DE69936284T2

DE69936284T2 - Vereinfachter sequenzieller chemilumineszenz-nachweis

Info

Publication number: DE69936284T2
Application number: DE69936284T
Authority: DE
Inventors: Hashem Howell AKHAVAN-TAFTI
Original assignee: Lumigen Inc
Current assignee: Lumigen Inc
Priority date: 1998-04-22
Filing date: 1999-04-16
Publication date: 2008-03-06
Anticipated expiration: 2019-04-17
Also published as: WO1999054503B1; CA2294436C; EP1015641A4; US6068979A; AU747976B2; ATE364719T1; AU3546299A; JP2002511770A; DE69936284D1; AU747976C; CA2294436A1; EP1015641A1; WO1999054503A1; JP4156677B2; EP1015641B1

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zum sequentiellen Chemilumineszenznachweis von zwei Analyten in einem Testsystem. Insbesondere betrifft die Erfindung zwei Verfahren, in denen die Analyten mit zwei verschiedenen Enzymen markiert werden, insbesondere wenn eines der Enzyme eine Peroxidase ist. Die Verfahren werden vorzugsweise zur Analyse von Analyten auf einer Festphase, wie z.B. einer Blotting-Membran, durchgeführt. Die Erfindung stellt Verfahren zum Nachweisen mehrerer Analyten auf einer Festphase bereit, die den Bedarf ausschließen, dass Blots abgestreift und erneut mit Sonden versehen werden müssen. Die erfindungsgemäßen Verfahren sind zum Nachweisen von mehreren DNA-Markierungen oder Sonden auf einem einzelnen Southern-Blot, für das forensische Erstellen eines DNA-Fingerabdrucks, bei dem mehrere Sonden verwendet werden, für eine Multiplex-DNA-Sequenzierung von mehr als einem Templat, für den Nachweis von Genumlagerungen, -mutationen und einer Genverknüpfung, von mehreren Proteinen in Western-Blots und für andere bekannte Tests geeignet.
Für den Chemilumineszenznachweis von Analyten, wie z.B. DNA, RNA, Proteinen, Antikörpern, Antigenen, Haptenen, Arzneistoffen, Hormonen, infektiösen Mitteln und dergleichen sind zahlreiche Verfahren bekannt. Ein Chemilumineszenznachweis kann durch Markieren von Analyten oder Molekülen, die spezifisch an einen Analyten binden, mit einer Verbindung, die dazu gebracht werden kann, dass sie eine Chemilumineszenzreaktion eingeht, durchgeführt werden (Direktmarkierung). Ein Chemilumineszenznachweis kann durch Markieren von Analyten oder Analyt-bindenden Verbindungen mit einem Enzym oder einem entsprechenden Katalysator durchgeführt werden, das bzw. der die Chemilumineszenzreaktion einer zugesetzten Verbindung katalysiert (Enzymmarkierung). Die Popularität dieser Nachweisverfahren beruht zum Teil auf dem Empfindlichkeitsniveau und dem breiten Bereich von Messungen, der möglich ist. Andere vorteilhafte Eigenschaften umfassen die Sicherheit, da keine Radioisotopen erforderlich sind, die Vielseitigkeit bei den Markierungsverfahren und die Auswahl von Nachweisvorrichtungen. Darüber hinaus werden in einem gebräuchlich verwendeten Format Sonden mit verschiedenen Haptenen, wie z.B. Biotin, Fluorescein und Digoxigenin, markiert. Diese Haptene wiederum werden dann mit ihren entsprechenden Liganden oder Antikörpern gebunden, die mit einem Enzym, wie z.B. Meerrettich-Peroxidase (HRP) oder alkalischer Phosphatase (AP), konjugiert sind. Die markierten Enzyme werden mit ihren jeweiligen chemilumineszierenden Substraten nachgewiesen.
Es ist häufig bevorzugt, mehr als einen Analyten gleichzeitig in einem einzelnen Testsystem nachzuweisen und/oder zu quantifizieren. Dadurch kann eine Einsparung von Zeit, Reagenzien und Materialien realisiert werden und Testvorschriften können vereinfacht werden. In manchen Fällen sind Informationen von mehreren Tests erforderlich, z.B. in bestimmten medizinischen diagnostischen Verfahren, bei denen die Ergebnisse von zwei oder mehr Tests in einer Kombination analysiert werden müssen, um Schlussfolgerungen zu ziehen. Ein Beispiel für eine Technik, die das Testen im Hinblick auf mehrere Analyten erfordert, ist die Erstellung eines genetischen Fingerabdrucks von DNA-Proben für forensische Tests, Tests zur Identifizierung von Menschen oder Vaterschaftstests durch eine Restriktionsfragmentlängenpolymorphismus-Analyse (RFLP-Analyse) von Southern-geblotteter DNA. Bei dieser Technik erfordern Blots ein Versehen mit mehreren Sonden und häufig erfordert die begrenzte DNA-Menge, dass der gleiche Blot einem mehrfachen Abstreifen und erneutem Versehen mit Sonden unterzogen wird (D.E. Adams, Crime Lab Digest 15, 106–108 (1988); K. Noppinger, G. Duncan, D. Ferraro, S. Watson und J. Ban, BioTechniques 13, 572–575 (1992)). Bei einer Northern-Blot-Analyse wird die Expression eines spezifischen Gens auf dem Messenger-RNA-Niveau (mRNA-Niveau) gemessen und das Signal wird dadurch, dass der Blot für mRNA's, wie z.B. mit α-Tubulin oder β-Actin, die in der Zelle normalerweise invariant sind, erneut mit Sonden versehen wird. In einem Western-Blot von mehreren Protein-Antigenen werden die in einem Schritt hybridisierten Antikörper abgestreift und in einem zusätzlichen Schritt mit einem anderen Satz von Antikörpern erneut mit Sonden versehen, so dass Daten für ein anderes Protein erhalten werden.
Das Abstreifen und erneute Versehen mit Sonden kann zu einem Verlust an Membrangebundenen Zielnukleinsäuren (K. Noppinger, G. Duncan, D. Ferraro, S. Watson und J. Ban, BioTechniques 13, 572–575 (1992)) und Proteinen (S. Krajewski, J.M. Zapata und J.C. Reed, Anal. Biochem. 236, 221–228 (1996)) führen, wodurch die Nachweisempfindlichkeit in dem zweiten Schritt und nachfolgenden Schritten zum Versehen mit Sonden vermindert wird. Ein Verfahren, das den Nachweis und die Differenzierung von mehr als einem Analyten in einem Testsystem erlaubt, würde die vorstehend genannten Nachteile vermeiden. Die vorliegende Erfindung beschreibt ein Chemilumineszenznachweisverfahren, das eine Lösung für dieses Problem durch Erreichen des sequentiellen Nachweises von zwei verschiedenen Zielanalyten auf einem einzelnen Blot und Ausschließen des Schritts des Abstreifens und erneuten Versehens mit einer Sonde erreicht.
In der PCT-Anmeldung WO 97/24460 ist ein Verfahren für mehrfachchemilumineszente Reportergentests beschrieben. Diese Tests werden in Lösungen durchgeführt, um die Gegenwart oder die Menge von zwei oder mehr Enzymen nachzuweisen, die von einem Reporter gen in einer transfizierten Zelle exprimiert werden. Die Verwendung eines Peroxidaseenzyms ist nicht beschrieben, da es sich nicht um ein gebräuchlich verwendetes Reporterenzym in Transfektionsexperimenten handelt.
Ein Verfahren zur Verwendung von zwei oder mehr enzymatisch auslösbaren Dioxetanen zur gleichzeitigen Erzeugung von Licht mit verschiedenen Wellenlängen ist in US 4,931,223 beschrieben. Die Lichtemission wird von zwei oder mehr verschiedenen Enzymmarkierungen ausgelöst. Da alle Lichtemissionsreaktionen gleichzeitig ablaufen, ist ein Mittel zur optischen Unterscheidung der verschiedenen Signale erforderlich, wodurch die Komplexität erhöht wird. Ein weiterer Nachteil dieses Ansatzes ist die Schwierigkeit, mehrere verschiedene Fluorophore zu finden, deren Emissionsspektren nicht zu einem gewissen Grad überlappen. Wenn dies stattfindet, wird das Signal von einer Markierung partiell in dem Wellenlängenbereich des Signals von einer anderen Markierung nachgewiesen. Daraus resultieren eine verminderte Messgenauigkeit- und präzision.
Das US-Patent 5,656,207 beschreibt duale Chemilumineszenztests von zwei verschiedenen Analyten in einer Lösung, bei denen die Analyten oder deren Bindungspartner direkt mit chemilumineszenten Verbindungen markiert sind. Die zwei Signale werden gleichzeitig erzeugt und kinetisch oder spektroskopisch unterschieden. Enzymmarkierungen sind nicht beteiligt und es ist kein Mechanismus zum Stoppen oder Steuern jeder Reaktion beschrieben.
Das US-Patent 5,672,475 beschreibt ebenfalls duale Lumineszenzbindungstests unter Verwendung von zwei verschiedenen Chemilumineszenzdirektmarkierungen in einer Lösung. Die zwei Chemilumineszenzsignale, eines von einem Luminolderivat und das andere von einer Acridiniumesterverbindung, werden separat durch eine Änderung der pH-Verfahrensbedingungen erzeugt. Enzymmarkierungen sind nicht beteiligt. Es findet ein Schritt des Behandelns der Lösung mit Salpetersäure statt, der das Verfahren zum Nachweisen von Analyten auf einer Blotting-Membran ungeeignet machen würde.
Ein radioaktives Verfahren zum sequentiellen Nachweis von geblotteter DNA und von geblotteten Proteinen wurde in der Literatur beschrieben. Durch ihr Signal unterscheidbare Sonden, die mit ³²P, ³⁵S und Digoxigenin markiert sind, wurden durch gleichzeitige Hybridisierungen und für eine differentielle oder sequentielle Autoradiographie verwendet (L.C. Au, K.J. Chang, C.M. Shih und G.W. Teh, BioTechniques 16, 680–683 (1994)). Dabei beruhte die Signaldifferenzierung jedoch auf der Intensität des Signals und nicht auf den qualitativen Signaldifferenzen wie in den vorliegenden Verfahren.
Ein Verfahren für den sequentiellen Chemilumineszenznachweis mehrerer Antigene auf Western-Blots mit dem verbesserten Luminol-HRP-Chemilumineszenzsubstrat bei jedem Schritt wurde beschrieben (S. Krajewski, J.M. Zapata und J.C. Reed, Anal. Biochem. 236, 221–228 (1996)). Während dieses Verfahren mehrere Analyten auf einem Blot sequentiell nachweisen kann, ist es bezüglich der Durchführung komplexer als die vorliegenden Verfahren. Der Antigen-Antikörper-HRP-Komplex in jedem Nachweisschritt wird durch Chemilumineszenz nachgewiesen und dann durch Umsetzen mit einem chromogenen Substrat, das ein gefärbtes Produkt auf der Bande abscheidet, unreaktiv gemacht. Obwohl dieses Verfahren das Vermögen zum sequentiellen Nachweis mehrerer Antigene aufweist, ist es mühsamer und arbeitsintensiver als die vorliegenden Verfahren, da der Blot mit primären und sekundären Antikörpern für jeden Nachweisschritt erneut mit Sonden versehen werden muss. Darüber hinaus erfordert jeder Schritt die Anwendung von zwei Nachweisreagenzien, um die Gegenwart eines Analyten zu zeigen.
Es sind mehrere Substanzen bekannt, welche die Peroxidaseaktivität hemmen oder zerstören. Beispiele dafür sind Wasserstoffperoxid bei hohen Konzentrationen, Imidazol, Phenylhydrazin (W. Straus, J. Histochem. Cytochem. 28(7), 645–652 (1980)), Fluorid- und Cyanidionen (P. Tulkens, R. Wattiaux, Experientia 24(3), 219–223 (1968)). Eine Liste verschiedener Hemmstoffe ist in einer Veröffentlichung von Pierce Chemical Co., Rockford, IL beschrieben (Katalog 1994–95, Seiten T-315, 316). Das US-Patent 4,810,630 beschreibt die Verwendung eines nichtionischen grenzflächenaktiven Mittels zum Hemmen der endogenen Peroxidaseaktivität von Vollblut in Immuntests unter Verwendung von Meerrettich-Peroxidase-Konjugaten mit kolorimetrischem Nachweis.
Es ist eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung, ein Verfahren für den sequentiellen Chemilumineszenznachweis von zwei Analyten in einem Testsystem bereitzustellen. Es ist eine weitere Aufgabe der vorliegenden Erfindung, ein Verfahren bereitzustellen, in dem die Analyten mit zwei verschiedenen Enzymen markiert werden, insbesondere wenn eines der Enzyme eine Peroxidase ist. Es ist eine weitere Aufgabe der vorliegenden Erfindung, ein Verfahren bereitzustellen, in dem zwei chemilumineszente Nachweisreagenzien sequentiell mit den zwei Enzym-markierten Analyten in Kontakt gebracht werden. Es ist eine weitere Aufgabe, ein Paar von Nachweisreagenzien zur Verwendung in solchen Verfahren bereitzustellen, wobei das erste Nachweisreagenz eine Chemilumineszenz durch Reagieren mit der Peroxidase erzeugt und das zweite Reagenz die Lichterzeugung von der Reaktion der Peroxidase mit dem ersten Reagenz stoppt und die Chemilumineszenz von dem zweiten Markierungsenzym initiiert. Es ist eine weitere Aufgabe, ein Verfahren zur Analyse von zwei Analyten auf einer Festphase, wie z.B. einer Blotting-Membran, bereitzustellen. Es ist eine weitere Aufga be, ein Verfahren zur Analyse von zwei Analyten auf einer Blotting-Membran bereitzustellen, das den Bedarf, Blots abzustreifen und erneut mit Sonden zu versehen, ausschließt. Die erfindungsgemäßen Verfahren sind zum Nachweisen von mehreren DNA-Markierungen oder -Sonden auf einem einzelnen Southern-Blot, für das forensische Erstellen eines DNA-Fingerabdrucks, bei dem mehrere Sonden verwendet werden, für ein Multiplex-DNA-Sequenzieren, für den Nachweis von Genumlagerungen, -mutationen und einer Genverknüpfung, für den Nachweis von mehreren Proteinen in Western-Blots und für andere bekannte Tests geeignet.
1. Ethidiumbromid-gefärbtes Agarosegel (1 %), das Markierungs-DNA enthält. Spur 1: 300 ng biotinylierte, Hind III-abgebaute Lambda-DNA; Spur 2: 300 ng dig-markierte, EcoRI-abgebaute SPPI-Größenmarkierung-DNA; Spur 3: 100 ng biotinylierte, Hind III-abgebaute Lambda-DNA und 300 ng dig-markierte, EcoRI-abgebaute SPPI-Größenmarkierung-DNA.
2. Sequentieller Nachweis der geblotteten DNA-Größenmarkierungen, die in der 1 gezeigt sind. A: HRP-Substrat (LUMIGEN PS-3)-Nachweis von biotinylierter, Hind III-abgebauter Lambda-DNA; B: der gleiche Blot, der ferner mit einem AP-Substrat (PDR) für den Nachweis von Digoxigenin-markierter SPPI-DNA-Markierung behandelt worden ist; C: Überlagerungsbild der Banden in (A) und (B), um zu zeigen, dass die Bandenstruktur derjenigen des Ethidium-gefärbten Gels von 1 entspricht.
3. Schematisches Diagramm des sequentiellen Nachweises von CFTR-Genotypen mit HRP- und AP-Substraten.
4. Sequentieller Nachweis von CFTR-Genotypen. Southern-geblottete PCR-amplifizierte Sequenzen einer Region von Exon 10 des CFTR-Gens von jedem der drei Genotypen, N/N, N/ΔF₅₀₈ und ΔF₅₀₈/ΔF₅₀₈ wurden gleichzeitig mit einem Paar von markierten Oligonukleotiden hybridisiert, die für die normalen (Biotin-markierten) und/oder mutanten (Digoxigenin-markierten) Allele spezifisch sind, und dann mit Avidin-HRP- und Anti-Digoxigenin-AP-Konjugaten inkubiert. A: Nachweis durch eine HRP-erzeugte Chemilumineszenz der Genotypen, die das normale Allel enthalten; Spur 1: N/N, Spur 2: N/Δ; B: Nachweis des gleichen Blots durch eine AP-erzeugte Chemilumineszenz der Genotypen mit dem mutanten ΔF₅₀₈-Allel; Spur 2: N/Δ und Spur 3: Δ/Δ.
Definitionen
Bindungspaar – Zwei Moleküle oder Teile davon, die aufgrund einer nicht-kovalenten Mehrfachanziehung eine spezifische Bindungsaffinität füreinander aufweisen. Spezifische Bindungspaare sind bekannt und umfassen beispielsweise Antigen-Antikörper, Hapten-Antikörper, Antikörper-Antikörper, komplementäre Stränge von DNA, DNA-RNA-Duplexe, DNA-komplementäres Oligonukleotid, RNA-komplementäres Oligonukleotid, DNA-anti-DNA-Antikörper, DNA-DNA-bindendes Protein, Biotin-Avidin oder Streptavidin, Rezeptor-Ligand, Protein A-IgG und Lektin-Kohlenhydrat.
Chemilumineszentes Peroxidasesubstrat – Verbindungen, die in der Gegenwart einer Peroxidase und eines Peroxids einer Oxidationsreaktion unterliegen, die zur Erzeugung von sichtbarem Licht führt. Es sind mehrere chemilumineszente Peroxidasesubstrate bekannt, wie es in dem Artikel von Kricka beschrieben ist. Die am gebräuchlichsten verwendeten Peroxidasesubstrate umfassen Amino-substituierte Dihydrophthalazindione, wie z.B. Luminol, Isoluminol, N-Alkyl- und N,N-Dialkylaminoderivate von Luminol und Isoluminol, 5-Amino-6,7,8-trimethoxydihydrophthal-azindion und die Benzo-anellierten Homologen, wie z.B. 7-Dimethylaminonapthalazindion. Andere chemilumineszente Peroxidasesubstrate umfassen die Pyridazinochinoxalinone, wie sie in dem US-Patent Nr. 5,324,835 beschrieben sind. Weitere chemilumineszente Peroxidasesubstrate umfassen die Hydroxy-substituierten Dihydrophthalazindione, wie z.B. 5-Hydroxy- und 6-Hydroxyphthalazindione und das Hydroxynaphthalazindion, das in US 5,552,298 des vorliegenden Anmelders beschrieben ist, und eine Klasse von N-Alkylacridan-9-carboxylat-Derivaten, einschließlich Ester, Thioester und Sulfonimide, wie sie in den US-Patenten 5,491,072 , 5,523,212 und 5,593,845 des vorliegenden Anmelders beschrieben ist.
Verstärker – Eine Substanz, welche die oxidative oder peroxidative Funktion eines Peroxidaseenzyms fördert oder verlängert. Die wirksamsten Verstärker sind bestimmte aromatische Amine und Phenole. Phenolische Verbindungen, von denen bekannt ist, dass sie Peroxidasereaktionen verstärken, sind in G. Thorpe, L. Kricka in Bioluminescence and Chemiluminescence, New Perspectives, J. Scholmerich et al., Hrsg., Seiten 199–208 (1987), M. Ii, H. Yoshida, Y. Aramaki, H. Masuya, T. Hada, M. Terada, M. Hatanaka, Y. Ichimori, Biochem. Biophys. Res. Comm., 193(2), 540-5 (1993) und in den US-Patenten Nr. 5,171,668 und 5,206,149 beschrieben. Bevorzugte Verstärker werden aus der Gruppe, bestehend aus substituierten Phenolen, unsubstituierten und substituierten Naphtholen, einschließlich unter anderem: p-Phenylphenol, p-Iodphenol, p-Bromphenol, p-Chlorphenol, 2,4-Dichlorphenol, p-Imidazolylphenol, p-Thiazolylphenol, p-Hydroxyacetanilid, p-Hydroxyzimtsäure, (p-Cyanomethylthio)phenol und ringhalogenierte Derivate davon, Phenolindophenol, 2- Naphthol, 6-Brom-2-naphthol, 6-Hydroxybenzothiazol, 2-Cyano-6-hydroxybenzothiazol, Glühwürmchen-Luziferin und Dehydroluziferin, ausgewählt.
Enzymmarkierung – Ein funktionelles Enyzm, das mit einem Element eines spezifischen Bindungspaars assoziiert ist. Das Enzym kann kovalent mit dem spezifischen Bindungspartner verknüpft sein, wie z.B. ein Enzym-Antikörper-Konjugat oder ein Enzym-Oligonukleotid-Konjugat. Das Enzym kann mit dem spezifischen Bindungspartner oder dem Ziel durch die Verwendung eines spezifischen Hilfsbindungspartners, mit dem das Enzym kovalent verknüpft wird, indirekt verknüpft oder assoziiert werden. Ein Beispiel für die letztgenannte Beziehung wäre die Verwendung einer Biotin-markierten Oligonukleotidsonde für eine bestimmte DNA-Sequenz, die mit einem Enzym-Avidin-Konjugat assoziiert ist.
Genetische Erkrankung – Pathologischer Zustand, der durch einen genetischen Defekt, wie z.B. eine Mutation oder eine Reihe von Mutationen, verursacht wird. Die Mutation kann eine Punktmutation, eine Einzelbasensubstitution, eine Deletion, eine Insertion, eine Verdoppelung oder eine Transposition von Basen oder eine Kombination davon sein. Abhängig von dem Ort oder der Position und dem Typ der Mutation kann das mutante Gen exprimiert werden oder nicht, und wenn es exprimiert wird, kann es zur Erzeugung verkürzter oder nicht-funktioneller Proteinprodukte oder von Proteinen mit veränderter Aminosäuresequenz führen. Bestimmte genetische Mutationen sind rezessiv, wodurch beide mutanten Allele oder Kopien des Gens auf den homologen Chromosomen vorliegen müssen, um Krankheitssymptome auftreten zu lassen. Andere genetische Mutationen sind dominant, wodurch nur eine Kopie des Gens die Mutation aufweisen muss, um Krankheitssymptome auftreten zu lassen. Individuen mit einer Kopie des rezessiv-mutanten Gens sind Träger ohne jedwede Krankheit, können jedoch eine Kopie des mutanten Gens auf die Nachkommen übertragen.
Heteroalkyl – Eine verzweigtkettige, geradkettige oder Cycloalkylgruppe, in der mindestens ein nicht-endständiges Kohlenstoffatom durch ein nicht-Kohlenstoff-Heteroatom, wie z.B. B, N, O, S, P, Si, Se oder Te, ersetzt ist. Das Heteroatom muss mindestens zweiwertig sein.
Hydrolytisches Enzym – Dabei handelt es sich um Enzyme, welche die hydrolytische Spaltung verschiedener Gruppen katalysieren. Repräsentative Mitglieder umfassen:
Esterasen, wie z.B. Carboxylesterase, Acetylcholinesterase, Butyrylcholinesterase und Cholinesterase,
Glycosidasen, wie z.B. Galactosidase, Glucosidase, Glucuronidase, Lactase und N-Acetylglucosaminidase,
Lipase, Phospholipase,
pflanzliche oder tierische Phosphatasen, einschließlich saure und alkalische Phosphatasen,
Proteaseenzyme, wie z.B. Chymotrypsin, Trypsin, Papain und Pepsin, und Sulfataseenzyme.
Peroxidaseenzym – Enzyme, die zur Klasse EC 1.11.1.7 gehören, einschließlich Meerrettich-Peroxidase, Cytochrom C-Peroxidase, Glutathion-Peroxidase, Mikroperoxidase, Myeloperoxidase, Lactoperoxidase, Arthromyces ramosus-Peroxidase (ARP) und Sojabohnen-Peroxidase.
Peroxid – Verbindungen, die als Quelle von Wasserstoffperoxid und als primäres Substrat der Peroxidase wirken. Beispiele für Peroxide umfassen Wasserstoffperoxid, Harnstoffperoxid und Perboratsalze, insbesondere Natriumperborat.
Probe – Materialien, auf welche die erfindungsgemäßen Verfahren angewandt werden, um einen Analyten nachzuweisen, und die menschliche und tierische Körperflüssigkeiten, wie z.B. Blut, Serum, Urin, Speichel, Auswurf, CSF, Samenflüssigkeit und Zelllysat, sowie Nahrungsmittelproben, Wasserproben, Pflanzenproben, mikrobiologische Proben und forensische Proben umfassen. Andere Arten von Proben, die für den Fachmann offensichtlich sind, sind vom Schutzbereich der Erfindung umfasst.
Fester Träger – Ein Testmedium, mit dem die Testverfahren der vorliegenden Erfindung durchgeführt werden können. Solche Träger umfassen Teststreifen, Blotting-Membranen, Filter, Glas- oder Plastikoberflächen, wie z.B. Mikroskopobjektträger und Deckgläschen, Mikrovertiefungen, Reagenzgläser, Kügelchen und dergleichen, die in dem Fachgebiet der Tests bekannt sind. Die Träger müssen das Zielspezies-spezifische Bindungsmittelpaar durch physikalische Adsorption oder kovalente Verknüpfung oder beides einfangen oder immobilisieren können.
Zielspezies – Molekül oder Teil davon, dessen Gegenwart geprüft wird. Zielspezies müssen mit einer Substanz binden können, mit der eine spezifische Bindungsaffinität vorliegt. In einer Ausführungsform wird die Zielspezies an zwei verschiedene spezifische Bindungspartner gebunden, von denen jeder eine spezifische Bindungsaffinität aufweist. Beispiele für Zielspezies umfassen Nukleinsäuren, wie z.B. ssDNA, dsDNA, RNA, Oligonukleotide, Proteine, Peptide, Antikörper, Antigene, Haptene, Zelloberflächenrezeptoren, Liganden, Hormone, Viren, Bakterien und dergleichen.
Testsystem – Umfasst einen festen Träger, auf dem die Analyten oder Zielspezies, die nachgewiesen werden sollen, immobilisiert sind. Das Testsystem wird an verschiedenen Punkten während einer Analyse oder eines Tests auch spezifische Bindungsmittel für die Zielspezies und Markierungsenzyme als Ergebnis der Durchführung des Testverfahrens enthalten.
Die vorliegende Erfindung betrifft Chemilumineszenzverfahren zum sequentiellen Nachweisen von zwei oder mehr Analyten in einem Testsystem unter Verwendung von zwei oder mehr Enzym-markierten Bindungspartnern und mindestens zwei Reagenzien, die jeweils ein chemilumineszentes Substrat für eines der Enzyme umfassen. Insbesondere wird die Auswahl des Paars von Enzymen und der Reagenzien so gestaltet, dass die Chemilumineszenz, die durch die Reaktion des ersten Enzyms und des ersten Substrats emittiert wird, mit einem Stop-Reagenz, wie z.B. einem Enzymhemmstoff, einfach gestoppt werden kann, und dass die Chemilumineszenz durch das zweite Enzym nach der Zugabe des zweiten Enzymsubstrats zu dem Testsystem erzeugt wird. In einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung wird das Stop-Reagenz in eine Zusammensetzung mit dem zweiten Enzymsubstrat einbezogen. Die vorliegenden Verfahren werden in vorteilhafter Weise auf den Nachweis von zwei oder mehr Analyten in einem Testsystem, z.B. auf eine Blotting-Membran, angewandt, da die zwei Nachweisreaktionen ohne jedwede Zwischenschritte oder Entfernung von Enzymen, Konjugaten oder Analyten durchgeführt werden können. Andere Vorteile bei der Durchführung werden weiter unten beschrieben.
Insbesondere betrifft die Erfindung ein Verfahren zum sequentiellen Nachweisen einer ersten und zweiten Zielspezies in einer Probe, welche unter Verdacht steht, die zwei Zielspezies zu enthalten, durch zwei sequentielle Chemilumineszenz-Reaktionen, umfassend:
das Immobilisieren der ersten und zweiten Zielspezies auf einem festen Träger,
das Inkontaktbringen der immobilisierten ersten und zweiten Zielspezies mit einem ersten spezifischen Bindungspartner für die erste Zielspezies und einem zweiten spezifischen Bindungspartner für die zweite Zielspezies, um dadurch ein erstes Bindungspaar und ein zweites Bindungspaar zu bilden,
das Bereitstellen eines Peroxidase-Enzyms als eine Markierung für den ersten Bindungspartner und das Bereitstellen eines zweiten Enzyms als eine Markierung für den zweiten Bindungspartner,
das Umsetzen des ersten Bindungspaars mit einem chemilumineszenten Peroxidase-Substrat und einer Peroxidverbindung, um ein erstes Chemilumineszenz-Signal zu erzeugen,
das Nachweisen der ersten Zielspezies durch Nachweisen des ersten Chemilumineszenz-Signals,
das Umsetzen der Peroxidase mit einem Stop-Reagenz, welches entweder ein Hemmstoff des Peroxidase-Enzyms oder ein Reagenz ist, welches das Peroxidase-Substrat zerstört oder nicht-lumineszent werden läßt, um das erste Chemilumineszenz-Signal zu stoppen,
das Umsetzen des zweiten Bindungspaares mit einem chemilumineszenten Substrat für das zweite Enzym, um ein zweites Chemilumineszenz-Signal zu erzeugen, und
das Nachweisen der zweiten Zielspezies durch Nachweisen des zweiten Chemilumineszenz-Signals.
Ferner betrifft die Erfindung ein Verfahren zum sequentiellen Nachweisen einer ersten und zweiten Zielspezies in einer Probe, welche unter Verdacht steht, die zwei Zielspezies zu enthalten, durch zwei sequentielle Chemilumineszenz-Reaktionen, umfassend:
das Immobilisieren der ersten und zweiten Zielspezies auf einem festen Träger,
das Inkontaktbringen der immobilisierten ersten und zweiten Zielspezies mit einem ersten spezifischen Bindungspartner für die erste Zielspezies und einem zweiten spezifischen Bindungspartner für die zweite Zielspezies, um dadurch ein erstes Bindungspaar und ein zweites Bindungspaar zu bilden,
das Bereitstellen eines Peroxidase-Enzyms als eine Markierung für den ersten Bindungspartner und das Bereitstellen eines zweiten Enzyms als eine Markierung für den zweiten Bindungspartner,
das Umsetzen des ersten Bindungspaares mit einem chemilumineszenten Peroxidase-Substrat und einer Peroxidverbindung, um ein erstes Chemilumineszenz-Signal zu erzeugen,
das Nachweisen der ersten Zielspezies durch Nachweisen des ersten Chemilumineszenz-Signals,
das Umsetzen des zweiten Bindungspaars mit einer Zusammensetzung, umfassend ein chemilumineszentes Substrat für das zweite Enzym und ein Stop-Reagenz, welches entweder ein Hemmstoff des Peroxidaseenzyms oder ein Reagenz ist, welches das Peroxidasesubstrat zerstört oder nicht-lumineszent werden lässt, um das erste Chemilumineszenz-Signal zu stoppen und ein zweites Chemilumineszenz-Signal zu erzeugen, und
das Nachweisen der zweiten Zielspezies durch Nachweisen des zweiten Chemilumineszenz-Signals.
Die Wirksamkeit der vorliegenden Verfahren beruht auf der Erfüllung mehrere Anforderungen bezüglich der Enzym/Reagenz-Paare. Die Chemilumineszenzreaktion der Peroxidase mit Peroxid und der chemilumineszenten Verbindung muss rasch gestoppt werden können. Dies wird am Besten sowohl durch Hemmen des Enzyms als auch durch Umwandeln von nicht-umgesetztem Substrat in eine nicht-lumineszente Form erreicht, obwohl die Durchführung von nur einem der beiden ebenfalls effektiv sein sollte.
Das Paar aus zweitem Reagenz/Enzym muss nicht nur ausreichend widerstandsfähig sein, um die Bedingungen zu überstehen, die zum Hemmen der Peroxidase und zum Zerstören des Peroxidasesubstrats ausgewählt worden sind, sondern auch selbst effizient eine Chemilumineszenz erzeugen können. Die Reagenzien und Bedingungen zum Stoppen der ersten enzymatischen, Licht-erzeugenden Reaktion darf auch die Intaktheit des Testsystems nicht beeinträchtigen. Die Reagenzien und Bedingungen dürfen biologische Analyten, die auf dem in dem Test verwendeten festen Träger immobilisiert sind, nicht verdrängen, denaturieren oder in sonstiger Weise verändern. Die physikalischen Eigenschaften des Trägers dürfen ebenfalls nicht nachteilig beeinflusst werden.
Die Auswahl von Peroxidaseenzymen als das erste Enzym beruht auf der einfachen Verfügbarkeit von Konjugaten und der einfachen Konjugatherstellung, der Verfügbarkeit von Substraten, dem schnellen katalytischen Umsatz und dem Vermögen zur Hemmung der Peroxidaseaktivität. Das bevorzugte Peroxidaseenzym ist Meerrettichperoxidase.
Das Substrat für das Peroxidaseenzym kann jedwede Verbindung sein, die kombiniert mit einem Peroxid eine Chemilumineszenz erzeugt, wenn sie mit der Peroxidase umgesetzt wird. Beispiele für chemilumineszente Peroxidasesubstrate umfassen Diacylhydrazide, einschließlich aminosubstituierte aromatische Diacylhydrazide, wie z.B. Luminol, und polycyclische aromatische Diacylhydrazide, wie sie in L.J. Kricka und G.H.G. Thorpe in Luminescence Immunoassay and Molecular Applications, K. Van Dyke und R. Van Dyke, Hrsg., CRC Press, Boca Raton, 1990, Seiten 77–98, zusammengefasst sind, hydroxysubstituierte aromatische Diacylhydrazide, die im US-Patent Nr. 5,552,298 beschrieben sind, heterocyclische Analoga von Luminol, wie z. B. (8-Amino-5-chlor-7-phenylpyrido[3,4-d-pyridazin-1,4(2H, 3H)dion (M. Ii et al., Biochem. Biophys. Res. Comm., 193(2), 540-5 (1993)), Pyridazinochinoxalinone ( US-Patent Nr. 5,324,835 ), 1,3-disubstituierte Pyrazolo[4',3':5',6']pyrido-[2,3-d]-pyrazindione (Y. Tominaga et al., Tetrahedron Lett., 36, 8641-4 (1995)) und Acridanverbindungen, wie sie in US 5,491,072 , US 5,523,212 , US 5,593,845 und 5,670,644 , und in der PCT-Anmeldung WO 98/02421 beschrieben sind. In einer bevorzugten Ausführungsform ist das Peroxidasesubstrat eine Acridanverbindung, mehr bevorzugt ein Acridan, das aus N-Alkylacridan-9-carboxylatderivaten mit der allgemeinen Formel
ausgewählt ist, worin R aus Alkyl-, Heteroalkyl- und Aralkylgruppen ausgewählt ist, worin R₁ bis R₈ unabhängig aus Gruppen ausgewählt sind, welche die Erzeugung von Licht erlauben, und benachbarte Paare von Gruppen R₁ bis R₈ verbunden sein können, so dass ein anellierter aromatischer Ring gebildet wird, und worin die Gruppe C(=O)Y eine Ester-, Thioester- oder Sulfonamidgruppe ist.
Es ist bevorzugt, dass das Peroxidasesubstrat schnell und vollständig durch einen einfachen chemischen Vorgang in eine nicht-lumineszierende Verbindung umgewandelt werden kann, um die Chemilumineszenzemission zu stoppen. Die Acridancarboxylatderivate sind besonders gut geeignet, da sie zu der entsprechenden Carbonsäure oder dem entsprechenden Carbonsäuresalz hydrolysiert werden können, die bzw. das keine Chemilumineszenz erzeugen kann. Eine Reaktion mit alkalischem Wasserstoffperoxid (^–OOH) kann die Acridancarboxylatderivate ebenfalls in die entsprechenden nicht-lumineszierenden Percarboxylatverbindungen umwandeln.
Das zweite Enzym ist vorzugsweise ein hydrolytisches Enzym, das vorzugsweise aus alkalischer Phosphatase, β-Galactosidase und Glucuronidase, mehr bevorzugt aus alkalischer Phosphatase ausgewählt ist. Die Eigenschaften von alkalischer Phosphatase, die für die vorliegenden Verfahren erwünscht sind, umfassen die leichte Verfügbarkeit von Konjugaten und die Einfachheit einer Konjugatherstellung, die Verfügbarkeit von Substraten, den schnellen katalytischen Umsatz und die Widerstandsfähigkeit gegen verschiedene Umgebungsbedingungen. In der vorliegenden Arbeit wurde z.B. festgestellt, dass die enzymatische Aktivität selbst in der Gegenwart relativ hoher Konzentrationen von alkalischem Wasserstoffperoxid bei pH 10 nicht nachteilig beeinflusst wird.
Das Substrat für das zweite Enzym ist vorzugsweise ein enzymatisch auslösbares Dioxetan. Bevorzugte Dioxetane haben die Formel:
worin A₁ und A₂ Gruppen sind, die dem Dioxetan eine Stabilität verleihen, A₃ aus geradkettigem, verzweigtkettigem oder Cycloalkyl, substituiertem Alkyl, Aryl- und substituierten Arylgruppen ausgewählt ist, A₄ eine aromatische Ringgruppe, vorzugsweise eine substituierte oder unsubstituierte Phenyl- oder Naphthylgruppe ist, OX ein Substituent an dem aromatischen Ring ist, der die Erzeugung einer Chemilumineszenz durch die Umsetzung mit einem Enzym auslöst, so dass die O-X-Bindung gespalten wird, um ein Oxyanion zu erzeugen, und wobei der OX-Substituent eine Position aufweist, die außerhalb der Konjugation mit dem Dioxetanring ist. Jedwedes Paar von Gruppen, die aus A₁, A₂, A₃ und A₄ ausgewählt sind, kann zusammen verbunden werden, um einen an den Dioxetanring anellierten Ring zu bilden. Geeignete Dioxetane dieses Typs sind bekannt und umfassen als Beispiele Dioxetane, die in den US-Patenten 4,857,652 , 4,952,707 , 5,068,339 , 5,112,960 , 5,132,204 , 5,220,005 , 5,248,618 , 5,578,253 , 5,607,625 , 5,631,167 , 5,652,345 , 5,679,803 und 5,707,559 , und in der PCT-Anmeldung WO 96/15122 beschrieben sind. In bevorzugten, enzymatisch auslösbaren Dioxetanen sind A₁ und A₂ jeweils verzweigtkettige Alkyl- oder Cycloalkylgruppen, die 3 bis 8 Kohlenstoffatome enthalten, oder sie sind als substituierte oder unsubstituierte Polycycloalkylgruppe mit 6 bis 10 Kohlenstoffatomen verbunden, A₃ ist eine unsubstituierte oder substituierte Alkylgruppe mit 1 bis 10 Kohlenstoffatomen, A₄ ist eine substituierte oder unsubstituierte Phenylgruppe und X ist aus einer PO₃ ^2–-Gruppe, einer Galactosidgruppe oder einer Glucuronidgruppe ausgewählt, wobei die PO₃ ^2–-Gruppe die am meisten bevorzugte Gruppe ist. Wenn A₁ und A₂ als Polycycloalkylgruppe miteinander verbunden sind, wie z.B. als Adamantyl-, Bicyclooctyl- oder Bicyclononylgrupe, wobei Adamantyl bevorzugt ist, kann sie unsubstituiert oder mit einer Gruppe substituiert sein, die aus Halogenen, insbesondere Chlor, Niederalkyl-, Alkoxyl-, Phenyl- oder Carboxylgruppen ausgewählt ist. Die Gruppe A₃ kann anstelle der vorhandenen Wasserstoffatome auch einen oder mehrere Substituenten enthalten. Repräsentative Gruppen umfassen z.B. Halogene, insbesondere Fluor und Chlor, und wasserlöslich machende Gruppen, wie z.B. Carboxylat-, Sulfonat-, Sulfat- oder quartäre Ammoniumgruppen. Die Gruppe A₄ kann anstelle der Wasserstoffatome an dem Ring auch einen oder mehrere Substituenten enthalten, vorzugsweise ein Chloratom oder eine Alkoxygruppe.
Das Peroxidasereagenz wird im Allgemeinen in einer wässrigen Pufferlösung mit der Peroxidquelle verwendet und kann Additive, wie z.B. grenzflächenaktive Mittel und phenolische oder andere bekannte Peroxidaseverstärker, die zur optimalen Leistung der Chemilumineszenzreaktion beitragen, organische Hilfslösungsmittel und Chelatisierungsmittel enthalten, um eine Störung durch zufällige Metallverunreinigungen zu verhindern. Bevorzugte Peroxidquellen sind Wasserstoffperoxid, Harnstoffperoxid und Perboratsalze. Beschreibungen bevorzugter Formulierungen und von deren Komponenten finden sich in den US-Patenten 5,491,072 , 5,523,212 und 5,593,845 des Anmelders.
Das Dioxetanreagenz für den Chemilumineszenznachweis des hydrolytischen Enzyms kann jedwedes einer Anzahl von stabilen, enzymatisch auslösbaren Dioxetanen sein, die bekannt sind. Der Fachmann kann aus den vielen, im Stand der Technik beschriebenen Dioxetanen, wie sie durch die zahlreichen, vorstehend zitierten Patente veranschaulicht werden, leicht ein geeignetes Dioxetan auswählen. Das Dioxetan muss eine Gruppe enthalten, die durch das spezielle, eingesetzte Enzym entfernt werden kann. Wenn das Enzym alkalische Phosphatase ist, ist ein bevorzugtes Dioxetan Lumigen PPD, das die nachstehend gezeigte Struktur hat.
Wenn das Enzym β-Galactosidase und Glucuronidase ist, wird das Dioxetan anstelle der Phosphatgruppe eine durch ein Sauerstoffatom an den aromatischen Ringsubstituenten des Dioxetans gebundene Galactosid- oder Glucuronidgruppe enthalten.
Das Nachweisreagenz für das zweite Enzym umfasst das Substrat für das zweite Enzym in einer wässrigen Pufferlösung und gegebenenfalls einen Peroxidasehemmstoff. Wenn der Peroxidasehemmstoff nicht verwendet wird, wird die Zusammensetzung des Reagenzes derart sein, dass die Anwendung dieses Reagenzes auf das Testsystem stattdessen das Peroxidasesubstrat zerstört oder nicht-lumineszent macht. Es ist bevorzugt, dass das Nachweisreagenz für das zweite Enzym sowohl eine Peroxidasehemmung als auch die Umwandlung des Peroxidasesubstrats in eine nicht-lumineszente Form erreicht. Ein bevorzugtes Nachweisreagenz wird durch Zugeben von einem oder mehreren Peroxidasehemmstoff(en) zu einem Reagenz hergestellt, das ein Phosphat-substituiertes Dioxetan enthält. Das Nachweisreagenz kann auch einen grenzflächenaktives Mittel-Verstärker enthalten, der das Signal/Hintergrund-Verhältnis der enzymatisch erzeugen Chemilumineszenz verbessert. Geeignete grenzflächenaktives Mittel-Verstärker sind bekannt und umfassen polymere Oniumsalze, einschließlich quartäre Phosphoniumsalze und Ammoniumsalze, monomere quartäre Phosphonium- und Ammoniumsalze, wie z. B. Cetyltrimethylammoniumbromid und dikationische grenzflächenaktive Mittel, wie z.B. diejenigen, die in US 5,451,347 des Anmelders beschrieben sind. Geeignete polymere quartäre Phosphoniumsalze sind in US 5,393,469 des Anmelders beschrieben. Geeignete polymere quartäre Ammoniumsalze sind in US 5,145,772 und 5,547,836 beschrieben. Ein bevorzugtes Nachweisreagenz umfasst: (1) Das käufliche Reagenz LUMI-PHOS PLUS (Lumigen, Southfield, MI), welches das Dioxetan LUMIGEN PPD in einer alkalischen Pufferlösung und einen Diphosphoniumsalzgrenzflächenaktives Mittel-Verstärker enthält, und (2) ein geeignetes Reagenz zum Stoppen der Peroxidase-katalysierten Chemilumineszenz.
Peroxidasehemmstoffe, die bei der Ausführung der vorliegenden Erfindung geeignet sind, umfassen diejenigen Verbindungen, die bekannt sind und vorstehend angegeben worden sind, und von denen bekannt ist, dass sie die Aktivität von Peroxidaseenzymen und insbesondere von Meerrettichperoxidase hemmen. Diese umfassen ohne Beschränkung: Wasserstoffperoxid allein oder in einer Kombination mit Azidion, Cyanidion, Fluoridion, Imidazol, Phenylhydrazin und Periodat. Wasserstoffperoxid ist am meisten bevorzugt. Es ist daher eine bevorzugte Ausführungsform, dass das Nachweisreagenz für das zweite Enzym LUMI-PHOS PLUS umfasst und ferner Wasserstoffperoxid enthält.
In einem anderen Aspekt betrifft die Erfindung ein Verfahren zum sequentiellen Nachweisen einer ersten und zweiten Zielspezies in einer Probe, welche unter Verdacht steht, die zwei Zielspezies zu enthalten, durch zwei sequentielle Chemilumineszenz-Reaktionen, umfassend:
das Immobilisieren der ersten und zweiten Zielspezies auf einem festen Träger,
das Inkontaktbringen der immobilisierten ersten und zweiten Zielspezies mit einem ersten spezifischen Bindungspartner für die erste Zielspezies und einem zweiten spezifischen Bindungspartner für die zweite Zielspezies, um dadurch ein erstes Bindungspaar und ein zweites Bindungspaar zu bilden,
das Bereitstellen eines Peroxidase-Enzyms als eine Markierung für den ersten Bindungspartner und das Bereitstellen von alkalischer Phosphatase als eine Markierung für den zweiten Bindungspartner,
das Umsetzen des ersten Bindungspaares mit einem Acridancarbonsäurederivat und einer Peroxidverbindung, um ein erstes Chemilumineszenz-Signal zu erzeugen,
das Nachweisen der ersten Zielspezies durch Nachweisen des ersten Chemilumineszenz-Signals,
das Umsetzen der Peroxidase mit einem Peroxidasehemmstoff, um das erste Chemilumineszenz-Signal zu stoppen,
das Umsetzen des zweiten Bindungspaares mit einem Phosphat-substituierten Dioxetan, um ein zweites Chemilumineszenz-Signal zu erzeugen, und
das Nachweisen der zweiten Zielspezies durch Nachweisen des zweiten Chemilumineszenz-Signals.
In einem weiteren Aspekt betrifft die Erfindung ein Verfahren zum sequentiellen Nachweisen einer ersten und zweiten Zielspezies, umfassend:
das Immobilisieren der ersten und zweiten Zielspezies auf einem festen Träger,
das Inkontaktbringen der immobilisierten Zielspezies mit einem ersten spezifischen Bindungspartner für die erste Zielspezies und einem zweiten spezifischen Bindungspartner für die zweite Zielspezies, um dadurch ein erstes Bindungspaar und ein zweites Bindungspaar zu bilden,
das Bereitstellen eines Peroxidase-Enzyms als eine Markierung für den ersten Bindungspartner und das Bereitstellen von alkalischer Phosphatase als eine Markierung für den zweiten Bindungspartner,
das Umsetzen des ersten Bindungspaares mit einem Acridancarbonsäurederivat und einer Peroxidverbindung, um ein erstes Chemilumineszenz-Signal zu erzeugen,
das Nachweisen der ersten Zielspezies durch Nachweisen des ersten Chemilumineszenz-Signals,
das Umsetzen der Peroxidase mit einem Peroxidasehemmstoff, um das erste Chemilumineszenz-Signal zu stoppen,
das Umsetzen des zweiten Bindungspaares mit einer Zusammensetzung, die ein Phosphatsubstituiertes Dioxetan und einen Hemmstoff des Peroxidaseenzymes umfasst, um das erste Chemilumineszenz-Signal zu stoppen und ein zweites Chemilumineszenz-Signal zu erzeugen, und
das Nachweisen der zweiten Zielspezies durch Nachweisen des zweiten Chemilumineszenz-Signals.
Die vorliegenden Verfahren erfordern die Gestaltung eines Paars von Enzymnachweisreagenzien, die den Nachweis und die Quantifizierung ihrer entsprechenden Enzyme rasch, empfindlich und spezifisch ermöglichen, ohne dass ein Signal von dem anderen Enzym auftritt. Ein besonders wirksames erstes Enzym-Substrat-Paar ist HRP und LUMIGEN PS-3. Der schnelle und hochempfindliche Chemilumineszenz-Nachweis von HRP-Konjugaten in Blotting-Anwendungen unter Verwendung dieses Reagenzes ist in H. Akhavan-Tafti, R. DeSilva, Z. Arghavani, K. Sugioka, Y. Sugioka und A.P. Schaap, 1994, Seiten 313–316, in A. Campbell, L. Kricka, P. Stanley (Hrsg.), Bioluminescence and Chemiluminescence Fundamentals and Applied Aspects, J. Wiley and Sons, Chichester, beschrieben. Wir haben gefunden, dass die Reaktion von HRP mit LUMIGEN PS-3 durch einen fünffachen Effekt durch Inkontaktbringen des leuchtenden Blots mit einem Puffer mit hohem pH-Wert, der eine hohe Konzentration an Peroxid enthält, schnell gestoppt werden kann. Der alkalische Puffer (pH ≥ 9,5) vermindert die Peroxidaseaktivität signifikant, während hohe Konzentrationen von Peroxid HRP in eine katalytisch inaktive Form, die HRP-Verbindung III, umwandeln (A. Lundin und L. Hallander, 1987, Seiten 555–558, in Bioluminescence and Chemiluminescence New Perspectives, J. Schölmerich, R. Andreesen, A. Kapp, M. Ernst und W.G. Woods (Hrsg.), J. Wiley and Sons, Chichester). Ferner kann der Puffer mit hohem pH-Wert die Estergruppe des HRP-Substrats 2,3,6-Trifluorphenyl-10-methylacridin-9-carboxylat in ein nicht-lumineszentes Carboxylatsalz umwandeln.
Alkalisches Wasserstoffperoxid kann ebenfalls die Estergruppe des HRP-Substrats in ein Percarboxylatanion umwandeln, das unter den Reaktionsbedingungen keine Chemilumineszenz erzeugen kann.
Das Inkontaktbringen des HRP-Substrats mit einer stark alkalischen Lösung beschleunigt auch dessen Chemilumineszenz-Autoxidation durch Addition von O₂ an die kleine Menge an Carbanion, die an der 9-Position des Rings gebildet wird (F. McCapra, Accts. Chem. Res., 9(6), 201-8 (1976)). Die Kombination dieser fünf Effekte ermöglicht die schnelle und vollständige Beseitigung der Lichtemission.
Eine besonders wirksame zweites Enzym-Substrat-Kombination ist alkalische Phosphatase mit LUMI-PHOS PLUS (Lumigen, Inc.). Das letztgenannte Reagenz hat sich als widerstandsfähiges Reagenz zur Verwendung in ultraempfindlichen Blotting-Anwendungen erwiesen (B. Budowle, F.S. Baechtel, C.T. Comey, A.M. Giusti und L. Klevan, Electrophoresis, 16, 1559–1567 (1995)). Die Modifizierung von LUMI-PHOS PLUS durch die Zugabe von H₂O₂ stellte ein stabiles Reagenz bereit, das dessen Nutzen für den Chemilumineszenznachweis von alkalischer Phosphatase beibehält. Das Einbeziehen von bis zu mindestens 0,15 % (v/v) Peroxid in Lumi-Phos Plus hatte keinen nachteiligen Effekt auf dessen Leistung bezüglich der Erzeugung einer Chemilumineszenz oder der Zerstörung der Aktivität von alkalischer Phosphatase. Es ist von Bedeutung, dass das zugesetzte Peroxid und der relativ hohe pH-Wert dieses Reagenzes dessen Verwendung beim Stoppen der vorstehend genannten ersten Chemilumineszenzreaktion ermöglicht.
In einer zusätzlichen Ausführungsform der vorliegenden Verfahren kann nach dem Nachweis der gebundenen Peroxidasemarkierung, jedoch vor dem Benetzen des festen Trägers mit dem Phosphatasenachweisreagenz, ein kurzer Zwischenwaschschritt mit einem alkalischen Puffer (pH > 9, vorzugsweise ≥ 9,5) eingesetzt werden. Der Zwischenwaschpuffer kann gegebenenfalls den Peroxidasehemmstoff enthalten. Der Ablauf kann durch Verlängern der Inkubationszeit der Membran in dem zweiten Nachweisreagenz auf ≥ 15 min vereinfacht und der zusätzliche Vorgang kann vermieden werden, da das Phosphatase-Nachweisreagenz LUMI-PHOS PLUS bei einem hohen pH-Wert (9,6) formuliert worden ist, so dass eine Hydrolyse des Peroxidasesubstrats verursacht wird. Für die Zusammensetzung, die das Chemilumineszenzsubstrat für das zweite Enzym enthält, kann es auch vorteilhaft sein, einen höheren pH-Wert aufzuweisen, wie z.B. etwa 10, um die Zeit, die zum Stoppen der Peroxidasekatalysierten Chemilumineszenz erforderlich ist, weiter zu vermindern.
Bei den meisten Arten von Anwendungen auf der Basis einer Blotting-Technik gibt es einen Bedarf dahingehend, die maximale Information mit der minimalen Probenmenge, der minimalen Zeit und dem minimalen Aufwand zu erhalten. Obwohl ein Abstreifen und erneutes Versehen mit Sonde dieses Ziel in einem gewissen Ausmaß erreichen, sind sie mühsam und aufgrund des Verlusts an membrangebundener Templat-DNA während des Abstreifens kann das Signal vermindert werden, was kontraproduktiv ist. Es wird geschätzt, dass während jedes Schritts des Abstreifens abhängig von dem Verfahren der Sondenentfernung bis zu 20 ng an membrangebundener Ziel-DNA verloren gehen. Der Materialverlust und die Zeit und der Aufwand für das Abstreifen und das erneute Versehen mit Sonden werden durch die vorliegenden Verfahren vermindert, bei denen die Blots gleichzeitig mit zwei unterschiedlich markierten Sonden hybridisiert und sequentiell mit zwei unterschiedlichen Enzymsubstraten nachgewiesen werden. Das vorliegende Verfahren ist daher für den sequentiellen Chemilumineszenznachweis von zwei unterschiedlich markierten DNA-Größenmarkierungen auf einem einzelnen Blot vorteilhaft. Beispielsweise können die vorliegenden Verfahren eingesetzt werden, um auf einem einzelnen Southern-Blot die CFTR-Genotypen sequentiell nachzuweisen, welche die ΔF₅₀₈-Mutation aufweisen.
Ein Test zum Nachweisen von zwei Nukleinsäureanalyten, der gemäß den Verfahren der vorliegenden Erfindung durchgeführt wird, umfasst das gleichzeitige Hybridisieren von zwei unterschiedlich markierten Sonden, das Binden der zwei Markierungen mit ihren entsprechenden Liganden oder Antikörpern, wobei eine mit einer Peroxidase und die andere mit einem zweiten, unterschiedlichen Enzym konjugiert ist, und das sequentielle Nachweisen der zwei Markierungsenzyme durch sequentielles Anwenden von zwei Chemilumineszenzsubstraten. Das erste Reagenz enthält ein Peroxidasesubstrat, das die Gegenwart der Per oxidase-markierten Banden signalisiert. Das zweite Reagenz enthält ein Substrat zum Signalisieren der Gegenwart der Banden, die mit dem zweiten Enzym markiert sind, und enthält ferner Komponenten, die eine fortgesetzte Lichtemission von der Peroxidase-katalysierten Reaktion verhindern. Der vorstehend genannte Test zum Nachweisen der CFTR-Genotypen, welche die ΔF₅₀₈-Mutation aufweisen, auf einem einzelnen Southern-Blot wird unter Verwendung von zwei unterschiedlich markierten Sonden durchgeführt, wobei eine spezifisch die normale Sequenz bindet, während die andere spezifisch die mutante Sequenz bindet.
Es gibt zahlreiche andere Anwendungen, bei denen der sequentielle Nachweis von zwei verschiedenen Nukleinsäureanalyten auf einem einzelnen Blot eingesetzt werden kann. Diese umfassen eine RFLP-Analyse durch Southern-Blotting, wie sie in forensischen Anwendungen eingesetzt wird, Genexpressionsanalysen durch Northern-, Western-, Southwestern-Blotting, eine in situ-Hybridisierung und die DNA-Sequenzierung. Zusätzliche Anwendungen eines sequentiellen Nachweises unter Verwendung von Southern-Blotting umfassen die Identifizierung von Subspezies einer Gattung durch gleichzeitiges Versehen mit Gattungs- und Spezies-spezifischen Sonden und dann einen sequentiellen Chemilumineszenznachweis der zwei Sonden; eine Bestimmung der Genverknüpfung auf großen DNA-Fragmenten, die durch Pulsfeld-Gradientenelektrophorese (PFGE) durch gleichzeitiges Hybridisieren mit zwei unterschiedlich markierten Gensonden und dann einem sequentiellen Chemilumineszenznachweis getrennt werden; einen Nachweis von benachbarten Genen in Chromosomentranslokationen bei Krebs durch gleichzeitiges Versehen eines Southern-Blots mit den zwei Gensonden und deren Chemilumineszenznachweis in einer sequentiellen Weise.
Bei Genexpressionsstudien unter Verwendung von Northern- und Western-Blotting kann ein sequentieller Chemilumineszenznachweis zum Messen der Konzentrationen von mRNA und Protein eines spezifischen Gens (erster Nachweis) und Normalisieren von dessen Expression mit einem nicht betroffenen konstitutiven Gen, wie z.B. von β-Actin oder α-Tubulin (zweiter Nachweis), verwendet werden. Es gibt zahlreiche Berichte in der Literatur, bei denen ein Abstreifen und ein erneutes Versehen des gleichen Northern-Blots mit einer zweiten Sonde durchgeführt wird, um die Konzentrationen an mRNA nach einer Inkubation oder einer Behandlung mit einer Verbindung zu bestimmen. Das Abstreifen und erneute Versehen mit einer Sonde wird auch beim Western-Blotting durchgeführt. Dies kann durch gleichzeitiges Inkubieren des Blots mit zwei verschiedenen Antikörpern und Nachweisen ihrer Bindung an das membrangebundene Protein in einer sequentiellen Weise, wie es für den Mutationsnachweis durchgeführt worden ist, vermieden werden.
Der sequentielle Nachweis kann auch bei der DNA-Sequenzierung unter Verwendung eines unterschiedlich markierten Primers (unterschiedliches Hapten) für die enzymatische Primerverlängerung jedes zu sequenzierenden DNA-Templats verwendet werden. Nach dem Blotten der Sequenzierleiter auf eine Membran kann der Blot mit den entsprechenden Anti-Hapten-HRP- und AP-Konjugaten behandelt werden, worauf eine sequentielle Behandlung mit den HRP- und AP-Substraten für die Banden, um Licht zu emittieren, durchgeführt wird. Der Vorteil besteht darin, dass die Primerverlängerung von zwei unterschiedlichen Templaten in einem einzelnen Röhrchen durchgeführt werden kann und dass die DNA-Sequenzierleitern jedes Templats für die Nukleotide A, C, G und T durch einen sequentiellen Nachweis unterschieden werden können.
In einer alternativen Ausführungsform kann ein DNA-Sequenzierprotokoll einer Templat-DNA durch Vereinigen von zwei Paaren von basenspezifischen Sequenzierreaktionen, wobei jedes Paar zwei unterscheidbar markierte Primer umfasst, anstelle von vier Spuren in zwei Spuren durchgeführt werden. Beispielsweise wird der Primer mit der Markierung 1 für die A- und T-anzeigenden Reaktionen verwendet, und der gleiche Primer, jedoch mit der Markierung 2, wird für die G- und C-anzeigenden Reaktionen verwendet. Die A- und G-Reaktionsprodukte werden vereinigt und in einer Spur einer Elektrophorese unterzogen, und die T- und C-Reaktionsprodukte werden vereinigt und in einer anderen Spur einer Elektrophorese unterzogen. Die Anwendung des sequentiellen Nachweisverfahrens zeigt die Sequenz aller vier Basen in nur zwei Spuren.
Das vorliegende Verfahren zum Nachweisen von mindestens zwei Analyten erfordert nur die primären und sekundären Antikörper-Bindungsschritte; es ist kein Abstreifen oder erneutes Versehen mit einer Sonde erforderlich. Es sind auch Hybridtechniken vorgesehen, die mehrere HRP-Nachweisschritte und einen am Ende stattfindenden AP-Nachweisschritt umfassen. Die Anwendung der vorliegenden sequentiellen Nachweistechniken auf mehr als zwei Analyten in einem Testsystem kann durch Abstreifen gebundener Liganden und Enzyme von dem festen Träger und erneutes Versehen des Testsystems mit neuen spezifischen Liganden für einen neuen Durchgang eines sequentiellen Nachweises gemäß den vorliegenden Verfahren erreicht werden. Eine weitere Erweiterung der vorliegenden Verfahren würde den sequentiellen Chemilumineszenznachweis von drei oder vier Analyten durch gleichzeitiges Versehen mit mehreren unterschiedlich markierten Sonden (z.B. Biotin, Fluorescein, Digoxigenin, Dinitrophenol) und das sequentielle Nachweisen der markierten Sonden unter Verwendung mehrerer unterschiedlicher Enzyme (z.B. HRP, AP, β-Galactosidase und Glucuronidase) durch Hemmen des Chemilumineszenzsignals, das in jedem vorhergehenden Schritt erzeugt wird, umfassen.
Beispiele
Beispiel 1. Chemilumineszenzsubstrate
Das chemilumineszente HRP-Nachweisreagenz LUMIGEN PS-3 wurde von Lumigen, Inc. erhalten. Das Reagenz wird durch Vereinigen von zwei Lösungen im Verhältnis 1:40 erhalten. Die Arbeitslösung enthält das 2,3,6-Trifluorphenyl-10-methylacridin-9-carboxylat, ein Peroxid, eine Phenolverstärkerverbindung und ein nichtionisches grenzflächenaktives Mittel in einem pH 8,0-Puffer. EDTA, das üblicherweise in das Reagenz einbezogen ist, wurde ausgeschlossen.
Chemilumineszente AP-Nachweisreagenzien wurden durch Zugeben unterschiedlicher Mengen von 30 %igem H₂O₂ zu LUMI-PHOS PLUS (Lumigen, Inc.) hergestellt. Eine Konzentration von 0,15 % H₂O₂ wurde für die Arbeiten zur Entwicklung des Verfahrens verwendet. Das Phosphatasenachweis-Arbeitsreagenz (PDR) wurde durch Zugeben von 0,5 ml 30 %igem H₂O₂ zu 100 ml LUMI-PHOS PLUS hergestellt.
Beispiel 2. Nachweis von DNA-Markierungen
Der sequentielle Nachweis von DNA wurde zunächst unter Verwendung von zwei unterschiedlich markierten DNA-Größenmarkierungen gezeigt, und zwar einer biotinylierten Hind III-Enzym-abgebauten Lambda-Phagen-DNA (Life Technologies, Gaithersburg, MD) und einer Digoxigenin-markierten EcoRI-Enzym-abgebauten SPPI-Markierungs-DNA (Boehringer Mannheim, Indianapolis, IN). Diese Größenmarkierungen wurden einzeln in getrennten Spuren und als Gemisch in einer dritten Spur in 1 %igem Agarosegel, das Ethidiumbromid enthielt, fraktioniert (1). Das Gel wurde von Purin befreit (0,25 M HCl), denaturiert (0,5 N NaOH, 1,5 M NaCl), neutralisiert (0,5 M Tris-HCl, pH 7,5, 1,5 M NaCl) und auf eine neutrale Hybond N-Nylonmembran (Amersham, Arlington Heights, IL) mittels Vakuumblotting aufgebracht. Die Membran wurde 2 Stunden bei 80°C erwärmt.
Die Blots wurden zuerst 15 min in 1X-Waschpuffer (0,1 M Maleinsäure, 0,15 M NaCl, pH 7,5, 0,3 % Tween 20) gewaschen und für 1 Stunde in 2 %igem Blockierpuffer blockiert (Blockierreagenz – Boehringer Mannheim, gelöst in 0,1 M Maleinsäure, 0,15 M NaCl, pH 7,5). Die Arbeitskonzentrationen der Enzymkonjugate waren 1:5000-Verdünnungen in 2 %igem Blockierpuffer. Die Blots, welche die DNA-Größenmarkierungen enthielten, wurden mit Avidin-HRP (Pierce, Rockford, IL) und Anti-Digoxigenin-AP (Boehringer Mannheim, Indianapolis, IN)-Enzymkonjugaten behandelt, worauf sequentielle Behandlungen mit den Chemilumineszenz-Substraten LUMIGEN PS-3 für HRP und PDR für AP durchgeführt wurden. Sowohl die Enzymbehandlungen als auch die Substratbehandlungen wurden bei Raumtemperatur durchgeführt; die Substratinkubierungen wurden im Dunklen durchgeführt, um das Aussetzen des Substrats gegenüber Licht zu vermindern. Nach der Enzymkonjugatbehandlung wurden die Blots zweimal für jeweils 20 min in 1X-Waschpuffer gewaschen und dann 5 min mit dem HRP-Substrat umgesetzt. Überschüssiges Substrat wurde durch sanftes Pressen der Blots zwischen einem Paar von transparenten Kunststofffolien entfernt. Die Blots wurden für einen Zeitraum von im Allgemeinen wenigen Sekunden bis Minuten einem Röntgenfilm ausgesetzt, um ein optimales Signal und einen optimalen Hintergrund zu erhalten. Die 2A zeigt das resultierende Bild, das nach dem Anwenden des Peroxidasesubstrats erhalten worden ist. Bei der Behandlung mit Lumigen PS-3 (vgl. Bsp. 1) wurde eine Chemilumineszenz nur von den Banden mit Avidin-HRP-gebundener, biotinylierter HindIII-abgebauter Lambda-DNA erzeugt (Spuren 1 und 3).
Als nächstes wurden die Blots jeweils 5 min in 1X-Waschpuffer und in AP-Nachweispuffer (100 mM Tris HCl, pH 9,5, 100 mM NaCl, 50 mM MgCl₂) gespült, worauf eine weitere fünfminütige Behandlung mit dem PDR von Beispiel 1 durchgeführt wurde. Die 2B zeigt das resultierende Bild, das nach der Anwendung des PDR erhalten worden ist. Das HRP-erzeugte Signal von den Spuren 1 und 3 endet und die AP-katalysierte Chemilumineszenz setzt sich von den Digoxigenin-markierten SPPI-EcoRI-Größenmarkierungen in den Spuren 2 und 3 fort. Die Überlagerung der Spuren in den 2A und 2B (2C) zeigt alle Bandengrößen in der Spur 3, wie es durch einen Vergleich mit der Struktur bestätigt wird, die in den Spuren des Ethidiumbromid-gefärbten Agarosegels, das in der 1 gezeigt ist, vorliegt.
Beispiel 3. Southern-Blot-Analyse von CFTR-Genotypen
Die vorstehend beschriebene sequentielle Nachweisstrategie wurde zum Nachweisen und Differenzieren der Genotypen des CFTR-Gens mit der ΔF₅₀₈-Mutation angewandt. Die DNA von CFTR-Genotypen für die ΔF₅₀₈-Mutation (von Coriell Cell Repositories, Camden, NJ, erhalten), nämlich Wildtyp (N/N), heterozygot (N/ΔF₅₀₈) und homozygot (ΔF₅₀₈/ΔF₅₀₈), wurde durch eine Polymerasekettenreaktion (PCR) unter Verwendung von Primern für die Region von Exon 10, das die Mutation enthält, amplifiziert (die Primer wurden von Oligos etc., Wilsonville, OR, synthetisiert). Die Primer hatten die Sequenzen: 5' ACTTCACTTCTAATGATGATTATG 3' (SEQ ID NO:1) und 5'CTCTTCTAGTTGGCATGCTTTGAT 3' (SEQ ID NO:2). Die PCR-Produkte wurden auf einem 1 %igen Agarosegel einer Elektrophorese unterzogen und in der Weise, wie es vorstehend für die DNA-Größenmarkierungen beschrieben worden ist, einem Southern-Blotting unterzogen. Der Blot wurde gleichzeitig mit einem Paar von unterschiedlich markierten (Biotin und Digoxigenin) Oligonukleotidsonden hybridisiert, wobei eine davon zu dem normalen Allel komplementär war und die andere zu dem mutanten Allel komplementär war. Die markierten Oligonukleotide waren 5' Biotin-ATATCATCTTTGGTGTTTCCT 3' (SEQ ID NO:3) (normal) und 5' Digoxigenin-GAAAATATCATTGGTGTTTCC 3' (SEQ ID NO:4) (mutant).
Die Bedingungen für die Vorhybridisierung und die Hybridisierung des Blots waren 52°C für 1 Stunde bzw. über Nacht unter Verwendung eines Puffers, der 6X SSC (0,9 M Natriumchlorid, 0,09 M Natriumcitrat, pH 7,0), 0,01 M EDTA, pH 8,0, 5X Denhardt's Lösung (0,1 % Ficoll Typ 400, 0,1 % Polyvinylpyrrolidon, 0,1 % Rinderserumalbumin), 0,5 % Natriumdodecylsulfat (SDS) und 100 μg/ml denaturierte Lachssperma-DNA (Life Technologies) enthielt. Die Nachhybridisierungswaschvorgänge wurden bei 52°C für 20 min jeweils in 2X SSC, 0,1 % SDS und 0,5X SSC, 0,1 % SDS durchgeführt. Die Blots, welche die DNA enthielten, die mit dem CFTR-Allel-spezifischen Oligonukleotiden hybridisiert war, wurden so behandelt, wie es vorstehend für das Waschen, Blockieren und Binden von Antikörpern und den Nachweis beschrieben worden ist.
Die amplifizierten normalen (24 bp) und mutanten Sequenzprodukte (27 bp) wurden ausreichend aufgetrennt, um die zwei Produkte auf den Blots klar zu unterscheiden. Eine gleichzeitige Inkubation mit Avidin-HRP- und Anti-Digoxigenin-AP-Konjugaten und ein Nachweis in der vorstehend beschriebenen Weise erreichte den selektiven Nachweis von zuerst der Genotypen, die das normale Allel (N/N und N/Δ) enthielten, durch HRP-erzeugte Chemilumineszenz (4A) und in dem zweiten Schritt den selektiven Nachweis der Genotypen mit dem mutanten ΔF₅₀₈-Alle) N/Δ und Δ/Δ, (4B).
Die vorstehende Beschreibung und die vorstehenden Beispiele dienen der Veranschaulichung und sind nicht beschränkend aufzufassen. Es sollte beachtet werden, dass Modifizierungen der spezifischen Verbindungen und Verfahren, die beschrieben worden sind, durchgeführt werden können, ohne vom Wesen und Schutzbereich der vorliegenden Erfindung abzuweichen. Der Schutzbereich der Erfindung ist nur durch die beigefügten Ansprüche beschränkt.
SEQUENZPROTOKOLL

Claims

Verfahren zum sequentiellen Nachweisen einer ersten und zweiten Zielspezies in einer Probe, welche unter Verdacht steht, die erste und zweite Zielspezies zu enthalten, durch zwei sequentielle Chemilumineszenz-Reaktionen, umfassend: das Immobilisieren der ersten und zweiten Zielspezies auf einem festen Träger, das Inkontaktbringen der immobilisierten ersten und zweiten Zielspezies mit einem ersten spezifischen Bindungspartner für die erste Zielspezies und einem zweiten spezifischen Bindungspartner für die zweite Zielspezies, um dadurch ein erstes Bindungspaar und ein zweites Bindungspaar zu bilden, das Bereitstellen eines Peroxidase-Enzyms als eine Markierung für den ersten Bindungspartner und das Bereitstellen eines zweiten Enzyms als eine Markierung für den zweiten Bindungspartner, das Umsetzen des ersten Bindungspaars mit einem chemilumineszenten Peroxidase-Substrat und einer Peroxidverbindung, um eine erstes Chemiluminszenz-Signal zu erzeugen, das Nachweisen der ersten Zielspezies durch Nachweisen des ersten Chemilumineszenz-Signals, das Umsetzen des zweiten Bindungspaars mit einer Zusammensetzung, umfassend ein chemilumineszentes Substrat für das zweite Enzym und ein Stop-Reagenz, welches entweder ein Hemmstoff des Peroxidaseenzyms oder ein Reagenz ist, welches das Peroxidasesubstrat zerstört oder nicht-lumineszent werden läßt, um das erste Chemiluminszenz-Signal zu stoppen und ein zweites Chemilumineszenz-Signal zu bilden, und das Nachweisen der zweiten Zielspezies durch Nachweisen des zweiten Chemilumineszenz-Signals.
Verfahren zum sequentiellen Nachweisen einer ersten und zweiten Zielspezies in einer Probe, welche unter Verdacht steht, die zwei Zielspezies zu enthalten, durch zwei sequentielle Chemilumineszenz-Reaktionen, umfassend: das Immobilisieren der ersten und zweiten Zielspezies auf einem festen Träger, das Inkontaktbringen der immobilisierten ersten und zweiten Zielspezies mit einem ersten spezifischen Bindungspartner für die erste Zielspezies und einem zweiten spezifischen Bindungspartner für die zweite Zielspezies, um dadurch ein erstes Bindungspaar und ein zweites Bindungspaar zu bilden, das Bereitstellen eines Peroxidase-Enzyms als eine Markierung für den ersten Bindungspartner und das Bereitstellen eines zweiten Enzyms als eine Markierung für den zweiten Bindungspartner, das Umsetzen des ersten Bindungspaares mit einem chemilumineszenten Peroxidase-Substrat und einer Peroxidverbindung, um ein erstes Chemilumineszenz-Signal zu erzeugen, das Nachweisen der ersten Zielspezies durch Nachweisen des ersten Chemilumineszenz-Signals, das Umsetzen der Peroxidase mit einem Stop-Reagenz, welches entweder ein Hemmstoff des Peroxidase-Enzyms oder ein Reagenz ist, welches das Peroxidase-Substrat zerstört oder nicht-lumineszent werden läßt, um das erste Chemilumineszenz-Signal zu stoppen, das Umsetzen des zweiten Bindungspaares mit einem chemilumineszenten Substrat für das zweite Enzym, um ein zweites Chemilumineszenz-Signal zu erzeugen, und das Nachweisen der zweiten Zielspezies durch Nachweisen des zweiten Chemilumineszenz-Signals.
Verfahren nach Anspruch 1 oder Anspruch 2, wobei der erste spezifische Bindungspartner mit einem ersten Hapten markiert ist, der zweite spezifische Bindungspartner mit einem zweiten Hapten markiert ist, welches von dem ersten Hapten verschieden ist, wobei das Peroxidase-Enzym als ein Konjugat mit einem dritten spezifischen Bindungspartner, welcher das erste Hapten bindet, bereitgestellt ist, und das zweiten Enzym als ein Konjugat mit einem vierten spezi fischen Bindungspertner, welcher das zweite Hapten bindet, bereitgestellt ist, wobei das erste und zweite Hapten vorzugsweise unabhängig aus der Gruppe, bestehend aus Biotin, Fluorescein und Digoxigenin, ausgewählt ist.
Verfahren nach Anspruch 1 oder Anspruch 2, wobei der erste spezifische Bindungspartner direkt mit dem Peroxidase-Enzym markiert ist.
Verfahren nach Anspruch 1 oder Anspruch 2, wobei der zweite spezifische Bindungspartner direkt mit dem zweiten Enzym markiert ist.
Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei das zweite Enzym ein hydrolytisches Enzym ist, das vorzugsweise aus alkalischer Phosphatase, β-Galactosidase und Glucuronidase ausgewählt ist, wobei es mehr bevorzugt alkalische Phosphatase ist.
Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei das Peroxidase-Enzym Meerrettich-Peroxidase ist.
Verfahren nach Anspruch 1 oder Anspruch 2, wobei die erste und zweite Zielspezies einen ersten Bereich einer Nukleinsäure und einen zweiten Bereich der Nukleinsäure umfassen, und wobei der erste spezifische Bindungspartner eine zu dem ersten Bereich der Nukleinsäure komplementäre erste Oligonukleotidsonde ist und der zweite spezifische Bindungspartner eine zu dem zweiten Bereich der Nukleinsäure komplementäre zweite Oligonukleotidsonde ist.
Verfahren nach Anspruch 8, verwendet zum Nachweisen der Anwesenheit einer genetischen Mutation, wobei das Verfahren vorzugsweise dadurch gekennzeichnet ist, daß die erste und zweite Zielspezies eine erste Nukleotidsequenz eines normalen Gens und eine zweite Nukleotidsequenz, welche eine Mutation des Gens enthält, umfassen, wobei der erste spezifische Bindungspartner eine zu der ersten Nukleotidsequenz komplementäre Oligonukleotidsonde ist und der zweite spezifische Bindungspartner eine zu der zweiten Nukleotidsequenz komplementäre Oligonukleotidsonde ist.
Verfahren nach Anspruch 1 oder Anspruch 2, verwendet in einer DNA-Sequenzanalyse.
Verfahren nach Anspruch 1 oder Anspruch 2, wobei die ersten und zweite Zielspezies erste und zweite Proteine sind, und das Verfahren in einem Western Blot Assay verwendet wird.
Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei das chemilumineszente Substrat für das zweite Enzym ein enzymatisch auslösbares Dioxetan ist.
Verfahren nach Anspruch 12, wobei das Dioxetan die Formel
aufweist, wobei A₁ und A₂ Gruppen sind, welche dem Dioxetan Stabilität verleihen, A₃ aus geradkettigem, verzweigtkettigem oder Cycloalkyl, substituiertem Alkyl, Aryl und substituierten Arylgruppen ausgewählt ist, A₄ eine aromatische Ringgruppe ist, welche mit einem auslösbaren OX-Substituenten in einer Position substituiert ist, welche außerhalb der Konjugation mit dem Dioxetanring ist, und jedes Paar von Gruppen, ausgewählt aus A₁, A₂, A₃ und A₄, zusammen verbunden werden kann, um einen an den Dioxetanring anellierten Ring zu bilden.
Verfahren nach Anspruch 13, wobei A₁ und A₂ zusammen verbunden sind als eine substituierte oder unsubstituierte Polycycloalkylgruppe mit 6 bis 10 Kohlenstoffatomen, A₃ eine substituierte oder unsubstituierte Alkylgruppe mit 1 bis 10 Kohlenstoffatomen ist, A₄ eine substituierte oder unsubstituierte Phenyl gruppe ist, und X aus einer PO₃ ^2– Gruppe, einer Galaktosidgruppe oder einer Glucuronidgruppe ausgewählt ist, wobei die Gruppe OX vorzugsweise eine Phosphatgruppe ist, wobei das Dioxetan mehr bevorzugt die Formel:
aufweist.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 11, wobei das chemilumineszente Peroxidase-Substrat ausgewählt ist aus N-Alkylacridan-9-carboxylat-Derivaten mit der allgemeinen Formel:
wobei R ausgewählt ist aus Alkyl, Heteroalkyl und Aralkylgruppen, wobei R₁ bis R₈ unabhängig ausgewählt sind aus Gruppen, welche das Erzeugen von Licht erlauben und wobei benachbarte Paare von Gruppen R₁ bis R₈ die Gruppe CH=CH-CH=CH bilden können, dadurch einen Benzo-anellierten Ring bilden und wobei die C(=O)-Y Gruppe eine Ester-, Thioester- oder Sulfonamidgruppe ist.
Verfahren nach Anspruch 15, wobei das N-Alkylacridan-9-carboxylat-Derivat die Formel:
aufweist, wobei R₃ ausgewählt ist aus H, Cl oder einer Methoxygruppe, vorzugsweise H, und wobei C(=O)Y wie in Anspruch 15 definiert ist, wobei Y vorzugsweise eine 2,3,6-Trifluorphenoxygruppe ist.
Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei der feste Träger aus der Gruppe, bestehend aus Teststreifen, Blotting-Membranen, Filtern, Glasobjektträgern, Plastikobjektträgern, Mikrovertiefungen, Reagenzgläsern und Kügelchen, vorzugsweise einer Blotting-Membran, ausgewählt ist.
Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei das Peroxid aus der Gruppe, bestehend aus Wasserstoffperoxid, Harnstoffperoxid und Perboratsalzen, ausgewählt ist.
Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei das chemilumineszente Peroxidase-Substrat, das Peroxid in einer wässrigen Reagenzzusammensetzung bereitgestellt sind, welche weiter einen Phenolverstärker umfaßt, wobei die wässrige Reagenz-Zusammensetzung vorzugsweise weiter einen grenzflächenaktives Mittel-Verstärker umfaßt.
Verfahren nach Anspruch 1 oder Anspruch 2, wobei das Reagenz ein Hemmstoff des Peroxidase-Enzyms ist.
Verfahren nach Anspruch 20, wobei der Peroxidasehemmstoff aus Wasserstoffperoxid alleine oder in Kombination mit Azidion, Cyanidion, Fluoridion, Imi dazol, Phenylhydrazin und Periodat, vorzugsweise Wasserstoffperoxid alleine, ausgewählt ist.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1, 2 und 21, in welchem das Stop-Reagenz das Peroxidase-Substrat zerstört.
Reagenz-Zusammensetzung, umfassend in wässriger, gepufferter Lösung einen Peroxidase-Hemmstoff, ausgewählt aus Wasserstoffperoxid alleine oder in Kombination mit Azidion, Cyanidion, Fluoridion, Imidazol, Phenylhydrazin und Periodat, und ein chemilumineszentes Substrat für ein hydrolytisches Enzym.
Zusammensetzung nach Anspruch 23, in welchem das hydrolytische Enzym aus alkalischer Phosphatase, β-Galaktosidase und Glucuronidase, vorzugsweise alkalische Phosphatase, ausgewählt ist.
Zusammensetzung nach Anspruch 23 oder 24, in welchem das Substrat eine Enzym-auslösbare Dioxetanverbindung ist.
Zusammensetzung nach Anspruch 25, in welcher das Substrat die Formel:
aufweist, wobei A₁ und A₂ Gruppen sind, welche dem Dioxetan Stabilität verleihen, A₃ aus geradkettigem, verzweigtkettigem oder Cycloalkyl, substituiertem Alkyl, Aryl und substituierten Arylgruppen ausgewählt ist, A₄ eine aromatische Ringgruppe ist, substituiert mit einem OX-Substituenten, auslösbar durch das hydrolytische Enzym in einer Position, die außerhalb der Konjugation mit dem Dioxetanring liegt, und jedes Paar von Gruppen, ausgewählt aus A₁, A₂, A₃ und A₄, zusammen verbunden werden kann, um einen mit dem Dioxetanring annelierten Ring zu bilden.
Zusammensetzung nach Anspruch 26, wobei A₁ und A₂ als eine substituierte oder unsubstituierte Polycycloalkylgruppe mit 6 bis 10 Kohlenstoffatomen verbunden sind, A₃ eine substituierte oder unsubstituierte Alkylgruppe mit 1 bis 10 Kohlenstoffatomen ist, A₄ eine substituierte oder unsubstituierte Phenylgruppe ist und X aus einer PO₃ ^2– Gruppe, einer Galaktosidgruppe oder einer Glucuronidgruppe ausgewählt ist, wobei die Gruppe OX vorzugsweise eine Phosphatgruppe ist, wobei das Dioxetan mehr bevorzugt die Formel:
aufweist.
Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 23 bis 27, weiter umfassend einen grenzflächenaktives Mittel-Verstärker, welcher das Signal/Hintergrundverhältnis von durch Peroxidase hervorgerufener Chemilumineszenz verbessert, welcher vorzugsweise ein dikationisches grenzflächenaktives Mittel ist, mehr bevorzugt ein Diphosphoniumsalz grenzflächenaktives Mittel.
Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 23 bis 28, in welchem der Peroxidasehemmstoff Wasserstoffperoxid ist.