CN104655596A - 一种含红细胞血液样品的质量检测方法及检测试剂盒 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种含红细胞血液样品的质量检测方法，以血液样品的非红细胞组分中的红细胞所特有的蛋白酶含量作为评价血液样品的质量的参数。还提供了一种具有荧光共振能量转移特性的蛋白酶底物，其结构式为：D-L-M；其中，D为荧光基团，L为连接基团，M为能量吸附基团；其中，所述连接基团为包括络氨酸的肽链。本发明通过检测含细胞成份液体生物样品中、非细胞成份内、属于细胞内特有的蛋白酶活性，反映样品中细胞的破裂程度；对于在取样时并无细胞破裂的新鲜样品来说，利用本发明方法能够反应样品在采集、储藏、运输过程中细胞所受到的损害；该方法对输血用血库样品质量评估具有重大意义。

Description

一种含红细胞血液样品的质量检测方法及检测试剂盒

技术领域

本发明属于生物检测领域，特别涉及一种含红细胞血液样品的质量检测方法，还涉及一种该方法使用的具有荧光共振能量转移特性的蛋白酶酶底物，还涉及一种含红细胞血液样品的质量的试剂盒。

背景技术

生物样品离体后，由于缺乏氧、养供应等必需的生存环境，自然发生腐败变质，其内部的生物分子发生降解，导致生物信息丢失、细胞功能丧失，从而影响样品的可利用价值；在医学临床工作中，样品降解可直接引发误诊、误治。

含有红细胞的血液样品是重要的生物样品，其临床使用价值在于将有携氧功能的存活红细胞回输到需血患者，适用于抢救外伤、手术等急性大出血失血量过多的危重病人以及血液置换等方面。输血具有扩充血容量以维持正常血压、协氧运输等功能。

血库是一个巨大的血液样品流动市场，具有存储血液样品以备输血需要的职能。因而，在血库存储后、血液样品使用前保持红细胞完整、健康，是样品出库时必须的质量监测指标。我国人口献血率虽然只有0.87%,低于世界卫生组织1%的警戒线，但这也意味着每年有一千万人次的献血，目前全国年用全血量约为3935吨。虽然国家卫生部对采血、用血操作有明确的规定，但是一千万人次的采血环境千差万别：有的在家中采血、有的在医院、有的在采血车里、有的甚至在路边；供血者身体健康状况、采血速度、针孔直径、运输方式等影响血液质量的因素也千差万别。这些不确定因素直接造成了血制品在冷藏前的质量已经参差不齐，而各种因素造成的红细胞损伤不同使得红细胞在冷藏过程中的耐受能力、裂解速度也不同。因而，在血制品使用前，应当对每一件血制品逐一进行质量评估，以杜绝不合格血制品输入需血者体内。

根据2012年国家卫生部制定的血站技术操作规程，目前全血及血液成分和关键物料质量检查以1％的抽样检查为标准，抽样样品中如果有75%的抽检结果落在质量控制指标范围内，可认为血液采集和制备过程受控，该血库的血液样品在配型、菌检后可直接使用。目前除了质量抽查以外，没有任何一种技术手段在输血前对每例血液制品进行个案化的质量评估，只是机械地执行1983年制定的“42天冰箱保质期”的输血原则。但是，同样是42天的血液样品，有的仍然健康可用，有的却早已变质过期。科学研究表明，陈旧血中钠、钾、氨、乳酸等代谢产物含量高，明显增加患者代谢负担，陈旧红细胞输入体内后还可造成急性溶血，红细胞破裂所释放的游离血红蛋白可造成多个器官损伤甚至衰竭，因而输入陈旧血造成的病患发病率和死亡率明显增加。最近的一项回顾性研究比较了2872例心脏病患者接受8802单位“新鲜血”与3130例接受10782单位“陈旧血（接近储存42天的血）”后的恢复过程，结果显示输“陈旧血”者留院时间延长、1年内死亡率、气管插管超过72小时、肾功能衰竭和脓毒血症的发生率增加。

现有血液样品抽样检测通常有三种方法，一是以测量红细胞破裂（即溶血）所释放的血浆游离血红蛋白为原理的溶血状态评估方法，二是以测量细胞破裂所释放的乳酸脱氢酶（LDH）为原理的溶血状态评估方法，三是以测量细胞缺养氧引起的能量储备不足导致细胞内三磷酸腺苷（ATP）下降为原理的溶血状态评估方法。其中，后两者不仅步骤繁琐，而且不能有效反映血液中红细胞状态。

而血浆游离血红蛋白是目前最为快速、经济、客观的溶血评价指标。该方法主要用以作为贫血的辅助检查，其原理是利用血红蛋白中亚铁血红素有类似过氧化物酶的作用，因而能够使邻-甲联苯胺氧化显色，呈蓝色，吸收峰在630nm处；加强酸后呈黄色，吸收峰435nm处。该方法从标准品配置、血浆分离、反应孵育，到比色调零、计算，耗时大约40分钟，收费6到15元不等。然而，该指标在西方国家已经被证明不能准确反应溶血程度，导致以其为标准评价的血液质量与输血导致的临床并发症无关。

生物样品离体后由于缺乏氧、养供给，开始发生自身降解，主要表现为细胞水肿，细胞膜通透性增加，细胞内外成分自由进出，从而激活各种自身消化的酶促反应，进一步降解细胞内外的各种分子从而完全瓦解生物组织。对于含有红细胞的血液样品来说，由于红细胞有特定的120天生存期，即使在正常人体体内，也动态地发生自身降解。因而，输血用血液样品中的红细胞在血库的保存过程中，不可避免地、自发地、渐进性地发生溶血，导致红细胞内部特有的生物分子释放到细胞外的血浆或保存液中（非细胞部分）。另外，为了缓解血液市场的供需紧张，应对突发事件，科学家新近推出了以减少红细胞溶血为唯一标准的一些延长“42天保质期”的方法，这样可以扩充血库库存、增加血液储备。但是，由于缺少辅助的质量检测手段，难以评价新方法的有效性，所以未能得到推广。

由上可见，提供一种对血液样品个体质量的准确检测方法，不但可以避免不合格血液输入患者体内，还可以缓解用血紧张的状况，具有重大意义。

蛋白酶广泛存在于生物体的各种细胞内，可以有靶向地打断氨基酸之间的肽键用以降解、清除细胞内衰老、损伤的蛋白，在回收、重新利用氨基酸代谢中发挥重要作用。在细胞的正常状态中，蛋白酶自身活性很低，必须在特定部位（如高尔基体）受到激活后，并且辅以适当浓度的金属离子才能发挥其水解肽链的活性。

蛋白酶在细胞损伤后，由于线粒体等细胞器受损导致ATP能量缺乏、细胞水肿导致膜通透性增加、溶酶体破裂等因素而被激活，从而破坏细胞内的蛋白质成份，使细胞各种生命功能失调，最终瓦解整个细胞。对红细胞而言，在血库保存期间，由于外界环境变化以及自身半衰期的影响，红细胞发生裂解，包括蛋白酶在内的红细胞内原有生物分子被释放到细胞外。与其他对细胞外环境变化敏感、在细胞外进一步降解（甚至完全消失）的生物分子（如血红蛋白等）不同，蛋白酶在被释放到细胞外后，其酶活性不但没有下降反而在金属离子的协同作用下上升，甚至完成水解目标蛋白以后，移动到下一目标蛋白，反复、循环地发挥水解功用。

申请人对红细胞内的钙蛋白酶为例的蛋白酶研究证明，其活性在室温环境下随着溶血程度增加而增加，这种趋势可以维持数周，直至血液中红细胞完全破裂。在血库的低温环境下，钙蛋白酶的活性维持时间更长，而且与溶血程度的相关性更紧密。因而，血浆或保存液等非红细胞组份中由红细胞破裂所释放的蛋白酶的含量，可以作为极好的评价输血用血液样品的溶血程度（即血液质量）的指标。

发明内容

发明目的：本发明的第一目的在于提供一种含红细胞血液样品的质量检测方法。

本发明的第二目的在于提供一种用于含红细胞血液样品的质量检测的荧光共振能量转移酶底物，所述荧光共振能量转移酶底物可用于检测蛋白酶活性，从而评价含红细胞血液样品的质量。

本发明的第三目的在于提供一种检测蛋白酶活性的试剂盒，利用该试剂盒可检测含细胞成份的液体生物样品中非细胞成份内的蛋白酶活性。

技术方案：本发明提供的一种含红细胞血液样品的质量检测方法，以血液样品的非红细胞组分中的蛋白酶含量作为评价血液样品的质量的参数。

具体而言，该含红细胞血液样品的质量检测方法包括以下步骤：将待测血液样品分离得到非细胞成分；将非细胞成分与过量的荧光共振能量转移酶底物混合反应，在荧光共振能量转移酶底物所结合的荧光基团相应的激发光波长和发射光波长下，检测荧光强度，即可检测出待测血液样品中蛋白酶含量。

其中，反应温度为20-25℃，反应时间为5-25min。

本发明还提供了一种用于含红细胞血液样品的质量检测的荧光共振能量转移酶底物，其结构式为：D-L-M；

其中，D为荧光基团，L为连接基团，M为能量吸附基团；

其中，所述连接基团为包括络氨酸的肽链。

实际上，只要具有以上结构的荧光共振能量转移酶底物即可实现本发明的目的；然而，本发明给出了几种具体的荧光共振能量转移酶底物：

其中，所述连接基团的氨基酸序列如SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2和SEQ ID NO：3所示。

其中，所述荧光基团为5-(2-氨基乙氨基)-1-萘磺酸（EDANS）、7-甲氧基香豆素-4-乙酸（MCA）或5-FAM。

其中，所述能量吸附基团为4-(对二甲氨基偶氮苯)苯甲酸（DABCYL）及其丁二酰亚胺酯、二硝基苯基(DNP)或QXL-520。

本发明提供的荧光共振能量转移酶底物可采用现有技术制备，例如可采用FMOC（9-芴甲氧羰基）保护法以固相多肽合成仪制备；其中荧光基团的标记是通过与谷氨酸侧链的羧基形成共价键相连，能量吸附基团DABCYL的丁二酰亚胺酯与谷氨酰胺的自由氨基缩合最终形成以肽键相连。

本发明还提供了一种检测蛋白酶活性的试剂盒，包括上述荧光共振能量转移酶底物。

有益效果：本发明方法通过检测含细胞成份液体生物样品中、非细胞成份内、属于细胞内特有的蛋白酶活性，反映样品中细胞的破裂程度；对于在取样时并无细胞破裂的新鲜样品来说，利用本发明方法能够反应样品在采集、储藏、运输过程中所受到的损害；该方法对输血用血库样品质量评估具有重大意义。

本发明提供的具有荧光共振能量转移特性的蛋白酶底物，能够客观的检测蛋白酶活性，准确性高、灵敏度高、速度快、应用范围广。

具体而言，将本发明提供的荧光共振能量转移酶底物应用于含红细胞血液样品的质量评估中，避免了现有单纯依靠存储时间的“一刀切”现象，具有以下突出的优势：

（1）客观。输入含红细胞的血液的主要目的是将健康的红细胞导入患者体内，增加血氧运送能力；因此，对红细胞功能的评估应当是评价此类血液制品质量好坏的客观标准；血样品离开供体后由于缺乏氧、养供给，开始发生自身降解，主要表现为红细胞水肿，细胞膜通透性增加，细胞内外成分自由进出，从而激活各种自身消化的酶促反应，进一步降解红细胞内外的各种分子（蛋白等），从而完全瓦解细胞，导致红细胞破裂(溶血)。本发明从红细胞离体后的病理变化入手，以红细胞破裂后所释放到细胞外的、红细胞胞内特有的蛋白酶在血浆（或其他非细胞成份）内的活性强弱作为检测溶血的指标。首先，这种设计是由于蛋白酶在血液样品储存条件下非常稳定，使得蛋白酶总量及其活性随着溶血程度的增加而不断增加并呈现紧密的、单边线性相关关系，从而使利用蛋白酶活性反映溶血程度（即样品质量）成为可能。同时，利用蛋白酶为观察对象，也是因为其切割肽链的功能使得利用荧光共振能量转移技术成为可能。因此，利用溶血过程中蛋白酶活性的有序变化来反应溶血程度，能够客观而便捷地评价血液样品的质量。

（2）准确。输血用血制品主要是利用其内的红细胞；红细胞有特定的生存期，平均为120天；在血库中的红细胞虽然被保存在2～10摄氏度，但由于失去氧养供应，其生存期更短。因此，红细胞在体内、采集、运输、储存过程中的任何时刻，都会有一部分在发生进行性溶血，从而导致红细胞内部特有的物质释放到细胞外的血浆或保存液中（非细胞成分）。本发明通过检测血液样品非细胞成分中红细胞内部所特有蛋白酶的含量，以评估血样的溶血程度，从而反应血样质量。由于溶血是渐进性的，而本发明所定位检测的红细胞蛋白酶在冷藏条件下具有持久的活性，因此本发明提供的荧光共振能量转移酶底物的应用方法与血样质量之间在很长一段储藏时间内（远大于42天），具有极好的动态相关性和持久的准确性。此外，本发明将非细胞成分从待测血液中分离，可使检测结果更准确。

（3）灵敏度高。目前对溶血的定性判断主要依靠显微镜观察红细胞碎片以及测量红细胞压积作为手段，其评价较为主观、影响因素多；而传统的、依靠对血液样品中游离血红蛋白含量进行检测作为溶血的定量评价手段，则因为血红蛋白在红细胞中含量巨大（占红细胞重量的1／3）、检测方法落后等因素，使得该手段不敏感，并且检测过程繁琐，其评价结果也不能与血液质量之间形成良好的动态相关关系。本发明利用溶血过程中血液中红细胞所释放的蛋白酶活性的变化来指示溶血程度，辅以敏感的荧光共振能量转移为原理的检测手段，能够敏感、量化的反应所检血液样品的质量，其精确度可以区分仅有30分钟储存时间区别的两个血库样品。

（4）速度快。现有的“42天保质期”实际上忽略了血样在从献血者自身体质到冷藏温度差异各个环节的个体性差异。本发明是以红细胞溶血后所释放的蛋白酶为检测指标，在血样回输前一刻用5分钟内对血样的质量进行终极检测，以识别血样间的个体化差异，从而快速剔除“保质期内”的不合格血样。

（5）应用广。本发明由于不破坏血样的完整性，因而还可以在“过期”血中选取质量仍然合格的血样，以扩大血库库容。也就是说，利用该底物检测血制品，一方面可以杜绝不合格血制品的使用，减少输血并发症，另一方面还可以延长相当一部分血制品的使用期，从而增加血库储备以应对突发事件。此外，蛋白酶广泛存在于生物体的各种细胞内，因此本发明对其他含有细胞成分的液态生物样品的质量评估同样有指导意义。

附图说明

图1为本发明具有荧光共振能量转移特性的酶底物的应用原理图；其中，图1（A）为具有荧光共振能量转移特性的蛋白酶底物，与未溶血的血样混合后反应，由于血样中无漏出的细胞内蛋白酶，该底物分子完整，因而在能量2激发下，虽然荧光基团D被激活，释放以荧光为表现的能量3,但由于能量吸附基团M仍然通过完整的连接肽链L与荧光基团D近距离相连，所以荧光检测装置1无法检测到荧光；图1（B）为荧光共振能量转移酶底物与发生溶血的血样混合后反应；由于红细胞破裂所释放的蛋白酶4可以水解连接肽链L，使荧光基团D和能量吸附基团M分开，使能量吸附基团M失去对荧光基团D在激发状态下所释放荧光3的遮挡作用，因而荧光检测装置1可以检测到荧光，并且荧光信号的强弱直接反应血样中蛋白酶4的含量。

图2为应用荧光共振能量转移酶底物在检测蛋白酶活性的流程图；其中图2（A）表示分离被检液体生物样品的非细胞成分；图2（B）表示将改良针头取下换成普通注射针头（详见图3说明）；图2（C）表示装有干粉态的荧光共振能量转移酶底物的针剂瓶；图2（D）表示加入纯水将荧光共振能量转移酶底物溶解；图2（E）表示将非细胞成分加入荧光共振能量转移酶底物溶液中；图2（F）表示非细胞成分加入荧光共振能量转移酶底物溶液混合；图2（G）表示蛋白酶与荧光共振能量转移酶底物进行酶促反应；图2（H）表示荧光检测体系。

图3为本发明血液样品非细胞成分分离装置的结构示意图及其使用状态图；其中，图3（A）为血液样品非细胞成分分离装置的结构示意图；图3（B）为血液样品非细胞成分分离装置的结构示意图；5为注射器，6为改良针头。

具体实施方式

下面结合附图对本发明做出进一步说明。

实施例1

荧光共振能量转移酶底物的制备是通过固相多肽合成仪完成，主要包括以下步骤：

(1)树脂与氨基酸的固定:首先，将所要合成肽链（从C’羧基端向N’氨基端）合成的羟末端氨基酸的羟基以共价键的结构同一个不溶性的高分子树脂交联聚苯乙烯相连。

(2)首个氨基酸的荧光标记：根据荧光基团性质不同，将会用到不同的标记技术，例如荧光基团EDANS(5-(2-氨基乙氨基)-1-萘磺酸)的标记是通过与谷氨酸侧链的羧基形成共价键相连。

(3)氨基酸的氨基、羧基以及侧链的保护与去保护：以FMOC（9-芴甲氧羰基）将暂时不参与肽链延长的氨基加以保护，以甲酯对羧基加以保护，同时对氨基酸侧链上的其他活性基团也加以保护。

(4)成肽反应：以结合在固相载体上的氨基酸作为氨基组份经过脱去氨基保护基并同过量的活化羧基组分反应，形成肽键以接长肽链。重复缩合、洗涤、去保护、中和及洗涤、下一轮缩合的操作，最终以不同达到所要合成的肽链。

(5)能量吸附基团的安装：根据能量吸附基团的分子特性，不同能量吸附基团以不同方式与肽链的最后一个氨基酸以共价键结合。例如与EDANS配对的DABCYL(4-[4-(二甲基氨基)苯偶氮]苯甲酸)N-丁二酰亚胺酯将与谷氨酰胺的自由氨基缩合最终形成以肽键相连的、具有荧光共振能量转移特性的蛋白酶底物。

(6)裂解及合成肽链的纯化：最后，以脱保护剂TFA(三氟乙酸)裂解、脱去侧链保护基。合成的肽链进一步的分离与纯化由高效液相色谱执行。

采用上述方法制得一批荧光共振能量转移酶底物，其结构式为：D-L-M，见表1。

表1 荧光共振能量转移酶底物

	D	L的氨基酸序列	M
				底物1	EDANS	SEQ ID NO：1	DABCYL
底物2	MCA	SEQ ID NO：2	DNP
				底物3	5-FAM	SEQ ID NO：3	QXL-520

其中：

SEQ ID NO：1为QQEVYGMMPRDK

SEQ ID NO：2为QEVYGMMPRDK

SEQ ID NO：3为QQEVYAMMPRDK

实施例2

包括荧光共振能量转移酶底物的试剂盒，包括：血液样品非细胞成分分离装置，装有荧光共振能量转移酶底物的针剂瓶，纯水，带有时间设置功能、标准曲线设置功能的荧光检测装置、荧光标准品以及使用说明书。

利用包括荧光共振能量转移酶底物的试剂盒检测血液样品，步骤如下：

（1）被检液体生物样品：任何含有红细胞的液体生物样品如血液样品，在任何时间都可以用本发明所涉及的技术进行质量评估。

（2）分离被检液体生物样品的非细胞成分：分离被检测液体生物样品的非细胞成分可采用传统的离心机分离方式，需要15分钟。为了简化分离步骤，本发明采用了如图3所示的血液样品非细胞成分分离装置，该血液样品非细胞成分分离装置为装有改良针头的注射器，改良针头内设有小于5微米微孔的滤膜。用该装置吸取被检血液样品时，由于滤膜能够阻挡红细胞（平均直径7微米）进入注射器，因而吸入注射器的即为血液样品的非细胞成分。由于所需样品极小，分离过程短于1分钟。

（3）酶底物溶液的准备：实施例1制得的荧光共振能量转移酶底物被储藏、运输于真空、避光的针剂瓶中。制备非细胞组份血的同时，荧光共振能量转移酶底物保存的针剂瓶中加入纯水将荧光共振能量转移酶底物溶解，即得。

（4）蛋白酶酶促反应：将步骤（2）制备的非细胞组份与过量的步骤（3）制备的酶底物溶液混合反应。

（5）检测：将步骤（4）的酶促反应体系与试剂盒所提供的荧光标准品置于荧光检测装置内，20-25℃反应5-25min后，检测该时间点以及5min后的时间点的对标准品和酶促反应体系荧光强度，荧光检测装置将根据酶促反应体系两次读取的荧光强度之差和制定的标准曲线计算出标准化的蛋白酶活性参数，以电子读数的形式给出被检血液样品的质量评估指数。引入了荧光标准品，从而杜绝了荧光基团自发降解对评价结果的影响。荧光标准品也使不同检测之间的系统误差降到最低。

在底物过量的条件下，蛋白酶的含量可以用蛋白酶的活性，即单位时间内所水解的底物的含量或者生成水解产物的含量来衡量。我们的研究发现细胞在腐败降解的过程中，被激活的钙蛋白酶能够将血影蛋白在其肽链特定的位置（第1176号络氨酸的羧基后方）处切割成两段。将本发明提供的荧光共振能量转移酶底物作为钙蛋白酶的底物，远远过量地与被测血样的非红细胞成分混合，酶促反应前、后分别以特定能量激发该分子上的荧光基团：如果血样样品新鲜而无红细胞破裂，则酶促反应前、后该分子未被钙蛋白酶切割而保持完整，能量激发出的荧光信号由于完全被处于近距离的吸附基团吸收，而不能被检测到；相反，如果血样陈旧，则在孵化过程中，由红细胞破裂而积累的钙蛋白酶将在荧光共振能量转移酶底物的络氨酸羧基端切割，使荧光基团和能量吸收基团之间的距离被拉大，能量吸收基团脱离其吸附的有效距离而无法继续遮挡荧光基团发出的荧光。因此，在酶促反应前、后，荧光基团在能量的激发下发射出的荧光强度将有显著差异。而且，被检血样的质量越差，其酶促反应前、后荧光强度的差距越明显。总之，荧光信号在酶促反应前、后两次检测的强度之差，直接反应出血样中钙蛋白酶的含量，并以此评价所检血样的质量。

下面给出一个更具体的实例，用于说明本发明。

库存全组份血液样品质量评价，步骤如下：

1.打开荧光检测装置电源开关预热，在于荧光检测装置相连的电脑输入血样信息或通过扫描血样条形代码获取血样信息。

2.取样：碘伏、酒精消毒盛有全组份血的塑料血袋上的输血管盲端，用本发明血液样品非细胞成分分离装置插入输血管消毒的部位，单手均匀用力吸取血液，至收集非细胞成份约0.5毫升；除去改良针头，换成普通针头，待用。

3.溶解具有荧光共振能量转移酶底物：用1毫升移液枪将450微升所提供的纯水加入装有0.1微克的荧光共振能量转移酶底物的1毫升容量的带盖针剂瓶中，以移液枪均匀吹吸10次，待用。此溶液也可于检测当天成批配置，置于暗盒室温保存。

4.酶促反应：以200微升移液枪吸取50微升步骤2所制备的非细胞成份，加入步骤3所制备的盛有已溶解荧光共振能量转移酶底物的针剂瓶中，加盖轻轻翻转针剂瓶3次；放入荧光检测装置的指定样品位置。

5.标准品：将500微升纯水以1毫升移液枪分别加入5例荧光标准品中，加盖，轻轻翻转针剂瓶3次混匀；将标准品放置于荧光检测装置的指定位置。

6.读取血液样品质量指标：荧光检测仪自动计时,检测两次度数的差值与标准品浓度制定标准曲线，荧光检测装置将根据酶促反应体系两次读取的荧光强度之差和制定的标准曲线计算出标准化的蛋白酶活性参数，以电子读数的形式给出被检血液样品的质量评估指数

7.检测结果及应用：

被检血液样品质量指数介于（0～5）：被检血制品合格，溶血程度小于99.99％的35天储存的血液样品；

被检血液样品质量指数介于（5～8），被检血制品可用，溶血程度小于99.99％的42天储存的血液样品；

被检血液样品质量指数大于8,被检血制品不可用，溶血程度大于42天存储的血液样品。

更具体的利用本发明提供的三种底物，分别测定相同血液样品，结果见表2。

结果显示：底物1-3均可用于检测血液样品质量，特别是底物1具有相对其他两种底物更为稳定的、反应蛋白酶活性的功能，并且具有更好的动量范围。被检血液制品质量指数为4，介于0～5之间，血液制品合格，可以使用。

表2 本发明提供的三种底物分别测定相同血液样品结果

Claims (8)

1.一种含红细胞血液样品的质量检测方法，其特征在于：以血液样品的非红细胞组分中的蛋白酶含量作为评价血液样品的质量的参数。

2.根据权利要求1所述的一种含红细胞血液样品的质量检测方法，其特征在于：包括以下步骤：将待测血液样品分离得到非细胞成分；将非细胞成分与过量的荧光共振能量转移酶底物混合反应，在荧光共振能量转移酶底物所结合的荧光基团相应的激发光波长和发射光波长下，检测荧光强度，即可检测出待测血液样品中蛋白酶含量。

3.根据权利要求2所述的一种含红细胞血液样品的质量检测方法，其特征在于：反应温度为20-25℃，反应时间为5-25min。

4.一种用于含红细胞血液样品的质量检测的荧光共振能量转移酶底物，其结构式为：

D-L-M；

其中，D为荧光基团，L为连接基团，M为能量吸附基团；

其中，所述连接基团为包括络氨酸的肽链。

5.根据权利要求4所述的一种荧光共振能量转移酶底物，其特征在于：所述连接基团的氨基酸序列如SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2和SEQ ID NO：3所示。

6.根据权利要求4所述的一种荧光共振能量转移酶底物，其特征在于：所述荧光基团为5-(2-氨基乙氨基)-1-萘磺酸（EDANS）、7-甲氧基香豆素-4-乙酸（MCA）或5-FAM。

7.根据权利要求4所述的一种荧光共振能量转移酶底物，其特征在于：所述能量吸附基团为4-(对二甲氨基偶氮苯)苯甲酸（DABCYL）及其丁二酰亚胺酯、二硝基苯基(DNP)或QXL-520。

8.一种检测蛋白酶活性的试剂盒，其特征在于：包括权利要求4至7任一项所述的荧光共振能量转移酶底物。