DD295245A5 - Verfahren zur herstellung von cyclosporin a-konjugaten - Google Patents

Abstract

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von Cyclosporin-A-Konjugaten mit Makromolekuelen, die als Komponenten fuer immunologische Nachweisverfahren von Cyklosporin A bzw. als Immunogen fuer die Gewinnung von CsA-Antiseren oder als Hilfsmittel fuer deren Aufreinigung geeignet sind. Erfindungsgemaesz wird diese Aufgabenstellung dadurch geloest, dasz CsA-Epoxid 1 in waeszriger ethanolischer Loesung in Gegenwart von Carbonatpuffer bei p H 9,6 mit Makromolekuelen wie Eiweiszverbindungen, Enzymen oder Kohlehydraten zur Reaktion gebracht wird. Die so gebildeten Konjugate lassen sich durch Gelchromatographie reinigen. Nicht vorhersehbar war der Befund, dasz auf diesem Wege hergestellte Konjugate monoklonale Anti-CsA-Antikoerper binden koennen.{Cyclosporin-A-Konjugate; Nachweisverfahren, immunologische; Immunogen; Antiseren; Makromolekuele; Cyclosporin-A-Epoxid; Enzymimmunassay; Antikoerperfestphasentest}

Description

Hierzu 3 Seiten Zeichnungen

Anwendungsgebiet der Erfindung

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von Cyclosporin A-Konjugaten mit Makromolekülen, die als Komponenten für immunologische Nachweisverfahren von Cyclosporin A bzw. als Immunogen für die Gewinnung von CsA-Antiseren oder als Hilfsmittel für deren Aufreinigung geeignet sind.

Charakteristik des bekannten Standes der Technik

Die chemische Verknüpfung des cyclischen Undecapeptides CsA mit Makromolekülen ist aufgrund der Besonderheiten seiner Struktur außerordentlich erschwert. Sie erfordert in der Regel beachtliche Veränderungen der Struktur <>s CsA, was mit großem Arbeitsaufwand und häufig mit dem Verlust an immunologischer Identität verbunden ist (PCT, WO 86,'0zu80). Die chemische Bindung von CsA über das Epoxid 1 (Abb. 1) an Proteine oder andere makromolekulare Trägerstoffe ist bisher nicht beschrieben. Die Herstellung von 1 gelang P.L.Durette u. Mitarb. (Transplantation Proceedings Vol.XX, No 2, Suppl.2,51-57 [1988]) durch Reaktion von 3'-0-Acetyl-CsA mit 3-Chlorperbenzoesäure.

Ziel der Erfindung

Ziel der Erfindung ist es, durch die Entwicklung einfacher chemischer Verfahren zur Herstellung von CsA-Konjugaten die Voraussetzungen zu schaffen, die kosten- und arbeitsaufwendigen Radioimmunoassays zum CsA-Nachweis durch einfache Enzymimmunoassays zu ersetzen.

Darlegung des Wesens der Erfindung

Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, die chemische Bindung von CsA an Makromoleküle unter Bildung von Konjugaten zu ermöglichen, die geeignet sind, als Komponenten immunologischer Nachweisverfahren für CsA bzw. als Immunogen für die Gewinnung von CsA-Antiseren oder als Hilfsmittel für deren Aufreinigung zu dienen. Erfindungsgemäß wird diese Aufgabenstellung dadurch gelöst, daß CsA-Epoxid (Abb. 1) in wäßrig ethanolischer Lösung in Gegenwart von Carbonatpuffer bei pH9,6 mit Makromolekülen wie Eiweißverbindungen, Enzymen oder Kohlehydraten zur Reaktion gebracht wird. Die so gebildeten Konjugate lassen sich durch Gelchromatographie reinigen. Nicht vorhersehbar war der Befund, daß auf diesem Wege hergestellte Konjugate monoclonale Anti-CsA-Antikörper binden können. Die Erfindung wird anhand von 3 Ausführungsbeispielen näher erläutert

Die dazugehörigen Abbildungen zeigen

Abb.1: 3'-0-Acetyl-CsA-Epoxid

Abb.2a: 3'-0-Acetyl-CsA

Abb.2b: restliches 3'-0-Acetyl-CsA nach Reaktion mit Peressigsäure Abb.2c: restliches 3'-0-Acetyl-Epoxid nach Reaktion mit RSA.

Ausführungsbeispiele Beispiel 1

3'-0-ACeIyI-CtA-EpOxId(D

Das aus 1,8mg (1,5 pmol) CsA (AWD) nach der Methode von R.Traber u. Mitarb. (HeIv. Chim. Acta 65,1655-1677,1982) in einer Ausbeute von 92% erhaltene 3'-0-Acetyl-CsA wird in 1 ml 70% wäßrigem Ethanol gelöst. Nach Zugabe von 0,3ml Peressigsäure (2%) wird das Gemisch 16Std. im verschlossenen Gefäß stehen gelassen. Nach Zufügen von 1 ml H₂O und 5ml CCI₄ (p. a., dest.). Rühren und Zentrifugieren, wird die wäßrige Phase abgesaugt und verworfen. Die organische Phase wird zweimal mit je 1 ml H₂O gewaschen und anschließend bei 4O⁰C unter N₂ zur Trockne eingeengt. Die Umsetzung des 3'-0-Acetyl-CsA zu 1 läßt sich durch physikalisch-chemische Methoden kontrollieren. Nach Quantifizierung durch HPLC erfolgt sie zu 70-80% (Abb. 2a und 2 b).

Beispiel 2

3'-0-AcOtVl-CsA-RSA (2)

Das nach Beispiel 1 erhaltene Rohprodukt 1 wird in 0,5ml 70% Ethanol gelöst. Dazu gibt man eine Lösung von 2mg RSA (PPH Polskie Odczynniki Chemiczne) in 0,3ml H₂O und fügt 0,2 ml Carbonatpuffer (0,1 mol/l, pH 9,6) hinzu. Das Gemisch läßt man unter gelegentlichem Rühren 20Std. bei Raumtemperatur stehen. Nach Quantifizierung durch HPLC erfolgt die Umsetzung von 1 zum Konjugat 2 zu etwa 80% (Abb. 2c). Die Reinigung von 2 erfolgt durch Gelchromatographie über eine Sephadex G-25-Säule 35cm x 1,4cm I. D.

Beispiel 3 Prüfung der Aktivität von CsA-Konjugaten gegenüber Antl-CeA-Antikörpern-Festphasentest

Material und Reagenzien

CsA-RSA-Losung:

0,01 mg 2 (bez. auf RSA)AnI Carbonatpuffer (0,1 mol/l, pH 9,6).

Anti-CsA-Antikorper, monoclonal nonspezifisch (Lyophilisat, Sandoz LTD, Basel, Schweiz).

Anti Maus (Ziege) POD (Lyophilisat, SIFIN, Berlin, DDR).

Waschlösung: PBS (Phosphat 0,01 mol/l, NaCI 0,3mol/l), Tween 20 0,1 Vol.-%.

Medium 1:

Carbonatpuffer (0,1 mol/l, pH 9,6)/Gelafusal® = 98/2 [v/v].

Medium 2:

PBS/Gelafusal«/Tween 20 = 95/5/0,1 [v/v].

Substratmedium:

1.2-Phenylendiamindihydrochlorid-Lösung (1 mg/ml CitratpufferO,1 mol/l, pH5,0)/H₂O₂-Lösung (30%) = 1/0,001 [v/v].

Stop-Losung: Na₂SO₃ (0,5mol/l H₂SO₄,1 molar).

Festphase:

Mikrotestplatten (Scopyrol, VEB MLW Polyplast, Halberstadt, DDR).

Beschichtung der Festphase

Mikrotestplatten werden mit 0,05ml CsA-RSA-Lösung pro Well über Nacht bei 4°C in der feuchten Kammer beschichtet und anschließend dreimal mit Waschlösung gewaschen. Die Nachbenetzung der Platten erfolgt mit je 0,05ml Medium 1 innerhalb 2 Std. bei 37⁰C. Danach wird dreimal mit Waschlösung gewaschen.

Festphasentest

Die beschichteten und nachbenetzten Platten werden mit 0,05ml Anti-CsA-Antikörper-Lösung (0,3mg Lyophilisat/ml Medium 2) pro Well 2 Std. bei Raumtemperatur inkubiert und dreimal mit Waschlösung gewaschen. Anschließend erfolgt Inkubation mit 0,05ml Anti-Maus-POD (0,017 mg/ml Medium 2) pro Well, 1,5Std. bei Raumtemperatur. Danach wird erneut dreimal mit Waschlösung gewaschen. Die Substratreaktion wird mit 0,05ml Substratmedium pro Well bei Raumtemperatur innerhalb von 30min durchgeführt und danach mit 0,05ml Stop-Lösung abgestoppt. Die Extinktionsmessung erfolgt bei 493nm/690nm.

Claims (4)

1. Verfahren zur Herstellung von Konjugaten des Cyclosporin A (CsA) mit Makromolekülen, dadurch gekennzeichnet, daß CsA-Epoxid der Formel 1 (Abb. 1) mit Eiweißverbindungen oder Kohlehydraten zur Reaktion gebracht wird.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß als Eiweißverbindungen Rinderserumalbumin (RSA), Tetanustoxoid, KLH oder andere Eiweißverbindungen eingesetzt werden.

3. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß als Eiweißverbindungen Enzyme wie Peroxidasen (z.B. Meerrettichperoxidase), Oxidasen (z.B. Glucoseoxidase), Dehydrogenasen (z.B. Lactatdehyrogenase), Phosphatasen (z.B. Alkalische Phosphatase) eingesetzt werden.

4. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß als Kohlehydrate z.B. Sepharose- oder Cellulosederivate eingesetzt werden.