DE60102218T2

DE60102218T2 - Biotin-peg-substrat für einen lipase-assay

Info

Publication number: DE60102218T2
Application number: DE60102218T
Authority: DE
Inventors: Molly J. Price-Jones; Martin David JAMES; Anne Fowler; Fritz Poulsen; Hans Tornquist; R. Calvin HAWES
Original assignee: Amersham Biosciences UK Ltd
Current assignee: GE Healthcare UK Ltd
Priority date: 2000-03-29
Filing date: 2001-03-23
Publication date: 2005-03-10
Anticipated expiration: 2021-03-24
Also published as: AU4259701A; ES2217123T3; DE60102218D1; GB0007465D0; CA2403989C; US20040014133A1; US7026135B2; CA2403989A1; ATE261124T1; JP2003528944A; AU782004B2; IL151854A0; EP1269192A1; EP1269192B1; WO2001073442A1

Description

Die vorliegende Erfindung beschreibt ein neues Substrat zur Verwendung in einem Assay für Lipaseenzymaktivität. Insbesondere kann dieses neue Substrat markiert und in einem homogenen Assay verwendet werden.
Einleitung
Lipasen sind Enzyme, welche die Hydrolyse von Triacylglycerinen beim ersten Schritt der Rückgewinnung von gespeicherten Fettsäuren zur Energieerzeugung katalysieren. Die Reihenfolge der Hydrolyse ausgehend von den drei Positionen an dem Glycerin hängt von der Spezifität der einzelnen beteiligten Lipase ab.
Die Lipaseenzymaktivität ist eine wichtige Funktion, und ihre strikte Regulation ist notwendig, um einen gesunden Stoffwechsel sicherzustellen. Zum Beispiel sind Lipasen in Fettgewebe die Schlüsselenzyme für die Freisetzung von wichtigen Energiereserven. Ihre Aktivität steht unter hormonaler Kontrolle, um sicherzustellen, daß die Triacylglycerin-Hydrolyse mit dem Prozeß der Triacylglycerin-Synthese ausgeglichen ist, um ausreichende Energiereserven sicherzustellen und dennoch zu vermeiden, daß die Fettsäurespiegel so hoch werden, daß nachteilige Wirkungen hervorgerufen werden.
Ein Beispiel für eine Lipase ist die Hormon-sensitive Lipase (HSL). Dieses Enzym katalysiert den geschwindigkeitsbegrenzenden Schritt bei der Lipolyse und Verwertung von Triacylglcerinvorräten, wie sie in Fettgewebe und im Skelettmuskel zu finden sind. Sie ist eine cytosolische neutrale Lipase und ihr Triacylglcerin-Substrat ist hydrophob. Das Enzym ist bei Insulindefizienz und/oder Insulinresistenz aktiviert, wodurch eine Abnahme der Lipidvorräte bei an Diabetes Leidenden hervorgerufen wird. Die Hemmung des Enzyms ist daher bei der Behandlung von Diabetes wichtig.
Ungleichgewichte bei der Aktivität von Lipasen sind auch mit anderen klinischen Störungen einschließlich Fettleibigkeit und arteriosklerotischen Gefäßerkrankungen in Verbindung gebracht worden. Im Hinblick auf die Wichtigkeit der Lipaseaktivität bei Störungen wie diesen ist es notwendig, Assays zu haben, welche zur Messung der Enzymaktivität geeignet sind. Solche Assays könnten eine nützliche Diagnose zur Beurteilung des Status von Störungen in Zusammenhang. mit der Lipaseaktivität vorsehen. Außerdem sind Assays erforderlich, welche zur Beurteilung der Wirksamkeit irgendwelcher Verbindungen, die das Potential besitzen können, die Enzymaktivität zu modifizieren (entweder zu inhibieren oder zu erhöhen), geeignet wären.
Neuere Entwicklungen in der Genomforschung und der kombinatorischen Chemie haben eine große Zahl von neuen Arzneistoff-Zielmolekülen und neuen Verbindungen generiert. Als Folge davon haben sich Verbesserungen bei der Arzneistoff-Entdeckung auf Screening-Technologien mit einem hohen Durchsatz (HTS) und die Miniaturisierung konzentriert. Diese Technologien zielen darauf ab, eine große Zahl von entweder möglichen Arzneistoff-Zielmolekülen oder neuen Verbindungen zu durchmustern, um neue Anhaltspunkte innerhalb eines kurzen Zeitraums aufzudecken (High-Throughput Screening for Drug Discovery, James R. Broach und Jeremy Thorner, Nature, Bd. 384, Anhang, 7. November 1996, 14–16). Der Schlüssel des Erfolgs solcher HTS-Techniken ist die Entwicklung von Assays, welche an ein verkleinertes Format angepaßt werden können und welche nur eine minimale Anzahl von Schritten aufweisen, um ein automatisiertes Screeningverfahren zu erleichtern.
Da Substrate für Lipasen im allgemeinen hydrophober Natur sind, beinhalten gegenwärtige Verfahren zur Messung der Lipaseenzymaktivität typischerweise eine große Zahl von Verfahrensschritten, einschließlich einer organischen Phasenextraktion.
Zum Beispiel würde ein typisches gegenwärtiges Verfahren zur Bestimmung der Aktivität einer Lipase, wie der Hormon-sensitiven Lipase (HSL), ein Substrat wie Triacylglycerin, Cholesterylester oder Diacylglycerin einschließen. Das Triacylglycerin-Substrat würde typischerweise radiomarkiert werden, z.B. durch einen ³H-Marker. Vor der Zugabe des Substrats zu dem Enzym würde eine Substratemulsion zum Beispiel durch Beschallen oder Mischen mit Hilfe eines Vortexgeräts einer Lösung des Substrats in einer Pufferlösung (zum Beispiel 100 mM Kaliumphosphat bei pH 7,0), enthaltend 0,05% BSA oder einen Emulsionsstabilisator wie Phospholipide, gebildet werden. Die Substrat/Enzym-Mischung würde dann bei 37°C für 60 Minuten inkubiert werden, im Anschluß daran würden die Umsetzungen durch die Zugabe einer Stopplösung (wie Chloroform:Methanol:Heptan (25:23:18)) gestoppt werden. Um die Enzymaktivität bei dem Substrat zu bestimmen, wäre es notwendig, die Produkte der Enzymreaktion von dem markierten Substrat durch Extrahieren der organischen Phase der Reaktionslösung zu trennen. Dies würde durch Vortexen und Zentrifugieren der die Reaktionslösung enthaltenden Röhrchen und die Entnahme von Aliquots aus der oberen Phase für eine Flüssigkeitsszintillationszählung erreicht. Die Ergebnisse würden in nmol freigesetzter Fettsäure/mg Protein ausgedrückt (vgl. zum Beispiel: Rapid Assay for Hormone-Sensitive Lipase Activity of Adipose Tissue, Tornquist H., Krabisch L. und Belfrage P., Journal of Lipid Research 13 (1972), 424–426).
Ein solches Mehrstufenverfahren in Verbindung mit Vortexen und Zentrifugieren wäre schwer zu automatisieren und für die Durchführung mit einer großen Zahl von Proben gleichzeitig ungeeignet. Demgemäß sind bis heute keine HTS-Techniken für das Screening auf eine Lipaseenzymaktivität oder auf Verbindungen, welche als Verstärker oder Inhibitoren dieser Aktivität wirksam sein können, zur Verfügung gestellt worden.
Vor kurzem sind Assays entwickelt worden, welche auf homogenen Techniken basieren, und diese können ohne weiteres an ein HTS angepaßt werden. Im allgemeinen beinhalten homogene Assays einen Nachweis mit Hilfe eines Festphasenbindungsschritts. Ein Beispiel für einen solchen Assay ist der 'Scintillation Proximity Assay (SPA)' (Szintillationsnäherungsassay – eine vielseitige Screening-Technologie mit einem hohen Durchsatz; Cook N.D.: Drug Discovery Today 1 (1996), 287–294). Dieser Assay beinhaltet eine Festphasenbindung an Mikrokügelchen oder "Kügelchen", welche eine Szintillationssubstanz enthalten. Falls SPA-Kügelchen zum Beispiel mit einem Rezeptor beschichtet und mit einem ³H-markierten Liganden inkubiert werden, wird irgendein Ligand, der an den Rezeptor bindet, in unmittelbare Nähe zu dem Kügelchen gebracht, so daß seine radioaktive Markierung die Szintillationssubstanz anregt, wodurch die Emission eines Lichtsignals hervorgerufen wird. SPA-Ergebnisse können in Platten mit 96 und 384 Vertiefungen unter Verwendung von üblichen Mikrotiterplatten-Szintillationszählern oder in Platten mit 384 Vertiefungen oder mehr Vertiefungen unter Verwendung eines 'LEADseeker^TM Homogeneous Imaging System' (Imaging Proximity Assays – The LEADseeker Homogeneous Imaging System, Fowler A., Harvey M., Cox A., Jessop B., Looker M., Davis I., Morris J., Santos A., Turner J. und Price-Jones M., Genetic Engineering News, Band 18, Nummer 20, 15. November 1998) abgelesen werden. Das LEADseeker^TM System ist durch eine CCD-Kamera gekennzeichnet, welche die Abbildung von Mikrotiterplatten in großer Dichte in einem einzigen Durchgang ermöglicht.
Um irgendeinen Assay, welcher von einer Festphasenbindung abhängt, wie SPA, an einen Assay für die Lipaseenzymaktivität anzupassen, wäre es jedoch notwendig. das Lipasesubstrat zu modifizieren, um es in die Lage zu versetzen, an eine Oberfläche zu binden. Wegen ihrer hydrophoben Natur sind Lipasesubstrate nicht ohne weiteres für Modifikationen wie eine Biotinylierung oder eine andere Markierung zugänglich, welche für eine Festphasenbindung notwendig wären. Außerdem gäbe es im Hinblick auf die hohe Spezifität von Lipaseenzymen für hydrophobe Substrate keine Garantie, daß ein Lipasesubstrat, welches modifiziert ist, um für einen Festphasennachweis geeignet zu sein, durch das Enzym noch erkannt würde.
Bei der vorliegenden Erfindung ist ein Lipasesubstrat derart modifiziert worden, daß es an eine feste Oberfläche, wie Streptavidin-beschichtete SPA-Kügelchen, gebunden werden kann, und es ist gezeigt worden, daß es als ein wirksames Lipasesubstrat in einem Assay für die Lipaseenzymaktivität dienen kann. In einer besonderen Ausführungsform ist ein Substrat mit einer Aminogruppe in der sn-2-Position und Ölsäure (18:1) in den sn-1- und sn-3-Positionen des Triacylglycerins entwickelt worden; die Ölsäure kann durch reduktive Tritiummarkierung markiert sein. Es ist festgestellt worden, daß dieses Substrat durch den Einbau einer Biotingruppe in eine PEG-Spacergruppe biotinyliert werden kann, um ein neues modifiziertes Lipasesubstrat zu erzeugen. Eine Lipaseaktivität entfernt den markierten Teil, wodurch bei einem SPA ein verringertes Lichtsignal von den SPA-Kügelchen erhalten wird.
Gemäß einem ersten Aspekt der Erfindung wird eine Verbindung der Formel I vorgesehen:
Formel I worin bedeuten:
L ein Verbindungsmittel, umfassend ein wasserlösliches Molekül;
B ein Bindemittel;
X ein Atom oder eine Gruppe, geeignet, um L an die Glycerinkette zu binden: und
R eine geradkettige, gesättigte oder ungesättigte Alkylgruppe mit 8 bis 30 Kohlenstoffatomen, substituiert mit M' oder M", worin mindestens eines von M' und M" ein nachweisbarer Marker ist.
Das Verbindungsmittel, L, ist eine Gruppe, welche ein Bindemittel, B, mit einem Triacylglycerin in einer solchen Weise verbindet, daß das Lipasesubstrat an eine feste Oberfläche gebunden werden kann und trotzdem noch seine biologische Aktivität beibehält. Das Verbindungsmittel ist ein wasserlösliches Molekül, welches nicht-toxisch und/ oder inert sein kann. In einer bevorzugten Ausführungsform des ersten Aspekts umfaßt das Verbindungsmittel, L, eine wasserlösliche Verbindung, gewählt aus den Verbindungen Polyethylenglykol (PEG) und Polyvinylpyrrolidon (PVP). Jede dieser Verbindungen kann als ein Polymer aus einer Reihe von wiederkehrenden Einheiten bestehen. Geeigneterweise, wenn L PEG umfaßt, beträgt die Größe des PEG-Polymers zwischen 6-100 wiederkehrenden Einheiten.
In einer anderen Ausführungsform des ersten Aspekts der Erfindung ist das Bindemittel, B, in der Lage, an eine feste Phase, wie die Wände oder die Basis von Vertiefungen in einer Platte, zum Beispiel einer Mikrotiterplatte, oder an die Oberfläche eines Kügelchens, wie eines SPA-Kügelchens, zu binden. Die Bindung des Bindemittels, B, an eine feste Oberfläche kann direkt oder indirekt sein. Zum Beispiel kann eine Verbindung an eine feste Phase durch indirekte Mittel, wie durch Beschichten der festen Oberfläche mit einem Vertreter eines spezifischen Bindungspaares und Binden des anderen Vertreters an die Verbindung der Formel I, gebunden werden. Die Bindung kann durch nicht-kovalente oder kovalente Mittel erfolgen.
In einer bevorzugten Ausführungsform umfaßt das Bindemittel, B, einen Vertreter eines spezifischen Bindungspaares, wobei das spezifische Bindungspaar vorzugsweise gewählt ist aus Biotin:Avidin oder Streptavidin, Antikörper:Antigen oder Protein A, Rezeptor:Ligand, Nucleinsäure:Nucleinsäure (z.B. DNA:DNA), Weizenkeim-Agglutinin (WGA):N-Acetyl-_-glucosamin-Resten oder Glycoproteinen, Glutathion:GST (Glutathion-S-Transferase) und Kupfer:Histidin-Markierung. Andere geeignete spezifische Bindungspaare würden den Fachleuten bekannt sein. Alternativ kann die Bindung durch elektrostatische Wechselwirkung erreicht werden, zum Beispiel durch das Erzeugen einer positiv geladenen Spezies in B, welche an eine negativ geladene Spezies auf der festen Phase gebunden ist. Eine positive Ladung könnte zum Beispiel unter Verwendung eines quaternisierten Amins erzeugt werden.
In einer besonders bevorzugten Ausführungsform des ersten Aspekts der Erfindung ist das Bindemittel, B, Biotin. Auf diese Weise würde die Verbindung der Formel I in die Lage versetzt werden, an eine Avidin- oder Streptavidin-beschichtete feste Phase zu binden.
X ist ein Atom oder eine Gruppe, das/die ermöglicht, daß das Verbindungsmitel, L, an das Kohlenstoffgrundgerüst (d.h. die Glycerinkette) der in Formel I angegebenen Verbindung bindet, und wird gemäß den in dem Verbindungsmittel vorhandenen reaktiven Gruppen, welche für eine Bindung zugänglich sind, ausgewählt. Folglich würde in einer Ausführungsform, falls das Verbindungsmittel, L, eine reaktive Gruppe NHS besitzt, X dann NH umfassen. In einem Beispiel kann die NHS-Gruppe an das Verbindungsmittel über eine Esterbindung gebunden sein, in diesem Fall kann die Gruppe X O=C-NH umfassen. In einer anderen Ausführungsform, falls das Verbindungsmittel, L, Maleimid als eine reaktive Gruppe besitzt, würde X dann S umfassen. Geeignete Kopplungsmechanismen unter Beteiligung von NH, S- oder O-Atomen würden einem Fachmann bekannt sein.
Verschiedene Lipasen besitzen eine Spezifität für Triacylglycerine mit Fettsäuren unterschiedlicher Kohlenstoffkettenlängen; diese Kohlenstoffketten weisen typischerweise zwischen 8–30 Kohlenstoffatome auf und können entweder gesättigt oder ungesättigt sein. Demgemäß ist R in der Verbindung der Formel I eine geradkettige, gesättigte oder ungesättigte Alkylgruppe mit 8 bis 30 Kohlenstoffatomen. Gespeicherte Fettsäuren, wie solche, welche die Substrate für einige Lipasen bilden, weisen im allgemeinen zwischen 14 und 18 Kohlenstoffatome in der Kohlenstoffkette auf. Demgemäß wird in einer anderen Ausführungsform des ersten Aspekts der Erfindung eine Verbindung der Formel I vorgesehen, worin R 14, 16 oder 18 und vorzugsweise 18 Kolenstoffatome besitzt.
R ist mit M' oder M" substituiert, wobei mindestens eine der Gruppen M' und M" ein nachweisbarer Marker ist. Wenn entweder M' oder M" kein nachweisbarer Marker ist, dann wäre die Gruppe vorzugsweise H. Geeignete nachweisbare Marker können Radio marker, Fluoreszenzmarker oder andere Marker (einschließlich zum Beispiel lumineszierende Moleküle) sein. In einer Ausführungsform ist mindestens eines von M' und M" ein Radiomarker, wie ³H, ¹²⁵I oder ¹⁴C, oder irgendwelche andere Marken, welcher zur Verwendung in einem Szintillationssubstanz-Nachweissystem wie SPA oder anderen Assay-Systemen auf Festphasenbasis (zum Beispiel Cytostar-T ^TM Szintillations-Mikrotiterplatten (Amersham Pharmacia Biotech) oder Flashplates^TM (NEN)), geeignet sein können. In solchen Systemen können, falls der nachweisbare Marker sich in der Nähe einer festen Oberfläche befindet, Szintillationsereignisse nachgewiesen werden, wenn aber eine Lipaseaktivität auftritt, wird der Marker mit der Fettsäure freigesetzt, und das Signal der Szintillationssubstanz verringert sich. In einer besonders bevorzugten Ausführungsform ist M' und/oder M" ³H. Für Fachleute ist selbstverständlich, daß eine Wanderung der Fettsäureketten zwischen den sn-1-, sn-2- und sn-3-Positionen des Kohlenstoffgrundgerüsts eines Triacylglycerins erfolgt.
In einer anderen bevorzugten Ausführungsform des ersten Aspekts der Erfindung ist mindestens eines von M' und M" ein Fluorophor. Geeignete Fluorophore schließen zum Beispiel solche auf der Basis von Fluorescein und dessen Derivate (Handbook of Fluorescent Probes and Research Chemicals, Molecular Probes, 6. Auflage, 1996, oder vgl. www.probes.com) sowie Cyaninfarbstoffmoleküle (Cy-Farbstoffe) ein.
In einer weiteren Ausführungsform des ersten Aspekts könnten M' und M" gewählt werden, um zu ermöglichen, daß eine Verbindung der Formel I in einem 'Fluorescence Resonance Energy Transfer' (FRET)-Assay verwendet werden kann. Das Prinzip des FRET wurde in US 4,996,143 und vor kurzem in PCT/GB99/01746 (Veröffentlichungsnummer WO99/64519) beschrieben. Kurz zusammengefaßt sind FRET-Assays auf eine Wechselwirkung zwischen zwei Fluorophoren, einem Donator-Fluorophor und einem Akzeptor-Fluorophor, angewiesen. Wenn die Donator- und Akzeptormoleküle in ausreichender Nähe zueinander vorliegen, wird die Fluoreszenz des Donatormoleküls auf das Akzeptormolekül übertragen, woraus eine Verringerung der Lebensdauer und eine Auslösung der Fluoreszenz der Donatorspezies und eine gleichzeitige Erhöhung der Fluoreszenzintensität der Akzeptorspezies resultiert. Wenn die zwei Moleküle getrennt werden, wird die Fluoreszenz des Donatormoleküls wiederhergestellt, und die Fluoreszenzintensität der Akzeptorspezies nimmt ab. Die Verwendung von FRET-Markern in biologischen Systemen ist gut bekannt. Das Prinzip ist beim Nachweis von Bindungsereignissen oder Spaltungsreaktionen in Assays, welche FRET verwenden, angewendet worden.
Geeignete Akzeptor/Donator-Paare zur Verwendung in einem FRET-Assay sind im Handbook of Fluorescent Probes and Research Chemicals; Molecular Probes (http://www.probes.com) beschrieben. Um einen FRET-Assay für die Verwendung bei einem Lipasesubstrat-Enzym-Assay anzupassen, würde entweder der Akzeptor oder der Donator in dem Kügelchen oder einer anderen festen Phase enthalten sein, und die andere Spezies würde an das Substrat der Formel I in einer/beiden der M'- und M"-Positionen) gebunden sein, so daß ein Partner des Akzeptor/Donator-Paares auf dem Substrat und der andere in dem Kügelchen vorliegt. Die Donator- und Akzeptormoleküle würden in unmittelbarer Nähe zueinander gehalten werden, wenn das Substrat an das Kügelchen gebunden ist. Bei einer Lipaseenzymaktivität auf das Substrat bewirkt die Spaltung in den sn-1- und sn-3-Positionen, daß die Donator- und Akzeptormoleküle getrennt werden, wodurch die Fluoreszenz des Donatormoleküls wiederhergestellt wird, während gleichzeitig die Fluoreszenzintensität der Akzeptorspezies abnimmt.
Bei einer Anordnung des FRET-Prinzips wird ein fluoreszierendes Mittel in unmittelbare Nähe zu einem Molekül eines "Auslöschungsmittels" gebracht, so daß die Energie von dem angeregten Donator-Fluorophor auf das Auslöschungsmittel übertragen und in Form von Wärme anstatt als Fluoreszenzenergie abgegeben wird. In diesem Fall wird die restliche Fluoreszenz auf ein Minimum verringert, wenn die zwei Komponenten des Dontor-Auslöschungsmittel-Paares in unmittelbarer Nähe zueinander vorliegen, und eine starke Signaländerung kann beobachtet werden, wenn sie getrennt werden.
Cyaninfarbstoffe, welche zur Verwendung als Akzeptor- oder "Auslöscher"-Moleküle in einem FRET-Assay geeignet sind, sind entwickelt worden (vgl. PCT/GB99/01746), indem bestimmte Modifikationen bei Cyaninfarbstoffen durch die Einführung von chemischen Gruppen, welche den Effekt haben, die Fluoreszenz des Moleküls zu vermindern oder aufzuheben, durchgeführt wurden. Solche ausgelöschten Cy-Farbstoffe werden als Cy-Q-Farbstoffe oder "dunkle Cyaninfarbstoffe" bezeichnet.
Demgemäß könnte in einer anderen Ausführungsform der Erfindung das Fluorophor, welches an eines oder beides von M' und M" gebunden ist, ein "Auslöscher"- oder ein "dunkles Cyaninfarbstoff"-Molekül wie Cy-Q sein, und das Streptavidin-beschichtete Kügelchen könnte ein normal fluoreszierendes Fluorophor enthalten. Wenn das Substrat an das Kügelchen gebunden ist, wird die Fluoreszenz des Fluorophors in dem Kügelchen ausgelöscht. Wenn die Lipaseenzymaktivität bewirkt, daß eine oder beide der sn-1- und sn-3-Fettsäureketten von dem Substrat abgespalten werden, werden die "Auslöscher"-Fluorophore von dem Kügelchen abgelöst, und folglich wird die Fluoreszenz des Fluorophors innerhalb des Kügelchens wiederhergestellt. Demgemäß würde die Lipaseenzymaktivität durch das Messen einer Erhöhung der Fluoreszenz nachgewiesen.
In einer anderen Ausführungsform könnte das normal fluoreszierende Fluorophor an eines oder beide von M' und M" gebunden sein, und das "Auslöscher"-Molekül könnte in dem Streptavidin-beschichteten Kügelchen enthalten sein.
Gemäß einem zweiten Aspekt der Erfindung wird ein Verfahren zur Herstellung einer Verbindung nach irgendeiner Ausführungsform des ersten Aspekts der Erfindung vorgesehen.
In einer Ausführungsform des zweiten Aspekts umfaßt das Verfahren die Schritte:

a) Durchführen einer Umsetzung, um einen nachweisbaren Marker, M' oder M", an ein Triacylglycerin zu addieren; und
b) Anbringen eines Bindemittels, B, an das Triacylglycerinmolekül durch ein Verbindungsmittel, L.

In einer anderen Ausführungsform umfaßt Schritt a) eine Tritiummarkierungsreaktion, vorzugsweise eine Addition von ³H an die Acyl-Kohlenstoffketten in den sn-1- und/oder sn-3-Positionen.
In einer weiteren Ausführungsform ist B an ein Triacylglycerinmolekül über L gebunden, wobei L eine PEG-Spacergruppe ist. In einer besonders bevorzugten Ausführungsform umfaßt Schritt b) das Umsetzen des Triacylglycerinmoleküls mit einem Biotin-PEG-NHS-Ester.
Die Verbindung der Formel I bildet ein Substrat für eine Lipase. Lipasen, welche mit einem Substrat der Formel I untersucht werden können, schließen aus Säuger-, Hefe- oder Bakterienzellen extrahierte Lipasen ein (Beispiele für Lipasen schließen die aus Weizenkeim extrahierten, Chromobacterium-, Mucor-, Pseudomonas- und Candida-Lipasen, Lipoprotein-Lipase, hepatische und pankreatische Lipasen und Hormon-sensitive Lipase (HSL) ein). Eine Zusammensetzung kann eine Lösung umfassen, welche ein Lipaseenzym oder eine Zelle oder einen Zellextrakt enthält. Im Prinzip kann irgendein Zelltyp verwendet werden, d.h. prokaryontisch oder eukaryontisch (einschließlich Bakterien-, Säuger- und Pflanzenzellen). Falls geeignet, kann ein Zellextrakt aus einer Zelle mittels Standardverfahren, welche den Fachleuten bekannt sind (Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2. Auflage, Cold Spring Harbour Laboratory Press, 1989), hergestellt werden.
Gemäß einem dritten Aspekt der Erfindung wird ein Assay zum Nachweis von Lipaseenzymaktivität in einer Zusammensetzung vorgesehen, wobei der Assay das Inkubieren der Zusammensetzung in Gegenwart der Verbindung der Formel I, wie in irgendeiner Ausführungsform des ersten Aspekts beansprucht, und das Messen der Freisetzung des nachweisbaren Markers, M' und/oder M", aus der Verbindung als ein Anzeichen für Lipaseaktivität umfaßt.
Die Anwesenheit eines Bindemittels, B, in der Verbindung der Formel I ermöglicht, daß dieses Enzymsubstrat in einem homogenen Assay, welcher einen Festphasenbindungsschritt beinhaltet, verwendet werden kann.
Demgemäß wird in einem vierten Aspekt der Erfindung ein Assay zum Nachweis von Lipaseenzymaktivität in einer Zusammensetzung vorgesehen, umfassend:

a) Mischen der Zusammensetzung mit einer Verbindung der Formel I, wie in irgendeiner Ausführungsform des ersten Aspekts beansprucht;
b) Inkubieren unter Bedingungen zur Förderung der Lipaseenzymaktivität;
c) Zugeben einer festen Phase unter Bedingungen zur Förderung der Bindung der Verbindung an die feste Phase; und
d) Nachweisen der Menge an M' und/oder M" auf der festen Phase als ein Anzeichen für Lipaseenzymaktivität.

Unter einem fünften Aspekt der Erfindung wird ein Assay zum Nachweis von Lipaseenzymaktivität in einer Zusammensetzung vorgesehen, umfassend:

a) Inkubieren der Verbindung der Formel I, wie in irgendeiner Ausführungsform des ersten Aspekts beansprucht, mit einer festen Phase unter Bedingungen zur Förderung der Festphasenbindung;
b) Zugeben der Zusammensetzung zu der Festphasen-gebundenen Verbindung;
c) Inkubieren unter Bedingungen zur Förderung der Lipaseenzymaktivität;
d) Nachweisen der Menge an M' und/oder M" auf der festen Phase als ein Anzeichen für Lipaseenzymaktivität.

In einer Ausführungsform des vierten oder fünften Aspekts bringt die Bindung der Verbindung an die feste Phase die Verbindung in die Nähe zu einer Szintillationssubstanz, und der Nachweis von M' und/oder M" auf der festen Phase erfolgt durch Zählen von Szintillationsereignissen, d.h. "Szintillationszählung".
In einer anderen Ausführungsform des vierten oder fünften Aspekts ist die feste Phase die Oberfläche eines SPA-Kügelchens, vorzugsweise eines Streptavidin-beschichteten Yttriumsilicat (YSi)- oder PVT (Poly(vinyltoluol))-SPA-Kügelchens. Andere geeignete Kügelchen schließen YOx (Yttriumoxid) (Amersham Pharmacia Biotech)- oder Polystyrol (PST)-Kügelchen ein.
In einer weiteren Ausführungsform wird ein Assay vorgesehen, wobei die feste Phase eine Oberfläche einer Platte ist, wie einer Mikrotiterplatte, vorzugsweise einer CytostarTM-Platte (Amersham Pharmacia Biotech) oder Flashplates^TM (NEN).
Enzymassays können zum Beispiel in einer SPA-Anordnung von 96 Vertiefungen oder einer LEADseeker^TM-Anordnung von 384 Vertiefungen durchgeführt werden und sind zur Verwendung beim Screening geeignet. Das LEADseeker^TM-System ist durch eine CCD-Kamera gekennzeichnet, welche die Abbildung von Mikrotiterplatten in großer Dichte in einem einzigen Durchgang ermöglicht. Dieses System kann für die Auswertung von Assays in radioaktiven, fluoreszierenden und lumineszierenden Anordnungen verwendet werden.
Das Lipaseenzymsubstrat der Formel I kann in einem Assay zum Nachweis der Anwesenheit einer Verbindung in einer Zusammensetzung, welche die Lipaseenzymaktivität modifizieren kann, verwendet werden. Demgemäß umfaßt in einer besonders bevorzugten Ausführungsform nach irgendeinem des dritten, vierten oder fünften Aspekts der Erfindung die Zusammensetzung ein Lipaseenzym und einen mutmaßlichen Inhibitor oder Verstärker der Lipaseenzymaktivität.
In einer Ausführungsform nach irgendeinem des dritten, vierten oder fünften Aspekts der Erfindung umfaßt der Assay weiterhin die Zugabe einer Stopplösung zu dem Reaktionsgemisch vor der Messung von M' oder M".
Unter einem sechsten Aspekt der Erfindung wird die Verwendung einer Verbindung der Formel I gemäß irgendeiner Ausführungsform des ersten Aspekts in einem Assay nach irgendeiner Ausführungsform der dritten, vierten oder fünften Ausführungsformen vorgesehen.
Die vorliegende Erfindung wird unter Bezugnahme auf die folgenden Figuren und Beispiele weiterhin veranschaulicht, wobei:
1 ein Reaktionsschema 1 für die Herstellung eines HSL-Substrats zeigt.
2 die Ergebnisse einer Enzymtitration zeigt, welche Testanordnungen 'auf' (o) und 'nicht' auf (•) Kügelchen vergleichen.
3 den Einfluß der Zeit auf die Substratspaltung durch 5 nM Lipase zeigt.
4 die Inhibierung der Lipaseaktivität durch Ebelacton B zeigt.
5 die Ergebnisse einer Enzymtitration zeigt, welche SPA (o)- und LEADseeker (•)-Testanordnungen vergleichen.
6 die Inhibierung der Lipaseaktivität durch Ebelacton B zeigt, nachgewiesen unter Verwendung von YSi-SPA-Kügelchen (o) und YOx-LEADseeker-Kügelchen (•).
7 die Spaltung eines HSL-Substrats durch eine Auswahl von Lipasen zeigt.
8 die Inhibierung von HSL durch PMSF zeigt.
Beispiel 1
Ein Verfahren zur Synthese eines Lipasesubstrats für HSL ist in Reaktionsschema 1 angegeben (vgl. 1).
Kurz zusammengefaßt wurde eine Tritiummarkierungsreaktion wie folgt durchgeführt:
Etwa 25 mg des Hypochioridsalzes von 9(Z)-Octadec-9-ensäure-2-amino-3-3-((9Z)-octadec-9-enoyloxy)propylester (NNC 90-3086) wurden mit 10% Palladium auf Holzkohle (25 mg) und Methanol (1,5 ml) in einem Tritiummarkierungsgefäß kombiniert und unter Tritiumgas (10 Ci) für 90 Minuten gerührt. Auf diese Weise wurde eine ungefähre Ausbeute des mit Tritium markierten Produkts von etwa 3.3 Ci erhalten.
Dieses Rohmaterial wurde durch Hochleistungsflüssigkeitschromatographie (HPLC) auf einer Progidy ODS-Säule (Phenomenex) unter Verwendung von Methanol: Wasser:Trifluoressigsäure (90:10:0,1) (Puffer A) und Methanol:Trifluoressigsäure (100:0,1) (Puffer B) gereinigt. Ein Gradient von 0% B zu 100% B wurde über 30 Minuten bei 3 ml/min aufgebaut. Die Ausbeute nach der Reinigung betrug etwa 1,6 Ci.
Die mit Tritium markierte Verbindung, [³H]-NNC 90-3086 (1,6 Ci, 2,5 ml), wurde dann dadurch biotinyliert, daß eine Dimethylformamidlösung hergestellt und diese zu einem Biotin-PEG-NHS-Ester (von Shearwater Polymers, Inc.) (MW ⁓3400, 57 mg) und Diisopropylethylamin (100 μl) zugegeben wurde. Das Reaktionsgemisch wurde bei 100°C für 45 Minuten erhitzt.
Das erhaltene Produkt wurde auf einer kurzen Silicasäule unter Eluieren in Dichlormethan:Methanol (9:1) teilweise gereinigt, dann durch Dünnschichtchromatographie auf einem kurzen Silicagel unter Eluieren in 4 ml Dichlormethan, gefolgt durch 6 ml Dichlormethan:Methanol (9:1), gereinigt.
Typiseherweise war die erreichte radiochemische Reinheit des [³H]-HSL-Substrats > 95%, und die spezifische Aktivität betrug 100 Ci/mmol.
Beispiel 2
Screening-Assay für eine Lipase unter Anwendung von Szintillations- und Abbildungsnäherungsassay-Technologien
Methode
SPA-Anordnung mit 96 Vertiefungen. Unter Verwendung einer Testanordnung 'auf Kügelchen' wurden 180 nM Lipasesubstrat (d.h. HSL-Substrat, hergestellt durch das in Beispiel 1 beschriebene Verfahren) zu Streptavidin-beschichteten Yttriumsilicat (YSi)-Kügelchen (Amersham Pharmacia Biotech) bei 5 mg/ml und 10% (Vol./Vol.) Triton^TM X-100 in einem Verhältnis von 1:3:2 zugegeben. TritonTM X-100 wurde zugegeben, um eine unspezifische Bindung des mit Tritium markierten Produkts an die Kügelchen zu verhindern. Die Assays enthielten 20 μl Substrat-vorbeschichtete SPA-Kügelchen (6 nM Lipasesubstrat, 50 μg Kügelchen, 0,67% (Vol./Vol.) TritonTM X-100), 5 nM Lipase und Assay-Puffer (50 mM Hepes, pH 7,5, 1 mM Dithioerythritol (DTE) und 0,001% (Vol./Vol.) C13E12) in einem Volumen von 100 μl. Bei Kontrollen 'ohne Enzym' wurden etwa 15.000 SPA-CpM's erhalten. Nach Inkubation für 60 Minuten bei Raumtemperatur unter Bewegen wurden die Assays durch die Zugabe von 100 μl 0,1 M Natriumcitrat/Citronensäure, pH 4,0, gestoppt und in einem TopCount^TM Mikrotiterplatten-Szintillationszähler (Packard Instruments Co., Meriden, CT, USA) gezählt.
SPA- und LEADseeker-Anordnungen mit 384 Vertiefungen. 180 nM Lipasesubstrat wurden zu Streptavidin-beschichteten YSi-Kügelchen bei 10 mg/ml und 10% (Vol./Vol.) TritonTM X-100 in einem Verhältnis von 2:3:1 zugegeben. Die Assays enthielten 10 μl Substrat-vorbeschichtete Streptavidin-YSi-SPA-Kügelchen oder Streptavidin-Yttriumoxid (YOa)-LEADseeker-Kügelchen (Amersham Pharmacia Biotech) (24 nM Lipasesubstrat, 50 μg Kügelchen, 0,67% (Vol./Vol.) TritonTM X-100), 30 nM Lipase und Assay-Puffer in einem Volumen von 25 μl. Bei Kontrollen 'ohne Enzym' wurden etwa 6.000 SPA-CpM's und 600 IOD's (Integrated Optical Density) erhalten. Nach Inkubation für 60 Minuten bei Raumtemperatur unter Bewegen wurden die Assays durch die Zugabe von 25 μl 0,1 M Natriumcitrat/Citronensäure, pH 4,0, gestoppt und in entweder einem TopCount^TM Mikrotiterplatten-Szintillationszähler (Packard Instruments Co., Meriden, CT, USA) gezählt oder mit einer LEADseeker-Vorrichtung (Amersham Pharmacia Biotech) abgebildet.
Ergebnisse
Entwicklung eines Lipase-Assays unter Verwendung einer SPA-Testanordnung mit 96 Vertiefungen. Enzymtitrationen wurden unter Verwendung von Testanordnungen 'auf' oder 'nicht auf' Kügelchen durchgeführt. Bei der Anordnung 'nicht auf' Kügelchen wurde das Lipasesubstrat vorher nicht auf SPA-Kügelchen aufgetragen; statt dessen wurden die Kügelchen zur gleichen Zeit wie die Stopplösung zugegeben. Unter Verwendung einer Testanordnungen 'auf' Kügelchen wurde ein höherer Prozentsatz der Substratspaltung als unter Verwendung einer Anordnung 'nicht auf' Kügelchen und ein besser reproduzierbarer Assay erhalten, wie durch die engeren Fehlerbalken erkennbar ist. Man nimmt an, daß die Bindung des Substrats an die Oberfläche des Kügelchens eine künstliche Membranumgebung erzeugt, welche für eine optimale Enzymaktivität notwendig ist (2). Jeder Datenpunkt in dieser Figur und in den nachfolgenden Figuren ist der Mittelwert (± SEM) von 3 Wiederholungsversuchen.
Die maximal erhaltene Substratspaltung betrug etwa 60%. Wegen der Beschaffenheit des Assays 'auf' Kügelchen ist es unwahrscheinlich, daß eine Substratspaltung von 100% erhalten wird, da die sterische Behinderung, welche durch das Vorliegen auf dem Kügelchen verursacht wird, wahrscheinlich die Enzymaktivität beeinflußt.
Unter Verwendung der Testanordnung 'auf' Kügelchen wurde der zeitliche Verlauf unter Verwendung von 5 nM Lipase überprüft (3).
Ebelacton B, ein Naturprodukt aus Streptomyces aburaviensis, ist als ein Inhibitor der Lipaseaktivität bekannt (Nonaka Y. et al., J. Enzyme Inhibition 10 (1990, S. 57–63). Inhibitionsstudien wurden unter Verwendung von Ebelacton B durchgeführt, und ein IC₅₀-Wert von 27,5 μM wurde erhalten (4). 5 nM Lipase wurden verwendet, und die Assays wurden bei Raumtemperatur für 60 Minuten inkubiert.
Miniaturisierung des Lipase-Assays auf eine Anordnung mit 384 Vertiefungen unter Verwendung von SPA und LEADseeker. Unter Verwendung eines reduzierten Assay-Volumens wurde eine Enzymtitration mit YSi-SPA-Kügelchen und YOx-LEADseeker-Kügelchen durchgeführt (5). Unter Verwendung der zwei Testanordnungen wurden unterschiedliche Profile erhalten, und dies kann ein Ergebnis davon sein, wie das Substrat auf der Oberfläche der zwei Kügelchen-Typen präsentiert wird.
Inhibitionskurven wurden für die miniaturisierten Assays unter Verwendung von Ebelacton B erhalten, und unter Verwendung von SPA- und LEADseeker-Anordnungen wurden IC₅₀-Werte von 32,3 μM bzw. 18,2 μM bestimmt (6). Diese Werte sind mit dem Wert vergleichbar, welcher unter Verwendung der SPA-Testanordnung mit 96 Vertiefungen berechnet wurde. 30 nM Lipase wurden verwendet, und die Assays wurden bei Raumtemperatur für 60 Minuten inkubiert.
Beispiel 3
Spaltung eines Lipasesubstrats durch andere Lipasen
Die Standard-Testanordnung (wie vorstehend in Beispiel 2 beschrieben) wurde mit Lipaseenzymen, abgeleitet aus einer Reihe von verschiedenen Quellen, ausgeführt. Die Ergebnisse sind in 7 gezeigt.
Beispiel 4
Inhibierung der HSL-Aktivität durch PMSF
Die Inhibierung der HSL-Aktivität durch PMSF wurde unter Verwendung der Standard-Testanordnung (wie vorstehend in Beispiel 2 beschrieben) und 14,35 mM bis 1,44 nM PMSF untersucht. Die Assays wurden bei Raumtemperatur für 60 Minuten inkubiert.
Ein IC₅₀-Wert von 16,3 μM wurde erhalten. In ähnlichen Experimenten wurden IC₅₀-Werte von 4,8, 10,6 und 16,7 μM erhalten. Die Ergebnisse sind in 8 gezeigt.

Claims

Verbindung der Formel I:
FORMEL I worin bedeuten: L ein Verbindungsmittel, umfassend ein wasserlösliches Molekül; B ein Bindemittel; X ein Atom oder eine Gruppe, geeignet, um L an die Glycerinkette zu binden; und R eine geradkettige, gesättigte oder ungesättigte Alkylgruppe mit 8 bis 30 Kohlenstoffatomen, substituiert mit M' oder M", worin mindestens eines von M' und/oder M" ein detektierbarer Marker ist.
Verbindung nach Anspruch 1, wobei L ein wasserlösliches Molekül umfasst, gewählt aus PEG oder PVP.
Verbindung nach Anspruch 1 und/oder 2, wobei L 6-100 Einheiten PEG umfasst.
Verbindung nach mindestens einem der Ansprüche 1 bis 3, wobei B in der Lage ist, an eine feste Phase zu binden.
Verbindung nach mindestens einem der Ansprüche 1 bis 4, wobei B ein Mitglied eines spezifischen Bindungspaares umfasst, wobei das spezifische Bindungspaar vorzugsweise gewählt ist aus Biotin:Avidin/Streptavidin, Antikörper:Antigen/Protein A, Nukleinsäure:Nukleinsäure, Rezeptor:Ligand, WGA:N- Acetyl-β-Glucosamin, Glutathion:GST (Glutathion-S-Transferase) und Kupfer:Histidin-Markierung.
Verbindung nach mindestens einem der Ansprüche 1 bis 5, wobei B Biotin ist.
Verbindung nach mindestens einem der Ansprüche 1 bis 6, wobei X irgendeines aus NH, O oder S umfasst.
Verbindung nach mindestens einem der Ansprüche 1 bis 7, wobei R 14, 16 oder 18, vorzugsweise 18 Kohlenstoffatome besitzt.
Verbindung nach mindestens einem der Ansprüche 1 bis 8, wobei mindestens eines von M' und M" ein radioaktiver Marker ist, vorzugsweise ³H.
Verbindung nach mindestens einem der Ansprüche 1 bis 8, wobei mindestens eines von M' und M" ein Fluorophor ist.
Verfahren zur Herstellung der Verbindung gemäß mindestens einem der Ansprüche 1 bis 10.
Verfahren nach Anspruch 11, umfassend die Schritte a) Durchführen einer Umsetzung, um einen detektierbaren Marker, M' oder M", an ein Triacylglycerin zu addieren; und b) Anbringen eines Bindemittels, B, an das Triacylglycerinmolekül durch ein Verbindungsmittel, L.
Verfahren nach Anspruch 12, wobei Schritt a) eine Tritiummarkierungsreaktion umfasst, vorzugsweise Addieren von ³H in den sn-1 und/oder sn-3-Positionen.
Verfahren nach Anspruch 12, wobei Schritt b) das Umsetzen des Triacylglycerinmoleküls mit Biotin-PEG-NHS-Ester umfasst.
Assay zur Bestimmung von Lipaseenzymaktivität in einer Zusammensetzung, umfassend das Inkubieren der Zusammensetzung in Gegenwart der Verbindung der Formel I wie in mindestens einem der Ansprüche 1 bis 10 beansprucht, und Messen der Freisetzung des detektierbaren Markers, M' und/oder M", aus der Verbindung als ein Anzeichen für Lipaseaktivität.
Assay zur Bestimmung von Lipaseenzymaktivität in einer Zusammensetzung, umfassend: a) Mischen der Zusammensetzung mit einer Verbindung der Formel I, wie in mindestens einer Ausführungsform des erstes Aspekts beansprucht; b) Inkubieren unter Bedingungen zur Förderung der Lipaseenzymaktivität; c) Addieren einer festen Phase unter Bedingungen, um das Binden der Verbindung an die feste Phase zu fördern; und d) Detektieren der Menge an M' und/oder M" auf der festen Phase als ein Anzeichen für Lipaseenzymaktivität.
Assay zur Bestimmung von Lipaseenzymaktivität in einer Zusammensetzung, umfassend: a) Inkubieren der Verbindung gemäß mindestens einem der Ansprüche 1 bis 10 mit einer festen Phase unter Bedingungen, um Festphasenbindung zu fördern; b) Zugeben der Zusammensetzung zu der Festphasen-gebundenen Verbindung; c) Inkubieren unter Bedingungen, um Lipaseenzymaktivität zu fördern; d) Detektieren der Menge an M' oder M" auf der festen Phase als ein Anzeichen für Lipaseenzymaktivität.
Assay nach mindestens einem der Ansprüche 16 oder 17, wobei das Binden an die feste Phase die Verbindung in die Nähe zu einer Szintillationssubstanz bringt, und die Defektion von M' oder M" auf der festen Phase durch Messen von Szintillationszählungen erfolgt.
Assay nach mindestens einem der Ansprüche 16 bis 18, wobei die feste Phase die Oberfläche eines SPA-Kügelchens ist, vorzugsweise eines Streptavidinbeschichteten Yttriumslicat-SPA-Kügelchens.
Assay nach mindestens einem der Ansprüche 16 bis 18, wobei die feste Phase eine Oberfläche einer Platte ist, wie einer Mikrotiterplatte, vorzugsweise eine Cytostar^TM-Platte oder Flashplater^TM.
Assay nach mindestens einem der Ansprüche 15 bis 20, wobei die Zusammensetzung ein Lipaseenzym und einen putativen Inhibitor oder Verstärker der Lipaseenzymaktivität umfasst.
Assay nach mindestens einem der Ansprüche 15 bis 21, wobei eine Stopplösung vor dem Detektieren von M' und/oder M" zugegeben wird.
Verwendung einer Verbindung nach mindestens einem der Ansprüche 1 bis 10 in einem Assay gemäß mindestens einem der Ansprüche 15 bis 22.