测中，底物包含结合至二氧杂环丁烷的合适酶可切割基团。
优选检测中每种酶的底物都不同。对于包括一种含二氧杂环丁烷底物的检测，底物任选包含取代或未取代的金刚烷基、可取代或未取代的Y基团和酶可切割基团。二氧杂环丁烷的优选实例包括上文提及的二氧杂环丁烷，例如称为Galacton、Galacton-Plus、CDP-Star、GlucuronTM、AMPPD、Galacton-Star和ADP-StarTM的二氧杂环丁烷，以及3-(4-甲氧基螺{1，2-二氧杂环丁烷-3，2′-(5′-氯)-三环[3.3.1.13，7]癸-4-基)苯基-β-D-吡喃葡糖苷(GluconTM)、CSPD、3-氯-5-(4-甲氧基螺{1，2-二氧杂环丁烷-3，2′-(5′-氯)-三环[3.3.1.13，7]癸-4-基)-1-苯基磷酸二钠(CDP)。
优选将至少一种待检测酶的底物修饰以含报告分子。报告分子是任何这样的分子：其允许连接至该分子的底物、酶和该底物之间反应产生的产物或该产物和另一种酶之间的反应产物差异化检测，优选定量检测。报告分子包括但不限于光学分子(例如荧光团)、吸收性有色颗粒或染料、放射性标记、酶(例如在合适反应组分存在下有效催化可检测反应的催化部分)、当与其它亚单位或片段结合时有功能的酶的亚单位或片段，或后续反应的底物，例如其中该反应产物可检测的底物。本文使用的“荧光团”包括能在某个波长范围吸收能量并能在该吸收范围以外的波长范围释放能量的分子。术语“激发波长”指荧光团吸收能量的波长范围。术语“发射波长”指荧光团释放能量或荧光的波长范围。
在一个实施方案中，报告分子发荧光。荧光剂的一个基团是呫吨染料，其包含荧光素、Rosamine和罗丹明。可市售获得在苯基上具有取代基的这些化合物，其可用作键合位点或键合官能团。例如，可获得氨基和异硫氰酸酯取代的荧光素化合物。
另一组荧光化合物是在α或β位(通常在α位)具有氨基的萘胺。在萘胺化合物中包括1-二甲基氨基萘基-5-磺酸盐、1-苯胺基-8-萘磺酸盐和2-对-甲苯胺基-6-萘磺酸盐。某些萘化合物被发现具有一些非特异性蛋白结合，致使其应用需要使用其中蛋白量最小化的检测介质。其它荧光剂是多齿配位体，包括含氮大环，其具有带π电子的共轭环系统。这些大环任选被取代，包括桥碳或氮上的取代。合适的大环包括卟啉、氮杂卟啉、咕啉、Sapphyrin和叶琳烯(porphycene)以及其它类似大环的衍生物，其包含广泛离域的电子。氮杂卟啉衍生物包括酞菁、苯并三氮杂卟啉和萘菁及其衍生物。
在某些情况下，可使用荧光融合蛋白，例如融合至多肽底物的绿色、红色或蓝色荧光蛋白或其它荧光蛋白。在其它实施方案中，荧光蛋白自身可为水解酶的底物。“荧光蛋白”是全长荧光蛋白或其荧光片段。
表2显示了用于本发明的化学荧光团的非限制性清单以及其激发和发射波长。激发和发射值可根据反应条件(例如pH、缓冲体系或溶剂)改变。
表2
    荧光团   激发(nm)   发射(nm)
 荧光素(FITC)     495     525
 Hoechst 33258     360     470
 R-藻红蛋白(PE)     488     578
 罗丹明(TRITC)     552     570
 Quantum RedTM     488     670
 Texas Red     596     620
 Cy3     552     570
 罗丹明-110     499     521
 AFC     380     500
 AMC     342     441
 试卤灵     571     585
 BODIPY FL     504     512
 BODIPY TR     591     620
在一个实施方案中，使用含氨基修饰荧光素或其羧基受保护衍生物的底物检测其中一种酶，该修饰包括酶底物。在一个实施方案中，修饰是含蛋白酶识别位点的一个或多个氨基酸残基。在一个实施方案中，底物通过肽键共价连接至氨基荧光素或其羧基修饰衍生物的氨基。在一个实施方案中，例如使用氨基末端保护基修饰肽或蛋白底物的N-端，以防止被氨肽酶降解。在没有合适酶或辅因子时，由于存在极少量氨基荧光素，含此底物和荧光素酶的混合物产生极少量光。在存在合适酶时，该酶可切割连接底物和氨基荧光素的键，产生荧光素酶底物氨基荧光素。因此，在存在荧光素酶(例如天然、重组或突变荧光素酶)和任何辅因子和合适反应条件时，产生光，其与酶的存在或活性成比例。
在一个实施方案中，使用含荧光团的底物检测其中一种酶。在一个实施方案中，底物包括一个或多个含蛋白酶识别位点的氨基酸残基。在一个实施方案中，底物共价连接至一个或多个荧光团。在没有合适酶或辅因子时，由于例如通过邻近的猝灭基团猝灭荧光团的荧光特性，使得底物-荧光团缀合物的特性被改变，导致缀合物的荧光特性相对于单独的荧光团被改变(例如降低)，含此底物的混合物于发射波长产生极少量光。在存在合适酶时，缀合物的切割产生荧光团。在另一个实施方案中，在切割前，缀合物发荧光，但在酶切割后，产物具有改变的光谱。
在一个实施方案中，至少两个反应的条件相容。例如，至少2种酶的条件，优选3种酶或更多种酶(例如4种酶或更多种酶)的条件相容。一组相似酶一般具有相容的反应条件，例如pH和离子强度，但是，涉及具有相对低质量浓度的检测组分(例如辅因子)的辅因子要求、金属离子要求等，不需要相同。相同条件包括在反应过程中使每种酶提供可检测速率的条件，一般是每种酶具有其特定底物最大转换率的至少约10％，通常至少约20％，优选至少约50％，不受加入的用于其它酶的组分的明显干扰。
或者，一个反应的条件可与另一个反应不相容，尽管两个反应的底物都存在。在这样的实施方案中，一种酶有活性，但不能与其底物反应。例如，在一个实施方案中，当两个反应的条件不相容时，依次和/或在单独的反应混合物中进行各个酶检测反应。在酶检测后，反应混合物(或其部分)可与另一个反应组合。各单独的反应混合物可包含一种或多种酶和一种或多种底物。就其最简单形式而言，各反应混合物中有一种待检测的酶和该酶的一种底物。反应中使用的底物组具有和在单反应多重检测中所要求特性相同的一般特性。即，每种底物和/或对应产物具有独特特性，使其彼此之间可被区分。
反应中分子的检测顺序可以改变。在一个实施方案中，不论反应是否同时开始，都检测通过发光实验检测的分子，然后检测通过不发光实验检测的分子。或者，不论反应是否同时开始，都检测通过不发光实验检测的分子，然后检测通过发光实验检测的分子。在其它实施方案中，基本上同时检测两种或更多种分子的存在或量。在一个实施方案中，显著降低待检测的一种分子的存在或活性，然后检测第二种分子的存在或量，例如通过等待直至第一种信号消失，例如消失至少50％，或通过加入第一种反应的猝灭剂。因此，在某些实施方案中，例如通过在检测前抑制反应中的酶，终止一个或多个反应。优选一个检测产生的信号基本上不干扰至少一个其它检测产生的信号的量。
本发明还提供检测样品(例如含完整细胞、细胞裂解物如至少部分纯化的裂解物或细胞上清液的样品)中一种或多种肽或蛋白、肽或蛋白结合和/或改变的分子或辅因子的存在或活性的试剂盒。这样的试剂盒包括至少一种试剂，用于定量至少一种肽和/或蛋白、肽和/或蛋白结合和/或改变的分子或辅因子，例如至少一种酶的底物。
本发明将通过以下的非限制性实施例进一步描述。对于所有实施例，本领域技术人员都容易设计合适的对照反应。
实施例I
荧光/发光多重检测
A. 在单孔多重实验中检测胱天蛋白酶-3和胱天蛋白酶-8
评价胱天蛋白酶-GloTM 8试剂(胱天蛋白酶-GloTM 8检测系统，Promega，Corp.)允许多重化均相发光胱天蛋白酶-8酶检测和不发光胱天蛋白酶-3酶检测的能力。胱天蛋白酶-GloTM 8试剂由胱天蛋白酶-GloTM 8缓冲液和发光底物Z-LETD-氨基荧光素组成。对于图1A中的发光检测，使用胱天蛋白酶-GloTM 8试剂(菱形)或还含有50-胱天蛋白酶-3荧光底物(Z-DEVD)2-罗丹明-110的胱天蛋白酶-GloTM 8试剂(方形)，表明多重发光和不发光检测的灵活性。对于图1B中的荧光检测，使用含50μM(Z-DEVD)2-罗丹明-110和10mM DTT(菱形)或50μM(Z-DEVD)2-罗丹明-110和Z-LETD-氨基荧光素(方形)的胱天蛋白酶-GloTM 8缓冲液。
在RPMI 1640(Sigma Corporation)中制备终浓度为100单位/ml的胱天蛋白酶-8酶、胱天蛋白酶-3酶和组合的胱天蛋白酶-8和胱天蛋白酶-3酶(Biomol Research Laboratories)的稀释液。将100μl胱天蛋白酶-8稀释液、胱天蛋白酶-8和胱天蛋白酶-3稀释液的混合物或胱天蛋白酶-3稀释液加入到96孔板的各个孔中。加入100μl有或没有50μM(Z-DEVD)2-罗丹明-110的胱天蛋白酶-GloTM 8试剂(图1A)或100μl有或没有Z-LETD-氨基荧光素、补加(Z-DEVD)2-罗丹明110和DTT的胱天蛋白酶-GloTM 8缓冲液(图1B)，至终体积为200μl/孔。反应板在板振荡器上于室温温育至少10分钟。
在温育后，使用DYNEX Laboratories MLXTM板发光计测定相对发光，使用配备485EX/530EM滤光片组的CytoFluor II荧光板读数器检测相对荧光。
结果
图1A显示了单个孔中两种蛋白酶荧光和发光的同时检测。由图1A可见，在胱天蛋白酶-8发光检测(方形)中存在胱天蛋白酶-3及其荧光底物(Z-DEVD)2-罗丹明-110没有很大地改变发光反应。同样，由图1B可见，在胱天蛋白酶-3荧光检测(方形)中存在胱天蛋白酶-8及其发光底物Z-LETD-氨基荧光素未影响胱天蛋白酶-3荧光检测。
B. 胱天蛋白酶-3和胱天蛋白酶-8多重检测的背景测定
混合各种浓度的发光和不发光试剂(包括胱天蛋白酶酶及其底物)和缓冲组分，以确定各种成分对荧光和/或发光的影响。荧光底物(Z-DEVD)2-罗丹明-110在罗丹明通道(485EX/520EM)报告胱天蛋白酶-3活性，荧光底物Ac-DEVD-AMC在AMC通道(360EX/460EM)报告胱天蛋白酶-3活性，而底物Z-LETD-氨基荧光素在发光检测中报告胱天蛋白酶-8活性。表III描述了用于12种不同反应条件的各种组分的量(μl)，获得总体积约500μl的总混合物，或每种反应条件100μl的总混合物/反应(n＝4)。对于‘加入的胱天蛋白酶’行，该行中的数字规定了过多加入的胱天蛋白酶的类型，没有描述体积。
表3
    组分   1   2   3     4     5     6   7   8   9   10   11   12
胱天蛋白酶-GloTM 8缓冲液   400   400   400     400     400     400   400   400   400   400   400   495
重构在1ml水中的胱天蛋白酶-GloTM 8冻干底物   100   na   na     100     100     100   100   100   100   100   100   na
5mM(Z-DEVD)2-罗丹明-110   na   5   na     5     5     na   na   na   5   5   na   5
5mM Ac-DEVD-AMC   na   na   5     na     na     5   na   na   na   na   na   na
DMSO   5   na   na     na     na     na   5   5   na   na   5   na
100mM Hepes   na   80   80     na     na     na   na   na   na   na   na   na
1M DTT   na   20   20     na     na     na   na   na   na   na   na   na
胱天蛋白酶-3抑制剂(过量)   na   na   na     na     是     na   na   是   na   na   是   na
加入的胱天蛋白酶   8   3   3     8和3     8和3     8和3   3   3   8   3   8   3
1.胱天蛋白酶-8luc对照
2.胱天蛋白酶-3罗丹明-110对照
3.胱天蛋白酶-3 AMC对照
4.多重对照和罗丹明-110
5.多重对照和罗丹明-110+抑制剂
6.多重对照和AMC
7.胱天蛋白酶-3和氨基荧光素混合物
8.胱天蛋白酶-3和氨基荧光素混合物+抑制剂
9.胱天蛋白酶-8和罗丹明-110
10.胱天蛋白酶-3和氨基荧光素混合物
11.胱天蛋白酶-8和氨基荧光素混合物+抑制剂
12.胱天蛋白酶-3和罗丹明-110，没有氨基荧光素混合物
将表III的组分加入至双份孔中，于室温温育反应物2小时。使用的缓冲液得自胱天蛋白酶-GloTM 8检测系统。DMSO得自Sigma-Aldrich，DTT得自Amersco。底物和抑制剂得自Promega Corp。
使用DYNEX Laboratories MLXTM板发光计测定相对发光。使用CytoFluor II荧光板读数器，配备485EX/530EM滤光片组用于罗丹明-110，接着配备360EX/460EM滤光片组用于AMC通道，检测相对荧光。
结果
对于图2A、B和C，所有的carat都代表在该情况下预期荧光或发光指示酶活性。图2A显示了每个反应的AMC荧光信号。仅在存在Ac-DEVD-AMC和胱天蛋白酶-3的合适底物/酶组合(反应条件3和6)时，才出现背景之上的荧光。图2B显示了每个反应的罗丹明-110荧光信号。除了存在胱天蛋白酶-3抑制剂(反应条件5)以外，当存在(Z-DEVD)2-罗丹明-110/胱天蛋白酶-3的底物/酶组合(反应条件2、4、10和12)时，出现背景之上的荧光。对于背景以上的发光信号(图2C)，具有Z-LETD-氨基荧光素/胱天蛋白酶-8的合适底物/酶组合的反应表现出背景以上的信号(反应条件1、4、6、7、9和10)，例外是存在胱天蛋白酶抑制剂的反应条件(反应条件5、8和11)。因此，数据表明，在这些条件下，反应组分对背景荧光和发光检测的影响可忽略不计。
C. 在单孔三重实验中检测胱天蛋白酶-3、胱天蛋白酶-8和胰蛋白酶
在Dulbecco磷酸缓冲盐水(Sigma Corp.)中制备可检测水平的胱天蛋白酶-8(150单位/ml，Biomol Research Laboratories)、胱天蛋白酶-3(Pharmingen Corp.)、胰蛋白酶(Sigma Corp.)以及全部三种酶组合的稀释液。将100μl各种酶稀释液加入到96孔板的孔中，适当时将100μl各种底物单独或组合加入到对应孔中：胱天蛋白酶-3底物(Z-DEVD)2-罗丹明-110、胰蛋白酶底物Z-PRNK-AMC(如美国专利申请序号09/955,639所述为β-类胰蛋白酶底物，但具有公认较小的胰蛋白酶效用，其通过引用整体结合到本文中)、胱天蛋白酶-8底物Z-LETD-氨基荧光素。当胱天蛋白酶-GloTM 8缓冲液和底物一起用于荧光检测时，包含10mM DTT。板在板振荡器上于室温温育至少10分钟。
在温育后，使用BMG Fluorostar(BMG Labtechnologies Ltd.)检测胱天蛋白酶-8活性的相对发光。使用Labsystems Fluoroskan Ascen板读数器测定相对荧光。对于胱天蛋白酶-3活性，使用485EX/527EM滤光片组。对于胰蛋白酶活性，使用360EX/460EM滤光片组。
结果
如图3A所示，在采用混合的三种不同底物和对应酶的反应(三重检测)中，用于检测胱天蛋白酶-3的条件产生相对比对照条件高的荧光。当对比三重检测(所有底物和所有酶)中的胱天蛋白酶-3活性和单独的胱天蛋白酶-3活性时，胱天蛋白酶-3活性高于胱天蛋白酶-3处于和其它三重酶反应相同反应中时的背景。对胰蛋白酶(图3B)和胱天蛋白酶-8(图3C)观察到相似的结果，虽然与胱天蛋白酶-3的程度不同。
D. 以单孔多重形式检测胱天蛋白酶-3和β-半乳糖苷酶
通过用Beta-Glo缓冲液(Beta-Glo检测系统，Promega Corp.)重构Beta-Glo冻干底物，或向Beta-Glo缓冲液中加入(Z-DEVD)2-罗丹明-110(50μM)，或用Beta-Glo缓冲液重构Beta-Glo冻干底物并加入(Z-DEVD)2-罗丹明-110(50μM，制备试剂。用RPMI 1640稀释胱天蛋白酶-3(2μl/ml，Pharmingen Corp)或β-半乳糖苷酶(0.1μl/ml)或胱天蛋白酶-3和β-半乳糖苷酶，并向96孔白板孔中加入100μl。向96孔板孔中加入100μl合适试剂，将板于室温温育。在30分钟时使用DYNEX Laboratories MLXTM板发光计检测发光。在温育后2小时，用具有485EX/530EM滤光片组的CytoFluor II荧光板读数器测定荧光。所有的测定都在18小时时在CytoFluor II荧光计上以不同的增益调整重复1次，以补偿增加的荧光。
结果
图4A和C表明，在存在检测胱天蛋白酶-3的荧光试剂时，β-半乳糖苷酶发光检测是可用的。图4B和D表明，在检测β-半乳糖苷酶的发光试剂存在时，检测胱天蛋白酶-3的的荧光检测是可用的。由图4B和4D可见，发光试剂组分对背景荧光具有较小的影响。但是，荧光试剂组分对发光的影响几乎没有(图4A和4C)。
E. 发光检测底物的光谱扫描
用含0.1M Tris pH7.3、2mM EDTA和10mM MgSO4的缓冲液，将荧光素、氨基荧光素和Z-LETD-氨基荧光素稀释至约2μM。在配备1.25mm激发和发射狭缝滤光片的情况下，用SPEX Fluorolog-2分光发光计以1mm波长间隔和0.2秒积分时间扫描样品。所有的扫描都使用石英比色皿进行。
结果
对于荧光素和氨基荧光素，于325mn激发，并捕获375-750nm的发射，捕获280-550nm的激发，于600nm检测发射(图5A和5B)。对于Z-LETD-氨基荧光素，于325mn激发，并捕获375-750nm的发射，捕获280-550nm的激发，于525nm检测发射(图5C)。令人感兴趣的是，当肽缀合至氨基荧光素时(图5C)，缀合物的发射峰蓝移至较短的波长。这令人意外，因此可进行双重发光/荧光检测，具体地说是使用的荧光团以与氨基荧光素发射相同的波长范围发射时。
实施例II
检测假结果的方法
方法
在胱天蛋白酶-3和胱天蛋白酶-3抑制剂(Ac-DEVD-CHO，10μM)或荧光素酶抑制剂(白藜芦醇(Resveratol)，5μM)存在下，将含Z-DEVD-氨基荧光素的胱天蛋白酶-GloTM 3/7试剂(胱天蛋白酶-GloTM3/7检测，Promega，Corp.)与(Z-DEVD)2-罗丹明-110或Ac-DEVD-AMC组合。在30分钟时对胱天蛋白酶-3切割Z-DEVD-氨基荧光素的发光信号读数，而在2小时时使用合适的AMC或罗丹明110滤光片组对胱天蛋白酶-3切割活性的荧光信号读数。
结果
发光获得最大的信号对背景比率，接着是罗丹明-110，然后是AMC(图6)。加入已知的胱天蛋白酶-3抑制剂一致且负面地影响用于检测胱天蛋白酶-3的全部三种底物。这提示可组合发光和荧光试剂，例如用于控制进行任一种检测时潜在的假结果干扰。因此，如果一种物质是特定酶的真正抑制剂，则多重信号可用于测定。
实施例III
另外的代表性多重检测
A. 单孔形式的乳酸脱氢酶(LDH)和腺苷三磷酸(ATP)多重检测
制备以下检测试剂：1)使用LDH试剂(30mM HEPES，pH7.4、10mM NaCl、20mM MgSO4、250μM刃天青(Aldrich))重构CytoTox-ONETM均相膜完整性检测(Promega Corp，技术公告306)的冻干底物组分；2)使用ATP试剂(30mM HEPES，pH7.4、10mM NaCl、20mMMgSO4)重构CellTiter-GloTM发光细胞存活力检测(Promega Corp，技术公报288)的冻干底物；3)使用LDH/ATP组合试剂(30mM HEPES，pH7.4、10mM NaCl、20mM MgSO4、250μM刃天青(Aldrich))重构CytoTox-ONETM的冻干底物组分，其再用于重构CellTiter-GloTM的冻干底物。
用10mM HEPES，pH7.5、0.1％Prionex(PentaPharma Corp)溶液制备LDH(0、1∶8000、1∶4000、1∶2000，菱形)、ATP(0、1.25、2.5和5μM，方形)和LDH/ATP组合(分别为0/0μM、1∶8000/1.25μM、1∶4000/2.5μM和1∶2000/5μM，三角形)的样品稀释液，向96孔白板孔中加入100μl稀释液(n＝4)。向样品中加入合适的检测试剂(100μl)，保护板避光，混合30秒，于室温温育。在8分钟温育后，用具有560EX/590Em滤光片组的Labsystems Fluoroskan Ascent板读数器检测荧光。在温育后30分钟，使用Dynex MLX板发光计记录发光。
结果
和对照反应(图7C)相比，LDH及其荧光检测试剂对ATP发光检测(图7A)具有较小影响；但是，ATP检测仍是有可能的。向LDH荧光检测中加入发光检测试剂不影响背景荧光(图7B)，尽管和对照反应(图7D)相比总荧光下降，但LDH活性仍可检测。
B. 单孔形式的LDH和胱天蛋白酶-3多重检测
制备以下试剂：1)LDH试剂-使用补加238-刃天青的胱天蛋白酶-GloTM 3/7缓冲液重构CytoTox-ONETM冻干底物；2)胱天蛋白酶-3试剂-按照Promega技术公告323使用胱天蛋白酶-GloTM 3/7缓冲液重构胱天蛋白酶-GloTM 3/7冻干底物；3)LDH/胱天蛋白酶-3组合试剂-使用LDH试剂(如上制备)重构冻干胱天蛋白酶-GloTM 3/7底物。LDH/胱天蛋白酶-3组合试剂的LDH检测试剂化合物不稳定，原因是在胱天蛋白酶-GloTM 3/7冻干底物中存在DTT，所以该试剂在加入样品前立即制备。
用10mM HEPES pH7.5、0.1％Prionex(PentaPharma Corp)溶液制备样品稀释液：LDH的0、1∶8000、1∶4000、1∶2000稀释液(菱形)；0、5、10和20U/ml胱天蛋白酶-3(BIOMOL Laboratories，方形)和LDH/胱天蛋白酶-3组合(分别为0/0U/ml、1∶8000/5U/ml、1∶4000/10U/ml和1∶2000/20U/ml，三角形)。向96孔白板中加入100μl稀释液(n＝4)。向样品中加入合适的检测试剂(100μl)，保护板避光，混合30秒，于室温温育。在于室温温育6分钟后，用具有560EX/590Em滤光片组的Labsystems Fluoroskan Ascent板读数器检测荧光。在温育后45分钟，使用Dynex MLX板发光计记录发光。
结果
和对照反应相比，向多重反应中加入荧光LDH检测试剂降低了发光(分别为图8A和8C)。尽管在图8A中总发光信号下降，但存在荧光LDH检测试剂时发光胱天蛋白酶-3检测是可用的。图8B表明，和对照相比，当将发光胱天蛋白酶-3检测试剂加入到多重反应中时，荧光背景增加(图8D)；但是，图8A表明，在存在胱天蛋白酶-3发光检测试剂时，LDH荧光检测是可用的。LDH对背景发光没有影响(图8C)，胱天蛋白酶-3对背景荧光没有影响(图8D)。
C. 单孔形式的胱天蛋白酶-3和蛋白激酶A(PKA)多重检测
制备以下的检测试剂：1)PKA试剂-制备含100mM Tris pH7.3、100mM MgCl2、1∶1000稀释度的PKA罗丹明-110底物(ProFluorTMPKA检测，Promega Corporation，技术公告315)和400μMATP的1X反应缓冲液；2)胱天蛋白酶-3试剂-制备含100mM Tris pH7.3、100mM MgCl2、150μg/ml重组热稳定荧光素酶、80-Z-DEVD-氨基荧光素(Promega Corp)、400μM ATP、100μM DTT(Promega Corp)、2.5mM CaCl2(Fisher)、40mM MgS04(Fisher)和0.2％Tergitol NP-9(Sigma)的1X反应缓冲液；3)激酶/胱天蛋白酶-3组合试剂-制备含100mM Tris(pH7.3)、100mM MgCl2、1∶1000稀释度的PKA罗丹明-110底物、150μg/ml重组热稳定荧光素酶、80μMZ-DEVD-氨基荧光素、400μM ATP、100μM DTT、2.5mM CaCl2、40mM MgSO4和0.2％Tergitol NP-9的1X反应缓冲液；4)蛋白激酶终止试剂-制备含100mM Tris pH7.3、100mM MgCl2、1∶50稀释度的蛋白酶试剂(ProFluorTMPKA实验)、30μM星形孢菌素(BIOMOL Laboratories)的1X终止试剂。
制备样品在10mM HEPES pH7.5、0.1％Prionex(PentaPharmaCorp)溶液中的稀释液：0、1、2和4U/ml PKA(菱形)；0、5、10和20U/ml胱天蛋白酶-3(方形)和PKA与胱天蛋白酶-3组合(分别为0/0U/ml、1/5U/ml、2/10U/ml和4/20U/ml，三角形)，将40μl稀释液(n＝4)加入到96孔白板中。向样品中加入合适的检测试剂(40μl)，保护板避光，混合30秒，于室温温育20分钟。在温育后，将40μl蛋白激酶终止试剂加入到含单独的激酶试剂或组合激酶/胱天蛋白酶-3试剂的孔中。再将板混合30秒，保护避光，于室温温育30分钟以上。用具有485EX/527Em滤光片组的Labsystems Fluoroskan Ascent板读数器检测荧光。使用Dynex MLX板发光计记录发光。
结果
和存在PKA但没有全部PKA检测试剂的对照反应(图9C)相比，加入荧光PKA实验检测试剂引起发光背景增加(图9A)。但是，胱天蛋白酶-3活性产生的反应发光成比例增加，条件似乎没有影响发光胱天蛋白酶-3反应自身。和存在胱天蛋白酶-3但没有全部胱天蛋白酶-3检测试剂的荧光对照反应(图9D)相比，向PKA荧光检测中加入胱天蛋白酶-3检测试剂(图9B)降低总荧光超过50％。使用这些多重条件可检测背景以上的胱天蛋白酶-3和PKA活性。
D. 单孔形式的海肾荧光素酶和胱天蛋白酶-3多重检测
制备以下的检测试剂：1)将海肾荧光素酶的细胞渗入性修饰腔肠素底物EnduRenTM(Promega Corp.)在补加10％胎牛血清和500μg/ml G-418硫酸盐的F-12组织培养基中稀释至600μM；2)胱天蛋白酶-3底物：将(Z-DEVD)2-罗丹明-110(Promega Corp.)在补加10％胎牛血清和500μg/ml G-418硫酸盐的F-12组织培养基中稀释至250μM；3)荧光素酶/胱天蛋白酶-3组合底物：用补加10％胎牛血清和500μg/ml G-418硫酸盐的F-12组织培养基稀释EnduRenTM(600μM)和(Z-DEVD)2-罗丹明-110(250μM)。
将稳定表达海肾荧光素酶的CHO-K1细胞(ATCC)(CHO-K1hRL25)保持在10％胎牛血清和500μg/ml G-418硫酸盐中，用于基于细胞的实验。利用这些细胞的实验条件包括：1)归因于星形孢菌素加入的荧光素酶活性水平变化，2)归因于星形孢菌素和胱天蛋白酶-3酶加入的荧光素酶活性水平变化，和3)未加星形孢菌素但加入胱天蛋白酶-3酶的荧光素酶活性。
收获CHO-K1 hRL25细胞，并以20,000细胞/孔的密度平板接种入96孔透明底、白壁组织培养板中，于37℃在5％CO2中温育过夜。将星形孢菌素以终浓度0、0.5、1、2μM(10μl/孔)加入到合适的孔中，以启动细胞死亡，由此改变荧光素酶活性。再于37℃在5％CO2中温育细胞3.5小时。在组织培养基(10μl/孔)中以0、5、10和20U/ml将各种浓度的胱天蛋白酶-3(BIOMOL Laboratories)加入到合适的孔中。因此，数据点的组合星形孢菌素/胱天蛋白酶-3浓度分别为0μM/0U/ml、0.5μM/5U/ml、1μM/10U/ml和2μM/20U/ml。在加入胱天蛋白酶-3酶后立即将10μl/孔的荧光素酶底物、胱天蛋白酶-3底物或荧光素酶/胱天蛋白酶-3底物加入到合适孔中。在加入检测试剂后，简短地混合平板，于37℃在5％CO2中温育2小时。用具有485EX/527Em滤光片组的Labsystems Fluoroskan Ascent板读数器检测荧光。使用Dynex MLX板发光计记录发光。
结果
海肾荧光素酶活性在这些检测中用作细胞死亡的内控。因此，随着星形孢菌素浓度增加，荧光素酶活性应下降。图10A表明，和对照反应(图10C)相比，加入胱天蛋白酶-3底物没有负面影响荧光素酶反应。图10B表明，加入荧光素酶底物对背景荧光没有作用，尽管和图10D相比总荧光稍微增加。在存在胱天蛋白酶-3或胱天蛋白酶-3底物时海肾荧光素酶的发光检测是完全可用的，在存在海肾荧光素酶或海肾荧光素酶底物时，胱天蛋白酶-3的荧光检测仅稍微受影响，但完全可用。
实施例IV
蛋白酶保留和释放细胞存活力多重检测
活细胞和死细胞检测广泛用于监测响应特定化学、生物或物理处理的细胞存活力改变。存活力和细胞毒性检测一般是相反的，检测不同的生物标记。从历史上讲，通过细胞毒性评价细胞存活力一般变化的方法与外膜渗透性变化相关。检测受损膜结构的经典方法包括锥虫蓝排除、核酸染色和乳酸脱氢酶释放(Riss等，2004；Myers等，1998)。评价细胞功能或增殖的检测包括氚化胸苷掺入、ATP含量、四唑染料转变或二乙酸荧光素(Cook等，1989)。假定完整细胞膜不允许大的带电分子或肽由胞外空间进入胞质。相反，受损的膜允许染料或化合物自由渗透入细胞内或细胞内容物渗出细胞外。这种渗透性现象是染料标记(“生命”染料、DNA嵌入剂或酯酶修饰的荧光素)和LDH释放检测二者的基础。然而，虽然测定细胞存活力的现有技术仍然是有用和成本有效的应用，它们具有许多技术或实操缺陷，这限制了其在高含量、多重化或高通量形式中的应用。例如，目前通过LDH释放(CytoTox-ONETM)或染料还原能力(CellTiter-BlueTM)检测细胞膜完整性不能被配对(标准化数据的一种方法)，原因是共用刃天青底物和Ex/Em光谱重叠。而且，用于两种检测的有色刃天青底物限制了采用其它终点实验检测(颜色猝灭)的第二检测信号窗强度(和敏感性)，浓度和形式对第二检测试剂对不是最佳的(例如限制体积)。
现有的活细胞/死细胞形式使用羧基荧光素和溴化乙锭同二聚体，后者是已知的有效诱变剂。该形式需要清洗和置换细胞培养基。而且，羧基荧光素在水溶液中表现出自发水解，而染色DNA的溴化乙锭同二聚体插入可干扰下游数据标准化。
培养的哺乳动物细胞包含富蛋白酶、酯酶、脂酶和核酸酶的环境。例如，以4种一般类型的蛋白酶(天冬氨酸、半胱氨酸、丝氨酸和金属依赖性)为代表，其与内稳态保持的特殊功能相关。这些胞质、溶酶体和跨膜结合蛋白酶参与胞内蛋白降解、产生免疫原性肽、翻译后修饰和细胞分裂(Tran等，2002，Constam等，1995，Vinitsky等，1997)。这些酶的活性受各种机制调节，包括特异性区室化(Bond等，1987)。响应极端压力、环境恶化或凋亡程序的持续进展(committedprogression of the apoptotic program)，观察到区室化和膜完整性同等程度的损失(Syntichaki等，2003，Haunstetter等，1998)。因此，在体外细胞模型中将稳定的蛋白水解介导物释放到细胞培养基中代表了细胞死亡的潜在替代。相反，保留的蛋白水解酶的细胞酶学染色与细胞健康的表型观察结果相对应。总之，这样的蛋白水解活性可能有助于确定细胞培养群中存活或受损细胞的相对数目，例如“活/死”检测。
在一个实施方案中，对基于蛋白酶的活细胞/死细胞检测，一种底物(用于死细胞)是相对大量、有活性和保守蛋白酶的底物，其在胞质pH(例如7.0-7.2)稳定且有活性，并具有不同光谱读数示值(R/O)的标志。优选该底物的切割动力学与LDH释放平行，活性条件不包括毒性或膜改变物质，例如盐或硫醇，获得快速的检测时间。另一种底物(用于活细胞)是相对大量和保守蛋白酶的底物，其对于活细胞是可渗入细胞的，蛋白酶在活细胞胞质环境中有活性，但在胞外环境中不稳定。该底物具有不同光谱R/O的标志，进行切割反应，以获得快速的检测时间。在非破坏性检测中使用两种底物可检测不需要的增殖事件，由于使用了处于不同光谱的互补和独立性替代，所以可减少错误结论和减少由于细胞聚集或移液产生的错误，因为存活力对细胞毒性比率与该孔中的存活细胞数无关。
A.采用AMC或R110荧光报告分子或氨基荧光素发光报告分子的 蛋白酶释放检测形式
2倍连续稀释HL-60细胞，然后通过加入Triton X至最终0.2％裂解或通过加入载体保持。将1/10体积的200μM Ala-Ala-Phe-AMC底物在100mM乙酸钠pH 4.5中的溶液加入到裂解物或细胞中，并于37℃再温育1小时。然后使用CytoFluor II于Ex.360 Em.460检测与裂解或活细胞有关的荧光。
通过锥虫蓝排除计数进行活跃倍增的Jurkat细胞，发现95％以上存活。以RPMI 1640+10％FBS将细胞调节至100,000细胞/ml，并分成两等份。使用装备有微探头的Misonix 3000以30％功率、3×5秒脉冲对1等份超声。另一部分在超声过程(总共约5分钟)中于37℃水浴中温育。然后通过代表0-100％存活度的比率混合将细胞悬浮液和裂解物组分混合成各种存活度。然后将混合的细胞样品以100μl体积加入到白壁、透明底96孔板(Costar)中。用RPMI-1640将(Ala-Ala-Phe)2-R110稀释至1000μM，并以1/10体积加入到板中。将板温育30分钟，然后使用CytoFluor II于Ex 485 Em 530检测荧光。
通过锥虫蓝排除计数进行活跃倍增的Jurkat细胞，发现95％以上存活。用RPMI 1640+10％FBS将细胞调节至100,000细胞/ml，并分成两等份。使用装备有微探头的Misonix 3000以30％功率、3×5秒脉冲对1等份超声。另一部分在超声过程(总共约5分钟)中于37℃水浴中温育。然后通过代表0-100％存活度的比率混合将细胞悬浮液和裂解物组分混合成各种存活度。然后将混合的细胞样品以100μl体积加入到白壁、透明底96孔板(Costar)中。通过用10ml 10mM Hepes(pH7.5)再水合荧光素检测试剂块(Promega V859A)，并补加Ala-Ala-Phe-氨基荧光素至100μM终浓度，制备发光蛋白酶释放检测试剂。将100μl发光蛋白酶释放检测试剂加入到板的孔中，使用BMGFLUOstar Optima以动力学模式检测发光。
计算AMC荧光形式的实际敏感性约为240个细胞(图11)，这是和CytoTox-ONETM相当的敏感性值。R110形式(图12)的检测敏感性相似，提供了再另一个用于多重检测应用的荧光团。值得注意的是，这些检测的敏感性在没有荧光猝灭的情况下获得，荧光猝灭是CytoTox-ONETM或其它基于刃天青的检测用于下游多重应用的主要障碍。发光形式的精确直线性和范围(图13)使得可统计学检测9800个活细胞的群中少至200个细胞。非裂解发光形式提供了对细胞毒性检测的另一种替代。
B.具有不同酶靶的蛋白酶释放检测形式
将活跃倍增的HL-60细胞调节至100,000细胞/ml，并分成两等份。使用微探头Misonix 3000以30％功率、3次5秒脉冲对1等份超声。另一等份保持于37℃。然后用RPMI 1640+10％FBS将细胞悬浮液和裂解物连续2倍稀释至100μl体积。单独的培养基用作无细胞对照。将荧光素检测试剂块(Promega V859A)重悬浮在2.0ml 10mMHepes pH7.5中。然后将荧光素检测试剂分开，与Z-Leu-Leu-Val-Tyr-氨基荧光素或Ala-Ala-Phe-氨基荧光素一起制成1mM。将每种试剂以1/10体积加入板的独立双份孔中，并使其在Me′Cour热夹套水浴储存器中于37℃温育15分钟，然后使用BMG FLUOstar Optima进行发光检测。
尽管进行Z-LLVY-氨基荧光素检测没有AAF-氨基荧光素序列适宜，但其表明，其它蛋白酶可用作受损完整性的替代(图14)。在此情况下，LLVY活性可归因于蛋白酶体的胰凝乳蛋白酶活性。
C.蛋白酶释放时程
在透明底、白壁96孔板(Costar)中，在37℃、5％CO2下，在7小时时程内，用10μM星形孢菌素或匹配的DMSO载体对照处理HL-60细胞(25,000/孔)。制作200μM Ala-Ala-Phe-AMC底物在100mM乙酸钠(pH4.5)中的溶液。将10μl体积的底物(样品的1/10体积)加入到孔中，并再温育1小时。在CytoFluor II上以Ex.360 Em.460检测“蛋白酶释放”活性。在平行组孔中，CytoTox-ONETM试剂起膜完整性检测对照的作用。在于Ex.560 Em.580检测荧光前10分钟加入试剂。
细胞渗透性的动力学，即LDH和蛋白酶释放，彼此映衬，与细胞群中继发性坏死的形态学观察结果一致(图15)。在酸性乙酸钠制备物中提供氨肽酶底物(样品的终pH约为6.5)，以适应潜在的溶酶体蛋白酶活性。
D.蛋白酶释放活性pH要求
使用调节至pH2.5、3.5和4.5的100mM乙酸钠研究蛋白酶释放活性的pH要求，并对比未调节的培养基(水载体)。在这些缓冲液中加入Ala-Ala-Phe-AMC至200μM。将1/10体积的溶液加入到板中，并通过回转振荡简短混合。将板于37℃温育40分钟，然后使用CytoFluor II于Ex.360 Em.460检测荧光。
加入1/10体积的乙酸钠(pH4.5)将培养基最终pH降低至约6.5。没有测试其它降低pH的溶液/培养基组合的最终pH，但先前的实验提示，加入1/10体积的乙酸钠(pH2.5)将细胞培养基pH降低至约5.5。发现未调节pH的载体被证实对蛋白酶释放活性最有利(图16)。该活性与胞质氨肽酶一致，可能不是溶酶体蛋白酶(组织蛋白酶等)。这是有意义的，因为检测蛋白酶释放活性不需要有害或潜在细胞毒性的添加剂。这使温育时限更灵活，更经得起可能的发光型检测的检验。
E.蛋白酶释放酶亚细胞定位
将HL-60细胞调节至100,000细胞/ml，并分成两等份。使用微探头Misonix 3000以30％功率、3次5秒脉冲对1等份超声。将100μl该裂解物(形态学证实)加入到透明底96孔板的多个孔中，以RPMI1640+10％FBS连续2倍稀释。同样，加入100μl未超声的细胞悬浮液，在板的多个孔中连续稀释。分别以0.2％和30μg/ml终浓度向单独的孔中加入NP-9和洋地黄皂甙。未处理的对照由活细胞和匹配体积的水载体组成。用2ml 10mM Hepes(pH7.5)再水合荧光素检测块(Promega V859A)，与Ala-Ala-Phe-氨基荧光素(Promega)一起制成500μM。将20μl此促发光蛋白酶释放溶液加入到所有孔中，在于37℃温育15分钟后使用BMG FLUOstar Optima检测发光。
已知具有以上参数和浓度的超声和NP-9不仅破坏外膜，而且破坏溶酶体内容物(据组织蛋白酶释放检测)(图17)。洋地黄皂甙的选择性破坏使得可进行锥虫蓝染色，没有溶酶体破裂的证据。因此，因为超声或不同变性剂裂解之间的活性是相似的，在和pH优化合在一起考虑时，人们可猜测：在蛋白酶释放检测中检测的蛋白酶可能在胞质中，在完整细胞器外。
F.蛋白酶释放或保留酶底物选择性
由Promega获得Ala-Ala-Phe-AMC。Z-Leu-Leu-Val-Tyr-氨基荧光素、Z-Leu-Arg-氨基荧光素、Z-Phe-Arg-氨基荧光素、Ala-Ala-Phe-氨基荧光素、(Ala-Ala-Phe)2-R110和(Gly-Phe)2-R110由PromegaBiosciences合成。Suc-Ala-Ala-Phe-AMC、H-Phe-AMC、H-Tyr-AMC、Glutyl-Ala-Ala-Phe-AMC、H-Gly-Phe-AMC、Z-Gly-Ala-Met-AMC、Suc-Leu-Leu-Val-Tyr-AMC、D-Ala-Leu-Lys-AMC、H-Gly-Ala-AMC、H-Gly-Gly-AMC、Suc-Ala-Ala-Phe-AMC、Z-Arg-Leu-Arg-Gly-Gly-AMC、Z-Leu-Arg-Gly-Gly-AMC和Ac-Ala-Ala-Tyr-AMC来源于Bachem。Gly-Phe-AFC、Pro-Phe-Arg-AMC、Gly-Gly-Leu-AMC和Ser-Tyr-AFC得自Calbiochem。Z-Phe-Arg-AMC和Suc-Arg-Pro-Phe-His-Leu-Leu-Val-Tyr-AMC购自Sigma。
根据固有溶解性，将所有底物以10-100mM溶解在DMSO中。以10mM Hepes pH7.5或匹配培养基细胞+10％血清将荧光底物稀释至100μM-1mM，并以1/10体积加入至白壁、透明底96孔板中的裂解(冷冻破碎、超声或变性剂)或未处理活细胞中。HL-60或Jurkat由于其易于操作的悬浮表型而在实验中可互换使用。板于37℃温育15-30分钟，然后利用CytoFluor II检测荧光。
将发光底物加入到荧光素检测块(Promega V859A)中，该检测块在2ml 10mM Hepes pH7.5中重悬至500μM。将1/5体积的促发光反应混合物加入到白壁、透明底96孔板中的裂解(冷冻破碎、超声或变性剂)或未处理活细胞中。此外，HL-60或Jurkat在实验中可互换使用。板在由Caron 2050W交换器控制的MeCour循环加热组合单元中于37℃温育。检测15-30分钟之间的发光(信号稳态)。
检验了广泛的蛋白水解底物，以致力于表征潜在底物对在受损或活细胞中的蛋白酶释放或保留的偏好(参见表4)。选择氨基末端封闭的底物(Z、Suc-或Ac-)，以阐述是内切肽酶活性还是外切肽酶活性占优势。检验未封闭的底物(H-等)，以纳入氨肽酶活性的贡献。由此名单可见，至少呈现出3种蛋白水解模式：优选未封闭Ala-Ala-Phe三肽的氨肽酶样活性，依据封闭Leu-Leu-Val-Tyr肽的释放检测的蛋白酶体(胰凝乳蛋白酶样)活性，以及Gly-Phe、Gly-Ala、Phe-、Tyr-或Gly-Gly-Leu底物的非常不稳定活性。后面的活性仅在活的完整细胞中才能检测到。更有意义的是几个荧光团或促发光标记可用于检测这些活性，最终允许增强下游多重检测的灵活性。
表4
底物： 靶蛋白酶   保留   释放
Z-Phe-Arg-AMCZ-Gly-Gly-Leu-AMCZ-Arg-Leu-Arg-Gly-Gly-AMCZ-Leu-Arg-Gly-Gly-AMC 组织蛋白酶B、L20S蛋白酶体同工肽酶T同工肽酶T   无1++*无无   无无无无
  S-R-P-F-H-L-L-V-Y-AMCH-Pro-Phe-Arg-AMCH-Gly-Gly-AMCH-Gly-Ala-AMCH-D-Ala-Leu-Lys-AMCAla-Ala-Phe-AMC(Ala-Ala-Phe)2R110Ala-Ala-Phe-AminolucGluty-Ala-Ala-Phe-AMCGly-Phe-AFCGly-Phe-AMC(Gly-Phe)2R110Suc-Leu-Leu-Val-Tyr-AMCZ-Leu-Leu-Val-Tyr-AlucZ-Gly-Ala-Met-AMCAc-Ala-Ala-Tyr-AMCZ-Leu-Arg-AlucZ-Phe-Arg-AlucSer-Tyr-AFCH-Phe-AMCH-Tyr-AMCSuc-Ala-Ala-Phe-AMC 蛋白酶体，胰凝乳蛋白酶激肽释放酶氨肽酶氨肽酶纤溶酶三肽基肽酶II三肽基肽酶II三肽基肽酶II胰凝乳蛋白酶组织蛋白酶C组织蛋白酶C组织蛋白酶C钙蛋白酶，胰凝乳蛋白酶钙蛋白酶，胰凝乳蛋白酶胰凝乳蛋白酶组织蛋白酶K组织蛋白酶B、L氨肽酶氨肽酶MApM或组织蛋白酶H胰凝乳蛋白酶   无无无++无无无无无++无无无无无无无无+++++无   无无无无无+++++++++++++++无无无无+++无无无无无无无无
无代表没有高于对照群的统计学活性。
(+)至(+++++)代表对照群以上的活性范围，由中到强。
G.蛋白酶保留活性和活细胞要求
将Jurkat细胞以20,000细胞/孔密度、50μl体积接种入白壁、透明底96孔板中。以RPMI 1640+10％FBS制备凋亡诱导剂rTRAIL(BioMol)的连续稀释液，由500ng/ml开始，并以50μl体积双份平行加入到细胞中。加入50μl培养基用作载体对照。将板于37℃在5％CO2中温育4小时。用RPMI 1640将Gly-Phe-AFC稀释至1mM，并以10μl体积加入到所有孔中。接着将板置于MeCour循环加热组合单元上30分钟，然后用CytoFluor II于Ex.405 Em.530检测荧光。接下来，向孔中加入等体积的CellTiter-GloTM试剂，利用FLUOstar Optima通过发光检测检查细胞中剩余的ATP含量。
相对ATP水平和蛋白酶保留活性实际上是可叠加的，提示最佳保留酶活性对细胞存活力或原状细胞膜的要求(图18)。因为破坏膜完整性对保留活性有害，所以该活性可与释放活性偶联，用于检测群存活力的“活/死”形式。
H.使用不同肽序列和报告分子的蛋白酶保留检测形式
在白壁、透明底96孔板中，以100μl体积的RPMI 1640+10％FBS将活跃倍增的Jurkat细胞由37,500细胞/孔开始连续稀释。加入TritonX至0.2％终浓度，裂解一半板中的细胞。另一半板孔接受匹配体积(5μl)的水载体。将Tyr-AMC、Phe-AMC和Gly-Phe-AFC在DMSO中全部再水合至100mM，然后以RPMI 1640稀释至1mM。将1/10体积的稀释底物加入到孔中，通过回转振荡简短混合，然后于37℃在5％CO2中温育达1.5小时。在30和90分钟于Ex.360 Em.460和Ex.405 Em.500检测产生的荧光。
良好区分活细胞和死细胞(活细胞靶向和利用)的肽序列是未封闭的单肽或二肽底物，推测其可自由进入活细胞的胞质(图19)。侯选底物(Gly-Phe)2-R110明显不能有效地穿过细胞膜，或不能被侯选蛋白酶有效切割。
I.蛋白酶释放活性半寿期
将Jurkat细胞以20,000细胞/孔密度、100μl体积接种入白壁、透明底96孔板中。在8小时时程中，每小时向双份平行孔中加入皂苷(Sigma)至0.2％终浓度(加入5μl)，并通过回转振荡简短混合。在此相同时限内，向对照孔中加入等体积的RPMI 1640+10％FBS。用RPMI 1640+10％FBS将Ala-Ala-Phe-AMC稀释至500μM，并以10μl体积加入到孔中，通过回转振荡简短混合，然后于37℃在5％CO2中温育1小时。用CytoFluor II检测产生的荧光。
当外推至活性衰减(图20)时，释放的蛋白酶活性半寿期接近10小时。有利的是，在细胞培养物裂解物中这种延长的活性与估计半寿期约为9小时的乳酸脱氢酶(LDH)不相上下。就此蛋白酶活性作为处理群中细胞死亡的替代而言，此观察结果是有意义的。简单地说，信号半寿期越长，检测在以通常的体外方案报告细胞死亡(而不降低活性，低估反应)方面的应用性就越大。
J.蛋白酶保留和释放活性抑制/强化模式
嘌呤霉素、E-64、苯基甲磺酰氟(PMSF)、腺苷5′-三磷酸(ATP)、N-(α-鼠李吡喃糖基氧羟基膦酰基)-Leu-Trp二钠盐(膦酰二肽(phosphoramidon))、盐酸N-[(2S，3R)-3-氨基-2-羟基-4-苯基丁酰基-L-亮氨酸(倍司他汀)、1，10-菲咯啉、3，4-二异香豆素、4-(2-氨基乙基)苯磺酰氟(AEBSF)、1，4-二硫-DL-苏糖醇(DTT)、乙二胺四乙酸二钠二水合物(EDTA)、异戊酰-L-缬氨酰-L-缬氨酰-[(3S，4S)-4-氨基-3-羟基-6-甲基庚酰基]-L-丙氨酰[93S，4S]-4-氨基-3-羟基-6-甲基庚酸(抑胃肽酶A)、氯化钠、抑肽酶、N-乙酰-L-亮氨酰-L-亮氨酰-L-精氨酸半硫酸盐(亮抑酶肽)均购自Sigma。将抑制剂悬浮在DMSO中，以将母液浓度改变为在有/无Mg++或Ca++的Dulbecco磷酸缓冲盐水(DPBS)中200μM或200μg/ml的高靶浓度，用于加入裂解物或活细胞群中。DTT、NaCl、EDTA和ATP也稀释在DPBS中。全部化合物都与受损细胞或活细胞于37℃温育至少30分钟的一段时间(最多60分钟)，然后评价活性。
如前所述，使用100μM终浓度的Gly-Phe-AFC对超声、皂苷裂解或活HL-60和/或U937进行蛋白酶保留实验抑制剂/添加剂检测。使用Ala-Ala-Phe-AMC或(Ala-Ala-Phe)2-罗丹明110对超声、皂苷裂解或活HL-60、SK-MEL-28和/或U937进行蛋白酶释放实验抑制剂/添加剂检测。
在各种类型的抑制剂或添加剂存在下的蛋白酶保留活性模式表明，观测到的大部分活性涉及氨肽酶(嘌呤霉素、EDTA和倍司他汀敏感性)(参见表5和6)。该活性是ATP和DTT非依赖性的(活性未恢复)，对卤化物(Cl-)不敏感。该活性确实表现出与半胱氨酸或丝氨酸蛋白酶类酶相关。
蛋白酶释放活性模式似乎对丝氨酸蛋白酶抑制剂敏感，但对具有胰蛋白酶或胰凝乳蛋白酶样活性选择性的酶抑制剂不敏感。对硫醇没有明显要求(强烈表明为半胱氨酸类)，天冬氨酸和金属蛋白酶的特异性抑制剂在控制活性方面无效。
负责蛋白酶保留活性的酶需要活细胞，不能在受损细胞外检测。相反，加强蛋白酶释放反应不需要混合添加剂。这使得可以组合无毒、非裂解形式的检测，以根据其不同蛋白酶活性检测活细胞和死细胞。
表5采用Gly-Phe-AFC和HL-60和/或U937的保留检测
  抑制剂/添加剂   靶类型 作用 注释
  嘌呤霉素EDTADTTNaCl1，10菲咯啉倍司他汀3，4二异香豆素膦酰二肽E-64PMSFATP   氨肽酶金属蛋白酶半胱氨酸氨肽酶金属蛋白酶氨肽酶丝氨酸金属蛋白酶半胱氨酸丝氨酸/半胱氨酸ATP依赖性 抑制抑制增强无抑制无抑制抑制抑制(？)无抑制无抑制无抑制无作用 非常温和还降低存活力在裂解物中非常轻微不敏感至100μM强杀死细胞至100μM至100μM至100μM至100μM
表6用Ala-Ala-Phe-AMC和HL-60、SK-MEL-28、U937的释放检测
  抑制剂/添加剂     靶类型   作用     注释
  倍司他汀EDTA抑胃肽酶AEBSFPMSF抑肽酶亮抑肽酶抗胰蛋白酶FPR-CMKDTT3，4二异香豆素E-641，10菲咯啉膦酰二肽 金属蛋白酶(氨肽酶)金属蛋白酶天冬氨酸丝氨酸丝氨酸/半胱氨酸丝氨酸(胰蛋白酶，凝乳样)丝氨酸(胰蛋白酶样)丝氨酸(胰蛋白酶样)丝氨酸/半胱氨酸半胱氨酸丝氨酸半胱氨酸金属蛋白酶金属蛋白酶 无抑制无抑制无抑制抑制抑制无抑制无抑制无抑制抑制增强抑制无抑制无抑制无抑制 至10μM至50mM至100μM强强至100μM至100μg/ml至100μg/ml适度适度提高强至100μM至100μM至100μM
K.多重蛋白酶释放和保留检测
1. Jurkat剂量反应
将活跃倍增的Jurkat细胞以20,000细胞/孔的细胞密度、50μl体积接种入96孔板中。用RPMI 1640连续稀释凋亡诱导配体rTRAIL，以另外的50μl体积将其以250ng-244pg/ml终浓度加入双份平行孔中。单独的RPMI用作未诱导对照。将板于37℃在5％CO2中温育4小时。用RPMI将Gly-Phe-AFC和Ala-Ala-Phe-AMC同时稀释至1mM，并以1/10体积加入到板中，再于37℃温育30分钟。用CytoFluor II于Ex 360 Em 460和Ex 405 Em 530检测产生的荧光。在完成荧光检测后，向孔中等量加入CellTiter-Glo，用BMGFLUOstar Optima检测发光。
以微量滴定板形式多重化细胞健康的两种独立非破坏性替代检测方法(蛋白酶释放和保留)，以报告群体存活力(图21)。获得的数据与细胞群健康检测相反。这种关系使得可使用对照，并提供标准化水平。而且，可以依次多重检测形式加入第三种存活力检测(ATP含量)，没有干扰或猝灭，以进一步增强数据解释的置信度。
2. SK-MEL-28和ACHN细胞
将SK-MEL-28或ACHN细胞以10,000细胞/孔密度、100μl体积接种入白壁、透明底96孔板中，并使其于37℃在5％CO2中附着2小时。在附着后，小心去除50μl培养基，并代以在MEM+10％FBS中连续稀释的离子霉素或星形孢菌素。单独的培养基用作对照。将板再温育5小时。在MEM中制备1mM Gly-Phe-AFC溶液，并以1/10体积加入到孔中。用CytoFluor II检测产生的荧光。然后加入胱天蛋白酶-GloTM 3/7试剂，用BMG FLUOstar Optima检测发光。
蛋白酶保留底物报告了孔中的一般存活力，而胱天蛋白酶特异性试剂报告了细胞毒性的特异性通路(图22)。就此而言，胱天蛋白酶活化(以及由此而来的凋亡诱导)是星形孢菌素作用于SK-MEL-28的证据，而离子霉素启动了坏死型模式。用星形孢菌素处理的ACHN也观察到凋亡模式。
3. HeLa细胞和他莫昔芬处理
将HeLa细胞以10,000细胞/孔密度、100μl体积接种入白壁、透明底96孔板中，并使其于37℃在5％CO2中附着2小时。在附着后，在24、7、5、3、1和0小时的接触时间小心去除50μl培养基，并代以50μM在MEM+10％FBS中的他莫昔芬。单独的培养基用作对照。通过用2ml 10mM Hepes pH7.5再水合荧光素检测试剂块，制备蛋白酶保留和释放试剂。然后与Ala-Ala-Phe-氨基荧光素和Gly-Phe-AFC一起制备500μM溶液。将1/5体积的溶液加入到所有孔中，并在Me′Cour热处理单元中于37℃温育15分钟。用BMG FLUOstarOptima检测发光，用CytoFluor II检测荧光。
该实施例表明，在设定的蛋白酶保留和释放检测中，混合平台(荧光和发光)是有可能的(图23)。要注意的是，这些试剂是非裂解性的，并明显无毒，这提示其适合于光谱不同的其它下游应用，例如利用Apo-ONETM实验检测胱天蛋白酶-3/7。
4. 采用DNA染色的活/死蛋白酶检测的应用
将HeLa或HepG2细胞以10,000细胞/孔密度、100μl体积接种入白壁、透明底96孔板中，并使其于37℃在5％CO2中附着2小时。在附着后，小心去除50μl培养基，并代以在MEM+10％FBS中连续稀释的他莫昔芬或离子霉素。单独的培养基用作对照。再继续与化合物温育5小时。通过用2ml 10mM Hepes pH7.5再水合荧光素检测试剂块(Promega V859A)，制备蛋白酶保留和释放试剂。然后与Ala-Ala-Phe-氨基荧光素和Gly-Phe-AFC一起制备500μM溶液。将1/5体积的溶液加入到所有孔中，并在Me′Cour热处理单元中于37℃温育15分钟。用BMG FLUOstar Optima检测发光，用CytoFluor II检测荧光。接着，通过加入0.4％NP-9变性剂裂解剩余的活细胞。在回转振荡器上简短混合后，以另外的1/10体积加入1∶20稀释度的PicoGreen(Molecular Probes)的MEM溶液。使用CytoFluor II于Ex.485 Em.530检测与DNA/染料结合相关的荧光。
该实施例不仅扩展基于蛋白酶的存活力测试至另外两种粘附细胞型筛选偏好的应用，而且将DNA染色并入“总”检测(图24)。因为光谱差异性和混合平台读数，所有的检测都是无干扰和无猝灭的。
讨论
药物开发和主要的研究努力都继续利用逐渐成熟的细胞模型系统。已充分认识到在实验操作后必须检测这些体外系统中的细胞数和存活力。这种要求必须要确认在复杂生物系统背景中检测和标准化这些反应的有效性。
不幸的是，当前确定细胞存活力和细胞毒性的化学方法还没有跟上生物学研究的新方法和技术的步伐，因此限制了实验选择。例如，多重检测技术的出现，即在同一孔中组合检测，必须要求匹配且光谱不同的检测组合，同时对检测效力没有显著降低。对细胞健康的一般寻常检测和更特异性事件(例如胱天蛋白酶活化或报告基因调节)组合而言，这种要求特别重要。
细胞存活力和/或细胞毒性报告分子检测的前述方法与许多下游检测应用相容。这可利用具有各种激发和发射光谱的不同荧光团或通过整合其它报告分子平台(例如发光)来实现。值得注意的是，这可在非裂解和推定无毒环境中完成，允许终点测定的检测窗灵活性。而且，该技术的敏感性和成本有效性足以适应通量、小型化和自动化。表7列出了各种检测所提供的优势的对比。
表7
检测属性 蛋白酶释放和保留 染料排除(锥虫蓝) 刃天青还原 LDH释放 前荧光素和碘化丙锭 放射性掺入或释放 ATP
同相非破坏性试剂在培养环境中稳定无毒，易废弃无颜色猝灭荧光发光平台选择与终点多重检测相容反应的成比例标准化   是是是是是是是是是是   是是是是否否否否是否   是是是是否是否否是否   是是是是否是否否是否   是/否是否否是是否否是(如果光谱不同)是   否是是否是否否否否否   是否N/A是是否是否否否
总之，迄今为止，权衡在哺乳动物蛋白酶研究中所公开的成就，主要围绕着容易纯化、分泌或这二者的蛋白酶。而这些研究所提供的信息提供了蛋白水解机制、结构和功能的了解，几乎没人知晓由蛋白质组学预测所推测的蛋白酶以外的其它蛋白酶。简单地说，需要对胞内蛋白酶的功能、调节、亚细胞分布、丰度和重要性进行更多的工作。
越来越多的证据提示，许多胞质蛋白酶参与细胞稳态机制。尽管蛋白酶体明显涉及胞质肽的释放，但若干发现提示了其它保守胞质蛋白酶的作用(Vititsky等，1997；Constam等，1995)。
本文公开的各个蛋白酶检测和基于蛋白酶的活细胞/死细胞检测由于光谱的独特性而对于多重检测更灵活，使得可进行检测互补或与其它终点检测组合，例如AMC、AFC、R110、甲酚紫或发光，无染料猝灭，不限制体积，不后加工检测化学物，温育时间短，实际敏感性(在筛选环境中细胞存活力的变化百分率)相似或更好，不干扰下游DNA结合检测，不需要清洗或离心，例如同相检测。而且，当以比率(细胞毒性指数)使用时，基于蛋白酶的活细胞/死细胞检测的数据可标准化，与细胞数无关，可扩展细胞化合物接触窗，以记录化合物作用动力学差异，例如在与其它检测(例如DNA嵌入)组合时(可鉴别原发性或继发性坏死的潜在结果)，DNA嵌入和胱天蛋白酶活性可鉴别细胞周期药物反应性，例如在孔中的非均一群中。此外，蛋白酶底物可相对简单，例如为二或三肽，利用众所周知的化学方法偶联至荧光或发光底物，无毒和/或无诱变性，稳定，可以各种形式提供，例如在DMSO中或为干燥形式。
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所有的出版物、专利和专利申请都通过引用结合到本文中。尽管在前述说明书中已就其某些优选实施方案描述了本发明，为描述目的提出了很多细节，但对本领域技术人员显而易见的是，本发明容许其它实施方案，本文描述的某些细节可在在相当程度上改变而不偏离本发明的基本原则。
序  列  表
<110>Promega Corporation
Riss，Terry L.
Niles，Andrew
Moravec，Richard A.
<120>发光和不发光多重检测
<130>341.029WO1
<140>PCT/US2005/002158
<141>2005-01-24
<150>10/762,836
<151>2004-01-22
<160>34
<170>FastSEQ for Windows Version 4.0
<210>1
<211>4
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>合成底物
<400>1
Asp Glu Val Asp
 1
<210>2
<211>4
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>合成底物
<400>2
Trp Glu His Asp
 1
<210>3
<211>4
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>合成底物
<400>3
Leu Glu His Asp
 1
<210>4
<211>4
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>合成底物
<400>4
Val Glu Ile Asp
 1
<210>5
<211>4
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>合成底物
<400>5
Val Glu Val Asp
 1
<210>6
<211>4
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>合成底物
<400>6
Val Glu His Asp
 1
<210>7
<211>4
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>合成底物
<400>7
Ile Glu Thr Asp
 1
<210>8
<211>4
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>合成底物
<400>8
Ala Glu Val Asp
 1
<210>9
<211>4
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>合成底物
<220>
<221>SITE
<222>3
<223>Xaa＝任意氨基酸
<400>9
Leu Glu Xaa Asp
 1
<210>10
<211>4
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>合成底物
<220>
<221>SITE
<222>3
<223>Xaa＝任意氨基酸
<400>10
Val Glu Xaa Asp
 1
<210>11
<211>4
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>合成底物
<400>11
Ile Glu His Asp
 1
<210>12
<211>4
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>合成底物
<400>12
Pro Glu His Asp
 1
<210>13
<211>4
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>合成底物
<400>13
Glx Glu Val Asp
 1
<210>14
<211>4
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>合成底物
<400>14
Leu Glu Thr Asp
 1
<210>15
<211>4
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>合成底物
<220>
<221>SITE
<222>1
<223>Xaa＝Z，Y，D，L，V，I，A，W或P
<220>
<221>SITE
<222>2
<223>Xaa＝V或E
<220>
<221>SITE
<222>3
<223>Xaa＝任意氨基酸
<400>15
Xaa Xaa Xaa Asp
 1
<210>16
<211>6
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>合成底物
<400>16
Ala Ala Phe Ala Ala Phe
 1               5
<210>17
<400>17
 000
<210>18
<211>4
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>合成底物
<400>18
Leu Leu Val Tyr
 1
<210>19
<211>5
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>合成底物
<220>
<221>SITE
<222>1
<223>Xaa＝W或L
<220>
<221>SITE
<222>5
<223>Xaa＝一个或多个氨基酸
<400>19
Xaa Glu His Asp Xaa
 1               5
<210>20
<211>5
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>合成底物
<220>
<221>SITE
<222>3
<223>Xaa＝一个或多个氨基酸
<220>
<221>SITE
<222>5
<223>Xaa＝一个或多个氨基酸
<400>20
Asp Glu Xaa Asp Xaa
 1               5
<210>21
<211>5
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>合成底物
<220>
<221>SITE
<222>1
<223>Xaa＝L或V
<220>
<221>SITE
<222>3
<223>Xaa＝一个或多个氨基酸
<220>
<221>SITE
<222>5
<223>Xaa＝一个或多个氨基酸
<400>21
Xaa Glu Xaa Asp Xaa
 1               5
<210>22
<211>5
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>合成底物
<220>
<221>SITE
<222>5
<223>Xaa＝一个或多个氨基酸
<400>22
Ile Glu Gly Arg Xaa
 1               5
<210>23
<211>7
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>合成底物
<220>
<221>SITE
<222>3
<223>Xaa＝一个或多个氨基酸
<220>
<221>SITE
<222>5
<223>Xaa＝一个或多个氨基酸
<220>
<221>SITE
<222>7
<223>Xaa＝S或G
<400>23
Glu Asn Xaa Tyr Xaa Gln Xaa
 1                       5
<210>24
<211>5
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>合成底物
<220>
<221>SITE
<222>5
<223>Xaa＝一个或多个氨基酸
<400>24
Pro Arg Asn Lys Xaa
 1               5
<210>25
<211>14
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>合成底物
<220>
<221>SITE
<222>6
<223>Xaa＝K或N
<220>
<221>SITE
<222>7
<223>Xaa＝M或L
<400>25
Glu Ile Ser Glu Val Xaa Xaa Asp Ala Glu Phe Arg His Asp
 1               5                   10
<210>26
<211>10
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>合成底物
<400>26
Ser Glu Val Asn Leu Asp Ala Glu Phe Arg
 1               5                  10
<210>27
<211>4
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>合成底物
<400>27
Pro Arg Asn Lys
 1
<210>28
<211>4
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>合成底物
<400>28
Gly Phe Gly Phe
 1
<210>29
<211>5
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>合成底物
<400>29
Arg Leu Arg Gly Gly
 1               5
<210>30
<211>4
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>合成底物
<400>30
Leu Arg Gly Gly
 1
<210>31
<211>8
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>合成底物
<400>31
Arg Pro Phe His Leu Leu Val Tyr
 1               5
<210>32
<211>4
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>合成底物
<400>32
Glu Ala Ala Phe
 1
<210>33
<400>33
000
<210>34
<211>9
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>合成底物
<400>34
Ser Arg Pro Phe His Leu Leu Val Tyr
 1               5

Claims (114)

1.一种检测方法，所述方法检测第一种酶介导反应的第一种分子和第二种酶介导反应的第二种分子的存在或量，所述方法包括：
a)使样品与第一种反应和第二种反应的反应混合物接触，其中第一种酶介导的反应产生发光产物，其中第二种酶介导的反应产生产生不发光产物；和
b)检测样品中第一种和第二种分子的存在或量。
2.权利要求1的方法，其中第一种分子是第一种酶介导反应的底物。
3.权利要求1的方法，其中第二种分子是第二种酶介导反应的底物。
4.权利要求1的方法，其中第一种分子是第一种酶介导反应的酶。
5.权利要求1的方法，其中第二种分子是第二种酶介导反应的酶。
6.权利要求1的方法，其中第一种分子是第一种酶介导反应的辅因子。
7.权利要求1的方法，其中第二种分子是第二种酶介导反应的辅因子。
8.权利要求1的方法，其中发光用于检测第一种分子。
9.权利要求1的方法，其中荧光用于检测第二种分子。
10.权利要求1的方法，其中依次检测第一种和第二种分子的存在或量。
11.权利要求1的方法，其中样品为细胞裂解物。
12.权利要求1的方法，其中样品在接触第二种反应的反应混合物之前接触第一种反应的反应混合物。
13.权利要求1的方法，其中样品在接触第一种反应的反应混合物之前接触第二种反应的反应混合物。
14.权利要求1的方法，其中样品同时接触第一种反应和第二种反应的反应混合物。
15.一种检测方法，所述方法检测第一种酶介导反应的第一种酶或辅因子的存在或量，其包括：
a)使样品与第一种酶的第一种底物、第二种酶的第二种底物以及任选的第三种酶接触，其中第一种底物和第一种酶之间的反应或第一种酶和第一种底物之间的反应产物与第三种酶之间的反应产生发光产物，其中第二种底物和/或第二种底物和第二种酶之间的反应产物不发光；和
b)检测第一种酶介导反应的第一种酶或辅因子的存在或量。
16.一种检测方法，所述方法检测酶介导的发光反应，以检测第一种酶介导反应的酶或辅因子的存在或量，其包括：
a)使样品与第一种酶的第一种底物、第二种酶的第二种底物以及任选的第三种酶接触，其中第一种底物和第一种酶之间的反应或第一种酶和第一种底物之间的反应产物与第三种酶之间的反应产生发光产物，其中第二种底物和/或第二种底物和第二种酶之间的反应产物不发光；和
b)检测发光。
17.权利要求15的方法，其中检测发光。
18.权利要求15或16的方法，其中在第一种酶或辅因子存在下发光增加。
19.权利要求15或16的方法，其中在第一种酶或辅因子存在下发光降低。
20.权利要求15或16的方法，所述方法进一步包含检测第二种酶的存在或量。
21.权利要求20的方法，其中荧光用于检测第二种酶的存在或量。
22.权利要求20的方法，其中依次检测第一种酶或辅因子的存在或量和第二种酶的存在或量。
23.权利要求20的方法，其中同时检测第一种酶或辅因子的存在或量和第二种酶的存在或量。
24.权利要求20的方法，其中以比色法检测第二种酶的存在或量。
25.权利要求20的方法，其中通过使样品与第四种酶和第三种底物接触，检测第二种酶的存在或量，第四种酶和第三种底物与第二种底物和第二种酶之间的反应产物反应，产生荧光产物。
26.权利要求15或16的方法，所述方法进一步包括检测不发光的第二种底物或第二种底物和第二种酶之间的不发光产物的存在或量。
27.权利要求15或16的方法，其中第二种酶基本上不与第一种底物反应。
28.权利要求15或16的方法，其中第一种酶基本上不与第二种底物反应。
29.权利要求15或16的方法，其中第二种底物或第二种底物和第二种酶之间的反应产物发荧光。
30.权利要求29的方法，其中第二种底物或第二种底物和第二种酶之间的反应产物包括：溴化乙锭、荧光素、Cy3、BODIPY、对甲氨基酚、Rox、5-羧基荧光素、6-羧基荧光素、蒽、2-氨基-4-甲氧基萘、phenalenone、吖啶酮、氟化呫吨衍生物、α-萘酚、β-萘酚、1-羟基芘、香豆素、7-氨基-4-甲基香豆素(AMC)、7-氨基-4-三氟甲基香豆素(AFC)、Texas Red、四甲基罗丹明、羧基罗丹明或罗丹明、羟甲苯基、罗丹明-110或试卤灵。
31.权利要求15或16的方法，其中一种酶是糖苷酶、磷酸酶、激酶、脱氢酶、过氧化物酶、硫酸酯酶、肽酶或水解酶。
32.权利要求15或16的方法，其中一种酶是蛋白酶。
33.权利要求32的方法，其中一种酶是胱天蛋白酶。
34.权利要求33的方法，其中所述胱天蛋白酶包括胱天蛋白酶-3、胱天蛋白酶-7或胱天蛋白酶-8。
35.权利要求15或16的方法，其中一种底物包含DEVD、WEHD、LEHD、VEID、VEVD、VEHD、IETD、AEVD、LEXD、VEXD、IEHD、PEHD、ZEVD或LETD。
36.权利要求15或16的方法，其中一种底物包含X1-X2-X3-D，其中X1是Z、Y、D、L、V、I、A、W或P，X2是V或E，X3是任意氨基酸。
37.权利要求15或16的方法，其中一种底物是胰蛋白酶或类胰蛋白酶底物。
38.权利要求15或16的方法，其中一种酶切割含精氨酸或赖氨酸的底物。
39.权利要求15或16的方法，其中样品是细胞裂解物。
40.权利要求39的方法，其中样品是在裂解前用细胞死亡诱导剂处理的细胞样品。
41.权利要求15或16的方法，其中样品包含完整细胞。
42.权利要求15或16的方法，其中第三种酶是荧光素酶。
43.权利要求42的方法，其中荧光素酶是甲虫荧光素酶。
44.权利要求15或16的方法，其中第二种底物是乳酸脱氢酶底物。
45.权利要求15或16的方法，其中样品在接触第二种底物前接触第一种底物。
46.权利要求15或16的方法，其中样品同时接触第一种和第二种底物。
47.权利要求15或16的方法，其中样品在接触第一种底物前接触第二种底物。
48.权利要求15或16的方法，其中通过使样品与第一种酶接触检测辅因子的存在或量。
49.一种检测样品中至少两种分子的存在或量的方法，所述方法包括：
a)使样品与第一种酶的第一种底物、第二种酶的第二种底物以及任选的第三种酶接触，其中第一种底物和第一种酶之间的反应或第一种酶和第一种底物之间的反应产物与第三种酶之间的反应产生发光产物，其中第二种底物和/或第二种底物和第二种酶之间的反应产物不发光，其中第一种酶和第二种酶不相同；和
b)检测由第一种或第二种酶介导的反应的第一种和第二种酶或辅因子的存在或量。
50.权利要求49的方法，其中检测发光。
51.权利要求49的方法，其中至少一种酶是蛋白酶。
52.权利要求49的方法，其中第二种酶与第一种底物基本不反应。
53.权利要求49的方法，其中第一种酶与第二种底物基本不反应。
54.权利要求49的方法，其中第二种底物或第二种底物与第二种酶之间的反应产物发荧光。
55.权利要求49的方法，其中荧光用于检测第二种酶或辅因子的存在或量。
56.权利要求49的方法，其中至少一种酶是胱天蛋白酶。
57.权利要求49的方法，其中一种底物是胰蛋白酶或类胰蛋白酶底物。
58.权利要求49的方法，其中样品为细胞裂解物。
59.权利要求58的方法，其中样品为在裂解前用细胞死亡诱导剂处理的细胞样品。
60.权利要求49的方法，其中样品包含完整细胞。
61.权利要求49的方法，其中第三种酶是荧光素酶。
62.权利要求61的方法，其中荧光素酶是甲虫荧光素酶。
63.权利要求62的方法，其中第二种底物或第二种底物和第二种酶之间的反应产物发荧光。
64.权利要求49的方法，其中样品在接触第二种底物前接触第一种底物。
65.权利要求49的方法，其中样品在接触第一种底物前接触第二种底物。
66.权利要求49的方法，其中样品同时接触第一种和第二种底物。
67.权利要求49的方法，其中在检测第二种酶或第二种辅因子的存在或量之前检测第一种酶或第一种辅因子的存在或量。
68.权利要求49的方法，其中在检测第一种酶或第一种辅因子的存在或量之前检测第二种酶或第二种辅因子的存在或量。
69.权利要求68的方法，其中第二种底物或第二种底物和第二种酶之间的反应产物发荧光。
70.权利要求69的方法，其中第二种底物或第二种底物和第二种酶之间的反应产物包括：溴化乙锭、荧光素、Cy3、BODIPY、对甲氨基酚、Rox、5-羧基荧光素、6-羧基荧光素、蒽、2-氨基-4-甲氧基萘、phenalenone、吖啶酮、氟化呫吨衍生物、α-萘酚、β-萘酚、1-羟基芘、香豆素、7-氨基-4-甲基香豆素(AMC)、7-氨基-4-三氟甲基香豆素(AFC)、Texas Red、四甲基罗丹明、羧基罗丹明或罗丹明、羟甲苯基、罗丹明-110或试卤灵。
71.权利要求15、16或49的方法，其中所述辅因子是ATP。
72.权利要求49的方法，其中通过使样品与第四种酶和第三种底物接触，检测第二种酶的存在或量，第四种酶和第三种底物与第二种底物和第二种酶之间的反应产物反应，产生荧光产物。
73.一种检测第一种酶介导反应的分子的存在或量的方法，所述方法包括：
A)使含荧光蛋白表达细胞的样品与第一种酶介导反应的反应混合物接触，其中第一种酶介导的反应产生发光产物；和
b)检测样品中分子的存在或量和荧光蛋白的存在或量。
74.权利要求73的方法，其中所述分子是底物。
75.权利要求73的方法，其中所述分子是辅因子。
76.权利要求73的方法，其中所述分子是酶。
77.一种试剂盒，所述试剂盒包含
不发光底物；和
发光底物。
78.权利要求77的试剂盒，所述试剂盒进一步包含能够介导与发光底物的发光反应的酶。
79.权利要求77的试剂盒，所述试剂盒进一步包含在单个反应容器中进行发光反应和不发光反应的说明书，所述容器包含不发光底物和发光底物。
80.一种试剂盒，所述试剂盒包含：
不发光底物；和
能够介导发光反应的酶。
81.权利要求80的试剂盒，所述试剂盒进一步包含酶的发光底物。
82.权利要求77或80的试剂盒，其中不发光底物是荧光底物。
83.权利要求78或80的试剂盒，其中所述酶是荧光素酶。
84.权利要求80的试剂盒，所述试剂盒进一步包含在单个反应容器中进行发光反应和不发光反应的说明书，所述容器包含不发光底物和酶。
85.一种检测样品中活细胞和/或死细胞的方法，所述方法包括：
a)使样品与第一种蛋白酶的底物和第二种蛋白酶的底物接触，其中一种蛋白酶介导的与一种底物的反应产生荧光产物，由另一种蛋白酶介导的与另一种底物的反应产生发光或荧光产物，其中一种底物基本上可渗入细胞，另一种底物基本上不可渗入细胞，其中如果两个反应都产生荧光产物，则两种底物上的荧光团光谱不同；和
b)检测或测定样品中的荧光和/或发光，由此检测或测定样品中活细胞和/或死细胞的数目或存在。
86.权利要求85的方法，其中每种蛋白酶介导的反应都产生荧光产物。
87.权利要求85的方法，其中一种蛋白酶介导的反应产生发光产物，另一种蛋白酶介导的反应产生荧光产物。
88.权利要求85的方法，其中基本上可渗入细胞的底物是与蛋白酶体结合的蛋白酶、氨肽酶或组织蛋白酶的底物。
89.权利要求85的方法，其中基本上不可渗入细胞的底物是三肽基肽酶、钙蛋白酶或胰凝乳蛋白酶的底物。
90.权利要求85的方法，其中所述样品包含哺乳动物细胞。
91.权利要求85的方法，其中两种底物在与样品接触前混合。
92.权利要求87的方法，其中依次检测或测定荧光和发光。
93.权利要求86的方法，其中同时检测或测定每种荧光产物的荧光。
94.权利要求85的方法，所述方法进一步包括检测或测定分子的存在或量。
95.权利要求94的方法，其中所述分子是DNA。
96.权利要求94的方法，其中所述分子是酶。
97.权利要求94的方法，其中所述分子是ATP。
98.权利要求85的方法，所述方法进一步包括使样品经受裂解细胞的条件。
99.权利要求85的方法，所述方法进一步包括使样品在接触底物前接触一种或多种物质。
100.一种检测样品中活细胞的方法，所述方法包括：
a)使样品与基本上可渗入细胞的荧光底物接触，所述荧光底物是和蛋白酶体结合的蛋白酶、氨肽酶或组织蛋白酶的荧光底物；和
b)检测或测定样品中的荧光，由此检测或测定样品中活细胞的数目或存在。
101.权利要求100的方法，其中所述底物是Gly-Phe-AFC、Gly-Phe-AMC、Gly-Gly-Leu-AMC、Z-Gly-Gly-Leu-AMC、Phe-AMC或Tyr-AMC。
102.一种检测样品中死细胞的方法，所述方法包括：
a)使样品与基本上不可渗入细胞的荧光或发光底物接触，所述荧光或发光底物是三肽基肽酶、钙蛋白酶或胰凝乳蛋白酶的底物；和
b)检测或测定样品中的荧光或发光，由此检测或测定样品中死细胞的数目或存在。
103.权利要求102的方法，其中所述底物是Ala-Ala-Phe-AMC、(Ala-Ala-Phe)2-R110、Ala-Ala-Phe-氨基荧光素、Suc-Leu-Leu-Val-Tyr-AMC或Z-Leu-Leu-Val-Tyr-氨基荧光素。
104.一种试剂盒，所述试剂盒包含：
一种组合物，其含有第一种蛋白酶的第一种基本不可渗入细胞的荧光或发光底物，和第二种蛋白酶的第二种基本可渗入细胞的荧光底物；以及用于指导用户使用组合物检测样品中活细胞和/或死细胞的说明书。
105.权利要求104的试剂盒，其中第一种底物是Ala-Ala-Phe-AMC、(Ala-Ala-Phe)2-R110、Ala-Ala-Phe-氨基荧光素、Suc-Leu-Leu-Val-Tyr-AMC或Z-Leu-Leu-Val-Tyr-氨基荧光素。
106.权利要求104的试剂盒，其中第二种底物是Gly-Phe-AFC、Gly-Phe-AMC、Gly-Gly-Leu-AMC、Z-Gly-Gly-Leu-AMC、Phe-AMC或Tyr-AMC。
107.权利要求104的试剂盒，所述试剂盒进一步含有一种或多种用于发光反应的试剂。
108.权利要求107的试剂盒，其中至少一种试剂被冻干。
109.权利要求104的试剂盒，其中所述组合物为其中所述底物在有机溶剂中的溶液。
110.权利要求109的试剂盒，其中所述组合物被冻干。
111.权利要求104的试剂盒，其中所述组合物为其中底物浓度为约0.005-1M的溶液。
112.一种含组合物的试剂盒，所述组合物包含：Ala-Ala-Phe-AMC、(Ala-Ala-Phe)2-R110、Ala-Ala-Phe-氨基荧光素、Gly-Phe-AFC、Gly-Phe-AMC、Gly-Gly-Leu-AMC或其任意组合。
113.权利要求112的试剂盒，其中所述组合物包含溶剂。
114.权利要求113的试剂盒，其中Ala-Ala-Phe-AMC、(Ala-Ala-Phe)2-R110、Ala-Ala-Phe-氨基荧光素、Gly-Phe-AFC、Gly-Phe-AMC或Gly-Gly-Leu-AMC的浓度为约0.005-1M。
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