ES2237184T3 - Deposicion catalizada de mensajeros potenciada. - Google Patents
Deposicion catalizada de mensajeros potenciada.Info
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Abstract
Un método para potenciar la conversión de un sustrato fenólico en un producto por una enzima peroxidasa, comprendiendo dicho método las etapas de: hacer reaccionar un conjugado que comprende un fenol marcado de manera detectable con una enzima peroxidasa en presencia de un reactivo potenciador, comprendiendo el reactivo potenciador (a) una sal inorgánica o acetato amónico o acetato sódico, (b) un compuesto orgánico que tiene la fórmula en la que cuando X es B(OH)2, Y es I; o en la que cuando X es OH, Y es un halógeno ó Q-R, en el que Q es una cadena alquílica heteroatómica de 1-12 átomos de carbono, lineal o ramificada, en la que los heteroátomos se pueden seleccionar del grupo consistente esencialmente en N, O y S, en la que los enlaces que conectan la cadena alquílica heteroatómica son simples o dobles, en la que cualquier átomo de carbono en la cadena alquílica heteroatómica incluye opcionalmente un sustituyente seleccionado del grupo consistente esencialmente en -OH, -COOH, -NH2 y -SH,y en la que R se selecciona del grupo consistente esencialmente en -OH, -COOH, -NH2 y -CH3; o mezclas de (a) y (b).
Description
Deposición catalizada de mensajeros
potenciada.
Esta invención se refiere a ensayos enzimáticos,
y más particularmente a potenciar la reactividad de la peroxidasa
para el uso en deposición catalizada de mensajeros.
La peroxidasa, a causa de su alta velocidad de
recambio, buena estabilidad y disponibilidad, se usa ampliamente en
métodos analíticos basados en enzimas. Por ejemplo, la peroxidasa de
rábano picante (PRP) (EC 1.11.1.7) cataliza la oxidación de una
gran variedad de sustratos donadores de hidrógeno con la hidrógeno
peroxidasa. La PRP es también una de las enzimas preferidas para el
uso en deposición catalizada de mensajeros.
La deposición catalizada de mensajeros (DCAM) es
un método nuevo de amplificación de señal que constituye el tema de
las Patentes U.S. Nos. 5.863.748, 5.688.966, 5.767.287, 5.731.158,
5.583.001 y 5.196.306. También se discute en Bobrow et al.,
Journal of Immunological Methods, 125:
279-285 (1989) y en Bobrow et al.,
Journal of Immunological Methods, 137:
103-112 (1991).
El método utiliza un sistema de activación
enzimática dependiente del analito ("SAEDA") para catalizar la
deposición de una marca detectable sobre la fase sólida de una
plataforma de ensayo. Estas marcas depositadas enzimáticamente se
pueden detectar directamente o indirectamente, y dan como resultado
una amplificación de la señal y unos límites de detección
mejorados. En una realización preferida, la enzima es PRP.
La PRP reacciona con un conjugado que consiste en
un sustrato marcado de manera detectable, específico para el SAEDA.
Cuando el SAEDA y el conjugado reaccionan, se forma un conjugado
activado que se deposita covalentemente donde esté inmovilizado un
sitio receptor para el conjugado activado.
Para el uso analítico, se ha usado la oxidación
de sustratos por PRP para generar productos que se vuelven
coloreados, fluorescentes o quimioluminiscentes. Estos productos
bien permanecen solubles o bien se hacen insolubles y precipitan en
la fase sólida. El método DCAM difiere a este respecto, ya que los
productos del sustrato fenólico marcado de manera detectable llegan
a unirse covalentemente a la fase sólida.
Para mejorar los límites de detección en los
métodos analíticos, se desea incrementar o potenciar la conversión
sustrato a producto por enzimas. Aunque no se ha descubierto una
sustancia que potencie la catálisis PRP independientemente del
sustrato usado, se han descrito varios potenciadores específicos
para sustratos de la PRP que forman productos solubles. Se ha
descrito un potenciador específico para el sustrato
diaminobencidina, que forma un producto insoluble. No se han
descrito potenciadores para sustratos que, por la actividad
catalítica de la PRP, formen productos covalentemente
depositables.
J. R. Whitaker y A. L. Tappel, Biochimica et
Biophysica Acta, páginas 310-317, Vol. 62,
1962, muestran que el KCl, NaCl, Na_{2}SO_{4} y, en menor
extensión, el LiCl, potencian la oxidación del guayacol.
La Patente U.S. Nº 4.598.044, expedida a Kricka
et al. el 1 de Julio de 1986, describe la potenciación de la
oxidación catalizada por PRP del sustrato,
2,3-dihidro-1,4-ftalazinadiona,
que forma un producto soluble quimioluminiscente, por diversos
compuestos fenólicos.
La Patente U.S. Nº 4.729.950, expedida a Kricka
et al. el 1 de Julio de 1986, describe la potenciación de la
oxidación catalizada por PRP del sustrato,
2,3-dihidro-1,4-ftalazinadiona,
por diversos compuestos aminados aromáticos. Las Tablas 1 y 2
resumen diversas combinaciones sustrato/potenciador. Las Tablas y la
discusión (de la columna 3, línea 67, a la columna 4, línea 34)
conducen a la conclusión de que no es predecible el que una
oxidación de un sustrato catalizada por PRP será potenciada por un
compuesto dado.
La Patente U.S. Nº 5.629.168, expedida a Kricka
el 13 de Mayo de 1997, describe la potenciación de la oxidación
catalizada por PRP del sustrato,
2,3-dihidro-1,4-ftalazinadiona,
por compuestos aromáticos de organoboro.
La Patente U.S. Nº 4.521.511, expedida a Stout el
4 de Junio de 1985, describe la potenciación de la oxidación
cata-
lizada por PRP del sustrato ácido 2,2'-azino-di(3-etil-benzotiazolona-6-sulfónico) por diversos compuestos fenólicos.
lizada por PRP del sustrato ácido 2,2'-azino-di(3-etil-benzotiazolona-6-sulfónico) por diversos compuestos fenólicos.
W. Straus, Journal of Histochemistry and
Cytochemistry, Vol. 30, páginas 491-493, 1982,
muestra que el imidazol potencia la oxidación catalizada por PRP de
la diaminobencidina, que forma un producto insoluble.
A. S. H. de Jong et al., Histochemical
Journal, Vol 17, páginas 1119-1130, 1985,
muestran también que el imidazol potencia la oxidación de la
diaminobencidina en aproximadamente cuatro veces, de una combinación
de un sustrato de
p-fenilendiamina-pirocatecol en dos
veces, y no tiene efecto en el sustrato
4-cloro-1-naftol,
todos los cuales forman productos insolubles.
Los potenciadores mencionados anteriormente, con
la excepción del imidazol, sólo potencian la conversión de
sustratos solubles en productos solubles. Además, los potenciadores
son específicos al sustrato. La potenciación por KCl, NaCl,
Na_{2}SO_{4} y LiCl de la oxidación del guayacol es específica
para el guayacol. Estas sales no potencian la oxidación de
sustratos que forman productos insolubles ni potencian la oxidación
de sustratos usados comúnmente que forman productos solubles, tales
como la ortofenilendiamina o la tetramentilbencidina. Los
potenciadores para la
2,3-dihidro-1,4-ftalazinadiona
tampoco potencian la oxidación de sustratos que forman productos
insolubles ni potencian la oxidación de sustratos usados comúnmente
que forman productos solubles, tales como la ortofenilendiamina o la
tetramentilbencidina. El imidazol, que se ha demostrado que
potencia la oxidación de la diaminobencidina, tiene un efecto
marginal en el
p-fenilendiamina-pirocatecol, ningún
efecto en el
4-cloro-1-naftol, y
ningún efecto en sustratos que forman productos depositables
covalentemente. No se puede predecir el que la oxidación por PRP de
un sustrato dado será potenciada por un compuesto dado.
Por consiguiente, sería ventajoso y deseable
tener reactivos para potenciar la catálisis de la PRP, y tener un
efecto de potenciación mayor que el que se esperaría basándose en
la tecnología previa.
La presente invención se refiere a potenciar la
catálisis de la PRP en un método de Deposición Catalizada de
Mensajeros (DCAM) haciendo reaccionar un conjugado que comprende un
fenol marcado de manera detectable con una enzima peroxidasa, en el
que la reacción se lleva a cabo en presencia de un reactivo
potenciador que incluye (a) al menos una sal inorgánica, (b) un
compuesto orgánico potenciador que tiene la siguiente estructura, o
mezclas tanto de (a) como (b)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
en la que cuando X es
B(OH)_{2}, Y es I; o en la que cuando X es OH, Y es
un halógeno ó Q-R, en el que Q es una cadena
alquílica heteroatómica de 1-12 átomos de carbono,
lineal o ramificada, en la que los heteroátomos se pueden
seleccionar entre N, O y S, en la que los enlaces que conectan la
cadena alquílica son simples o dobles, en la que cualquier carbono
en la cadena alquílica incluye opcionalmente un sustituyente
seleccionado entre -OH, -COOH, -NH_{2} y -SH, y en la que R se
selecciona entre -OH, -COOH, -NH_{2} y
-CH_{3}.
Serán fácilmente apreciables otras ventajas de la
presente invención cuando la misma se llegue a entender mejor por
referencia a la siguiente descripción detallada, cuando se
considere en relación con los dibujos acompañantes, en los que:
Las Figuras 1A-C son fotografías
que ilustran los resultados de la detección potenciada por
Deposición Catalizada de Mensajeros (DCAM), en las que (A) es una
fotografía que ilustra los resultados de la detección DCAM normal
usando cianina 3 tiramida, (B) es una fotografía que ilustra los
resultados de la detección DCAM potenciada por orgánicos usando
cianina 3 tiramida, y (C) es una fotografía que ilustra los
resultados de la detección DCAM potenciada por orgánicos y sales
usando cianina 3 tiramida.
Las Figuras 2A-C son fotografías
que ilustran la detección por Deposición Catalizada de Mensajeros
(DCAM) usando fluoresceína tiramida, en las que (A) ilustra los
resultados de la detección DCAM normal usando fluoresceína tiramida,
(B) ilustra los resultados de la detección DCAM potenciada por
orgánicos usando fluoresceína tiramida, y (C) muestra los
resultados de la detección DCAM potenciada por orgánicos y sales
usando fluoresceína tiramida; y
Las Figuras 3A-B ilustran la
detección potenciada por Deposición Catalizada de Mensajeros (DCAM)
usando biotiniltiramida, en la que (A) muestra los resultados de la
detección DCAM normal usando biotiniltiramida, y (B) muestra los
resultados de la detección DCAM potenciada por orgánicos y sales
usando biotiniltiramida.
La presente invención se refiere a potenciar la
catálisis de PRP en un método DCAM o de amplificación de señal por
tiramida (AST), haciendo reaccionar un conjugado que comprende un
fenol marcado de manera detectable con una enzima peroxidasa, en el
que la reacción se lleva a cabo en presencia de un reactivo
potenciador que incluye al menos una sal inorgánica tal como NaCl,
MgCl_{2}, KCl, CaCl_{2}, fosfato sódico y sulfato amónico, o
acetato sódico o acetato amónico, un compuesto orgánico potenciador
o mezclas de ambos reactivos potenciadores inorgánico y
orgánico.
\newpage
Los compuestos orgánicos útiles como reactivos
potenciadores son de la estructura
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
en la que cuando X es
B(OH)_{2}, Y es I; ó en la que cuando X es OH, Y es
un halógeno ó Q-R, en el que Q es una cadena
alquílica heteroatómica de 1-12 átomos de carbono,
lineal o ramificada, en la que los heteroátomos se pueden
seleccionar entre N, O y S, en la que los enlaces que conectan la
cadena alquílica son simples o dobles, en la que cualquier carbono
en la cadena alquílica incluye opcionalmente un sustituyente
seleccionado entre -OH, -COOH, -NH_{2} y -SH, y en la que R se
selecciona entre -OH, -COOH, -NH_{2} y
-CH_{3}.
En términos generales, la concentración del
reactivo inorgánico potenciador varía desde aproximadamente 0,1 M
hasta la saturación. La concentración del reactivo potenciador
inorgánico es al menos aproximadamente 0,5 M. Lo más
preferiblemente, la concentración del reactivo inorgánico
potenciador varía desde aproximadamente al menos 2 M hasta la
saturación.
La concentración del reactivo orgánico
potenciador varía preferiblemente entre aproximadamente 1 x
10^{-7} M y 1 x 10^{-3} M. Más preferiblemente, la
concentración del reactivo orgánico potenciador varía desde
aproximadamente 1 x 10^{-6} M hasta 1 x 10^{-4}M. Los reactivos
potenciadores orgánicos preferidos incluyen compuestos de las
estruc-
turas
turas
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
Para el uso con reactivos no fluorescentes,
es el potenciador más preferido.
Cuando se utiliza un sustrato
fluorescente,
es el potenciador más
preferido.
Como se usa en la presente memoria, el término
conjugado significa un fenol marcado de manera detectable que es un
sustrato para la enzima PRP. Los conjugados preferidos incluyen
compuestos de tiramida, ácido p-hidroxicinámico y
derivados suyos. El conjugado, por consiguiente, comprende dos
componentes. Un componente es el resto de fenol, que sirve como
sustrato para la enzima. El otro componente es la marca
detectable.
Como se usa en la presente memoria, marcado de
manera detectable significa que el sustrato puede ser acoplado bien
a un mensajero o bien a un primer miembro sin marcar de un par de
unión específica. Cuando el sustrato es acoplado a un miembro sin
marcar de un par de unión específica, después de la unión covalente
del conjugado activado, el complejo sustrato-par de
unión específica se hace reaccionar con el segundo miembro del par
de unión, que está acoplado a un mensajero.
Como se usa en la presente memoria, el término
sitio receptor significa un sitio en el que el conjugado activado
se unirá a la superficie mediante la formación de un enlace
covalente. Los ejemplos de composiciones de sitios receptores para
sustratos fenólicos incluyen residuos tirosínicos de proteínas,
fenol y otras moléculas orgánicas ricas en electrones. Los sitios
receptores pueden ser componentes reactivos de la superficie de un
soporte sólido o pueden ser añadidos a la superficie del soporte
sólido.
Como se usa en la presente memoria, el término
conjugado activado significa que el conjugado ha sido preparado
para unirse al sitio receptor.
Como se usa en la presente memoria, el término
halógeno incluye cloro, flúor, bromo y yodo.
Como se usa en la presente memoria, el término
alquilo significa una cadena hidrocarbonada lineal o ramificada.
Los ejemplos representativos de grupos alquílicos son el metilo,
etilo, propilo, isopropilo, isobutilo, butilo,
terc-butilo, sec-butilo, pentilo y
hexilo.
Como se usa en la presente memoria, el término
heteroátomo es oxígeno, nitrógeno y azufre.
Los miembros de pares de unión específica
adecuados para su uso en la práctica de la invención pueden ser de
tipo inmune o no inmune. Los pares de unión específica inmunes se
ejemplifican por sistemas antígeno/anticuerpo o sistemas
hapteno/antihapteno. El miembro anticuerpo, ya sea policlonal,
monoclonal o un fragmento inmunorreactivo suyo, del par de unión, se
puede producir por métodos habituales, familiares a los expertos en
la técnica. Los términos fragmento de anticuerpo inmunorreactivo o
fragmento inmunorreactivo significan fragmentos que contienen la
zona de unión del anticuerpo. Tales fragmentos pueden ser fragmentos
de tipo Fab, que se definen como fragmentos desprovistos de la
parte Fc, p. ej., fragmentos Fab, Fab' y F(ab')2, o pueden
ser los llamados fragmentos hemimoeculares, obtenidos por escisión
reductora de los enlaces disulfuro que conectan los componentes de
la cadena principal del anticuerpo intacto. Si el miembro antígeno
del par de unión específica no es inmunogénico, p. ej., un hapteno,
se puede acoplar covalentemente a una proteína vehicular para
hacerlo inmunogénico.
Los pares de unión no inmunes incluyen sistemas
en los que los dos componentes comparten una afinidad natural el
uno por el otro pero no son anticuerpos. Son ejemplos de pares de
unión no inmunes la biotina-avidina o la
biotina-estreptavidina, la proteína de unión del
ácido fólico-folato, ácidos nucleicos sonda
complementarios, etc. También se incluyen pares de unión no inmunes
que forman un enlace covalente el uno con el otro. Los ejemplos de
pares de unión covalente incluyen grupos reactivos sulfhidrilo
tales como maleimidas, y derivados haloacetilados y grupos reactivos
amina, tales como isotiocianatos, ésteres succinimidílicos, haluros
sulfonílicos, y tintes acopladores tales como
3-metil-2-benzotiazolinona
hidrazona (MBTH) y ácido 3-(dimetil-amino) benzoico
(DMAB).
Como se usa en la presente memoria, el término
reactivo potenciador significa un reactivo que incrementa o acelera
la velocidad de unión del conjugado activado al sitio receptor. La
unión incrementada o acelerada del conjugado activado al sitio
receptor se verifica directa o indirectamente por la marca
detectable del conjugado.
La presente invención es sorprendente e
inesperada, a causa de la naturaleza molecular de los restos
potenciadores en relación al sustrato marcado de manera detectable.
Se requieren dos reacciones para permitir que el conjugado se una al
sitio receptor. Primero, la enzima peroxidasa cataliza la
oxidación, o activación del conjugado; en segundo lugar, el
conjugado activado reacciona con el sitio receptor, formando un
enlace covalente. Las estructuras de los potenciadores orgánicos se
prestan como sustratos para la PRP y/o sitios receptores para el
conjugado activado. Por consiguiente, se predeciría que estos
restos actuarían como inhibidores bien de la primera, la segunda, o
bien de ambas reacciones, más que potenciadores.
También es sorprendente que los potenciadores
inorgánicos y orgánicos de la presente invención, cuando se
combinan, son aditivos en su efecto de potenciación.
Se desparafinaron y bloquearon rodajas de tejido
de próstata humana (Dako Corp., Carpinteria, CA) durante treinta
minutos con Tampón bloqueante TNB (kit TSA Direct Cyanine 3, NEN
Life Science Products, Boston, MA). Se incubó antígeno específico
anti-próstata humana de conejo (Dako) diluido
1/40.000 en tampón TNB durante una hora a temperatura ambiente. Las
rodajas se lavaron en tampón TNT (kit TSA Direct Cyanine 3) y
después se incubaron con un conjugado IgG-PRP
anti-conejo (Roche Molecular Biochemicals,
Indianapolis, IN) diluido 1/1000 en tampón TNB durante una hora a
temperatura ambiente.
La detección normal por DCAM se realizó usando el
kit TSA Direct Cyanine 3. La detección por DCAM potenciada por
orgánicos se realizó usando el kit TSA Direct Cyanine 3 y añadiendo
ácido p-iodofenilborónico (estructura 2) en una
relación de 20:1 (peso/peso) al reactivo de cianina 3 tiramida. La
detección por DCAM potenciada por orgánicos y sales se realizó
usando el kit TSA Direct Cyanine 3, añadiendo ácido
p-iodofenilborónico (estructura 2) en una relación
de 20:1 (peso/peso) al reactivo de cianina 3 tiramida y añadiendo
NaCl al diluyente hasta una concentración final de 2 M.
Las rodajas se lavaron en tampón TNT, se montaron
con medio de montaje y un cubreobjetos.
La Figura 1A muestra los resultados de la
detección por DCAM normal usando cianina 3 tiramida. La Figura 1B
muestra los resultados de la detección por DCAM potenciada por
orgánicos usando cianina 3 tiramida. La Figura 1C muestra los
resultados de la detección por DCAM potenciada por orgánicos y sales
usando cianina 3 tiramida. Hay una diferencia muy drástica entre la
detección con cianina 3 normal y la potenciada por orgánicos (Fig.
1A comparada con la Fig. 1B), que muestra la detección mejorada.
Hay una mejora inesperada y significativa con la adición de sal a la
detección con cianina 3 potenciada por orgánicos (Fig. 1B comparada
con la Fig. 1C). La diferencia es más obvia cuando se ve
visualmente, comparado con fotográficamente.
Se desparafinaron y bloquearon rodajas de tejido
de próstata humana (Dako) durante treinta minutos con Tampón
Bloqueante TNB (kit TSA Direct Green, NEN Life Science Products).
Se incubó antígeno específico anti-próstata humana
de conejo (Dako) diluido 1/10.000 en tampón TNB durante una hora a
temperatura ambiente. Las rodajas se lavaron en tampón TNT (kit TSA
Direct Green) y después se incubaron con un conjugado
IgG-PRP anti-conejo (Roche) diluido
1/1000 en tampón TNB durante una hora a temperatura ambiente.
La detección por DCAM normal se realizó usando el
kit TSA Direct Green, que utiliza fluoresceína tiramida. La
detección por DCAM potenciada por orgánicos se realizó usando el
kit TSA Direct Green y añadiendo ácido
p-iodofenilborónico (estructura 2) en una relación
de 20:1 (peso/peso) al reactivo de fluoresceína tiramida. La
detección por DCAM potenciada por orgánicos y sales se realizó
usando el kit TSA Direct Green, añadiendo ácido
p-iodofenilborónico (estructura 2) en una relación
de 20:1 (peso/peso) al reactivo de fluoresceína tiramida y
añadiendo NaCl al diluyente hasta una concentración final de 2
M.
Las rodajas se lavaron en tampón TNT, se montaron
con medio de montaje y un cubreobjetos.
La Figura 2A muestra los resultados de la
detección por DCAM normal usando fluoresceína tiramida. La Figura 2B
muestra los resultados de la detección por DCAM potenciada por
orgánicos usando fluoresceína tiramida. La Figura 1C muestra los
resultados de la detección por DCAM potenciada por orgánicos y sales
usando fluoresceína tiramida. Hay una diferencia significativa entre
la detección con fluoresceína normal y la potenciada por orgánicos
(Fig. 2A comparada con la Fig. 2B), que muestra la detección
mejorada. Hay una mejora inesperada y muy drástica con la adición
de sal a la detección con fluoresceína potenciada por orgánicos
(Fig. 2B comparada con la Fig. 2C). Comparando las diferencias
entre la potenciación por orgánicos y sal entre el sustrato de
cianina 3 tiramida (Ejemplo 1) y el sustrato de fluoresceína
tiramida en este ejemplo, se demuestra la falta de predictibilidad y
el resultado inesperado del efecto de potenciación.
Se desparafinaron y bloquearon rodajas de tejido
de próstata humana (Dako) durante treinta minutos con Tampón
Bloqueante TNB (kit TSA Indirect, NEN Life Science Products). Se
incubó antígeno específico anti-próstata humana de
conejo (Dako) diluido 1/100.000 en tampón TNB durante una hora a
temperatura ambiente. Las rodajas se lavaron en tampón TNT (kit TSA
Indirect) y después se incubaron con un conjugado
IgG-PRP anti-conejo (Roche) diluido
1/1000 en tampón TNB durante una hora a temperatura ambiente.
La detección por DCAM normal se realizó usando el
kit TSA Indirect, que utiliza biotiniltiramida. La detección por
DCAM potenciada por orgánicos y sales se realizó usando el kit TSA
Indirect, añadiendo
N-(5-hidroxipentil)-3-(p-
hidroxifenil)propionamida (estructura 1) en una relación de
20:1 (peso/peso) al reactivo de biotiniltiramida, y añadiendo NaCl
al diluyente hasta una concentración final de 2 M. Las rodajas se
lavaron en tampón TNT, y se incubó
Estreptavidina-PRP (kit TSA Indirect) diluida 1/100
en tampón TNB durante treinta minutos a temperatura ambiente. Las
rodajas se lavaron en tampón TNT y se añadió diaminobencidina (NEN
Life Science Products) y se incubaron durante tres minutos a
temperatura ambiente. Las rodajas se lavaron con agua, y se les
hizo una tinción inversa con Hematoxilina. Las rodajas se lavaron
después con agua, suero salino tamponado con fosfato, agua, se
deshidrataron y se montaron.
La Figura 3A muestra los resultados de la
detección por DCAM normal usando biotiniltiramida. La Figura 2B
muestra los resultados de la detección por DCAM potenciada por
orgánicos y sales usando biotiniltiramida. Hay una diferencia
acusada entre la detección con biotiniltiramida normal y la
potenciada (Fig. 3A comparada con la Fig. 3B), que muestra la
detección mejorada.
Claims (19)
1. Un método para potenciar la conversión de un
sustrato fenólico en un producto por una enzima peroxidasa,
comprendiendo dicho método las etapas de:
hacer reaccionar un conjugado que comprende un
fenol marcado de manera detectable con una enzima peroxidasa en
presencia de un reactivo potenciador, comprendiendo el reactivo
potenciador (a) una sal inorgánica o acetato amónico o acetato
sódico, (b) un compuesto orgánico que tiene la fórmula
en la que cuando X es
B(OH)_{2}, Y es I; o en la que cuando X es OH, Y es
un halógeno ó Q-R, en el que Q es una cadena
alquílica heteroatómica de 1-12 átomos de carbono,
lineal o ramificada, en la que los heteroátomos se pueden
seleccionar del grupo consistente esencialmente en N, O y S, en la
que los enlaces que conectan la cadena alquílica heteroatómica son
simples o dobles, en la que cualquier átomo de carbono en la cadena
alquílica heteroatómica incluye opcionalmente un sustituyente
seleccionado del grupo consistente esencialmente en -OH, -COOH,
-NH_{2} y -SH, y en la que R se selecciona del grupo consistente
esencialmente en -OH, -COOH, -NH_{2} y -CH_{3}; o mezclas de
(a) y
(b).
2. El método según la reivindicación 1, en el que
la sal inorgánica se selecciona del grupo consistente esencialmente
en NaCl, MgCl_{2}, KCl y CaCl_{2}, fosfato sódico, y sulfato
amónico.
3. El método según la reivindicación 1, en el que
dicha etapa de reacción incluye tanto la sal inorgánica como el
compuesto orgánico.
4. El método según la reivindicación 1, en el que
la enzima peroxidasa es peroxidasa de rábano picante.
5. El método según la reivindicación 1, en el que
la concentración de la sal inorgánica es mayor que alrededor de 0,5
M.
6. El método según la reivindicación 1, en el que
la concentración de la sal inorgánica varía desde aproximadamente
0,5 M hasta la saturación.
7. El método según la reivindicación 6, en el que
la concentración de la sal inorgánica varía desde aproximadamente 2
M hasta la saturación.
8. El método según la reivindicación 1, en el que
la concentración del compuesto orgánico varía desde aproximadamente
1 x 10^{-7} M hasta 1 x 10^{-3} M.
9. El método según la reivindicación 8, en el que
la concentración del compuesto orgánico varía desde aproximadamente
1 x 10^{-6} M hasta 1 x 10^{-4} M.
10. El método según la reivindicación 1, en el
que los conjugados incluyen un compuesto de tiramina, ácido
p-hidroxicinámico, o derivados suyos.
11. Un kit para la deposición catalizada del
mensajero o la amplificación de señal por tiramida, comprendiendo
dicho kit:
un catalizador enzimático de peroxidasa;
un conjugado que comprende un sustrato fenólico
marcado de manera detectable; y
al menos un reactivo potenciador para potenciar
la conversión del sustrato fenólico en un producto, comprendiendo
dicho reactivo potenciador (a) una sal inorgánica o acetato amónico
o acetato sódico, (b) un compuesto orgánico que tiene la
fórmula
en la que cuando X es
B(OH)_{2}, Y es I, o en la que cuando X es OH, Y es
un halógeno ó Q-R, en el que Q es una cadena
alquílica heteroatómica 1-12 lineal o ramificada,
en la que los heteroátomos se seleccionan del grupo consistente
esencialmente en N, O y S, en la que los enlaces que conectan la
cadena alquílica heteroatómica son simples o dobles, en la que
cualquier átomo de carbono en la cadena alquílica heteroatómica
incluye opcionalmente un sustituyente seleccionado del grupo
consistente esencialmente en -OH, -COOH, -NH_{2} y -SH, y en la
que R se selecciona del grupo consistente esencialmente en -OH,
-COOH, -NH_{2} y -CH_{3}; o mezclas de (a) y
(b).
12. Un kit según la reivindicación 11, en el que
la sal inorgánica se selecciona del grupo consistente esencialmente
en NaCl, MgCl_{2}, KCl y CaCl_{2}, fosfato sódico y sulfato
amónico.
13. Un kit según la reivindicación 11, en el que
dicha enzima peroxidasa es peroxidasa de rábano picante.
14. Un kit según la reivindicación 11, en el que
dicho sustrato fenólico marcado es un compuesto de tiramida, ácido
p-hidroxicinámico o derivados de ellos.
15. Un compuesto que tiene la fórmula:
en la que R^{1} es -CH_{2}OH,
-COOH, y n es 4, 5 ó
7.
16. Un compuesto según la reivindicación 15, en
el que R^{1} es -CH_{2}OH.
17. Un compuesto según la reivindicación 15, en
el que n es 4 y R^{1} es -CH_{2}OH.
18. Un compuesto según la reivindicación 15, en
el que n es 5 y R^{1} es -CH_{2}OH.
19. Un compuesto según la reivindicación 15, en
el que n es 7 y R^{1} es -COOH.
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