DE2656155A1

DE2656155A1 - Maleinimidobenzoesaeure-n-hydroxysuccinimidester und ihre verwendung zur enzymmarkierung von antigenen

Info

Publication number: DE2656155A1
Application number: DE19762656155
Authority: DE
Inventors: Tsunehiro Kitagawa
Original assignee: Dainippon Pharmaceutical Co Ltd
Current assignee: Dainippon Pharmaceutical Co Ltd
Priority date: 1975-12-12
Filing date: 1976-12-10
Publication date: 1977-06-23
Also published as: DE2656155C2; FR2334954B1; JPS556193B2; GB1570533A; JPS5272284A; FR2334954A1; US4150033A; GB1570532A; US4214048A

Description

"Maleinimidobenzoesäure-N-hydroxysuccinimidester und ihre "Ver-.. wendung zur Enzymmarkierung von Antigenen"

Priorität: 12. Dezember 1975, Japan, Nr. 148 787/1975

Die Erfindung betrifft Maleinimidobenzoesäure-N-hydroxysuccinimidester (im folgenden auch mit MBS abgekürzt) der allgemeinen

Formel I . ·

COO-N

(D

Diese Verbindungen sind wertvolle Reagenzien zur Bindung von Enzymen an Antigene. Somit betrifft die Erfindung auch -Enzymmarkierte Antigene der allgemeinen Formel II

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ΌΟΝΗ-

(II)

in der X und Y verschiedene Bedeutungen haben und jeweils ein Enzym oder ein Antigen bedeuten. Schließlich betrifft die Erfindung auch ein enzymimmunologisches Verfahren unter Verwendung der vorgenannten enzymmarkierten Antigene sowie Testpackungen, die die enzymmarkierten Antigene enthalten.

Unter enzymimmunologischen Verfahren sind alle Verfahren zu verstehen, bei denen enzymmarkierte Antigene für Antigen-AntikörperReaktionen eingesetzt werden.

Das erfindungsgemäße enzymimmunologische Verfahren wird im allgemeinen so durchgeführt, daß man ein enzymmarkiertes Antigen, ein nicht markiertes Antigen (d.h. die zu bestimmende Substanz) und einen Antikörper in einer Pufferlösung einer kompetitiven Antigen-Äntikörper-Reaktion unterwirft, das enzymmarkierte, an den Antikörper gebundene Antigen abtrennt und das freie enzymmarkierte Antigen (d.h. enzymmarkiertes. Antigen, an das kein Antikörper gebunden ist) abtrennt und die Menge an markiertem Antigen (d.h. die zu bestimmende Substanz) aus der enzymatischen Aktivität des an den Antikörper gebundenen, enzymmarkierten Antigens oder des freien enzymmarkierten Antigens bestimmt.

Derartige Verfahren sind an sich bekannt und beispielsweise in

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den US-PSen 3 654- 090, 3 839 153 und 3 850 752 beschrieben.

Jedoch haben die zur Durchführung von enzymimmunologischen Bestimmungen verwendeten, bekannten enzymmarkierten Antigene bestimmte Nachteile. Beispielsweise werden die herkömmlichen enzymiaarkierten Antigene hergestellt, indem man das Enzym und das Antigen unter· Verwendung der folgenden, nicht selektiven, bifunktionellen Bindungsmittel aneinander bindet:

COOH COOH JJO, '~

(CH₂)

CHO CHO

O=C=N

iT=C=O

O₂Cl

SO₂Cl

Diese Bindungsmittel enthalten zwei gleiche funktionelle Gruppen, so daß bei ihrem Einsatz zur Bindung von Enzym und Antigen unerwünschte Nebenprodukte, wie Antigen-Antigen-Komplexe und/oder Enzym-Enzym-Komplexe neben dem gewünschten Enzym-Antigen-Komplex (d.h. dem enzymmarkierten Antigen) entstehen. Demgemäß ist es schwierig, das gewünschte Änzymmarkierte Antigen aus dem Gemisch dieser drei Produkte zu isolieren. Insbesondere verursacht die Anwesenheit von Enzym-Enzym-Komplexen Störungen bei enzymimmunologischen Bestimmungen.

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Aufgabe der Erfindung ist es, verbesserte Bindungsmittel zur Verfugung zu stellen, mit denen Enzyme und Antigene selektiv aneinander gebunden werden können.

Es wurde erfindungsgemäß festgestellt, daß die Ester der allgemeinen Formel I in der Lage sind, unter sehr milden Bedingungen Enzyme und Antigene selektiv aneinander zu binden. Ferner wurde festgestellt, daß sich unter Verwendung von MBS hergestellte enzymmarkierte Antigene gut in enzymimmunologischen Bestimmungen einsetzen lassen. Schließlich lassen sich unter Verwendung dieser enzymmarkierten Antigene auch wertvolle Testpackungen zur Durchführung von enzymimmunologischen Be st immungs verfahr en herstellen.

Erfindungsgemäß lassen sich Enzyme und Antigene selektiv unter Verwendung von MBS der allgemeinen Formel I aneinander binden. Auf diese Weise ergeben sich die gewünschten enzymmarkierten Antigene. In der Literatur sind zwar Verbindungen beschrieben, die strukturell mit MBS verwandt sind (vgl. Helvetica Chimica Acta, Bd. 58, (1975), S. 53I bis 541). Jedoch ist in dieser Literatursteile die Verwendung dieser Verbindungen für enzymimmunologische Verfahren nicht beschrieben.

Zur Herstellung einer Bindung zwischen einem Enzym und einem Antigen werden erfindungsgemäß folgende Reaktionen durchgeführt: (a) Umsetzung eines Antigens oder Enzyms, das eine Aminogruppe, aber keine Mercaptogruppen enthält, mit dem Esterrest von MBS

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unter Bildung eines Produkts der allgemeinen Formel III

CONH

(III)

in der X die vorstehende Bedeutung hat.

(b) Umsetzung des Produkts der allgemeinen Formel III mit einem Enzym oder Antigen, das eine Mercaptogruppe enthält und gegebenenfalls auch Aminogruppen aufweist, wobei der Maleinimidorest von MBS im Produkt der allgemeinen Formel III einer Additionsreaktion mit dem Enzym oder Antigen unter Bildung des enzymmarkierten Antigens der allgemeinen Formel II unterliegt.

Somit ist MBS ein ausgezeichnetes bifunktionelles Bindungsmittel von hoher Selektivität, mit dem Enzyme und Antigene in einer zweistufigen UmEetzung unter sehr milden Bedingungen aneinander gebunden werden können. Das erfindungsgemäße Bindungsmittel unterscheidet sich in seiner Bindungswirkung von den herkömmlichen Bindungsmitteln.

Als an das Enzym zu bindendes Antigen wird im allgemeinen die gleiche Substanz verwendet, die gemessen werden soll. Dafür kommen eine Reihe von Substanzen von hohem Molekulargewicht bis zu niederem Molekulargewicht in Frage, beispielsweise die sogenannten "Haptene".

Das in der ersten Stufe (a) verwendete Antigen enthält keine

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Mercaptogruppe, weist aber eine Aminogruppe oder eine in eine Aminogruppe umwandelbare Gruppe auf. Dabei kann die Aminogruppe im Antigen bereits ursprünglich enthalten sein oder aber auch nachträglich chemisch eingeführt werden. Spezielle Beispiele für Antigene, die ursprünglich eine Aminogruppe, aber keine Mercaptogruppe aufweisen, sind Hormone, wie Angiotensin I, Insulin, Jodthyronin und choriales Gonadotropin (HCG), Verbindungen mit einer Aminogruppe, die in ihrer chemischen Struktur teilweise der zu messenden Verbindung ähnlich sind, wie α,α¹-Diphenylpropylamin bei der Messung von Diphenylhydantoin, physiologische Amine, wie Serotonin, Enzyme mit Ausnahme des zur Markierung des Antigens verwendeten Enzyms, virusspezifische Antigene, wie Virus-Hepatitis B, Tumorantigene, wie Oc-S¹Otoprotein, Immunoglobuline, wie IgG und IgE. Beispiele für Antigene, die keine \ttercaptogruppe enthalten, in die aber eine Aminogruppe eingeführt werden kann, sind Haptene, wie Steroidhormone (z.B. östradiol).

In der ersten Reaktionsstufe (a) können alle Enzyme verwendet werden, die eine Aminogruppe aber keine Mercaptogruppe aufweisen. Vorzugsweise werden Enzyme verwendet, die sämtlichen oder einigen der nachstehend angegebenen Bedingungen genügen:

(1) Hohe Substratspezifität

(2) Hohe Stabilität unter den Bestimmungs- und Lagerungsbedingungen

(3) Hohe Löslichkeit

(4) Einfaches, empfindliches, rasches und billiges Bestimmungs-

verfahren

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(5) - Abwesenheit von biologischen Flüssigkeiten

(6) Es sind keine Substrate, Inhibitoren und Störfaktoren aus biologischen Flüssigkeiten vorhanden«

(7) Me biologische Aktivität bleibt nach'der chemischen Umsetzung zur Bindung mit dem Antigen erhalten.

Spezielle Beispiele für entsprechende Enzyme sind Peroxidase, Glucose-oxidase, alkalische Phosphatase und dergl.

In der zweiten Reaktionsstufe (b) können alle Enzyme verwendet werden, die eine Mercaptogruppe enthalten. Vorzugsweise genügen diese Enzyme sämtlichen oder einigen der vorstehend aufgeführten Verbindungen. Ein Beispiel dafür ist ß-D-Galactosidase. Es können auch andere Enzyme verwendet werden, in die eine Mercaptogruppe eingeführt wird. Die Einführung einer Mercaptogruppe in Enzyme läßt sich beispielsweise gemäß dem in Archives of Biochemistry and Biophysics, Bd. 96 (1962), S. 605 "bis 612, beschriebenen Verfahren durchführen.

Ferner können in der zweiten Stufe (b) Antigene verwendet werden, die ursprünglich bereits eine Mercaptogruppe aufweisen. Es können aber auch Antigene ohne Mercaptogruppen verwendet werden, in die sich auf chemischem Wege eine derartige Gruppe einführen läßt. Die Einführung von Mercaptogruppen in Protein- oder Peptid-Antigene läßt sich nach dem vorstehend angegebenen Verfahren durchführen. Bei Antigenen mit -S-S- Bindungen im Molekül, wie Insulin, kann die Mercaptogruppe durch Reduktion der -S-S- Bindung

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gebildet werden.

Gemäß einer bevorzugten Ausfuhrungsform der Erfindung wird ein Antigen, das eine Aminogruppe, aber keine Mercaptοgruppe enthält, in der ersten Stufe an MBS gebunden. Anschließend wird das erhaltene Produkt in der zweiten Stufe an ein Enzym mit einer Mercapto gruppe gebunden.

Insbesondere wird ein Antigen von vergleichsweise hohem Molekulargewicht wie Insulin oder Angiotensin, in der ersten Stufe an MBS gebunden. Anschließend wird· das erhaltene Produkt an ß-D-Galactosidase, die eine Merc apt ο gruppe enthält, gebunden.

Gemäß einer besonders bevorzugten Ausführungsform wird von den drei Positionsisomeren der Verbindungen der allgemeinen Formel I, d.h. die o-substituierte Verbindung (o-MBS), die m-substituierte Verbindung (m-MBS) und.die p-substituierte Verbindung (p-MBS), m-MBS verwendet, da es sich durch eine besondere Stabilität und eine ausgezeichnete Reaktivität mit der Aminogruppe auszeichnet. Ferner wird gemäß dieser besonders bevorzugten Ausfuhrungsform ein Antigen mit einem vergleichsweise hohen Molekulargewicht, wie Insulin oder Angiotensin, zunächst an m-MBS gebunden, wobei das erhaltene Produkt an ß-D-Galactosidase, das ursprünglich eine Mercaptogruppe enthält, gebunden wird.

Die Reaktion gemäß der ersten und zweiten Stufe kann durchgeführt werden, indem man die Bestandteile in einem Puffer (pH-Wert

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6 bis 8) bei 10 bis 40⁰C, vorzugsweise 20 bis 3O⁰C, 10 bis 180 Minuten, gegebenenfalls unter Rühren, in Berührung bringt. Diese Umsetzung wird vorzugsweise in Gegenwart einer geringen Menge eines in Wasser löslichen organischen Lösungsmittels, wie Tetrahydrofuran', Dioxan, Aceton oder Äthanol, durchgeführt, wobei aber darauf zu achten ist, daß nicht eine der Komponenten, wie das Enzym, durch das organische Lösungsmittel inaktiviert oder denaturiert wird. Das auf diese V/eise erhaltene Reaktionsprodukt kann leicht nach üblichen Verfahren gereinigt werden, beispielsweise durch Waschen mit einer Pufferlösung, Säulenchromatographie an dreidimensional vernetztem Dextran (Sephadex; Pharmacia Fine Chemicals) Membranfiltration (beispielsweise Diaflo, Amicon Corp.).

Das Verhältnis von Enzym zu Antigen im enzymmarkierten Antigen der allgemeinen Formel II, das auf diese Weise erhalten wird, hängt von der Art des Enzyms oder des Antigens und insbesondere von der Anzahl der Amino- oder Mercaptogruppen im Enzym oder Antigen ab.

Die Verbindungen der allgemeinen Formel I lassen sich leicht herstellen, indem man eine Maleinimidobenzoesäure der allgemeinen Formel

ooff

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mit N-Hydroxysuccinimid der Formel

HO-F

"bei Raumtemperatur 2 bis 3 Stunden in einem organischen Lösungsmittel, wie Tetrahydrofuran, Dioxan, Benzol oder Aceton, in Gegenwart eines Dehydratisierungsmittels, wie Dicyclohexylcarbο-diimid, umsetzt.

Der Antikörper zum enzymmarkierten Antigen läßt sich durch Immunisieren von entsprechenden Tieren, wie Kaninchen, Pferden, Ziegen, Meerschweinchen oder Rindern, mit dem entsprechenden Antigen, das ein Adjuvans enthält, herstellen. Dabei wird der Antikörper im Serum gebildet; Das auf diese Weise erhaltene antikörperhaltige Serum kann direkt, d.h. ohne weitere Reinigung, zur enzymimmunologischen Bestimmung verwendet werden. Es kann aber auch vorher einer Reinigung unterzogen werden. Ferner lassen sich Antikörper (Antiseren) gegen Haptene herstellen, indem man die Haptene an eine hochmolekulare Substanz, wie Albumin, absorbiert oder bindet und anschließend das Tier mit dem erhaltenen Produkt zusammen mit einem Adjuvans in entsprechender Weise immunisiert.

Die enzymimmunologische Bestimmung unter Verwendung des erfindungsgemäßen enzymmarkierten Antigens kann beispielsweise gemäß den Angaben der US-PS 3 654 090, 3 850 752 und 3 839 153 durchgeführt werden. Dabei wird eine kompetitive Immunreaktion

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-in

dem enzymmarkierten Antigen und einem nicht markierten Antigen, d.h. der zu bestimmenden Substanz, in bezug auf den Antikörper in einer Pafferlösung durchgeführt. Anschließend wird der entstandene enzymmarkierte Antigen-Antikörper-Komplex durch Zentrifugieren abgetrennt. Eine andere Möglichkeit besteht darin, dem vorstehend erhaltenen Reaktionsgemisch zur Ausfällung des enzymmarkierten Antigen-Antikörper-Komplexes einen zweiten Antikörper zuzusetzen (sogenannte "doppelte Antikörpermethode")· Sodann wird die Aktivität des markierten Enzyms im Niederschlag oder in der überstehenden Flüssigkeit auf herkömmliche Weise gemessen. Schließlich wird die Menge an nicht markiertem Antigen in der Probe berechnet, wobei eine Eichkurve zugrundegelegt wird, die man bei der entsprechenden enzymimmunologischen Bestimmung unter Verwendung einer vorbestimmten Menge eines standardisierten Antigens erhält. Der zweite Antikörper läßt sich ebenfalls auf die vorstehend beschriebene Weise herstellen, wobei der erste Antikörper (Immunoglobuline) als Antigen zur Herstellung des zweiten Antikörpers im Serum eines Tieres, das nicht zur Herstellung des ersten Antikörpers verwendet worden ist, eingesetzt wird.

Somit werden bei der -enzymimmunologischen Bestimmung unter Verwendung des erfindungsgemäßen markierten Antigens folgende wesentliche Bestandteile verwendet:

(a) Ein enzymmarkiertes Antigen, das durch Bindung eines Enzyms und eines Antigens mit Hilfe von MBS hergestellt worden ist.

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(b) Ein Antikörper gegen das Antigen von (a).

(c) Ein Substrat für das Enzym von (a). Gegebenenfalls können folgende Reagenzien verwendet werden:

(d) Ein zweiter Antikörper.

(e) Ein von (c) abweichendes Reagenz zur Messung der Enzymaktivität.

Die Reagenzien (a), (b) und (d) können in Form einer Pufferlösung kühl aufbewahrt werden. Vorzugsweise werden sie aber in gefriergetrocknetem Zustand aufbewahrt und vor der Verwendung in Wasser oder in Puffer in Lösung gebracht. Das gefriergetrocknete Produkt läßt sich herstellen, indem man eine entsprechende Lösung, die gegebenenfalls mit Stabilisatoren, Füllstoffen oder dergl. versetzt worden ist, der Gefriertrocknung unterzieht. Die Aufbewahrung im gefriergetrockneten Zustand ist im Hinblick- auf die Stabilität und leichte Ekndhabbarkeit besonders bevorzugt.

Die Beschaffenheit des Reagenz (e) hängt von der Art des Enzyms von (a) und dem jeweiligen Verfahren ab. Beispiele dafür sind chromogene Reagenzien, Coenzyme und Mittel zum Abbruch der enzymatisehen Reaktion.

Die Beispiele erläutern die Erfindung.

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Beispiel 1 Herstellung von ο-, m- und p-MBS

Eine Lösung von 217 g o-, m- oder p-Maleinimidobenzoesäure in 30 ml Tetrahydrofuran wird mit 130 mg N-Hydroxysuccinimid und 224 mg Dicyclohexylcarbodiimid versetzt. Das Gemisch wird 2 Stunden bei Raumtemperatur gerührt. Der ausgefällte Ν,Ν'-Dicyclohexylharnstoff wird abfiltriert. Das Filtrat wird unter vermindertem Druck eingeengt. Der auf diese Weise erhaltene Rückstand wird säulenchromatographisch an Kieselgel unter Verwendung von Chloroform als Elutionsmittel gereinigt. Anschließend wird das Erodukt aus einer Mischung von Diäthyläther und Dichlormethan umkristallisiert. Man erhält o-, m- oder p-MBS mit den in Tabelle I angegebenen Eigenschaften.

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Tabelle I

•

.'· El ement aranalys e

10^N2°

6

N

8

92

I R-Spektrum

(=C-H)

1495,

.....

, 1446,

ρ 1513,

_f

1712 '

(

-CH₀CH₀-

N M R-Spektriim

3>

Ha R'

3H

• iv

■■" ^C15^H

-'·.(%

)

(KBr)

1731,

1065

1075

Suc-

6OMHz.CDCl

IH

(⁰C)

_.,,£. ber

)

8,

8 j

85

v> max (cm~

(Maleinimid

'l720 .

699

f 832,.

-COONO /

S-'-Wert

Ha—<T/-CO-

- gef

cinimide,

,Suc-

(=C-H)

1392,

-CH-CH-

H

8,

1559,

-COONO,

, 1740,

(-COONC)/

2,82(s)

Ha Hb

C

3100

1202,

1390,

Mal einimid _%

4H

7,28-7,95(m),

125

3,21

1770,

987,

(-COONO /

cinimid ,

.8,.13-8,37(πι)/

I

57,33

N

92

3110

842, 701

1605

1718

6,86(s)

Wasserstoff im"Benzol

R. Hb

2H

0-MBS

128

2,95

1773

(=C-H)

1208,

Suc-

2H

ring- ' ■"■■·

2H

57,29

8?

72

, 1738,

1002

-COONC)/

Ha—L \— CO-

Maleinimid,

·. 1375,

/—\

H

⁸J

cinimid ,

(-COONO;

2,90(s)

Ha Hb

C

1487

.6.99 .. . '

4H

.7,57-7,77 (m),

182

3,21

1204,

8,03-8,23(m),

I

57,33

N

92

830,

6^89 (s)

Ha:

Ha Hb

8Hz, 2H

m-MBS

185

2,98

3095

2H

Hb:

8Hz,. 2ϊ\

57,22

65

1774

R—L /}—CO-

/\

H

2,90(s)

Ha Hb

C

4H

7,65 (d), J=8,

198

3,21

8,23(d).,. J=8,

ί :

57,33

6,90 (s)

Ha:

p-MBS

200

3,18

2H

Hb:

56,90

Ha:

Hb:

R: Maleinimid

JM

Von den beiden funktionell en Gruppen in diesen MBS-Verbindungen ist'die Maleinimidogruppe als instabil anzusehen, während die Estergruppe eine geringere Reaktivität für das Antigen oder das Enzym aufweist. Die Stabilität und Reaktivität von MBS wurde untersucht. Die Ergebnisse sind in den Tabellen II und III zusammengestellt.

Tabelle II
Stabilität von MBS

Ver- . .	30	Inkubationszeit	8,	0	20 min	5
..bindung	PH- 5,0	min „ ..	69,	0	7,	8
	3,1	'Bereich 6,0 7,0	43,	8	18,	4
o-MBS	2,9	6,2 21,4	52,	0	9,	5
m-MBS	3,8	2,5 7,1			37,
p-MBS	6,6 32,0

Anmerkung: Der Zahlenwert in vorstehender Tabelle gibt den Prozentsatz an zersetzten Maleinimidogruppen in MBS an. Dabei werden 10 mMol der zu untersuchenden Verbindung in 20^uI Tetrahydrofuran gelöst und gründlich mit 0,5 ml eines 0,05 m Phosphatpuffers vom pH-Wert 6,0,, 7,0, 7,5 bzw. 8,0 oder eines 0,05 m Citratpuffers vom pH-Wert 5,0 vermischt. Das Gemisch wird 20 bzw. 30 Minuten inkubiert.

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Zl

Tabelle III Reaktivität von MBS

Verbindung	Reagens: Lysin
o-MBS	32,6
m-MBS	4-1,0
p-MBS	27,5

Anmerkung: Die Zahlenwerte in der vorstehenden Tabelle geben den Prozentsatz der Acylierung von Lysin mit MBS an. 1 mMol der zu untersuchenden Verbindung wird in 10 ^uI Tetrahydrofuran gelöst und mit 0,1 ml einer 0,1 m Lysinlösung in 0,05 m Phosphatpuffer vom ρH-Wert 7,5 vermischt. Das Gemisch wird 20 Minuten bei 3O⁰C umgesetzt.

Beispiel 2 Bestimmung von Insulin
a) Bindung von m-MBS an Insulin

1 ml 0,05 m Phosphatpuffer vom pH-Wert 7*0 mit einem Gehalt an 6-mg (1^uMoI) Schweineinsulin (25,5 U/mg, Produkt der Firma Schwarz/Mann) wird mit 75^1 einer Lösung von m-MBS

in Tetrahydrofuran

(1,2;uMol, d.h. 5 mg/ml)/versetzt. Das Gemisch wird 30 Minuten bei Raumtemperatur stehengelassen und dabei gelegentlich gerührt. Das erhaltene Gemisch wird mit 1 ml 1 m Citrat-Phosphat-Puffer vom pH-Wert 5,0 versetzt. Der gebildete Niederschlag wird 15 Minuten bei 800 g ab zentrifugiert.

Sodann wird der Niederschlag 2 mal mit 0,01 m Citratpuffer

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(pH-Wert 5?3i 2 ml) gewaschen und unter vermindertem Druck getrocknet. Man erhält 5,5 mg /S-MBSj7-/"~Insulin_7.

b) Bindung von /m-MBS/⁷-/""Insulin "J an ß-D-Galactosidase

1 ml 0,05 m Phosphatpuffer vom pH-Wert 7>0 mit einem Gehalt

(0,93 nMol)
an 500 ^g/ß-D-Galactosidase aus Escherichia coli (Boehringer Mannheim) wird mit 0,15 ml 0,05 m. Phosphatpuffer vom pH-Wert 7,0 mit einem Gehalt an I5I ^ug (Maleinimidgehalt 3,6 nMol) /^-MBS7-/f"liisulin_7', das gemäß a) erhalten worden ist, versetzt. Das Gemisch wird 2 Stunden bei Raumtemperatur stehengelassen.

Sodann wird das erhaltene Gemisch auf eine mit Sepharose 6B gepackte Säule der Abmessungen 1,8 χ 33 cm aufgesetzt und mit 0,01 m WaCl- - 0,02 m Phosphatpuffer vom pH-Wert 7,0 eluiert.

Dabei wird das gewünschte ^-D-Galactosidasj^-^-MB^T^/^Insu-HnZ-Produkt von freiem Enzym und von /S-MBS/^r-/~Insuliii7^rabgetrennt. Die Ausbeute beträgt 80 Prozent, berechnet aus der enzymatisehen Aktivität. Das Molverhältnis von Insulin zu ß-D-Galactosidase im Produkt beträgt etwa 1:1,8.

c) Insulinbestimmung

Die Hauptfraktion des ZB-D-Galactosidas^T-Zm-MBST-Z-inguXin^.

Produkts (d.h. das enzymmarkierte Antigen), das gemäß b) erhalten worden ist, wird auf das 200-fache mit Wasser verdünnt. 10 )iL des verdünnten enzymmarkierten Antigens werden

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mit 0,2 ml 0,02 m Phosphatpuffer vom pH-Wert 7,0 (0,1 Prozent Kaninchenserumalbumin, 1 millimolar MgCIo, 0,1 m NaCl, 0,1 Prozent NaNO versetzt, das Insulin (d.h. nicht markiertes Antigen, O bis 20 ^uU) und 50 )ti. Anti-Schweineinsulin-Meer schweinchen-Anti serum (Dainabot Radioisotope Lab. Ltd., Japan; d.h. erster Antikörper) enthält. Das Gemisch wird 16 Stunden bei 4-⁰C stehengelassen und anschließend mit 10^1 Anti-Kaninchen-7s- /'-Globulin-Anti-Meerschweinchenserum (d.h. zweiter Antikörper) versetzt. Das Gemisch wird weitere 8 Stunden bei 4⁰C stehengelassen und anschließend 15 Minuten bei 800 g zentrifugiert. Die ß-D-Galactosidase-Aktivität in der überstehenden Flüssigkeit oder im Niederschlag wird gemäß dem in d) erläuterten Verfahren gemessen. Aus den Werten wird die in Fig. 1 dargestellte Eichkurve gewonnen. Nach diesem enzymimmunologischen Verfahren läßt sich somit Insulin in Mengen von 0,5 bis 2O_xIiIr messen.

d) Messung der ß-D-Galactosidase-Aktivität

0,15 ml einer Substratlösung (0,1 millimolar 4—Methylumbelliferyl-ß-D-galactosid, 0,02 m. Natriumphosphat, 0,1 Prozent Kaninchenserumalbumin, 1 millimolar MgCIp, 0,1 m NaCl, 0,1 Prozent NaN,, pH-Wert 7,0) werden mit 50^uI überstehender Flüssigkeit versetzt, die nach der Antigen-Antikörper-Reaktion von c) erhalten worden ist. Das Gemisch wird 60 Minuten bei 30⁰C stehengelassen.

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Eine andere Möglichkeit besteht darin, den gemäß c) erhaltenen Niederschlag mit 2 ml 0,05.m Phosphatpuffer vom pH-Wert 7₅O zu waschen und mit 0,15 ml der vorstehenden Substratlösung zu versetzen. Dabei wird das Gemisch 30 Minuten bei 30⁰C stehengelassen.

Die vorstehenden Gemische werden jeweils mit 2,5 ml einer 0,1 m Glycin-NaOH-Pufferlösung vom pH-Wert 10,3 versetzt, um die Reaktion zu beenden. Das im Reaktionsgemisch je nach der Aktivität des enzymmarkierten Antigens gebildete 4-Methylumbelliferon wird mit einem MPF-4-Spektrofluorometer (Hitachi, Ltd., Japan) bei .einer Erregungswellenlänge von 365 nm und einer Emisionswellenlänge von 448 nm gemessen.

Beispiel 3 Messung von Angiotensin I
a) Bindung von m-MBS an Angiotensin I

1 ml 0,5 m Phosphatpuffer vom pH-Wert 7»0 mit einem Gehalt an 2 mg (1,4_/uMol) Angiotensin I wird zu 0,26 ml einer Lösung von ϊα-MBS (4,2,JoMoI, d.h. 5 mg/ml) in Tetrahydrofuran gegeben. Das Gemisch wird 30 Minuten bei Raumtemperatur stehengelassen, wobei es gelegentlich geschüttelt wird. Anschließend wird das Reaktionsgemisch mit 0,5 ml 1 m Citratpuffer vom pH-Wert 5»0 versetzt und sodann auf eine mit dreidimensional vernetzten! Dextran (Sephadex G-15) beschickte Säule der Abmessungen 1,9 x 38 cm gegeben,. Die Elution wirdmit 0,02 m

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Citratpuffer mit einem Gehalt an 0,1 m NaGl durchgeführt. Dabei wird das gewünschte Produkt /^-MBS7-/~Angiotensin I_7 von nicht umgesetztem Angiotensin I und m-MBS abgetrennt.

b) Bindung von /m-MBST-/"Angiotensin I 7 an B-D-Galactosidase 0,5 ml. eines 0,05 m Phosphatpuffers vom ρH-Wert 7»0 mit

. einem Gehalt an 500 ^Ug (0,93 nMol) ß-D-Galactosidase werden mit 0,5 ml 0,05 m Phosphatpuffer vom pH-Wert 7,0_? der das gemäß a) erhaltene /ff-MBS7-/~Angiotensin I_7 (Maleinimidogehalt: 2,8 nMol) enthält, versetzt. Das Gemisch wird 2 Stunden bei Raumtemperatur stehengelassen. Sodann wird es auf eine mit dreidimensional vernetztem Dextran (Sephadex G-25)-gepackte Säule der Abmessungen 1,8 χ 4-2 cm aufgesetzt und mit 0,02 m Phosphatpuffer mit einem Gehalt an 0,1 m NaCl eluiert. Man erhält eine Hauptfraktion mit einem Gehalt an /l"-D-Galcatosidase7-/m-MBS7-/~Angiotensin I_7.

c) Messung von Angiotensin I

Die Hauptfraktion mit einem Gehalt an /E-D-GaIactosidas_e_7- ^ü-MBS_7-/~Angiotensin I_7, d.h. das enzymmarkierte Antigen, erhalten gemäß b), wird auf das 1000-fache mit Wasser verdünnt. 10 ul verdünntes, enzymmarkiertes Antigen wird mit 0,2 ml des Puffers von Beispiel 2 c), der 0 bis 800 ng (ng = Nanogramm) Angiotensin I, d.h. nicht markiertes Antigen, und 50/Ul Anti-Angiotensin I-Kaninchenserum, d.h. ersten Antikörper, enthält, vermischt. Das Gemisch wird 8 Stunden bei Raumtemperatur stehengelassen und sodann mit 10 ul Anti-

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Kaninchen-7s- /'-Globulin-Ziegenantiserum, d.h. zweiter Antikörper, versetzt. Das Gemisch wird sodann 16 Stunden bei 4⁰C stehengelassen und anschließend 15 Minuten bei 800 g zentrifugiert. Die Enzymaktivität der überstehenden Flüssigkeit und des erhaltenen Niederschlags wird gemäß Beispiel 2 d) bestimmt. Dabei erhält man die in Fig. 2 abgebildete Eichkurve zur enzymimmunologischen Bestimmung von Angiotensin

I. Gemäß diesem Verfahren läßt sich also Angiotensin in

—12

Mengen von 5 bis 100 pg (pg = Picogramm = 10" g) bestimmen.

Beispiel 4

Messung von Trijodthyronin (abgekürzt "GV' a) Herstellung von /~T^ 7-/m-,P- oder o-MBS7-/~ß-D-Galactosi- da se7

50 ^l .einer 0,1 η wäßrigen NaOH-Losung mit einem Gehalt an 0,5^uMoI T₃, (Sigma Chemical Co.) werden mit 1 ml 0,05 m Phosphatpuffer vom pH-Wert 7»0 versetzt. Die erhaltene Lösung wird tropfenweise unter Rühren mit 25 ^l einer Lösung von 0,5/iMol m-, p- oder o-MBS in Tetrahydrofuran versetzt. Das Gemisch wird 10 Minuten bei Raumtemperatur umgesetzt und sodann mit 40^uI 0,2 m Citrat-Phosphat-Puffer vom pH-Wert 4,3 versetzt. Der erhaltene Niederschlag wird 10 Minuten bei 800 g abzentrifugiert und mit 1 ml 0,05 m Citrat-Phosphat-Puffer vom pH-Wert 4,3 durch Zentrifugieren gewaschen. Der so erhaltene Niederschlag wird mit 1 ml 0,05 ei Phosphatpuffer vom pH-Wert 7,0 versetzt und sodann unter Rühren mit 100 (0,19 nMol) ß-D-Galactosidase versetzt. Nach 10 minütigem

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Rühren wird das Gemisch mit 5 ml eines 0,1 m Glycin-NaOH-Puffers vom pH-Wert 10,3 versetzt. Das Gemisch wird durch Diaflo PM 30 (Amicon Corp.) filtriert, um nicht umgesetztes /m-, p- oder o-MBS_7-/~T;z_7 oder nicht umgesetztes T^ zu entfernen. Der erhaltene Niederschlag wird ferner 2 mal mit 0,05 m Phosphatpuffer vom pH-Wert 7,0 (3 ml) gewaschen und anschließend zu 1 ml 0,05 m Phosphatpuffer vom pH-Wert 7,0 gegeben. Sodann wird mit 0,5 ml einer Iprozentigen Rinders erumalbuminlö sung versetzt.

b) Messung von T^

Die gemäß a) erhaltene Fraktion von /~T;z T-v^ä-, p- oder o-MBS7-/ß-D-Galactosidase7, d.h. das enzymmarkierte Antigen, wird auf das 100-fache mit Wasser verdünnt. 10^uI verdünntes, ■ enzymmarkiertes Antigen werden mit 1 ml .einer 0,02 m tris-HCl-Lösung mit einem Gehalt an 0,9 Prozent NaCl vom pH-Wert 7,0, die 0 bis 50 ng Standard-T, und 50 jil T^-Kaninchenantiserum (Dainippon Pharmaceutical Co., Ltd.), mit Wasser auf das 100-fache verdünnt, enthält, versetzt. Das Gemisch wird. 5 Stunden bei 5°C stehengelassen. Anschließend wird mit 1O₇JiI Anti-Kaninchen-IgG-Ziegenantiserum (Miles Laboratories Inc.) versetzt. Das Gemisch wird 16 Stunden bei 5⁰C stehengelassen und anschließend 10 Minuten bei 800 g zentrifugiert. Der erhaltene Niederschlag wird mit 1 ml des vorstehenden Puffers versetzt. Sodann wird das Gemisch weiter

zentrifugiert. Der Niederschlag wird mit 0,15 ml 0,1 millimolarem 4-Methylumbelliferyl-ß-D-galactosid - 0,02 m Phos-

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phatpuffer vom pH-Wert 7,0 versetzt. Das Gemisch wird 30 Minuten "bei 30⁰C stehengelassen. Anschließend wird die ß-D-GaIactosidase-Aktivität gemäß Beispiel 2 d) "bestimmt. Dadurch erhält man die in Fig. 3 abgebildete Eichkurve. Somit lassen sich 200 pg bis 50 ng T₇, nach diesem enzymimmunologischen "Verfahren bestimmen.

Beispiel 5

a) Herstellung von /0)iphenylpropylamin7-/^-MBS'7-/ß"'-D-Galactosi-

dase7

Eine Lösung von 3,2^uMoI (1,1 mg/O,16 ml) m-MBS in Tetrahydrofuran wird mit einer Lösung von 3,2^uMoI 3,3-Diphenylpropylamin in 32^1 Äthanol versetzt. Das Gemisch wird 1 Stunde bei Raumtemperatur gerührt. Anschließend werden 25/Ul des Reaktionsgemisches mit 0,05 m Ehosphatpuffer vom pH-Wert 7,0 mit einem Gehalt an 100 ^uig (0,19 nMol) ß-D-Galactosidase gerührt. Das Gemisch wird 10 Minuten stehengelassen und ■ sodann durch Diaflo EM 30 (Amicon Corp.) filtriert. Der Rückstand wird 2 mal mit 0,05 m Ehosphatpuffer vom pH-Wert 7,0 (3 ml) gewaschen und filtriert. Der dabei erhaltene Rückstand wird mit 1 ml 0,05 m Ehosphatpuffer vom pH-Wert 7,0 und 0,5 ml Iprozentiger Rinderseruuialbuminlösung versetzt.

b) Messung; von Diphenylhydantoin nach dem enzymimmunologischen Verfahren

10 ia1 des gemäß a) erhaltenen, auf das 10-fache verdünnten

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Lösung von ^iphenylpropylamin7-^-MBSy-/^-D-Galactosidasj37, 0 bis 50 ng Diphenylhydantoin und 10 ul mit Wasser auf das 20-fache verdünntes diphenylacetyliertes Rinderalbumin-Kaninchenantiserum (Dainippon Pharmaceutical Co., Ltd.) werden zu 1 ml einer 0,02 m tris-HCT-Lösung mit einem Gehalt an 0,9 Prozent HaGl vom pH-Wert 7₅O gegeben. Das Gemisch wird 5 Stunden bei 5⁰C stehengelassen. Inschließend werden 10 ^l Anti-Kaninchen-IgG-Ziegenantiserum zugesetzt. Das Gemisch wird 16 Stunden bei 5°^c stehengelassen und anschließend 10 Minuten bei 800 g zentrifugiert. Der erhaltene Niederschlag wird mit 1 ml des vorstehenden Puffers unter Zentrifugieren . gewaschen. Anschließend wird die ß-D-Galactosidase-Aktivität gemäß Beispiel 2 d) gemessen. Dabei erhält man die in Fig. 4-abgebildete Eichkurve. Somit lassen sich nach diesem enzymimmunologischen Verfahren 0,8 bis 100 ng Diphenylhydantoin bestimmen.

Beispiel 6

Herstellung einer Testpackung zur Messung von Insulin A: Puffer

60.6 g Rinderserumalbumin, 272,7 g NaCl, 14-9,5 g Na₂HPO^.12H

29.7 g NaH₂PO^-H₂O und 30,3 g NaN₅ werden gründlich vermischt. Jeweils 5,374- mg werden in 100 braune 15 ml fassende Flaschen gefüllt. Vor der Verwendung wird der Flascheninhalt auf ein Endvolumen von 300 ml mit Wasser aufgefüllt. Fi e Lösung weist dann einen Gehalt an 0,2 Prozent Rinderserumalbumin, 0,9 Prozent NaCl, 0,1 Prozent NaN, und 0,02 m Phos-

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phatpuffer (pH-Wert 7,0) auf. (Reagenz A).

B: Enzymmarkiertes Antigen

0,53 ml der gemäß Beispiel 2 erhaltenen Fraktion mit einem Gehalt an ^-D-Galactosidas£7-/^-MBJ37-/~Insulin_7 werden auf ein Gesamtvolumen von 1060 ml mit Reagenz A (Puffer) versetzt,Es erfolgt also eine Verdünnung auf das 2000-fache. 100 braune 15 ml-Flaschen werden mit jeweils 10,5 ml dieses Gemisches gefüllt (Reagenz B).

C: Erster Antikörper

3O₇Ul Anti-Schweineinsulin-Meerschweinchenantiserum (37 000 Einheiten des ersten Antikörpers), hergestellt gemäß J. Clin. Invest., Bd. 39 0960), S. 1157, werden mit 222 ml einer 0,5-prozentigen wäßrigen Lösung eines normalen Meerschweinchenserums versetzt und somit auf das etwa 7^00-fache verdünnt. 100 "braune 15 ml-Flaschen werden mit jeweils 2,2 ml dieses Gemisches versetzt und anschließend gefriergetrocknet.

Bei der Verwendung wird dieses gefriergetrocknete Produkt in 11,0 ml Puffer gelöst. Man erhält eine Lösung des ersten Antikörpers in einer Konzentration von 1 U/0,1 ml (Reagenz C).

Unter 1 U (Einheit) ist die Antikörpermenge zu verstehen,

125 die bei der Umsetzung des Antikörpers mit 100 pg ^J-Insulin mit 50 Prozent des mit 125 J markierten Insulins reagiert.

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D: Zweiter Antikörper

Jeweils 2,1 ml Anti-Meerschweinchen-IgG-Kaninchenantiserum, hergestellt gemäß Biochem. J., Bd. 88 (1963), S. 137 werden in 115 ml-fassende braune Flaschen gefüllt und gefriergetrocknet.

Bei der Verwendung wird das gefriergetrocknete Produkt in 10,5 ^ml Reagenz A (Puffer) gelöst (Reagenz D). 0,1 ml dieser Lösung weist eine ausreichende Aktivität auf, daß die Antikörperreaktion mit 0,1 ml Reagenz C (erster Antikörper) abläuft.

E: Standardinsulin

100 braune 15 ml-Flaschen werden mit Jeweils 1,0 ml einer Insulinlösung mit einer Konzentration von 640 ^uU/ml gefüllt und gefriergetrocknet.

Bei der Verwendung wird das gefriergetrocknete Produkt in '^: Wasser auf ein Endvolumen von 2,0 ml gelöst. In dieser Lösung sind 320,UUZmI Insulin enthalten. Diese Insulin-Stammlösung wird zur Erstellung einer Insulin-Eichkurve jeweils auf das Doppelte verdünnt (Reagenz E).

F: Substrat

63 mg ^-Methylumbelliferyl-ß-D-galactosid, 8679 mg Na₂HPO^. O, I76O mg NaH₂PO^, I76O mg Rinder serumalbumin, I76O mg , 352 mg MgCl₂ und 10,56 g NaCl werden gründlich vermischt, 709825/1059

Jeweils 227 ^S dieses Gemisches werden in100 braune 20 ml- Flaschen gegeben. Bei der Verwendung wird das Produkt mit Wasser zu einem Endvolumen.von 16,0 ml gelöst (Reagenz

G: Puffer

Jeweils 20,0 ml eines 1,5 m Glycin-NaOH-Puffers vom pH-Wert 10,3 werden in 100 braune " 20 ml-Flaschen gefüllt. Bei der Verwendung wird mit Wasser auf ein Endvolumen von 300 ml verdünnt (Reagenz G).

Auf diese Weise werden 100 Testpackungen hergestellt, die jeweils 1 Flasche der Reagenzien A bis G (im folgenden als "Insulin EIA-Testpackung" bezeichnet), die für 100 Bestimmungen ausreichen., erhalten.

Bei der Verwendung dieser Insulin EIA-Testpackung für die enzymimmunologische Bestimmung von Insulin wird folgendermaßen vorgegangen;

Ein Gemisch aus 0,5. ml Reagenz A (Puffer), 0,1 ml Reagenz B (enzymmarkiertes Antigen), 0,1 ml Reagenz C (erster Antikörper) und'der zu untersuchenden Probe oder einer entsprechenden Menge einer Standard-Insulinlösung wird 24-Stunden bei 4°C inkubiert. Das erhaltene Gemisch wird mit 0,1 ml Reagenz D (zweiter Antikörper) versetzt. Das Gemisch wird 8 Stunden bei 4-⁰C inkubiert und anschließend-15 Minuten bei 800 g zentrifugiert. Der erhaltene Niederschlag wird mit

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St

2,0 ml Reagenz A (Puffer) unter Zentrifugieren gewaschen. Anschließend wird die Enzymaktivität gemäß Beispiel 2 d) gemessen.

Beispiel 7

Messung von Insulin im menschlichen Serum Die Insulinkonzentration in den Seren von 54 Erobanden, die offensichtlich gesund sind, wird unter Verwendung der gemäß Beispiel 6 hergestellten Insulin EIA-Testpackung und einer handelsüblichen Insulin-Testpackung (Insulin RIA-Testpackung, Handelsbezeichnung der Dainabot Radioisotope Lab., Ltd., einer Testpackung zur Messung von Insulin nach einem radioimmunologischen Verfahren) bestimmt. Die Ergebnisse sind in Fig. 5 zusammengestellt. Aus Fig. 5 geht hervor, daß die nach beiden Verfahren bestimmten Insulinkonzentrationen gut korreliert sind (Korrelationskoeffizient = 0,92).

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Claims

Patentansprüche

1; Maleinimidobenzoesäure-N-hydroxysuccinimidester der allgemeinen Formel

COO-N

2. m-Isomeres der Verbindungen von Anspruch 1 mit der folgenden Formel

COO-N

3. Enzymmarkiertes Antigen, geeignet für enzymimmunologische Bestimmungen, der allgemeinen Formel

CONH-

in der X und Y jeweils verschieden sind und ein Enzym oder ein Antigen bedeuten.

. Enzymmarkiertes Antigen nach Anspruch 3* gekennzeichnet durch die folgende allgemeine Formel

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ORSGiMAL fMSPECTED

oöm-

in der X und Y die gleiche Bedeutung wie in Anspruch 3 haben.

5. Enzymmarkiertes Antigen nach Anspruch 3> dadurch gekennz eichnet, daß X ein Antigen und Y ein Enzym ist.

6. Enzymmarkiertes Antigen nach Anspruch 3» dadurch gekennzeichnet, daß X ein Enzym und Y ein Antigen ist.

7. Enzymmarkiertes Antigen nach Anspruch 3» dadurch gekennz ei.chnet, daß einer der Reste X und Y ein Hormon ist.

8. Enzymmarkiertes Antigen nach Anspruch 7·» dadurch gekennz e i chne t, daß es als Hormon Insulin, Angiotensin I oder Jodthyronin enthält.

9. Enzymmarkiertes Antigen nach Anspruch.3? dadurch gekennz eichnet, daß einer der Reste X und Y ein Hapten ist.

10. Enzymmarkiertes Antigen nach Anspruch 9» dadurch gekenn'ζ eichnet, daß das Hapten teilweise die

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gleiche Struktur wie die zu messende Substanz aufweist.·

11. Enzymmarkiertes Antigen nach Anspruch 10, dadurch gek ennz e i c h η e t, daß es als- Hapten Diphenylpropylamin enthält.

12. Enzymmarkiertes Antigen nach Anspruch 3, dadurch gekennz eichnet, daß Y ß-D-Galactosidase ist.

1J. Enzymmarkiertes Antigen nach Anspruch 3» dadurch gekennz eichnet, daß X Peroxidase, Glucose-oxidase oder alkalische Phosphatase ist.

14. Enzymmarkiertes Antigen nach Anspruch 5? dadurch gekennzeichnet, daß X Insulin und Y ß-D-Galactosidase ist.

15· Enzymmarkiertes Antigen nach Anspruch 5i dadurch gekennz eichnet, daß X Trijodthyronin und Y ß-D-Galactosidase ist.

16. Enzymmarkiertes Antigen nach Anspruch 5» dadurch gekennz eichnet, daß X Angiotensin I und Y ß-D-Galactosidase ist.

17· Enzymimmunologisches Bestimmungsverfahren, dadurch gekennzeichnet, daß man ein enzymmarkiertes

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Antigen der allgemeinen Formel

COHH

verwendet, in der X und Y verschieden sind und jeweils ein Enzym oder Antigen, "bedeuten.

18. Testpackung für enzymimmunologische Bestimmungsverfahren, g e k e n-n zeichnet durch die folgenden drei Bestandteile als wesentliche Komponenten:
Komponente A: fenzymmarkiertes Antigen der allgemeinen Formel

com

in der -X und Y verschieden sind und jeweils ein Enzym oder Antigen bedeuten,

Komponente B: ein Antikörper gegen das Antigen der Komponente A und

Komponente C: ein Substrat für das Enzym der Komponente A.

19· Testpackung nach Anspruch 18, dadurch gekennzeichnet, daß die Komponente A ein enzymmarkiertes Antigen der allgemeinen Formel ist

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β -D-fralact osidase

0ONH

•Insulin

20. Verfahren zur Herstellung eines enzymmarkierten Antigens für enzymimmunologische Bestimmungsverfahren der allgemeinen
Formel II

C (Midi)

in der X und Y verschieden sind und Jeweils ein Enzym oder
Antigen bedeuten, dadurch gekennzeichnet, daß man eine Verbindung der allgemeinen Formel I

COO-N

(I)

mit einem Antigen oder Enzym, das eine Aminogruppe aber keine Mercaptogruppe enthält, zu einem Produkt der allgemeinen Formel III umsetzt

com

(in)

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in der X die vorstehende Bedeutung hat, und das Produkt der allgemeinen Formel III mit einem Enzym oder Antigen mit einer Mercaptogruppe umsetzt.

21. Verfahren nach. Anspruch 20, dadurch gekennzeichnet, daß man die Verbindung der allgemeinen Formel I mit einem Antigen, das eine Aminogruppe aber keine Mercaptogruppe enthält, umsetzt und das erhaltene Produkt der allgemeinen Formel III mit einem Enzym, das eine Mercaptogruppe enthält, umsetzt.

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