DE60037655T2 - 4-(4-hydroxystyryl)pyridin-enthaltende substrate für analytabhängiges enzym aktivierungssystem - Google Patents

4-(4-hydroxystyryl)pyridin-enthaltende substrate für analytabhängiges enzym aktivierungssystem Download PDF

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Description

  • GEBIET DER ERFINDUNG
  • Die vorliegende Erfindung betrifft 4-(4-Hydroxystyryl)pyridin enthaltende Verbindungen und die Verwendung von 4-(4-Hydroxystyryl)pyridin enthaltende Verbindungen als Peroxidase-Enzymsubstrate in einer Reihe von Anwendungen, wie beispielsweise einer katalysierten Reporter-Deposition.
  • FACHLICHER HINTERGRUND
  • Peroxidase findet auf Grund ihrer hohen Umsatzrate, guten Stabilität und Verfügbarkeit in analytischen Methoden auf Enzymbasis eine weit verbreitete Anwendung. Beispielsweise katalysiert Meerrettichperoxidase (HRP) (EC 1.11.1.7) die Oxidation einer großen Vielzahl von Wasserstoff spendenden Substraten mit Wasserstoffperoxid. Außerdem ist HRP eines der bevorzugten Enzyme zur Verwendung in der katalysierten Reporter-Deposition.
  • Die katalysierte Reporter-Deposition ("catalyzed reporter deposition") (CARD) ist eine neuartige Methode der Signalverstärkung, die Gegenstand der US-P 5731158 ; 5583001 und 5196306 ist. Sie wird ebenfalls diskutiert in Bobrow et al., Journal of Immunological Methods, 125: 279–285 (1989) und Bobrow et al., Journal of Immunological Methods, 137: 103–112 (1991).
  • Die CARD-Methode nutzt ein analytenabhängiges Enzymaktivierungssystem ("ADEAS") zum Katalysieren der Deposition von Reporter- oder Hapten-Gruppen (Marker) auf der festen Phase einer Assay-Plattform. Diese enzymatisch abgeschiedenen Marker werden direkt oder indirekt detektiert und ergeben eine Signalverstärkung und verbesserte Nachweisgrenzen. In einer bevorzugten Ausführungsform ist das Enzym HRP.
  • HRP reagiert mit einem Konjugat, das aus einer markierten Verbindung besteht, die in ein Peroxidase-Substrat eingebaut ist. Wenn das System und die Verbindung reagieren, wird ein reaktionsfähiges Intermediat gebildet, das sich kovalent abscheidet, wo immer ein Rezeptor für das aktivierte reaktionsfähige Intermediat immobilisiert wurde. Beispiele für derartige Verbindungen, die beschrieben worden sind, schließen substituierte Phenole ein, wie beispielsweise Biotinyl-Tyramid, Fluorescein-Tyramid und p-Hydroxycinnamoyl enthaltenden Substraten, wie in der US-P-5863748 offenbart wurde.
  • Für die analytische Anwendung sind Peroxidase-Substrate zur Erzeugung von Produkten verwendet worden, die farbig, fluoreszent oder chemolumineszent wurden. Diese Produkte blieben entweder löslich oder wurden unlöslich und schieden auf der Oberfläche aus. Die CARD-Methode unterscheidet sich insofern, dass die reaktionsfähigen Intermediate auf der Oberfläche kovalent gebunden werden.
  • Styrylpyridinium-Verbindungen sind zur Verwendung beispielsweise als elektrochrome Membransonden gut bekannt, Loew, Journal of Biochemical and Biophysical Methods, 6 (1982) 243–260; Loew and Simpson, Biophys, J., Bd. 34, Juni 1981, 353–365; Loew et al., Biochemistry, Bd. 17, Nr. 19, 1978, 4065–4071; und Loew et al., Nature, Bd. 281, 11. Oktober 1979, 497–499. Die Verwendung von Styrylpyridinium-Verbindungen als Sonden mit Membranpotential ist in diesen Veröffentlichungen eingehend ausgeführt worden. In keiner dieser Veröffentlichungen findet sich jedoch eine Lehre über die Anwendung von Styrylpyridinium-Verbindungen als Substrate.
  • Im typischen Fall werden Fluoreszenzverbindungen als Marker für CARD und andere Methoden verwendet. Je größer die Intensität der Fluoreszenz und je größer die Stokes-Verschiebung (größere Spreizung zwischen Erregungs- und Emissionsmaxima) einer Fluoreszenzverbindung sind, umso geringer ist die Nachweisgrenze des gewählten Materials.
  • Dementsprechend wäre es vorteilhaft und wünschenswert, über markierte Verbindungen zu verfügen, die ein hohes Maß an Reaktionsfähigkeit besitzen, eine sehr große Stokes-Verschiebung und die ebenfalls stark fluoreszent im trockenen Zustand sind, und zwar als Substrate zur Verwendung in Enzym-Assays, wie beispielsweise CARD-Assays.
  • ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
  • Die vorliegende Erfindung betrifft markierte 4-(4-Hydroxystyryl)pyridin enthaltende Verbindungen, die in Substraten auf Peroxidase-Basis eingebaut sind, und betrifft die Verwendung dieser Substrate in Assays. Ebenfalls betrifft die vorliegende Erfindung 4-(4-Hydroxystyryl)pyridin enthaltende Verbindungen, die die folgende Struktur haben:
    Figure 00020001
    worin R1, R2, R3 und R4 unabhängig H sind oder X-L, R5 ist ein Elektronenpaar oder -X-L, X ist eine Linker-Gruppe, die zum Binden von L an einen 4-(4-Hydroxystyryl)pyridin-Teil in der Lage ist, L ist eine detektierbarer Marker, A ist N oder N+, und wobei, wenn R1, R2, R3 und R4 H sind, R5 -X-L ist und A N+ ist, und wobei, wenn irgendeines von R1 bis R4 -X-L ist, A N ist, und wobei L ein erstes Glied eines spezifisch bindenden Paares ist und Biotin oder Dinitrophenyl ist, oder L ist eine Fluoreszenzverbindung und ist Fluorescein oder Tetramethylrhodamin. Die Verbindung selbst ist fluoreszent und kann als ein Marker dienen. Wenn L als ein entsprechender Marker gewählt wird, kann eine Fluoreszenzverstärkung ohne die Anwendung von CARD erreicht werden.
  • Ebenfalls offenbart werden 4-(4-Hydroxystyryl)pyridin enthaltende Verbindungen, die in Substraten auf Peroxidase-Basis eingebaut sind, sowie die Verwendung dieser Substrate in Assays. Die Verbindungen die die folgende Struktur haben:
    Figure 00020002
    worin R1, R2, R3 und R4 H oder Z sind; R5 ist ein Elektronenpaar oder Z, Z ist ein geradkettiges, ein verzweigtes Alkyl, ein substituiertes Alkyl, Heteroalkyl oder substituiertes Heteroalkyl, worin das Heteroatom ausgewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus N, O oder S; A ist N oder N+, und worin, wenn R1, R2, R3 und R4 H sind, R5 Z ist und A N+ ist, und worin, wenn irgendeines der R1 bis R4 Z sind, A N ist.
  • Ebenfalls wird hierin die Verwendung von 4-(4-Hydroxystyryl)pyridin enthaltende Verbindungen in Assays zum Detektieren oder quantitativen Nachweisen des Vorhandenseins oder der Abwesenheit eines Analyten in einer Probe offenbart, worin die Anwendung von CARD zur Amplifikation des Reporter-Signals einbezogen sein kann, nicht jedoch einbezogen sein muss.
  • KURZE BESCHREIBUNG DER FIGUREN
  • Weitere Vorteile der vorliegenden Erfindung werden mühelos durch das bessere Verständnis unter Bezugnahme auf die folgende detaillierte Beschreibung unter Berücksichtigung der beigefügten Zeichnungen erkannt, worin sind:
  • 1A ist eine Mikrophotographie, die veranschaulicht, dass Mittel von Maus-Intestinum, inkubiert in PBS-BB ohne Weizenkeim-Agglutinin, keine spezifische Markierung haben;
  • 1B ist eine Mikrophotographie, die einen Schnitt von Maus-Intestinum darstellt, die an HRP-konjugiertem Weizenkeim-Agglutinin exponiert ist, wobei die Mikrophotographie eine an den intestinalen Becherzellen lokalisierte, intensive HPPS-Fluoreszenz zeigt;
  • 2A ist eine Mikrophotographie, die einen Schnitt von Maus-Intestinum veranschaulicht, das mit HMPT behandelt ist und in wässriger Lösung eine helle Fluoreszenz zeigt, und
  • 2B ist eine Mikrophotographie, die einen Schnitt von Maus-Intestinum zeigt, das mit HMPT behandelt ist, um in einem nichtwässrigen Medium ein hell leuchtendes Reaktionsprodukt zu erzeugen.
  • DETAILLIERTE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
  • Die hierin offenbarte, vorliegende Erfindung betrifft die Verwendung von 4-(4-Hydroxystyryl)pyridin enthaltenden Verbindungen, die in Peroxidase-Substraten eingebaut sind. Der Begriff "analytabhängiges Enzym-Aktivierungssytem" (ADEAS, Analyte Dependent Enzyme Activation System) bezieht sich auf ein Enzymsystem, worin (i) mindestens eines der Enzyme in irgendeiner in der Fachwelt bekannten Weise an einem Glied eines spezifisch bindenden Paares gekoppelt ist oder (ii) das Enzym nicht an einem Glied eines spezifisch bindenden Paares gekoppelt sein muss, wenn es der Analyt ist. Das Enzym katalysiert entweder von sich aus oder in Verbindung mit einem zweiten Enzym die Bildung eines reaktionsfähigen Intermediats, das dann abgeschieden wird, wo immer es für das reaktionsfähige Intermediat einen Rezeptor gibt.
  • Der Begriff "Oberfläche", wie er hierin verwendet wird, bedeutet jeden beliebigen, in der Fachwelt bekannten Träger oder Phase, einschließlich Zellen, Gewebe, Membranen, Objektträger und Kügelchen.
  • Der Begriff "Amplifikation" bedeutet, wie er hierin verwendet wird, die Amplifikation eines Reportersignals Der Begriff "reaktionsfähiges Intermediat" bedeutet die 4-(4-Hydroxystyryl)pyridin enthaltende Verbindung, die durch das Enzym zum Binden an dem Rezeptor sensibilisiert worden ist.
  • Der Begriff "Rezeptor" bedeutet eine Stelle, die über die Bildung einer kovalenten Bindung ein reaktionsfähiges Intermediat binden wird.
  • Der Begriff "detektierbar markiert" bedeutet, dass die 4-(4-Hydroxystyryl)pyridin enthaltende Verbindung zusätzlich zu der Substratcharakteristik, die durch den phenolischen Teil vermittel wird, auch infolge des zusätzlichen Ring-Gliedes fluoreszent ist, der über die Styryl-Verknüpfung gebunden ist. Die Verbindung kann auch detektierbar markiert sein, infolge ihrer Kopplung an einen Reporter oder ein unmarkiertes erstes Glied eines spezifisch bindenden Paares. In dem Fall, in dem die Verbindung an ein unmarkiertes Glied eines spezifisch bindenden Paares gekoppelt ist, nachdem das reaktionsfähige Intermediat kovalent an dem Rezeptor gebunden ist, wird der substratspezifische Komplex des bindenden Paares umgesetzt mit dem zweiten Glied des bindenden Paares, das an einen Reporter gekoppelt ist.
  • Glieder von spezifisch bindenden Paaren, die zur Verwendung in der Ausführung der Erfindung geeignet sind, können vom Immun-Typ oder Nichtimmun-Typ sein. Immunspezifische bindende Paare werden exemplifiziert durch Antigen/Antikörper-Systeme oder Hapten/Antihapten-Systeme, wie beispielsweise Dinitrophenyl (DNP)-Anti-DNP. Das Antikörper-Glied des bindenden Paares, ob es nun ein polyklonales, monoklonales oder ein immunreaktives Fragment davon ist, kann erzeugt werden mit Hilfe der dem Fachmann auf diesem Gebiet vertrauten Methoden. Die Begriffe "immunreaktives Antikörperfragment" oder "immunreaktives Fragment" bedeuten Fragmente, die die bindende Region des Antikörpers enthalten. Diese Fragmente können Fragmente vom Fab-Typ sein, die als Fragmente definiert sind, denen der Fc-Abschnitt fehlt, z. B. Fab-, Fab'- und F(ab')2-Fragmente, oder können sogenannte "Halbmolekül"-Fragmente sein, die durch reduktive Spaltung der Disulfidbindungen erhalten werden, die die Komponenten der schweren Kette des intakten Antikörpers verbinden. Wenn das Antigen-Glied des spezifisch bindenden Paares nicht immunogen ist, z. B. ein Hapten, kann es kovalent an ein Trägerprotein gebunden werden, um es immunogen zu machen.
  • Nichtimmunbindende Paare schließen Systeme ein, in denen die zwei Komponenten eine natürliche Affinität zueinander teilen, jedoch keine Antikörper sind. Für nichtimmunbindende Paare beispielhaft sind Biotin-Avidin oder Biotin-Streptavidin, Folsäure-Folat-bindendes Protein, komplementäre Sonden-Nucleinsäuren, usw. Ebenfalls einbezogen sind nichtimmunbindende Paare, die eine kovalente Bindung untereinander bilden. Beispielhafte kovalent bindende Paare schließen Sulfhydryl-reaktive Gruppen ein, wie beispielsweise Maleinimide und Halogenacetyl-Derivate sowie Amin-reaktive Gruppen, wie beispielsweise Isothiocyanate, Succinimidylester, Sulfonylhalogenide und Kuppler-Farbstoffe, wie beispielsweise 3-Methyl-2-benzothiazolinon-hydrazon (MBTH) und 3-(Dimethylamino)benzoesäure (DMAB), usw.
  • Der Begriff "Deposition" bedeutet gerichtetes Binden eines reaktionsfähigen Intermediats an den Rezeptor, das aus der Bildung einer kovalenten Bindung resultiert.
  • Das Enzym katalysiert die Deposition einer 4-(4-Hydroxystyryl)pyridin enthaltenden Verbindungen durch Überführug der Verbindung in ein reaktionsfähiges Intermediat, das zum kovalenten Binden an einem Rezeptor in der Lage ist.
  • Die vorliegende Erfindung betrifft ebenfalls die 4-(4-Hydroxystyryl)pyridin enthaltenden Verbindungen, die bisher als Enzymsubstrate nicht beschrieben worden sind.
  • Enzyme, die zur Verwendung mit 4-(4-Hydroxystyryl)pyridin enthaltenden Verbindungen der Erfindung geeignet sind, schließen Oxidoreduktasen ein. Spezieller können Peroxidasen eingesetzt werden. Eines der besonders bevorzugten Enzyme, das für die neuartigen erfindungsgemäßen Substrate geeignet ist, ist Meerrettichperoxidase.
  • Es ist überraschend und unerwartet festgestellt worden, dass ein Peroxidase-Substrat, in das eine neuartige 4-(4-Hydroxystyryl)pyridin enthaltende Verbindung eingebaut wurde, die Empfindlichkeit der katalysierten Reporter-Deposition über das gegenwärtig unter Verwendung der bereits beschriebenen Fluoreszenzkonjugate erreichbare Maß wesentlich verbessert und eine sehr starke Stokes-Verschiebung zeigt.
  • In einer anderen Ausführungsform betrifft die Erfindung 4-(4-Hydroxystyryl)pyridin enthaltende Verbindungen, die die Struktur haben:
    Figure 00050001
    worin R1, R2, R3 und R4 unabhängig H sind oder -X-L, R5 ist ein Elektronenpaar oder -X-L, X ist eine Linker-Gruppe, die zum Binden von L an einen 4-(4-Hydroxystyryl)pyridin-Teil in der Lage ist, L ist ein detektierbarer Marker, A ist N oder N+, und worin, wenn R1, R2, R3 und R4 H sind, R5 -X-L ist und A N+ ist, und worin, wenn irgendeines der R1 bis R4 -X-L ist, A N ist, und worin L ein erstes Glied eines spezifisch bindenden Paares ist und Biotin oder Dinitrophenyl ist, oder L ist eine Fluoreszenzverbindung und ist Fluorescein oder Tetramethylrhodamin.
  • In einer anderen Ausführungsform betrifft die Erfindung die Verwendung von 4-(4-Hydroxystyryl)pyridin enthaltenden Verbindungen, die die Struktur haben:
    Figure 00050002
    worin R1, R2, R3 und R4 H oder Z sind; R5 ist ein Elektronenpaar oder Z, Z ist ein geradkettiges Alkyl, ein verzweigtes Alkyl, ein substituiertes Alkyl, Heteroalkyl oder substituiertes Heteroalkyl, worin das Heteroatom ausgewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus N, O oder S; A ist N oder N+, und worin, wenn R1, R2, R3 und R4 H sind, R5 Z ist und A N+ ist, und worin, wenn irgendeines der R1 bis R4 Z ist, A N ist.
  • Beispiele für geeignete 4-(4-Hydroxystyryl)pyridin enthaltende Verbindungen schließen beispielsweise ein:
    Figure 00060001
  • Der Begriff "Heteroalkyl" bedeutet eine Alkyl-Gruppe, in der ein oder mehrere Kohlenstoffatome durch ein Heteroatom ersetzt sind.
  • Der Begriff "substituiert" bedeutet, dass der organische Rasenrest einen oder mehrere Substituenten hat. Beispielsweise bedeutet "substituiertes Heteroalkyl" ein Heteroalkyl-Rest, der einen oder mehrere Substituenten hat. Substituenten können die folgenden einschließen, ohne auf diese beschränkt zu sein: -OH, -COOH, -NH2 und -SH. Die Bindungen, die das Heteroalkyl binden, schließen einfache und/oder Doppelbindungen ein.
  • Zum Verknüpfen des 4-(4-Hydroxystyryl)pyridin-Teils steht eine große Vielzahl von detektierbaren Marker zur Verfügung, wobei die vorliegende Erfindung auf keinerlei speziellen Marker beschränkt ist. Der detektierbare Marker kann ein Reporter sein, wie beispielsweise ein radioaktives Isotrop, z. B. 125I, Enzyme, fluorogene Reagenzien, wie beispielsweise Fluorescein oder Tetramethylrhodamin, chemoluminescente Reagenzien oder elektrochemische Materialien. Der detektierbare Marker kann auch ein Glied eines spezifisch bindenden Paares entsprechend der vorstehenden Beschreibung sein. Andere Marker sind für den Fachmann auf dem Gebiet ohne weiteres erkennbar.
  • Enzyme, die zur Ausführung der Erfindung verwendet werden können, wenn der Reporter ein Enzym ist, schließen Hydrolasen ein, Lyasen, Oxidoreduktasen, Transferasen, Isomerasen und Ligasen. Einige bevorzugte Beispiele sind Phosphatasen, Esterasen, Glykosidasen und Peroxidasen. Spezielle Beispiele schließen Alkali-Phosphatasen ein, Lipasen, beta-Galactosidasen und Meerrettichperoxidasen. Wenn als ein Reporter ein Enzym verwendet wird, kann es gleich dem Enzym oder den Enzymen oder von diesen verschieden sein, die zur Erzeugung des reaktionsfähigen Intermediats verwendet werden.
  • Die Linker-Gruppe, X, kann nahezu jede beliebige Gruppe sein, die zum Verknüpfen des detektierbaren Markers mit dem 4-(4-Hydroxystyryl)pyridin-Teil in der Lage ist, wobei die Erfindung nicht auf die Verwendung irgendwelcher spezieller Linker begrenzt ist. Als Linker kann jede beliebige geradkettige oder verzweigte Alkyl (C1-C10-Allyl) oder Aryl-Gruppe dienen mit der einzigen Bedingung, dass die den 4-(4-Hydroxystyryl)pyridin-Teil mit dem Marker verknüpft. Beispielsweise werden Halogenallyl-Verbindungen, wie z. B. Bromhexansäure, mit dem 4-(4-Hydroxystyryl)pyridin-Teil reagieren und zu der Erzeugung einer 4-(4-Hydroxystyryl)-N-(6-hexanoyl)pyridin-Verbindung führen. Die Hexansäure-Gruppe kann anschließend zum Verknüpfen der Amin enthaltenden Marker verwendet werden.
  • Bin Beispiel für eine Verbindung gemäß der vorliegenden Erfindung, die eine Linker-Gruppe an der detektierbaren Biotin-Gruppe an einem 4-(4-Hydroxystyryl)pyridin-Teil anbringt, hat die Struktur:
    Figure 00070001
    worin die Linker-Gruppe -(CH2)5CONHCH2)5NH- ist.
  • Wenn eine 4-(4-Hydroxystyryl)pyridin enthaltende Verbindung der vorliegenden Erfindung mit einem Enzym umgesetzt wird, ist das resultierende reaktionsfähige Intermediat in der Lage, einen Rezeptor zu binden. Das reaktionsfähige Intermediat wird an den Rezeptor über eine kovalente Bindung gebunden. Das Neue an dem reaktionsfähigen Intermediat, das an dem Rezeptor über eine kovalente Bindung bindet, kann auf elektronenreiche Teile des Rezeptors zurückgeführt werden. Ein exogener Rezeptor bedeutet ein Rezeptor, der nicht innerhalb des Assays seinen Ursprung hat. Er kann auf der Oberfläche eines Trägers vor der Hinzufügung des Konjugats zur Reaktionsmischung immobilisiert werden.
  • In noch einer anderen Ausführungsform betrifft die Erfindung die Verwendung derartiger 4-(4-Hydroxystyryl)pyridin enthaltenden Verbindungen zum Detektieren oder quantitativen Bestimmen des Vorhandenseins oder der Abwesenheit eines Analyten in einer Probe, in der zur Amplifikation des Reportersignals eine katalysierte Reporter-Deposition angewendet wird.
  • Die Verbindungen der vorliegenden Erfindung lassen sich unter Anwendung konventioneller Methoden des Koppeln und Markierens synthetisch darstellen.
  • Wie vorstehend ausgeführt, stehen zahlreiche an detektierbaren Markern gebundene Linker-Gruppen kommerziell zur Verfügung. Diese kommerziell verfügbaren Linker-Gruppen können mit 4-(4-Hydroxystyryl)pyridin enthaltenden Verbindungen unter Anwendung konventioneller Protokolle umgesetzt werden, wie sie dem Fachmann auf dem Gebiet gut bekannt sind.
  • Die nachfolgend präsentierten Beispiele sollen spezielle Ausführungsformen der Erfindung veranschaulichen und sind in keiner Weise zur Beschränkung des Schutzumfanges der Beschreibung und einschließlich der Ansprüche vorgesehen.
  • EXPERIMENTELLE DATEN
  • BEISPIEL 1 – SENSITIVE HRP-LOKALISIERUNG UNTER ANWENDUNG EINER 4-(4-HYDROXYSTYRYL)PYRIDIN ENTHALTENDEN VERBINDUNG
  • Es wurden Schnitte von in Paraffin eingebettetem Maus-Intestinum deparaffiniert und nichtspezifische Bindungsstellen durch Behandlung für 30 Minuten in PBS-blockierendem Puffer (PBS-BB; 0,1 Mol phosphatgepufferte Salzlösung, pH 7,2; 1,0% Rinderserumalbumin, 0,2% fettfreies Milchpulver und 0,3% Triton X-100) blockiert. Auf den Schnitten wurde für eine Stunde bei Raumtemperatur Meerrettichperoxidase (HRP)-konjugiertes Weizenkeim-Agglutinin (Sigma; St. Louis, MO) bei einer Konzentration von 0,5 μg/ml in PBS-BB inkubiert. Es wurden Kontrollschnitte in PBS-BB allein inkubiert. Die Schnitte wurden sodann in PBS (3 × für 5 Minuten für die jeweilige Wäsche) gewaschen und für 10 Minuten bei Raumtemperatur in einer Lösung umgesetzt, die 4-(4-Hydroxystyryl)pyridinium-propylsulfonat (HPPS) (Molecular Biosciences; Boulder, CO) mit 100 μg/ml in TSA Amplification Diluent, (NEN Life Science Products, Inc.; Boston, MA) enthielt. Sodann wurden die Schnitte in PBS gewaschen (3 × für 5 Minuten für die jeweilige Wäsche) eingebettet in PBS:Glyzerin (1:1) und mit Deckglas versehen. Die Schnitte wurden unter einem Mikroskop "Zeiss Axioskop" untersucht, das mit Epifluoreszenz und einem Filtersatz mit einer Erregungs/Emissionscharakteristik von 360 nm Peak-Erregung/>400 nm Langpassage-Emission ausgestattet war. Unter Verwendung eines Kamerasystems "Zeiss MC100" wurden Mikrophotographien aufgenommen.
  • In den in PBS-BB ohne Weizenkeim-Agglutinin inkubierten Schnitten wurde kein spezifisches Markieren festgestellt (1A). In den in HRP-konjugierten Weizenkeim-Agglutinin (1B) exponierten Schnitten wurden eine intensive HPPS-Fluoreszenz an intestinalen Becherzellen lokalisiert, die zahlreiche Weizenkeim-Agglutinin-Bindungsstellen besaßen. Die Konzentration von HRP-konjugiertem Weizenkeim-Agglutinin, das hierin für die HPPS-Detektion verwendet wurde (0,5 μg/ml) war deutlich geringer als diejenige, die für eine Weizenkeim-Agglutinin-Lokalisierung unter Verwendung von Fluoresceinkonjugiertem Weizenkeim-Agglutinin erforderlich ist (10 μg/ml). Originalvergrößerungen 400-fach.
  • BEISPIEL 2 – ABGESCHIEDENES 4-(4-HYDROXYSTYRYL)PYRIDIN-FLUORESZENZ-REAKTIONSPRODUKT IST IN NICHTWÄSSRIGEM MEDIUM STABIL
  • Es wurden Schnitte von in Paraffin eingebettetem Maus-Intestinum deparaffiniert und die nichtspezifischen Bindungsstellen durch Behandlung für 30 Minuten in PBS-BB blockiert. Auf den Schnitten wurde HRP-konjugiertes Weizenkeim-Agglutinin (Sigma) mit einer Konzentration von 0,5 μg/ml in PBS-BB für eine Stunde bei Raumtemperatur inkubiert. Anschließend wurden die Schnitte in PBS gewaschen (3 × für 5 Minuten für jede Wäsche) und für 10 Minuten bei Raumtemperatur in einer Lösung von 4-(4-Hydroxystyryl)methylpyridinium-tosylat (HMPT) (Molecular Biosciences) bei 100 μg/ml in TSA Amplification Diluent (NEN Life Science Products, Inc.) umgesetzt. Sodann wurden die Schnitte in PBS gewaschen (3 × für 5 Minuten für jede Wäsche) und entweder in PBS:Glyzerin (1:1) eingebettet oder in abgestuften Ethanollösungen dehydratisiert (0%, 70%, 95%, 100%, 100% 3 Minuten jeweils) und in Xylol (2 × für jeweils 3 Minuten) eingebettet in Permount (ein nichtwässriges Einbettungsmedium; Fisher Scientific, Pittsburgh, PA) und mit Deckglas versehen. Die Intensität des Fluoreszenzsignals der in wässrigem Medium (PBS:Glyzerin) oder nichtwässrigem Medium (Permount) eingebetteten Objektträger wurde unter Verwendung eines Mikroskops "Zeiss Axioskop" verglichen, das mit Epifluoreszenz und einem 360nm-Erregung/>400nm-Emissions-Filtersatz ausgestattet war. Unter Verwendung eines Kamerasystems "Zeiss MC100" und einer Standardbelichtung von zwei Sekunden wurden Mikrophotographien aufgenommen.
  • Im Gegensatz zu den meisten konventionellen Fluorophoren, die eine deutlich verminderte Fluoreszenzintensität in nichtwässrigem Medium zeigen, war das HMPT-Reaktionsprodukt in wässrigem Medium (2A) und nichtwässrigem Medium (2B) gleich hell. Darüber hinaus wurde bei Einbettung in nichtwässrigem Medium das Hintergrundsignal verringert, was zu einem besseren Signal/Rauschverhältnis führte. Unter beiden Bedingungen wurde eine starke Weizenkeim-Agglutinin-Reaktivität an dem intestinalen Epithel lokalisiert. Originalvergrößerungen 400-fach.

Claims (34)

  1. 4-(4-Hydroxystyryl)pyridin enthaltende Verbindung mit der Struktur:
    Figure 00090001
    worin R1, R2, R3 und R4 unabhängig H oder -X-L sind, R5 ist ein Elektronenpaar oder -X-L, X ist eine Linker-Gruppe, die zum Verknüpfen von L mit einem 4-(4-Hydroxystyryl)pyridin-Teil in der Lage ist, L ist ein detektierbarer Marken, A ist N oder N+, und worin, wenn R1, R2, R3 und R4 H sind, R5 -X-L ist und A N+ ist und worin, wenn eines von R1 bis R4 -X-L ist, A N ist, und worin L ein Glied eines spezifisch bindenden Paares ist und Biotin ist oder Dinitrophenyl, oder L ist eine Fluoreszenzverbindung und ist Fluorescein oder Tetramethylrhodamin.
  2. Verbindung nach Anspruch 1, worin X C1-C10-Alkyl ist.
  3. Verbindung nach Anspruch 1, worin X -(CH2)5CONH(CH2)5NH- ist.
  4. Assay zum Detektieren oder quantitativen Bestimmen eines Analyten, wobei der Assay umfasst: (a) Immobilisieren der zu assayierenden Probe, die den Analyten enthalten kann oder nicht enthalten kann, und zwar auf einer Oberfläche, um ein erstes Produkt zu erzeugen; (b) Umsetzen des ersten Produktes von Schritt (a) mit einem Glied eines spezifisch bindenden Paares, das an einem Enzym gekoppelt ist, um so ein zweites Produkt zu erzeugen; (c) Umsetzen des zweiten Produktes von Schritt (b) mit einer 4-(4-Hydroxystyryl)pyridin enthaltenden Verbindung, um ein reaktionsfähiges Intermediat zu erzeugen, wobei das reaktionsfähige Intermediat sich kovalent auf der Oberfläche durch Binden an einen Rezeptor abscheidet, wobei das abgeschiedene, reaktionsfähige Intermediat entweder direkt oder indirekt ein Signal erzeugt, das detektiert oder quantitativ bestimmt werden kann; und (d) Detektieren oder quantitatives Bestimmen des Analyten aus dem in Schritt (c) erzeugten Signal.
  5. Assay nach Anspruch 4, wobei die 4-(4-Hydroxystyryl)pyridin enthaltende Verbindung die Formel hat:
    Figure 00090002
    worin R1, R2, R3 und R4 unabhängig H oder -X-L sind, R5 ist ein Elektronenpaar oder -X-L, X ist eine Linker-Gruppe, die zum Binden von L an einen 4-(4-Hydroxystyryl)pyridin-Teil in der Lage ist, L ist ein detektierbarer Marker, A ist N oder N+, und wobei, wenn R1, R2, R3 und R4 H sind, R5 -X-L ist und A N+ ist, und wobei, wenn irgendeine von R1 bis R4 -X-L ist, A N ist.
  6. Assay nach Anspruch 5, wobei X -(CH2)5CONH(CH2)5NH- ist.
  7. Assay nach Anspruch 5, wobei L ausgewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus Biotin, Dinitrophenyl, Fluorescein und Tetramethylrhodamin.
  8. Assay nach Anspruch 7, wobei die 4-(4-Hydroxystyryl)pyridin enthaltende Verbindung ist:
    Figure 00100001
  9. Assay nach Anspruch 4, worin das 4-(4-Hydroxystyryl)pyridin enthaltende Substrat die Formel hat:
    Figure 00100002
    worin R1, R2, R3 und R4 H oder Z sind; R5 ist ein Elektronenpaar oder Z, Z ist ein lineares Alkyl, ein verzweigtes Alkyl, ein substituiertes Alkyl, Heteroalkyl oder substituiertes Heteroalkyl, wobei das Heteroatom ausgewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus N, O oder S; A ist N oder N+, und worin, wenn R1, R2, R3 und R4 H sind, R5 Z ist und A N+ ist, und worin wenn irgendeines der R1 bis R4 Z ist, A N ist.
  10. Assay nach Anspruch 9, wobei die 4-(4-Hydroxystyryl)pyridin enthaltende Verbindung ausgewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus:
    Figure 00110001
  11. Assay nach Anspruch 9, wobei in das Heteroalkyl eine Doppelbindung einbezogen ist.
  12. Assay nach Anspruch 9, wobei das Heteroalkyl substituiert ist mit einer Gruppe, die ausgewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus -OH, -COOH, -NH2 und -SH.
  13. Assay nach Anspruch 4, wobei das Enzym eine Peroxidase ist.
  14. Verfahren zum Detektieren oder quantitativen Bestimmen eines Analyten, welches Verfahren umfasst: (a) Umsetzen eines Enzyms mit einer 4-(4-Hydroxystyryl)pyridin enthaltenden Verbindung, um ein reaktionsfähiges Intermediat zu erzeugen, wobei sich das reaktionsfähige Intermediat kovalent auf einer Oberfläche durch Binden an einen Rezeptor abscheidet, wobei das abgeschiedene reaktionsfähige Intermediat entweder direkt oder indirekt ein Signal erzeugt, das detektiert oder quantitativ bestimmt werden kann; und (b) Detektieren oder quantitatives Bestimmen des Analyten aus in dem Schritt (a) erzeugten Signal.
  15. Verfahren nach Anspruch 14, wobei das 4-(4-Hydroxystyryl)pyridin enthaltende Substrat die Formel hat:
    Figure 00110002
    worin R1, R2, R3 und R4 unabhängig H oder -X-L sind, R5 ist ein Elektronenpaar oder -X-L, X ist eine Linker-Gruppe, die zum Binden von L an einen 4-(4-Hydroxystyryl)pyridin-Teil in der Lage ist, L ist ein detektierbarer Marker, A ist N oder N+, und wobei, wenn R1, R2, R3 und R4 H sind, R5 -X-L ist und A N+ ist, und worin, wenn irgendeines der R1 bis R4 -X-L ist, A N ist.
  16. Verfahren nach Anspruch 15, wobei X -(CH2)5CONH(CH2)5NH- ist.
  17. Verfahren nach Anspruch 15, wobei L ausgewählt ist aus der Gruppe, bestehend am Biotin, Dinitrophenyl, Fluorescein und Tetramethylrhodamin.
  18. Verfahren nach Anspruch 17, wobei das 4-(4-Hydroxystyryl)pyridin enthaltende Substrat
    Figure 00120001
    ist.
  19. Verfahren nach Anspruch 14, wobei das 4-(4-Hydroxystyryl)pyridin enthaltende Substrat die Formel hat:
    Figure 00120002
    worin R1, R2, R3 und R4 H oder Z sind; R5 ist ein Elektronenpaar oder Z, Z ist ein lineares Alkyl, ein verzweigtes Alkyl, ein substituiertes Alkyl, Heteroalkyl oder substituiertes Heteroalkyl, wobei das Heteroatom ausgewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus N, O oder S; A ist N oder N+, und wobei, wenn R1, R2, R3 und R4 H sind, R5 Z ist und A N+ ist, und wobei, wenn eines von R1 bis R4 Z ist, A N ist.
  20. Verfahren nach Anspruch 19, wobei die 4-(4-Hydroxystyryl)pyridin enthaltende Verbindung ausgewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus:
    Figure 00130001
  21. Verfahren nach Anspruch 19, wobei in das Heteroalkyl eine Doppelbindung einbezogen ist.
  22. Verfahren nach Anspruch 19, wobei das Heteroallyl substituiert ist mit einer Gruppe, die ausgewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus -OH, -COOH, -NH2 und -SH.
  23. Verfahren nach Anspruch 14, wobei das Enzym eine Peroxidase ist.
  24. Verfahren zum Herstellen einer aktivierten 4-(4-Hydroxystyryl)pyridin enthaltenden Verbindung, umfassend das Umsetzen einer 4-(4-Hydroxystyryl)pyridin enthaltenden Verbindung mit einem Peroxidase-Enzym.
  25. Verfahren nach Anspruch 24, wobei das 4-(4-Hydroxystyryl)pyridin enthaltende Substrat die Formel hat:
    Figure 00130002
    worin R1, R2, R3 und R4 unabhängig H oder -X-L sind, R5 ist ein Elektronenpaar oder -X-L, X ist eine Linker-Gruppe, die zum Binden von L an einen 4-(4-Hydroxystyryl)pyridin-Teil in der Lage ist, L ist ein detektierbarer Marker, A ist N oder N+, und wobei, wenn R1, R2, R3 und R4 H sind, R5 -X-L ist und A N ist, und wobei, wenn irgendeines von R1 bis R4 -X-L ist, A N ist.
  26. Verfahren nach Anspruch 24, wobei das 4-(4-Hydroxystyryl)pyridin enthaltende Substrat die Formel hat:
    Figure 00140001
    worin R1, R2, R3 und R4 H oder Z sind; R5 ist ein Elektronenpaar oder Z, Z ist ein lineares Alkyl, ein verzweigtes Alkyl, ein substituiertes Alkyl, Heteroalkyl oder substituiertes Heteroalkyl, wobei das Heteroatom ausgewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus N, O oder S; A ist N oder N+, und worin, wenn R1, R2, R3 und R4 H sind, R5 Z ist und A N+ ist, und wobei, wenn eines der R1 bis R4 Z ist, A N ist.
  27. Verfahren nach Anspruch 26, wobei daß 4-(4-Hydroxystyryl)pyridin enthaltende Substrat ausgewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus:
    Figure 00140002
  28. Verfahren zum Detektieren von Peroxidase-Aktivität, welches Verfahren das Umsetzen einer Peroxidase mit einer 4-(4-Hydroxystyryl)pyridin enthaltenden Verbindung umfasst.
  29. Verfahren nach Anspruch 28, wobei das 4-(4-Hydroxystyryl)pyridin enthaltende Substrat detektierbar markiert ist und die Struktur hat:
    Figure 00140003
    worin R1, R2, R3 und R4 unabhängig H oder -X-L sind, R5 ist ein Elektronenpaar oder -X-L, X ist eine Linker-Gruppe, die zum Binden von L an einen 4-(4-Hydroxystyryl)pyridin-Teil in der Lage ist, L ist ein detektierbarer Marker, A ist N oder N+, und worin, wenn R1, R2, R3 und R4 H sind, R5 -X-L ist und A N+ ist, und worin, wenn eines der R1 bis R4 -X-L ist, A N ist.
  30. Verfahren nach Anspruch 28, wobei das 4-(4-Hydroxystyryl)pyridin-enthaltende Substrat die Struktur hat:
    Figure 00150001
    worin R1, R2, R3 und R4 H oder Z sind, R5 ist ein Elektronenpaar oder Z, Z ist ein lineares Alkyl, ein verzweigtes Alkyl, ein substituiertes Alkyl, Heteroalkyl oder substituiertes Heteroalkyl, wobei das Heteroatom ausgewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus N, O oder S; A ist N oder N+, und wobei, wenn R1, R2, R3 und R4 H sind, R5 Z ist und A N+ ist, und wobei, wenn eines der R1 bis R4 Z ist, A N ist.
  31. Verfahren nach Anspruch 30, wobei das 4-(4-Hydroxystyryl)pyridin enthaltende Substrat ausgewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus:
    Figure 00150002
  32. Kit zum Ausführen eines Assays auf Basis einer Peroxidase, wobei das Kit aufweist: ein Peroxidase-Enzym und ein Substrat, aufweisend eine 4-(4-Hydroxystyryl)pyridin-Verbindung mit der Formel:
    Figure 00160001
    worin R1, R2, R3 und R4 unabhängig H oder -X-L sind, R5 ist ein Elektronenpaar, Z oder X-L, wobei Z ein lineares Alkyl ist, ein verzweigtes Alkyl, ein substituiertes Alkyl, Heteroalkyl oder substituiertes Heteroalkyl, wobei das Heteroatom ausgewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus N, O oder S, X ist eine Linker-Gruppe, die zum Binden von L an einen 4-(4-Hydroxystyryl)pyridin-Teil in der Lage ist, L ist ein detektierbarer Marker, A ist N oder N+, und worin R1, R2, R3 und R4 H sind, R5 ist Z oder X-L und A ist N+, und worin, wenn eines von R1 bis R4 Z oder X-L ist, A N ist.
  33. Kit nach Anspruch 32, wobei das Peroxidase-Enzym Meerrettichperoxidase ist.
  34. Kit nach Anspruch 32, wobei die 4-(4-Hydroxystyryl)pyridin enthaltende Verbindung ausgewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus:
    Figure 00160002
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