DE69923580T2 - Verstärkte katalysierte reporterabscheidung - Google Patents

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Description

  • Gebiet der Erfindung
  • Die Erfindung betrifft enzymatische Tests und insbesondere die Verstärkung der Reaktivität von Peroxidase zur Verwendung in einer katalysierten Reporter-Abscheidung.
  • Hintergrund der Erfindung
  • Peroxidase wird aufgrund ihrer hohen Turnover-Rate, ihrer guten Stabilität und ihrer Verfügbarkeit in breitem Umfang in analytischen Verfahren auf enzymatischer Basis eingesetzt. Beispielsweise katalysiert Meerrettichperoxidase (HRP) (EC 1.11.1.7) die Oxidation einer Vielzahl von Wasserstoff-Donator-Substraten mit Wasserstoffperoxidase. HRP ist auch eines der bevorzugten Enzyme zur Verwendung bei der katalysierten Reporter-Abscheidung.
  • Die katalysierte Reporter-Abscheidung (CARD) ist ein neues Verfahren der Signalamplifikation, die Gegenstand der folgenden US-Patente ist: 5 863 748, 5 688 966, 5 767 287, 5 731 158, 5 583 001 und 5 196 306. Dieses Verfahren wird auch von Bobrow et al., Journal of Immunological Methods, Bd. 125 (1989), S. 279-285, und von Bobrow et al., Journal of Immunological Methods, Bd. 137 (1991), S. 103-112, diskutiert. Das Verfahren bedient sich eines analytenabhängigen Enzym-Aktivierungssystems ("AREAS") zur Katalyse der Abscheidung einer nachweisbaren Markierung auf die feste Phase einer Testplattform. Diese enzymatisch abgeschiedenen Markierungen können direkt oder indirekt erfasst werden und führen zu einer Signalamplifikation und zu verbesserten Nachweisgrenzen. In einer bevorzugten Ausführungsform stellt HRP das Enzym dar.
  • HRP reagiert mit einem Konjugat, das aus einem nachweisbar markierten Substrat, das spezifisch für ADEAS ist, besteht. Wenn das AREAS und das Konjugat reagieren, entsteht ein aktiviertes Konjugat, das sich kovalent abscheidet, wo auch immer die Rezeptorstelle für das aktivierte Konjugat immobilisiert wird.
  • Zum analytischen Einsatz wurde die Substratoxidation durch HRP zur Erzeugung von Produkten verwendet, die gefärbt, fluoreszierend oder chemilumineszierend werden. Diese Produkte bleiben entweder löslich oder werden unlöslich und fallen auf der festen Phase aus. Das CARD-Verfahren unterscheidet sich diesbezüglich, da die Produkte des nachweisbar markierten Phenolsubstrats kovalent an die feste Phase gebunden werden.
  • Zur Verbesserung der Nachweisgrenzen bei analytischen Verfahren ist es erstrebenswert, durch Enzyme die Umwandlung von Substrat in Produkt zu erhöhen oder zu verstärken. Obgleich eine Substanz, die die HRP-Katalyse unabhängig vom verwendeten Substrat verstärkt, bisher noch nicht aufgefunden worden ist, wurden verschiedene, für HRP-Substrate spezifische Verstärkungsmittel beschrieben, die lösliche Produkte bilden. Es wurde ein für das Substrat Diaminobenzidin spezifisches Verstärkungsmittel beschrieben, das ein unlösliches Produkt bildet. Verstärkungsmittel für Substrate, die durch die katalytische Aktivität von HRP kovalent abscheidbare Produkte bilden, wurden noch nicht beschrieben.
  • J. R. Whitaker und A. L. Tappel, Biochimica et Biophysica Acta, Bd. 62 (1962), S. 310-317, zeigen, dass KCl, NaCl, Na2SO4 und in geringerem Umfang LiCl die Oxidation von Guaiacol verstärken.
  • Das US-Patent 4 598 044 (Kricka et al., 1. Juli 1986) beschreibt die Verstärkung der HRP-katalysierten Oxidation des Substrats 2,3-Dihydro-1,4-phthalazindion, das ein lösliches, chemilumineszierendes Produkt bildet, durch verschiedene Phenolverbindungen.
  • Das US-Patent 4 729 950 (Kricka et al., 8. März 1988) beschreibt die Verstärkung der HRP-katalysierten Oxidation des Substrats 2,3-Dihydro-1,4-phthalazindion durch verschiedene aromatische Aminverbindungen. In den Tabellen 1 und 2 sind verschiedene Substrat/Verstärkungsmittel-Kombinationen zusammengestellt. Die Tabellen und die Diskussion (Spalte 3, Zeile 67 bis Spalte 4, Zeile 34) führen zu dem Schluss, dass keine Vorhersagen darüber gemacht werden können, ob eine HRP-katalysierte Oxidation eines Substrats durch eine gegebene Verbindung verstärkt wird.
  • Das US-Patent 5 629 168 (Kricka, 13. Mai 1997) beschreibt die Verstärkung der HRP-katalysierten Oxidation des Substrats 2,3-Dihydro-1,4-phthalazindion durch aromatische Organoborverbindungen.
  • Das US-Patent 4 521 511 (Stout, 4. Juni 1985) beschreibt die Verstärkung der HRP-katalysierten Oxidation des Substrats 2,2'-Azinodi-(3-ethylbenzothiazolon-6-sulfonsäure) durch verschiedene Phenolverbindungen.
  • W. Straus, Journal of Histochemistry and Cytochemistry, Bd. 30 (1982), S. 491-493, zeigt, dass Imidazol die HRP-katalysierte Oxidation von Diaminobenzidin, das ein unlösliches Produkt bildet, verstärkt.
  • A. S. H. de Jong et al., Histochemical Journal, Bd. 17 (1985), S. 1119-1130, zeigen ebenfalls, dass Imidazol die Oxidation von Diaminobenzidin etwa 4-fach verstärkt, eine Substratkombination aus p-Phenylendiamin und Pyrocatechin etwa 2-fach verstärkt und keine Wirkung auf das Substrat 4-Chlor-1-naphthol ausübt, die alle unlösliche Produkte bilden.
  • Die vorerwähnten Verstärkungsmittel, mit der Ausnahme von Imidazol, verstärken lediglich die Umwandlung von löslichen Substraten zu löslichen Produkten. Ferner sind die Verstärkungsmittel substratspezifisch. Die Verstärkung der Oxidation von Guaicol durch KCl, NaCl, Na2SO4 und LiCl ist für Guaiacol spezifisch. Diese Salze verstärken weder die Oxidation von Substraten, die unlösliche Produkte bilden, noch verstärken sie die Oxidation von üblicherweise verwendeten Substraten, die lösliche Produkte bilden, wie Orthophenylendiamin oder Tetramethylbenzidin. Die Verstärkungsmittel für 2,3-Dihydro-1,4-phthalazindion bewirken ferner weder eine Verstärkung der Oxidation von Substraten, die unlösliche Produkte bilden, noch eine Verstärkung der Oxidation von üblicherweise verwendeten Substraten, die lösliche Produkte bilden, wie Orthophenylendiamin oder Tetramethylbenzidin. Imidazol, von dem gezeigt worden ist, dass es die Oxidation von Diaminobenzidin verstärkt, hat nur einen marginalen Einfluss auf p-Phenylendiamin/Pyrocatechin, keinen Einfluss auf 4-Chlor-1-naphthol und keinen Einfluss auf Substrate, die kovalent abscheidbare Produkte bilden. Eine Vorhersage darüber, ob die Oxidation eines gegebenen Substrats durch HRP mit einer gegebenen Verbindung verstärkt wird, kann nicht getroffen werden.
  • Demzufolge wäre es vorteilhaft und erstrebenswert, über Reagenzien zur Verstärkung der Katalyse von HRP zu verfügen und eine Verstärkungswirkung zu erzielen, die größer ist, als es nach der herkömmlichen Technologie zu erwarten ist.
  • Zusammenfassende Darstellung der Erfindung
  • Die vorliegende Erfindung betrifft die Verstärkung der Katalyse von HRP in einem katalysierten Reporterabscheidungsverfahren (CARD) durch Umsetzung eines Konjugats, das ein erfassbares markiertes Phenol enthält, mit einem Peroxidaseenzym in Gegenwart eines Verbesserungsmittels (Verstärkungsmittels), das (a) mindestens ein anorganisches Salz, (b) eine organische Verstärkungsverbindung der folgenden Strukturformel oder Gemische aus (a) und (b) enthält
    Figure 00050001
    worin X die Gruppe B(OH)2 bedeutet und Y entweder I oder, wenn X die Gruppe OH darstellt, ein Halogen oder den Rest Q-R bedeutet, worin Q eine gerade oder verzweigte 1-12-Heteroatomalkylkette darstellt, wobei die Heteroatome aus der Gruppe N, O und S ausgewählt sein können, wobei die Bindungen, die die Alkylkette verbinden, Einfach- oder Doppelbindungen sind und irgendein Kohlenstoffatom in der Alkylkette gegebenenfalls einen Substituenten aufweist, der aus -OH, -COOH, -NH2 und -SH ausgewählt ist, und wobei R aus -OH, -COOH, -NH2 und -CH3 ausgewählt ist.
  • Kurze Beschreibung der Zeichnung
  • Weitere Vorteile der Erfindung ergeben sich aus der folgenden ausführlichen Beschreibung der Erfindung unter Bezugnahme auf die beigefügten Zeichnungen.
  • 1A-C sind Photographien zur Erläuterung der Ergebnisse des Nachweises durch verstärkte katalysierte Reporterabscheidung (CARD), wobei (A) eine Aufnahme darstellt, die die Ergebnisse eines üblichen CARD-Nachweises unter Verwendung von Cyanin-3-tyramid zeigt, (B) eine Aufnahme darstellt, die die Ergebnisse eines mit einer organischen Verbindung verstärkten CARD-Nachweises unter Verwendung von Cyanin-3-tyramid zeigt, und (C) eine Aufnahme darstellt, die die Ergebnisse eines mit einem organischen Salz verstärkten CARD-Nachweises unter Verwendung von Cyanin-3-tyramid zeigt.
  • 2A-C sind Photographien zur Erläuterung des Nachweises durch verstärkte katalysierte Reporterabscheidung (CARD) unter Verwendung von Fluorescein-tyramid, wobei (A) die Ergebnisse eines üblichen CARD-Nachweises unter Verwendung von Fluorescein-tyramid zeigt, (B) die Ergebnisse eines mit einer organischer Verbindung verstärkten CARD-Nachweises unter Verwendung von Fluorescein-tyramid zeigt, und (C) die Ergebnisse eines mit einer organischen Verbindung und einem Salz verstärkten CARD-Nachweises unter Verwendung von Fluorescein-tyramid zeigt.
  • 3A-B erläutern den Nachweis durch verstärkte katalysierte Reporterabscheidung (CARD) unter Verwendung von Biotinyl-tyramid, wobei (A) die Ergebnisse eines üblichen CARD-Nachweises unter Verwendung von Biotinyl-tyramid zeigt und (B) die Ergebnisse eines mit einer organischen Verbindung und einem Salz verstärkten CARD-Nachweises unter Verwendung von Biotinyl-tyramid zeigt.
  • Ausführliche Beschreibung der Erfindung
  • Die vorliegende Erfindung betrifft die Verstärkung (Verbesserung) der Katalyse von HRP in einem CARD-Verfahren oder einem Tyramid-Signalverstärkungsverfahren (TSA-Verfahren) durch Umsetzen eines Konjugats, das ein erfassbar markiertes Phenol enthält, mit einem Peroxidaseenzym, wobei die Umsetzung in Gegenwart eines Verstärkungsmittels durchgeführt wird, das mindestens ein anorganisches Salz, wie NaCl, MgCl2, KCl, CaCl2, Natriumphosphat und Ammoniumsulfat, oder Natriumacetat oder Ammoniumacetat, eine organische verstärkende Verbindung oder Gemische aus den anorganischen und organischen Verstärkungsreagenzien enthält.
  • Organische Verbindungen, die sich als Verstärkungsreagenzien eignen, weisen die folgende Strukturformel auf
    Figure 00070001
    worin X die Gruppe B(OH)2 bedeutet und Y entweder I oder, wenn X die Gruppe OH darstellt, ein Halogen oder den Rest Q-R bedeutet, worin Q eine gerade oder verzweigte 1-12-Heteroatomalkylkette darstellt, wobei die Heteroatome aus der Gruppe N, O und S ausgewählt sein können, wobei die Bindungen, die die Alkylkette verbinden, Einfach- oder Doppelbindungen sind und irgendein Kohlenstoffatom in der Alkylkette gegebenenfalls einen Substituenten aufweist, der aus -OH, -COOH, -NH2 und -SH ausgewählt ist, und wobei R aus -OH, -COOH, -NH2 und -CH3 ausgewählt ist.
  • Ein breiter Konzentrationsbereich für das anorganische Verstärkungsmittel beträgt etwa 0,1 M bis zur Sättigung. Die Konzentration des anorganischen Verstärkungsreagenz beträgt vorzugsweise mindestens etwa 0,5 M. Insbesondere liegt die Konzentration des anorganischen Verstärkungsreagenz im Bereich von etwa mindestens 2 M bis zur Sättigung.
  • Die Konzentration des organischen Verstärkungsreagenz liegt vorzugsweise im Bereich von etwa 1 × 10–7 M bis 1 × 10–3 M. Insbesondere liegt die Konzentration des organischen Verstärkungsreagenz im Bereich von etwa 1 × 10–6 M bis 1 × 10–4 M.
  • Zu bevorzugten organischen Verstärkungsreagenzien gehören Verbindungen der folgenden Strukturformeln
    Figure 00080001
    Figure 00090001
  • Zur Verwendung mit nicht-fluoreszierenden Reagenzien stellt
    Figure 00090002
    das besonders bevorzugte Verstärkungsmittel dar. Bei Verwendung eines fluoreszierenden Substrats stellt
    Figure 00100001
    das besonders bevorzugte Verstärkungsmittel dar.
  • Der hier verwendete Ausdruck "Konjugat" bedeutet ein erfassbar markiertes Phenol, bei dem es sich um ein Substrat für das HRP-Enzym handelt. Bevorzugte Konjugate umfassen Tyramid-Verbindungen, p-Hydroxyzimtsäure und Derivate davon. Das Konjugat umfasst somit zwei Komponenten. Bei einer Komponente handelt es sich um den Phenolrest, der als Substrat für das Enzym dient, bei der anderen Komponente handelt es sich um die erfassbare Markierung.
  • Der hier verwendete Ausdruck "erfassbar markiert" bedeutet, dass das Substrat entweder an einen Reporter oder an ein unmarkiertes erstes Element eines spezifischen Bindungspaars gekuppelt werden kann. Wenn das Substrat an ein unmarkiertes Element eines spezifischen Bindungspaars gekuppelt wird, wird im Anschluss an die kovalente Bindung des aktivierten Konjugats der Komplex aus dem Substrat und dem spezifischen Bindungspaar mit dem zweiten Element des Bindungspaars, das an einen Reporter gekuppelt ist, umgesetzt.
  • Der hier verwendete Ausdruck "Rezeptorstelle" bedeutet eine Stelle, an der das aktivierte Konjugat über die Bildung einer kovalenten Bindung an die Oberfläche bindet. Zu Beispielen für Rezeptorstellen-Zusammensetzungen für phenolische Substrate gehören Tyrosinreste von Proteinen, Phenol und andere elektronenreiche organische Moleküle. Bei den Rezeptorstellen kann es sich um reaktive Komponenten der Oberfläche eines festen Trägers handeln oder sie können an die Oberfläche des festen Trägers addiert werden.
  • Der hier verwendete Ausdruck "aktiviertes Konjugat" bedeutet, dass das Konjugat so vorbehandelt worden ist, dass es an die Rezeptorstelle bindet.
  • Der hier verwendete Ausdruck "Halogen" umfasst Chlor, Fluor, Brom und Iod.
  • Der hier verwendete Ausdruck "Alkyl" bedeutet eine gerade oder verzweigte Kohlenwasserstoffkette. Zu repräsentativen Beispielen für Alkylgruppen gehören Methyl, Ethyl, Propyl, Isopropyl, Isobutyl, Butyl, tert.-Butyl, sec.-Butyl, Pentyl und Hexyl.
  • Der hier verwendete Ausdruck "Heteroatom" betrifft Sauerstoff, Stickstoff und Schwefel.
  • Elemente der spezifischen Bindungspaare, die sich zur Verwendung bei der praktischen Durchführung der Erfindung eignen, können vom Immuntyp oder vom Nichtimmuntyp sein. Beispiele für immunspezifische Bindungspaare sind Antigen/Antikörper-Systeme oder Hapten/Antihapten-Systeme. Das Antikörperelement des Bindungspaars kann unabhängig davon, ob es sich um einen polyklonalen oder monoklonalen Antikörper oder um ein immunoreaktives Fragment davon handelt, nach herkömmlichen Verfahren, die dem Fachmann geläufig sind, hergestellt werden. Die Ausdrücke "immunoreaktives Antikörperfragment" oder "immunoreaktives Fragment" bedeuten Fragmente, die die Bindungsregion des Antikörpers enthalten. Bei derartigen Fragmenten kann es sich um Fragmente vom Fab-Typ handeln, die als Fragmente definiert sind, denen der Fc-Bereich fehlt, z.B. Fab-, Fab'- und F(ab')2-Fragmente, oder es kann sich um sogenannte Halbmolekülfragmente handeln, die durch reduktive Spaltung der Disulfidbindungen, die die schweren Kettenkomponenten des intakten Antikörpers verbinden, erhalten worden sind. Wenn das Antigenelement des spezifischen Bindungspaars nicht immunogen ist, z.B. ein Hapten, kann dieses kovalent an ein Trägerprotein gekuppelt werden, um ihm eine immunogene Beschaffenheit zu verleihen.
  • Nichtimmun-Bindungspaare umfassen Systeme, bei denen die beiden Komponenten eine natürliche Affinität zueinander, jedoch nicht zu Antikörpern aufweisen. Zu Beispielen für Nichtimmun-Bindungspaare gehören Biotin-Avidin oder Biotin-Streptavidin, Folsäure-Folatbindungsprotein, komplementäre Sonden-Nucleinsäuren und dergl. Ferner gehören hierzu Nichtimmun-Bindungspaare, die eine kovalente Bindung miteinander bilden. Zu Beispielen für kovalente Bindungspaare gehören Sulfhydryl-reaktive Gruppen, wie Maleinimide und Halogenacetylderivate, und Amin-reaktive Gruppen, wie Isothiocyanate, Succinimidylester, Sulfonylhalogenide und Kupplerfarbstoffe, wie 3-Methyl-2-benzothiazolinon-hydrazon (MBTH) und 3-(Dimethylamino)-benzoesäure (DMAB).
  • Der hier verwendete Ausdruck "Verbesserungsmittel" (oder "Verstärkungsmittel") bedeutet ein Reagenz, das die Geschwindigkeit der Bindung des aktivierten Konjugats an die Rezeptorstelle erhöht oder beschleunigt. Die erhöhte oder beschleunigte Bindung des aktivierten Konjugats an die Rezeptorstelle wird direkt oder indirekt ausgehend von der erfassbaren Markierung des Konjugats überwacht.
  • Die vorliegende Erfindung ist aufgrund der molekularen Natur der Verstärkerreste in Bezug zum erfassbar markierten Substrat überraschend und unerwartet. Es sind zwei Reaktionen erforderlich, um dem Konjugat die Bindung an die Rezeptorstelle zu ermöglichen. Erstens katalysiert das Peroxidase-Enzym die Enzymoxidation oder die Aktivierung des Konjugats und zweitens reagiert das aktivierte Konjugat mit der Rezeptorstelle unter Ausbildung einer kovalenten Bindung. Die Strukturen der organischen Verstärkungsmittel begründen eine Eignung als Substrate für HRP und/oder Rezeptorstellen für das aktivierte Konjugat. Daher würde man vorhersagen, dass diese Reste als Inhibitoren der ersten und/oder der zweiten Reaktion statt als Verstärkungsmittel dienen.
  • Ferner ist es überraschend, dass die anorganischen und organischen Verstärkungsmittel der Erfindung bei Kombination sich in Bezug auf ihre Verstärkungswirkung additiv verhalten.
  • Beispiel 1
  • Nachweis der verstärkten katalysierten Reporterabscheidung (CARD) unter Verwendung von Cyanin-3-tyramid
  • Objektträger mit humanen Prostata-Gewebeschnitten (Dako Corp., Carpinteria, CA) wurden deparaffiniert und 30 Minuten mit TNB-Blockierpuffer (TSA Direct Cyanine 3-Kit, NEN Life Science Products, Boston, MA) blockiert. Kaninchen-antihuman-Prostata-spezifisches Antigen (Dako), das in TNB-Puffer 1/40 000 verdünnt war, wurde 1 Stunde bei Raumtemperatur inkubiert. Die Objektträger wurden in TNT-Puffer (TSA Direct Cyanine 3-Kit) gewaschen und sodann mit anti-Kaninchen-IgG-HRP-Konjugat (Roche Molecular Biochemicals, Indianapolis, IN), das in TNB-Puffer 1/1 000 verdünnt war, 1 Stunde bei Raumtemperatur inkubiert.
  • Ein Standard-CARD-Nachweis wurde unter Verwendung des TSA Direct Cyanine 3-Kits durchgeführt. Ein organisch verstärkter CARD-Nachweis wurde unter Verwendung des TSA Direct Cyanine 3-Kits und Zugabe von p-Iodphenylborsäure (Formel 2) in einem Verhältnis von 20:1 (Gew./Gew.) zum Cyanin-3-tyramid-Reagenz durchgeführt. Ein mit einer organischen Verbindung und einem Salz verstärkter CARD-Nachweis wurde unter Verwendung des TSA Direct Cyanine 3-Kits und unter Zugabe von p-Iodphenylborsäure (Formel 2) im Verhältnis von 20:1 (Gew./Gew.) zum Cyanin-3-tyramid-Reagenz und unter Zugabe von NaCl zum Verdünnungsmittel in einer Endkonzentration von 2 M durchgeführt.
  • Die Objektträger wurden in TNT-Puffer gewaschen, mit Fixiermedium fixiert und mit einer Abdeckung bedeckt.
  • 1A zeigt die Ergebnisse des Standard-CARD-Nachweises unter Verwendung von Cyanin-3-tyramid. 1B zeigt die Ergebnisse des mit einer organischen Verbindung verstärkten CARD-Nachweises unter Verwendung von Cyanin-3-tyramid. 1C zeigt die Ergebnisse des mit einer organischen Verbindung und einem Salz verstärkten CARD-Nachweises unter Verwendung von Cyanin-3-tyramid. Es gibt einen sehr erheblichen Unterschied zwischen dem standardmäßigen und dem mit einer organischen Verbindung verstärkten Cyanin-3-Nachweis (1A im Vergleich mit 1B), woraus sich der verbesserte Nachweis ergibt. Ferner ergibt sich eine unerwartete und signifikante Verbesserung bei der Zugabe des Salzes beim mit einer organischen Verbindung verstärkten Cyanin-3-Nachweis (1B im Vergleich mit 1C). Die Differenz ist bei visueller Betrachtung noch deutlicher als in der Photographie.
  • Beispiel 2
  • Nachweis der verstärkten katalysierten Reporterabscheidung (CARD) unter Verwendung von Fluorescein-Tyramid
  • Objektträger mit humanen Prostata-Gewebeschnitten (Dako) wurden deparaffiniert und 30 Minuten mit TNB-Blockierpuffer (TSA Direct Green Kit, NEN Life Science Products) blockiert. Kaninchen-antihuman-Prostata-spezifisches Antigen (Dako), das in TNB-Puffer 1/10 000 verdünnt war, wurde 1 Stunde bei Raumtemperatur inkubiert. Die Objektträger wurden in TNT-Puffer (TSA Direct Green Kit) gewaschen und sodann mit anti-Kaninchen-IgG-HRP-Konjugat (Roche), das in TNB-Puffer 1/1 000 verdünnt war, 1 Stunde bei Raumtemperatur inkubiert.
  • Ein Standard-CARD-Nachweis wurde unter Verwendung des TSA Direct Green Kits, bei dem Fluorescein-tyramid eingesetzt wird, durchgeführt. Ein organisch verstärkter CARD-Nachweis wurde unter Verwendung des TSA Direct Green Kits und Zugabe von p-Iodphenylborsäure (Formel 2) in einem Verhältnis von 20:1 (Gew./Gew.) zum Fluorescein-tyramid-Reagenz durchgeführt. Ein mit einer organischen Verbindung und einem Salz verstärkter CARD-Nachweis wurde unter Verwendung des TSA Direct Green Kits und unter Zugabe von p-Iodphenylborsäure (Formel 2) im Verhältnis von 20:1 (Gew./Gew.) zum Fluorescein-tyramid-Reagenz und unter Zugabe von NaCl zum Verdünnungsmittel in einer Endkonzentration von 2 M durchgeführt.
  • Die Objektträger wurden in TNT-Puffer gewaschen, mit Fixiermedium fixiert und mit einer Abdeckung bedeckt.
  • 2A zeigt die Ergebnisse eines standardmäßigen CARD-Nachweises unter Verwendung von Fluorescein-tyramid. 2B zeigt die Ergebnisse eines mit einer organischen Verbindung verstärkten CARD-Nachweises unter Verwendung von Fluorescein-tyramid. 2C zeigt die Ergebnisse eines mit einer organischen Verbindung und einem Salz verstärkten CARD-Nachweises unter Verwendung von Fluorescein-tyramid. Es besteht ein signifikanter Unterschied zwischen dem standardmäßigen und dem mit einer organischen Verbindung verstärkten Fluorescein-Nachweis (2A im Vergleich mit 2B), woraus sich der verbesserte Nachweis ergibt. Ferner ergibt sich eine unerwartete und sehr erhebliche Verbesserung durch die Zugabe eines Salzes bei dem mit einer organischen Verbindung verstärkten Fluorescein-Nachweis (2B im Vergleich mit 2C). Ein Vergleich der Unterschiede zwischen der Verstärkung mit der organischen Verbindung und dem Salz und der Verwendung des Cyanin-3-tyramid-Substrats (Beispiel 1) und des Fluorescein-tyramid-Substrats in diesem Beispiel belegt, dass die Ergebnisse der Verstärkungswirkung nicht vorhersagbar und unerwartet sind.
  • Beispiel 3
  • Nachweis der verstärkten katalysierten Reporterabscheidung (CARD) unter Verwendung von Biotinyltyramid
  • Objektträger mit humanen Prostata-Gewebeschnitten (Dako) wurden deparaffiniert und 30 Minuten mit TNB-Blockierpuffer (TSA Indirect Kit, NEN Life Science Products) blockiert. Kaninchen-antihuman-Prostata-spezifisches Antigen (Dako), das in TNB-Puffer 1/100 000 verdünnt war, wurde 1 Stunde bei Raumtemperatur inkubiert. Die Objektträger wurden in TNT-Puffer (TSA Indirect Kit) gewaschen und sodann mit anti-Kaninchen-IgG-HRP-Konjugat (Roche), das in TNB-Puffer 1/1 000 verdünnt war, 1 Stunde bei Raumtemperatur inkubiert.
  • Ein standardmäßiger CARD-Nachweis wurde unter Verwendung des TSA-Indirekt-Kits, bei dem Biotinyltyramid verwendet wird, durchgeführt. Ein mit einer organischen Verbindung und einem Salz verstärkter CARD-Nachweis wurde unter Verwendung des TSA-Indirekt-Kits durchgeführt, wobei N-(5-Hydroxypentyl)-3-(p-hydroxyphenyl)-propionamid (Strukturformel 1) in einem Verhältnis von 20:1 (Gew./Gew.) zum Biotinyltyramid-Reagenz gegeben wurde und NaCl zum Verdünnungsmittel in einer Endkonzentration von 2 M zugesetzt wurde. Die Objektträger wurden in TNT-Puffer gewaschen. Streptavidin-HRP (TSA Indirekt-Kit), das in TNB-Puffer 1/100 verdünnt worden war, wurde 30 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert. Die Objektträger wurden in TNT-Puffer gewaschen und mit Diaminobenzidin (NEN Life Science Products) versetzt und 3 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert. Sodann wurden die Objektträger gewaschen und mit Hämatoxylin gegengefärbt. Anschließend wurden die Objektträger mit Wasser, phosphatgepufferter Kochsalzlösung und Wasser gewaschen, dehydratisiert und fixiert.
  • 3A zeigt die Ergebnisse eines standardmäßigen CARD-Nachweises unter Verwendung von Biotinyltyramid. 3B zeigt die Ergebnisse eines mit einer organischen Verbindung und einem Salz verstärkten CARD-Nachweises unter Verwendung von Biotinyltyramid. Es besteht ein auffallender Unterschied zwischen dem standardmäßigen und dem verstärkten Biotinyltyramid-Nachweis (3A im Vergleich mit 3B), woraus der verbesserte Nachweis hervorgeht.

Claims (19)

  1. Verfahren zum Verbessern der Umwandlung eines Phenolsubstrats in ein Produkt mittels eines Peroxidaseenzyms, wobei das Verfahren folgende Stufen umfasst: Umsetzen eines Konjugats, das ein erfassbares markiertes Phenol enthält, mit einem Peroxidaseenzym in Gegenwart eines Verbesserungsmittels, das (a) ein anorganisches Salz oder Ammoniumacetat oder Natriumacetat, (b) eine organische Verbindung der Formel
    Figure 00180001
    worin X die Gruppe B(OH)2 bedeutet und Y entweder I oder, wenn X die Gruppe OH darstellt, ein Halogen oder den Rest Q-R bedeutet, worin Q eine gerade oder verzweigte 1-12-Heteroatomalkylkette darstellt, wobei die Heteroatome aus der Gruppe ausgewählt sind, die im wesentlichen aus N, O und S besteht, sowie die Bindungen, welche die Heteroatomalkylkette verbinden, Einfach- oder Doppelbindungen sind und irgendein Kohlenstoffatom in der Heteroatomalkylkette gegebenenfalls einen Substituenten aufweist, der aus der Gruppe ausgewählt ist, die im wesentlichen aus -OH, -COOH, -NH2 und -SH besteht, sowie R aus der Gruppe ausgewählt ist, die im wesentlichen aus -OH, -COOH, -NH2 und -CH3 besteht, oder Gemische aus (a) und (b) enthält.
  2. Verfahren nach Anspruch 1, worin das anorganische Salz aus der Gruppe ausgewählt ist, die im wesentlichen aus NaCl, MgCl2, KCl und CaCl2, Natriumphosphat und Ammoniumsulfat besteht.
  3. Verfahren nach Anspruch 1, worin die Reaktionsstufe sowohl das anorganische Salz als auch die organische Verbindung beinhaltet.
  4. Verfahren nach Anspruch 1, worin das Peroxidaseenzym Meerrettichperoxidase ist.
  5. Verfahren nach Anspruch 1, worin die Konzentration des anorganischen Salzes größer als etwa 0,5 m ist.
  6. Verfahren nach Anspruch 1, worin die Konzentration des anorganischen Salzes im Bereich von etwa 0,5 m bis zur Sättigung liegt.
  7. Verfahren nach Anspruch 6, worin die Konzentration des anorganischen Salzes im Bereich von etwa 2 m bis zur Sättigung liegt.
  8. Verfahren nach Anspruch 1, worin die Konzentration der organischen Verbindung im Bereich von etwa 1 × 10–7 m bis 1 × 10–3 m liegt.
  9. Verfahren nach Anspruch 8, worin die Konzentration der organischen Verbindung im Bereich von etwa 1 × 10–6 m bis 1 × 10–4 m liegt.
  10. Verfahren nach Anspruch 1, worin die Konjugate eine Tyraminverbindung, p-Hydroxyzimtsäure oder Derivate hiervon beinhalten.
  11. Set für eine katalysierte Reporterabscheidung oder eine Tyramidsignalverstärkung, das folgende Merkmale aufweist: Einen Peroxidaseenzymkatalysator; ein Konjugat, das ein erfassbares markiertes Phenolsubstrat enthält; und mindestens ein Verbesserungsmittel zum Verbessern der Umwandlung des Phenolsubstrats in ein Produkt, wobei das Verbesserungsmittel (a) ein anorganisches Salz oder Ammoniumacetat oder Natriumacetat, (b) eine organische Verbindung der Formel
    Figure 00200001
    worin X die Gruppe B(OH)2 bedeutet und Y entweder I oder, wenn x die Gruppe OH darstellt, ein Halogen oder den Rest Q-R bedeutet, worin Q eine gerade oder verzweigte 1-12-Heteroatomalkylkette darstellt, wobei die Heteroatome aus der Gruppe ausgewählt sind, die im wesentlichen aus N, O, S besteht, sowie die Bindungen, welche die Heteroatomalkylkette verbinden, Einfach- oder Doppelbindungen sind und irgendein Kohlenstoffatom in der Heteroatomalkylkette gegebenenfalls einen Substituenten aufweist, der aus der Gruppe ausgewählt ist, die im wesentlichen aus -OH, -COOH, -NH2 und -SH besteht, sowie R aus der Gruppe ausgewählt ist, die im wesentlichen aus -OH, -COOH, -NH2 und -CH3 besteht, oder Gemische aus (a) und (b) enthält.
  12. Set nach Anspruch 11, worin das anorganische Salz aus der Gruppe ausgewählt ist, die im wesentlichen aus NaCl, MgCl2, KCl und CaCl2, Natriumphosphat und Ammoniumsulfat besteht.
  13. Set nach Anspruch 11, worin das Peroxidaseenzym Meerrettichperoxydase ist.
  14. Set nach Anspruch 11, worin das markierte Phenolsubstrat eine Tyraminverbindung, p-Hydroxyzimtsäure oder Derivate hiervon sind.
  15. Verbindung der Formel
    Figure 00210001
    worin R1 die Gruppe -CH2OH oder -COOH sowie n die Zahl 4, 5 oder 7 bedeuten.
  16. Verbindung nach Anspruch 15, worin R1 die Gruppe -CH2OH bedeutet.
  17. Verbindung nach Anspruch 15, worin n die Zahl 4 und R1 die Gruppe -CH2OH bedeuten.
  18. Verbindung nach Anspruch 15, worin n die Zahl 5 und R1 die Gruppe -CH2OH bedeuten.
  19. Verbindung nach Anspruch 15, worin n die Zahl 7 und R1 die Gruppe -COOH bedeuten.
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