WO2005043137A1 - Direkte beobachtung molekularer veränderungen in biologischen testsystemen mittels messungen der fluoreszenz-lebensdauer - Google Patents

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Definitions

  • the invention is a method for the direct detection of the change in a molecule carrying a fluorescent dye by measuring the fluorescence lifetime.
  • luminescence processes that are accompanied by an emission of radiation when an excited molecule is in its energetic ground state are referred to as luminescence and are generally divided into fluorescence and phosphorescence.
  • excitation energy can be released through various non-radiative processes.
  • Fluorescence occurs during the transition from the lowest vibration level of the excited singlet state Si to a vibration level of the singlet ground state S 0 .
  • the transition rate k f is in the range from 10 7 to 10 12 s "1.
  • the fluorescence excitation takes place at a shorter wavelength than the fluorescence emission, since energy is lost through radiationless processes between absorption and emission of the radiation energy.
  • the fluorescence lifetime (FLT) is a measure of the time that a molecule remains on average in the excited state before the fluorescence emission takes place.
  • the radiation lifetime ⁇ f corresponds to the inverse fluorescence transition rate k f .
  • acceptor dyes have a similar effect, absorbing the excitation energy of the donor dye in a resonance phenomenon without radiation and releasing the absorbed energy either without radiation or as fluorescence. This also lowers the FLT of the donor dye.
  • TCSPC time correlated single photon counting
  • the alternative to FLT measurements in the time domain are measurements in the frequency domain, which are also called phase-modulated.
  • the sample is excited with a continuous laser, the light intensity of which is modulated with a sine curve. Frequencies in the order of magnitude of the fluorescence transition rates are usually used. If a fluorescent dye is excited in this way, the emission is forced to follow this modulation.
  • the emission is delayed relatively for excitation. This delay is measured as a phase shift from which the FLT can be calculated.
  • the maximum difference between the maximum and minimum of the modulated emission signal decreases with increasing FLT, so that the FLT can also be calculated therefrom.
  • the measurement of the fluorescence intensity can, for example, be used to measure the increase in fluorescence of a protease reaction with a fluorogenic peptide substrate from which fluorescent aminocoumarin (AMC) is split off. Large signals are usually measured, but the auto-fluorescence of screening substances could interfere.
  • the fluorescence intensity signal is susceptible to the so-called “inner filter effect” if there is an absorbing substance in the solution. Dynamic fluorescence quenching by molecular collision as well as light scattering in cloudy solutions can be as disruptive as the fading of the fluorescent dye or volume / meniscus
  • the fluorescence signal is dependent on the concentration of the fluorescent dye and on the temperature.
  • FRET fluorescence resonance energy transfer
  • the fluorescence lifetime (FLT) is • considerably more robust. It is only disturbed in some cases by strongly autofluorescent substances with comparable FLT. But neither "inner filter effect” nor KoUision quencher, photobleaching, volume effects or concentration influence the FLT. These properties predestine this robust method for use in screening.
  • no screening assays have been established for FLT, as has been the case up to now Mainly due to the low throughput and high costs for the instrumentation. Modern developments of powerful and stable lasers as well as detection systems have recently enabled FLT measurements on microtiter plates and thus substance screening. Fi ⁇ na Tecan has ended with the Ultra Evolution In 2002, a commercial device for reading microtiter plates was launched for the first time.
  • FLT applications The measurement of FLT was applied to a wide variety of biological issues. Either fluorescent probe molecules were used, which bind cations such as Ca + (Schoutteten L., Denjean P., Joliff-Botrel G., Bernard C, Pansu D., Pansu RB, Photochem. Photobiol. 70, 701-709 (1999)), Mg 2+ (Szmacinski K, Lakowicz JR, J. Fluoresc. 6, 83-95 (1996)), H + (Zz / z HJ., Szamacinski, Anal. Biochem.
  • the change in fluorescence lifetime is achieved by a binding reaction with a molecule, which either leads to a smaller FLT for the donor dye through resonance energy transfer (quench or FRET), or in rare cases results in a larger FLT.
  • FRET resonance energy transfer
  • Binding of a Cy3-labeled anti-phosphotyrosine antibody for example, the activity of a receptor tyrosine kinase was measured (FS Wouters, PIH Bastiaens, Current Biology 9, 1127-1130, 1999).
  • Protein (de) phosphorylation is a general regulatory mechanism by which cells selectively modify proteins that transmit regulatory signals from outside to the cell nucleus.
  • the proteins that carry out these biochemical modifications belong to the group of kinases or phosphatases.
  • Phosphodiesterases hydrolyze the secondary messenger cAMP or cGMP and in this way also influence cellular signal transduction pathways. Therefore, these enzymes serve as highly interesting target molecules in pharmaceutical and crop protection research.
  • Newer methods replace radioactive immunoassays with ELISAs (enzyme-linked immunosorbent assay). These methods use purified substrate proteins or synthetic peptide substrates that are immobilized on a substrate surface. After exposure to a kinase, the extent of phosphorylation is quantified by using anti-phosphotyrosine antibodies, which are linked to an enhancing enzyme such as e.g. Peroxidases are coupled, to which phosphorylated immobilized substrates bind.
  • an enhancing enzyme such as e.g. Peroxidases are coupled, to which phosphorylated immobilized substrates bind.
  • Epps. et al. (US 6203994) describe a fluorescence-based HTS assay for protein kinases and phosphatases which uses fluorescence-labeled phosphorylated reporter molecules and antibodies which specifically bind the phosphorylated reporter molecules. The binding is measured by means of fluorescence polarization, fluorescence quench or fluorescence correlation spectroscopy (FCS).
  • FCS fluorescence correlation spectroscopy
  • the company Molecular Devices recently offers nanoparticles with charged metal cations on the surface as a generic binding reagent that is suitable for phosphorylation reactions on tyrosine as well as on serine and threonine.
  • the binding reaction is carried out at a strongly acidic pH of approx. 5 and at high ionic strength. Therefore, for binding Nanoparticles require a strong dilution of the reaction in the target buffer, which is problematic for total assay volumes of 10 ⁇ l in 1536 format in the uHTS.
  • the binding is also measured here by means of fluorescence polarization.
  • Fluorescence polarization is a relatively complex measurement method and currently does not allow parallel measurement of a microtiter plate (MTP). Therefore, the measurement times for a 1536-MTP would be very long and the parallel measurement of enzyme kinetics would not be possible. In addition, fluorescence polarization as a method is limited to very small fluorescent substrates.
  • the kinase activity can be measured by using ATP using Firefly luciferase or by forming ADP using a downstream enzyme cascade.
  • the disadvantage of these assay formats is that, due to the indirect measurement method, they not only produce more scattering measurement values, but also have problems with substances that inhibit the cascade enzymes.
  • fiuorogenic substrates with C-terminal dyes such as aminocoumarin can be used. Endoproteases that cut in the middle of peptide sequences can usually be measured well in FRET assays, with the donor (eg EDANS) and acceptor dyes (eg dabcyl) being at the ends of the substrate. The substrate cleavage increases the fluorescence intensity because the acceptor dye can no longer quench the donor dye.
  • FRET assays FRET assays
  • the enzyme reaction must be measured indirectly either by means of complex chemical analysis (eg HPLC / MS, GC / MS) or by chemical reaction or enzyme cascades.
  • complex chemical analysis eg HPLC / MS, GC / MS
  • chemical reaction or enzyme cascades eg HPLC / MS, GC / MS
  • all disadvantages with regard to the stability of the assay and non-specific reactions of screening substances with the detection reaction have to be accepted.
  • the complex analysis is not suitable for high-throughput screening.
  • Enzymes whose reactions - in the required throughput - cannot be measured directly include those which, for example, make the following modifications to substrates: phosphorylation / dephosphorylation, sulfation / desulfation, methylation / demethylation, oxidations / reductions, acetylation / deacetylation, Amidation / deamidation, cyclization / ring cleavage, conformational ent, cleavage of amino acids / peptides / coupling of amino acids / peptides, ring expansion / ring reduction, rearrangements, substitutions, eliminations, addition reactions etc.
  • FLT fluorescence lifetime
  • a suitably coupled dye should indicate this molecular modification by changing the FLT.
  • Such a method has the potential to be generically applicable to tyrosine as well as serine / threonine kinases and phosphatases.
  • the principle should also be applicable to other modification reactions such as sulfation / desulfation, methylation / demethylation, oxidation / reduction, acetylation / deacetylation, amidation / deamidation, cyclization / ring cleavage, conformational changes, cleavage of amino acids / peptides / coupling of amino acids / Peptides, ring expansion / ring reduction, rearrangements, substitutions, eliminations, addition reactions etc.
  • FLT measurements are currently possible very quickly (sometimes 50 ms or less per well), so that the method is suitable for high-throughput screening.
  • the high robustness against interference such as inner filter effect, autofluorescence, light scattering, photobleaching, volume / meniscus effects, concentration of the fluorescent substrate is particularly advantageous for HTS applications.
  • the application shows that only 2 components, substrate and enzyme, have to be mixed to start and measure the reaction.
  • Conventional assay methods usually require the addition of other reagents, such as cascade enzymes, so that the reaction can be measured.
  • a pipetting error and thus an additional error for the measurement result is caused, which is also called error propagation. This propagated errors lead 'to an increased variance of the measurement results.
  • the homogeneous assay method according to the invention or the method according to the invention for the direct quantitative measurement of molecule modifications is characterized in that the molecule carries a fluorescent dye and in that the fluorescence lifetime of the molecule differs from the fluorescence lifetime of the modified molecule.
  • the fluorescence lifetime of the modified molecule can be longer than that of the unmodified molecule.
  • the invention also includes an assay method according to the invention in which the fluorescence lifetime of the modified molecule is shorter than that of the unmodified molecule.
  • the molecule can be, for example, an organic, in particular a peptide or peptidomimetic, or inorganic molecule.
  • the fluorescent dye can be, for example, a coumarin, a fluorescein, a kardamine, an oxazine or a cyanine dye.
  • the fluorescent dye used can be covalently or non-covalently coupled to the molecule.
  • a spacer molecule can be located between the fluorescent dye and the molecule.
  • the assay method according to the invention or the method according to the invention can be used to quantify biochemical assays in which enzymes can carry out the following modification reactions, for example: phosphorylation / dephosphorylation, sulfation / desulfationation, methylation / demethylation, oxidation / reduction, acetylation / deacetylation, amidation / Deamidation, cyclization / ring cleavage, conformational changes, cleavage of amino acids / peptides, coupling of amino acids / peptides, ring expansion / ring downsizing, rearrangements, substitutions, eliminations, addition reactions etc.
  • the assay method according to the invention or the method according to the invention can be used to advantage in high-throughput screening - in particular in high-throughput screening for identifying active pharmaceutical ingredients.
  • the invention furthermore includes a reagent kit which contains fluorescence-dye-molecule conjugates and other reagents which are required for carrying out the assay method according to the invention or the method according to the invention.
  • Fig. 1 Logarithmic temporal fluorescence decay curve of 15 nM of a fluorescein-peptide conjugate. Measured on Ultra FLT prototype (TECAN) using TCSPC.
  • Fig. 3 The course of the fluorescence lifetime (FLT in ps) is plotted against the reaction time (time in s).
  • Fig. 5 For a potential educt (FJ23, hatched) and its product (FJ24, black) of the reaction with the TAFI enzyme, the fluorescence lifetimes are under different conditions (1: water, 2: pH 6, 3: pH 7 , 4: pH 8.5, pH 9.5, 6: OOmM NaCl, 7: 2 M NaCl) was measured. 'The fluorescence lifetimes are practically independent of the conditions examined. But the fluorescence lifetimes of FJ23 (552 ps) and FJ23 (2194 ps) are very different.
  • Fl-P 1 Fluorescein-C6-TEGQYpQPQP-COOH, Eurogentec, phosphorylated
  • FLT fluorescence lifetime
  • the fluorescence lifetime of Fl-Pl is 3880 ps and the FLT of Fl-1 is 3600 ps. Since the standard deviations are very small with ⁇ 25 ps at a measuring time of 1 s, both molecules can be distinguished very well (see Fig. 2). From the standard deviations and the mean fluorescence lifetimes of Fl-Pl and Fl-1 one can calculate a z'-factor of approx. 0.5 for the performance of a potential biological test with FLT-measurement windows spanned by Fl-Pl and Fl-1. which would be enough for a screening campaign. The z 'factor was developed by Zhang et al. Introduced in 1999 to evaluate the performance of HTS assays (Zhang JH, Chung TDY, Oldenburg KR, J. Biomol. Screen 4, 67-73 (1999)). The activity of a kinase such as p60 src , which would phosphorylate Fl-1, should be very easy to measure using FLT measurements.
  • Fl-P kemptide fluorescein-C6-LRRApSLGCONH 2 , Eurogentec, phosphorylated
  • Fl-kemptide fluorescein-C6-LRRASLGCONH 2 , Eurogentec, nonphosphorylated
  • it should be possible to increase the FLT difference obtained initially e.g. by selecting and combining different parameters such as Fluorescent dye, spacer molecule between dye and substrate molecule, or polarity, pH, ionic strength of the solvent or other additives.
  • This example shows how a significant increase in the FLT difference between a phosphorylated and a non-phosphorylated variant of a fluorescein-kemptide-peptide conjugate (Fl-P-kemptide, Fl-kemptide) was achieved by increasing the pH .
  • Fl-P-kemptide fluorescein-kemptide-peptide conjugate
  • 50 nM Fl-P-Kemptid and Fl-Kemptid were dissolved in the solutions described under Material and their FLT's measured using a modified Nanoscan device (IOM GmbH, Berlin), which transmitted the signals to a transient recorder. 16 decay curves were averaged for each measurement point. The falling part of the logarithmic curve was evaluated using linear regression and the negative slope was converted into the FLT.
  • Fl-cAMP 8-Fluo-cAMP, BIOLOG Life Science Institute
  • PDElb Phosphodiesterase lb (Laboratory Dr. A. Tersteegen, Bayer AG)
  • phosphodiesterases represent a very important class of targets, among others. in the indication areas cardiovascular, metabolic diseases, central nervous system, cancer and respiratory diseases. It is therefore of great interest to have a generic assay format that can measure the conversion of cAMP or cGMP into the respective monophosphates. Detection enzyme cascades are usually used. This example shows that it is possible to measure the phosphodiesterase reaction directly.
  • 1 ⁇ M Fl-cAMP and a 1: 360 dilution of PDElb were first mixed in the presence of different concentrations of the inhibitor BAY 383045. The kinetics of the enzyme reaction was measured using an Ultra FLT prototype (Tecan) at room temperature.
  • the FLT of Fl-cAMP changes - without inhibitor - in the course of the reaction to Fl-AMP within 100 minutes from approx. 3500 ps to approx. 3350 ps.
  • Increasing concentrations of BAY 383045 increasingly inhibit the enzyme reaction (see FIG. 3).
  • the clear concentration dependence of the inhibition of the phosphodiesterase reaction has shown that the change in Fluorescence lifetime of the Fl-cAMP is clearly related to enzyme activity. This proves that this method can in principle be used to search (screen) for substances that inhibit phosphodiesterases.
  • the measuring principle should also be expandable to kinase and phosphatase and other enzyme assays if a measurable FLT change occurs during the enzymatic modification of the substrate.
  • a phosphodiesterase assay with direct FLT detection of the substrate modification should be very robust due to the interference-free measurement signal and few pipetting steps.
  • the described assay method one could rule out that substances interfere with detection enzymes.
  • the following generally applies to the described assay method based on fluorescence lifetime measurements: The incubation times of phosphodiesterase, kinase and phosphatase assays as well as other enzyme assays can be easily measured in one experiment by the direct and immediate measurement of the enzyme kinetics and set it up exactly for a robot high throughput screening campaign.
  • FJ24 Evoblue30-Ttds (spacer) -IFT-COOH, Jerini Peptide Technologies
  • TAFI thrombih activatable fibrinolysis inhibitor
  • the fluorescence lifetimes of the conjugates FJ23 and FJ24 were measured, both of which carry a fluorescent dye that can be excited at 630 nm (Evoblue30, Mobitec) and differ only in that the C-terminal arginine is missing in the FJ24 conjugate.
  • FJ23 represents a potential starting material for the TAFI reaction, while FJ24 would be the corresponding reaction product.
  • the conjugates FJ23 and FJ24 were dissolved in a concentration of 60 nM in different buffers with pH values 6, 7, 8 and 9.5, as well as in the presence of 200 mM and 2 M NaCl. Result:

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Abstract

Bei der Erfindung handelt es sich um eine Methode zum direkten Nachweis der Veränderung eines Moleküls, das einen Fluoreszenz-Farbstoff trägt, mittels Messung der Fluoreszenz-Lebenszeit.

Description

Direkte Beobachtung molekularer Veränderungen in biologischen Testsystemen mittels Messungen der Fluoreszenz-Lebensdauer
Bei der Erfindung handelt es sich um eine Methode zum direkten Nachweis der Veränderung eines Moleküls, das einen Fluoreszenz-Farbstoff trägt, mittels Messung der Fluoreszenz-Lebenszeit.
Einführung in Fluoreszenz-Spektroskopie
Alle Vorgänge, die beim Übergang eines angeregten Moleküls in dessen energetischen Grundzustand mit einer Emission von Strahlung einhergehen, werden als Lumineszenz bezeichnet und allgemein in Fluoreszenz und Phosphoreszenz unterteilt. Daneben kann die Anregungsenergie durch verschiedene nichtstrahlende Prozesse abgegeben werden.
Fluoreszenz tritt beim Übergang vom niedrigsten Schwingungsniveau des angeregten Singulett- zustandes Si in ein Schwingungsniveau des Singulettgrundzustandes S0 auf. Die Übergangsrate kf liegt im Bereich von 107 bis 1012 s"1. Die Fluoreszenzanregung erfolgt bei einer geringeren Wellenlänge, als die Fluoreszenzemission, da zwischen Aufnahme und Abgabe der Strahlungsenergie Energie durch strahlungslose Prozesse verloren geht.
Die Fluoreszenz-Lebensdauer (FLT) ist ein Maß für die Zeit, die ein Molekül im Mittel im angeregten Zustand verweilt, ehe die Fluoreszenz-Emission erfolgt. Die Strahlungslebensdauer τf entspricht der inversen Fluoreszenz-Übergangsrate kf. Im Gegensatz zu dieser Strahlungslebensdauer angeregter Moleküle müssen für eine Betrachtung der tatsächlichen - messbaren - FLT τ der angeregten Moleküle die strahlungslosen Prozesse mit einbezogen werden: τ kf +kk +kisc+kβ mit k;0 = Rate für Übergänge zwischen Schwingungszuständen, kjSC = Rate für Übergänge in Triplett-Zustände, g = Quench-Rate. Daraus wird u.a. ersichtlich, dass ein Fluoreszenz-Quencher die FLT erniedrigt. Eine ähnliche Wirkung entfalten sogenannte Akzeptor-Farbstoffe, die die Anregungsenergie des Donor-Farbstoffes strahlungslos in einem Resonanz-Phänomen aufnehmen und die aufgenommene Energie entweder strahlungslos oder als Fluoreszenz abgeben. Dadurch wird die FLT des Donor-Farbstoffes ebenfalls erniedrigt.
Methoden zur Messung der Fluoreszenzlebensdauer (FLT)
Zwei grundsätzlich unterschiedliche Methoden werden zur Messung der FLT angewandt: Messungen in der Zeit-Domäne (TD) und Messungen in der Frequenz-Domäne (FD).
In der TD-FLT wird die Probe mit einem kurzen Lichtpuls angeregt und die Fluoreszenzabkling- kurve gemessen. Grundsätzlich kann man entweder für jeden Blitz die komplette Abklingkurve aufnehmen. Dazu ist aber ein hochzeitauflösender Transientenrekorder nötig mit einer Bandbreite im Giga-Hertz-Bereich. In den meisten Fällen wird aber die sogenannte „Time correlated Single photon counting"(TCSPC)-Methode angewandt. TCSPC ist eine digitale Technik, die Photonen zählt, die zeitlich mit dem Anregungspuls korrelieren. Bei diesem Verfahren beginnt das Experiment mit einem Anregungspuls, der die Probe anregt und eine sehr schnelle Uhr startet. Sobald das erste emittierte Fluoreszenz-Photon am Detektor ankommt, stoppt die Uhr und die Zeit wird abgespeichert. Dieser Vorgang wiederholt sich vielfach. Da der Prozess der Fluoreszenzemission ein statistischer Vorgang ist, erhält man unterschiedliche Zeiten. Trägt man die Häufigkeit dieser Messzeiten gegen die Messzeit auf, so erhält man eine Fluoreszenz-Abklingkurve, deren Zeitkonstante die FLT ist (s. Fig. 1).
Die Alternative zu FLT-Messungen in der Zeitdomäne sind Messungen in der Frequenz-Domäne, die auch phasenmoduliert genannt werden. Die Probe wird mit einem kontinuierlichen Laser angeregt, dessen Lichtintensität mit einer Sinuskurve moduliert wird. Üblicherweise werden Frequenzen in der Größenordnung der Fluoreszenzübergangsraten verwendet. Wenn ein Fluoreszenzfarbstoff derart angeregt wird, so wird die Emission gezwungen, dieser Modulation zu folgen. Je nach FLT wird die Emission relativ zrur Anregung verzögert. Diese Verzögerung wird als Phasenverschiebung gemessen, aus der die FLT berechnet werden kann. Außerdem nimmt die maximale Differenz zwischen dem Maximum und Minimum des modulierten Emissionssignals mit zunehmender FLT ab, so dass die FLT auch daraus berechnet werden kann.
Fluoreszente Messmethoden für die Detektion biologischer Testsysteme
Für die Detektion biochemischer Testsysteme unter dem Aspekt des hohen Durchsatzes und hoher Stabilität haben sich u.a. folgende Methoden bewährt:
Die Messung der Fluoreszenzintensität kann z.B. dazu verwendet werden, um die Fluoreszenzzunahme einer Protease-Reaktion mit einem fluorogenen Peptid-Substrat, von dem fluoreszentes Aminocoumarin (AMC) abgespalten wird, zu messen. Im der Regel werden große Signale gemessen, aber die Autofluoreszenz von Screening-Substanzen könnte stören. Außerdem ist das Fluoreszenzintensitätssignal anfällig für den sogenannten „inner Filter Effekt", wenn sich in der Lösung eine absorbierende Substanz befindet. Dynamische Fluoreszenzlöschung durch Molekül- Kollision wie auch Lichtstreuung in trüben Lösungen kann ebenso stören wie das Ausbleichen des Fluoreszenzfarbstoffes oder Volumen-/Meniscus-Effekte. Außerdem ist das Fluoreszenzsignal abhängig von der Konzentration des Fluoreszenzfarbstoffes und von der Temperatur. All diese Störquellen werfen für die Stabilität solcher Assays und für deren Einsatz als Screeningmethode Fragen auf. Andererseits sind derartige Assays sehr leicht bei sehr kurzen Messzeiten durchführbar und haben sich deshalb zu einem Standard im HTS entwickelt. Wird ein kleines fluoreszentes Molekül z.B. durch einen wesentlich größeres Molekül (z.B. ein Protein) gebunden, so kann die verlangsamte Rotationsdiffusion des entstandenen großen Molekülkomplexes durch die Messung der stationären Fluoreszenzpolarisation gemessen werden. Auch diese Methode hat sich inzwischen zu einem Standard für Bindungsreaktionen im HTS entwickelt. Störeinflüsse durch den „inner Filter Effekt", durch Lichtstreuung, Konzentration und Temperatur machen sich nicht bemerkbar. Allerdings wird die Fluoreszenzpolarisation auch durch echtes Kollisions-Quenching, Autofluoreszenz, Volumen und Meniskus der Lösung beeinflusst.
Eine weitere Methode für Bindungsereignisse nutzt den Fluoreszenzresonanzenergie-Transfer (FRET) zwischen einem Donor- und Akzeptorfarbstoff, bei denen das Emissionsspektrum des Donor-Farbstoffes mit dem Anregungsspektrum des Akzeptorfarbstoffes überlappt, aus. In der betreffenden Bindungsreaktion muss ein Partner den Donor-Farbstoff und der andere Partner den Akzeptor-Farbstoff tragen. Nur bei Bindung kommt es durch die räumliche Nähe zum FRET. Bei der Messung des FRET's stören „inner Filter Effekt", Quencher und Autofluoreszente Substanzen. Lichtstreuung, Photobleaching, Volumen- u. Meniskuseffekte wie auch Konzentration und Tem- peratur stören dagegen nicht. Daher sind sowohl Fluoreszenzpolarisation als auch FRET im Vergleich zur Fluoreszenzintensität relativ robuste Methoden zur Messung der Interaktion von Molekülen.
Im Vergleich zu den genannten Fluoreszenzmethoden ist die Fluoreszenz-Lebenszeit (FLT) er- • heblich robuster. Sie wird nur in einigen Fällen von stark autofluoreszenten Substanzen mit vergleichbarer FLT gestört. Aber weder „inner Filter Effekt", noch KoUisions-Quencher, Photobleaching, Volumeneffekte oder Konzentration beeinflussen die FLT. Diese Eigenschaften prädestinieren diese robuste Methode für den Einsatz im Screening. Auf der anderen Seite sind für FLT noch keine Screening-Assays etabliert, was bisher hauptsächlich durch den geringen Durchsatz und hohe Kosten für die Instrumentierung begründet ist. Moderne Entwicklungen von leistungsstarken und stabilen Lasern sowie Detektionssystemen ermöglichen neuerdings den Einstieg in FLT-Messungen auf Mikrotiterplatten und somit ins Substanz-Screening. So hat die Fiπna Tecan mit dem Ultra Evolution Ende 2002 erstmals ein kommerzielles Gerät zur Auslesung von Mikrotiterplatten auf den Markt gebracht.
Bekannte FLT-Applikationen: Die Messung der FLT wurde auf verschiedenste biologische Fragestellungen angewendet. Dabei wurden entweder fluoreszente Sondenmoleküle eingesetzt, die bei Bindung von Kationen wie z.B. Ca + (Schoutteten L., Denjean P., Joliff-Botrel G., Bernard C, Pansu D., Pansu R.B., Photochem. Photobiol. 70, 701-709 (1999)), Mg2+ (Szmacinski K, Lakowicz J.R., J.Fluoresc. 6, 83-95 (1996)), H+(Zz/z HJ., Szamacinski, Anal. Biochem. 269, 162-167 (1999)), Na"1 '(Lakowicz J.R., Szamacinski K, Nowaczyk K., Lederer W.J., Kirby M.S., Johnson M.L., Cell Calcium 15, 7-2.7 (1994)), K+ (Szmacinski H., Lakowicz J.R. in „ Topics in Fluorescence Spectroscopy" Vol. IV, (Lakowicz, J.R., Ed.), 295-334 (1994)) oder Anionen wie z.B. CI" (A.S. Verlanan, Am.J.Physiol 253, C375-C388 (1990)) ihre Fluoreszenzeigenschaften und insbesondere die Fluoreszenz-Lebenszeiten verändern. Oder die Änderung der Fluoreszenzlebenszeit wird erreicht durch eine Bindungsreaktion mit einem Molekül, das entweder durch Resonanz-Energietransfer (Quench oder FRET) zu einer kleineren FLT für den Donor-Farbstoff führt, oder in seltenen Fällen eine größere FLT bedingt. Mit Hilfe der. Bindung eines Cy3 -markierten Anti-Phosphotyrosin- Antikörpers wurde z.B. die Aktivität einer Rezeptor Tyrosin-Kinase gemessen (F.S. Wouters, P.I.H. Bastiaens, Current Biology 9, 1127-1130, 1999).
Es wird bisher keine Anwendung eines biologischen Testsystems beschrieben, wo die Änderung der FLT zur Messung der Modifikation eines Moleküls verwendet wird, ohne das eine Bindungsreaktion involviert ist. Auf der anderen Seite wäre ein Assay, bei dem die Veränderung eines Moleküles, z.B. eines Substrates durch ein Enzym, direkt gemessen wird, von großem Vorteil. Denn der Substratumsatz eines Substrates könnte direkt gemessen werden, ohne dass eine Enzym-Kaskade oder Bindungsreaktion benötigt wird, die den primären Substratumsatz indirekt sichtbar macht Der Vorteil für ein Sübstanzscreening liegt darin, dass die getesteten Substanzen nicht mehr mit den Nachweisreaktionen interferieren können. Damit ließen sich vorgetäuschte Hits oder Substanzen, die aufgrund der Interferenzen nicht bewertet werden können, vermeiden.
Screening-Assay-Formate für Kinasen/Phosphatasen
Protein-(De-)Phosphorylierung ist ein allgemeiner regulatorischer Mechanismus, mit dem Zellen selektiv Proteine modifizieren, die regulatorische Signale von außen in den Zellkern vermitteln. Die Proteine, die diese biochemischen Modifikationen ausführen gehören zur Gruppe der Kinasen bzw. Phosphatasen. Phosphodiesterasen hydrolysieren den sekundären Botenstoff cAMP bzw. cGMP und nehmen auf diese Weise ebenfalls Einfluss auf zelluläre Signaltransduktionswege. Daher dienen diese Enzyme als hochinteressante Zielmoleküle der Pharma- und Pflanzenschutzforschung.
Für das Screening von Kinasen haben sich verschiedene Formate etabliert, denen gemeinsam ist, dass die Phosphorylierungsreaktion (abgesehen von radioaktiven Methoden) immer indirekt ge- messen wird. Daher sind diese Verfahren grundsätzlich störanfällig durch Substanzen, die mit der nachgeschalteten Enzymkaskade oder Bindungsreaktion interferieren. Einige Methoden sind sogar nur auf Tyrosin-Kinasen begrenzt. Traditionelle Methoden zur Messung des Phosphorylierungszustandes zellulärer Proteine basieren auf den Einbau von radioaktivem 32P-orthophosphate. Die 32P-phosphorylierten Proteine werden auf einem Gel getrennt und anschließend mit einem Phospho-hnager sichtbar gemacht. Alternativ können phosphorylierte Tyrosinreste durch Bindung von radioaktiv markierten anti-Phospho- tyrosin-Antikörpern gebunden und durch Irnrnunoassays z.B. Lnmunoprezipitation oder Blotting, nachgewiesen werden. Da diese Methoden radioaktive Isotopen nachweisen müssen, sind sie zeitaufwendig und auch aufgrund der Sicherheitsaspekte im Umgang mit radioaktiven Substanzen nicht für die Hochdurchsatz- Wirkstofffindung ( HTS, ultra high throughput screening) geeignet.
Neuere Methoden ersetzen die radioaktiven Irnrnunoassays durch ELISAs (enzyme-linked immunosorbent assay). Diese Methoden verwenden aufgereinigte Substratproteine oder synthetische Peptidsubstrate, die auf einer Substratoberfläche immobilisiert sind. Nach Einwirkung einer Kinase wird das Ausmaß der Phosphorylierung dadurch quantifiziert, indem anti-Phosphotyrosin- Antikörper, die mit einem Verstärkerenzym wie z.B. Peroxidasen gekoppelt sind, an die phos- phorylierten immobilisierten Substrate binden.
Epps. et al. (US 6203994) beschreiben einen Fluoreszenz-basierten HTS-Assay für Protein Kinasen und Phosphatasen, der fluoreszenzmarkierte phosphorylierte Reportermoleküle und Antikörper, die spezifisch die phosphorylierten Reportermoleküle binden, verwendet. Die Bindung wird mittels Fluoreszenzpolarisation, Fluoreszenzquench oder Fluoreszenz Correlations Spektroskopie (FCS) gemessen. Dieses Verfahren hat den intrinsischen Nachteil, dass es nur gute generische Antikörper (z.B. clone PT66, PY20, Sigma) für Phosphotyrosin-Substrate gibt. Es werden nur wenige Beispiele von geeigneten anti-Phosphoserin- bzw. anti-Threonin-Antikörpern berichtet (z.B. Bader B. et al., Journal of Biomolecular Screening, 6, 255 (2001), Panvera-Kit No. P2886). Diese Antikörper haben aber die Eigenschaft, nicht nur Phosphoserin, sondern auch die benachbarten Aminosäuren als Epitop zu erkennen. Es ist aber bekannt, dass Kinasen sehr substratspezifisch arbeiten und sich die Substratsequenzen stark unterscheiden können. Daher sind anti-Phosphoserin-Antikörper nicht als generiscrie Reagenzien einsetzbar.
Die Firma Perkin Eimer (Wallac) bietet für Tyrosin-Kinasen einen Assay an, der auf zeitaufgelöster Fluoreszenz und einem Energietransfer von Europium-Chelaten auf Allophycocyanin beruht (s.auch EP929810). Auch hier ist das Verfahren durch die Verwendung von Antikörpern im wesentlich auf Tyrosin-Kinasen beschränkt.
Die Firma Molecular Devices bietet seit kurzem Nanopartikel mit geladenen Metall-Kationen auf der Oberfläche als generisches Bindungsreagenz an, dass für Phosphorylierungsreaktionen sowohl an Tyrosin, als auch an Serin und Threonin geeignet ist. Die Bindungsreaktion wird aber im stark sauren pH von ca. 5 und bei hoher Ionenstärke durchgeführt. Daher ist für die Bindung der Nanopartikel ein starker Verdünnungsscliritt der Reaktion in den Ziel-Puffer notwendig, was bei Assay-Gesamtvolumina von lOμl im 1536-Format im uHTS problematisch ist. Die Messung der Bindung geschieht auch hier mittels Fluoreszenzpolarisation.
Fluoreszenzpolarisation ist als Messmethode relativ aufwendig und erlaubt derzeit noch keine parallele Messung einer Mikrotiterplatte (MTP). Daher wären die Messzeiten für eine 1536-MTP sehr hoch und die parallele Messung von Enzymkinetiken nicht möglich. Außerdem ist die Fluoreszenzpolarisation als Methode auf sehr kleine fluoreszente Substrate beschränkt.
Des weiteren kann die Kinase-Aktivität durch den Verbrauch von ATP mittels Firefly-Luciferase bzw. durch die Bildung von ADP mittels nachgeschalteter Enzymkaskade gemessen werden. Diese Assay-Formate haben den Nachteil, dass sie aufgrund der indirekten Messmethode nicht nur stärker streuende Messwerte erzeugen, sondern auch Probleme mit Substanzen haben, die die Kaskaden-Enzyme hemmen.
Könnte man die Phosphorylierung/Dephosphorylierung direkt durch Detektion der FLT messen, wäre die Messung direkter und damit weniger behaftet mit systematischen oder zufälligen Fehlern. Außerdem wäre die Limitierung einiger Assay-Formate auf Tyrosin-Kinasen bzw. Phosphatasen beseitigt, da kein spezifischer Antikörper mehr benötigt würde.
Bestehende Assay-Probleme:
Für Proteasen, bei denen C-terminale Aminosäuren abgespalten werden, können in sehr vielen Fällen fiuorogene Substrate mit C-terminalen Farbstoffen wie z.B. Aminocoumarin verwendet werden. Endoproteasen, die inmitten von Peptid-Sequenzen schneiden, können meist gut in FRET- Assays gemessen werden, wobei sich die Donor (z.B. EDANS)- und Akzeptor-Farbstoffe (z.B. Dabcyl) an den Enden des Substrates befinden. Durch die Substrat-Spaltung nimmt die Fluoreszenzintensität zu, weil der Akzeptor-Farbstoff den Donor-Farbstoff nicht mehr quenchen kann. Es gibt aber auch Proteasen, für die keine fluorogenen Substrate konstruiert werden können. In solchen Fällen muss die Enzymrealction entweder mittels aufwendiger chemischer Analytik (z.B. HPLC/MS, GC/MS) oder durch chemische Reaktion oder Enzymkaskaden indirekt gemessen werden. Dadurch müssen alle Nachteile hinsichtlich der Stabilität des Assays und unspezifischer Reaktionen von Screening-Substanzen mit der Nachweisreaktion in Kauf genommen werden. Die aufwendige Analytik ist nicht für das Hochdurchsatz-Screening geeignet. Enzyme, deren Reak- tionen - im erforderlichen Durchsatz - nicht direkt gemessen werden können, umfassen solche, die z.B. folgende Modifikationen an Substraten vornehmen: Phosphorylierung/Dephosphorylierung, Sulfatierung/Desulfatierung, Methylierung/Demethylierung, Oxidationen/Reduktionen, Acetylie- rung/Deacetylierung, Amidierung/Deamidierung, Cyclisierung/Ringspaltung, Konformationsände- rungen, Abspaltung von Aminosäuren/Peptiden/Ankopplung von A inosäuren/Peptiden, Ringaufweitung/Ringverkleinerung, Umlagerungen, Substitutionen, Eliminierungen, Additionsreaktionen etc.
Beschreibung der Erfindung:
Die Fluoreszenzlebenszeit (FLT) ändert sich prinzipiell, wenn sich die chemische Umgebung ändert. Allerdings sind derartige FLT-Änderungen bisher noch nicht generell vorhersagbar, insbesondere, wenn es sich um nur kleine molekulare Veränderungen handelt. Daher beinhalteten bisher alle publizierten FLT-Assays immer eine Bindungsreaktion entweder mit einem Sensormolekül oder mit einem quenchenden Partnermolekül.
Bei unseren Versuchen hat sich überraschend gezeigt, dass bereits Peptide, die sich nur durch eine Phosphorylierung unterscheiden, eine deutliche FLT-Differenz aufweisen. Weitergehende Experimente haben gezeigt, dass diese Aussage auf ein weiteres Peptid erweitert werden konnte. Um hierfür akzeptable FLT-Differenzen zwischen dem phosphorylierten und nichtphosphorylier- ten Peptid zu erhalten, mussten zuvor diverse Bedingungen getestet werden. Aus dem Experiment wurde aber auch klar, dass FLT-Differenzen durch Änderung von Parametern optimiert werden können. Basierend auf diesen Experimenten sollte es möglich sein, FLT-Messungen auf alle Kinase- und Phosphatase-Reaktionen auszudehnen. Darüber hinaus sollten sich auch andere Reaktionen erschließen lassen, die mit bisherigen Methoden im Hinblick auf HTS-Tauglichkeit nicht oder nur sehr indirekt messen lassen. Generell sollte gelten:
Ändert sich z.B. der Phosphorylierungszustand eines Eduktes bei Umwandlung in sein Produkt, so sollte ein geeignet angekoppelter Farbstoff diese molekulare Modifikation durch Änderung der FLT anzeigen. Solch eine Methode hat das Potenzial, generisch auf Tyrosin- wie auch Serin-/ Threonin-Kinasen sowie Phosphatasen anwendbar zu sein. Ebenso sollte das Prinzip auf andere Modifikationsreaktionen anwendbar sein wie z.B. Sulfatierung/Desulfatierung, Methylierung/De- methylierung, Oxidationen/Reduktionen, Acetylierung/Deacetylierung, Amidierung/Deamidie- rung, Cyclisierung/Ringspaltung, Konformationsänderungen, Abspaltung von Aminosäuren/Peptiden/ Ankopplung von Aminosäuren/Peptiden, Ringaufweitung/Ringverkleinerung, Umlagerungen, Substitutionen, Eliminierungen, Additionsreaktionen etc. FLT-Messungen sind aktuell sehr schnell möglich (z.T. 50 ms oder weniger pro well), so dass die Methode für das Hochdurchsatzscreening geeignet ist. Besonders vorteilhaft ist für HTS-Anwendungen die große Robustheit gegenüber Störeinflüssen wie z.B. Inner Filter Effect, Autofluoreszenz, Lichtstreuung, Photobleaching, Volumen-/Meniscus-Effekten, Konzentration des fluoreszenten Substrates. Aus der Anwendung ergibt sich, dass nur 2 Komponenten, Substrat und Enzym, gemischt werden müssen, um die Reaktion zu starten und zu messen. Konventionelle Assayverfahren benötigen in der Regel die Zugabe weiterer Reagenzien, wie z.B. Kaskadenenzyme, damit die Reaktion messtechnisch erfasst werden kann. Mit jedem Pipettierschritt wird ein Pipettierfehler und damit ein zusätzliche Fehler für das Messresultat verursacht, was man auch Fehlerfortpflanzung nennt. Diese fortgepflanzten Fehler führen 'zu einer erhöhten Varianz der Messresultate.
Werden dann, wie beim Substanz-Screening sehr kleine Volumina pipettiert, so sind die Fehler jedes einzelnen dieser Schritte nicht mehr zu vernachlässigen. Deshalb ergibt für alle Testsysteme, in denen kleine Volumina pipettiert werden müssen und insbesondere für das Subanzscreening, die Notwendigkeit, die Anzahl der Fehlerquellen und damit auch der Pipettierschritte zu reduzieren.
Daraus ergibt sich, dass diese Erfindung einfachere, robustere und genauere Messresultate als herkömmliche Assay- Verfahren ermöglicht. Diese Vorteile kommen besonders beim Substanz- Screening zum tragen.
Die erfindungsgemäße homogene Assay-Methode bzw. das erfindungsgemäße Verfahren zur direkten quantitativen Messung von Molekül-Modifikationen ist dadurch gekennzeichnet, dass das Molekül einen Fluoreszenz-Farbstoff trägt und dass die Fluoreszenz-Lebensdauer des Moleküls sich von der Fluoreszenz-Lebensdauer des modifizierten Moleküls unterscheidet. Dabei kann die Fluoreszenz-Lebensdauer des modifizierten Moleküls größer sein als die des nicht modifizierten Moleküls. Die Erfindung umfasst aber auch eine erfindungsgemäße Assay-Methode, bei der die Fluoreszens-Lebensdauer des modifizierten Moleküls geringer ist als die des nicht modifizierten Moleküls.
Bei dem Molekül kann es sich z.B. um ein organisches, insbesondere um ein Peptid oder Peptido- Mimetikum, oder anorganisches Molekül handeln. Der Fluoreszenzfarbstoff kann z.B. ein Coumarin-, ein Fluorescein-, ein Khodamin-, ein Oxazin- oder ein Cyanin-Farbstoff sein kann. Der verwendete Fluoreszenz-Farbstoff kann kovalent oder nicht-kovalent an das Molekül angekoppelt ist. Zwischen dem Fluoreszenz-Farbstoff und dem Molekül kann sich ein Spacer-Molekül befinden. Bestandteil der Erfindung ist ebenfalls die Verwendung der erfindungsgemäßen Assay- Methode bzw. des erfindungsgemäßen Verfahrens zur Quantifizierung biochemischer Assays. Die erfindungsgemäße Assay-Methode bzw. das erfindungsgemäße Verfahren kann zur Quantifi- zierung biochemischer Assays verwendet werden, bei denen Enzyme z.B. folgende Modifikationsreaktionen ausführen können: Phosphorylierung/Dephosphorylierung, Sulfatierung/Desul- fatierung, MethylierungDemethylierung, Oxidationen/Reduktionen, Acetylierung/Deacetylierung, Amidierung/Deamidierung, Cyclisierung/Ringspaltung, Konformationsänderungen, Abspaltung von Aminosäuren/Peptiden Ankopplung von Aminosäuren/Peptiden, Ringaufweitung/Ring- verkleinerung, Umlagerungen, Substitutionen, Eliminierungen, Additionsreaktionen etc. Außerdem kann die erfindungsgemäße Assay-Methode bzw. das erfindungsgemäße Verfahren für den Einsatz im Hochdurchsatz-Screening - insbesondere im Hochdurchsatz-Screening zur Identifizierung von pharmazeutischen Wirkstoffen - nutzbringend eingesetzt werden.
Bestandteil der Erfindung ist des weiteren ein Reagentien-Kit, der Fluoreszenz-Farbstoff-Molekül- Konjugate und andere Reagenzien enthält, die zur Durchführung der erfindungsgemäßen Assay- Methode bzw. des erfindungsgemäßen Verfahrens benötigt werden.
Beschreibung der Figuren:
Fig. 1: Logarithmierte zeitliche Fluoreszenzabklingkurve von 15 nM eines Fluorescein-Peptid- Konjugates. Gemessen auf Ultra FLT Prototyp (TECAN) mittels TCSPC.
Fig. 2: Unterschiede in der Fluoreszenzlebenszeit eines phosphorylierten (1) und nicht- phosphorylierten (2) Peptides (1: Fl-Pl, 2: Fl-1). Measurement time 1 s. The mean and Standard deviation of 10 measurements is shown.
Fig. 3: Der zeitliche Verlauf der Fluoreszenz-Lebensdauer (FLT in ps) ist gegen die Reaktionszeit (time in s) aufgetragen. Während der Reaktion der Phosphodiesterase PDElb mit Fluorescein-cAMP
( Fluor escein - cAMP(τ&düCt ) — ^^ — > Fluor escein - AMP(τpmdut,t ) ) ändert sich die Fluoreszenz-Lebensdauer innerhalb von 100 Minuten von ca. 3500 ps auf ca. 3350 ps. Diese Änderung zeigt direkt die Umwandlung von Fl-cAMP in Fl-AMP an. Durch steigende Konzentrationen an BAY 383045 (grüne Dreiecke: 20 μM, rote Quadrate: 10 μM, violette Kreuze: 5 μM, braune Kreise: 2.5 μM, rosa Quadrate: 1.25 μM, blaue Rauten: 0.7 μM, grüne Pluszeichen: 0.35 μM, dunkelblaue Minuszeichen: 0.17 μM, hellblaue Minuszeichen: 0.08 μM) wird die Enzymreaktion zunehmend gehemmt.
Fig. 4: Die Fluoreszenz-Lebensdauer-Unterschiede zwischen der phosphorylierten und nicht- phosphorylierten Form eines Fluorescein-Kemptid-Peptide-Konjugates sind bei erschie- denen pH-Werten bzw. 200 mM NaCl aufgetragen (1: pH 13, 2: pH 9.5, 3: pH 8, 4: pH 7, 5: pH 200 mM NaCl, 7: pH 6.
Fig. 5: Für ein potentielles Edukt ( FJ23, schraffiert) und dessen Produkt (FJ24, schwarz) der Umsetzung mit dem TAFI-Enzym sind die Fluoreszenz-Lebensdauern unter verschiedenen Bedingungen (1: Wasser, 2: pH 6, 3: pH 7, 4: pH 8, 5: pH 9.5, 6: OOmM NaCl, 7: 2 M NaCl) gemessen worden. 'Die Fluoreszenz-Lebensdauern sind praktisch unabhängig von den untersuchten Bedingungen. Aber die Fluoreszenz-Lebensdauern von FJ23 (552 ps) undFJ23 (2194 ps) unterscheiden sich sehr deutlich.
Beispiele:
1. Unterschiede in der Fluoreszenzlebenszeit eines phosphorylierten und nicht-phos- phorylierten Peptides (FL-Pl vs. FL1)
Material:
Fl-P 1 : Fluorescein-C6-TEGQYpQPQP-COOH, Eurogentec, phosphoryliert
Fl-1: Fluorescein-C6-TEGQYQPQP-COOH, Eurogentec, nichtphosphoryliert
Durchführung:
Es sollte untersucht werden, ob sich die Fluoreszenz-Lebensdauer (FLT) der Fluorescein-Peptid- Konjugate Fl-Pl und Fl-1 unterscheiden. Dazu wurden je 10 nM Fl-Pl und Fl-1 in 50 mM HEPES pH 7.5 gelöst. Die Fluoreszenzlebensdauern (FLT) wurden mittels eines Ultra FLT-Prototypen (Tecan) gemessen. Jeweils 10 Messungen a l s wurden gemittelt.
Ergebnis:
Die Fluoreszenz-Lebensdauer von Fl-Pl beträgt 3880 ps und die FLT von Fl-1 3600 ps. Da bei einer Messzeit von 1 s die Standardabweichungen mit < 25 ps sehr klein sind, lassen sich beide Moleküle sehr gut unterscheiden (s. Fig. 2). Aus den Standardabweichungen und den mittleren Fluoreszenz-Lebensdauern von Fl-Pl und Fl-1 kann man für die Leistungsfähigkeit eines potentiellen biologischen Tests mit durch Fl-Pl und Fl-1 aufgespannten FLT-Messfenster einen z'- Faktor von ca. 0.5 berechnen, was für eine Screening-Kampagne ausreichend wäre. Der z' -Faktor -wurde von Zhang et al. 1999 zur Bewertung der Leistungsfähigkeit von HTS-Assays eingeführt (Zhang JH, Chung TDY, Oldenburg KR, J. Biomol. Screen 4, 67-73 (1999)). Die Aktivität einer Kinase wie z.B. p60src, die Fl-1 phosphorylieren würde, müsste mittels FLT-Messungen sehr gut messbar sein.
Viele heute verwendete Kinase- Assays sind Endpunkt-Assays, wo die Kinetik nicht kontinuierlich verfolgt werden kann. Vielmehr müssen verschiedene Reaktionen zu verschiedenen Zeiten ge- stoppt werden und die erhaltenen Messwerte anschließend zu einer Kinetik-Kurve zusammengesetzt werden.
Durch die Messung von Fluoreszenz-Lebensdauern kann die Kinetik der Phosphorylierung ohne Detektions-Enzymkaskade direkt und unmittelbar verfolgt werden. Dies erleichtert insbesondere auch die Einstellung der Inkubationszeit für eine Roboter-Screening-Kampagne. 2. Optimierung des FLT-Unterschiedes zwischen Fluorescein-markiertem phos- phoryliertem und nicht phosphoryliertem Kemptid-Peptid
Material:
Fl-P-Kemptid: Fluorescein-C6-LRRApSLGCONH2 , Eurogentec, phosphoryliert
Fl-Kemptid: Fluorescein-C6-LRRASLGCONH2 , Eurogentec, nichtphosphoryliert
0.1 M NaOH, 50 mM Borat-Puffer pH 9.5, 50 mM HEPES-Puffer pH 8.0, 50 mM HEPES-Puffer pH 7.0, 50 mM MES-Puffer pH 6.0, 200 mM NaCl (low)
Durchführung:
Ein FLT-Assay ist umso besser, je größer die Unterschiede der Fluoreszenz-Lebenszeiten von Edukt und Produkt sind. Nicht in jedem Fall wird man auf Anhieb eine optimal große FLT- Differenz messen. Andererseits sollte es möglich sein die zunächst erhaltene FLT-Differenz zu vergrößern, z.B. durch Auswahl und Kombination verschiedener Parameter wie z.B. Fluoreszenzfarbstoff, Spacer-Molekül zwischen Farbstoff und Substratmolekül, oder Polarität, pH, Ionenstärke des Lösungsmittel oder andere Additive. In diesem Beispiel wird aufgezeigt, wie durch Erhöhung des pH-Wertes eine signifikante Vergrößerung des FLT-Unterschiedes zwischen einer phosphorylierten und einer nicht-phosphorylierten Variante eines Fluorescein-Kemptid-Peptid-Konjugates (Fl-P-Kemptid, Fl-Kemptid) eneicht wurde. Jeweils 50 nM Fl-P-Kemptid und Fl-Kemptid wurden in den unter Material beschriebenen Lösungen gelöst und deren FLT's mittels eines modifizierten Nanoscan-Gerätes (IOM GmbH, Berlin), das die Signale auf einen Transientenrekorder übertrug, gemessen. Für jeden Messpunkt wurden 16 Abklingkurven gemittelt. Der abfallende Teil der logarithmierten Kurve wurde mittels linearer Regression ausgewertet und die negative Steigung in die FLT umgerechnet.
Ergebnis:
In Fig. 4 sind die Differenzen der FLT's von Fl-P-Kemptid und Fl-Kemptid bei verschiedenen Bedingungen angegeben. In diesem Fall ergibt sich, dass die Differenzierung der phosphorylierten und nichtphosphorylierten Form von Kemptide mittels FLT besser wird, wenn sich der pH von 6.0 auf 9.5 erhöht. Das erzielte Ergebnis zusammen mit dem Befund des 1. Beispiels legt nahe, dass durch die Auswahl der richtigen Fluoreszenzfarbstoffe, Spacer und Lösungsmitteleigenschaften bzw. Additive für sehr viele, wenn nicht fast alle Paare von phosphorylierten und nicht-phos- phoryherten Peptid-Substraten für Phosphatasen bzw. Kinasen Bedingungen gefunden werden können, die zu einem für das Screening ausreichend großen Unterschied zwischen den Fluoreszenz-Lebenszeiten zwischen Edukten und Produkten führen. Somit lassen sich für die genannten Enzymklassen generische Assays aufbauen, die denkbar einfach zu entwickeln sind. Wenn die richtigen Reaktionsbedingungen für die Enzyme abgeklärt wurden, bedarf die Reaktion nur noch der Mischung von Enzym und Substrat. Die folgende Kinetik kann unmittelbar und direkt verfolgt werden. Dadurch lassen sich Inkubationszeiten an HTS-Roboter-Anlagen einfach einstellen. Aufgrund der robusten Messgröße Fluoreszenzlebenszeit wirken sich leichte Schwankungen von Volumen und Substrat-Konzentration nur geringfügig auf das Messergebnis aus. Darüber hinaus gilt generell, dass solch ein Assay mit wenig Pipettierschritten deutlich robuster, als andere Standard-Assays mit zusätzlichen Pipettierschritten, wie sie z.T. durch Detek- tions-Enzymkaskaden erforderlich werden.
3. PDE-Reaktion
Material:
Fl-cAMP: 8-Fluo-cAMP, BIOLOG Life Science Institute
PDElb: Phosphodiesterase lb (Labor Dr. A. Tersteegen, Bayer AG)
BAY 383045: Bayer AG
Durchführung:
Phosphodiesterasen stellen wie die zuv r behandelten Phosphatasen und Kinasen eine sehr bedeutsame Klasse von Targets u.a. in den Indikationsgebieten Herz-Kreislauf, Metabolische Krankheiten, Zentrales Nervensystem, Krebs und Respiratorische Krankheiten dar. Daher ist es von hohem Interesse, ein generisches Assay-Format zu haben, das die Umwandlung von cAMP bzw. cGMP in die jeweiligen Monophosphate messen kann. Üblicherweise werden Detektions- Enzymkaskaden verwendet. In diesem Beispiel wird gezeigt, das es möglich ist, die Phospho- diesterase-Reaktion direkt zu messen. Im Experiment wurden zunächst 1 μM Fl-cAMP und eine 1:360-Verdünnung von PDElb in Gegenwart verschiedener Konzentrationen des Inhibitors BAY 383045 gemischt. Die Kinetik der Enzymreaktion wurde mittels eines Ultra FLT-Prototypen (Tecan) bei Raumtemperatur gemessen.
Ergebnis:
Die FLT von Fl-cAMP ändert sich - ohne Inhibitor - im Laufe der Reaktion zu Fl-AMP innerhalb von 100 Minuten von ca. 3500 ps auf ca. 3350 ps. Steigende Konzentrationen von BAY 383045 hemmen die Enzymreaktion zunehmend (s. Fig. 3). Durch die deutliche Konzentrationsabhängigkeit der Hemmung der Phosphodiesterase-Reaktion wurde gezeigt, dass die Änderung der Fluoreszenzlebensdauer des Fl-cAMP eindeutig mit der Enzymaktivität zusammenhängt. Dadurch ist der Nachweis erbracht, dass mit dieser Methode prinzipiell nach Substanzen gesucht (gescreent) werden kann, die Phosphodiesterasen hemmen. Das Messprinzip sollte aber auch auf Kinase- und Phosphatase- und andere Enzym-Assays erweiterbar sein, wenn bei der enzymatischen Modifikation des Substrates eine messbare FLT-Änderung auftritt. Wie bei den zuvor diskutierten Phosphatase- und Kinase-Assays sollte ein Phosphodiesterase-Assay mit direkter FLT-Detektion der Substratmodifikation aufgrund des störunanfälligen Messsignals und wenigen Pipettierschritten sehr robust sein. Man könnte mit der beschriebenen Assay-Methode ausschließen, dass Substanzen mit Detektions-Enzyme interferieren. Für die beschriebene Assay- Methode auf Basis von Fluoreszenz-Lebensdauer-Messungen gilt generell: Die Inkubationszeiten von Phosphodiesterase-, Kinase- und Phosphatase-Assays wie auch anderen Enzym-Assays lassen sich durch die direkte und unmittelbare Messung der Enzymkinetik in einem Experiment sehr leicht und genau für eine Roboter-Hochdurchsatz-Screening-Kampagne einstellen.
4. Unterschied in der Fluoreszenz-Lebenszeit zwischen Edukt und Produkt der TAFI- Enzymreaktion:
Material: FJ23: Evoblue30-Ttds(Spacer)-IFTR-COOH, Jerini Peptide Technologies
FJ24: Evoblue30-Ttds(Spacer)-IFT-COOH, Jerini Peptide Technologies
Durchführung:
Beim Enzym Thrombih activatable fibrinolysis inhibitor (TAFI) handelt es sich um eine Carboxypeptidase, die in der Thrombose eine wichtige Rolle spielt. TAFI spaltet von der Peptid- Sequenz JJFTR das Arginin ab. Diese Reaktion kann entweder durch Massenspektroskopische oder chromatographische Methoden nachgewiesen werden. Beide Methoden sind nicht tauglich für die Hochdurchsatz-Substanz-Testung. Alternativ können mehr oder weniger komplexe Enzymkaskaden oder chemische Reaktionen verwendet werden, die ein messbares Absorptions-, Fluoreszenz- oder Lumineszenzsignal generieren. Bisher ist keine Methode beschrieben, mit der die TAFI-Reaktion direkt gemessen werden kann und die gleichzeitig für einen höheren Durchsatz geeignet ist. Daher wurden die Fluoreszenz-Lebensdauern der Konjugate FJ23 und FJ24 gemessen, die beide einen bei 630 nm anregbaren Fluoreszenzfarbstoff tragen (Evoblue30, Mobitec) und sich nur darin unterscheiden, dass im FJ24-Konjugat das C-terminale Arginin fehlt. FJ23 stellt ein potentielles Edukt für die TAFI-Reaktion dar, während FJ24 das entsprechende Reaktion-Produkt wäre. Die Konjugate FJ23 und FJ24 wurden in einer Konzentration von 60 nM in verschiedenen Puffern mit pH- Werten 6, 7, 8 und 9.5, sowie in Gegenwart von 200 mM und 2 M NaCl gelöst. Ergebnis:
Unabhängig vom pH-Wert und der NaCl-Konzentration beträgt die Fluoreszenzlebensdauer von FJ23 (552+45) ps und die von FJ24 (2194+18) ps (s. Fig. 5) . Daraus lässt sich ein exzellenter z'- Faktor von 0.89 berechnen, der einen sehr leistungsfähigen Assay erwarten lässt. Es wurde wie auch schon in den vorgehenden Beispielen für Kinasen, Phosphatasen und Phosphodiesterasen gezeigt, dass sich Fluoreszente Konjugate von Edukten und Produkten synthetisieren lassen, die - in Falle von TAFI - einen sehr großen Unterschied in der Fluoreszenz-Lebensdauer besitzen. Diese große Fluoreszenz-Lebensdauer-Differenz erlaubt den Aufbau eines Assay mit großer Signal-Stabilität und sehr guter Unterscheidung zwischen unterschiedlich stark hemmenden Substanzen. Darüber hinaus wurde in diesem Beispiel eine Lösung für das TAFI-spezifische Problem aufgezeigt, dass bisher für TAFI keine für hohen Durchsatz geeignete • Methoden beschrieben sind, die eine direkte Messung der Enzymreaktion ohne sekundäre Nachweisreaktionen erlauben.

Claims

P atentansprüche
1. Verfahren zur homogenen, direkten quantitativen Messung von Molekül-Modifikationen dadurch gekennzeichnet, dass das Molekül einen Fluoreszenz-Farbstoff trägt und dass die Fluoreszenz-Lebensdauer des Moleküls sich von der Fluoreszenz-Lebensdauer des modifizierten Moleküls unterscheidet.
2. Verfahren nach Anspruch 1, wobei es sich bei dem Molekül um ein organisches, insbesondere um ein Peptid oder Peptido-Mimetikum, oder anorganisches Molekül handelt.
3. Verfahren nach Anspruch 1 bis 2, wobei der Fluoreszenzfarbstoff z.B. ein Coumarin-, ein Fluorescein-, ein Rhodamin-, ein Oxazin-, ein Cyanin-Farbstoff sein kann.
4. Verfahren nach Anspruch 1 bis 3, wobei der Fluoreszenz-Farbstoff kovalent oder nicht- kovalent an das Molekül angekoppelt ist. Zwischen dem Fluoreszenz-Farbstoff und dem Molekül kann sich ein Spacer-Molekül befinden.
5. Verfahren nach Anspruch 1 bis 4 zur Quantifizierung biochemischer Assays.
6. Verfahren nach Anspruch 5, bei denen Enzyme folgende Modifikationsreaktionen ausführen können: Phosphorylierung/Dephosphorylierung, Sulfatierung/Desulfatierung, Methylierung/Demethylierung, Oxidationen/Reduktionen, Acetylierung/Deacetylierung, Amidierung/Deamidierung, Cyclisierung/Ringspaltung, Konformationsänderungen, Abspaltung von Aminosäuren/Peptiden/ Ankopplung von Aminosäuren Peptiden, Ringauf- weitung/Ringverkleinerung, Umlagerungen, Substitutionen, Eliminierungen, Additionsreaktionen.
7. Verfahren nach Anspruch 1 bis 6, für den Einsatz im Hochdurchsatz-Screening.
8. Ein Reagentien-Kit, der Fluoreszenz-Farbstoff-Molekül-Konjugate und andere Reagenzien enthält, die zur Durchführung der Assay-Methode nach Anspruch 1 bis 6 benötigt werden.
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