-
Bei
der Erfindung handelt es sich um eine Methode zum direkten Nachweis
der Veränderung
eines Moleküls,
das einen Fluoreszenz-Farbstoff trägt, mittels Messung der Fluoreszenz-Lebenszeit.
-
Einführung in
Fluoreszenz-Spektroskopie
-
Alle
Vorgänge,
die beim Übergang
eines angeregten Moleküls
in dessen energetischen Grundzustand mit einer Emission von Strahlung
einhergehen, werden als Lumineszenz bezeichnet und allgemein in
Fluoreszenz und Phosphoreszenz unterteilt. Daneben kann die Anregungsenergie
durch verschiedene nichtstrahlende Prozesse abgegeben werden.
-
Fluoreszenz
tritt beim Übergang
vom niedrigsten Schwingungsniveau des angeregten Singulettzustandes
S1 in ein Schwingungsniveau des Singulettgrundzustandes
S0 auf. Die Übergangsrate kf liegt
im Bereich von 107 bis 1012 s-1. Die Fluoreszenzanregung erfolgt bei einer
geringeren Wellenlänge,
als die Fluoreszenzemission, da zwischen Aufnahme und Abgabe der
Strahlungsenergie Energie durch strahlungslose Prozesse verloren
geht.
-
Die
Fluoreszenz-Lebensdauer (FLT) ist ein Maß für die Zeit, die ein Molekül im Mittel
im angeregten Zustand verweilt, ehe die Fluoreszenz-Emission erfolgt.
Die Strahlungslebensdauer τ
f entspricht der inversen Fluoreszenz-Übergangsrate
k
f. Im Gegensatz zu dieser Strahlungslebensdauer
angeregter Moleküle
müssen für eine Betrachtung
der tatsächlichen – messbaren – FLT τ der angeregten
Moleküle
die strahlungslosen Prozesse mit einbezogen werden:
mit k
ic =
Rate für Übergänge zwischen
Schwingungszuständen,
k
isc = Rate für Übergänge in Triplett-Zustände, k
Q = Quench-Rate. Daraus wird u.a. ersichtlich,
dass ein Fluoreszenz-Quencher die FLT erniedrigt. Eine ähnliche
Wirkung entfalten sogenannte Akzeptor-Farbstoffe, die die Anregungsenergie
des Donor-Farbstoffes strahlungslos in einem Resonanz-Phänomen aufnehmen
und die aufgenommene Energie entweder strahlungslos oder als Fluoreszenz
abgeben. Dadurch wird die FLT des Donor-Farbstoffes ebenfalls erniedrigt.
-
Methoden zur Messung der
Fluoreszenzlebensdauer (FLT)
-
Zwei
grundsätzlich
unterschiedliche Methoden werden zur Messung der FLT angewandt:
Messungen in der Zeit-Domäne
(TD) und Messungen in der Frequenz-Domäne (FD).
-
In
der TD-FLT wird die Probe mit einem kurzen Lichtpuls angeregt und
die Fluoreszenzabklingkurve gemessen. Grundsätzlich kann man entweder für jeden
Blitz die komplette Abklingkurve aufnehmen. Dazu ist aber ein hochzeitauflösender Transientenrekorder
nötig mit
einer Bandbreite im Giga-Hertz-Bereich. In den meisten Fällen wird
aber die sogenannte „Time
correlated single photon counting"(TCSPC)-Methode angewandt. TCSPC ist
eine digitale Technik, die Photonen zählt, die zeitlich mit dem Anregungspuls
korrelieren. Bei diesem Verfahren beginnt das Experiment mit einem
Arregungspuls, der die Probe anregt und eine sehr schnelle Uhr startet.
Sobald das erste emittierte Fluoreszenz-Photon am Detektor ankommt,
stoppt die Uhr und die Zeit wird abgespeichert. Dieser Vorgang wiederholt
sich vielfach. Da der Prozess der Fluoreszenzemission ein statistischer
Vorgang ist, erhält
man unterschiedliche Zeiten. Trägt
man die Häufigkeit
dieser Messzeiten gegen die Messzeit auf, so erhält man eine Fluoreszenz-Abklingkurve,
deren Zeitkonstante die FLT ist (s. 1).
-
Die
Alternative zu FLT-Messungen in der Zeitdomäne sind Messungen in der Frequenz-Domäne, die auch
phasenmoduliert genannt werden. Die Probe wird mit einem kontinuierlichen
Laser angeregt, dessen Lichtintensität mit einer Sinuskurve moduliert
wird. Üblicherweise
werden Frequenzen in der Größenordnung der
Fluoreszenzübergangsraten
verwendet. Wenn ein Fluoreszenzfarbstoff derart angeregt wird, so
wird die Emission gezwungen, dieser Modulation zu folgen. Je nach
FLT wird die Emission relativ zur Anregung verzögert. Diese Verzögerung wird
als Phasenverschiebung gemessen, aus der die FLT berechnet werden
kann. Außerdem
nimmt die maximale Differenz zwischen dem Maximum und Minimum des
modulierten Emissionssignals mit zunehmender FLT ab, so dass die
FLT auch daraus berechnet werden kann.
-
Fluoreszente
Messmethoden für
die Detektion biologischer Testsysteme
-
Für die Detektion
biochemischer Testsysteme unter dem Aspekt des hohen Durchsatzes
und hoher Stabilität
haben sich u.a. folgende Methoden bewährt:
Die Messung der Fluoreszenzintensität kann z.B.
dazu verwendet werden, um die Fluoreszenzzunahme einer Protease-Reaktion
mit einem fluorogenen Peptid-Substrat, von dem fluoreszentes Aminocoumarin
(AMC) abgespalten wird, zu messen. In der Regel werden große Signale
gemessen, aber die Autofluoreszenz von Screening-Substanzen könnte stören. Außerdem ist
das Fluoreszenzintensitätssignal
anfällig
für den
sogenannten „inner
Filter Effekt",
wenn sich in der Lösung
eine absorbierende Substanz befindet. Dynamische Fluoreszenzlöschung durch
Molekül-Kollision wie auch
Lichtstreuung in trüben
Lösungen
kann ebenso stören
wie das Ausbleichen des Fluoreszenzfarbstoffes oder Volumen-/Meniscus-Effekte.
Außerdem
ist das Fluoreszenzsignal abhängig
von der Konzentration des Fluoreszenzfarbstoffes und von der Temperatur.
All diese Störquellen
werfen für
die Stabilität
solcher Assays und für
deren Einsatz als Screeningmethode Fragen auf. Andererseits sind
derartige Assays sehr leicht bei sehr kurzen Messzeiten durchführbar und
haben sich deshalb zu einem Standard im HTS entwickelt.
-
Wird
ein kleines fluoreszentes Molekül
z.B. durch einen wesentlich größeres Molekül (z.B.
ein Protein) gebunden, so kann die verlangsamte Rotationsdiffusion
des entstandenen großen
Molekülkomplexes
durch die Messung der stationären
Fluoreszenzpolarisation gemessen werden. Auch diese Methode hat
sich inzwischen zu einem Standard für Bindungsreaktionen im HTS
entwickelt. Störeinflüsse durch
den „inner
Filter Effekt",
durch Lichtstreuung, Konzentration und Temperatur machen sich nicht
bemerkbar. Allerdings wird die Fluoreszenzpolarisation auch durch
echtes Kollisions-Quenching, Autofluoreszenz, Volumen und Meniskus der
Lösung
beeinflusst.
-
Eine
weitere Methode für
Bindungsereignisse nutzt den Fluoreszenzresonanzenergie-Transfer (FRET)
zwischen einem Donor- und Akzeptorfarbstoff, bei denen das Emissionsspektrum
des Donor-Farbstoffes mit dem Anregungsspektrum des Akzeptorfarbstoffes überlappt,
aus. In der betreffenden Bindungsreaktion muss ein Partner den Donor-Farbstoff
und der andere Partner den Akzeptor-Farbstoff tragen. Nur bei Bindung kommt
es durch die räumliche
Nähe zum
FRET. Bei der Messung des FRET's
stören „inner
Filter Effekt",
Quencher und Autofluoreszente Substanzen. Lichtstreuung, Photobleaching,
Volumen- u. Meniskuseffekte wie auch Konzentration und Temperatur
stören
dagegen nicht. Daher sind sowohl Fluoreszenzpolarisation als auch FRET
im Vergleich zur Fluoreszenzintensität relativ robuste Methoden
zur Messung der Interaktion von Molekülen.
-
Im
Vergleich zu den genannten Fluoreszenzmethoden ist die Fluoreszenz-Lebenszeit
(FLT) erheblich robuster. Sie wird nur in einigen Fällen von
stark autofluoreszenten Substanzen mit vergleichbarer FLT gestört. Aber
weder „inner
Filter Effekt",
noch Kollisions-Quencher, Photobleaching, Volumeneffekte oder Konzentration
beeinflussen die FLT. Diese Eigenschaften prädestinieren diese robuste Methode
für den
Einsatz im Screening. Auf der anderen Seite sind für FLT noch
keine Screening-Assays etabliert, was bisher hauptsächlich durch
den geringen Durchsatz und hohe Kosten für die Instrumentierung begründet ist.
Moderne Entwicklungen von leistungsstarken und stabilen Lasern sowie
Detektionssystemen ermöglichen
neuerdings den Einstieg in FLT-Messungen auf Mikrotiterplatten und
somit ins Substanz-Screening. So hat die Firma Tecan mit dem Ultra
Evolution Ende 2002 erstmals ein kommerzielles Gerät zur Auslesung
von Mikrotiterplatten auf den Markt gebracht.
-
Bekannte FLT-Applikationen:
-
Die
Messung der FLT wurde auf verschiedenste biologische Fragestellungen
angewendet. Dabei wurden entweder fluoreszente Sondenmoleküle eingesetzt,
die bei Bindung von Kationen wie z.B. Ca2+ (Schoutteten
L., Denjean P., Joliff-Botrel G., Bernard C., Pansu D., Pansu R.B.,
Photochem. Photobiol. 70, 701-709 (1999)), Mg2+(Szmacinski
H., Lakowicz J.R., J.Fluoresc. 6, 83-95 (1996)), H+(Lin
H.J., Szamacinski, Anal. Biochem. 269, 162-167 (1999)), Na+(Lakowicz J.R., Szamacinski H., Nowaczyk
K., Lederer W.J., Kirby M.S., Johnson M.L., Cell Calcium 15, 7-27
(1994)), K+ (Szmacinski H., Lakowicz J.R.
in „Topics
in Fluorescence Spectroscopy" Vol.
IV, (Lakowicz, J.R., Ed.), 295-334 (1994)) oder Anionen wie z.B.
Cl- (A.S. Verkman, Am.J.Physiol 253, C375-C388
(1990)) ihre Fluoreszenzeigenschaften und insbesondere die Fluoreszenz-Lebenszeiten
verändern.
Oder die Änderung
der Fluoreszenzlebenszeit wird erreicht durch eine Bindungsreaktion
mit einem Molekül,
das entweder durch Resonanz-Energietransfer (Quench oder FRET) zu
einer kleineren FLT für
den Donor-Farbstoff führt,
oder in seltenen Fällen
eine größere FLT
bedingt. Mit Hilfe der Bindung eines Cy3-markierten Anti-Phosphotyrosin-Antikörpers wurde
z.B. die Aktivität
einer Rezeptor Tyrosin-Kinase gemessen (F.S. Wouters, P.I.H. Bastiaens,
Current Biology 9, 1127-1130, 1999).
-
Es
wird bisher keine Anwendung eines biologischen Testsystems beschrieben,
wo die Änderung
der FLT zur Messung der Modifikation eines Moleküls verwendet wird, ohne das
eine Bindungsreaktion involviert ist. Auf der anderen Seite wäre ein Assay,
bei dem die Veränderung
eines Moleküles,
z.B. eines Substrates durch ein Enzym, direkt gemessen wird, von
großem
Vorteil. Denn der Substratumsatz eines Substrates könnte direkt
gemessen werden, ohne dass eine Enzym-Kaskade oder Bindungsreaktion
benötigt
wird, die den primären
Substratumsatz indirekt sichtbar macht Der Vorteil für ein Substanzscreening
liegt darin, dass die getesteten Substanzen nicht mehr mit den Nachweisreaktionen
interferieren können.
Damit ließen
sich vorgetäuschte
Hits oder Substanzen, die aufgrund der Interferenzen nicht bewertet
werden können,
vermeiden.
-
Screening-Assay-Formate
für Kinasen/Phosphatasen
-
Protein-(De-)Phosphorylierung
ist ein allgemeiner regulatorischer Mechanismus, mit dem Zellen
selektiv Proteine modifizieren, die regulatorische Signale von außen in den
Zellkern vermitteln. Die Proteine, die diese biochemischen Modifikationen
ausführen
gehören
zur Gruppe der Kinasen bzw. Phosphatasen. Phosphodiesterasen hydrolysieren
den sekundären
Botenstoff cAMP bzw. cGMP und nehmen auf diese Weise ebenfalls Einfluss
auf zelluläre
Signaltransduktionswege. Daher dienen diese Enzyme als hochinteressante Zielmoleküle der Pharma-
und Pflanzenschutzforschung.
-
Für das Screening
von Kinasen haben sich verschiedene Formate etabliert, denen gemeinsam
ist, dass die Phosphorylierungsreaktion (abgesehen von radioaktiven
Methoden) immer indirekt gemessen wird. Daher sind diese Verfahren
grundsätzlich
störanfällig durch
Substanzen, die mit der nachgeschalteten Enzymkaskade oder Bindungsreaktion
interferieren. Einige Methoden sind sogar nur auf Tyrosin-Kinasen
begrenzt.
-
Traditionelle
Methoden zur Messung des Phosphorylierungszustandes zellulärer Proteine
basieren auf den Einbau von radioaktivem 32P-orthophosphate.
Die 32P-phosphorylierten Proteine werden
auf einem Gel getrennt und anschließend mit einem Phospho-Imager
sichtbar gemacht. Alternativ können
phosphorylierte Tyrosinreste durch Bindung von radioaktiv markierten
anti-Phosphotyrosin-Antikörpern
gebunden und durch Immunoassays z.B. Immunoprezipitation oder Blotting,
nachgewiesen werden. Da diese Methoden radioaktive Isotopen nachweisen
müssen,
sind sie zeitaufwendig und auch aufgrund der Sicherheitsaspekte
im Umgang mit radioaktiven Substanzen nicht für die Hochdurchsatz-Wirkstofffindung
(uHTS, ultra high throughput screening) geeignet.
-
Neuere
Methoden ersetzen die radioaktiven Immunoassays durch ELISAs (enzyme-linked
immunosorbent assay). Diese Methoden verwenden aufgereinigte Substratproteine
oder synthetische Peptidsubstrate, die auf einer Substratoberfläche immobilisiert
sind. Nach Einwirkung einer Kinase wird das Ausmaß der Phosphorylierung
dadurch quantifiziert, indem anti-Phosphotyrosin-Antikörper, die mit einem Verstärkerenzym wie
z.B. Peroxidasen gekoppelt sind, an die phosphorylierten immobilisierten
Substrate binden.
-
Epps.
et al. (
US 6203994 )
beschreiben einen Fluoreszenz-basierten HTS-Assay für Protein
Kinasen und Phosphatasen, der fluoreszenzmarkierte phosphorylierte
Reportermoleküle
und Antikörper,
die spezifisch die phosphorylierten Reportermoleküle binden,
verwendet. Die Bindung wird mittels Fluoreszenzpolarisation, Fluoreszenzquench
oder Fluoreszenz Correlations Spektroskopie (FCS) gemessen. Dieses
Verfahren hat den intrinsischen Nachteil, dass es nur gute generische
Antikörper
(z.B. clone PT66, PY20, Sigma) für
Phosphotyrosin-Substrate gibt. Es werden nur wenige Beispiele von
geeigneten anti-Phosphoserin- bzw. anti-Threonin-Antikörpern berichtet
(z.B. Bader B. et al., Journal of Biomolecular Screening, 6, 255
(2001), Panvera-Kit No. P2886). Diese Antikörper haben aber die Eigenschaft,
nicht nur Phosphoserin, sondern auch die benachbarten Aminosäuren als
Epitop zu erkennen. Es ist aber bekannt, dass Kinasen sehr substratspezifisch
arbeiten und sich die Substratsequenzen stark unterscheiden können. Daher
sind anti-Phosphoserin-Antikörper nicht
als generische Reagenzien einsetzbar.
-
Die
Firma Perkin Elmer (Wallac) bietet für Tyrosin-Kinasen einen Assay
an, der auf zeitaufgelöster
Fluoreszenz und einem Energietransfer von Europium-Chelaten auf
Allophycocyanin beruht (s.auch
EP929810 ). Auch
hier ist das Verfahren durch die Verwendung von Antikörpern im
wesentlich auf Tyrosin-Kinasen beschränkt.
-
Die
Firma Molecular Devices bietet seit kurzem Nanopartikel mit geladenen
Metall-Kationen auf der Oberfläche
als generisches Bindungsreagenz an, dass für Phosphorylierungsreaktionen
sowohl an Tyrosin, als auch an Serin und Threonin geeignet ist.
Die Bindungsreaktion wird aber im stark sauren pH von ca. 5 und bei
hoher Ionenstärke
durchgeführt.
Daher ist für
die Bindung der Nanopartikel ein starker Verdünnungsschritt der Reaktion
in den Ziel-Puffer notwendig, was bei Assay-Gesamtvolumina von 10μl im 1536-Format
im uHTS problematisch ist. Die Messung der Bindung geschieht auch
hier mittels Fluoreszenzpolarisation.
-
Fluoreszenzpolarisation
ist als Messmethode relativ aufwendig und erlaubt derzeit noch keine
parallele Messung einer Mikrotiterplatte (MTP). Daher wären die
Messzeiten für
eine 1536-MTP sehr hoch und die parallele Messung von Enzymkinetiken
nicht möglich.
Außerdem
ist die Fluoreszenzpolarisation als Methode auf sehr kleine fluoreszente
Substrate beschränkt.
-
Des
weiteren kann die Kinase-Aktivität
durch den Verbrauch von ATP mittels Firefly-Luciferase bzw. durch
die Bildung von ADP mittels nachgeschalteter Enzymkaskade gemessen
werden. Diese Assay-Formate haben den Nachteil, dass sie aufgrund
der indirekten Messmethode nicht nur stärker streuende Messwerte erzeugen,
sondern auch Probleme mit Substanzen haben, die die Kaskaden-Enzyme
hemmen.
-
Könnte man
die Phosphorylierung/Dephosphorylierung direkt durch Detektion der
FLT messen, wäre die
Messung direkter und damit weniger behaftet mit systematischen oder
zufälligen
Fehlern. Außerdem
wäre die
Limitierung einiger Assay-Formate auf Tyrosin-Kinasen bzw. Phosphatasen
beseitigt, da kein spezifischer Antikörper mehr benötigt würde.
-
Bestehende Assay-Probleme:
-
Für Proteasen,
bei denen C-terminale Aminosäuren
abgespalten werden, können
in sehr vielen Fällen fluorogene
Substrate mit C-terminalen Farbstoffen wie z.B. Aminocoumarin verwendet
werden. Endoproteasen, die inmitten von Peptid-Sequenzen schneiden,
können
meist gut in FRET-Assays
gemessen werden, wobei sich die Donor (z.B. EDANS)- und Akzeptor-Farbstoffe
(z.B. Dabcyl) an den Enden des Substrates befinden. Durch die Substrat-Spaltung
nimmt die Fluoreszenzintensität
zu, weil der Akzeptor-Farbstoff den Donor-Farbstoff nicht mehr quenchen
kann. Es gibt aber auch Proteasen, für die keine fluorogenen Substrate konstruiert
werden können.
In solchen Fällen
muss die Enzymreaktion entweder mittels aufwendiger chemischer Analytik
(z.B. HPLC/MS, GC/MS) oder durch chemische Reaktion oder Enzymkaskaden
indirekt gemessen werden. Dadurch müssen alle Nachteile hinsichtlich
der Stabilität
des Assays und unspezifischer Reaktionen von Screening-Substanzen
mit der Nachweisreaktion in Kauf genommen werden. Die aufwendige
Analytik ist nicht für
das Hochdurchsatz-Screening geeignet. Enzyme, deren Reaktionen – im erforderlichen
Durchsatz – nicht
direkt gemessen werden können,
umfassen solche, die z.B. folgende Modifikationen an Substraten vornehmen:
Phosphorylierung/Dephosphorylierung, Sulfatierung/Desulfatierung,
Methylierung/Demethylierung, Oxidationen/Reduktionen, Acetylierung/Deacetylierung,
Amidierung/Deamidierung, Cyclisierung/Ringspaltung, Konformationsänderungen,
Abspaltung von Aminosäuren/Peptiden/Ankopplung
von Aminosäuren/Peptiden,
Ringaufweitung/Ringverkleinerung, Umlagerungen, Substitutionen,
Eliminierungen, Additionsreaktionen etc.
-
Beschreibung der Erfindung:
-
Die
Fluoreszenzlebenszeit (FLT) ändert
sich prinzipiell, wenn sich die chemische Umgebung ändert. Allerdings
sind derartige FLT-Änderungen
bisher noch nicht generell vorhersagbar, insbesondere, wenn es sich
um nur kleine molekulare Veränderungen
handelt. Daher beinhalteten bisher alle publizierten FLT-Assays immer
eine Bindungsreaktion entweder mit einem Sensormolekül oder mit
einem quenchenden Partnermolekül.
-
Bei
unseren Versuchen hat sich überraschend
gezeigt, dass bereits Peptide, die sich nur durch eine Phosphorylierung
unterscheiden, eine deutliche FLT-Differenz aufweisen. Weitergehende
Experimente haben gezeigt, dass diese Aussage auf ein weiteres Peptid
erweitert werden konnte. Um hierfür akzeptable FLT-Differenzen
zwischen dem phosphorylierten und nichtphosphorylierten Peptid zu
erhalten, mussten zuvor diverse Bedingungen getestet werden. Aus
dem Experiment wurde aber auch klar, dass FLT-Differenzen durch Änderung
von Parametern optimiert werden können. Basierend auf diesen
Experimenten sollte es möglich
sein, FLT-Messungen auf alle Kinase- und Phosphatase-Reaktionen
auszudehnen. Darüber
hinaus sollten sich auch andere Reaktionen erschließen lassen,
die mit bisherigen Methoden im Hinblick auf HTS-Tauglichkeit nicht
oder nur sehr indirekt messen lassen. Generell sollte gelten:
Ändert sich
z.B. der Phosphorylierungszustand eines Eduktes bei Umwandlung in
sein Produkt, so sollte ein geeignet angekoppelter Farbstoff diese
molekulare Modifikation durch Änderung
der FLT anzeigen. Solch eine Methode hat das Potenzial, generisch
auf Tyrosin- wie auch Serin-/Threonin-Kinasen sowie Phosphatasen
anwendbar zu sein. Ebenso sollte das Prinzip auf andere Modifikationsreaktionen
anwendbar sein wie z.B. Sulfatierung/Desulfatierung, Methylierung/Demethylierung,
Oxidationen/Reduktionen, Acetylierung/Deacetylierung, Amidierung/Deamidierung,
Cyclisierung/Ringspaltung, Konformationsänderungen, Abspaltung von Aminosäuren/Pep tiden/Ankopplung
von Aminosäuren/Peptiden,
Ringaufweitung/Ringverkleinerung, Umlagerungen, Substitutionen,
Eliminierungen, Additionsreaktionen etc. FLT-Messungen sind aktuell
sehr schnell möglich
(z.T. 50 ms oder weniger pro well), so dass die Methode für das Hochdurchsatzscreening
geeignet ist. Besonders vorteilhaft ist für HTS-Anwendungen die große Robustheit
gegenüber
Störeinflüssen wie
z.B. Inner Filter Effect, Autofluoreszenz, Lichtstreuung, Photobleaching,
Volumen-/Meniscus-Effekten, Konzentration des fluoreszenten Substrates.
-
Die
erfindungsgemäße homogene
Assay-Methode bzw. das erfindungsgemäße Verfahren zur direkten quantitativen
Messung von Molekül-Modifikationen
ist dadurch gekennzeichnet, dass das Molekül einen Fluoreszenz-Farbstoff
trägt und
dass die Fluoreszenz-Lebensdauer des Moleküls sich von der Fluoreszenz-Lebensdauer
des modifizierten Moleküls
unterscheidet. Bei dem Molekül
kann es sich z.B. um ein organisches, insbesondere um ein Peptid
oder Peptido-Mimetikum,
oder anorganisches Molekül
handeln. Der Fluoreszenzfarbstoff kann z.B. ein Coumarin-, ein Fluorescein-,
ein Rhodamin-, ein Oxazin- oder ein Cyanin-Farbstoff sein kann.
Der verwendete Fluoreszenz-Farbstoff kann kovalent oder nicht-kovalent
an das Molekül
angekoppelt ist. Zwischen dem Fluoreszenz-Farbstoff und dem Molekül kann sich
ein Spacer-Molekül
befinden. Bestandteil der Erfindung ist ebenfalls die Verwendung
der erfindungsgemäßen Assay-Methode bzw. des
erfindungsgemäßen Verfahrens
zur Quantifizierung biochemischer Assays. Die erfindungsgemäße Assay-Methode
bzw. das erfindungsgemäße Verfahren
kann zur Quantifizierung biochemischer Assays verwendet werden,
bei denen Enzyme z.B. folgende Modifikationsreaktionen ausführen können: Phosphorylierung/Dephosphorylierung,
Sulfatierung/Desulfatierung, Methylierung/Demethylierung, Oxidationen/Reduktionen,
Acetylierung/Deacetylierung, Amidierung/Deamidierung, Cyclisierung/Ringspaltung,
Konformationsänderungen,
Abspaltung von Aminosäuren/Peptiden/Ankopplung
von Aminosäuren/Peptiden,
Ringaufweitung/Ringverkleinerung, Umlagerungen, Substitutionen,
Eliminierungen, Additionsreaktionen etc. Außerdem kann die erfindungsgemäße Assay-Methode
bzw. das erfindungsgemäße Verfahren
für den
Einsatz im Hochdurchsatz-Screening – insbesondere im Hochdurchsatz-Screening
zur Identifizierung von pharmazeutischen Wirkstoffen – nutzbringend
eingesetzt werden.
-
Bestandteil
der Erfindung ist des weiteren ein Reagentien-Kit, der Fluoreszenz-Farbstoff-Molekül-Konjugate und andere
Reagenzien enthält,
die zur Durchführung
der erfindungsgemäßen Assay-Methode bzw. des
erfindungsgemäßen Verfahrens
benötigt
werden.
-
Beschreibung der Figuren:
-
1:
Logarithmierte zeitliche Fluoreszenzabklingkurve von 15 nM eines
Fluorescein-Peptid-Konjugates.
Gemessen auf Ultra FLT Prototyp (TECAN) mittels TCSPC.
-
2:
Unterschiede in der Fluoreszenzlebenszeit eines phosphorylierten
(1) und nichtphosphorylierten (2) Peptides (1: F1-P1, 2: F1-1).
Measurement time 1 s. The mean and standard deviation of 10 measurements
is shown.
-
3:
Der zeitliche Verlauf der Fluoreszenz-Lebensdauer (FLT in ps) ist
gegen die Reaktionszeit (time in s) aufgetragen. Während der
Reaktion der Phosphodiesterase PDE1b mit Fluorescein-cAMP
ändert sich
die Fluoreszenz-Lebensdauer innerhalb von 100 Minuten von ca. 3500
ps auf ca. 3350 ps. Diese Änderung
zeigt direkt die Umwandlung von F1-cAMP in F1-AMP an. Durch steigende
Konzentrationen an BAY 383045 (grüne Dreiecke: 20 μM, rote Quadrate:10 μM, violette
Kreuze: 5 μM,
braune Kreise: 2.5 μM,
rosa Quadrate: 1.25 μM,
blaue Rauten: 0.7 μM,
grüne Pluszeichen:
0.35 μM,
dunkelblaue Minuszeichen: 0.17 μM,
hellblaue Minuszeichen: 0.08 μM)
wird die Enzymreaktion zunehmend gehemmt.
-
4:
Die Fluoreszenz-Lebensdauer-Unterschiede zwischen der phosphorylierten
und nichtphosphorylierten Form eines Fluorescein-Kemptid-Peptide-Konjugates
sind bei erschiedenen pH-Werten bzw. 200 mM NaCl aufgetragen (1:
pH 13, 2: pH 9.5, 3: pH 8, 4: pH 7, 5: pH 200 mM NaCl, 7: pH 6.
-
5:
Für ein
potentielles Edukt (FJ23, schraffiert) und dessen Produkt (FJ24,
schwarz) der Umsetzung mit dem TAFI-Enzym sind die Fluoreszenz-Lebensdauern
unter verschiedenen Bedingungen (1: Wasser, 2: pH 6, 3: pH 7, 4:
pH 8, 5: pH 9.5, 6: 00mM NaCl, 7: 2 M NaCl) gemessen worden. Die
Fluoreszenz-Lebensdauern sind praktisch unabhängig von den untersuchten Bedingungen.
Aber die Fluoreszenz-Lebensdauern von FJ23 (552 ps) und FJ23 (2194
ps) unterscheiden sich sehr deutlich.
-
Beispiele
-
1. Unterschiede in der
Fluoreszenzlebenszeit eines phosphorylierten und nicht-phosphorylierten
Peptides (FL-P1 vs. FL1)
-
Material:
F1-P1:
Fluorescein-C6-TEGQYpQPQP-COOH, Eurogentec, phosphoryliert
F1-1:
Fluorescein-C6-TEGQYQPQP-COOH, Eurogentec, nichtphosphoryliert
-
Durchführung:
Es
sollte untersucht werden, ob sich die Fluoreszenz-Lebensdauer (FLT)
der Fluorescein-Peptid-Konjugate F1-P1
und F1-1 unterscheiden. Dazu wurden je 10 nM F1-P1 und F1-1 in 50
mM HEPES pH 7.5 gelöst.
Die Fluoreszenzlebensdauern (FLT) wurden mittels eines Ultra FLT-Prototypen
(Tecan) gemessen. Jeweils 10 Messungen á 1 s wurden gemittelt.
-
Ergebnis:
Die
Fluoreszenz-Lebensdauer von F1-P1 beträgt 3880 ps und die FLT von
F1-1 3600 ps. Da bei einer Messzeit von 1 s die Standardabweichungen
mit < 25 ps sehr
klein sind, lassen sich beide Moleküle sehr gut unterscheiden (s. 2).
Aus den Standardabweichungen und den mittleren Fluoreszenz-Lebensdauern
von F1-P1 und F1-1 kann man für
die Leistungsfähigkeit
eines potentiellen biologischen Tests mit durch F1-P1 und F1-1 aufgespannten
FLT-Messfenster einen z'-Faktor
von ca. 0.5 berechnen, was für
eine Screening-Kampagne ausreichend wäre. Der z'-Faktor
wurde von Zhang et al. 1999 zur Bewertung der Leistungsfähigkeit
von HTS-Assays eingeführt
(Zhang JH, Chung TDY, Oldenburg KR, J. Biomol. Screen 4, 67-73 (1999)).
Die Aktivität
einer Kinase wie z.B. p60src, die F1-1 phosphorylieren
würde,
müsste
mittels FLT-Messungen
sehr gut messbar sein.
-
Viele
heute verwendete Kinase-Assays sind Endpunkt-Assays, wo die Kinetik
nicht kontinuierlich verfolgt werden kann. Vielmehr müssen verschiedene
Reaktionen zu verschiedenen Zeiten gestoppt werden und die erhaltenen
Messwerte anschließend
zu einer Kinetik-Kurve zusammengesetzt werden.
-
Durch
die Messung von Fluoreszenz-Lebensdauern kann die Kinetik der Phosphorylierung
ohne Detektions-Enzymkaskade direkt und unmittelbar verfolgt werden.
Dies erleichtert insbesondere auch die Einstellung der Inkubationszeit
für eine
Roboter-Screening-Kampagne.
-
2. Optimierung
des FLT-Unterschiedes zwischen Fluorescein-markiertem phosphoryliertem
und nicht phosphoryliertem Kemptid-Peptid
-
Material:
F1-P-Kemptid:
Fluorescein-C6-LRRApSLGCONH2, Eurogentec,
phosphoryliert
F1-Kemptid: Fluorescein-C6-LRRASLGCONH2, Eurogentec, nichtphosphoryliert
0.1
M NaOH, 50 mM Borat-Puffer pH 9.5, 50 mM HEPES-Puffer pH 8.0, 50
mM HEPES-Puffer pH 7.0, 50 mM MES-Puffer pH 6.0, 200 mM NaCl (low)
-
Durchführung:
Ein
FLT-Assay ist umso besser, je größer die
Unterschiede der Fluoreszenz-Lebenszeiten von Edukt und Produkt
sind. Nicht in jedem Fall wird man auf Anhieb eine optimal große FLT-Differenz messen.
Andererseits sollte es möglich
sein die zunächst
erhaltene FLT-Differenz zu vergrößern, z.B.
durch Auswahl und Kombination verschiedener Parameter wie z.B. Fluoreszenzfarbstoff
Spacer-Molekül
zwischen Farbstoff und Substratmolekül, oder Polarität, pH, Ionenstärke des
Lösungsmittel
oder andere Additive. In diesem Beispiel wird aufgezeigt, wie durch
Erhöhung
des pH-Wertes eine signifikante Vergrößerung des FLT-Unterschiedes
zwischen einer phosphorylierten und einer nicht-phosphorylierten
Variante eines Fluorescein-Kemptid-Peptid-Konjugates (F1-P-Kemptid,
F1-Kemptid) erreicht wurde. Jeweils 50 nM F1-P-Kemptid und F1-Kemptid
wurden in den unter Material beschriebenen Lösungen gelöst und deren FLT's mittels eines modifizierten
Nanoscan-Gerätes
(IOM GmbH, Berlin), das die Signale auf einen Transientenrekorder übertrug,
gemessen. Für
jeden Messpunkt wurden 16 Abklingkurven gemittelt. Der abfallende
Teil der logarithmierten Kurve wurde mittels linearer Regression
ausgewertet und die negative Steigung in die FLT umgerechnet.
-
Ergebnis:
In 4 sind
die Differenzen der FLT's
von F1-P-Kemptid und F1-Kemptid bei verschiedenen Bedingungen angegeben.
In diesem Fall ergibt sich, dass die Differenzierung der phosphorylierten
und nichtphosphorylierten Form von Kemptide mittels FLT besser wird,
wenn sich der pH von 6.0 auf 9.5 erhöht. Das erzielte Ergebnis zusammen
mit dem Befund des 1. Beispiels legt nahe, dass durch die Auswahl
der richtigen Fluoreszenzfarbstoffe, Spacer und Lösungsmitteleigenschaften
bzw. Additive für
sehr viele, wenn nicht fast alle Paare von phosphorylierten und
nicht-phosphorylierten Peptid-Substraten für Phosphatasen bzw. Kinasen
Bedingungen gefunden werden können,
die zu einem für
das Screening ausreichend großen
Unterschied zwischen den Fluoreszenz-Lebenszeiten zwischen Edukten
und Produkten führen.
Somit lassen sich für
die genannten Enzymklassen generische Assays aufbauen, die denkbar
einfach zu entwickeln sind. Wenn die richtigen Reaktionsbedingungen
für die
Enzyme abgeklärt
wurden, bedarf die Reaktion nur noch der Mischung von Enzym und Substrat.
Die folgende Kinetik kann unmittelbar und direkt verfolgt werden.
Dadurch lassen sich Inkubationszeiten an HTS-Roboter-Anlagen einfach
einstellen. Aufgrund der robusten Messgröße Fluoreszenzlebenszeit wirken
sich leichte Schwankungen von Volumen und Substrat-Konzentration
nur geringfügig
auf das Messergebnis aus. Darüber
hinaus gilt generell, dass solch ein Assay mit wenig Pipettierschritten
deutlich robuster, als andere Standard-Assays mit zusätzlichen
Pipettierschritten, wie sie z.T. durch Detektions-Enzymkaskaden erforderlich
werden.
-
3. PDE-Reaktion
-
Material:
F1-cAMP:
8-Fluo-cAMP, BIOLOG Life Science Institute
PDE1b: Phosphodiesterase
1b (Labor Dr. A. Tersteegen, Bayer AG)
BAY 383045: Bayer AG
-
Durchführung:
Phosphodiesterasen
stellen wie die zuvor behandelten Phosphatasen und Kinasen eine
sehr bedeutsame Klasse von Targets u.a. in den Indikationsgebieten
Herz-Kreislauf Metabolische Krankheiten, Zentrales Nervensystem,
Krebs und Respiratorische Krankheiten dar. Daher ist es von hohem
Interesse, ein generisches Assay-Format zu haben, das die Umwandlung
von cAMP bzw. cGMP in die jeweiligen Monophosphate messen kann. Üblicherweise
werden Detektions-Enzymkaskaden
verwendet. In diesem Beispiel wird gezeigt, das es möglich ist,
die Phosphodiesterase-Reaktion direkt zu messen. Im Experiment wurden
zunächst
1 μM F1-cAMP
und eine 1:360-Verdünnung
von PDE1b in Gegenwart verschiedener Konzentrationen des Inhibitors BAY
383045 gemischt. Die Kinetik der Enzymreaktion wurde mittels eines
Ultra FLT-Prototypen (Tecan) bei Raumtemperatur gemessen.
-
Ergebnis:
Die
FLT von F1-cAMP ändert
sich – ohne
Inhibitor – im
Laufe der Reaktion zu F1-AMP innerhalb von 100 Minuten von ca. 3500
ps auf ca. 3350 ps. Steigende Konzentrationen von BAY 383045 hemmen
die Enzymreaktion zunehmend (s. 3). Durch
die deutliche Konzentrationsab hängigkeit
der Hemmung der Phosphodiesterase-Reaktion wurde gezeigt, dass die Änderung
der Fluoreszenzlebensdauer des F1-cAMP eindeutig mit der Enzymaktivität zusammenhängt. Dadurch
ist der Nachweis erbracht, dass mit dieser Methode prinzipiell nach
Substanzen gesucht (gescreent) werden kann, die Phosphodiesterasen
hemmen. Das Messprinzip sollte aber auch auf Kinase- und Phosphatase-
und andere Enzym-Assays erweiterbar sein, wenn bei der enzymatischen
Modifikation des Substrates eine messbare FLT-Änderung auftritt. Wie bei den
zuvor diskutierten Phosphatase- und Kinase-Assays sollte ein Phosphodiesterase-Assay
mit direkter FLT-Detektion der Substratmodifikation aufgrund des
störunanfälligen Messsignals
und wenigen Pipettierschritten sehr robust sein. Man könnte mit
der beschriebenen Assay-Methode ausschließen, dass Substanzen mit Detektions-Enzyme
interferieren. Für
die beschriebene Assay-Methode
auf Basis von Fluoreszenz-Lebensdauer-Messungen gilt generell: Die
Inkubationszeiten von Phosphodiesterase-, Kinase- und Phosphatase-Assays
wie auch anderen Enzym-Assays lassen sich durch die direkte und
unmittelbare Messung der Enzymkinetik in einem Experiment sehr leicht
und genau für
eine Roboter-Hochdurchsatz-Screening-Kampagne einstellen.
-
4. Unterschied in der
Fluoreszenz-Lebenszeit zwischen Edukt und Produkt der TAFI-Enrymreaktion:
-
Material:
FJ23: Evoblue30-Ttds(Spacer)-IFTR-COOH, Jerini Peptide Technologies
FJ24:
Evoblue30-Ttds(Spacer)-IFT-COOH, Jerini Peptide Technologies
-
Durchführung:
Beim
Enzym Thrombin activatable fibrinolysis inhibitor (TAFI) handelt
es sich um eine Carboxypeptidase, die in der Thrombose eine wichtige
Rolle spielt. TAFI spaltet von der Peptid-Sequenz IFTR das Arginin ab. Diese Reaktion
kann entweder durch Massenspektroskopische oder chromatographische
Methoden nachgewiesen werden. Beide Methoden sind nicht tauglich
für die
Hochdurchsatz-Substanz-Testung. Alternativ können mehr oder weniger komplexe
Enzymkaskaden oder chemische Reaktionen verwendet werden, die ein
messbares Absorptions-, Fluoreszenz- oder Lumineszenzsignal generieren.
Bisher ist keine Methode beschrieben, mit der die TAFI-Reaktion
direkt gemessen werden kann und die gleichzeitig für einen
höheren
Durchsatz geeignet ist. Daher wurden die Fluoreszenz-Lebensdauern
der Konjugate FJ23 und FJ24 gemessen, die beide einen bei 630 nm
anregbaren Fluoreszenzfarbstoff tragen (Evoblue30, Mobitec) und
sich nur darin unterscheiden, dass im FJ24-Konjugat das C-terminale
Arginin fehlt. FJ23 stellt ein potentielles Edukt für die TAFI-Reaktion
dar, während
FJ24 das entsprechende Reaktion-Produkt wäre. Die Konjugate FJ23 und
FJ24 wurden in einer Konzentration von 60 nM in verschiedenen Puffern
mit pH-Werten 6, 7, 8 und 9.5, sowie in Gegenwart von 200 mM und
2 M NaCl gelöst.
-
Ergebnis:
Unabhängig vom
pH-Wert und der NaCl-Konzentration beträgt die Fluoreszenzlebensdauer
von FJ23 (552±45)
ps und die von FJ24 (2194±18)
ps (s. 5). Daraus lässt
sich ein exzellenter z'-Faktor von 0.89 berechnen,
der einen sehr leistungsfähigen
Assay erwarten lässt.
Es wurde wie auch schon in den vorgehenden Beispielen für Kinasen,
Phosphatasen und Phosphodiesterasen gezeigt, dass sich Fluoreszente
Konjugate von Edukten und Produkten synthetisieren lassen, die – in Falle
von TAFI – einen
sehr großen
Unterschied in der Fluoreszenz-Lebensdauer besitzen. Diese große Fluoreszenz-Lebensdauer-Differenz
erlaubt den Aufbau eines Assay mit großer Signal-Stabilität und sehr
guter Unterscheidung zwischen unterschiedlich stark hemmenden Substanzen.
Darüber
hinaus wurde in diesem Beispiel eine Lösung für das TAFI-spezifische Problem
aufgezeigt, dass bisher für
TAFI keine für
hohen Durchsatz geeignete Methoden beschrieben sind, die eine direkte
Messung der Enzymreaktion ohne sekundäre Nachweisreaktionen erlauben.
