JPH01297556A - アルギニノコハク酸リアーゼの免疫学的定量法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 ［産業上の利用分野］ この発明は、アルギニノコハク酸リアーゼの免役学的定
量法に係り、特に抗ヒトアルギニノコハク酸り７一ゼ抗
体を使用してアルギニノコハク酸リアーゼを定量刃る方
法及びそのための定量用試薬に関する。

［従来の技術］ アルギニノコハク酸リアーゼ（ＡＳＬ＞は、尿素回路又
はアルキニン合成系の一員でめり、主として アルキニノ］ハク酸≠フルキニン十］ハク酸の反応を触
媒する酵素である。

また、ヒトにおいてこのＡＳＬか遺伝的に欠（（１する
と、アルギニノコハタ酸の代謝が阻害されてこのアルギ
ニノコハタ酸か尿、血液、’ＫｆＡ液等の体液中に蓄積
するＡＳＬ欠損症（アルギニノコハク酸而症あるいはフ
ルギニノロハクＭ尿症ともいう）となり、尿素回路代謝
異常（こ畢いで高）７ンーＥニア而症をきたし、けいれ
んや嘔吐、意識障害、知能師害等の中枢神経症状を引き
起こす。ぞして、この疾患の診断は、尿中アルギニノコ
ハク酸のＤ１泄増量を測定したり、必るいは、赤血球△
Ｓ　Ｌの欠損をぞのＡＳＬ活性を測定することで証明す
ることにより行われている。

しかしなから、このアルギニノコハク酸の代謝をつかさ
どるＡＳＬについてはその定量法が確立８れであらず、
このＡＳｌ−欠損症の病因の解明やその正確な診断を迅
速に行うのか困難で必り、少量の検体で正確にこの△Ｓ
［を定量しく（する方法の開発か要請されていた。

［発明か解決しようとする課題］ 従って、本発明の目的は、例えば血清、而４ｆｌ。

赤血球、繊維芽細胞、羊水細胞等のヒト由来の体液ある
いは組織、その他の種々の生物組織中に存在ηるＡＳｌ
を少量の検体で正確に定量し得るＡＳｌ一定量法及び定
量用試薬を提供することにある。

また、本発明の他の目的は、ＡＳＬ欠損症において、そ
れか完全欠損症であるが、部分欠損症であるか、あるい
は、（の保因者であるか等のＡＳＬ欠損症に閉覆る正確
な診断をするための方法として利用できるＡｓｋ定量法
及び定量用試薬を提供することにある。

さらに、本発明の他の目的は、抗ヒトアルギニノ］ハタ
酸リアーゼ抗体を使用して検体中のアルギニノコすク酸
リアーゼを免疫学的に定量するＡＳ１定準法及び定量用
試薬を提供することにおる。

Ｆ課題を解決するための手段］ すなわち、本発明は、抗アルギニノコハタ酸リアーゼ抗
体、好ましくは抗ヒトデルキニノコハク酸リアーゼ抗体
（抗ヒトＡＳＬ抗体）を使用し、ＥＬＩＳＡ（，１ンザ
イムリンクトイムノソルベントアツセイ）法により検体
中の７フルキニノコハク酸り７−セ（ＡＳＬ）を定ｍ−
＝ｊるアルキニ／］ハク酸リアーゼの色疫学的定吊法及
び定量用試薬である。

水発明方払で使用覆る抗アルキニノコハタ酸リアーゼ抗
体は、好ましくはじト■■臓がらｌｌ＃Ｉ製ヒト△ＳＬ
を調製し、この精製ヒトＡＳＩ−を家兎、モルモット、
山羊等の適当な免疫動物に免疫しτｉ？？られる抗血清
から調製する。なお、以下の説明では、このヒ１〜肝臓
から調製される精製ヒトＡＳＬを使用する場合を例にし
で説明する。

そして、上記ヒト肝臓から精製ヒトＡＳＬを調製する方
法としては、基本的にはパルカー・マンタゴスの方法（
Ａ、　Ｇ、　Ｐａ１ｅｋａｌ”　ａｎｄ　ｓ、　Ｈａｎ
ｔａｇｏｓ。

、Ｌ　Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅｍ、、　２５６．　ｐ９１９
２−９１９４（１９８１））に従って行う。この方法に
おいて、その最終ステップの陰イオン交換樹脂カラムク
ロマトグラノイーによる分離方法では安定性か悪く完全
精製が困難であるので、この最終ステップの分離方法と
して好ましくはアフィニティークロマトグラノイーを採
用するのかよい。

このようにして調製された精製ヒト△Ｓ　Ｌを抗原とし
て用い、抗血清を得る方法としては、この技術分野で広
く知られている方法、例えば七ツク「］−ナル抗体を製
造覆るための細胞融合技術による方法や、動物を宿主と
じで抗原を免疫し、生体中で抗体を産生させ、この動物
の血液中からポリクローナル抗体を採集する方法か用い
られる。抗ヒトＡＳＬ−抗体を得るための具体的り法と
しては、オブライエン・バールの方法（Ｗ、［、Ｏ’Ｂ
ｒ１ｅｎ　ａｎｄＲｌｌｌ、Ｂａｒｒ、　Ｂｉｏｃｈｅ
ｍｉｓｔｒｙ、　２０．ｐ２０５Ｂ−２０６０（１９８
１）〉の開示がある。得られた抗血清は次に抗体上白を
分子！Ａ１情製精製ための従来公知の方法、例えば研（
安分画や陰イオン交換樹脂等の方法により免疫グロブリ
ンＧ（ＩｇＧ）にまで精製される。

次に、このようにして１ｑられた抗じトＡＳＬ抗体は適
当な酵素で標識され、酵素標識抗体として使用される。

この目的で使用される酵素としくは、ペルオキシダーゼ
、アルカリホスファターゼ、β−ガラクトシダーセ等の
従来公知の種々のものを使用できるが、好ましくはペル
オキシダーゼであり、その酵素標識方法としてもグルタ
ルアルデヒド法、過ヨード酸法、マレイミド法等の従来
公知の方法を採用できるか、好ましくはｌ’ＪＧ　（７
）　Ｆ　ａｂ“のじンジ部のヂオール阜と反応するマレ
イミド・ペルオキシダーゼを使用する石川らのマレイミ
ド法（■）　（Ｅ、　Ｉｓｈｉｋａｗａ、　Ｈ，Ｉｍａ
ｇａｗａ、　Ｓ、　）ｌａｓｈｉｄａ、Ｓ、　Ｙｏｓｈ
ｉｔａｋｅ、　Ｙ、　Ｈａｍａｇｕｃｈｉ　ａｎｄ　ｒ
、　ｌ１ｅｎｏ、　Ｊ。

ｌｍｍｕｎｏａｓｓａｙ、　４．　ｐ２０９−３２７（
１り８３）　）かよく、この方法により抗ヒトＡＳＬ抗
体のＦａｂ’−ベルオキシダーし複合体（Ｆａｂ’−Ｐ
ＯＩ）　）が調製される。

一方、ＥＬＩＳＡ法により検体中のＡＳＬ濃度を測定す
る際にマイクロプレートを］−卜するために使用するＩ
ｇＧ　（以下、［基準ＩａＧＪという）については、上
述のようにして抗血清から得られたＩＣＩＧをざらに精
製して使用する。この際の精製方法としては、Ｎ−ハイ
ド」］キシサクシンイミト活竹化ゲル、トレシル活性化
ゲル、ジビニルスルホン活性化ゲルあるいはアクチゲン
Ａ等の従来公知の方法を適宜採用できるが、好ましくは
支持体として臭化シアン９８理によって活性化させた７
カロースグルを使用し、これに精製ＡＳＬを結合させて
親相竹吸肴体を調製し、この親和ｔｉｔ吸着体を使用す
るアフィニティークロマトグラフィーにより＃ｊ製づる
のかよい。

以上のようにして調製された抗ヒトＡＳ１．−抗体のＥ
ａｂ’−ペルオキシダーセ複合体（Ｆａｂ’−ＰＯＤ　
）と阜Ｃ（月ＵＧとを使用１６Ｅ　１．−　Ｉ　ＳＡ法
によるＡＳＬ蛋白の免疫学的定量は、例えば、先ずマイ
ク１」プレートの各穴を基準１（ＪＧ　ｒコートし、次
いで牛血清アル１ミン等の血清アルブミンでブＬ１ツキ
ングし、燐Ｍｌ函溶液（ＰＢＳ）等の生理的塩類溶液で
希釈した検体を入れて一次反応させ、次い″Ｃ洗浄後に
ｌ：ａｂ’−ＰＯＤを入れて二次反応させ、再磨洗浄し
た後に過酸化水素と０−ノエニレンシアミンを加えてペ
ルオキシターｔ：’　（ＰＯＤ＞活性を測定することに
より行う。

本発明方法が適用される検体としては、それか溶液状態
で得られるものであればどのようなものでもよく、例え
ば、血清、血漿、赤血球の溶面溶液や、培養繊維芽細胞
や培養羊水細胞等のヒト細胞に凍結融解法を適用して得
られる細胞抽出液等を挙げることかできる。

［実施例１ 以下、実施例に基いて、本発明方法を具体的に説明覆る
。

（１）ヒト肝臓から精製ヒトＡＳＬの調製パルカー・マ
ンタゴスの方法（Ａ、　Ｇ、　Ｐａ１ｅｋａｌ’ａｎｄ
　Ｓ、　　Ｍａｎｔａｇｏｓ、　　Ｊ、　　Ｂｉｏｌ、
　　Ｃｂｅｍ、、　　２Ｆ＋６．　　ｐ９１９２−９１
９４　（１９８１）　）におけるその最終ステップの［
陰イオン交換樹脂カラムクロマトグラフィーによる分離
］に代え、へＦ−レッドトヨパール（東洋曹達ｑｌ製７
フイニデイークロマトグラノイー用充頃剤）を使用する
７フイニテイークロマ］・グラフィーを採用した。この
ために、先ず、０．０１ｍｏｌ／、１１燐酸カリウム溶
液（ｐＨ７，０）で平衡させたアノイニティー力ラムの
−ｋｊ寺イ本にＣＭセルロース・カラムク目ントグラノ
イーで得られた脱塩酵素製剤を適用し、次いでこのカラ
ムを同じ緩Ｖ１■液で洗浄し、それからＱ、　４ｍｏｆ
／、Ｑの塩化カリ「クムを含有するＱ、　１ｍｏｌ／Ｎ
燐酸力１戸燐酸力演（ｐｔ１７．５＞で△Ｓ１−を溶離
させた。

活性画分を集め、これをセントリフＤ　ＣＦ　−２５（
Ｃｅｎｔｒｉｆｌｏ　ＣＦ−２５、米国７ミコンネ１製
〉で濃縮し、そして、−２０°Ｃで２０ｗｔ％−グリセ
ロール溶液中に保存した。

このようにして得られた精製ヒトＡＳＬはパルカー・マ
ンタゴスの方法（前出）に記）ホされ（いる値と同じ高
さの比活性２０　（１／ｍｙを示し、８１）Ｓ−ポリフ
ックリルアミドゲル電気泳動で単一の帯を与えた。

（２）抗ＡＳＬ抗体の調製 宿主動物として家兎を使用し、オブライエン・バールの
方法（前出）に従って上記精製ヒトＡＳ１−の抗血清を
調製し、得られた抗血清を硫安分画及び陰イオン交換樹
脂により常法に従って免疫グロブリンＧ（ＩＣＩＧ＞に
まで精製し、抗ＡＳＩ−抗体を調製した。

この抗ＡＳＬ抗体（ＩｇＧ＞は、オフテロ二−二重免疫
拡散法によって単一特異性を有する抗体であることか確
認された。

（３）　Ｆａｂ’−ペルオキシダーセ複合体（Ｆ　ａｂ
’　−ＰＯＯ）の調製 次に、石川らのマレイミド法（１）　（前出）に従い、
ペルオキシターゼをＮ−（４−カルホキジシクロヘキシ
ルメチル）マレイミドのＮ−ヒドロキシサクシニミドエ
ステルと反応させてマレイミド・ペルオキシダーゼとし
、これに上記（２）で得られた抗ヒトΔＳ１−抗体の１
−ａｂ’を反応させてＦａｂ−ベルオキシダーピ復合体
（Ｆａｂ“−Ｐｏｏ）を調製した。

（４）　Ｆｌ−Ｉ　Ｓ　Ａ法用基準ＩＩＧの調製ｔ＝Ｉ
−Ｉｓ△法で検体中のＡＳｌｊｌａ度を測定する際にマ
イクロプレートを二１−トするために使用覆る基準１ｇ
（３については、上記（２）で゛得られたＩ（ＩＧをざ
らにアノイニティーク［１マドグラフイーで精製しで調
製した。

号なわら、支持体として臭化シアン処理によって活↑（
↓化させたアカロースゲル（スウェーデン国ノアーマシ
アス［装面品名：　　ＣＮＢｒ−活第１セファロース４
Ｂ）を使用し、フ７−マシア社の指示に従ってこれに精
製△Ｓ１を結合させ、ゼファＬ１−ス４Ｂにリンクした
△８１−のアフィニティーカラムを調製し、１５ｍ　ｍ
ｏｌ／、１）の酢酸バッファ（ｐＨ３，１）を展開液と
して基準ｌｌ１Ｇを溶離８せだ。

（５）検体の調製 サンプルとして赤血球を使用し、この赤血球を３倍量の
水に溶面させて検体とした。

また、サンプルとして培養繊維芽細胞〔（２〜４）Ｘ１
０６細胞〕を使用し、これらに０．１Ｍ燐酸カリウム溶
液（ｐｔｌ　７．５＞　１０Ｃ１，Ｏを加えて凍結融解
を２回繰返し、次いで１２，０ＯＯＸ！Ｊ、１０分の条
件で遠心分離し、得られた一ト澄液を検体とした。

（６）ＥＬＩＳＡ法による検体中△Ｓ１−の定量９６穴
のマイクロル−トを使用し−Ｃ第１表に示す検体中の△
Ｓｔ−を定量した。この定量に当って、先ず、上記（４
）で調製した基準Ｉ（ＪＧを使用し、０．０５ｍｏｌ／
ρ−炭酸塩緩肖液（ｐｔｌ　９．６）中に？Ｐ１度４０
μ９７ｍ２で基準ＩｇＧを添１１１シて得られた基準１
［ＪＧ温溶液調製し、この基準１ｇＧ溶液５０μ、Ｑを
マイ’１０）Ｌ／−ト（７）各人（基準１（ＩＧ　２０
０　ｎｒｐ　／穴）に添／ＩＩ　Ｌ、４°Ｃで゛１侵保
存してこの各人を畢準ＩｇＧでコートし、各人の残りの
部位を２０ｍＦＪ／ｍρ溌度の生血清アルブミン（ＢＳ
Ａ）の燐酸緩衝溶液（＋−）Ｂ　Ｓ　）を使用して３７
°Ｃ１２時間の条件でブロッキングした。それから、各
人を０　、．５　ｍｆｆ　／’、１）のポリオキシエチ
レンソルビタンラウレート（Ｔｗｅｅｎ−２０）を含有
するＰＢＳで洗浄し、”Ｉｙ／’、ＱのＢ　Ｓ　Ａを含
有するＰＢＳで希釈した上記各検体あるいは精製ヒトＡ
ＳＬの５０μρを添加し、４°Ｃで一夜インクへ一トシ
た（−次反応）。

この−次反応終了後、洗浄してから上記（３）で゛得ら
れた０、２ｍｇ／’ｊ　’Ｉｆａ度のＦ　ａｂ’−ＰＯ
Ｄ溶液５０μ店を添加し、３７°Ｃて３０分間インクベ
ートしたく二次々応）。

この二次反応路γ後、再び洗浄し、次いで３０ｗｔ尼−
過酸化水素０　、４　ｍｌ　／　、ＱとＯ−ノエニレン
シアミン０．４ｙ＃を含有する０、１ｍｏｌ＃　−’ｙ
土ンＭ塩−燐酸塩緩衝液（ｐｔｌ　５．０）　１００μ
、Ｑを添ｈ［１シ、室温で２０分間インクベートした後
、２ｍｏｌ／、ｌＪ　−硫酸溶液１０Ｃ１ｆＪを添／Ｉ
［Ｉ　Ｌ、て反応を停止させた。

このようにして反応を停ＬＬさせた後、自動Ｆｌ−ＩＳ
Ａ測定機（フィンランド国うブシステムズ社製）を使用
し、４９２ｎｍのカラー強度を測定した。

精製ヒトＡＳ＋を使用して得られたＡＳＩ−Φ白定量の
標準曲線を第１図に示す。この第１図から明らかなよう
に、精製ヒトＡＳＬ１ｎ（］／ｉ　（５０Ｄ（］／穴）
　〜３０　ｉ／ｄ　（１，５ｎ（］／穴）の間でほぼ直
線となり、１．０００倍希釈の赤血球溶血液でＡＳＬ蛋
白を検出できるレベルの感度をもすることが判明した。

また、第１表に示す各検体についてそれぞれ測定された
ＡＳＬ定量結果を第１表に示覆。

（７）各検体のＡｓ１−活性の測定 比較対照として、第１表に示す各検体についてそのＡＳ
Ｉ活す４を小林らの方法（Ｃ１１ｎｉｃａ　Ｃｈｉｍｉ
ｃａ　Ａｃｔａ、　１５９（１９８６）５９−６７＞に
従って比色定量的に測定し、上記（６）で測定されたＡ
ＳＬ定Ｅｄ結果と比較した。結末を第１表に示寸。

この第１表の結果から明らかなように、各検体における
Ｆ、ｔｌＳ八測へ１泊はＡＳＩ−活性の測定値とよく相
関していることかわかる。また、各検体についてそのＡ
ＳＩ活性を測定するのに約１０５個の細胞を要したか、
本発明のＦＬＩＳＡ法では約３０分の１の吊の細胞で測
定することができた。

第１表 （注）＊１：コントロール（正常人２８例の平均値）＊
２：コントロール（正常人４例の平均値）［発明の効果
］ 本発明によれば、生体液（白液等）あるいは生体組織中
に存在するＡＳＬを少早の検体で正確に定量することか
でき、例えばＡＳＬ−欠損症等の診断に応用できる。

【図面の簡単な説明】

第１図はＥＬＩＳＡ法によるＡＳ１１白定量の標準曲線
を示すグラフ図である。 特８′（出願人　佐伯　武頼

Claims (4)

【特許請求の範囲】
1. （１）抗アルギニノコハク酸リアーゼ抗体を使用し、Ｅ
   ＬＩＳＡ法により検体中のアルギニノコハク酸リアーゼ
   を定量することを特徴とするアルギニノコハク酸リアー
   ゼの免疫学的定量法。
2. （２）抗アルギニノコハク酸リアーゼ抗体が抗ヒトアル
   ギニノコハク酸リアーゼ抗体である請求項１記載のアル
   ギニノコハク酸リアーゼの免疫学的定量法。
3. （３）抗アルギニノコハク酸リアーゼ抗体を含むことを
   特徴とするアルギニノコハク酸リアーゼの定量用試薬。
4. （４）抗アルギニノコハク酸リアーゼ抗体が抗ヒトアル
   ギニノコハク酸リアーゼ抗体である請求項３記載のアル
   ギニノコハク酸リアーゼの定量用試薬。