JPS61205862A - アレルゲン特異ＩｇＧ抗体測定用試薬 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 イ１発明の目的 １１直立五ユ皇１ 抗原抗体反応を基盤とするアレルギー疾患は、その原因
物質（アレルゲン）の検索特定により、病状の診断分類
、治療方針の方向づけが可能となってきた０本発明にお
ける特異ＩｇＧ試験用試薬は、外因性気管喘息、アトピ
ー性皮膚炎、免疫複合体疾患などのアレルギー疾患にお
けるアレルゲンの特定用診断薬として、また、臨床経過
を免疫学的に追跡するモニターとして利用することがで
きる。

更米辣宜 ヒト血清中のアレルゲンに対する免疫グロブリンＧ（以
下ＩｇＧという）抗体を定量することの重要性が、二工
数十年の間に認識きれるようになってきた［Ｊ、Ｗ、ヤ
ングインゲル（Ｙｏｕｎｇｉｎｇｅｒ　）ら、ｊ、ｃｌ
ｉｎ、Ｉｎｖｅｓｔ、　５２．１２６８（１９７３）　
；　Ａ、に、ツボツカ（５ｏｂｏｔｋａ　）ら、Ｊ、Ｉ
ｍｍｕｎｏｌ、　１１７．８４（１９７６）　］　−最
近、ヒト血清中のアレルゲンに特異性を有するＩｇＥｔ
Ａ体の測定に、ラジオアレルゴソルベントテスト（ｒａ
ｄｔｏａｌｌｅｒｇｏｓｏｒｂｅｎｔ　ｔａｓｔ　）　
Ｃ以下ＲＡＳＴ法という）が利用きれるようになってき
ている［Ｎ、Ｆ、アドキンソン・ジュニア−（Ａｄｋｉ
ｎｓｏｎ、Ｊｒ、　）、Ａｍｅｒｉｃａｎ　５ｏｃｉＱ
ｔｙ　ｆｏｒ　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ。

Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ、　Ｄ、　Ｃ，ｐ、　５９０−６
０２（１９７６）　］。しかし、ヒトアレルゲン特異性
ＩｇＧ抗体の測定へのＲＡＳＴ法の応用は、一部の報告
「清水ら５．７．　Ｉｍｍｕｎｏｌ。

Ｍｅｔｈｏｄｓ、　１９．３１７（１９７８）コを除い
て成功していない、不成功の主な理由は、ＲＡＳＴ法で
は正常血清中の非特異的抗体結合レベルが、特異抗体の
結合レベル以上に高いことであったためと推定される。

ハミルトン（Ｈａｍｉｌｔｏｎ　）らは、ウサギ抗ヒト
ＩｇＧ抗体の代わりに、スタフィロコッカス・アウレウ
ス（５ｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ　ａｕｒａｕｓ　）
由来の１１８１−プロティンＡを用いて非特異的結合を
低下せしめることに成功した。　［Ｊ、　Ｉｍｍｕｎｏ
ｌ、　１２２１０７３（１９７９）］。

スタフィロコッカス・アウレウスから分離したプロティ
ンＡは、ヒトＩｇＧサブクラス１．２および４のＦｃ部
分に優先的に結合するが、ヒト！ｇＧｓには結合しない
、プロティンＡは免疫グロブリンＡ（以下ＩｇＡという
）のサブクラスであるＩｇＡｔおよびＩｇＡ庶と結合す
るが、ＩｇＡサブクラスとプロティンＡの結合能との間
には、特別な関係はないらしい［ブルンダ（Ｂｒｕｎｄ
ａ　）ら、Ｊ、　Ｉｍｍｕｎｏｌ、　Ｖｏｌ、　１２３
＋１４５７（１９７９）コ、ヨハンソン（Ｊｏｈａｎｓ
ｓｏｎ　）およびインガナス（Ｉｎｇａｎａｓ　）は、
ポリクローナル免疫グロブリンＥ（以下工ｇＥという）
を含有する血清試料から分離したＩｇＥは、プロティン
Ａと高い親和性を示すが、その結合部位はＩｇＧとは異
なってＦｃ部分ではないとしている［　Ｉｍｍｕｎｏｌ
ｏｇｉｃａｌＲｅｖ、　４１．２４８（１９７８）　１
　。

以上の現状から見てヒトアレルゲン特異ＩｇＧ抗体の新
たな測定法の開発が強く望まれている。

本発明らは、ヒトＩｇＧのＦｃ部分に対して、均一な親
和性をもって結合することのできるモノクローナル抗体
を、マウスの腹腔内において多量に調製することに成功
している［特願昭５９−８７１９０］。

明が　　しようとする４ｃ：に アレルギー疾患におけるアレルゲンの特定に際して、ア
レルゲンを固定化した同相系と被検血清を反応きせた場
合、次の三条性が存在すると考えられる。

ａ、固定化したアレルゲンとアレルゲンに特異的なＩｇ
Ｇ抗体が正常に反応している状態。

ｂ、固定化したアレルゲンと反応せずに、ＩｇＧやＩｇ
Ｇ抗体が非特異的に固相に吸着した状態。

Ｃ１同相系外の溶液中にＩｇＧが残存している状態。

高い特異性でＩｇＧ抗体を測定するには、抗ヒト１ｇＧ
抗体の特性が重要であり、以下の条件を満足しているこ
とが望ましい。

（１）ｂの状態のごとき非特異的に吸着したＩｇＧとの
親和性が低いこと。

（２）ｃの状態のごとき溶液中で遊離のＩｇＧとの親和
性が低いこと。

（３）ａのごとき状態の固相アレルゲンと結合したＩｇ
Ｇ抗体との親和性が極めて高いこと。

本発明に係るアレルゲン特異ＩｇＧ抗体測定用試薬は、
上記（１〉〜（３）の条件を満たし、ＩｇＧ抗体の測定
に適したモノクローナル抗ヒトＩｇＧ抗体を使用してい
る。従って、アレルゲン結合能のあるＩｇＧ抗体を的確
にとらえ、遮断抗体、レアギン様工（抗体などを測定し
得る。

口１発明の構成 ｐｌ　　　を　　するための　段 本発明が提供するアレルゲン特異ＩｇＧ抗体測定用試薬
は、酵素免疫測定法（ＥＩＡ）にもとづく臨床検査用試
薬であり、酵素、特にペルオキシダーゼで標識したモノ
クローナル抗ヒトＩｇＧ抗体（以下ａｎｔｉ−ｈＩｇＧ
という）を主体とする下記構成々分よりなる試薬である
。

（イ）酵素標識抗ＩｇＧ試薬 （ロ）　呈色剤試薬 （ハ〉　基質液試薬 （ニ）反応停止液試薬 （＄＞　　４１！衝液試薬 （へ）洗浄液試薬 （ト）希釈液試薬 上記構成成分において（イ）の酵素標識抗ＩｇＧ試薬は
、酵素で標識したａｎｔｉ−ｈＩｇＧを主成分とする試
薬であり、下記の成分より構成きれる。

（イ）　ヒト血清アルブミン （ロ）　リン酸二水素ナトリウム （ハ）　リン酸−水素ナトリウム （ニ）　塩化ナトリウム （＊）ペルオキシダーゼで標識 したａｎｔｉ−ｈ）ｇＧ （へ）保存剤　　　　　　　　　　　　　　　微量（ト
）酸および／またはアルカリ　　　　　　適量以下に上
記各構成成分につき詳述する。

（１）　　モノクローナル抗ヒトＩｇＧ抗体本発明試薬
の酵素標識抗ＩｇＧの作成に使用するａｎｔｉ−ｈＩｇ
Ｇは、本発明者らにより細胞融合法にもとづき調製され
たモノクローナル抗体ＨＧ２−２５［特願昭５９−８７
１９０コであり、この抗体は次のような特徴を有する。

（ａ）　　ヒトＩｇＧのＣＨ，ドメインを認識する。

（ｂ）　　ヒトＩｇＧのサブクラスに属するＩｇＧ＋　
、　ｘｇに、。

ＩｇＧｓおよびＩｇＧ　ａに高い結合能を示す。

（ｃ）　　固相化された非特異ＩｇＧと比較して、アレ
ルゲンに結合した特異ＩｇＧ抗体に対して選択的に結合
し、溶液状態にある遊離ヒトＩｇＧとの結合性が極めて
弱い。

モノクローナル抗体ＨＧ２−２５の具体的調製例は、後
記の参考例に示しである。

（２）　　酵素標識ａｎｔｉ−ｈＩｇＧａｎｔｉ−ｈＩ
ｇＧをペルオキシダーゼ、特に西洋わネびペルオキシダ
ーゼ（ｈｏｒｓｅｒａｄｉｓｈ　ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ
；以下ＨＲＰという）と結合させて標識する。　ａｎｔ
ｉ−ｈＩｇＧとＨＲＰの結合は公知の方法に従って行え
ばよく、例えば、ＨＲＰを一旦過ヨウ素酸塩と反応させ
て部分的にアルデヒド基を生成させた後、これにポリペ
プチドであるａｎｔｉ−ｈＩｇＧを結合せしめる０次い
で、水素化ホウ素ナトリウムもしくはカリウムあるいは
これと等価の還元剤に還元すれば、安定な酵素標識ａｎ
ｔｉ−ｈＩｇＧ複合体が得られる。

（３）酵素標識抗ＩｇＧ試薬 前項（２）で取得した酵素ＩＩ　ｍ　ａｎｔｉ−ｈＩｇ
Ｇ複合体は、通常リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）に血
清アルブミンを加えた溶液中に保存する。この溶液には
保存剤または安定剤としてアジ化ナトリウム、ケーソン
ＣＧ　［Ｋａｔｈｏｎ　ＣＧ　：ロームアンドハース社
製］などを加えてもよい、典型的な成分構成は前記のと
おりである。

本試薬の保存条件は、ｐＨ７，０〜８．０、好ましくは
ｐＨ７，３〜７．６、より好ましくはｐＨ７，４である
。また、温度は室温以下、好ましくは２〜８°Ｃである
。　ｐＨのｍ整は酸、例えば塩酸、硫酸などの無機酸お
よびアルカリ、例えば水酸化ナトリウム、炭酸ナトリウ
ムなどの無機塩基を添加して行えばよい。

（４）　　呈色剤試薬 ペルオキシダーゼが触媒する過酸化水素（Ｈよ０．）に
より酸化されて呈色する化合物、例えばロイコクリスタ
ルバイオレット（１ｅｕｃｏ　ｃｒｙｓｔａｌ　ｖｉｏ
ｌｅｔ；　ＬＣＶ薯に＆にラボラトリ−）、２　、２　
’−７ジノージ（３−エチルベンズチアゾリン−６−ス
ルホン酸［２、２’−ａｚｉｎｏ−ｄｉ（３−ｅｔｈｙ
ｌ　ｂｅｎｚｔｈｉａｚｏｌｉｎｅ　−６−５ｕｌｆｏ
ｎｉｃ　ａｃｉｄ；　ＡＢＴＳコなどが使用される。例
えば、ＡＢＴＳを使用した場合、可視部吸収スペクトル
の吸収極大波長は、酵素反応が進むに従って３５０ｎｍ
から４１５ｎｍに移行する。

呈色剤の１回の使用量は約０．１〜１．０ｍｇ。

好ましくは、０．４〜０．８ｍｇである。

（５）　　基質液試薬 酵素反応の基質としては０．０５〜０．６％過酸化水素
水、より好ましくは０．０８〜０．５％のものに安定剤
として０．０５〜０．２％程度のリン酸を加えたものを
使用する。１回使用量は約１．０〜３．０ｍｌ、好まし
くは２．０〜２．５ｍｌ量である。

（６）反応停止液試薬 一定時間後に酵素反応を停止するために反応停止薬とし
て０．１〜０．５％濃度のアジ化ナトリウムを添加する
。より好ましいアジ化ナトリウムの濃度は０．２〜０．
３％であり、１回量約１〜３ｍｌ、好ましくは約１．５
〜２．５ｍｌを使用する。

（７）　　＊衝液試薬 緩衝液試薬は上記呈色試薬の溶解、基質液試薬および反
応停止液試薬の希釈に使用する。

緩衝液試薬はクエン酸（３，０〜８．０％）およびクエ
ン酸塩（５，０〜１０．０％）（例えばクエン酸ナトリ
ウム、クエン酸カリウム）の０．２〜０．６Ｍ濃度溶液
として使用する。安定剤としてアジ化ナトリウム、ケー
ソンＣＧなどを加えてもよい。

該緩衝液試薬は一旦水で約５０倍に希釈し、この緩衝液
で上記の試薬を溶解もしくは希釈する。

例えば、上記呈色剤試薬をこの希釈液に溶解し、さらに
基質液試薬を加えて基質溶液とする。また、上記約５０
倍に希釈した緩衝液を反応停止液試薬に加えて反応停止
液として使用する。

（８）洗浄液試薬 洗浄液試薬はＩｇＧ抗体の定量に際して、抗原抗体反応
あるいは酵素反応の終了後に、反応系を洗浄するための
試薬であり、通常この試薬を１０〜５０倍に希釈して使
用する。該試薬はリン酸緩衝生理食塩水系の緩衝液であ
り、塩化ナトリウム１５〜３５％、リン酸塩（例えばリ
ン酸二水素ナトリウム２．０〜７．０％）、その他安定
剤、界面活性剤（例えばトウイーン（Ｉｗａｅｎ　２０
　）　）　（１，０〜３．０％）、水酸化アルカリ０．
０５〜３．０％などからなり、通常ｐＨ７，０〜７．８
、好ましくはｐＨ７，２〜７．６で使用する。

（９）　　希釈液試薬 被検者から採取した検体、特に血清の希釈に使用する。

該試薬はヒト血清アルブミンを約０．０５〜３．０％、
好ましくは約１〜２％含有する０、１〜０．３Ｍ濃度の
リン酸緩衝生理食塩水（塩化ナトリウム６〜１２％、リ
ン酸二水素ナトリウム１．０〜３．０％、水酸化アリカ
リ０．１〜１．０％、および保存剤微量よりなる）であ
り、用時約８〜１２倍、好ましくは約１０倍に水で希釈
して使用する。必要に応じ安定剤を加えてもよい。

以上の構成試薬を酵素トレサーキットとし、これと各ア
レルゲンの標準曲線作成用基準キットおよびアレルゲン
を適当な担体上に固定化したアレルゲンキットを用いて
、血清中のＩｇＧ抗体値を測定する。

本発明試薬により測定可能なアレルゲンとしては、ダニ
、卵白、スギ花粉、カモガヤ花粉、ヨモギ花粉、カビ類
［例えば、アルテルナリア（Ａｌｔｅｌｎａｒｉａ　）
、カンデダ（Ｃａｎｄｉｄａ）　］　、猫のふけなど広
範囲に及ぶ、アレルゲンキットはこれらのアレルゲンを
適当な担体、例えばガラスもしくは合成樹脂製のビーズ
、プレート、シート、チューブなど。

に固定化したものを使用できる。また、市販のアレルゲ
ン結合ヘーパーディスク［ファルマシア咎ディアグノス
ティックス社製］などを利用するとともできる。

測定操作 （ａ）　　反応容器、例えばガラスもしくはプラスチッ
ク製試験管を用意する１通常ブランク試験用２本、リフ
ァレンス用各２本ずつ数本（通常１０〜１４本）および
被検検体（通常血清）用２木を使用する。各試験管に固
定化したアレルゲンを入れる（試験管の内壁にアレルゲ
ンを固定化してもよい）。

（ｂ）　　ＩＪファレンス血清（通常６段階に倍々希釈
したもの）または被検検体を各試験管に入れ、室温で２
〜５時間振盪または回転攪拌する。

（ｃ）　　リファレンス検体および被検検体を吸引除去
し、残留固定化アレルゲンを洗浄液で洗浄する。

（ｄ）　　酵素標識抗ＩｇＧ溶液を注入して、室温で１
０〜３０時間、好ましくは１６〜２０時間攪拌する。

（Ｑ）　　試験管内液を吸引除去し、（ｃ）と同じ洗浄
操作を行なう。

＜ｆ）　　基質溶液を注入し、室温で１０〜６０分間攪
拌する。ブランクの操作はこのステップより開始する。

（ｇ）　　反応停止液を注入し、室温で約３０分間よく
攪拌する。

（ｈ）　　各試験管の反応液について、特定波長での吸
光度を測定する［例えば、ＡＢＴＳを発色剤として使用
した場合、４１５ｎｍの吸光度を測定する］。

以下に本発明実施の！ｍ様をより具体的に実施例および
参考例により示すが、本発明はこれらの実施例および参
考例に限定されるものではない。

（以下余白） 実施例１ ａｎｔｉ−ｈＩＧの　　標 西洋わきびペルオキシダーゼ（ｈｏｒｓａｒａｄｉｓｈ
ｐｅｒｏｘｉｄａｓａ　；　ＨＲＰ　；シグマ社製）２
０ｍｇを０．０１Ｍ酢酸緩衝液（ｐＨ４、５）　５ｍｌ
にとかし、これに過ヨウ素酸ナトリウム５ｍｇと０　、
　Ｏ１Ｍ酢酸緩衝液０．２５ｍ１からなる溶液を加え、
室温で２０分間インキュベートする。この溶液をセファ
デックスＧ−２５のカラム（１，５Ｘ２０ｃｍ）に通し
て、０．００１Ｍ酢酸緩衝液（ｐＨ４，５）で流出すれ
ば活性化ＨＲＰのフラクション約７ｍｌが得られる。コ
ノフラクションにａｎｔｉ−ｈＩｇＧ　２５　ｍｇおよ
び０．１Ｍ炭酸緩衝液（ｐＨ９、５）　５ｍｌからなる
溶液を加え、室温で２時間インキュベートする。

次いで水素化ホウ素ナトリウム（ＮａＢＨ＜　）　２　
ｍｇを加え、４℃で２時間インキュベートした後、セフ
ァデックスＧ−２５のカラム（１，５Ｘ２０ｃｍ）に通
し、０．０１ＭＩＪン酸緩衝生理食塩水（以下ＰＢＳと
いう）（ｐＨ７，４）で流出し、得られる複合体（フン
シュゲート）フラクションを５ｍｌまで濃縮する。これ
をセファクリル（５ａｐｈａｃｒｙｌ　）Ｓ−２００の
カラム（１，５Ｘ９０ｃｍ）に通し、０　、　ＯＬＭ　
　ＰＢＳ（ｐＨ７、４’）で流出し、５　ｍｌまで濃縮
する。これをセファロース（Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ）６Ｂ
のカラム（１，５Ｘ６０ｃｍ）に通し、０．ＯＬＭＰＢ
Ｓ（ｐＨ７゜４）で流出する。得られる非凝集フラクシ
ョンを濃縮し、濃縮物を０．１％ヒト血清アルブミン含
有０．ＯＩＭ　ＰＢＳ（ｐＨ７，４）で稀釈して、濃度
を０．１５６μｇ／ｍｌとなるように調整し、酵素標識
抗ＩｇＧ試薬の調製に使用する。

標　ａｎｔｉ−ｈＩＧの　。

酵素標識抗ＩｇＧ溶液０　、０５　μｇ／ｍｌに、ａｎ
ｔｉ−ｈＩｇＧを０．０．０２５および０．０７５μｓ
／ｍｌ添加し、それぞれり、　Ｐ、特異ＩｇＧ抗体を含
む血清での標準曲線を描いた。結果は第１図に示すとお
りである。

先ず、酵素ＨＲＰに対する酵素反応系によって呈色し、
酵素標識抗ＩｇＧに加えたａｎｔ、ｉ−ｈＩｇＧの量に
応じて吸光度の低下と［）ｏｓｅ−Ｒｅｓｐｏｎｓｅが
認められたことにより、ＨＲＰに結合しているのはａｎ
ｔｉ−ｈＩｇＧであることが判る。

実施例２ 乳釆立舅１ （４）　　酵素標識抗ＩｇＧ試薬 ヒト血清アルブミン１５．０ｇ、リン酸二水素ナトリウ
ム２水塩３．６７ｇ、　　リン酸−水素ナトリウム１２
水塩４５．３３ｇ、塩化ナトリウム１３５匹、ＨＲＰで
標識したａｎｔｉ−ｈＩｇＧｏ　、　８２５ｍｇ、およ
び保存剤（ケーソンＣＧ）９．０ｇを水１２！にとかし
、水酸化ナトリウムまたは塩酸を加えｐＨ７，４に調整
する０本品は５５０本のバイアルに分注し、１バイアル
１キツトとする（１キツトは１００回分）。

（ｂ）　　呈色剤試薬 ＡＢＴＳ　３８．６２５ｇを５５０本のバイアルに分配
し、１バイアル当り精製水３１ｍ１を加えて凍結乾燥す
る（１バイアルは１００回分）。

（ｃ）　　基質液試薬 ３０％過酸化水素水５．６０ｇおよびリン酸１゜５ｍｌ
を５５０本のバイアルに分注し、水を加えて１バイアル
当り２．５ｍｌとする。

（ｄ）　　反応停止液試薬 アジ化ナトリウム２．７７８ｇを５５０本のバイアルに
分配し、精製水を加えて１バイアル当り２ｍｌとする（
１バイアルは１００回分）。

（ａ）緩衝液試薬 クエン酸１５３．９８ｇ、クエン酸三ナトリウム２１７
．７８ｇ、および安定剤（ケーソンＣＧ）８．４２ｇを
５５０本のバイアルに分配し、精製水を加えて１バイア
ル当り５ｍｌとして水酸化ナトリウムおよび／または塩
酸でｐＨ調整する（１バイアルは１００回分）。

（ｆ＞　　洗浄液試薬 トウイーン（Ｔｗａｉｎ−２０）４２７．６３ｇ。

リン酸二水素ナトリウム２水塩１３３４．３ｇ。

水酸化ナトリウム３０１．０ｇ、塩化ナトリウム７６５
０ｇ、および安定剤（ケヘソンＣＧ）をバイアル５５０
・本に分配し、精製水を加えて１バイアル６０ｍ１とす
る（１バイアルは１００回分）。

（ｇ）　　希釈液試薬 ヒト血清アルブミン６０．５ｇ、塩化ナトリウム５４４
．５ｇ、リン酸二水素ナトリウム２水塩９４．３８ｇ、
水酸化ナトリウム２５．０ｇ、および安定剤（ケーソン
ＣＧ）　３６　、３　ｇをバイアル５５０本に分配し、
精製水を加えて１バイアル当り１０ｍ１とする（１バイ
アルは１００回分）。

実施例３ ダニ　Ｄ、　Ｐ、　　アレルゲンＩＧ　　の測（１）ダ
ニ（Ｄ、Ｐ、）アレルゲンの調製ダニ（Ｄｅｒｍａｔｏ
ｐｈａｇｏｉｄａｓ　ｐｔａｒｏｎｙｓｓｉｎｕｓ　）
を乾燥酵母および乾燥魚粉（１：１）からなる培地で、
温度２５℃、湿度７５％の条件下培養する。

増殖したダニを飽和食塩水上に浮遊させてダニだけを集
め、凍結乾燥する。これを０．０１Ｍ　ＰＢＳ（ｐＨ７
，４）中に４℃で均等に分散させ、４℃で１時間遠心分
離（３０，ＱＯＯＸｇ）する、上澄液をミリポアフィル
タ−（ｍ１ｌｌｉｐｏｒｅ　ｆｉｌｔｅｒ　：０．２２
μｍ）で濾過し、粗製のダニ抽出液を得る。

（２）Ｄ、Ｐ、アレルゲンの固定化（アレルゲンビーズ
の調製） ポリスプレンビーズ（直径１７４インチ）に１ビーズ当
り０６２ｍ１の割合で０．ＯＩＭＰＢＳ（ｐＨ７，４）
を加える０次いで、上記のダニ抽出液を２５ｇｇ／ｎ＋
１濃度に調整してビーズの混合物に加え、３７°Ｃで一
夜インキユベートする。溶液を除去し、残留ビーズを０
．ＯＩＭＰＢＳ（ｐＨ７，４）で３回洗浄する。これに
１％ヒト血清アルブミン含有０．ＯＬＭ　ＰＢＳ（ｐＨ
７，４）を加えて３７°Ｃ１時間インキュベートする。

溶液部を除去、残留ビーズをＯ、ＯＩＭ　ＰＢＳ（ｐＨ
７゜４）で３回洗浄し、１％ヒト血清アルブミン含有０
　、　ＯＬＭ　　ＰＢＳ（ｐＨ７、４）を加え、３７℃
で３時間インキュベートした後、溶液部を除去してり、
　Ｐ、アレルゲン固定化ビーズを得る。

（３）試薬の用時調製 （ａ）緩衝液 精製水２５０ｍ１に緩衝液試薬１バイアル中の内容物（
５＋ｎｌ）全量を加えて混和する。

（ｂ）希釈液 精製水１００ｍ１に希釈液試薬１バイアル中の内容物（
１０ｍｌ）全量を加えて混和する。

（ｃ）洗浄液 精製水１５００ｍｌに洗浄液試薬１バイアル中の内容物
（６０ｍｌ）全量を加えて混和する。

（ｄ）基質溶液 呈色剤試薬１バイアルに緩衝液３０ｍ１を加えて溶解し
、次いで基質液試薬２ｍｌを加えて混和する。

（ｅ）反応停止液 緩衝液２００ｍ１に反応停止液試薬１バイアル中の内容
物（２ｍｌ）全量を加えて混和する。

（４）リファレンス血清の調製 ダニ（Ｄ、　Ｐ、　）アレルゲン特異ＩｇＧ抗体を高濃
度に含む患者血清（抗体値１０００　Ｕ／ｍｌ）を０．
１％ヒト血清アルブミン溶液で希釈し、下記のダニ（Ｄ
、　Ｐ、　”）リファレンス血清を調製する。

リファレンス血清Ａ（抗体値２０Ｕ／ｍｌ）リファレン
ス血清Ｂ（抗体値１０Ｕ／ｍｌ）リファレンス血清Ｃ（
抗体値　４Ｕ／ｍｌ）リファレンス血清Ｄ（抗体値　２
Ｕ／ｍｌ）リファレンス血清Ｅ（抗体値　ＩＵ／ｍｌ）
リファレンス血清Ｆ（抗体値０　、４　Ｕ／ｍ１）（５
）検体の調製 患者血清２０ａｌに希釈液１ｍｌを加えて混和し５１倍
希釈液をつくる。

（ｂ）操作手順 （ａ）フランク用２本、リファレンス血１１ｆＡ−Ｆ用
各２本（計１２本）および被検検体用各２本ずつの内径
約ｌｅａのプラスチック製試験管に上記のダニ（Ｄ、？
、）アレルゲン固定化ビーズを１個宛撮入する。

（ｂ）リファレンス血清Ａ−Ｆおよび被検検体各２００
ｍ１を上記試験管に注入し、室温で３時間ローチーター
傾斜回転（３０〜３５回転／分）を行う。

（ｃ）リファレンス血清および被検検体を吸引除去し、
ビーズを洗浄後２ｍｌで３回洗浄する。

（ｄン各試験菅に酵素ｔｌＩ識抗ＩｇＧ溶液２００ｍ１
を注入し、室温で１６〜２０時間ローチーター傾斜回転
（３０〜３５回転／分）を行う。

（ｅ）抗ＩｇＧ溶液を吸引し、（ｃ）と同様の洗浄操作
を行う。

（ｆ）基質溶液をブランク用を含めた全ての試験管に３
００μＰずつ注入し、室温で３０分間ローチーター傾斜
回転を行う。

（ｇ）各試験管に反応停止液２ｍｌを注入し、ポルテッ
クスミキサーでよく攪拌する。

（ｈ）各試験管の反応液について、４１５ｎｍの吸光度
を測定する。

（ｉ）リファレンス血清Ａ−Ｆの吸光度からブランクの
吸光度をひいた値を片対数グラフにプロットしてリファ
レンス曲線を描き、被検検体のブランクをひいた吸光度
値を用いて、被検検体のダニ（Ｄ、Ｐ、）アレルゲンＩ
ｇＧ抗体値を得る。

（７）結果 吸光度の測定結果および被検検体（アトピー性アレルギ
ー疾患で治療中の３患者血清）の読取り値を第１表に示
し、リファレンス曲線を第２図に示す。

第１表 なお、卵白固定ビーズおよび卵白特異ＩｇＧ抗体を含む
血清を用いて前記と同様の反応操作を行ない、第３図に
示す希釈曲線を得た。なお図中Ｎ５Ｂ（非特異的結合）
の値は希釈液を用いて測定した値である。

艶曳忽 （１）　　抗ヒトＩｇＧ抗体産生ハイブリドーマの調製 ＢＡＬＢ／Ｃ系マウス（８〜１０週令）を、ヒト血清由
来のＩｇＧ２００Ｉ１ｇ（１００μ！生理食塩水）をフ
ロイント完全アジュバント１００μ！と共に腹腔的投与
して免疫した。２１日後、更にヒト血清由来のＩｇＧ　
２０μｇをミョウバン沈降物として腹腔的投与した。３
日後に肺臓を摘出し、ＲＰＭＩ培地を用いて細胞浮遊液
を調製し、１０８個の肺臓細胞を含むＲＰＭＩ培地１０
ｍ１を、予めＲＰＭＩ培地１０Ｉ１１１中に浮遊きせた
５Ｘ１０’個のＭＳ−１骨髄腫細胞と混合した。この混
合物を４５０ｇで１０分間遠心し、上清液を除去した０
次いで５０％ＰＥＧ　４００Ｇ（メルク社製）を含むＲ
ＰＭＩ培地（ＲＰＭＩ−１８４０）１ｍｌをゆるやかに
攪拌しながら添加した。更に１分間攪拌した後、ＲＰＭ
Ｉ溶液の追加量１ｍｌを１分間を要して添加した。同じ
く１ｍ１を追加した後、同溶液７ｍｌを約３分を要して
添加した後、４００ｇで１０分間遠心分離して上清液を
除去し、得られた細胞を１５％ウシ胎児血清（以下ＦＣ
５という）を含むＲＰＭＩ−１６４０培地２０ｍ１に浮
遊させて、組織培養プレート（フーニング社製９６穴）
２枚の各ウェルに１００μ！ずつ接種し、７％炭酸ガス
の存在下３７°Ｃで培養した。

１日、２日、３日、５日および８日後に各培地の半量を
ＨＡＴ培地（１０％ＦＣ５，４Ｘ１０−’Ｍアミノプテ
リン、１．６Ｘ１０−’Ｍチミジン、１×１０−’Ｍヒ
ボキサンチンを添加したＲＰＭＩ−１６４０培地）と交
換し、更に培養を続けた。培養の１１日、１３日、１４
日目に培地の半量をＩＩ’培地（１０％ＦＣ５，１，６
Ｘ１０−６Ｍチミジン、１×１０−４Ｍヒポキサンチン
を添加したＲＰＭＩ−１６４０培地）と交換した。

融合操作開始から１６日後、全てのウェルからハイブリ
ドーマのコロニーが出現した。このハイブリドーマを１
５％ＦＣ５を含むＲＰＭＩ−１６４０培地中で培養し、
その培養土清液中の特異抗体産生の有無を次のようにし
て検定した。

培養上清を被検液とし、被検液５μ２と１０％ＦＣ５を
加えたリン酸塩緩衝食塩水（以下ＰＢＳという）５０μ
！とをＵ底組織培養用プレートの各ウェルに採る。　Ｕ
ＪＩ！プレートの各ウェルにヒトエ（感作ヒツジ赤血球
１％浮遊ｆ１１５０μ！を加え、鈴かに攪拌する。２時
間室温に静置後、血球凝集の有無を判定した。結果を第
１表に示す。

第１表 ■　抗ヒｌ−ＩｇＧ抗体産生細胞株のクローニング ■により得られた抗ヒトＩｇＧ抗体産生ハイブリドーマ
を、１５％ＦＣ５を含むＲＰＭＩ−１６４０培地中に、
５個／ｆ１１１の濃度になるように浮遊させ、各ウェル
が１００μ！となるように組織培養プレート（フーニン
グ社製９６穴）の４０ウエルに接種した０次いで該浮遊
液を１個／ｍｌ濃度に希釈して３２ウエルに接種し、更
に０．５個／ｍｌ濃度に希釈して２４ウエルに接種した
。５日後に１５％ＦＣ５７ＪＣＩＲＰＭＩ−１６４０培
地１００μ！を各ウェルに追加した０例えば、クローン
ＨＧ２−２５の場合培養１０日後、０．５個／ｍｌ濃度
の２４ウエルの中２ウェルに、また１個／ｍｌ濃度の３
２ウエルの中４ウェルにハイブリドーマクローンが出現
した。各クローンの培養上清につき抗体産生能を検定し
た。

［試験結果］ 全クローンに抗体産生能が認められた （３）　　抗ヒトＩｇＧ抗体の産生 あらかじめブリステン０．５ｎｌで腹腔内投与処理した
ＢＡＬＢ／Ｃマウスの腹腔内に、前工程で取得した抗ヒ
トＩｇＧ抗体産生ハイブリドーマを５Ｘ１０’個宛０．
５ｍｌの生理食塩水に懸濁し移植した。３週間後、°７
ウスの腹部肥大を確かめて、注射器で腹水を採取し、遠
心操作により細胞を除去した。

（（抗ヒトＩｇＧ抗体の分離精製 前工程で採取した腹水を４５％飽和硫酸アンモニウム水
で塩析し、生じた沈澱を０．，１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ
８，０）に溶解後、同波にて透析した。腹水より塩析に
て得られたガンマ−分画２０ｍｇを０，１Ｍリン酸緩衝
液（ｐＨ８、０）　２ｍｌにとかし、プロティンＡ−セ
ファローズ［ファルマシア社（Ｐｈａｒｍａｃｔａ　Ａ
Ｂ）コのカラム（１，６Ｘ５ｃｍ）に吸着させた。先ず
、０゜１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ８，０）約５０ｍ１で不
純物を流出し、次いで０．１Ｍクエン酸緩衝液（ｐＨ５
，０）約１００ｍ１で溶出してモノクローナル抗ヒトＩ
ｇＧ抗体ＨＧ２−２５を得た。

ハ。発明の効果 （１）本発明で用いるモノクローナル抗体ａｎｔｉ−ｈ
ＩｇＧは極めて高い特異性を有している。すなわち、ポ
リクローナル抗ヒトＩｇＧ抗体では測りえない特異Ｉｇ
Ｇ抗体の測定が可能である。以下に示す実験例により優
れた特異性を証明する。

［実験方法］ 蜂毒特異ＩｇＧ抗体５Ｕ／ｍｌを含む血清を０．５％正
常ヒト血清を含む希釈液で希釈し、特異抗体０．１，０
．２．０．５，１．０，２．０および５　、　ＯＵ／ｍ
ｌ含有の標準液を作成し、各溶液と蜂毒アレルゲンディ
スクと室温で３時間反応させたのち、ディスクを洗浄、
至適濃度の＋　１１１ＪＩ識モノクロ一ナル抗体ａｎｔ
ｉ−ｈＩｇＧおよび市販ポリクローナル抗ヒトＩｇＧ抗
体（ファルマシア社製）とを反応させて洗浄後カウント
し、標準曲線を得る。

［結果］ 図４に示すごとく、本発明で用いるモノクローナル抗体
ａｎｔｉ−ｈＩｇＧは０　、　Ｉ　Ｕ／ｍｌにおける結
合率が低く非特異的結合が低いと考えられる。その上、
最高濃度における結合率はポリクローナル抗体よりも高
く、特異性の高い値が得られる。

■本発明のａｎｔｉ−ｈＩｇＧは高いアレルゲン特異性
を示し、目的のアレルゲン結合抗ＩｇＧ抗体と特異的に
結合する。

［実験方法］ ダニ（Ｄ、Ｐ、）特異１ｇＧ抗体を含む２００倍希釈標
準血清１００μ夕をダニ（Ｄ、Ｐ、）アレルゲンディス
クおよび卵白アレルゲンディスクと室温で３時間振盪反
応させたのち、反応液５０μ！を用いて残存ダニ（Ｄ、
Ｐ、）アレルゲン特異ＩｇＧ抗体を測定した。

［結果］ 第５図に示すようにダニ特異ＩｇＧ抗体は卵白アレルゲ
ンディスクで吸収されず、ダニアレルゲンディスクの枚
数に応じて吸収され、アレルゲン特異性が認められる。

（３）本発明で用いるａｎｔｉ−ｈＩｇＧは非特異Ｉｇ
Ｇとは結合が極めて少なく、本発明のキットを用いて行
うアレルゲン特異ＩｇＧ測定に非特異ＩｇＧの及ぼす影
響は殆ど認められない。

［実験方法コ 前記の標準血清を用いて特異ＩｇＧ抗体の最高濃度を１
０００ユニツト／ｍｌとし、段階希釈してその僅に対応
させ８０検体につき標準曲線からダニ（Ｄ、Ｐ、）特異
ＩｇＧ抗体を測定する。同時に総ＩｇＧ値を測定し、両
者の相関性を調べる。

［結果］ 第６図に示すようにダニ特異ＩｇＧ抗体の測定値と総Ｉ
ｇＧ値の間には、相関係数ｒが０．３５４であることか
ら相関性は認められず、特異ＩｇＧ抗体の測定結果に対
する非特異ＩｇＧの影響は極めて少ないと認められる。

（４）本発明のキットを用いて行う特異ＩｇＧ抗体の測
定法は極めて精度のようものである。

［実験方法］ アトピー性アレルギー患者血清でダニ（Ｄ、　Ｐ、　）
特異ＩｇＧ抗体濃度の異なる４検体（Ｉ〜■）およびリ
ファレンス血清Ａ−Ｆにつき、２倍希釈法にて５０〜１
６００倍希釈し、実施例３の方法に従って反応させた後
４１５ｎｍの吸光度を３重測定し、両対数グラフを用い
吸光度と希釈倍率の関係をプロットする。

［結果〕 第７図に示すように、ゾファレンス血清Ａ−Ｆおよび４
検体すべての吸光度と希釈倍率の間に直線性が認められ
、かつそれら直線の間には平行性が認められた。

（９本発明にかかるキットを用いた測定法は極めて感度
の良いものである。

［実験方法］ リファレンス血清Ｆ（抗体値０゜４Ｕ／ｍｌ）を２倍希
釈法で２〜６４倍希釈し、リファレンス血清Ｃ，Ｄ、　
Ｅ、　Ｆとともに実施例３の方法に従って反応きせ４１
５ｎｍの吸光度を５重測定し、片対数グラフに平均吸光
度と抗体値の関係をプロットする。

なお、希釈液をＮＳＢとして同様の測定（１０重測定）
を行なう。

［結果］ 測定感度は第８図に示すようにリファレンス血清Ｆの４
倍希釈（矢印）またはそれ以上であり、希釈液の吸光度
は極めて低く、４倍希釈液のそれとは明らかな差が認め
られる。２倍希釈液および４倍希釈液のバラツキは、変
動係数（Ｃ，Ｖ、％）で７％以下であった。

【図面の簡単な説明】

第１図は酵素標識抗ＩｇＧ（０、０５ｔｌ　ｇ／ｍｌ）
を用いてダニ（Ｄ、Ｐ、）特異ＩｇＧ抗体を測定したリ
ファレンス曲線を示し、縦軸が吸光度、横軸がダニ（Ｄ
、Ｐ、）特異ＩｇＧ抗体の抗体値を表わす、Ｏｌ・およ
び△はそれぞれ一定量の酵素標識抗ＩｇＧに加えて、ａ
ｎｔｉ−ｈＩｇＧの濃度が０．０．００２５μｇ　／　
ｍｌおよび０．００７５μｇ／ｍｌである場合を示す。 第２図はリファレンス血清Ａ−Ｆを用いて得たリファレ
ンス曲線を表わし、縦軸が吸光度、横軸がダニ（Ｄ、Ｐ
、）特異ＩｇＧ抗体値を表わす。 第３図は卵白をアレルゲンとして得た陽性血清希釈曲線
を示し、縦軸が吸光度、横軸が陽性血清希釈倍数を表わ
す。 第４図は市販ポリクローナル抗体および本発明のモノク
ローナル抗体を用いてダニ（Ｄ、Ｐ、）特異ＩｇＧ抗体
を測定して得た吸光度（縦軸）と血清希釈度（横軸）の
関係を示す。 第５図はダニ（Ｄ、Ｐ、）アレルゲンディスクおよび卵
白アレルゲンディスクを用いてダニ（Ｄ、Ｐ、）特異Ｉ
ｇＧ抗体を測定して得た吸光度（縦軸）とディスク枚数
（横軸）の関係を示す。 第６図はダニ（Ｄ、Ｐ、　）特異ＩｇＧ抗体量（縦軸）
と総ＩｇＧ値（横軸）の相関関係を示す。 第７図はリファレンス血清および検体血清希釈液の吸光
度（縦軸）と抗体値（Ｕ／ｍｌ）または血清希釈度（横
軸）の関係を示す。 第８図はリファレンス血清希釈液の吸光度（縦軸）と抗
体値ｌｆ軸）の関係を示し、矢印は測定感度の限界を示
す。 第　　１　　図 Ｕ／ｍＩ Ｆ　　　　　　ＥＤＣＢＡ （Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ） 第　　３　　図 陽性血清希釈倍数 第　　４　　図 Ｂ／Ｔ（％）

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 （１）ペルオキシダーゼで標識したａｎｔｉ−ｈＩｇＧ
   ．（２）下記の成分からなる酵素標識抗ＩｇＧ試薬。 （イ）ヒト血清アルブミン０．０６〜０．２％（ロ）リ
   ン酸二水素ナトリウム０．０２〜０．０４％（ハ）リン
   酸−水素ナトリウム０．３〜０．４％（ニ）塩化ナトリ
   ウム０．８〜１．１％ （ホ）ペルオキシダーゼで標識したａｎｔｉ−ｈＩｇＧ
   ０．０１〜０．０２％（ヘ）保存剤微量 （ト）酸および／またはアルカリ適量 （３）下記の構成成分からなる特異ＩｇＧ試験用試薬。 （イ）酵素標識抗ＩｇＧ試薬 （ロ）呈色剤試薬 （ハ）基質液試薬 （ニ）反応停止液試薬 （ホ）緩衝液試薬 （ヘ）洗浄液試薬 （ト）希釈液試薬 （４）呈色剤試薬がＡＢＴＳである特許請求の範囲（３
   ）記載の特異ＩｇＧ試験用試薬。 （５）基質液試薬が過酸化水素水０．０５〜０．６％お
   よびリン酸０．０５〜０．２％よりなる特許請求の範囲
   （３）記載の特異ＩｇＧ試験用試薬。 （６）反応停止液試薬がアジ化ナトリウムである特許請
   求の範囲（３）記載の特異ＩｇＧ試験用試薬。 （７）緩衝液試薬がクエン酸３．０〜８．０％、クエン
   酸三ナトリウム５．０〜１０．０％、および安定剤適量
   よりなる特許請求の範囲（３）記載の特異ＩｇＧ試験用
   試薬。 （８）洗浄液試薬が界面活性剤１．０〜３．０％、リン
   酸二水素ナトリウム２．０〜７．０％、水酸化アルカリ
   ０．０５〜３．０％、塩化ナトリウム１５〜３５％、お
   よび安定剤適量よりなる特許請求の範囲（３）記載の特
   異ＩｇＧ試験用試薬。 （９）希釈液試薬がヒト血清アルブミン０．０５〜３．
   ０％、塩化ナトリウム６．０〜１２．０％、リン酸二水
   素ナトリウム１．０〜３．０％、水酸化アルカリ０．１
   〜１．０％、および保存剤微量よりなる特許請求の範囲
   （３）記載の特異ＩｇＧ試験用試薬。