DE69837683T2

DE69837683T2 - Neuartige peroxidasesubstrate und ihre anwendung in katalysierten reporterbindungsassays

Info

Publication number: DE69837683T2
Application number: DE69837683T
Authority: DE
Inventors: Mark Norman Lexington BOBROW
Original assignee: PerkinElmer LAS Inc
Current assignee: PerkinElmer Health Sciences Inc
Priority date: 1998-06-04
Filing date: 1998-06-04
Publication date: 2008-01-10
Anticipated expiration: 2018-06-05
Also published as: EP1084269B1; ES2285777T3; AU750640B2; CA2334010C; CA2334010A1; JP4162858B2; JP2002517205A; WO1999063108A1; IL140052A0; AU8057498A; DE69837683D1; EP1084269A1; EP1084269A4; ATE360704T1

Description

GEBIET DER ERFINDUNG
Diese Erfindung betrifft neuartige Peroxidasesubstrate und insbesondere Cinnamoyl enthaltende Substrate, die bei vielfältigen Einsatzmöglichkeiten, wie zum Beispiel dem katalysierten Reporterbindungsassay, verwendet werden können.
ALLGEMEINER STAND DER TECHNIK
Peroxidase wird wegen seiner hohen Umsatzgeschwindigkeit, guten Stabilität und Verfügbarkeit weithin bei Enzym-basierten analytischen Verfahren verwendet. Zum Beispiel katalysiert Meerrettichperoxidase (HRP) (EC 1.11.1.7) die Oxidation einer großen Vielfalt von Wasserstoffabgebenden Substraten mit Wasserstoffperoxid. HRP ist auch eines der bevorzugten Enzyme zur Anwendung im katalysierten Reporterbindungsassay.
Das katalysierte Reporterbindungsassay ist ein neuartiges Verfahren der Signalverstärkung, das den Gegenstand der U.S. Patentschriften Nr. 5196306 und 5583001 konstituiert. Es wird auch in Bobrow et al., Journal of Immunological Methods, 125: 279–285 (1989) und in Bobrow et al., Journal of Immunological Methods, 137: 103–112 (1991), diskutiert.
Das Verfahren verwendet ein analytabhängiges Enzymaktivierung ("ADEAS"), um die Abscheidung zusätzlicher Reporterenzyme auf die feste Phase mit dem Resultat der Signalverstärkung und verbesserter Assaydetektionsgrenzen zu katalysieren. In einer bevorzugten Ausführungsform ist HRP das ADEAS.
Das ADEAS reagiert mit einem Konjugat, das aus einem für das ADEAS spezifischen, detektierbar markiertem Substrat besteht. Wenn das ADEAS und das Konjugat reagieren, wird ein aktiviertes Konjugat gebildet, das sich dort kovalent abscheidet, wo ein Rezeptor für das aktivierte Konjugat immobilisiert ist. Der Rezeptor ist mit dem analytabhängigen Enzymaktivierungssystem nicht reaktiv.
Konjugate können unter Verwendung von herkömmlichen Kupplungs- und Markierungstechniken synthetisiert werden. Die Auswahl des Substrats wird vom ausgewählten ADEAS abhängig sein. Somit ist die detaillierte Kenntnis der katalytischen Eigenschaften jedes spezifischen Enzyms erforderlich, um ein anwendbares synthetisches Substrat angemessen zu entwerfen und, wenn nötig, einen Rezeptor. Beispiele von Konjugaten, die beschrieben wurden, beinhalten substituierte Phenole wie zum Beispiel Biotintyramin, Fluoreszintyramin, NADP, phosphoriliertes Biotin, usw.
Allerdings muss man beim Entwerfen von Substraten, die für die Peroxidase-vermittelten Assays geeignet sind, Sorgfalt walten lassen. Guilbault et al., Analytical Chemistry, Band 40, Nr. 8, Seiten 1256–1263 (1968) untersuchten breitgefächerte Substrate zur fluorometrischen Bestimmung oxidativer Enzyme wie zum Beispiel Peroxidase, Galaktoseoxidase, Glukoseoxidase und Invertase. Diese Forscher berichteten, dass 3,4-Dihydroxycinnaminsäure, die eine Doppelbindung in der Seitenkette enthält, kein verwendbares Substrat für die fluorometrische Bestimmung oxidativer Enzyme ist, da es die Reaktion mit dem Enzym beendete.
US-A-4978523 bezieht sich auf einen Melanininhibitor, der eine reaktive Komponente eines Derivats der Cinnaminsäure umfasst und bei betroffenen Bereichen, wie zum Beispiel Sommersprossen oder Pigmentablagerungen nach Sonnenbrand, eingesetzt werden kann, ohne anregende oder allergische Probleme für die Haut zu verursachen.
EP-A-0097096 betrifft ein Verfahren zur Aufbereitung von Phenolamiden, die eine antivirale und eine hormonelle biologische Aktivität aufweisen.
Bobrow et al.: „Catalysed reporter deposition, a novel method of signal amplification II. Application to membrane immunoassays" Journal of Immunological Methods, Elsevier Science Publishers B. V., Amsterdam, ML: Band 137, Nr. 1, bezieht sich auf die Nutzung von Verstärkung für nicht-radiometrische Membranassays, wobei Detektion durch die Bildung eines unlöslichen, chromogenischen Produkts unterstützt wird.
US-A-5583001 betrifft ein Verfahren zur Katalysierung von Reporterbindungsassays, um die Detektion oder Quantifizierung eines Analyts in einer Probe zu verbessern, indem das Detektorsignal, das die Reaktion eines analytabhängigen Enzymaktivierungssystems mit einem Konjugat, das aus einem für das Enzymsystem spezifischen, detektierbar markierten Substrat besteht, umfasst, verstärkt wird, wobei das Konjugat mit dem analytabhängigen Enzymaktivierungssystem reagiert, um ein aktiviertes Konjugat zu bilden, das sich im Wesentlichen dort abscheidet, wo der Rezeptor für das aktivierte Konjugat immobilisiert ist, wobei der Rezeptor nicht mit dem analytabhängigen Enzymaktivierungssystem reaktiv ist.
Cevasco G. und Thea S.: „Participation of an extended p-oxo ketene intermediate in the dissociative alkaline hydrolysis of aryl 4-hydroxycinnamates" Journal of Organic Chemistry, Band 59, 1994, Seiten 6274–6278, betrifft die alkaline Hydrolyse von 4-Hydroxycinnamatester von acidischen Phenolen.
Cevasco G. und Thea S.: „The dissociative hydrolysis of 2-4 dinitrophenyl 4 hydroxycinnamate" Gazetta Chimica Italiana, Band 122, 1992, Seiten 199–200 betrifft die dissoziative Hydrolyse von 2,4-Dinitrophenyl-4-Hydroxycinnamat.
Gemäß eines ersten Aspekts der vorliegenden Erfindung ist ein Verfahren zur Detektion oder Quantifizierung eines Analyts in einem Assay bereitgestellt, welches die folgenden Schritte umfasst:

a) Umsetzen eines analytabhängigen Enzymaktivierungssystems, das mindestens ein Enzym umfasst, mit einem Konjugat, das ein detektierbar markiertes Substrat mit der Struktur einer p-Hydroxycinnamoyl enthaltenden Verbindung umfasst, die die folgende Struktur hat:
worin: X eine Linkergruppe ist, die A an eine p-Hydroxycinnamoyleinheit linken kann, und A eine Markierung ist, die in einem analytabhängigen Enzymaktivierungssystemassay detektierbar ist und ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Biotin, Dinitrophenyl, Fluoreszein und Tetramethylrhodamin, um ein aktiviertes Konjugat zu bilden, das sich im Wesentlichen dort kovalent abscheidet, wo sich mindestens ein Rezeptor für das aktivierte Konjugat befindet, wobei der Rezeptor mit dem analytabhängigen Enzymaktivierungssystem nicht reaktiv ist; und
b) Detektieren oder Quantifizieren der Signale, die direkt oder indirekt aus den abgeschiedenen detektierbaren Markierungen erzeugt worden sind.

Gemäß eines zweiten Aspekts der vorliegenden Verbindung ist eine p-Hydroxycinnamoyl enthaltende Verbindung bereitgestellt, die die folgende Struktur hat:
worin:
X eine Linkergruppe ist, die ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus:

worin X in der Lage ist, A an eine p-Hydroxycinnamoyleinheit zu linken und
A eine Markierung ist, die in einem analytabhängigen Enzymaktivierungssystemassay detektierbar ist und ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Biotin, Dinitrophenyl, Fluoreszein und Tetramethylrhodamin.
KURZE BESCHREIBUNG DER FIGUREN
1 zeigt die Detektion des Zytomegalievirus-Early-Antigen unter Verwendung eines katalysierten Reporterbindungsassays, um das Detektorsignal zu verstärken. HRP war das ADEAS und Biotintyramid war das Konjugat.
2 zeit die Detektion des Zytomegalievirus-Early-Antigen unter Verwendung eines katalysierten Reporterbindungsassays, um das Detektorsignal zu verstärken. HRP war das ADEAS und N-1-Biotinyl-N-2-(4-hydroxycinnamoyl)-ethandiamin war das Konjugat. Dieses Konjugat wurde mit einer zehnfach niedrigeren Konzentration als Biotintyramid verwendet.
DETAILLIERTE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
Der Ausdruck analytabhängiges Enzymaktivierungssystem (ADEAS) bezieht sich auf ein Enzymsystem, wobei (i) mindestens ein Enzym an ein Mitglied eines spezifischen Bindungspaars, in irgendeiner den Fachleuten bekannten Weise, gekuppelt ist oder (ii) das Enzym nicht an ein Mitglied eines spezifischen Bindungspaars gebunden werden muss, wenn es der Analyt ist. Das Enzym, entweder an sich oder in Anbindung an ein zweites Enzym, katalysiert die Bildung eines aktivierten Konjugats, das dann dort abgeschieden wird, wo sich ein Rezeptor für das aktivierte Konjugat befindet.
Der Ausdruck Verstärkung, wie hier verwendet, bedeutet Verstärkung eines Reportersignals aufgrund der Abscheidung eines Konjugats, das durch ein ADEAS aktiviert wurde.
Der Ausdruck Konjugat, wie hier verwendet, bedeutet ein detektierbar markiertes Cinnamoyl enthaltendes Substrat, das für ein Peroxidase-vermitteltes ADEAS spezifisch ist, gleich ob es ein Einzelenzym-ADEAS- oder ein Multienzym-ADEAS-Konjugat ist, wie unten diskutiert wird.
Der Ausdruck detektierbar markiert bedeutet, dass das Substrat entweder an einen Reporter oder an ein unmarkiertes erstes Mitglied eines spezifischen Bindungspaars gekuppelt werden kann, vorausgesetzt dass der Reporter eine andere Einheit in das Substrat einführt, wie unten diskutiert wird. Wenn das Substrat an ein unmarkiertes Mitglied eines spezifischen Bindungspaars gekuppelt ist, wird der Substrat-spezifische Bindungspartnerkomplex, der Bindung an den Rezeptor folgend, mit dem zweiten Mitglied des Bindungspaars, das an einen Reporter gekuppelt ist, umgesetzt. Alternativ kann der Substrat-spezifische Bindungspartnerkomplex mit dem detektierbar markierten anderen Mitglied des spezifischen Bindungspaars vor der Abscheidung umgesetzt werden.
Der Ausdruck Abscheidung bedeutet gerichtete Bindung eines aktivierten Konjugats an den Rezeptor, die aus der Bildung einer Interaktion des spezifischen Bindungspaars wie unten beschrieben resultiert.
Der Ausdruck Rezeptor bedeutet eine Stelle, die durch die Bildung einer Interaktion des spezifischen Bindungspaars, wie unten beschrieben, an das aktivierte Konjugat binden wird.
Der Ausdruck aktiviertes Konjugat bedeutet, dass das Konjugat durch das ADEAS darauf vorbereitet wurde, an den Rezeptor zu binden.
Das ADEAS katalysiert die Abscheidung eines Konjugats (d.h. ein detektierbar markiertes Substrat, das für das ADEAS spezifisch ist) durch Umwandlung des Substratteils des Konjugats in eine aktivierte Form, die dort kovalent bindet, wo sich ein Rezeptor befindet. Das ADEAS verwendet keine Enzymkaskadenreaktionen oder Enzymzyklen, um Verstärkung zu bewirken. Vielmehr verwendet es ein Einzelenzym oder eine Kombination von Enzymen, um das Konjugat zu aktivieren. Die Abscheidung des Konjugats findet nur statt, wenn das Analyt und das ADEAS umgesetzt wurden und ein Rezeptor verfügbar ist, um das aktivierte Konjugat zu binden. Somit werden ADEAS, Konjugat und Rezeptor so ausgewählt, dass ein funktionsfähiges Trio gebildet wird. Der Analyt und das ADEAS können identisch, falls der Analyt ein Enzym ist (z.B. Peroxidase), oder unterschiedlich sein.
Die vorliegende Erfindung betrifft neuartige Cinnamoyl enthaltende Substrate, die vordem für ungeeignete Substrate bei Peroxidase-vermittelten Reaktionen gehalten wurden, da es zu erwarten war, dass solche Cinnamoyl enthaltenden Substrate die Reaktion mit dem Enzym hemmen würden.
ADEAS, die für die Verwendung mit den Cinnamoyl enthaltenden Substraten der Erfindung geeignet sind, beinhalten Oxidoreduktasen. Insbesondere können Peroxidasen erwähnt werden. Das bevorzugte ADEAS, das für die neuartigen Substrate der Erfindung geeignet ist, ist die Meerrettich-Peroxidase.
Man hat herausgefunden, überraschender- und unerwarteterweise, dass ein neuartiges Konjugat, das eine p-Hydroxycinnamoyl-Einheit in seiner Struktur aufweist, die Sensitivität des katalysierten Reporterbindungsassays mindestens zehnfach über das zur Zeit erreichte Maß unter Verwendung von nicht-Cinnamoyl enthaltenden Konjugaten verbessert.
Die neuartigen p-Hydroxycinnamoyl enthaltenden Verbindungen der Erfindung haben die in Anspruch 11 definierte Struktur.
Beispiele von Linkergruppen, die an detektierbare Markierungen angefügt werden, beinhalten die Folgenden:
Eine große Vielfalt von Reporter sind für die Kupplung an das Substrat verfügbar, um das Konjugat zu erzeugen oder um an ein Mitglied eines spezifischen Bindungspaars zu kuppeln. Reporter können radioaktive Isotope wie zum Beispiel ¹²⁵I, Enzyme, fluorogene, chemi-lumineszente oder elektrochemische Materialien sein.
Beispiele von Reporterenzymen, die für die Durchführung der Erfindung verwendet werden können, beinhalten Hydrolasen, Lyasen, Oxidoreduktasen, Transferasen, Isomerasen und Ligasen. Einige bevorzugte Beispiele sind Phosphatasen, Esterasen, Glykosidasen und Peroxidasen. Spezifische Beispiele beinhalten alkaline Phosphatase, Lipase, beta-Galaktosidase und Meerrettich-Peroxidase. Wie oben angemerkt, kann ein Enzym, wenn es als Reporter verwendet wird, identisch mit oder unterschiedlich von dem Enzym oder den Enzymen sein, die in dem ADEAS verwendet werden. Die vorliegende Erfindung kann verwendet werden, um die Abscheidung eines radioisotopisch markierten Konjugats oder eines Enzymmarkierten Konjugats, usw., zu katalysieren.
Wenn der Reporter ein Mitglied eines spezifischen Bindungspaars ist, dann kann er vom Typ her entweder immun oder nicht-immun sein. Spezifische Bindungspaare des Immuntyps sind beispielhaft durch Antigen/Antikörpersysteme oder Hapten/Antihaptensysteme dargestellt. Das Antikörpermitglied, ob polyklonal, monoklonal oder ein immunreaktives Fragment desselben, kann durch herkömmliche Verfahren erzeugt werden, mit denen Fachleute vertraut sind. Der Ausdruck immunreaktives Antikörperfragment oder immunreaktives Fragment bezeichnet Fragmente die Bindungsgebiete des Antikörpers umfassen. Solche Fragmente können Fab-artige Fragmente sein, die definiert sind als Fragmente ohne den Fc-Anteil, z. B. Fab, Fab' und F(ab')₂ Fragmente, oder können die sogenannten „half-molecule" -Fragmente sein, die durch reduktive Spaltung der Disulfidbindungen erhalten werden, die die Komponenten der schweren Kette des intakten Antikörpers verbinden. Wenn das Antigenmitglied des spezifischen Bindungspaars nicht immunogen ist, z. B. ein Hapten, kann es kovalent an ein Carrierprotein gekuppelt werden, um es immunogen vorzulegen.
Nicht-immune Bindungspaare beinhalten Systeme, worin die zwei Komponenten eine natürliche Affinität füreinander haben, aber nicht Antikörper sind. Beispielhafte nicht-immune Bindungspaare sind Biotin-Avidin oder Biotin-Streptavidin, Folsäure-Folat-bindendes Protein, komplementäre Testnukleinsäuren usw.
Die Verbindungen der Erfindung können unter Verwendung von herkömmlichen Kupplungs- und Markierungstechniken, wie in den Beispielen unten dargestellt, synthetisiert werden. Ein Ansatz kann darin bestehen, p-Hydroxycinnaminsäure nach dem folgenden Schema umzusetzen:
Das resultierende Amin kann dann mit geeigneten Markierungen, die N-Hydroxysuccinimid oder Isothiocyanateinheiten beinhalten, umgesetzt werden, um die endgültige p-Hydroxycinnamoyl enthaltende Verbindung zu erzeugen.
Wie oben bemerkt wurde, sind viele Linkergruppen, die an die detektierbaren Markierungen angefügt werden, kommerziell erhältlich. Die kommerziell erhältlichen Linkergruppen können mit p-Hydroxycinnaminsäure unter Verwendung herkömmlicher, dem Fachmann gut bekannter Protokolle umgesetzt werden.
Wenn eine detektierbar markierte p-Hydroxycinnamoyl enthaltende Verbindung (Konjugat) der Erfindung aktiviert ist, wird sie dort binden, wo sich ein Rezeptor befindet. Das aktivierte Konjugat bindet sich an den Rezeptor mittels einer spezifischen Bindungspaarinteraktion, die in diesem Fall eine kovalente Bindung ist. Ein exogener Rezeptor bedeutet ein Rezeptor, der nicht aus dem Assay stammt. Er kann auf der Oberfläche einer Hilfseinrichtung immobilisiert werden, bevor das Konjugat zum Reaktionsgemisch hinzugefügt wird. Ein endogener Rezeptor bedeutet ein Rezeptor, der aus dem Assay stammt. Es wird angenommen, dass die neuartigen Konjugate der Erfindung, wenn aktiviert, mit den für die aktivierten phenolischen Einheiten, wie zum Beispiel elektronenreiche Einheiten, Rezeptoren binden.
In einer anderen Ausführungsform betrifft diese Erfindung die Verwendung dieser detektierbar markierten Cinnamoyl enthaltenden Verbindung für das Detektieren oder Quantifizieren der Anwesenheit oder Abwesenheit eines Analyts in einer Probe unter Verwendung eines katalysierten Reporterbindungsassays, um das Reportersignal zu verstärken. Nahezu jedes Assayformat, wie zum Beispiel ein Immunoassay oder ein Nukleinsäurehybridisierungsassay, kann verwendet werden.
Es sollte den Fachleuten klar sein, dass eine große Anzahl von Variationen möglich ist und alle diese Variationen in den Gültigkeitsbereich der Erfindung fallen.
Die folgenden Beispiele sind dazu vorgesehen, die Erfindung zu illustrieren und sollten nicht als Einschränkungen derselben gedeutet werden. BEISPIEL 1 4-Hydroxycinnaminsäure, N-hydroxysuccinimidester
p-Hydroxycinnaminsäure (5,0 g, 30,5 mmol) wird mit Erwärmung in Acetonitril aufgelöst (150 mL), gefolgt vom Zusatz von N-Hydroxysuccinimid (4,0 g, 35 mmol) und 1,3-Dicyclohexylcarbodiimid (1M in Dichloromethan, 35 mL, 35 mmol). Die hellgelbe Lösung wird bei Raumtemperatur über Nacht umgerührt, gefiltert, und das Filtrat wird verdampft und durch Silica-Gel-Chromatographie unter Eluierung mit 1:1 Ethylacetat:Hexan aufgereinigt. Fraktionen, die das Produkt durch Dünnschichtchromatographie enthalten, werden vereinigt und verdampft, um einen weißen Feststoff zu ergeben (3,31 g, 42 %). ¹H NMR (DMSO-d₆) δ 7,9 (d, 1H, Vinyl), 7,7 (d, 2H, Phenyl 3,5), 6,9 (d, 2H, Phenyl 2,6), 6,7 (d, 1H, Vinyl), 2,8 (s, 4H, Succinimid Methylen). BEISPIEL 2 N-1-Biotinyl-N-2-(4-hydroxycinnamoyl)-ethandiamin
N-(2-aminoethyl)biotinamid-Hydrobromid (25 mg, 0,068 mmol), Triethylamin (10 μL, 0,072 mmol), und 4-Hydroxycinnaminsäure, Succinimidylester (18 mg, 0,068 mmol) werden in Dimethylformamid (DMF) (1 mL) aufgelöst und über Nacht bei Raumtemperatur umgerührt. Das Reaktionsgemisch wird mit Hilfe einer C18 Umkehrphasenchromatographie unter Eluierung mit einem linearen Gradienten von 0–100 % Methanol in Wasser über 30 Minuten aufgereinigt. Der Eluathöchststand bei 22 Minuten wird gesammelt und verdampft, um 22 mg eines weißen Feststoffs zu ergeben (0,051 mmol, 75 %). ¹H NMR (CD₃ OD) δ 7,5 (d, 1H, Vinyl), 7,4 (d, 2H, Aromat 3,5), 6,8 (d, 2H, Aromat 2,6), 6,4 (d, 1H, Vinyl), 4,4 (m, 1H, Biotin Methin-NH), 4,2 (m, 1H, Biotin Methin-NH), 3,4 (m, 4H, Ethandiamid), 3,1 (m, 1H, Biotin Methin-S), 2,8 (1H, Biotin Methylen-S), 2,6 (1H, Biotin Methylen-S), 2,2 (2H, Biotin CH₂ CO), 1,3-1,7 (m, 6H, Biotin Aliphate). BEISPIEL 3 N-ε-(2,4-Dinitronhenyl)-N-α-(4-Hydroxycinnamoyl)-L-Lysin
N-ε-(2,4-Dinitronhenyl)-L-Lysin (32 mg, 0,09 mmol) wird in 0.2 M Natriumborat (3 mL) pH = 8 suspendiert, und eine Lösung von 4-Hydroxycinnaminsäure, Succinimidylester (35 mg, 0,13 mmol) in DMF (0,5 mL) wird in kleinen Portionen unter Umrühren hinzugefügt. Die gelbe Suspension wird bei Raumtemperatur über Nacht umgerührt und das rohe Reaktionsgemisch wird mit Hilfe einer C18 Umkehrphasenchromatographie unter Eluierung mit einem linearen Gradienten von 50–100 % Methanol in 50 mM Natriumphosphat, pH = 3 über 15 Minuten aufgereinigt. Der Haupteluathöchststand bei ungefähr 11 Minuten wird von verschiedenen Injektionen vereinigt, auf einer C8-Sep-Pak-Kartusche entsalzt und verdampft, um 10 mg eines gelben Feststoffs zu ergeben (0,02 mmol, 25 %). ¹H NMR (CD₃OD) δ 8,9 (s, 1H, DNP H-3), 8,2 (d, 1H, DNP H-5), 7,4 (d, 1H, Vinyl), 7,3 (d, 2H), 7,2 (d, 1H, DNP H-6), 6,8 (d, 2H, Aromat 2,6), 6,4 (d, 1H, Vinyl), 4.5 (m, 1H, Lysin Methin), 3,5 (t, 2H, CH₂-NH), 2,1-1,5 (m, 6H, CH₂). BEISPIEL 4 DAMP-Cinnamat
N-(3-((2,4-Dinitrophenyl)amino)propyl)-N-(3-aminopropyl)methylamin, Dihydrochlorid (DAMP) (45 mg, 0,12 mmol), Triethylamin (35 μL, 0,25 mmol), und 4-Hydroxycinnaminsäure, Succinimidylester (35 mg, 0,13 mmol) werden in Dimethylfomamid (DMF) (1 mL) aufgelöst und bei Raumtemperatur über Nacht umgerührt. Das Reaktionsgemisch wird im Vakuum verdampft, in einer minimalen Menge an Methanol/Wasser aufgelöst und durch C18 Umkehrphasenchromatographie unter Eluierung mit einem linearen Gradienten von 0–100 % Methanol in Wasser über 30 Minuten aufgereinigt. Der erste größere Höchststand wird gesammelt und verdampft, um 27 mg eines gelben Feststoffes zu ergeben (0,06 mmol, 49 %). ¹H NMR (CD₃ OD) δ 8,9 (s, 1H, DNP H-3), 8,2 (d, 1H, DNP H-5), 7,4 (d, 1H, vinyl), 7,3 (d, 2H), 7,2 (d, 1H, DNP H-6), 6,8 (d, 2H, Aromat 2,6), 6,4 (1, 1H, Vinyl), 3,6 (t, 2H, CH₂-NH), 3,4 (t, 2H, CH₂-NH), 3,3 (t, 2H, CH₂-NH), 3,2 (t, 2H, CH₂-NH), 2,9 (s, 3H, Methyl), 2,2-1,9 (m, 4H, CH₂). BEISPIEL 5 N-α-(4-Hydroxycinnamoyl)-L-Lysin
N-ε-BOC-L-Lysin Hydrochlorid (78 mg, 0,32 mmol) wird in 0,2M Natriumborat, pH = 8 suspendiert und eine Lösung von 4-Hydroxycinnaminsäure, Succinimidylester (130 mg, 0,50 mmol) in DMF (3 mL) wird in kleinen Portionen unter Umrühren hinzugefügt. Die leichtgelbe Lösung wird bei Raumtemperatur über Nacht umgerührt und das rohe Reaktionsgemisch wird durch C18 Umkehrphasenchromatographie unter Eluierung mit einem linearen Gradienten von 0–100 % Methanol in 50 mM Natriumphosphat, pH = 3,5 über 30 Minuten aufgereinigt. Der Haupteluathöchststand bei ungefähr 25 Minuten wird aus verschiedenen Injektionen vereinigt und verdampft, um einen glasigen Feststoff zu ergeben, der durch Umrühren mit trifluoracitischer Säure:Wasser (7:3) (10 mL) für 24 Stunden entschützt wird. Die Lösung wird im Vakuum verdampft, von Toluen freigemacht (3 × 10 mL), und mit Ether zerrieben, um 97 mg eines gebrochen weißen, glasigen Feststoffs zu ergeben (0,24 mmol, 75 %). BEISPIEL 6 N-ε-(5-(und-6)-Carboxyfluoresceinyl)-N-α-(4-Hydroxycinnamoyl)-L-Lysin
N-α-(4-Hydroxycinnamoyl)-L-Lysin (24 mg, 0,06 mmol) wird in Wasser (1 mL) aufgelöst und der pH durch Zufügen von 1N NaOH auf 9–10 eingestellt. 5-(und-6)Carboxyfluorescein, N-Hydroxysuccinimidester (39 mg, 0,08 mmol) wird als Feststoff in mehreren Portionen hinzugefügt und das Reaktionsgemisch wird bei Raumtemperatur über Nacht umgerührt und durch eine C18 Umkehrphasenchromatographie unter Eluierung mit einem linearen Gradienten von 50–100 % Methanol in 50 mM Natriumphosphat, pH = 3,5 über 30 Minuten aufgereinigt. Der Haupthöchststand wird aus mehreren Injektionen vereinigt um eine gelbe Lösung zu ergeben, die 0,06 mmol (100 %) des erwünschten Produkts enthält.
BEISPIEL 7
Detektion des Zytomegalovirus(CMV)-Early-Antigens
CMV-infizierte Zellen auf einem Objektträger (Objektträger mit acht Vertiefungen mit CMV-infizierten MRC-5 Zellen, Hemagen Diagnostics, Inc.) wurden mit Phosphat-gepufferter Saline (PBS) zwei Minuten lang hydriert. Ein Anti-CMV-Meerrettich-Peroxidase Konjugat (durch eine Modifizierung des Verfahrens von Ishikawa, E., et al., J. Immunoassay, 4, 209–237, 1983, bereitgestellt) wurde in 0,1M Tris, 0,15M NaCl, 0,5 % Milchprotein, pH 7,5 verdünnt und auf einem Objektträger 30 Minuten lang bei 37°C inkubiert. Der Objektträger wurde dann mit 0,1M Tris, 0,15M NaCl, 0,05 % Tween 20, pH 7,5 (TNT) Puffer zwei Minuten lang gewaschen. Biotinyl-Tyramid (NEN Life Science Products, NEL-700) wurde auf 2 μg/ml in Amplification Diluent (NEN Life Science Products, NEL-700) verdünnt, einer Vertiefung des Objektträgers hinzugegeben und 10 Minuten lang bei Raumtemperatur inkubiert. N-1-Biotinyl-N-2-(4-hydroxycinnamoyl)-ethandiamin wurde auf 2 μg/ml in Amplification Diluent verdünnt, der zweiten Vertiefung des Objektträgers hinzugefügt und 10 Minuten lang bei Raumtemperatur inkubiert. Der Objektträger wurde zwei Mal jeweils fünf Minuten lang bei Raumtemperatur mit TNT Puffer gewaschen. Streptavidin-Fluorescein (NEN Life Science Products, NEL-720) wurde 1:500 in TNT Puffer verdünnt und 30 Minuten lang bei Raumtemperatur inkubiert. Der Objektträger wurde drei Mal jeweils fünf Minuten lang mit TNT Puffer gewaschen. Evans Blue (0,001 %) wurde eine Minute lang auf dem Objektträger inkubiert, der Objektträger wurde zwei Mal mit de-ionisiertem Wasser gespült und luftgetrocknet. Nach Einsatz eines Antifade Mounting Mediums (Vectashield) und eines Deckglases, wurde der Objektträger mit einem Zeiss Fluoresezenzmikroskop bei 200facher Vergrößerung bildlich dargestellt.
Ergebnisse: 2 veranschaulicht, dass bei Verwendung des Substrats N-1-Biotinyl-N-2-(4-hydroxycinnamoyl)-ethandiamin, unter einer zehnfach niedrigeren Konzentration als für Biotinyl-Tyramid, eine weit bessere Sensitivität resultiert, wie es durch die hellen CMV-infizierten Kerne bezeugt wird. Es ist so sensitiv, dass die endogene Peroxidaseaktivität, die nicht durch die Biotinyl-Tyramid-Verstärkung detektiert wird, unter Verwendung von N-1-Biotinyl-N-2-(4-hydroxycinnamoyl)-ethandiamin klar detektiert wird. In der routinemäßigen Praxis wird ein endogener Peroxidaseinaktivierungsschritt verwendet, allerdings wurde für dieses Beispiel dieser Schritt nicht ausgeführt, um die überlegene Sensitivität, die unter Verwendung des N-1-Biotinyl-N-2(4-hydroxycinnamoyl)-ethandiamins erhalten wird, weiter zu illustrieren.

Claims

Verfahren zur Detektierung oder Quantifizierung eines Analyten in einem Assay, der die folgenden Schritte umfasst: a) Umsetzen eines analytabhängigen Enzymaktivierungssystems, das mindestens ein Enzym umfasst, mit einem Konjugat, das ein detektierbar markiertes Substrat mit der Struktur einer p-Hydroxycinnamoyl enthaltenden Verbindung umfasst, die die folgende Struktur hat:
X eine Linkergruppe ist, die A an eine p-Hydroxycinnamoyleinheit linken kann, und A eine Markierung ist, die in einem analytabhängigen Enzymaktivierungssystemassay detektierbar ist und ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Biotin, Dinitrophenyl, Fluoreszein und Tetramethylrhodamin, um ein aktiviertes Konjugat zu bilden, das sich im Wesentlichen dort kovalent abscheidet, wo sich mindestens ein Rezeptor für das aktivierte Konjugat befindet, wobei der Rezeptor mit dem analytabhängigen Enzymaktivierungssystem nicht reaktiv ist, und b) Detektieren oder Quantifizieren der Signale, die direkt oder indirekt aus den abgeschiedenen detektierbaren Markierungen erzeugt worden sind.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei X ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus:
Verfahren nach den Ansprüchen 1 oder 2, wobei das analytabhängige Enzymaktivierungssystem eine Peroxidase ist.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei der Assay den folgenden Anfangsschritt aufweist: Immobilisieren des Analyten auf einer festen Phase, um das analytabhängige Aktivierungssystem zu bilden, und wobei das aktivierte Konjugat ein erstes Mitglied eines spezifischen Bindungspaars ist und sich kovalent auf der festen Phase abscheidet, indem es an ein zweites Mitglied des spezifischen Bindungspaars bindet, und wobei das aktivierte Konjugat mit dem analytabhängigen Enzymaktivierungssystem nicht reaktiv ist.
Verfahren nach Anspruch 4, wobei X ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus:
Verfahren nach den Ansprüchen 4 oder 5, wobei das analytabhängige Enzymaktivierungssystem eine Peroxidase ist.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei das analytabhängige Enzymaktivierungssystem ein Mitglied eines spezifischen Bindungspaars ist und das aktivierte Konjugat bildet, welches ein erstes Mitglied eines spezifischen Bindungspaars ist, wobei das aktivierte Konjugat sich auf der festen Phase abscheidet, indem es sich an ein zweites Mitglied des spezifischen Bindungspaars auf der Oberfläche der festen Phase bindet, wobei das zweite Mitglied mit dem analytabhängigen Enzymaktivierungssystem nicht reaktiv ist.
Verfahren nach Anspruch 7, wobei X ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus:
Verfahren nach den Ansprüchen 7 oder 8, wobei das analytabhängige Enzymaktivierungssystem eine Peroxidase ist.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei das mindestens eine Enzym mindestens ein Peroxidaseenzym ist.
p-Hydroxycinnamoyl enthaltende Verbindung mit der folgenden Struktur:
worin: X eine Linkergruppe ist, die ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus:

wobei X in der Lage ist, A an eine p-Hydroxycinnamoyleinheit zu linken, und A eine Markierung ist, die in einem analytabhängigen Enzymaktivierungssystemassay detektierbar ist und ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Biotip, Dinitrophenyl, Fluoreszein und Tetramethylrhodamin.