JPH0299863A - アンジオテンシン−ｉの測定法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 【産業上の利用分野】

本発明は、アンジオテンシン−■の測定法、特に高感度
酵素免疫測定法に関するものである。

【発明の背景】

レニン・アンジオテンシン・アルトスプロン系は生体内
において血圧上昇に関与する主要なしくみである。 すなわち、肝臓で生合成されたアンジオテンシノーゲン
は、血中で腎臓から分泌された蛋白質分解酵素レニ〉・
により加水分解され、１０個のアミノ酸からなるアンジ
オテンシン−■となる。 そして、アンジオテンシン−■は変換酵素によリＣ末端
側の２個のアミノ酸を切られ、アンジオテンシン−■と
なり、電解質代謝や昇圧作用に関係する。すなわち、ア
ンジオテンシン−■は血管を構成する血管内皮細胞に働
き、血管を収縮させるとともに、副腎皮質にも作用し、
体内の電解質代謝を促進するホルモンであるアルトステ
ンの分泌を促進し、その結果として血圧を上昇させる。 この一連の反応においてレニンは中心的な役割を担って
おり、又、レニンは前駆体（プロレニン）として血中に
多く分泌されていることが知られている。 このようなことから、レニン・アンジオテンシン・アル
ドステロン系が各臓器においてどのような役割を果たし
ているかを検討する為、あるいは例えば高血圧症の病因
解明及びその治療の為、アンジオテンシン＝■の鋭敏で
、かつ、簡便な測定法を確立することが求められている
。 そして、従来においてもアンジオテンシン−１の測定法
が提案されており、例えばラジオイムノアッセイ（旧＾
）が提案されている。 しかしながら、この旧＾法には次のような問題点がある
。 ■　アイソトープを使用する為に、その取り扱いや廃棄
、操作上の煩わしさがあり、又、特別な機器、施設が必
要である。 ■　アイソト−プを使用する為に、その半減期を考慮す
る必要があり、１２ｓＩ標識アンジオテンシン−■の長
期保存が不可能で、アッセイに対応して１２Ｓｉ標識ア
ンジオテンシン−■を調製しなくてはならず、面倒であ
る。 ■　アンジオテンシン−■生成反応後、既知量の１２５
ＩＩＦ識アンジオデンシン−■及び生成アンジオテンシ
ン−１と抗体との競合反応の平衡化に１晩を要し、時間
がかかる。 ■　競合反応後、抗体結合１２５１標識アンジオテンシ
ン−■と非結合アンジオテンシン−■とを活性炭等の吸
着剤を用いた遠心分離や、他の方法により分離する必要
があり、面倒である。 ■　放射活性の測定に時間がかかる。 ■　測定感度が良くなく、又、測定範囲も狭い。 一 又、β−Ｄ−ガラクトシダーゼで標識したアンジオテン
シン−■を用いたエンザイムイムノアッセイによってア
ンジオテンシン−１を測定する方法が提案されているも
のの、この方法にあっても測定感度が１．２ｐｇ／＋ｍ
ｌ程度と良くなく、かつ、測定範囲も狭い。

【発明の開示】

本発明の第１の目的は、測定操作が安全で、がっ、簡素
化されたアンジオテンシン−■の測定法を提供すること
にある。 すなわち、本発明では、ラジオアイソトープを用いない
為、ガンマ−カウンタ等の高′価な測定機器は必要とぜ
ず、被曝の危険もなく、又、放射性廃棄物も出ない。 本発明の第２の目的は、測定感度が鋭敏で、がっ、測定
範囲が広いアンジオテンシン−■の測定法を提供するこ
とにある。 本発明によれば、０．０５ｐＨ／ｍｌ〜５ｎｇ／ｍｌの
濃度のアンジオテンシン−■が測定可能である。 この測定範囲は、従来広く行なわれているＲ１＾法の測
定範囲１　ｐｇ／ｍ１〜１　ｎＢ／ｍｌ及びβ−０−ガ
ラクトシダーゼで標識したアンジオテンシン−１を用い
たエンザイムイムノアッセイによる１、２ｐ［１／ＩＩ
Ｉ〜程度のものと比べて非常に広く、又、最低検出感度
も約２０倍鋭敏となっている。従って、本発明を用いる
ことにより、低レニン高血圧症患者のスクリーニングが
可能となる。 本発明の第３の目的は、血漿の前処理が不要となり、ア
ンジオテンシン−Ｉを直接測定することができるアンジ
オテンシン−Ｉの測定法を提供することにある。 従来のＲＩＡ法では、血漿を検体とする場合、測定に先
立ってあらかじめ血漿の前処理を行い、血中の反応阻害
物質を除去しておく必要があったが、本発明では血漿の
前処理が不要となり、測定操作は著しく簡素化され、実
用性が増大する。 本発明の第４の目的は、測定時間が短いアンジオテンシ
ン−Ｉの測定法を提供することにある。 従来のＲ１＾法では測定に２日間を要したが、水沫では
およそ約４時間で測定可能であり、その日のうちに測定
結果を知ることが可能となる。 上記の目的は、ペルオキシダーゼ標識アンジオテンシン
−■を用いて、又、ペルオキシダーゼ標識アンジオテン
シン−■と、３．３’　、５．５’−テトラメチルベン
チジンとを用いて、又、ペルオキシダーゼ標識アンジオ
テンシン−■と、　３．３’　、５．５’テ１〜ラメチ
ルベンチジンと、被覆用緩衝液とを用いて、又、ペルオ
キシダーゼ標識アンジオテンシン−夏と、３．３’　、
５．５’−テトラメチルベンチシンと、被覆用緩衝液と
、ブロッキング［［ｒ液とを用いて、又、ペルオキシダ
ーゼ標識アンジオテンシン−夏と、３．３’　、５．５
’−テトラメチルベンチジンと、被覆用緩衝液と、ブロ
ッキング緩衝液と、酵素希釈用緩衝液とを用いてアンジ
オテンシン−Ｉを測定することを特徴とするアンジオテ
ンシン−■の測定法によって達成される。 【実施例］ （Ａ）　　アンジオテンシン＝■のペルオキシダーゼ標
識 尚、特別に記載する以外、操作は１５〜３０℃で行う。 ■　ホースラデイツシュ（西洋ワサビ）ペルオキシダー
ゼ１〜１０ｍｇを０．０２〜０．２Ｍ、ｐＨ６〜８のリ
ン酸ヂトリウム緩衝液（このｐＨ範囲に緩衝能を有する
緩衝液であれば制限はなく、例えばピロリン酸ナトリウ
ム緩衝液等を用いても良い）０．５〜１ｍｌに溶解する
。 ■　グルタルアルデヒドを精製水に溶解し、０．７５〜
７，５％とする。 ■　■を泡立たない程度に良く撹拌しつつ、■を滴下す
る。 ■　３０〜６０分間そのまま撹拌を続ける。 ■　反応液を濃縮器等の適当な方法を用いて０．１〜０
．２請ｌに濃縮した後、高速液体クロマトグラフにより
遊離のグルタルアルデヒドを除く。 分離条件二カラム　分画分子量範囲がｌＯ万以下のゲル
濾過用カラム 溶出液　ｐ１１６〜８．０．０５〜０．２Ｎ塩化ナトリ
ウムを含む０．Ｏ１〜０．２Ｍピロリン酸すトリウム緩
衝液（このｐＨ範囲に緩衝能を有するＭｆｌｌ液であれ
ばＭ限はなく、例えばリン酸すトリウム緩衝液等を用い
ても良い、）流速　　０．５〜ｆｅｅｌ／分 ■　酵素溶出画分（分子１４万付近）を■と同様にして
、０．５〜１１に濃縮する。 ■　アンジオテンシン−１０，１３〜０．２６−ｇをＩ
ｆｆ製氷０．１〜０．２請ｌに溶解し、泡立てない程度
に良く撹拌した■に滴下し、２〜４時間（１０℃以下で
は一晩程度）反応させる。 尚、以上の工程でペルオキシダーゼ標識アンジオテンシ
ン−１が得られる。 ■　０．０５〜０．２Ｍのアミン類（例えばリジン、ア
ルギニン及び！・リスヒドロキシアミノメタン等）０．
１〜０．５請ｌを加え、さらに１〜４時間反応させる。 ■　反応液をＯと同様にして０．１〜０．２１に濃縮し
、■と同様の分離条件で高速液体クロマトグラフを用い
て遊離のアンジオテンシン−■を除く。 ［相］　酵素溶出画分（分子量４万付近）に０．０５〜
０．２％の血清アルブミン、カゼイン、ヘモグロビン、
ゼラチン等の安定化剤を加え、−１０℃以下に保存する
。 （Ｂ）　　ペルオキシダーゼ標識アンジオテンシン■を
用いたエンザイムイムノアッセイ このエンザイムイムノアッセイは固相法又は液相法のい
ずれにも適用が可能である。−例として、９６六マイク
ロプレートを固相として用いた場合を以下に記載する。 尚、特別に記載する以外、操作はすべて１５〜３０℃で
行う。 ■　９６穴マイクロプレートの各ウェルに、下記の被覆
用１１Ｉｉｌ液で１００〜２００００倍に希釈した抗ア
ンジオテンシン＝■血清を０．３〜０．５請ｌずつ分注
し、２〜４時間（１０℃以下では一晩以上）放置する。 被覆用Ｍ衝液 ０．０５〜０．２Ｍ塩化すトリウム及び１〜２０ｍｇ／
ｍ　Ｉウシ血清アルブミン又はカゼインを含む０．０１
−０．２ＭでｐＨ６〜８のビロリン酸すトリウム緩衝液
。 ■　各ウェルの中身を捨て、下記のブロッキング緩衝液
を０．３〜０．５請ｌずつ分注し、２〜４時間（１０℃
以下では−・晩以上）放置する。 ブロッキングＭ、衝液 ０．０５〜０．２Ｍ塩化すｌ・リウム及びｌＯ〜２０１
１１ＥＴ／１Ｍ＋ウシ血清アルブミンを含む０．０１〜
０．２Ｍでｐｌ＋６〜８のビロリン酸すトリウノ１」液
。 ■　各ウェルの中身を捨て、下記のアンジオテンシン−
Ｉ標準溶液及び下記の酵素希釈用Ｍ、ＦＲ液でアン′ジ
オテ〉・シンー■濃度が０．０５ｐｇ／ｍｌ−５Ｂ／ｍ
ｌとなるように希釈した試ｆｉｌをＯ，１〜ｌずつ加え
る。 さらに、ツウィーン２０等の非イオン性界面活性剤を含
む酵素希釈用ＭＴＫｔ液で１００〜１００００倍に希釈
したペルオキシダーゼ標識ア〉′ジオデンシンー■を０
．１〜ｌずつ加える。尚、これらの操作はブレートを氷
水中に浮かべて行う。 アンジオテンシン−■標準溶液 ０．０５ｐｇ／ｍ１〜５ｎｇ／ｍｌとなるようにアンジ
オテンシン−■を酵素希釈用緩衝液に溶解したもの。 酵素希釈用緩衝液 ０．０５〜０．２Ｍ塩化すｌ・リウム、０．１〜ｌ　ｍ
Ｍ７　ｘ　ニールメチルスルフォニルフルオライド及び
１〜２０　＋ｎ　Ｈ／ｍｌウシ血清アルブミン又はヘモ
グロビンをよむ０．０１〜０．２ＭでｐＨ６〜８のビロ
リン酸すトリウム緩衝液。 ■　１５℃以下で０．５〜４時間反応させる。 ■　各ウェルの中身を捨て、０，３〜０．５〜ｌずつ下
記の洗浄用緩衝液を加え、吸引除去し、ウェルを洗浄す
る。この操作を３〜５回繰り返す。 洗浄用緩衝液 ０．０５・−〇、ＺＭ塩化す１〜リウム及び０．１〜０
．２％の非オン性界面活性剤を含む０．０１〜０゜２Ｍ
’ｒｐＨ６〜８のビロリン酸すトリウム緩衝液。 ■　各ウェルに下記の基質溶液を０．１５〜０，３１ず
つ加え、３７℃に５〜１０分置い装後、３０％過酸化水
素水を０．０５〜０．１〜ｌずつ加える。 基質溶液 少藍のＮ−ジメチルホルムアミドに３．３’　、５．５
”デトラメヂルベンチジンを溶解し、さらにこれを０．
０１〜０．２Ｍでｐ１１５〜６の酢酸緩衝液に溶解し、
終濃度を０．０１・〜０．ＩＭとしたもの。 ■　３７℃で３０分〜４時間反応させた後、各ウェルに
０．０５〜２Ｍ硫酸を０．１〜０．２〜ｌ加え反応を停
止させる。 ■　マイクロプレート用分光光度計を用い、各ウェルの
吸光度を波長４５０ｎｍで測定する。 上記のようにして測定されるアンジオテンシン■の濃度
と吸光度との関係は第１図に示す通りであり、これによ
れば同様にすることで０．０５ｐｇ／輸１〜５ｎｇ／ｍ
ｌの濃度のアンジオテンシン−１を測定できることが理
解できる。

【図面の簡単な説明】

第１図は、アンジオテンシン−Ｉの濃度と吸光度との関
係を示すグラフである。 第 図

Claims (5)

【特許請求の範囲】
1. （１）ペルオキシダーゼ標識アンジオテンシン− I を
   用いてアンジオテンシン− I を測定することを特徴と
   するアンジオテンシン− I の測定法。
2. （２）ペルオキシダーゼ標識アンジオテンシン− I と
   、３，３′，５，５′−テトラメチルベンチジンとを用
   いてアンジオテンシン− I を測定することを特徴とす
   るアンジオテンシン− I の測定法。
3. （３）ペルオキシダーゼ標識アンジオテンシン− I と
   、３，３′，５，５′−テトラメチルベンチジンと、被
   覆用緩衝液とを用いてアンジオテンシン− I を測定す
   ることを特徴とするアンジオテンシン− I の測定法。
4. （４）ペルオキシダーゼ標識アンジオテンシン− I と
   、３，３′，５，５′−テトラメチルベンチジンと、被
   覆用緩衝液と、ブロッキング緩衝液とを用いてアンジオ
   テンシン− I を測定することを特徴とするアンジオテ
   ンシン− I の測定法。
5. （５）ペルオキシダーゼ標識アンジオテンシン− I と
   、３，３′，５，５′−テトラメチルベンチジンと、被
   覆用緩衝液と、ブロッキング緩衝液と、酵素希釈用緩衝
   液とを用いてアンジオテンシン− I を測定することを
   特徴とするアンジオテンシン− I の測定法。