CN112745374A - 一种血液样本质量评估方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了如SEQ ID NO:1‑4所示的多肽分子，及荧光标记的多肽，并提供了它们的应用。本发明还提供了评估血液样品质量的方法，以血液样品中的蛋白酶活性作为评价血液样品的质量参数，以上述多肽分子或荧光标记的多肽作为蛋白酶底物，检测蛋白酶的活性。本发明有助于提高在科学研究、临床医学、生物样本库等领域中应用的血液样本的质量，避免由于样本质量下降导致的实验室或临床医疗数据错误。

Description

一种血液样本质量评估方法
技术领域
本发明属于生物检测领域，具体涉及一种多肽分子及其荧光标记物。本发明还涉及通过所述多肽分子评估血液样品质量的方法，所述方法包括向样品中添加荧光标记多肽和荧光淬灭剂、通过检测荧光在一定时间内的连续变化获得样品中天然蛋白酶活性的技术，也包括通过该技术测定血液样品中蛋白酶活性的值、比较测定值与标准新鲜血液样品参照值的差异、评估被测血液样品的质量。
背景技术
血浆和血清样品是临床信息的重要来源。来自血液样本的分子指标和生物标志物被广泛用于非侵入性疾病诊断、早期筛查、预后监控、健康体检等医学领域。但是，血液是高度动态性的样本。如果不能妥善的操作，在采集、存储、运输等“分析前”阶段，血样中的成分就有可能发生显著变化，为后续科学研究和临床应用带来难以预料的误差。目前，对血液样品的标准操作流程(standard operation procedure,SOP)已经形成一些普遍共识，如：减少离体后全血放置时间、尽量避免血样暴露于室温、减少血液的非冷冻保存期、长期存储的血样需要冷冻在-80℃冰箱或液氮环境、尽量保持血液存储温度恒定、避免反复冻融血样等等。在“分析前”阶段，充分执行这些SOP，能有效的减少由于样本自身变质导致的分析结果误差。
但是，当一名分析人员拿到不同渠道来源的样品时，往往很难知道这些样品在之前的流程中是否有效的遵循了SOP，也很难知道结果中的差异是来自患者的生理状态、还是来自分析前样品变质导致的。因此，如果找到一些血液中的指标，能够在不同的“分析前”操作条件下发生显著性改变，同时，又不受一般的生理状态的影响，就能够通过这些指标来探知未知血样在“分析前”阶段是否有效的遵循了SOP，明确被保存或传递的血液样品的质量是否满足临床应用或科学研究的标准，并在复杂的正式分析和数据处理之前来剔除低质量样品。
根据目前血液样本采集和存储的标准SOP，我们可以发现，正确的“分析前”操作的关键是“血液样本处理和存储的时间和温度”。因此，血液中那些依赖时间或温度而发生持续性变化的分子或参数，就有可能作为评估“分析前”操作和样品质量的指标。目前，已有一些实验室方法可用来评估血液样品由于“分析前”操作导致的质量变化，这些方法大多根据样本中某种特定组成分子的含量变化情况来评估样品的分析前操作和质量优劣，常见的目标分子包括样品中的特定蛋白质、多肽、代谢小分子、DNA或RNA。但是，这些已建立的方法目前仍处于小规模验证或实验室使用阶段，并未在医院、生物样本库等一线机构进行推广或应用。几个关键性的因素影响了上述方法的大规模应用：第一，对上述血液中指标分子的定量分析往往需求昂贵复杂的大型仪器设备，如蛋白质和多肽的分析多用MALDI-TOF质谱仪或液相色谱-ESI质谱联用仪；代谢小分子分析主要采用核磁共振、液相色谱-质谱联用或气相色谱-质谱联用；DNA和RNA的定量研究则要求具备荧光定量PCR等设备。这些仪器不仅价格昂贵，并且操作复杂，往往需要专业的维护与运行管理人员。许多大规模应用临床样本的一线机构往往并不具备这样的条件。第二，上述方法所测试的分子指标均为血液样品中的内源分子，其含量不可避免受到样品捐赠者生理状态的影响。疾病、生理和心理状态的波动、甚至饮食习惯都有可能显著影响这些血液分子的水平。因此，要广泛应用这些潜在的分子指标来评估样品的质量，必须使用不同来源和不同状态的样本对被发现的指标进行深入的验证。这进一步提高了样本质量标志物应用的门槛。第三，用来监控样本质量的分子指标需要具有比较适中的稳定性，这样才能通过其在一段时间内的稳定持续变化来获知其暴露温度与时间的信息；从这个角度看，小分子代谢物和DNA往往过于稳定，受温度影响较小；而RNA又过于敏感，短时间内就会降解。因此，如能发展一种简便易行、可靠性高的血液样本质量评估方法，将有利于血液标准化操作流程和质量控制标准在临床机构的推广，对血液样本在临床和科研机构的规范使用、提升相关临床数据的准确性与可靠性具有重要意义。
蛋白水解酶是广泛存在于血液样品(血浆或血清)中的一种蛋白质分子。这些蛋白酶往往由血样采集过程中活化、死亡或裂解的血细胞(包括粒细胞、巨噬细胞、红细胞等)所释放、然后进入血浆或血清。在合适的条件下，这些蛋白酶能持续性的催化降解血液样品中的蛋白质和多肽分子。蛋白酶的催化活性来源于其复杂的分子结构，包括酶分子上的底物结合位点和相邻的活性中心。一旦其分子结构遭到破坏，则蛋白酶的活性也将被破坏。已有的研究表明，蛋白酶的催化活性和结构完整性的保持容易受到环境因素的影响。当血液样本被冷冻保存于低温环境中时，蛋白酶结构保持完整，其活性能够保持较长时间；当血液样本长时间暴露于较高温度时，由于蛋白质的变性、团聚、或被其他蛋白酶酶促降解等原因，蛋白酶分子的精细催化结构很容易被破坏、进而导致其失活。因此，被存储的血液样本中蛋白酶总体活性的变化与环境的温度及在高温下暴露的时间直接相关；根据血样中蛋白酶的总体活性的变化，有可能对血样在“分析前”流程中所暴露的环境温度和暴露时间进行回溯，并评估样品在“分析前”操作中是否执行了合理的规程或保持了较高的质量。
发明内容
为了克服现有技术的不足，本发明提供了一种多肽分子，其作为蛋白酶底物可用于检测血液样品中蛋白酶活性，还相应提供了所述多肽分子的用途，以及使用所述多肽分子来评估血液样品质量的方法。
所述方法利用荧光标记的多肽分子作为蛋白酶底物，利用氧化石墨烯(GO)作为荧光淬灭剂，基于GO对荧光分子的荧光共振能量转移性质，来测定血液样品中天然蛋白水解酶活性。其基本原理为：当荧光标记的多肽分子片段比较完整时，会通过疏水相互作用吸附在GO表面，其所发射的荧光被GO所淬灭，溶液中的荧光强度保持在较低水平。当这两种分子被加入到含有蛋白水解酶的样品(如血浆)时，多肽分子被蛋白酶水解为较小的片段或氨基酸，不再能够被吸附在GO表面，荧光基团所在的片段从GO表面脱落，荧光不再能够被淬灭，使溶液体系中的荧光强度逐渐上升。荧光强度上升的程度和速度与样品中蛋白酶的总体活性具有直接相关性，从而能够通过荧光的增强情况获得蛋白酶总体活性的信息。
因此，在本发明的第一方面，提供了一种多肽分子，所述多肽分子的氨基酸序列如以下所示：
TATSEYQTFFNPR(SEQ ID NO:1)；
DKSKLKKTETQEKNPLP(SEQ ID NO:2)；
SSSYSKQFTSSTSYNRGDSTFESKSYKMA(SEQ ID NO:3)或
SSSYSKQFTSSTSYNRGDSTFESKSYKM(SEQ ID NO:4)。
另外，将SEQ ID No:1-4所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的保守的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的蛋白质也在本发明的保护范围中。
在本发明的一个具体实施方案中，所述多肽分子为血液样品中蛋白酶的底物。
在本发明的另一实施方案中，还提供了一种荧光标记的多肽，其结构式为P-F，其中P为上述SEQ ID No:1-4所示的多肽分子，F为荧光基团，二者通过共价键连接；
优选地，所述荧光基团为5-(2-氨基乙氨基)-1-萘磺酸(EDANS)、7-甲氧基香豆素-4-乙酸(MCA)、5-FAM或罗丹明。
本发明的荧光标记多肽可采用任何已有的可用多肽合成技术制备，例如可采用FMOC保护法以固相多肽合成仪制备。荧光基团则可链接在多肽的N端或C端。
在本发明的另一实施方案中，还提供了一种试剂盒，所述试剂盒包括上述的荧光标记的多肽，以及荧光淬灭剂，优选地所述荧光淬灭剂为氧化石墨烯。
在本发明的第二方面，提供了所述多肽分子或所述荧光标记的多肽在检测血液样品中蛋白酶活性的用途。
在本发明的一个实施方案中，还提供了所述多肽分子或所述荧光标记的多肽在评估血液样品质量中的用途。
在本发明的一个具体实施方案中，所述血液样品为不含血细胞的血液样品，优选为血清或血浆。
在本发明的最后一个方面，本发明还提供了一种评估血液样品质量的方法，其中，以血液样品中的蛋白酶活性作为评价血液样品的质量参数，以所述多肽分子或所述荧光标记的多肽作为蛋白酶底物，检测蛋白酶的活性。
在本发明的一个具体实施方案中，所述方法包括以下步骤：将待测血液样品与过量的荧光标记的多肽和荧光淬灭剂混合反应，在荧光标记的多肽的荧光基团的特征激发光波长下，检测荧光强度，即可检测出待测血液样品中蛋白酶活性。
在本发明的一个具体实施方案中，所述反应温度为20℃-40℃，反应时间为1-60分钟。
在本发明的一个具体实施方案中，所述方法的具体操作步骤为：
1)将一定量的荧光标记的多肽溶液与荧光淬灭剂溶液混合；
2)将上述混合溶液加入到待测的血浆或血清中，立即开始在20-40℃的恒温下开始孵育；同时，在荧光标记多肽的荧光团的特征激发光波长下，开始监测该荧光团的特征波长发射光的强度变化，监测时长1-60分钟。
3)获得荧光强度读值随时间变化的曲线，在荧光强度线性变化的范围内，荧光强度的改变量ΔFL与时间的长度ΔT的比值即代表蛋白酶活性的指标参数A。
A＝ΔFL/ΔT
4)异常血液样品的判定标准：
血液样本采样时设置有标准对照组时：(该标准对照组的设置标准为：血液样本自采样离开生物体后，在短时间内立即进行离心分离血细胞处理，且这一过程始终保持在0℃-4℃环境下，且从采样到测试时间小于12个小时。对照组内样本数量≥10。)以酶活性指标参数A在对照组样本均值加减三倍标准偏差为判断值。单个样本的酶活性参数A超过该判读值范围的，该样本即可视为异常样本，应在后续实验中排除。
在不具有对照组时：以每组样本内酶活性A的均值加减两倍标准偏差为判断值，单个样本A值超过该范围的，该样本即可视为异常样本；单组内有三分之一样本偏离该范围的，该组样本整体被视为不合格样品。
本发明的意义和优点在于：
血清和血浆等临床样品是医疗领域的关键材料。高质量的临床样本对于获取准确的患者信息、进行疾病诊断、预后评估、健康筛查等都具有决定性的重要意义。同时，这些临床样品也是生物医学等科研领域的重要材料，每年都有大量的经费和人力物力投入相关科研领域以求获得人类健康领域的重大进步，生物样品的质量同样决定了能否获得准确和有意义的科研数据与结论。开发一种准确、方便、成本低廉、分析通量高、容易推广的血液样品质量评估工具，对于提升医疗服务质量、提高相关领域科研水平、促进医学研究进步、减少人力物力资源浪费等都有重要的价值。相比目前常见的实验室样品质量评估方法，本方法具有以下优点：
1)方法简便、成本低廉、易于推广。已有的样品质量评估手段多需要复杂的大型仪器设备，如质谱仪、液相色谱-质谱联用仪、核磁共振、荧光定量PCR等。这些仪器不仅价格昂贵，并且操作复杂，往往需要专业的维护与运行管理人员。许多大规模应用临床样本的一线机构往往并不具备这样的条件。本发明提供的方法仅需要普通的荧光光度计即可完成全部的分析测试工作。荧光光谱是医院检验科等机构常见的低成本设备，使用也很简单，这大大降低了血液样品质控工作的门槛。
2)已有的方法多通过测定样品中内源性分子的改变来评估样品质量的变化，但内源性物质易受到样品供体生理状态的影响，影响了方法的广泛应用。本发明提供的方法测定的是标准添加到样品中的荧光标记多肽的变化。外源性分子不会受到生理状态影响，测定标准和质量的判读依据更易于统一和标准化。
3)血液中蛋白酶作为一种蛋白质，其稳定性比较适中，既不会像RNA那样迅速降解，也不会像小分子代谢物在较长的时间内保持稳定。同时，血液中的蛋白酶种类不止一种，总体蛋白酶活性受到的影响因素比较多。因此，在不利的存储条件下(如室温放置)暴露一定时间，蛋白酶活性所发生的变化是逐步和渐进的。有可能通过蛋白酶活性在一段时间内的稳定持续变化来获知样品暴露温度与时间的信息。
附图说明
从下面结合附图的详细描述中，本发明的上述特征和优点将更明显，其中：
图1显示了本方法测定血液样品中蛋白水解酶活性的原理图。在与样品中的蛋白水解酶作用之前，荧光标记的多肽分子片段比较完整，会通过疏水相互作用等分子间相互作用力吸附在GO表面。由于GO特殊的共轭大∏键结构，能够通过“荧光共振能量转移(FRET)”效应广泛的吸收和淬灭较宽波长范围的荧光，因此，被吸附在GO表面、距离GO很近的荧光团所发射的荧光被淬灭，溶液中的荧光强度保持在较低水平。当溶液中(如血浆样品)存在具有活性的蛋白水解酶时，多肽分子被蛋白酶水解为较小的片段或氨基酸，其与GO的分子间作用力减弱，不再能够被吸附在GO表面，因而荧光基团也随之从GO表面脱落。由于荧光团与GO的分子间距离增加，FRET效应不再起作用，荧光团能够重新发射荧光，使溶液体系中的荧光强度逐渐上升。荧光强度上升的程度和速度与样品中蛋白酶的总体活性具有直接相关性，从而能够利用该方法获得蛋白酶总体活性的信息。
图2显示了将一定浓度GO和荧光标记多肽分别添加在血浆和磷酸缓冲溶液(PBS)中，血浆和PBS溶液中荧光强度随时间的变化。
图3显示了血浆样品的存储温度对血浆中蛋白水解酶活性的影响，其中，曲线的斜率代表荧光多肽被蛋白酶水解的速度，即相关蛋白酶的活性。具体地，将同一个血浆样品在不同温度下(25℃、4℃、-80℃)存储一天之后，分别加入荧光多肽及GO，立即在37℃下连续监测体系在0.5小时之内的荧光变化。用不同温度下样品的荧光强度值对时间作图。
图4显示了血浆样品存储温度和时间对其中蛋白酶活性的影响。
图5显示了血浆样品的存储温度对血浆中蛋白水解酶活性的影响。其中，使用SEQID NO:1作为蛋白酶底物，在适宜条件下被血浆中蛋白酶逐渐水解、造成体系荧光强度上升，证明了SEQ ID NO:1多肽序列可做为血浆蛋白酶的底物应用于酶活测定。
图6显示了血浆样品的存储温度对血浆中蛋白水解酶活性的影响。其中，使用SEQID NO:3作为蛋白酶底物，在适宜条件下被血浆中蛋白酶逐渐水解、造成体系荧光强度上升，证明了SEQ ID NO:3多肽序列可做为血浆蛋白酶的底物应用于酶活测定。
具体实施方式
下面参照具体的实施例进一步描述本发明，但是本领域技术人员应该理解，以下的实施例便于更好的理解本发明，本发明并不限于这些具体的实施例。
以下实施例中的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的实验材料如无特殊说明，均为常规生化试剂，可通过商业途径购买得到。
实施例1：
通过添加氧化石墨烯(GO)和荧光标记多肽测定血浆蛋白酶活性的可行性分析。步骤如下：
1)GO用纯水配制成5mg/mL的溶液。荧光标记多肽为：荧光基团MCA标记在N端的肽段DKSKLKKTETQEKNPLP(SEQ ID NO:2)。用pH7.4的磷酸缓冲溶液(PBS)将荧光标记多肽配制成5mg/mL的溶液。
2)取健康人的血浆样本110μL，加入2.3μL的GO溶液和2.3μL的荧光多肽溶液。同时取110μL的PBS，加入2.3μL的GO溶液和2.3μL的荧光多肽溶液，作为阴性对照。上述溶液均置于荧光专用96孔板中。
3)立即将96孔板放入多功能酶标仪(Perkin Elmer公司，型号EnSpire)，37℃孵育，同时开始监测激发光波长328nm、发射波长395nm处的荧光发射强度。
4)分别记录0、2、22、45小时处的荧光发射强度。绘制荧光强度随时间变化的曲线，如图2所示。
结果显示，在PBS中放置一定时间，溶液荧光强度始终保持在较低水平且维持不变；与PBS不同，血浆的存在确实会引起荧光信号在放置一定时间后显著性增强。这一结果说明血浆中的确存在着能够使肽段断裂，进而导致荧光强度增强的物质(能水解多肽的水解酶)，并且这种增强与放置时间具有一定相关性。
实施例2
验证血浆中蛋白酶的活性对血浆样品存储温度的反映。步骤如下：
1)取五个新鲜的血浆样本，等体积混合成一个混合血浆样本。
2)取三只1.5mL的EP管，分别加入150μL的混合血浆，分别标记为1、2、3号样品。1号样品放置于25℃恒温加热器中；2号样品放置于4℃冷藏冰箱中；3号样品放置于-80℃超低温冰箱中。存储时间均为24小时。
3)GO用水配制成5mg/mL的溶液。荧光标记多肽为：荧光基团MCA标记在N端的肽段DKSKLKKTETQEKNPLP(SEQ ID NO:2)。用pH 7.4的磷酸缓冲溶液(PBS)将荧光标记多肽配制成5mg/mL的溶液。
4)3个血浆样本存储24小时后，分别向其中加入3μL的GO和荧光多肽溶液。并置于荧光专用96孔板中。
5)立即将96孔板放入多功能酶标仪(Perkin Elmer公司，型号EnSpire)，37℃孵育，同时开始连续监测激发光波长328nm、发射波长395nm处的荧光发射强度。孵育/监测时间30分钟。绘制不同温度下存储的样品的荧光强度随时间变化的曲线，如附图3所示。曲线的斜率代表荧光多肽被蛋白酶水解的速度，即相关蛋白酶的活性。
结果表明，初始新鲜血浆在加入荧光多肽及GO后，荧光强度很快开始上升，说明血浆中存在活性较强的蛋白水解酶。-80℃下存储一天的血浆，荧光变化趋势与新鲜血浆类似，说明低温冷冻存储的血浆中蛋白酶活性保持较好。该条件也是血浆样品比较适宜的规范保存条件。相比之下，4℃存储的血浆，荧光增加的速度大大降低，说明在冷藏非冷冻条件下存储一天，蛋白酶活性已大为下降。而25℃下存储一天的血浆，其中的蛋白酶几乎无法再水解多肽进而引起荧光上升，活性几乎完全消失。这一实验结果证明，血浆中蛋白水解酶的活性受到存储温度的直接影响，通过测定蛋白酶活性，能够反映样品之前的存储温度是否适宜。
实施例3
验证血浆中蛋白酶的活性对血浆样品存储温度和存储时间的反映。步骤如下：
1)取五个新鲜的血浆样本，等体积混合成一个混合血浆样本。
2)取十只1.5mL的EP管，分别加入150μL的混合血浆，分别标记为0、1、2、3、4、5、6、7、8、9号样品。其中1-3号样品放置于25℃恒温加热器中；4-6号样品放置于4℃冷藏冰箱中；7-9号样品放置于-80℃超低温冰箱中。存储时间：1、4、7号样品分别存储24小时；2、5、8号样品分别存储48小时；3、6、9号样品分别存储6天。0号样品不经存储，新鲜状态下直接测试。
3)GO用水配制成5mg/mL的溶液。荧光标记多肽为：荧光基团MCA标记在N端的肽段DKSKLKKTETQEKNPLP(SEQ ID NO:2)，用pH 7.4的磷酸缓冲溶液(PBS)将荧光标记多肽配制成5mg/mL的溶液。
4)将10个血浆样本按照2)中的条件处理完成后，分别向其中加入3μL的GO和荧光多肽溶液。并置于荧光专用96孔板中。
5)立即将96孔板放入多功能酶标仪(Perkin Elmer公司，型号EnSpire)，37℃孵育，同时开始连续监测激发光波长328nm、发射波长395nm处的荧光发射强度。孵育/监测时间30分钟。绘制不同条件下处理的样品的荧光强度随时间变化的曲线，进而获得这些血浆样品的总体蛋白酶活性指标(即荧光在0.5小时内随时间变化的曲线斜率)。
6)所有条件下血浆样本的酶活性指标采集完成后，用酶活性值(荧光变化曲线斜率)对样品的存储时间作图(附图4)。
结果表明，-80℃下存储的血浆，其中的蛋白酶活性始终保持较好。4℃存储的血浆，蛋白酶活性会随着存储时间逐渐下降，在4-5天之后降到0以下。而25℃下存储的血浆，其蛋白酶活性则快速下降，一天之后就会迅速下降到0以下。我们可以看出，蛋白酶活性的这一变化趋势与血浆存储条件的规范性存在直接相关性。在最适宜的血浆保存条件下(-80℃冷冻存储)，蛋白酶活性也保存较好。在4℃条件下，血浆能够存储一定时间(7天以内)，但长期存储在此条件下的血浆仍然会发生变质。而在不适宜的血浆存储条件下(25℃)，蛋白酶活性也会迅速消失。这一结果表明，血浆中的蛋白酶活性与血浆的存储条件或血浆的整体质量存在直接相关性，能够利用GO/荧光多肽法测定的蛋白酶活性来评估血浆的存储条件的规范性和血浆质量。
实施例4
以SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:3作为血液蛋白酶的底物，来测定血液中特定蛋白酶活性。步骤如下：
1)取20个新鲜的血浆样本，并将每个样本分别分装，每管150μL血浆。
2)GO用水配制成5mg/mL的溶液。荧光标记多肽分别为：荧光基团MCA标记在N端的肽段TATSEYQTFFNPR(SEQ ID NO:1)、和荧光基团MCA标记在N端的肽段SSSYSKQFTSSTSYNRGDSTFESKSYKMA(SEQ ID NO:3)。用pH 7.4的磷酸缓冲溶液(PBS)将荧光标记多肽配制成5mg/mL的溶液。
3)每个血浆样本分别取6个分装副本，分别向每管中加入3μL的GO和荧光多肽SEQID NO:1，立即冷冻保存在-80℃冰箱，并分别在存储后的0、1、2、3、4、15天取出其中1个副本，融化样本并混匀后读取激发光波长328nm、发射波长395nm处的荧光发射强度；
每个样本分别取6个分装副本，分别向每管中加入3μL的GO和荧光多肽SEQ ID NO:1，立即保存在4℃冰箱，并分别在存储后的0、1、2、3、4、15天取出其中1个副本，混匀后读取激发光波长328nm、发射波长395nm处的荧光发射强度；
每个样本分别取6个分装副本，分别向每管中加入3μL的GO和荧光多肽SEQ ID NO:1，立即保存在密封的25℃恒温器中，并分别在存储后的0、1、2、3、4、15天取出其中1个副本，混匀后读取激发光波长328nm、发射波长395nm处的荧光发射强度；
将上述读取的每个样本的荧光强度数据对存储时间作图，结果如附图5所示。
4)每个血浆样本分别取6个分装副本，分别向每管中加入3μL的GO和荧光多肽SEQID NO:3，立即冷冻保存在-80℃冰箱，并分别在存储后的0、1、2、3、4、15天取出其中1个副本，融化样本并混匀后读取激发光波长328nm、发射波长395nm处的荧光发射强度；
每个样本分别取6个分装副本，分别向每管中加入3μL的GO和荧光多肽SEQ ID NO:3，立即保存在4℃冰箱，并分别在存储后的0、1、2、3、4、15天取出其中1个副本，混匀后读取激发光波长328nm、发射波长395nm处的荧光发射强度；
每个样本分别取6个分装副本，分别向每管中加入3μL的GO和荧光多肽SEQ ID NO:3，立即保存在密封的25℃恒温器中，并分别在存储后的0、1、2、3、4、15天取出其中1个副本，混匀后读取激发光波长328nm、发射波长395nm处的荧光发射强度；
将上述读取的每个样本的荧光强度数据对存储时间作图，结果如附图6所示。
图5和图6结果表明，在不适宜酶促反应进行的条件下，如-80℃，体系的荧光强度始终稳定保持在较低水平。而在酶促反应能够进行的条件下，如25℃和4℃下，体系的荧光强度均会逐渐上升，证明这两个多肽能够被血浆中的蛋白酶逐渐水解，是适合的蛋白水解酶底物，能够用于酶活测定和血浆质量监控测试。SEQ ID NO:4的结构与SEQ ID NO:3极为接近，其也具有同样的效果。
以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，根据本发明的技术方案及其发明构思加以等同替换或改变，都应涵盖在本发明的保护范围之内。
Figure IDA0002255283930000011

Claims (10)

1.一种多肽分子，其氨基酸序列如SEQ ID NO:1-4所示。
2.根据权利要求1所述的多肽分子，其特征在于，所述多肽分子为血液样品中蛋白酶的底物。
3.一种荧光标记的多肽，其结构式为P-F，其中P为如权利要求1所述的多肽分子，F为荧光基团，二者通过共价键连接；
优选地，所述荧光基团为5-(2-氨基乙氨基)-1-萘磺酸(EDANS)、7-甲氧基香豆素-4-乙酸(MCA)、5-FAM或罗丹明。
4.一种试剂盒，其包括权利要求3所述的荧光标记的多肽和荧光淬灭剂，优选地所述荧光淬灭剂为氧化石墨烯。
5.权利要求1-2所述的多肽分子或权利要求3所述的荧光标记的多肽在检测血液样品中蛋白酶活性的用途。
6.权利要求1-2所述的多肽分子或权利要求3所述的荧光标记的多肽在评估血液样品质量中的用途。
7.根据权利要求6所述的用途，其中，所述血液样品为不含血细胞的血液样品，优选为血清或血浆。
8.评估血液样品质量的方法，其特征在于，以血液样品中的蛋白酶活性作为评价血液样品的质量参数，以权利要求1-2所述的多肽分子或权利要求3所述的荧光标记的多肽作为蛋白酶底物，检测蛋白酶的活性。
9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，包括以下步骤：将待测血液样品与过量的权利要求3所述的荧光标记的多肽和荧光淬灭剂混合反应，在荧光标记的多肽的荧光基团的特征激发光波长下，检测荧光强度，即可检测出待测血液样品中蛋白酶活性。
10.根据权利要求9所述的方法，其特征在于，反应温度为20℃-40℃，反应时间为1-60分钟。
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