JPS5938545B2 - 抗原性を有する物質の分折法 - Google Patents
抗原性を有する物質の分折法Info
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- JPS5938545B2 JPS5938545B2 JP51014179A JP1417976A JPS5938545B2 JP S5938545 B2 JPS5938545 B2 JP S5938545B2 JP 51014179 A JP51014179 A JP 51014179A JP 1417976 A JP1417976 A JP 1417976A JP S5938545 B2 JPS5938545 B2 JP S5938545B2
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Description
【発明の詳細な説明】
本発明は抗原性を有する物質の分析法に関する。
従来、ホルモンなど多くの生理活性物質で抗原性を有す
るものについて、その高感度の定量法として利用されて
いる方法にラジオイムノアツセイ（Ｒａｄｉｏｉｍｍｎ
ｏａｓｓａｙ）があるが、このラジオイムノアツセイは
、標識物質として放射性同位元素の使用を必要とするた
め、それに伴う技術上の種々の不利点を有している。こ
のラジオイムノアツセイに代るべく提案されている方法
としては、標識物質として酵素を用いて行なうエンザイ
ムノアツセイ（以下、酵素免疫定量法と称する）がある
。この酵素免疫定量法は、抗原抗体反応の特異性に基づ
いて、原理的にはラジオイムノアツセイと同様に行うも
のであるが、代表的なシステムとしては、次の２法が提
案されている。ハ 酵素で標識した一定量の抗原性を有
する物質と、未知量の該抗原性を有する物質とを該物質
の抗体に対して競合的に結合させ、抗体と結合した物質
の酵素活性もしくは抗体と結合しなかつた物質の酵素活
性を測定し、その測定結果を、予め既知量の抗原性物質
において同様にして得られた結果と対比することにより
定量を行う方法。
るものについて、その高感度の定量法として利用されて
いる方法にラジオイムノアツセイ（Ｒａｄｉｏｉｍｍｎ
ｏａｓｓａｙ）があるが、このラジオイムノアツセイは
、標識物質として放射性同位元素の使用を必要とするた
め、それに伴う技術上の種々の不利点を有している。こ
のラジオイムノアツセイに代るべく提案されている方法
としては、標識物質として酵素を用いて行なうエンザイ
ムノアツセイ（以下、酵素免疫定量法と称する）がある
。この酵素免疫定量法は、抗原抗体反応の特異性に基づ
いて、原理的にはラジオイムノアツセイと同様に行うも
のであるが、代表的なシステムとしては、次の２法が提
案されている。ハ 酵素で標識した一定量の抗原性を有
する物質と、未知量の該抗原性を有する物質とを該物質
の抗体に対して競合的に結合させ、抗体と結合した物質
の酵素活性もしくは抗体と結合しなかつた物質の酵素活
性を測定し、その測定結果を、予め既知量の抗原性物質
において同様にして得られた結果と対比することにより
定量を行う方法。
２）測定しようとする抗原性を有する物質を、その物質
の抗体を用いて固定し、これに酵素で標識した抗体を結
合させて、その酵素活性を測定し定量する方法。
の抗体を用いて固定し、これに酵素で標識した抗体を結
合させて、その酵素活性を測定し定量する方法。
（この方法はサンドイッチ法と呼ばれる。この場合は、
測定すべき抗原性を有する物質が抗体が結合する機能的
部位を２力所以上有する必要がある。この方法の利点は
ハの方法に比べ測定し得る量的範囲が広いことである。
）本発明者等は、上記のの方法において、酵素と・ 抗
体の結合物としてβ−Ｄ−ガラクトシダーゼの遊離のＳ
Ｈ基と抗体とを結合させて得たβ−Ｄ−ガラクトシダー
ゼと抗体との結合物を用いると、高感度、高精度の微量
定量が可能であることを見出し、本発明方法を提供する
ことに成功した。
測定すべき抗原性を有する物質が抗体が結合する機能的
部位を２力所以上有する必要がある。この方法の利点は
ハの方法に比べ測定し得る量的範囲が広いことである。
）本発明者等は、上記のの方法において、酵素と・ 抗
体の結合物としてβ−Ｄ−ガラクトシダーゼの遊離のＳ
Ｈ基と抗体とを結合させて得たβ−Ｄ−ガラクトシダー
ゼと抗体との結合物を用いると、高感度、高精度の微量
定量が可能であることを見出し、本発明方法を提供する
ことに成功した。
本発明者等はβ−Ｄ−ガラクトシダーゼにおいてその酵
素活性と無関係な遊離のＳＨ基が蛋白質と結合し得るこ
とを見出し、これを抗体との結合に利用した。したがつ
て、本発明方法はこの酵素活性と無関係なＳＨ基を抗体
との結合に利用し、抗体をβ−Ｄ−ガラクトシダーゼに
より標識することに基づくものである。また、抗体側の
結合基として還元して遊離せしめたＳＨ基を利用するこ
とが望ましい。本発明方法において分析の対象となる抗
原性を有する物質としては、抗体が結合する機能的部位
２力所以上を有するものはいずれも適用対象として可能
である。免疫グロプリン、α−フエトプロテイン、ＣＥ
Ａ．ＨＣＣｌオーストラリヤ抗原などはその代表例とし
てあげられる。本発明方法の適用対象となる抗原性を有
する物質がこれらの例示に限定されないことはもちろん
である。以下に、抗原性を有する物質として、ヒトＩｇ
Ｇを例にとつて、本発明方法を説明する。（１）抗ヒト
ＩｇＧウサギ抗体、ＩｇＧをメルカプトエチルアミン類
の存在下で還元し、ゲル済過によつて未反応物質を除去
する。
素活性と無関係な遊離のＳＨ基が蛋白質と結合し得るこ
とを見出し、これを抗体との結合に利用した。したがつ
て、本発明方法はこの酵素活性と無関係なＳＨ基を抗体
との結合に利用し、抗体をβ−Ｄ−ガラクトシダーゼに
より標識することに基づくものである。また、抗体側の
結合基として還元して遊離せしめたＳＨ基を利用するこ
とが望ましい。本発明方法において分析の対象となる抗
原性を有する物質としては、抗体が結合する機能的部位
２力所以上を有するものはいずれも適用対象として可能
である。免疫グロプリン、α−フエトプロテイン、ＣＥ
Ａ．ＨＣＣｌオーストラリヤ抗原などはその代表例とし
てあげられる。本発明方法の適用対象となる抗原性を有
する物質がこれらの例示に限定されないことはもちろん
である。以下に、抗原性を有する物質として、ヒトＩｇ
Ｇを例にとつて、本発明方法を説明する。（１）抗ヒト
ＩｇＧウサギ抗体、ＩｇＧをメルカプトエチルアミン類
の存在下で還元し、ゲル済過によつて未反応物質を除去
する。
こうして得られた還元された抗ヒトＧＧウサギ抗体１ｇ
Ｇにマレイミドを反応させ、次いでゲルろ過によつて低
分子量物質を除去した後、得られたマレイミド型抗体に
β−Ｄ−ガラクトシダーゼを反応させる。こうして得ら
れた反応生成物をゲル沢過によつて精製し、β−Ｄ−ガ
ラクトシダーゼと抗ヒトＩｇＧウサギ抗体１ｇＧの結合
物を得る。（２）ヒトＩｇＧの抗体（不溶化抗体）に、
測定すべきヒトＩｇＧ含有の分析対象物を加えて抗原抗
体反応を行つた後これに、（１）で得られたβＤ−ガラ
クトシダーゼと抗ヒトＩｇＧウサギ抗体１ｇＧとの結合
物を加えて反応させ、遠心分離により反応生成物を分離
する。
Ｇにマレイミドを反応させ、次いでゲルろ過によつて低
分子量物質を除去した後、得られたマレイミド型抗体に
β−Ｄ−ガラクトシダーゼを反応させる。こうして得ら
れた反応生成物をゲル沢過によつて精製し、β−Ｄ−ガ
ラクトシダーゼと抗ヒトＩｇＧウサギ抗体１ｇＧの結合
物を得る。（２）ヒトＩｇＧの抗体（不溶化抗体）に、
測定すべきヒトＩｇＧ含有の分析対象物を加えて抗原抗
体反応を行つた後これに、（１）で得られたβＤ−ガラ
クトシダーゼと抗ヒトＩｇＧウサギ抗体１ｇＧとの結合
物を加えて反応させ、遠心分離により反応生成物を分離
する。
ここで得られる反応生成物はヒトＩｇＧ（ａ）をヒトＩ
ｇＧに対する不溶化抗体（ｂ）とβ−Ｄ−ガラクトシダ
ーゼ−抗ヒトＩｇＧウサギ抗体１ｇＧの結合物（Ｃ）（
！ｌ：でサンドイツチしたものである。（３）（２）で
得られた反応生成物にβ−Ｄ−ガラクトシダーゼの基質
としてフルオレセイン・ジ．β−Ｄ−ガラクトピラノシ
ド、４−メチルウンベリフエリル・β−Ｄ−ガラクトシ
ドなどを加えて、遊離したフルオレセイン、４−メチル
ウンベリフエロンなどを螢光光度計で測定することによ
り上記の反応生成物の酢素活性を知る。
ｇＧに対する不溶化抗体（ｂ）とβ−Ｄ−ガラクトシダ
ーゼ−抗ヒトＩｇＧウサギ抗体１ｇＧの結合物（Ｃ）（
！ｌ：でサンドイツチしたものである。（３）（２）で
得られた反応生成物にβ−Ｄ−ガラクトシダーゼの基質
としてフルオレセイン・ジ．β−Ｄ−ガラクトピラノシ
ド、４−メチルウンベリフエリル・β−Ｄ−ガラクトシ
ドなどを加えて、遊離したフルオレセイン、４−メチル
ウンベリフエロンなどを螢光光度計で測定することによ
り上記の反応生成物の酢素活性を知る。
（４）上記（１），（２），（３）の操作を既知量のヒ
トＩｇＧの標準溶液に対し予め行ない、ヒトＩｇＧの量
と上記の螢光強度との関係を標準曲線として作成してお
く。（５）未知量のヒトＩｇＧを含む分析対象物につい
て得られた螢光掲度を標準曲線（検量線）にあてはめ、
分析対象中のヒトＩｇＧの量を測定する。
トＩｇＧの標準溶液に対し予め行ない、ヒトＩｇＧの量
と上記の螢光強度との関係を標準曲線として作成してお
く。（５）未知量のヒトＩｇＧを含む分析対象物につい
て得られた螢光掲度を標準曲線（検量線）にあてはめ、
分析対象中のヒトＩｇＧの量を測定する。
本発明方法による分析法の感度は、ラジオイムノアツス
イのそれに匹敵するが、上記においてβＤ−ガラクトシ
ダーゼと抗ヒトＩｇＧウサギ抗体１ｇＧとの結合物に代
えてβ−Ｄ−ガラクトシダーゼと抗ヒトＩｇＧウサギ抗
体Ｆａｂ′フラグメントとの結合物を用いた場合、更に
感度を上昇させることが可能である。
イのそれに匹敵するが、上記においてβＤ−ガラクトシ
ダーゼと抗ヒトＩｇＧウサギ抗体１ｇＧとの結合物に代
えてβ−Ｄ−ガラクトシダーゼと抗ヒトＩｇＧウサギ抗
体Ｆａｂ′フラグメントとの結合物を用いた場合、更に
感度を上昇させることが可能である。
以下に実施例をあげ、本発明をさらに具体的に説明する
。
。
なお、実施例におけるβ−Ｄ−ガラクトシダーゼと抗体
との結合に用いる結合試薬は単なる例示であり、他の試
薬に置換することができることは理解されよう。実施例
は標準曲線を得るための操作として記載されているが、
分析対象となる未知量の抗原性を有する物質の場合も、
操作は同様に行い、検量線から、その量を知ることとな
る。実施例 １ β−Ｄ−ガラクトシダーゼと抗ヒトＩｇＧウサギ抗体Ｇ
Ｇとの結合物によるヒトＩｇＧの測定。
との結合に用いる結合試薬は単なる例示であり、他の試
薬に置換することができることは理解されよう。実施例
は標準曲線を得るための操作として記載されているが、
分析対象となる未知量の抗原性を有する物質の場合も、
操作は同様に行い、検量線から、その量を知ることとな
る。実施例 １ β−Ｄ−ガラクトシダーゼと抗ヒトＩｇＧウサギ抗体Ｇ
Ｇとの結合物によるヒトＩｇＧの測定。
１．抗ヒトＩｇＧウサギ抗体１ｇＧの還元０．１Ｍ酢酸
緩衝液ＰＨ５．Ｏに一夜透析し、不溶性物質を遠心除去
した抗ヒトＩｇＧウサギ抗血清のＩｇＧフラクシヨン（
１４η／２ａ）に１／１０量の０１．Ｍ２−メルカプト
エチルアミンを加え、３７℃で９０分間放置した。
緩衝液ＰＨ５．Ｏに一夜透析し、不溶性物質を遠心除去
した抗ヒトＩｇＧウサギ抗血清のＩｇＧフラクシヨン（
１４η／２ａ）に１／１０量の０１．Ｍ２−メルカプト
エチルアミンを加え、３７℃で９０分間放置した。
還元され主としてＨ鎖間ジスルフイド橋の開裂したＩｇ
Ｇフラクシヨンを０．１Ｍ酢酸緩衝液ＰＨ５．Ｏで平衡
化したＳＥＰＨＡＤＥＸＣ−２５のゲル済過層１．０×
４０Ｃｒ１Ｌを通して分離した。このＩｇＧフラクシヨ
ン中には、４，４′−ジチオジピリジン法で定量したと
ころ、１モル当り１．０〜１．５モル相当のＳＨ基が測
定された。２．マレイミド一抗ヒトＩｇＧウサギ抗体１
ｇＧの製法０．１Ｍ酢酸緩衝液ＰＨ５．Ｏで飽和溶解さ
せたＮ，Ｎ′−０−フエニレンジマレイミド液（約０．
７５ＩＴ１Ｍ／Ｍｊ）中に還元ＧＧフラクシヨン１ｍ１
（２，７Ｔｒ１９）を滴下し、３０℃で２０分間放置し
た。
Ｇフラクシヨンを０．１Ｍ酢酸緩衝液ＰＨ５．Ｏで平衡
化したＳＥＰＨＡＤＥＸＣ−２５のゲル済過層１．０×
４０Ｃｒ１Ｌを通して分離した。このＩｇＧフラクシヨ
ン中には、４，４′−ジチオジピリジン法で定量したと
ころ、１モル当り１．０〜１．５モル相当のＳＨ基が測
定された。２．マレイミド一抗ヒトＩｇＧウサギ抗体１
ｇＧの製法０．１Ｍ酢酸緩衝液ＰＨ５．Ｏで飽和溶解さ
せたＮ，Ｎ′−０−フエニレンジマレイミド液（約０．
７５ＩＴ１Ｍ／Ｍｊ）中に還元ＧＧフラクシヨン１ｍ１
（２，７Ｔｒ１９）を滴下し、３０℃で２０分間放置し
た。
反応後、０．１Ｍ酢酸緩衝液で洗浄したＳＥＰＨＡＤＥ
ＸＧ−２５、１．０〜４５ｃＴｎを通して、マレイミド
−１ｇＧフラクシヨンを未反応ジマレイミドと分離した
。このマレイミド−１ｇＧフラクシヨンに含まれるマレ
イミド基をメルカプトエチルアミンで逆滴定すると１モ
ル当り０．３〜０．６モル相当のマレイミド残基が測定
された。３．β−Ｄ−ガラクトシダーゼ−抗ヒトＩｇＧ
ウサギ抗体１ｇＧ結合物の製造β−Ｄ−ガラクトシダー
ゼ２０μｌ（０．１ｍ９）をマレイミド−１ｇＧフラク
シヨン１ｍ１と混合し、３０℃で２０分間反応させた。
ＸＧ−２５、１．０〜４５ｃＴｎを通して、マレイミド
−１ｇＧフラクシヨンを未反応ジマレイミドと分離した
。このマレイミド−１ｇＧフラクシヨンに含まれるマレ
イミド基をメルカプトエチルアミンで逆滴定すると１モ
ル当り０．３〜０．６モル相当のマレイミド残基が測定
された。３．β−Ｄ−ガラクトシダーゼ−抗ヒトＩｇＧ
ウサギ抗体１ｇＧ結合物の製造β−Ｄ−ガラクトシダー
ゼ２０μｌ（０．１ｍ９）をマレイミド−１ｇＧフラク
シヨン１ｍ１と混合し、３０℃で２０分間反応させた。
反応後、直ちに１ＮＮａ０Ｈで中性にして５％牛血清ア
ルブミン２０μｌと１ＭＭｇＣ１２２μｌを酵素安定化
のために加えた。４゜Ｃで一夜放置後、平衡化したＳＥ
ＰＨＡＲＯＳＥ６Ｂのゲル淵過層１．５Ｘ４０（１−J
モV１に通し、反応生成物のβ−Ｄ−ガラクトシダーゼ
〜抗ヒトＩｇＧウサギ抗体１ｇＧ結合物を得た。
ルブミン２０μｌと１ＭＭｇＣ１２２μｌを酵素安定化
のために加えた。４゜Ｃで一夜放置後、平衡化したＳＥ
ＰＨＡＲＯＳＥ６Ｂのゲル淵過層１．５Ｘ４０（１−J
モV１に通し、反応生成物のβ−Ｄ−ガラクトシダーゼ
〜抗ヒトＩｇＧウサギ抗体１ｇＧ結合物を得た。
４．β−Ｄ−ガラクトシダーゼ抗ヒトＩｇＧウサギ抗体
１ｇＧ結合物を用いたヒトＩｇＧの定量ＣＮＢｒ活性化
ＳＥＰＨＡＲＯＳＥ４Ｂ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）１９と
抗ヒトＩｇＧ抗体１０Ｔｎ９の反応生成物を０．１Ｍ燐
酸緩衝液ＰＨ７．Ｏで懸濁した抗ヒト１ｇＧ抗体結合Ｓ
ＥＰＨＡＲＯＳＥ４Ｂ（以下、抗ヒトＧＧ不溶化抗体と
記載）１０ｍ１を、０．１％牛血清アルブミン、０．０
１％ＮａＮ３、１ｍＭＭｇＣ１２、０．１ＭＮａＣ１を
含む０．０１Ｍ燐酸緩衝液（以下、緩衝液Ａと記載）で
１０倍は希釈したものを０．１ｍ１ずつ別々の試験管（
０．９×１５Ｃ１ｒＬ）にとつた。
１ｇＧ結合物を用いたヒトＩｇＧの定量ＣＮＢｒ活性化
ＳＥＰＨＡＲＯＳＥ４Ｂ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）１９と
抗ヒトＩｇＧ抗体１０Ｔｎ９の反応生成物を０．１Ｍ燐
酸緩衝液ＰＨ７．Ｏで懸濁した抗ヒト１ｇＧ抗体結合Ｓ
ＥＰＨＡＲＯＳＥ４Ｂ（以下、抗ヒトＧＧ不溶化抗体と
記載）１０ｍ１を、０．１％牛血清アルブミン、０．０
１％ＮａＮ３、１ｍＭＭｇＣ１２、０．１ＭＮａＣ１を
含む０．０１Ｍ燐酸緩衝液（以下、緩衝液Ａと記載）で
１０倍は希釈したものを０．１ｍ１ずつ別々の試験管（
０．９×１５Ｃ１ｒＬ）にとつた。
緩衝液ＡでヒトＩｇＧを種種の濃度に希釈し、５０μｌ
ずつをそれぞれの試験管に加えて３７℃で４時間振盪し
た。４時間インキユベーシヨンした後、４℃で一夜放置
した。
ずつをそれぞれの試験管に加えて３７℃で４時間振盪し
た。４時間インキユベーシヨンした後、４℃で一夜放置
した。
翌日、これに緩衝液Ａを１ｍ１加えて遠心分離し、上澄
を捨て、５μｌのβ−Ｄ−ガラクトシダーゼ〜抗ヒトＩ
ｇＧウサギ抗体１ｇＧ結合物を加えて緩衝液Ａで最終容
量０．１５ｍ１にした。３７℃で６時間振盪した後、遠
心分離して上澄を捨て、上記のように１ｍ１の緩衝液Ａ
で２度洗浄した。
を捨て、５μｌのβ−Ｄ−ガラクトシダーゼ〜抗ヒトＩ
ｇＧウサギ抗体１ｇＧ結合物を加えて緩衝液Ａで最終容
量０．１５ｍ１にした。３７℃で６時間振盪した後、遠
心分離して上澄を捨て、上記のように１ｍ１の緩衝液Ａ
で２度洗浄した。
洗浄した抗ヒトＩｇＧ不溶化抗体（０．１５ｍ１）に結
合した酵素の量を測定するため５０μｌの３×１０−４
Ｍウンベリフエリル・β−Ｄ−ガラクトシドを加えて３
００Ｃで１０分間振盪した。２，５ｍ１（７）０．１Ｍ
グリシン−ＮａＯＨ緩衝液ＰＨｌＯ．３を加えて反応を
止め、１×１０３Ｍの４−メチルウンベリフエロンを標
準にして試料中の螢光光度を測定した。
合した酵素の量を測定するため５０μｌの３×１０−４
Ｍウンベリフエリル・β−Ｄ−ガラクトシドを加えて３
００Ｃで１０分間振盪した。２，５ｍ１（７）０．１Ｍ
グリシン−ＮａＯＨ緩衝液ＰＨｌＯ．３を加えて反応を
止め、１×１０３Ｍの４−メチルウンベリフエロンを標
準にして試料中の螢光光度を測定した。
第１図は抗ヒトＩｇＧウサギ抗体１ｇＧ〜β−Ｄ−ガラ
クトシダーゼ結合物を用いた時のヒトＩｇＧの定量曲線
である。実施例 ２ β−Ｄ−ガラクトシダーゼと抗ヒトＩｇＧウサギ抗体Ｆ
ａｂ′フラグメントとの結合物によるヒト１ｇＧの測定
実施例１におけるβ−Ｄ−ガラクトシダーゼ〜抗ヒトＧ
Ｇウサギ抗体１ｇＧ結合物の代りに、高感度測定を行な
うため、β−Ｄ−ガラクトシダーゼ−抗ヒトＩｇＧウサ
ギ抗体Ｆａｂ′フラグメント結合物を用いてヒト１ｇＧ
を測定した。
クトシダーゼ結合物を用いた時のヒトＩｇＧの定量曲線
である。実施例 ２ β−Ｄ−ガラクトシダーゼと抗ヒトＩｇＧウサギ抗体Ｆ
ａｂ′フラグメントとの結合物によるヒト１ｇＧの測定
実施例１におけるβ−Ｄ−ガラクトシダーゼ〜抗ヒトＧ
Ｇウサギ抗体１ｇＧ結合物の代りに、高感度測定を行な
うため、β−Ｄ−ガラクトシダーゼ−抗ヒトＩｇＧウサ
ギ抗体Ｆａｂ′フラグメント結合物を用いてヒト１ｇＧ
を測定した。
１。
抗ヒトＩｇＧウサギ抗体Ｆ（Ａｂり，フラグメントの製
造０．１Ｍ酢酸緩衝液ＰＨ４．５に４℃で一夜透析した
抗ヒト１ｇＧウサギ抗体１ｇＧフラクシヨン５０即にベ
ンジン１Ｔ！１９を加え、３７℃で１６時間消化した。
造０．１Ｍ酢酸緩衝液ＰＨ４．５に４℃で一夜透析した
抗ヒト１ｇＧウサギ抗体１ｇＧフラクシヨン５０即にベ
ンジン１Ｔ！１９を加え、３７℃で１６時間消化した。
反応液を１ＮＮａ０Ｈ−［有］Ｈ８にし、０．１Ｍホウ
酸緩衝液ＰＨ８．Ｏで平衡化したＳＥＰ−ＨＡＤＥＸＧ
−１５０、１．５×４０ｃ１ｎに通して、Ｆ（Ａｂり，
フラグメントを集め、コロジオンバツクでＡ２８Ｏ＝６
〜１０に濃縮した。２．抗ヒトＧＧウサギ抗体Ｆａｂ′
フラグメントの製造０．１Ｍ酢酸緩衝液ＰＨ５．Ｏに透
析した抗ヒトＩｇＧウサギ抗体Ｆ（Ａｂ○２フラグメン
ト１０〜に１／１０量の０．０１Ｍ２−メルカプトエチ
ルアミンを加え、３７℃で９０分間還元した後、ＳＥＰ
ＨＡＤＥＸＧ−２５、１．０〜４５ｃ７ｒＬを通して、
０．１Ｍ酢酸緩衝液ＰＨ５．Ｏで溶出させて低分子物質
を除去し、Ｆａｂ′フラグメント（０．５〜０．８モル
ＳＨ基／１モルＦａｂつを得た。
酸緩衝液ＰＨ８．Ｏで平衡化したＳＥＰ−ＨＡＤＥＸＧ
−１５０、１．５×４０ｃ１ｎに通して、Ｆ（Ａｂり，
フラグメントを集め、コロジオンバツクでＡ２８Ｏ＝６
〜１０に濃縮した。２．抗ヒトＧＧウサギ抗体Ｆａｂ′
フラグメントの製造０．１Ｍ酢酸緩衝液ＰＨ５．Ｏに透
析した抗ヒトＩｇＧウサギ抗体Ｆ（Ａｂ○２フラグメン
ト１０〜に１／１０量の０．０１Ｍ２−メルカプトエチ
ルアミンを加え、３７℃で９０分間還元した後、ＳＥＰ
ＨＡＤＥＸＧ−２５、１．０〜４５ｃ７ｒＬを通して、
０．１Ｍ酢酸緩衝液ＰＨ５．Ｏで溶出させて低分子物質
を除去し、Ｆａｂ′フラグメント（０．５〜０．８モル
ＳＨ基／１モルＦａｂつを得た。
３．β−Ｄ−ガラクトシダーゼ−抗ヒトＩｇＧウサギ抗
体ＦａＹｌフラグメント結合物を用いたヒトＧＧの定量
以下、実施例１と同様の方法により、抗ヒトＩｇＧウサ
ギ抗体Ｆａｂ′フラグメントをマレイミドによりβ−Ｄ
−ガラクトシダーゼと結合させ、これを用いてヒト１ｇ
Ｇの測定を行なつた。
体ＦａＹｌフラグメント結合物を用いたヒトＧＧの定量
以下、実施例１と同様の方法により、抗ヒトＩｇＧウサ
ギ抗体Ｆａｂ′フラグメントをマレイミドによりβ−Ｄ
−ガラクトシダーゼと結合させ、これを用いてヒト１ｇ
Ｇの測定を行なつた。
測定結果は第２図のとおりであるが第１図と比較すると
、この場合が実施例１の場合よりも感度が著しく増すこ
とが判る。実施例 ３ β−Ｄ−ガラクトシダーゼと抗α−フエトプロテインウ
サギ抗体Ｆａｂ′フラグメント結合物によるα−フエト
プロテイン（以下、ＡＦＰと記載）の測定１．抗ヒトＡ
ＦＰウサギ抗体Ｆ（Ａｂ′）２フラグメントの製造０．
１Ｍ酢酸緩衝液ＰＨ４．５に透析した抗ヒトＡＦＰウサ
ギ抗体１ｇＧ５０ワにペプシレ１〜を加え、３７℃で１
６時間消化した。
、この場合が実施例１の場合よりも感度が著しく増すこ
とが判る。実施例 ３ β−Ｄ−ガラクトシダーゼと抗α−フエトプロテインウ
サギ抗体Ｆａｂ′フラグメント結合物によるα−フエト
プロテイン（以下、ＡＦＰと記載）の測定１．抗ヒトＡ
ＦＰウサギ抗体Ｆ（Ａｂ′）２フラグメントの製造０．
１Ｍ酢酸緩衝液ＰＨ４．５に透析した抗ヒトＡＦＰウサ
ギ抗体１ｇＧ５０ワにペプシレ１〜を加え、３７℃で１
６時間消化した。
反応液を１Ｎ，Ｎａ０ＨでＰＨ８にし、０．１Ｍホウ酸
緩衝液ＰＨ８．Ｏで平衡化したＳＥＰＨＡＤＥＸＧ−１
５０１１．５×４０Ｃ！ＴＬに通して、Ｆ（Ａｂ′）２
フラグメントを集めた。これをコロジオンバツクでＡ２
８Ｏ＝６〜１０に濃縮した。２．抗ヒトＡＦＰウサギ抗
体Ｆａｂ／フラグメントの製造０．１Ｍ酢酸緩衝液ＰＨ
５に透析したＦ（Ａｂり，フラグメント１０ｒｆ１９に
１／１０量の０．１Ｍ２メルカプトエチルアミンを加え
、３７℃で９０分間還元した後、ＳＥＰＨＡＤＥＸＧ−
５２、１．０〜４５ＣＴｒＬを通して、０．１Ｍ酢酸緩
衝液ＰＨ５で溶出させて低分子化合物を除去し、Ｆａｂ
′フラグメント（０．５〜０．８モルＳＨ基／１モルＦ
ａｂうを得た。
緩衝液ＰＨ８．Ｏで平衡化したＳＥＰＨＡＤＥＸＧ−１
５０１１．５×４０Ｃ！ＴＬに通して、Ｆ（Ａｂ′）２
フラグメントを集めた。これをコロジオンバツクでＡ２
８Ｏ＝６〜１０に濃縮した。２．抗ヒトＡＦＰウサギ抗
体Ｆａｂ／フラグメントの製造０．１Ｍ酢酸緩衝液ＰＨ
５に透析したＦ（Ａｂり，フラグメント１０ｒｆ１９に
１／１０量の０．１Ｍ２メルカプトエチルアミンを加え
、３７℃で９０分間還元した後、ＳＥＰＨＡＤＥＸＧ−
５２、１．０〜４５ＣＴｒＬを通して、０．１Ｍ酢酸緩
衝液ＰＨ５で溶出させて低分子化合物を除去し、Ｆａｂ
′フラグメント（０．５〜０．８モルＳＨ基／１モルＦ
ａｂうを得た。
３．マレイミド一抗ヒトＡＦＰウサギ抗体Ｆａｂ′フラ
グメントの製造０．１Ｍ酢酸緩衝液ＰＨ５で飽和溶解さ
せたＮ，Ｎ゛−０−フエニレンジマレイミド１ｍ１中に
還元Ｆａｂ′フラグメント２ｍ１（２．５ｒＩ１９）を
加え、３０℃で２０分間放置した。
グメントの製造０．１Ｍ酢酸緩衝液ＰＨ５で飽和溶解さ
せたＮ，Ｎ゛−０−フエニレンジマレイミド１ｍ１中に
還元Ｆａｂ′フラグメント２ｍ１（２．５ｒＩ１９）を
加え、３０℃で２０分間放置した。
反応液をＳＥＰＨＡＤＥＸＧ−２５、Ｉ．Ｏ〜４５ＣＴ
！ｌを通して低分子物質を除去した。このマレイミド一
抗ヒトＡＦＰウサギ抗体Ｆａｂ′フラグメントは１モル
当り０．３〜０．６モルのマレイミド残基をもつ。４．
β−Ｄ−ガラクトシダーゼ−抗ヒトＡＦＰウサギ抗体Ｆ
ａｂ′フラグメント結合物の製造β−Ｄ−ガラクトシダ
ーゼ２０μｌ（０．１η）をマレイミド一抗ヒトＡＦＰ
ウサギ抗体Ｆａｂ′フラグメント１ηと混合し、３０℃
で２０分間反応させた後、１ＮＮａ０Ｈで中性にし、５
％牛血清アルブミン２０μｌ、１ＭＭｇＣ１２２μｌを
加えた。
！ｌを通して低分子物質を除去した。このマレイミド一
抗ヒトＡＦＰウサギ抗体Ｆａｂ′フラグメントは１モル
当り０．３〜０．６モルのマレイミド残基をもつ。４．
β−Ｄ−ガラクトシダーゼ−抗ヒトＡＦＰウサギ抗体Ｆ
ａｂ′フラグメント結合物の製造β−Ｄ−ガラクトシダ
ーゼ２０μｌ（０．１η）をマレイミド一抗ヒトＡＦＰ
ウサギ抗体Ｆａｂ′フラグメント１ηと混合し、３０℃
で２０分間反応させた後、１ＮＮａ０Ｈで中性にし、５
％牛血清アルブミン２０μｌ、１ＭＭｇＣ１２２μｌを
加えた。
４℃で一夜放置後、ＳＥＰＨＡＲＯＳＥ６Ｂｌｌ．５Ｘ
４ＯｃＴｎに通し、β−Ｄ−ガラクトシダーゼ−抗ヒト
ＡＦＰウサギ抗体Ｆａｂ′フラグメント結合物を得た。
４ＯｃＴｎに通し、β−Ｄ−ガラクトシダーゼ−抗ヒト
ＡＦＰウサギ抗体Ｆａｂ′フラグメント結合物を得た。
５．β−Ｄ−ガラクトシダーゼ−抗ヒトＡＦＰウサギ抗
体Ｆａｂ′フラグメント結合物によるヒトＡＦＰの定量
ＣＮＢｒ活性化ＳＥＰＨＡＲＯＳＥ４Ｂｌ９と抗ヒトＡ
ＦＰ抗体３０ηの反応生成物を０．１Ｍ燐酸緩衝液ＰＨ
７．Ｏで懸濁した抗ヒトＡＦＰ抗体結合ＳＥＰｌＩＡＲ
ＯＳＥ４ＢｌＯｍｌを緩衝液Ａで１０倍に希釈したもの
を０，１ｍ１ずつ別々の試験管にとつた。
体Ｆａｂ′フラグメント結合物によるヒトＡＦＰの定量
ＣＮＢｒ活性化ＳＥＰＨＡＲＯＳＥ４Ｂｌ９と抗ヒトＡ
ＦＰ抗体３０ηの反応生成物を０．１Ｍ燐酸緩衝液ＰＨ
７．Ｏで懸濁した抗ヒトＡＦＰ抗体結合ＳＥＰｌＩＡＲ
ＯＳＥ４ＢｌＯｍｌを緩衝液Ａで１０倍に希釈したもの
を０，１ｍ１ずつ別々の試験管にとつた。
ヒトＡＦＰＯ〜１０ｎｇを含むヒト血清５０μｌを試験
管に加え、３７℃で４時間つづいて４℃で一夜インキユ
ベーシヨンした後、緩衝液Ａｌｍｌで遠沈洗浄し、上澄
を捨て、β−Ｄ−ガラクトシダーゼ−抗ヒトウサギ抗体
Ｆａｂ′フラグメント結合物を加え、緩衝液Ａで最終容
量０．１５ｍ１にした。３７℃で５時間振盪後，緩衝液
１ｍ１を加え、遠沈洗浄を２回行なつた。
管に加え、３７℃で４時間つづいて４℃で一夜インキユ
ベーシヨンした後、緩衝液Ａｌｍｌで遠沈洗浄し、上澄
を捨て、β−Ｄ−ガラクトシダーゼ−抗ヒトウサギ抗体
Ｆａｂ′フラグメント結合物を加え、緩衝液Ａで最終容
量０．１５ｍ１にした。３７℃で５時間振盪後，緩衝液
１ｍ１を加え、遠沈洗浄を２回行なつた。
上澄を捨てた後、残渣（０．１５ｍ０に３×１０−４Ｍ
４−メチルウンベリフエリル一β−Ｄガラクトシド５０
ｔｔ１を加え、３０℃で１０分間インキユベーシヨンし
た後、２．５ｍ１００．１Ｍグリシン−ＮａＯＨ緩衝液
ＰＨｌＯ，３を加えて反応を止め、反応液の螢光強度を
１×１０１Ｍ４メチルウンベリフエロンを標準にして、
測定した。測定結果は第３図に示すとおりである。
４−メチルウンベリフエリル一β−Ｄガラクトシド５０
ｔｔ１を加え、３０℃で１０分間インキユベーシヨンし
た後、２．５ｍ１００．１Ｍグリシン−ＮａＯＨ緩衝液
ＰＨｌＯ，３を加えて反応を止め、反応液の螢光強度を
１×１０１Ｍ４メチルウンベリフエロンを標準にして、
測定した。測定結果は第３図に示すとおりである。
第１図は本発明方法によるβ−Ｄ−ガラクトシダーゼと
抗ヒトＩｇＧウサギ抗体１ｇＧとの結合物によるヒトＩ
ｇＧの測定結果であり、分析管中のヒトＧＧ量（ＦｍＯ
ｌ）（横軸）と螢光強度（縦軸）との関係を示す曲線で
ある。
抗ヒトＩｇＧウサギ抗体１ｇＧとの結合物によるヒトＩ
ｇＧの測定結果であり、分析管中のヒトＧＧ量（ＦｍＯ
ｌ）（横軸）と螢光強度（縦軸）との関係を示す曲線で
ある。
Claims (1)
- １ 抗原性を有する物質の分析法であつて、分析しよう
とする抗原性を有する物質を含有している分析対象物（
ａ）と該抗原性を有する物質の抗体（ｂ）とを接触させ
、得られた生成物に、β−Ｄ−ガラクトシダーゼの遊離
のＳＨ基に結合させた該抗体とβ−Ｄ−ガラクトシダー
ゼとの結合物（ｃ）を接触させ、得られた生成物の酵素
活性を測定し、既知量の抗原性を有する物質により得ら
れた標準曲線と対比することを特徴とする上記抗原性を
有する物質の分析法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP51014179A JPS5938545B2 (ja) | 1976-02-12 | 1976-02-12 | 抗原性を有する物質の分折法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP51014179A JPS5938545B2 (ja) | 1976-02-12 | 1976-02-12 | 抗原性を有する物質の分折法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS5299210A JPS5299210A (en) | 1977-08-19 |
| JPS5938545B2 true JPS5938545B2 (ja) | 1984-09-18 |
Family
ID=11853905
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP51014179A Expired JPS5938545B2 (ja) | 1976-02-12 | 1976-02-12 | 抗原性を有する物質の分折法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPS5938545B2 (ja) |
Families Citing this family (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS6069555A (ja) * | 1983-09-27 | 1985-04-20 | Teijin Ltd | スルホ化抗体を用いる免疫測定法 |
Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS5272284A (en) * | 1975-12-12 | 1977-06-16 | Dainippon Pharmaceutical Co | Enzymeeimmunoassay reagent |
-
1976
- 1976-02-12 JP JP51014179A patent/JPS5938545B2/ja not_active Expired
Patent Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS5272284A (en) * | 1975-12-12 | 1977-06-16 | Dainippon Pharmaceutical Co | Enzymeeimmunoassay reagent |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPS5299210A (en) | 1977-08-19 |
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