JP2013162804A - ルミネセンス発生及びルミネセンス非発生多重アッセイ - Google Patents
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Abstract
【解決手段】例えば、サンプルを、第1のプロテアーゼのための基質及び第2のプロテアーゼのための基質に接触させ、プロテアーゼの一方により媒介される前記基質の一方との反応が、蛍光発生生成物を生成し、他方のプロテアーゼにより媒介される他方の基質との反応が、蛍光発生生成物を生成し、そして基質の一方が、細胞透過性であり、他方の基質が、細胞不透過性であり、2種の基質上の蛍光体のスペクトルが異なり、かつサンプル中の蛍光又はルミネセンスを検出するか、又は測定する。
【選択図】なし
Description
蛍光/ルミネセンス多重アッセイ
A.単一ウェル、多重アッセイにおけるカスパーゼ−3及びカスパーゼ−8の測定
Caspase−Glo(商標)8 Reagent(Caspase−Glo(商標)8 Assay System、Promega社)を、均一ルミネセンス発生カスパーゼ−8及びルミネセンス非発生カスパーゼ−3酵素アッセイの多重化を可能にする能力に関して評価した。Caspase−Glo(商標)8 Reagentは、Caspase−Glo(商標)8 Buffer及びルミネセンス発生基質であるZ−LETD−アミノルシフェリンからなる。図1Aにおけるルミネセンス発生アッセイに関して、多重化されたルミネセンス発生及びルミネセンス非発生アッセイの実行可能性を実証するために、Caspase−Glo(商標)8 Reagent(菱形)又はカスパーゼ−3に対する50μMの蛍光発生基質、(Z−DEVD)2−ローダミン−110(四角形)も含有するCaspase−Glo(商標)8 Reagentのいずれかを用いた。図1Bにおける蛍光発生アッセイに関して、50μM (Z−DEVD)2−ローダミン−110及び10mM DTT(四角形)又は50μM (Z−DEVD)2−ローダミン−110及びZ−LETD−アミノルシフェリン(四角形)のいずれかを含有するCaspase−Glo(商標)8 Bufferを用いた。
図1に、単一ウェル中、2種のプロテアーゼ酵素に関する蛍光及びルミネセンスの同時測定が示されている。図1Aに見られる通り、カスパーゼ−8(四角形)に関するルミネセンス発生アッセイにおいて、カスパーゼ−3及びその蛍光発生基質である(Z−DEVD)2−ローダミン−110の存在は、ルミネセンス反応を大きく変化させることはない。同様に、カスパーゼ−3(四角形)に関する蛍光発生アッセイにおいて、カスパーゼ−8及びそのルミネセンス発生基質であるZ−LETD−アミノルシフェリンの存在は、カスパーゼ−3に関する蛍光発生アッセイに影響を与えない。
カスパーゼ酵素及びそれらの基質などの種々の濃度のルミネセンス発生試薬及び蛍光発生試薬並びに緩衝液成分を組み合わせて、蛍光及び/又はルミネセンスに対する各構成成分の寄与を確認した。ルミネセンス測定時、蛍光発生基質である(Z−DEVD)2−ローダミン−110は、ローダミンチャネル(485EX/520EM)内でカスパーゼ−3活性を報じ、蛍光発生基質であるAc−DEVD−AMCは、AMCチャネル(360EX/460EM)内でカスパーゼ−3活性を報じるが、Z−LETD−アミノルシフェリン基質は、カスパーゼ−8活性を報じる。表3には、12の異なる反応条件に関する各成分の量(μl)が、各反応条件に関し、合計、約500μlのマスター混合物、又は100μlのマスター混合物/反応(n=4)を生じることが記載されている。「カスパーゼ添加」の列でのこの列の数は過剰に添加されたカスパーゼのタイプを定義するものであって、容量を示しているのではない。
1.カスパーゼ−8 luc対照
2.カスパーゼ−3ローダミン−110対照
3.カスパーゼ−3AMC対照
4.ローダミン−110を有する多重対照
5.ローダミン−110+阻害剤を有する多重対照
6.AMCを有する多重対照
7.アミノルシフェリン混合物を有するカスパーゼ−3
8.アミノルシフェリン混合物+阻害剤を有するカスパーゼ−3
9.ローダミン−110を有するカスパーゼ−8
10.アミノルシフェリン混合物を有するカスパーゼ−3
11.アミノルシフェリン混合物+阻害剤を有するカスパーゼ−8
12.ローダミン−110を有し、アミノルシフェリン混合物を有さないカスパーゼ−3
図2A、B、及びCで、全てのカラットは、酵素活性を示す蛍光又はルミネセンスのいずれかが予測される場合を表す。図2Aは、各反応におけるAMC蛍光に関するシグナルを示す。背景以上の蛍光は、Ac−DEVD−AMC及びカスパーゼ−3という適切な基質/酵素の組合せが存在した場合のみ存在した(反応条件3及び6)。図2Bは、各反応におけるローダミン−110蛍光に関するシグナルを示す。背景以上の蛍光は、カスパーゼ−3阻害剤が存在した場合(反応条件5)を除いて、(Z−DEVD)2−ローダミン−110/カスパーゼ−3という基質/酵素の組合せが存在した場合に存在した(反応条件2、4、10、及び12)。背景以上のルミネセンスシグナル(図2C)では、カスパーゼ阻害剤が存在した反応条件(反応条件5、8、及び11)を除いて、Z−LETD−アミノルシフェリン/カスパーゼ−8という適切な基質/酵素の組合せを有した反応が、背景以上のシグナルを示した(反応条件1、4、6、7、9、及び10)。したがって、該データにより、これらの条件下で、背景の蛍光及びルミネセンス測定に及ぼす反応成分の影響は無視できるものだったことが証明された。
ダルベッコ−リン酸緩衝生理食塩水(Sigma社)中、カスパーゼ−8(150単位/ml、Biomol Research Laboratories)、カスパーゼ−3(Pharmingen社)、トリプシン(Sigma社)、及び3種全ての酵素の組合せの検出可能濃度の希釈液を調製した。100μlの各酵素希釈液を、96ウェルプレートのウェルに加え、100μlの各基質を、単独で、又は適切に組み合わせて対応するウェルに加えた:カスパーゼ−3に対しては、(Z−DEVD)2−ローダミン−110基質、トリプシンに対しては、Z−PRNK−AMC基質(ベータ−トリプターゼに対する基質として、本明細書にその全体が組み込まれている米国特許出願第09/955,639号に記載されているが、トリプシンに対しては、有用性が少ないと認識されている)、及びカスパーゼ−8に対しては、Z−LETD−アミノルシフェリン基質。蛍光アッセイで、基質と共にCaspase−Glo(商標)8緩衝液を用いた場合、10mM DTTを含めた。プレートは、プレートシェーカー上、室温で、少なくとも10分間温置した。
図3Aに示されるように、3種の異なる基質及び組み合わされた対応する酵素を有する反応(三重アッセイ)において、カスパーゼ−3の検出に用いられた条件により、対照条件の蛍光以上の比較的高い蛍光が生じた。三重アッセイ(全ての酵素と共に全ての基質)におけるカスパーゼ−3の活性を、カスパーゼ−3単独の活性と比較すると、カスパーゼ−3が同じ反応液中に他の三重酵素反応液と共にあった場合、カスパーゼ−3活性は背景より大きかった。トリプシン(図3B)及びカスパーゼ−8(図3C)に関しても、カスパーゼ−3と同程度ではないにしても、同様な結果が見られた。
Beta−Glo(登録商標)緩衝液(Beta−Glo(登録商標)Assay System、Promega社)を用いてBeta−Glo(登録商標)凍結乾燥基質を再構成することにより、又はBeta−Glo(登録商標)緩衝液に(Z−DEVD)2−ローダミン−110(50μM)を加えることにより、又はBeta−Glo(登録商標)緩衝液を用いてBeta−Glo(登録商標)凍結乾燥基質を再構成して(Z−DEVD)2−ローダミン−110(50μM)を加えることにより、試薬を調製した。カスパーゼ−3(2μl/ml、Pharmingen社)、又はβ−ガラクトシダーゼ(0.1μl/ml)、又はカスパーゼ−3及びβ−ガラクトシダーゼを、RPMI1640中で希釈し、100μlを96ウェル白色プレートのウェルに加えた。100μlの適切な試薬を96ウェルプレートのウェルに加え、室温で温置した。DYNEX LaboratoriesのMLX(商標)プレートルミノメータを用いて、30分におけるルミネセンスを測定した。485EX/530EMのフィルターにセットしたCytoFluorII Fluorescentプレート読取り機上で、2時間温置後の蛍光を測定した。増加した蛍光を補正するために、18時間目に、CytoFluorIIフルオロメータ上、異なる増加セッティングで全ての測定を繰り返した。
図4A及びCは、β−ガラクトシダーゼに関するルミネセンス発生アッセイが、カスパーゼ−3を測定するための蛍光発生試薬の存在下で機能的であることを証明している。図4B及びDは、カスパーゼ−3を測定するための蛍光発生アッセイが、β−ガラクトシダーゼを測定するためのルミネセンス発生試薬の存在下で機能的であることを証明している。図4B及び4Dに見られるように、背景蛍光に及ぼすルミネセンス発生試薬成分の軽微な影響がある。しかし、ルミネセンスに及ぼす蛍光発生試薬成分の影響はほとんど無い(図4A及び4C)。
0.1M Tris pH7.3、2mM EDTA、及び10mM MgSO4を含有する緩衝液中、ルシフェリン、アミノルシフェリン、及びZ−LETD−アミノルシフェリンを、およそ2μMに希釈した。1.25mm励起及び発光スリットフィルターを有するSPEX Fluorolog−2分光器上、1nmの波長間隔及び0.2秒の積分時間でサンプルを走査した。全ての走査は、石英キュベットを用いて実施された。
ルシフェリン及びアミノルシフェリンに関して、励起が325nmに存在すると、発光は、375nmから750nmで捕捉され、発光が600nmで測定される場合の励起は、280nmから550nmで捕捉された(図5A及び5B)。Z−LETD−アミノルシフェリンでは、励起が325nmに存在すると、発光は、375nmから750nmで捕捉され、発光が525nmで測定される場合の励起は、280nmから500nmで捕捉された(図5C)。興味深いことに、ペプチドがアミノルシフェリンに共役すると(図5C)、共役体の発光ピークは、より短い波長へ青色シフトした。これは予想外のことであり、したがって、特に、アミノルシフェリンと同じ波長領域で発光する蛍光体を用いると、ルミネセンス/蛍光二重測定が可能になる。
偽結果を検出する方法
方法
カスパーゼ−3阻害剤(Ac−DEVD−CHO、10μM)又はルシフェラーゼ阻害剤(Resveratol、5μM)のいずれかと共に、カスパーゼ−3の存在下、Z−DEVD−アミノルシフェリンを含有するCaspase−Glo(商標)3/7試薬(Caspase−Glo(商標)3/7 Assay、Promega社)を、(Z−DEVD)2−ローダミン−110又はAc−DEVD−AMCと組み合わせた。Z−DEVD−アミノルシフェリンのカスパーゼ−3開裂に由来するルミネセンスシグナルは、30分目に読み取り、一方、カスパーゼ−3開裂活性由来の蛍光シグナルは、適切なAMC又はローダミン110フィルターセットを用いて、2時間目に読み取った。
ルミネセンスは、背景比に対して最大のシグナルを与え、次いでローダミン−110、次いで、AMCであった(図6)。カスパーゼ−3を検出する3種の基質全てが、知られたカスパーゼ−3阻害剤の添加によって、一貫して影響を受けなかった。このことは、いずれかのアッセイが実施される際に、例えば、可能性のある偽妨害を制御するために、ルミネセンス発生試薬と蛍光発生試薬とを組み合わせることができるということを示唆している。したがって、ある試薬がある一定の酵素の真の阻害剤であるかどうかを判定するために多重シグナルを用いるこができる。
さらなる典型的多重アッセイ
A.単一ウェルフォーマットにおける乳酸デヒドロゲナーゼ(LDH)及びアデノシン三リン酸に関する多重アッセイ
以下の検出試薬を調製した:1)LDH試薬(30mM HEPES、pH7.4、10mM NaCl、20mM MgSO4、250μMレザズリン(Aldrich))を用いて、CytoTox−ONE(商標)Homogeneous Membrane Integrity Assay(Promega社、Technical Bulletin306)からの凍結乾燥基質成分を再構成した;2)ATP試薬(30mM HEPES pH7.4、10mM NaCl、20mM MgSO4)を用いて、CellTiter−Glo(商標)Luminescent Cell Viability Assay(Promega社、Technical Bulletin288)からの凍結乾燥基質成分を再構成した;3)LDH/ATP組合せ試薬(30mM HEPES、pH7.4、10mM NaCl、20mM MgSO4、250μMレザズリン(Aldrich))を用いて、CytoTox−ONE(商標)からの凍結乾燥基質成分を再構成し、次に、これを用いて、CellTiter−Glo(商標)からの凍結乾燥基質成分を再構成した。
対照反応(図7C)と比較した場合、ATPに関するルミネセンス発生アッセイに及ぼすLDH及びその蛍光発生検出試薬の軽微な影響があった(図7A);しかし、ATPの検出は、依然として可能であった。LDHに関する蛍光発生アッセイへルミネセンス発生検出試薬を添加しても背景蛍光に影響を与えず(図7B)、対照反応(図7D)に比較して全体的な蛍光は減少したが、LDH活性は、依然として検出可能であった。
多重反応に蛍光発生LDH検出試薬を加えると、対照反応に比較してルミネセンスの減少があった(それぞれ、図8A及び8C)。図8Aにおける全体的なルミネセンスシグナルの減少に関わらず、蛍光発生LDH検出試薬の存在下、ルミネセンスカスパーゼ−3アッセイは機能的であった。図8Bは、多重反応にルミネセンス発生カスパーゼ−3検出試薬を加えると、対照(図8D)に比較して、蛍光背景の増加があることを示している。;しかし、図8Aは、カスパーゼ−3に関するルミネセンス発生検出試薬の存在下で、LDHに関する蛍光発生アッセイが機能的であることを証明している。背景ルミネセンスに対するLDHの影響はなく(図8C)、また、背景ルミネセンスに対するカスパーゼ−3の影響もなかった(図8D)。
以下の検出試薬を調製した:1)PKA試薬−100mMトリス pH7.3、100mM MgCl2、PKAローダミン−110基質(ProFluor(商標)PKA Assay、Promega社、 Technical Bulletin315)の1:1000希釈液、及び400μM ATPを含有する1X反応緩衝液を調製した;2)カスパーゼ−3試薬−100mMトリス pH7.3、100mM MgCl2、150μg/mlの組換え熱安定性ルシフェラーゼ、80μM Z−DEVD−アミノルシフェリン(Promega社)、400μM ATP、100μM DTT(Promega社)、2.5mM CaCl2(Fisher)、40mM MgSO4(Fisher)、及び0.2% Tergitol NP−9(Sigma)を含有する1X反応緩衝液を調製した;3)キナーゼ/カスパーゼ−3組合せ試薬−100mMトリス pH7.3、100mM MgCl2、PKAローダミン−110基質の1:1000希釈液、150μg/mlの組換え熱安定性ルシフェラーゼ、80μM Z−DEVD−アミノルシフェリン、400μM ATP、100μM DTT、2.5mM CaCl2、40mM MgSO4、及び0.2% Tergitol NP−9を含有する1X反応緩衝液を調製した;4)タンパクキナーゼ停止試薬−100mMトリス pH7.3、100mM MgCl2、プロテアーゼ試薬(ProFluor(商標)PKA Assay)の1:50希釈液、30μM スタウロスポリン(BIOMOL Laboratories)を含有する1X停止試薬を調製した。
蛍光発生PKAアッセイ検出試薬の添加により、PKAは存在するが完全なPKA検出試薬が存在しない対照反応(図9C)に比較して、ルミネセンス背景の増加が生じた。しかし、カスパーゼ−3の活性から生じた反応ルミネセンスは比例して増加し、該条件は、ルミネセンス発生カスパーゼ−3反応それ自体に影響したとは思われなかった。PKAに関する蛍光発生アッセイに、カスパーゼ−3に関する検出試薬を添加すると(図9B)、カスパーゼ−3は存在するが完全なカスパーゼ−3検出試薬が存在しない蛍光対照反応(図9D)に比較して、全体の蛍光が50%超減少した。カスパーゼ−3及びPKA活性は、これらの多重条件を用いて、背景以上を測定できた。
以下の検出試薬を調製した:1)ウミシイタケルシフェラーゼに対する細胞透過性修飾セレンテラジン基質であるEnduRen(商標)(Promega社)を、10%ウシ胎仔血清及び500μg/mlのG−418サルフェートを添加したF−12組織培養培地中に、600μMに希釈した;2)カスパーゼ−3基質:(Z−DEVD)2−ローダミン−110(Promega社)を、10%ウシ胎仔血清及び500μg/mlのG−418サルフェートを添加したF−12組織培養培地中に、250μMに希釈した;3)ルシフェラーゼ/カスパーゼ−3組合せ基質:EnduRen(商標)(600μM)及び(Z−DEVD)2−ローダミン−110(250μM)を、10%ウシ胎仔血清及び500μg/mlのG−418サルフェートを添加したF−12組織培養培地中に、希釈した。
これらのアッセイにおいて、ウミシイタケルシフェラーゼの活性を、細胞死に関する内部対照として用いた。したがって、スタウロスポリンの濃度が増加するにつれて、ルシフェラーゼの活性は減少するはずである。図10Aは、カスパーゼ−3基質の添加は、対照反応(図10C)と比較して、ルシフェラーゼ反応に負の影響を与えなかったことを示している。図10Bは、ルシフェラーゼ基質の添加が、図10Dに比較して、全体の蛍光にわずかな増加はあったものの、背景蛍光に影響を与えなかったことを示している。ウミシイタケルシフェラーゼに関するルミネセンス発生アッセイは、カスパーゼ−3又はカスパーゼ−3基質の存在下で十分に機能的であり、カスパーゼ−3に関する蛍光発生アッセイは、わずかに影響を受けただけで、ウミシイタケルシフェラーゼ又はウミシイタケルシフェラーゼ基質の存在下で十分に機能的であった。
プロテアーゼ保持及び放出細胞生存度多重アッセイ
生細胞及び死細胞アッセイは、特定の化学的、生物学的又は物理的処理に応答した細胞生存度の変化をモニターするために、広く用いられている。生存度と細胞毒性アッセイとは、一般的に逆であり、異なった生物マーカーを測定する。細胞毒性による細胞生存度の一般的変化を評価する方法は、歴史的に外部膜透過性の変化に関連してきた。膜構造の損傷を検出する古典的方法としては、トリパンブルー排除、核酸染色、及び乳酸デヒドロゲナーゼ放出が挙げられる(Rissら、2004年;Myersら、1998年)。細胞機能又は増殖の評価に関するアッセイとしては、トリチウムチミジン取込み、ATP含量、テトラゾリウム色素移行又はフルオレセインジアセテートが挙げられる(Cookら、1989年)。無処置細胞膜は、かさばった荷電分子又はペプチドを、細胞外空間から細胞質内へ進入させないと考えられる。逆に、損傷した膜は、色素又は化合物を細胞内へ、又は細胞内容物を細胞外へ自由に透過させる。この透過現象が、色素標識(「生命」色素、DNA挿入剤、又はエステラーゼ修飾フルオレセイン)並びにLDH放出アッセイの双方にとっての基礎である。細胞生存度を測定する既存の方法は、依然として有用であり、コスト効率の良い適用である一方、それらは多くの技術的又は実用的な欠点を有し、高含量、多重又は高スループットフォーマットにおける利用が制限されている。例えば、LDH放出(CytoTox−ONE(商標))又は色素減少能力(CellTiter−Blue(商標))による細胞膜の完全性の現在の測定は、レザズリン基質の共有及びEx/Emスペクトルの重なりのために、対にする(データ正規化の手段)ことができない。さらに、双方のアッセイに利用される着色レアズリン基質は、他のエンドポイントアッセイ測定(消色)との第2のアッセイシグナルウィンドー強度(及び感度)を制限し、濃度及びフォーマットが、第2のアッセイ試薬ペアリングに関して最適化されない(例えば、容量が限定される)。
HL−60細胞を、2倍連続希釈してからトリトンXの添加によって、0.2%最終に細胞溶解させるか、又は媒体添加によって維持した。100mM酢酸ナトリウム、pH4.5中、200μM Ala−Ala−Phe−AMC基質の1/10容量を、溶解物又は細胞に加え、37℃でさらに1時間温置した。次いで、溶解細胞又は生存細胞に関連した蛍光を、CytoFluorIIを用いて、Ex.360 Em.460で測定した。
活動的ダブリングHL−60細胞を、100,000個の細胞/mlに調整し、2つのアリコットに分けた。1つのアリコットは、マイクロチップのMisonix3000を用いて3回の5秒パルスの30%出力で超音波処理した。他のアリコットは、37℃で保持した。次に細胞懸濁液及び溶解物を、100μl容量でRPMI 1640+10%FBS中で2倍連続希釈した。培地のみのものは、無細胞対照として寄与した。ルシフェリン検出試薬のケーク(Promega V859A)を、2.0mlの10mM Hepes、pH7.5で再懸濁した。次いでルシフェリン検出試薬を分けて、Z−Leu−Leu−Val−Tyr−アミノルシフェリン又はAla−Ala−Phe−アミノルシフェリンによる1mMを作製した。各試薬を、1/10容量で独立した反復試験のプレートに加え、Me’Courの熱ジャケット水浴ホルダー中37℃で15分間温置させてから、BMG FLUOstar Optimaを用いてルミネセンス測定を行った。
HL−60細胞(25,000個/ウェル)を、透明底の白壁で仕切られた96ウェルプレート(Costar)内で5%CO2と共に37℃で7時間の経過にわたり、10μMスタウロスポリン又は適性のDMSO媒体対照により処理した。200μMのAla−Ala−Phe−AMC基質溶液を、100mMのNaアセテート、pH4.5中で作製した。10μl容量の基質(1/10容量のサンプル)をウェルに加えてさらに1時間温置した。「プロテアーゼ放出」活性を、CytoFluor II上Ex.360Em.460で測定した。平行にセットされたウェル内で、CytoTox−ONE(商標)試薬は、膜完全性アッセイ対照として作用した。この試薬を、Ex.560 Em.580で蛍光測定10分前に加えた。
プロテアーゼ放出活性のpH要件は、非調整培養培地(水媒体)と比較して、pH2.5、3.5及び4.5に調整された100mM Naアセテートを用いて調査された。Ala−Ala−Phe−AMCを、これらの緩衝液中200μMに加えた。溶液の1/10容量をプレートに加え、軌道振とうにより短時間混合した。このプレートを37℃で40分間温置してから、蛍光を、CytoFluor IIを用いてEx.360Em.460で測定した。
HL−60細胞を、1ml当り100,000個の細胞に調整し、2つのアリコットに分けた。1つのアリコットは、マイクロチップのMisonix3000を用いて3回の5秒パルスの30%出力で超音波処理した。100μlのこの溶解物(形態学的に確認された)を、透明底96ウェルプレートの複数ウェルに加え、10%FBSを有するRPMI 1640中で2倍連続希釈した。同様に、100μlの非超音波処理の細胞懸濁液を加え、プレートの複数ウェルで連続希釈した。NP−9及びジギトニンを、それぞれ最終0.2%及び30μg/mlで個別のウェルに加えた。未処理の対照は、生細胞及び適性容量の水媒体から構成された。ルシフェリン検出ケーク(Promega V859A)を、2mlの10mM Hepes、pH7.5で再水和し、Ala−Ala−Phe−アミノルシフェリン(Promega)により500μMを作製した。20μlのこのプロルミネセンスプロテアーゼ放出溶液を、全てのウェルに加えて、37℃で15分間温置させてから、BMG FLUOstar Optimaを用いてルミネセンスを測定した。
Ala−Ala−Phe−AMCを、Promegaから入手した。Z−Leu−Leu−Val−Tyr−アミノルシフェリン、Z−Leu−Arg−アミノルシフェリン、Z−Phe−Arg−アミノルシフェリン、Ala−Ala−Phe−アミノルシフェリン、(Ala−Ala−Phe)2−R110、及び(Gly−Phe)2−R110は、Promega Biosciencesにより合成された。Suc−Ala−Ala−Phe−AMC、H−Phe−AMC、H−Tyr−AMC、グルチル−Ala−Ala−Phe−AMC、H−Gly−Phe−AMC、Z−Gly−Ala−Met−AMC、Suc−Leu−Leu−Val−Tyr−AMC、D−Ala−Leu−Lys−AMC、H−Gly−Ala−AMC、H−Gly−Gly−AMC、Suc−Ala−Ala−Phe−AMC、Z−Arg−Leu−Arg−Gly−Gly−AMC、Z−Leu−Arg−Gly−Gly−AMC及びAc−Ala−Ala−Tyr−AMCは、Bachemから供給された。Gly−Phe−AFC、Pro−Phe−Arg−AMC、Gly−Gly−Leu−AMC、及びSer−Tyr−AFCは、Calbiochemから入手した。Z−Phe−Arg−AMC及びSuc−Arg−Pro−Phe−His−Leu−Leu−Val−Tyr−AMCは、Sigmaから購入した。
ジャーカット細胞を、50μl容量で1ウェル当り20,000個の密度で白壁仕切りの透明底の96ウェルプレートに接種した。アポトーシス誘導試剤rTRAIL(BioMol)の連続希釈液を、RPMI1640+10%FBSで500ng/mlから作製し、50μl容量で反復して細胞に加えた。50μl培地の添加は、媒体対照として寄与した。このプレートを、5%CO2と共に37℃で4時間温置した。Gly−Phe−AFCを、RPMI1640中1mMに希釈し、10μ容量で全てのウェルに加えた。次にプレートをMeCour’循環熱ブロックに30分間置いてから、CytoFluor IIによりEx.405Em.530で蛍光を測定した。次に、等しい容量のCellTiter−Glo(商標)試薬をウェルに加え、細胞内に残存するATP含量を、FLUOstar Optimaによるルミネセンス測定により調べた。
ダブリング活性のジャーカット細胞を、100μl容量で白壁仕切りの透明底の96ウェルプレート内で、RPMI1640+10%FBS中37,500細胞/ウェルから連続希釈した。プレートの半分の細胞を、トリトンXの添加により最終0.2%に細胞溶解した。プレートウェルの他の半分は、適性容量(5μl)の水媒体を受けた。Tyr−AMC、Phe−AMC及びGly−Phe−AFCの全てを、DMSO中100mMに再水和化してから、RPMI1640で1mMに希釈した。希釈基質の1/10容量をウェルに加え、軌道振とうにより短時間混合してから、5%CO2中37℃で1.5時間まで温置した。生じた蛍光を、30分と90分でEx.360 Em.460及びEx.405、Em.500で測定した。
ジャーカット細胞を、100μl容量で1ウェル当り20,000個の密度で白壁仕切りの透明底の96ウェルプレート内に接種した。サポニン(Sigma)を加え、短時間軌道振とうすることにより最終0.2%濃度(5μl添加)に混合し、8時間の時間経過にわたって毎時間ウェルを反復させた。この同じ時間枠内で等しい容量の10%FBSを有するRPMI1640を対照ウェルに加えた。Ala−Ala−Phe−AMCを、RPMI1640+10%FBSで500μMに希釈し、ウェルに10μl容量で加え、軌道振とうにより短時間混合してから、5%CO2中37℃で1時間温置した。生じた蛍光を、CytoFluor IIで測定した。
プロマイシン、E−64、フェニルメタンスルホニルフルオリド(PMSF)、アデノシン−5’−トリホスフェート(ATP)、N−(α−ラムノピラノシルオキシヒドロキシホスフィニル)−Leu−Trp二ナトリウム塩(ホスホラミドン)、N−[(2S,3R)−3−アミノ−2−ヒドロキシ−4−フェニルブチリル−L−ロイシン塩酸塩(ベスタチン)、1,10−フェナントロリン、3,4−ジイソクマリン、4−(2−アミノエチル)ベンゼンスルホニルフルオリド(AEBSF)、1,4−ジチオ−DL−トレイトール(DTT)、エデテート二ナトリウム二水和物(EDTA)、イソバレリル−L−バリル−L−バリル−[(3S,4S)−4−アミノ−3−ヒドロキシ−6−メチルヘプタノイル]−L−アラニル[93S,4S]−4−アミノ−3−ヒドロキシ−6−メチルヘプタン酸(ペプスタチンA)、塩化ナトリウム、アプロチニン、N−アセチル−L−ロイシル−L−ロイシル−L−アルギニナルヘミサルフェート塩(ロイペプチン)は全てSigmaから購入した。阻害剤は、溶解物又は生存細胞集団のいずれかに添加するために、Mg++又はCa++(DPBS)の無いダルベッコ燐酸緩衝生理食塩水中、200μM又は200μg/mlの高標的濃度の保存濃度を変えてDMSO中に再懸濁した。DTT、NaCl、EDTA、及びATPもまた、DPBS中に希釈した。全ての化合物を、損傷細胞又は生存細胞と共に37℃で少なくとも30分間(大部分は60分間)温置してから活性を評価した。
1.ジャーカット用量応答
ダブリング活性のジャーカット細胞を、50μl容量で1ウェル当り20,000個の密度で96ウェルプレート内に接種した。RPMIアポトーシス誘導リガンド、すなわち、1640中のrTRAILの連続希釈液を、追加の50μl容量中、250ngから244pg/mlの最終濃度で反復ウェルに加えた。RPMIのみのものは、非誘導対照として寄与した。このプレートを、5%CO2中37℃で4時間温置した。Gly−Phe−AFC及びAla−Ala−Phe−AMCを、RPMI中1mMに同時に希釈し、1/10容量でプレートに加え、さらに37℃で30分間温置した。生じた蛍光を、CytoFluor IIを用いてEx 360 Em 460及びEx 405 Em 530で測定した。蛍光測定が完了したら、CellTiter−Glo(登録商標)を等しい添加でウェルに加え、ルミネセンスを、BMG FLUOstar Optimaを用いて測定した。
SK−MEL−28又はACHN細胞を、100μl容量で1ウェル当り10,000個の密度で白壁仕切りの透明底の96ウェルプレート内に接種し、5%CO2中37℃で2時間結合させた。結合後、50μlの培地を注意深く除き、MEM+10%FBS中、イオノマイシン又はスタウロスポリンのいずれかの連続希釈で置き換えた。培地のみのものは、対照として寄与した。このプレートを、さらに5時間温置した。Gly−Phe−AFCの1mM溶液をMEM中で作製し、1/10容量でウェルに加えた。生じた蛍光を、CytoFluor IIを用いて測定した。次にCaspase−Glo(商標)3/7試薬を加えて、BMG FLUOstar Optimaを用いて蛍光測定を行った。
HeLa細胞を、100μl容量で1ウェル当り10,000個の密度で白壁仕切りの透明底の96ウェルプレート内に接種し、5%CO2中37℃で2時間結合させた。結合後、0時間、1時間、3時間、5時間、7時間、24時間の曝露時間で50μlの培地を注意深く除き、MEM+10%FBS中、50μMのタモキシフェンで置き換えた。培地のみのものは、対照として寄与した。プロテアーゼ保持及び放出試薬を、2mlの10mM Hepes、pH7.5を有するルシフェリン検出試薬ケークを再水和化することにより調製した。次にこの溶液を、Ala−Ala−Phe−アミノルシフェリン及びGly−Phe−AFC双方により500μMを作製した。この溶液の1/5容量を全てのウェルに加え、Me’Cour熱ユニット内で37℃で15分間温置した。ルミネセンスは、BMG FLUOstar Optimaにより測定し、蛍光は、CytoFluor IIを用いて測定した。
HeLa又はHepG2細胞を、100μl容量で1ウェル当り10,000個の密度で白壁仕切りの透明底の96ウェルプレート内に接種し、5%CO2中37℃で2時間結合させた。結合後、50μlの培地を注意深く除き、MEM+10%FBS中、タモキシフェン又はイオノマイシンの連続希釈で置き換えた。培地のみのものは、対照として寄与した。化合物との温置を、さらに5時間続けた。プロテアーゼ保持及び放出試薬は、2mlの10mM Hepes、pH7.5を有するルシフェリン検出試薬ケーク(Promega V859A)を再水和化することにより調製した。次にこの溶液を、Ala−Ala−Phe−アミノルシフェリン及びGly−Phe−AFC双方により500μMを作製した。この溶液の1/5容量を全てのウェルに加え、Me’Cour熱ユニット内で37℃で15分間温置した。ルミネセンスは、BMG FLUOstar Optimaにより測定し、蛍光は、CytoFluor IIを用いて測定した。次に残りの生存細胞を、0.4% NP−9界面活性剤の添加により溶解した。軌道振とう機上で短時間混合後、MEM中、PicoGreen(登録商標)(Molecular Probes)の1:20希釈液を、さらに1/10容量で加えた。DNA/色素結合に伴う蛍光は、CytoFluor IIを用いてEx.485 Em.530で測定した。
益々精巧な細胞モデル系を利用するために、薬物発見及び一次研究双方の努力が継続されている。実験操作後にこれらのインビトロ系における細胞数及び細胞生存度を測定することが絶対に必要であることは、十分に認識されている。この要件は、測定の信頼性を証明するために、又複雑な生物系の背景内でこれらの応答を正規化するために必要である。
(参考文献)
Claims (26)
- サンプル中の生細胞及び/又は死細胞を検出する方法であって、
a)サンプルを、第1のプロテアーゼのための基質及び第2のプロテアーゼのための基質に接触させ;
ここで、前記プロテアーゼの一方により媒介される前記基質の一方との反応が、蛍光発生生成物を生成し、また、他方のプロテアーゼにより媒介される他方の基質との反応が、蛍光発生生成物を生成し;
さらに基質の一方が、細胞透過性であり、他方の基質が、細胞不透過性であり;2種の基質上の蛍光体のスペクトルが異なり;及び
b)サンプル中の蛍光を検出するか、又は測定することによって、サンプル中の生細胞及び/又は死細胞の数又は存在を検出又は測定すること
を含む方法。 - 細胞透過性基質が、プロテアソーム、アミノペプチダーゼ又はカテプシンから選択されるプロテアーゼに対する基質である請求項1に記載の方法。
- 細胞不透過性基質が、トリペプチジルペプチダーゼ、カルパイン又はキモトリプシンに対する基質である請求項1に記載の方法。
- 前記サンプルが、哺乳動物細胞を含む請求項1に記載の方法。
- 前記2種の基質が、前記サンプルとの接触前に組み合わされる請求項1に記載の方法。
- 前記生細胞又は死細胞由来の分子の存在又は量を検出又は測定することをさらに含む請求項1に記載の方法。
- 前記分子が、DNA、酵素又はATPである請求項6に記載の方法。
- 前記サンプルを、細胞を溶解する条件に供することをさらに含む請求項1に記載の方法。
- 1種又は複数の試薬の細胞毒性を検出する方法であって;
a)サンプル中の細胞を1種又は複数の試薬に接触させ;
そしてその後に
b)サンプルを、第1のプロテアーゼのための基質及び第2のプロテアーゼのための基質に接触させ;
ここで、前記プロテアーゼの一方により媒介される前記基質の一方との反応が、蛍光発生生成物を生成し、また、他方のプロテアーゼにより媒介される他方の基質との反応が、蛍光発生生成物を生成し;
さらに基質の一方が、細胞透過性であり、他方の基質が、細胞不透過性であり;2種の基質上の蛍光体のスペクトルが異なり;及び
c)サンプル中の蛍光を検出するか、又は測定することによって、サンプル中の生細胞及び/又は死細胞の数又は存在を検出又は測定すること
を含む方法。 - サンプル中の生細胞を検出する方法であって、
a)サンプルを、プロテアソーム、アミノペプチダーゼ又はカテプシンから選択されるプロテアーゼに対する細胞透過性蛍光発生基質に接触させること;及び
b)サンプル中の蛍光を検出又は測定することによって、サンプル中の生細胞の数又は存在を検出又は測定すること
を含む方法。 - 前記基質が、Gly−Phe−AFC、Gly−Phe−AMC、Gly−Gly−Leu−AMC、Z−Gly−Gly−Leu−AMC、Phe−AMC、又はTyr−AMCである請求項10に記載の方法。
- サンプル中の死細胞を検出する方法であって、
a)サンプルを、トリペプチジルペプチダーゼ、カルパイン又はキモトリプシンに対する蛍光発生又はルミネセンス発生の細胞不透過性基質に接触させること;及び
b)サンプル中の蛍光又はルミネセンスを検出又は測定することによって、サンプル中の死細胞の数又は存在を検出又は測定すること
を含む方法。 - 前記基質が、Ala−Ala−Phe−AMC、(Ala−Ala−Phe)2−R110、Ala−Ala−Phe−アミノルシフェリン、Suc−Leu−Leu−Val−Tyr−AMC、又はZ−Leu−Leu−Val−Tyr−アミノルシフェリンである請求項12に記載の方法。
- 第1のプロテアーゼに対する第1の蛍光発生又はルミネセンス発生の細胞不透過性基質及び第2のプロテアーゼに対する第2の蛍光発生の細胞透過性基質を含む組成物;及び
サンプル中の生細胞及び/又は死細胞を検出する組成物の使用について使用者に指示する使用説明書を含む、請求項1−13のいずれかに記載の方法のために用いられるキット。 - 前記第1の基質が、Ala−Ala−Phe−AMC、(Ala−Ala−Phe)2−R110、又はSuc−Leu−Leu−Val−Tyr−AMCである請求項14に記載のキット。
- 前記第2の基質が、Gly−Phe−AFC、Gly−Phe−AMC、Gly−Gly−Leu−AMC、Z−Gly−Gly−Leu−AMC、Phe−AMC、又はTyr−AMCである請求項14に記載のキット。
- ルミネセンス発生反応のための1種又は複数の試薬をさらに含む請求項14に記載のキット。
- 少なくとも1種の試薬が、凍結乾燥されている請求項14に記載のキット。
- 前記組成物は、前記基質が有機溶媒中にある溶液である請求項18に記載のキット。
- 前記組成物が、更に凍結乾燥されている請求項19に記載のキット。
- 前記組成物は、前記基質濃度が、0.005Mから1Mの溶液である請求項19に記載のキット。
- Ala−Ala−Phe−AMC、(Ala−Ala−Phe)2−R110、Gly−Phe−AFC、Gly−Phe−AMC、Gly−Gly−Leu−AMC、又はそれらの任意の組合せを含む組成物を含む、請求項1−13のいずれかに記載の方法のために用いられるキット。
- 前記組成物が、溶媒を含む請求項22に記載のキット。
- Ala−Ala−Phe−AMC、(Ala−Ala−Phe)2−R110、Gly−Phe−AFC、Gly−Phe−AMC、又はGly−Gly−Leu−AMCの濃度が、0.005Mから1Mである請求項22に記載のキット。
- 第1の酵素媒介反応のための分子の存在又は量を検出する方法であって、
a)蛍光タンパク質を発現する細胞を含むサンプルを、前記第1の酵素により媒介される反応がルミネセンス発生生成物を生成する前記第1の酵素媒介反応のための反応混合物に接触させること;及び
b)サンプル中の蛍光又はルミネセンスを検出又は測定することにより、前記分子の存在又は量及びサンプル中の蛍光タンパク質の存在又は量を検出すること
を含む方法。 - 前記分子が、前記第1の酵素媒介反応における基質又は補酵素、あるいは酵素である請求項25に記載の方法。
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