JPH09210998A - 同時サンドイツチイムノアツセイにおいてアツセイ範囲を拡大し、フツク効果を回避する方法、および対応する試験キツト - Google Patents
同時サンドイツチイムノアツセイにおいてアツセイ範囲を拡大し、フツク効果を回避する方法、および対応する試験キツトInfo
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Abstract
(57)【要約】
【課題】 改良された同時サンドイッチイムノアッセイ
および試験キットの提供。 【解決手段】 アフィニティークロマトグラフィーを使
って精製されたポリクローナル抗体を含む同時サンドイ
ッチイムノアッセイおよび試験キット。
および試験キットの提供。 【解決手段】 アフィニティークロマトグラフィーを使
って精製されたポリクローナル抗体を含む同時サンドイ
ッチイムノアッセイおよび試験キット。
Description
【０００１】
【０００２】
【従来の技術】イムノアッセイは、特に、それらの満足
できる特異性と感度のために、しばしば、医療における
診断目的で、血清サンプルや尿サンプル中のタンパク質
を検出するのに使用される。いわゆるサンドイッチアッ
セイは、イムノアッセイの特に重要な一変法である。こ
のアッセイにおいては、２種の抗体が、タンパク質の２
つの異なる抗原決定基に結合するが、抗体の１つは、液
相からの分離を実施するために、固相、例えば、ポリエ
チレンのミクロタイタープレートか、またはポリマー粒
子からなる小ビーズのような支持材に結合されている。
第２の抗体は、形成された免疫複合体を検出するために
使用され、そしてこの目的のために、例えば、染料、蛍
光もしくは化学発光標識物、放射性核種、または酵素に
結合される。
できる特異性と感度のために、しばしば、医療における
診断目的で、血清サンプルや尿サンプル中のタンパク質
を検出するのに使用される。いわゆるサンドイッチアッ
セイは、イムノアッセイの特に重要な一変法である。こ
のアッセイにおいては、２種の抗体が、タンパク質の２
つの異なる抗原決定基に結合するが、抗体の１つは、液
相からの分離を実施するために、固相、例えば、ポリエ
チレンのミクロタイタープレートか、またはポリマー粒
子からなる小ビーズのような支持材に結合されている。
第２の抗体は、形成された免疫複合体を検出するために
使用され、そしてこの目的のために、例えば、染料、蛍
光もしくは化学発光標識物、放射性核種、または酵素に
結合される。
【０００３】２つのタイプのサンドイッチイムノアッセ
イが、既知であり、それぞれ、「一段階」もしくは同時
アッセイ、および「二段階」もしくは連続イムノアッセ
イと呼ばれる。２つのタイプは、２種の抗体試薬が添加
される順序において異なる。同時イムノアッセイは、固
相抗体（捕捉抗体）とシグナル発生抗体を、同時に、タ
ンパク質含有サンプルとともに混合し、次いで、そのシ
グナルを測定するために、液相から生成された免疫複合
体を、それを固相に結合させて分離することによって実
施される。
イが、既知であり、それぞれ、「一段階」もしくは同時
アッセイ、および「二段階」もしくは連続イムノアッセ
イと呼ばれる。２つのタイプは、２種の抗体試薬が添加
される順序において異なる。同時イムノアッセイは、固
相抗体（捕捉抗体）とシグナル発生抗体を、同時に、タ
ンパク質含有サンプルとともに混合し、次いで、そのシ
グナルを測定するために、液相から生成された免疫複合
体を、それを固相に結合させて分離することによって実
施される。
【０００４】これに対して、連続もしくは二段階アッセ
イでは、タンパク質含有サンプルと最初にインキュベー
トされるのは、捕捉抗体のみである。形成される抗体／
抗原複合体は、固相に結合され、そして過剰な抗原が、
洗浄によって除去される。固定された抗体／抗原複合体
が、インキュベーション段階において、第２の標識され
たシグナル抗体とインキュベートされるのは、その後で
ある。
イでは、タンパク質含有サンプルと最初にインキュベー
トされるのは、捕捉抗体のみである。形成される抗体／
抗原複合体は、固相に結合され、そして過剰な抗原が、
洗浄によって除去される。固定された抗体／抗原複合体
が、インキュベーション段階において、第２の標識され
たシグナル抗体とインキュベートされるのは、その後で
ある。
【０００５】同時「一段階」イムノアッセイは、伝統的
な「二段階」アッセイと比較して、その実施の迅速性の
ゆえに、ますます重要になりつつある。その上、その感
度と精度は、より好適である。
な「二段階」アッセイと比較して、その実施の迅速性の
ゆえに、ますます重要になりつつある。その上、その感
度と精度は、より好適である。
【０００６】同時サンドイッチイムノアッセイを用いる
定量的免疫学的測定法における基本的問題は、反応曲線
の形から生じる。被検体の濃度「０」から一定の限界濃
度まで、測定曲線は正の勾配をもつ。被検体濃度のそれ
以上の増加につれて、曲線は最高点を通過し、その後、
再びそれ以上の高い濃度では下向きになる。その結果と
して、測定曲線は、非常に高い濃度では、負の勾配をも
つ。
定量的免疫学的測定法における基本的問題は、反応曲線
の形から生じる。被検体の濃度「０」から一定の限界濃
度まで、測定曲線は正の勾配をもつ。被検体濃度のそれ
以上の増加につれて、曲線は最高点を通過し、その後、
再びそれ以上の高い濃度では下向きになる。その結果と
して、測定曲線は、非常に高い濃度では、負の勾配をも
つ。
【０００７】そのような測定曲線をもつ分析は、２つの
異なる被検体濃度が、１つの測定シグナルに帰せられ、
次には、被検体の誤った定量へと導くことを示してい
る。この効果は、「フック（ｈｏｏｋ）効果」と呼ばれ
る。
異なる被検体濃度が、１つの測定シグナルに帰せられ、
次には、被検体の誤った定量へと導くことを示してい
る。この効果は、「フック（ｈｏｏｋ）効果」と呼ばれ
る。
【０００８】したがって、同時サンドイッチイムノアッ
セイを用いて被検体を測定する場合には、このフック効
果による誤った定量を避けるために、測定シグナルが、
曲線の上昇部分か下降部分かいずれに位置しているかを
確認することが必要である。
セイを用いて被検体を測定する場合には、このフック効
果による誤った定量を避けるために、測定シグナルが、
曲線の上昇部分か下降部分かいずれに位置しているかを
確認することが必要である。
【０００９】測定曲線の正勾配の領域において、比較的
低い濃度では、フック・ピークに接近するにつれて、曲
線が平らになるので、近接した濃度の間の識別が事実上
もはや不可能になるという、さらなる難題が生じる。こ
のことは、実際に定量的測定に使用できるアッセイ範囲
を一層限定する。
低い濃度では、フック・ピークに接近するにつれて、曲
線が平らになるので、近接した濃度の間の識別が事実上
もはや不可能になるという、さらなる難題が生じる。こ
のことは、実際に定量的測定に使用できるアッセイ範囲
を一層限定する。
【００１０】文献から既知であるフック効果を認識する
方法は、非常に高い濃度の場合に、より強く希釈された
サンプルが、より高い測定シグナルを生じるような２つ
の異なるサンプル希釈を用いるサンプルの並列測定であ
る（Schulze and Schwich, Prot. Biol. Fluids 5(195
8), 15）。さらに、フック効果を認識し、そして抗体／
抗原反応の速度論を解析することによって、それを除く
試みもなされてきた（ドイツ特許第27 24 2722号、欧州
特許第0 148 463号，Hoffmann et al., Clin.Chem. 30,
(1984), 1499）。しかしながら、これら上記方法はす
べて、それらが、複雑な測定法か複雑な測定値の評価の
いずれかを要するという欠点をもっている。
方法は、非常に高い濃度の場合に、より強く希釈された
サンプルが、より高い測定シグナルを生じるような２つ
の異なるサンプル希釈を用いるサンプルの並列測定であ
る（Schulze and Schwich, Prot. Biol. Fluids 5(195
8), 15）。さらに、フック効果を認識し、そして抗体／
抗原反応の速度論を解析することによって、それを除く
試みもなされてきた（ドイツ特許第27 24 2722号、欧州
特許第0 148 463号，Hoffmann et al., Clin.Chem. 30,
(1984), 1499）。しかしながら、これら上記方法はす
べて、それらが、複雑な測定法か複雑な測定値の評価の
いずれかを要するという欠点をもっている。
【００１１】連続アッセイ技術は、原則としてフック効
果を防ぐことができるけれども、既に述べたように、同
時サンドイッチアッセイに比較した場合、より低い感度
と精度、ならびにより長い測定時間という欠点を有す
る。
果を防ぐことができるけれども、既に述べたように、同
時サンドイッチアッセイに比較した場合、より低い感度
と精度、ならびにより長い測定時間という欠点を有す
る。
【００１２】同時サンドイッチイムノアッセイにおける
誤った解釈を避けるためのより良き考えは、フック効果
の存在が、回避できるか、または少なくとも、より高い
濃度範囲にシフトできるような程度に、測定曲線の形状
を変えるという考えであろう。これは、実用試験のため
のより広いアッセイ範囲をもたらすであろう。
誤った解釈を避けるためのより良き考えは、フック効果
の存在が、回避できるか、または少なくとも、より高い
濃度範囲にシフトできるような程度に、測定曲線の形状
を変えるという考えであろう。これは、実用試験のため
のより広いアッセイ範囲をもたらすであろう。
【００１３】免疫試験において通常存在する高度に特異
的な抗体に加えて、被検体に対して低い親和力をもつ、
少なくとも１種のさらなる抗体を添加することによっ
て、フック効果が低減できるということが報告された
（米国特許第4 595 661号）。この方法の欠点は、被検
体に対して極端に異なる親和力をもつ２つの特異的抗体
が、検出されるべき各被検体について調製されねばなら
ないということである。
的な抗体に加えて、被検体に対して低い親和力をもつ、
少なくとも１種のさらなる抗体を添加することによっ
て、フック効果が低減できるということが報告された
（米国特許第4 595 661号）。この方法の欠点は、被検
体に対して極端に異なる親和力をもつ２つの特異的抗体
が、検出されるべき各被検体について調製されねばなら
ないということである。
【００１４】
【発明が解決しようとする課題】したがって、本発明の
目的は、一方では、フック効果が、できるだけ高い濃度
範囲までシフトでき、そして他方では、それによる曲線
の傾斜が、比較的高い被検体濃度まで急勾配に残され
て、近接した被検体濃度が、それに関する測定シグナル
に基づいて互いに容易に区別できるように、サンドイッ
チアッセイを改良することであった。これは、実用的ア
ッセイ範囲を比較的高い濃度まで拡大させることができ
るであろう。
目的は、一方では、フック効果が、できるだけ高い濃度
範囲までシフトでき、そして他方では、それによる曲線
の傾斜が、比較的高い被検体濃度まで急勾配に残され
て、近接した被検体濃度が、それに関する測定シグナル
に基づいて互いに容易に区別できるように、サンドイッ
チアッセイを改良することであった。これは、実用的ア
ッセイ範囲を比較的高い濃度まで拡大させることができ
るであろう。
【００１５】
【課題を解決するための手段】本発明は、サンドイッチ
アッセイの２種の抗体の少なくとも１種が、ポリクロー
ナル抗体である同時（「一段階」）イムノアッセイに関
する。本発明による目的は、分離ゲルに共有結合されて
いる抗体に対応する抗原を用いて、アフィニティークロ
マトグラフィー法を使ってポリクローナル抗体（類）を
精製することによって達成される。
アッセイの２種の抗体の少なくとも１種が、ポリクロー
ナル抗体である同時（「一段階」）イムノアッセイに関
する。本発明による目的は、分離ゲルに共有結合されて
いる抗体に対応する抗原を用いて、アフィニティークロ
マトグラフィー法を使ってポリクローナル抗体（類）を
精製することによって達成される。
【００１６】本発明による方法において、ポリクローナ
ル抗体は、精製されるべき特定の抗体に相補的である抗
原タンパク質が、共有結合されているゲルを充填された
クロマトグラフィーカラムを用いて精製される。そのタ
ンパク質に特異的である抗体のみが、そのカラムに結合
され、一方、非特異的な抗体のすべては、カラムから妨
げられずに溶出される。次いで、カラムに結合されてい
る特異的抗体は、例えば、ｐＨを変えることによって、
カラムから溶出され、濃縮され、そしてさらなる処理に
かけることができる。アフィニティークロマトグラフィ
ーにより抗体を精製するそのような方法は、文献に詳細
に記述されている（P.D.G. Dean, W.S.Johnson and F.
A. Middle (Fds.) Affinity Chromatography. A Practi
cal Approach, IRL Press (1985)）。
ル抗体は、精製されるべき特定の抗体に相補的である抗
原タンパク質が、共有結合されているゲルを充填された
クロマトグラフィーカラムを用いて精製される。そのタ
ンパク質に特異的である抗体のみが、そのカラムに結合
され、一方、非特異的な抗体のすべては、カラムから妨
げられずに溶出される。次いで、カラムに結合されてい
る特異的抗体は、例えば、ｐＨを変えることによって、
カラムから溶出され、濃縮され、そしてさらなる処理に
かけることができる。アフィニティークロマトグラフィ
ーにより抗体を精製するそのような方法は、文献に詳細
に記述されている（P.D.G. Dean, W.S.Johnson and F.
A. Middle (Fds.) Affinity Chromatography. A Practi
cal Approach, IRL Press (1985)）。
【００１７】本発明の好適な例は、固相抗体としてのモ
ノクローナル抗体とシグナル発生抗体としてのポリクロ
ーナル抗体を含む同時サンドイッチイムノアッセイを包
含する。本明細書に記述される本発明による方法にした
がい、このポリクローナル抗体は、対応する抗原が共有
結合されているゲルを含有するクロマトグラフィーカラ
ムを用いて精製される。
ノクローナル抗体とシグナル発生抗体としてのポリクロ
ーナル抗体を含む同時サンドイッチイムノアッセイを包
含する。本明細書に記述される本発明による方法にした
がい、このポリクローナル抗体は、対応する抗原が共有
結合されているゲルを含有するクロマトグラフィーカラ
ムを用いて精製される。
【００１８】本発明の非常に特別に好適な例は、β−２
−ミクログロブリンを定量的に測定するための同時サン
ドイッチイムノアッセイを包含する。このイムノアッセ
イは、モノクローナル捕捉抗体とポリクローナルシグナ
ル発生抗体を使用する。本明細書に記述される方法に基
づき、ポリクローナル抗体は、純粋なβ−２−ミクログ
ロブリンが共有結合されているゲルを充填されたクロマ
トグラフィーカラムを用いて精製される。この方法は、
アフィニティークロマトグラフィーによって精製されな
かったシグナル発生抗体を用いて達成される方法に比較
して、より高い被検体濃度までシフトされるフック・ピ
ークと、より広い濃度範囲について適切にされた測定曲
線をもたらす。
−ミクログロブリンを定量的に測定するための同時サン
ドイッチイムノアッセイを包含する。このイムノアッセ
イは、モノクローナル捕捉抗体とポリクローナルシグナ
ル発生抗体を使用する。本明細書に記述される方法に基
づき、ポリクローナル抗体は、純粋なβ−２−ミクログ
ロブリンが共有結合されているゲルを充填されたクロマ
トグラフィーカラムを用いて精製される。この方法は、
アフィニティークロマトグラフィーによって精製されな
かったシグナル発生抗体を用いて達成される方法に比較
して、より高い被検体濃度までシフトされるフック・ピ
ークと、より広い濃度範囲について適切にされた測定曲
線をもたらす。
【００１９】以下に挙げられる実施例は、これらの実施
例が、本出願における特許請求の全体をいかなる点でも
限定することなしに、β−２−ミクログロブリンを定量
的に測定する方法に基づく発明を明らかにする。
例が、本出願における特許請求の全体をいかなる点でも
限定することなしに、β−２−ミクログロブリンを定量
的に測定する方法に基づく発明を明らかにする。
【００２０】
（実施例１）β−２−ミクログロブリンを定量するため
のサンドイッチイムノアッセイを、自動Ｉｍｍｕｎｏ
１ アナライザー（Bayer Diagnostics, Munich）にお
いて実施した。β−２−ミクログロブリンに対するモノ
クローナル抗体、Ａおよびβ−２−ミクログロブリンに
対する、ヒツジ血清由来のポリクローナル抗体、Ｂを使
用した。
のサンドイッチイムノアッセイを、自動Ｉｍｍｕｎｏ
１ アナライザー（Bayer Diagnostics, Munich）にお
いて実施した。β−２−ミクログロブリンに対するモノ
クローナル抗体、Ａおよびβ−２−ミクログロブリンに
対する、ヒツジ血清由来のポリクローナル抗体、Ｂを使
用した。
【００２１】モノクローナル抗体Ａは、捕捉抗体として
使用されるが、文献から既知である方法にしたがって、
フルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）で標識
される（例えば、S.S. Wong, Chemistry of Protein Co
njugation and Cross-Linking, CRC Press, 1991）。
使用されるが、文献から既知である方法にしたがって、
フルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）で標識
される（例えば、S.S. Wong, Chemistry of Protein Co
njugation and Cross-Linking, CRC Press, 1991）。
【００２２】ポリクローナル抗体Ｂは、硫酸アンモニウ
ムによる沈殿、次いで、分離ゲル（BioRad Affi-Prep 1
0 affinity chromatography support）にβ−２−ミク
ログロブリンが共有結合されているクロマトグラフィー
カラムを用いることによって、ヒツジ血清から精製す
る。それを分離後、このアフィニティー精製された抗体
を、文献から既知の方法を用いて、酵素「アルカリ性ホ
スファターゼ」に結合する（例えば、S.S. Wong, Chemi
stry of Protein Conjugation and Cross-Linking, CRC
Press, 1991）。この共役体は、シグナル発生抗体試薬
として働く。
ムによる沈殿、次いで、分離ゲル（BioRad Affi-Prep 1
0 affinity chromatography support）にβ−２−ミク
ログロブリンが共有結合されているクロマトグラフィー
カラムを用いることによって、ヒツジ血清から精製す
る。それを分離後、このアフィニティー精製された抗体
を、文献から既知の方法を用いて、酵素「アルカリ性ホ
スファターゼ」に結合する（例えば、S.S. Wong, Chemi
stry of Protein Conjugation and Cross-Linking, CRC
Press, 1991）。この共役体は、シグナル発生抗体試薬
として働く。
【００２３】２種の抗体共役体を、タンパク質含有バッ
ファー水溶液において、自動Ｉｍｍｕｎｏ １の試験に
おいて検出試薬として使用する。
ファー水溶液において、自動Ｉｍｍｕｎｏ １の試験に
おいて検出試薬として使用する。
【００２４】２種の抗体およびサンプルを、最初に、サ
ンドイッチ複合体を形成させるために、３７℃で２１分
間、その装置においてインキュベートする。その後、小
さい磁気ビーズを添加し、そしてその混合液を、３７℃
でさらに８分間インキュベートする。磁気ビーズは、フ
ルオレセインに対する抗体によりコーティングされ、免
疫複合体の捕捉抗体のフルオレセインに結合する。免疫
複合体を分離、洗浄し、そしてリン酸ｐ−ニトロフェノ
ールを添加した後、免疫複合体の第２の抗体に結合して
いる酵素アルカリ性ホスファターゼが、発色性ｐ−ニト
ロフェノール塩の形成を触媒する。最初の数分で形成さ
れる染料の量が、被検体の濃度に比例する。
ンドイッチ複合体を形成させるために、３７℃で２１分
間、その装置においてインキュベートする。その後、小
さい磁気ビーズを添加し、そしてその混合液を、３７℃
でさらに８分間インキュベートする。磁気ビーズは、フ
ルオレセインに対する抗体によりコーティングされ、免
疫複合体の捕捉抗体のフルオレセインに結合する。免疫
複合体を分離、洗浄し、そしてリン酸ｐ−ニトロフェノ
ールを添加した後、免疫複合体の第２の抗体に結合して
いる酵素アルカリ性ホスファターゼが、発色性ｐ−ニト
ロフェノール塩の形成を触媒する。最初の数分で形成さ
れる染料の量が、被検体の濃度に比例する。
【００２５】対照のために、ヒツジ血清由来のポリクロ
ーナル抗体Ｂを、プロテインＡを含んだカラムを用いて
精製し、次いで、前記のようにアルカリ性ホスファター
ゼに結合した。次に、それを、前記のように、Ｉｍｍｕ
ｎｏ １においてβ−２−ミクログロブリンを測定する
ために、フルオレセイン化したモノクローナル抗体Ａと
ともに、シグナル発生抗体として使用した。
ーナル抗体Ｂを、プロテインＡを含んだカラムを用いて
精製し、次いで、前記のようにアルカリ性ホスファター
ゼに結合した。次に、それを、前記のように、Ｉｍｍｕ
ｎｏ １においてβ−２−ミクログロブリンを測定する
ために、フルオレセイン化したモノクローナル抗体Ａと
ともに、シグナル発生抗体として使用した。
【００２６】実験結果は、ポリクローナル抗体を、アル
カリ性ホスファターゼに結合する前に、分離ゲルにβ−
２−ミクログロブリンが共有結合されている分離カラム
を用いて精製する場合には、範囲０〜２０ｍｇ／ｌにお
いて、β−２−ミクログロブリンを定量的に測定できる
ことを例証している。もし、一方で、ヒツジ血清由来の
抗体が、プロテインＡクロマトグラフィーによって単離
される場合には、被検体濃度約８ｍｇ／ｌで既に飽和に
達する測定曲線が得られ、そしてもはや、範囲８〜２０
ｍｇ／ｌにおいてβ−２−ミクログロブリン濃度を定量
的に測定することはできない。実験結果は、試薬中のプ
ロテインＡで精製された抗体濃度を増加することによっ
ては改善されない。
カリ性ホスファターゼに結合する前に、分離ゲルにβ−
２−ミクログロブリンが共有結合されている分離カラム
を用いて精製する場合には、範囲０〜２０ｍｇ／ｌにお
いて、β−２−ミクログロブリンを定量的に測定できる
ことを例証している。もし、一方で、ヒツジ血清由来の
抗体が、プロテインＡクロマトグラフィーによって単離
される場合には、被検体濃度約８ｍｇ／ｌで既に飽和に
達する測定曲線が得られ、そしてもはや、範囲８〜２０
ｍｇ／ｌにおいてβ−２−ミクログロブリン濃度を定量
的に測定することはできない。実験結果は、試薬中のプ
ロテインＡで精製された抗体濃度を増加することによっ
ては改善されない。
【００２７】図１は、グラフの形式でその結果を示す。
測定曲線は、６個の標準対照を用いて構築された。これ
らの対照の値は、０、０.１、１.０、３.０、８.０およ
び２０ｍｇ／ｌである。測定点が三角形で指示される測
定曲線は、シグナル発生抗体として、アフィニティー精
製されたポリクローナル抗体を含む抗体ペアーに関して
の測定曲線のコースを記す。測定点が四角で指示される
測定曲線は、シグナル発生抗体として、プロテインＡで
精製されたポリクローナル抗体を含む抗体ペアーに関し
ての測定曲線のコースを記す。被検体濃度は、ｘ軸上に
与えられ、一方、ｙ軸は、アナライザーによって測定さ
れた１分当たりの吸収における変化を与える。
測定曲線は、６個の標準対照を用いて構築された。これ
らの対照の値は、０、０.１、１.０、３.０、８.０およ
び２０ｍｇ／ｌである。測定点が三角形で指示される測
定曲線は、シグナル発生抗体として、アフィニティー精
製されたポリクローナル抗体を含む抗体ペアーに関して
の測定曲線のコースを記す。測定点が四角で指示される
測定曲線は、シグナル発生抗体として、プロテインＡで
精製されたポリクローナル抗体を含む抗体ペアーに関し
ての測定曲線のコースを記す。被検体濃度は、ｘ軸上に
与えられ、一方、ｙ軸は、アナライザーによって測定さ
れた１分当たりの吸収における変化を与える。
【００２８】（実施例２）フルオレセイン化された抗体
Ａを、実施例１に記載のように捕捉抗体として使用す
る。
Ａを、実施例１に記載のように捕捉抗体として使用す
る。
【００２９】ポリクローナル抗体Ｃを、硫酸アンモニウ
ムによる沈殿、そして、β−２−ミクログロブリンが共
有結合されているゲルを充填されたクロマトグラフィー
カラムを用いるアフィニティークロマトグラフィーによ
る続いての精製によって、ヒツジ血清から精製する。
ムによる沈殿、そして、β−２−ミクログロブリンが共
有結合されているゲルを充填されたクロマトグラフィー
カラムを用いるアフィニティークロマトグラフィーによ
る続いての精製によって、ヒツジ血清から精製する。
【００３０】対照のために、同じポリクローナル抗体
を、ヒツジ血清から沈殿させた後、プロテインＡを用い
て精製する。
を、ヒツジ血清から沈殿させた後、プロテインＡを用い
て精製する。
【００３１】２種の抗体画分を、実施例１に記載のよう
にアルカリ性ホスファターゼに共役する。２種の共役体
を、シグナル発生抗体として使用する。
にアルカリ性ホスファターゼに共役する。２種の共役体
を、シグナル発生抗体として使用する。
【００３２】イムノアッセイを、実施例１記載のように
実施する。
実施する。
【００３３】実験結果は、シグナル発生抗体共役体とし
て使用された場合、範囲０〜２０ｍｇ／ｌにおいて、β
−２−ミクログロブリンを定量的に測定できる測定曲線
を作るのは、アフィニティー精製されたポリクローナル
抗体のみであることを例証している。反対に、もし、ポ
リクローナル抗体が、プロテインＡでの精製型において
使用される場合には、もはや、濃度１０〜２０ｍｇ／ｌ
の被検体を測定することはできない。実験結果は、プロ
テインＡで精製された抗体共役体濃度を増加することに
よっては改善されない。
て使用された場合、範囲０〜２０ｍｇ／ｌにおいて、β
−２−ミクログロブリンを定量的に測定できる測定曲線
を作るのは、アフィニティー精製されたポリクローナル
抗体のみであることを例証している。反対に、もし、ポ
リクローナル抗体が、プロテインＡでの精製型において
使用される場合には、もはや、濃度１０〜２０ｍｇ／ｌ
の被検体を測定することはできない。実験結果は、プロ
テインＡで精製された抗体共役体濃度を増加することに
よっては改善されない。
【００３４】図２は、グラフの形式でその結果を示す。
測定曲線は、６個の標準対照を用いて構築された。これ
らの対照の値は、０、０.１、１.０、３.０、８.０およ
び２０.０ｍｇ／ｌである。測定点が三角形で指示され
る測定曲線は、シグナル発生抗体として、アフィニティ
ー精製されたポリクローナル抗体を含む抗体ペアーに関
しての測定曲線のコースを記す。測定点が四角で指示さ
れる測定曲線は、シグナル発生抗体として、プロテイン
Ａで精製されたポリクローナル抗体を含む抗体ペアーに
関しての測定曲線のコースを記す。被検体濃度は、ｘ軸
上に与えられ、一方、ｙ軸は、アナライザーによって測
定された１分当たりの吸収における変化を与える。
測定曲線は、６個の標準対照を用いて構築された。これ
らの対照の値は、０、０.１、１.０、３.０、８.０およ
び２０.０ｍｇ／ｌである。測定点が三角形で指示され
る測定曲線は、シグナル発生抗体として、アフィニティ
ー精製されたポリクローナル抗体を含む抗体ペアーに関
しての測定曲線のコースを記す。測定点が四角で指示さ
れる測定曲線は、シグナル発生抗体として、プロテイン
Ａで精製されたポリクローナル抗体を含む抗体ペアーに
関しての測定曲線のコースを記す。被検体濃度は、ｘ軸
上に与えられ、一方、ｙ軸は、アナライザーによって測
定された１分当たりの吸収における変化を与える。
【００３５】（実施例３）モノクローナル抗体Ｄを、捕
捉抗体として使用し、そして実施例１に記載のようにＦ
ＩＴＣと共役する。ポリクローナル抗体Ｂのアルカリ性
ホスファターゼ共役体を、シグナル発生抗体として使用
する。実施例１に記載のように、その抗体を、１つの場
合は、アフィニティークロマトグラフィーによって精製
し、他方の場合は、プロテインＡを用いて精製する。
捉抗体として使用し、そして実施例１に記載のようにＦ
ＩＴＣと共役する。ポリクローナル抗体Ｂのアルカリ性
ホスファターゼ共役体を、シグナル発生抗体として使用
する。実施例１に記載のように、その抗体を、１つの場
合は、アフィニティークロマトグラフィーによって精製
し、他方の場合は、プロテインＡを用いて精製する。
【００３６】イムノアッセイを、実施例１記載のように
実施する。
実施する。
【００３７】実験結果は、アフィニティー精製された、
シグナル発生抗体を用いる抗体組み合わせが、急勾配に
立ち上がる測定曲線を生じることを例証している。
シグナル発生抗体を用いる抗体組み合わせが、急勾配に
立ち上がる測定曲線を生じることを例証している。
【００３８】もし、反対に、シグナル発生抗体が、プロ
テインＡでの精製型において使用される場合には、著し
いフック効果が、被検体濃度約３〜５ｍｇ／ｌにおいて
既に存在しているフックピークをもつ測定曲線において
見られる。
テインＡでの精製型において使用される場合には、著し
いフック効果が、被検体濃度約３〜５ｍｇ／ｌにおいて
既に存在しているフックピークをもつ測定曲線において
見られる。
【００３９】図３は、グラフの形式でその結果を示す。
測定曲線は、６個の標準対照を用いて構築された。これ
らの対照の値は、０、０.１、１.０、３.０、８.０およ
び２０.０ｍｇ／ｌである。測定点が三角形で指示され
る測定曲線は、シグナル発生抗体として、アフィニティ
ー精製されたポリクローナル抗体を含む抗体ペアーに関
しての測定曲線のコースを記す。測定点が四角で指示さ
れる測定曲線は、シグナル発生抗体として、プロテイン
Ａで精製されたポリクローナル抗体を含む抗体ペアーに
関しての測定曲線のコースを記す。被検体濃度は、ｘ軸
上に与えられ、一方、ｙ軸は、アナライザーによって測
定された１分当たりの吸収における変化を与える。
測定曲線は、６個の標準対照を用いて構築された。これ
らの対照の値は、０、０.１、１.０、３.０、８.０およ
び２０.０ｍｇ／ｌである。測定点が三角形で指示され
る測定曲線は、シグナル発生抗体として、アフィニティ
ー精製されたポリクローナル抗体を含む抗体ペアーに関
しての測定曲線のコースを記す。測定点が四角で指示さ
れる測定曲線は、シグナル発生抗体として、プロテイン
Ａで精製されたポリクローナル抗体を含む抗体ペアーに
関しての測定曲線のコースを記す。被検体濃度は、ｘ軸
上に与えられ、一方、ｙ軸は、アナライザーによって測
定された１分当たりの吸収における変化を与える。
【００４０】アフィニティー精製された、シグナル発生
抗体の場合には、２０ｍｇ／ｌ対照についての値は、８
ｍｇ／ｌ対照についての値よりも高い。しかしながら、
それは、測定範囲外にあり、そして、いかなる正確な値
をも確定することが不可能であったので、それは、図に
おいて再現されなかった。
抗体の場合には、２０ｍｇ／ｌ対照についての値は、８
ｍｇ／ｌ対照についての値よりも高い。しかしながら、
それは、測定範囲外にあり、そして、いかなる正確な値
をも確定することが不可能であったので、それは、図に
おいて再現されなかった。
【００４１】（実施例４）モノクローナル抗体Ｄを、捕
捉抗体として使用し、そして実施例１に記載のようにＦ
ＩＴＣと共役する。ポリクローナル抗体Ｃのアルカリ性
ホスファターゼ共役体を、シグナル発生抗体として使用
する。実施例２に記載のように、その抗体を、１つの場
合は、アフィニティークロマトグラフィーによって精製
し、他方の場合は、プロテインＡを用いて精製する。
捉抗体として使用し、そして実施例１に記載のようにＦ
ＩＴＣと共役する。ポリクローナル抗体Ｃのアルカリ性
ホスファターゼ共役体を、シグナル発生抗体として使用
する。実施例２に記載のように、その抗体を、１つの場
合は、アフィニティークロマトグラフィーによって精製
し、他方の場合は、プロテインＡを用いて精製する。
【００４２】イムノアッセイを、実施例１記載のように
実施する。
実施する。
【００４３】実験結果は、アフィニティー精製された、
シグナル発生抗体を含む抗体組み合わせが、高濃度にお
いてのみ、ゆっくりと飽和に達する測定曲線を生じるこ
とを例証している。
シグナル発生抗体を含む抗体組み合わせが、高濃度にお
いてのみ、ゆっくりと飽和に達する測定曲線を生じるこ
とを例証している。
【００４４】反対に、もし、プロテインＡでの精製型に
おけるシグナル発生抗体が使用される場合には、著しい
フック効果が、被検体濃度約３〜５ｍｇ／ｌにおいて既
に存在しているフックピークをもつ測定曲線において見
られる。
おけるシグナル発生抗体が使用される場合には、著しい
フック効果が、被検体濃度約３〜５ｍｇ／ｌにおいて既
に存在しているフックピークをもつ測定曲線において見
られる。
【００４５】図４は、グラフの形式でその結果を示す。
測定曲線は、６個の標準対照を用いて構築された。これ
らの対照の値は、０，０．１，１．０，３．０，８．０
および２０．０ｍｇ／ｌである。測定点が三角形で指示
される測定曲線は、シグナル発生抗体として、アフィニ
ティー精製されたポリクローナル抗体を含む抗体ペアー
に関しての測定曲線のコースを記す。測定点が四角で指
示される測定曲線は、シグナル発生抗体として、プロテ
インＡで精製されたポリクローナル抗体を含む抗体ペア
ーに関しての測定曲線のコースを記す。被検体濃度は、
ｘ軸上に与えられ、一方、ｙ軸は、アナライザーによっ
て測定された１分当たりの吸収における変化を与える。
測定曲線は、６個の標準対照を用いて構築された。これ
らの対照の値は、０，０．１，１．０，３．０，８．０
および２０．０ｍｇ／ｌである。測定点が三角形で指示
される測定曲線は、シグナル発生抗体として、アフィニ
ティー精製されたポリクローナル抗体を含む抗体ペアー
に関しての測定曲線のコースを記す。測定点が四角で指
示される測定曲線は、シグナル発生抗体として、プロテ
インＡで精製されたポリクローナル抗体を含む抗体ペア
ーに関しての測定曲線のコースを記す。被検体濃度は、
ｘ軸上に与えられ、一方、ｙ軸は、アナライザーによっ
て測定された１分当たりの吸収における変化を与える。
【００４６】（実施例５）捕捉抗体：実施例１に記載の
ようにＦＩＴＣと共役されるモノクローナル抗体Ａ。
ようにＦＩＴＣと共役されるモノクローナル抗体Ａ。
【００４７】シグナル発生抗体：実施例１記載のよう
に、β−２−ミクログロブリンを充填されたカラムを用
いてアフィニティー精製され、そしてアルカリ性ホスフ
ァターゼと共役されるポリクローナル抗体Ｅ。
に、β−２−ミクログロブリンを充填されたカラムを用
いてアフィニティー精製され、そしてアルカリ性ホスフ
ァターゼと共役されるポリクローナル抗体Ｅ。
【００４８】実験を、実施例１記載のように実施する。
【００４９】作成された測定曲線は、β−２−ミクログ
ロブリンを、濃度２０ｍｇ／ｌまで定量的に測定させ
る。
ロブリンを、濃度２０ｍｇ／ｌまで定量的に測定させ
る。
【００５０】図５は、グラフの形式でその結果を示す。
測定曲線は、６個の標準対照を用いて構築された。これ
らの対照の値は、０，０．１，１．０，３．０，８．０
および２０．０ｍｇ／ｌである。示された図は、シグナ
ル発生抗体として、アフィニティー精製されたポリクロ
ーナル抗体を含む抗体ペアーに関しての測定曲線のコー
スを記す。被検体濃度は、ｘ軸上に与えられ、一方、ｙ
軸は、アナライザーによって測定された１分当たりの吸
収における変化を与える。
測定曲線は、６個の標準対照を用いて構築された。これ
らの対照の値は、０，０．１，１．０，３．０，８．０
および２０．０ｍｇ／ｌである。示された図は、シグナ
ル発生抗体として、アフィニティー精製されたポリクロ
ーナル抗体を含む抗体ペアーに関しての測定曲線のコー
スを記す。被検体濃度は、ｘ軸上に与えられ、一方、ｙ
軸は、アナライザーによって測定された１分当たりの吸
収における変化を与える。
【００５１】本発明の特徴および態様は以下のとおりで
ある。
ある。
【００５２】１． ポリクローナル抗体が、アフィニテ
ィークロマトグラフィーを使って抗原において精製され
ることを特徴とする、ポリクローナル抗体を含む同時サ
ンドイッチイムノアッセイのための試験キット。
ィークロマトグラフィーを使って抗原において精製され
ることを特徴とする、ポリクローナル抗体を含む同時サ
ンドイッチイムノアッセイのための試験キット。
【００５３】２． ポリクローナル抗体が、シグナル発
生抗体であることを特徴とする、第１項記載の試験キッ
ト。
生抗体であることを特徴とする、第１項記載の試験キッ
ト。
【００５４】３． ポリクローナル抗体が、染料、核種
もしくは酵素であることを特徴とする、第２項記載の試
験キット。
もしくは酵素であることを特徴とする、第２項記載の試
験キット。
【００５５】４． β−２−ミクログロブリンを検出す
るための第１〜３項試験キット。
るための第１〜３項試験キット。
【００５６】５． イムノアッセイを作出するための、
アフィニティークロマトグラフィーを使って抗原におい
て精製されるポリクローナル抗体の使用。
アフィニティークロマトグラフィーを使って抗原におい
て精製されるポリクローナル抗体の使用。
【００５７】６． アフィニティークロマトグラフィー
を使って関連する抗原に対して精製されるポリクローナ
ル抗体を用いることによる、同時サンドイッチイムノア
ッセイ（一段階アッセイ）においてアッセイ範囲を拡大
する方法。
を使って関連する抗原に対して精製されるポリクローナ
ル抗体を用いることによる、同時サンドイッチイムノア
ッセイ（一段階アッセイ）においてアッセイ範囲を拡大
する方法。
【００５８】７． 少なくとも１種のポリクローナル抗
体が使用され、そしてアフィニティークロマトグラフィ
ーを使って抗原に対して精製されることを特徴とする、
第６項記載の方法。
体が使用され、そしてアフィニティークロマトグラフィ
ーを使って抗原に対して精製されることを特徴とする、
第６項記載の方法。
【００５９】８． 捕捉抗体がモノクローナル抗体であ
り、そしてシグナルを発生する第２の抗体が、アフィニ
ティークロマトグラフィーを使って抗原に対して精製さ
れるポリクローナル抗体であることを特徴とする、第６
および７項記載の方法。
り、そしてシグナルを発生する第２の抗体が、アフィニ
ティークロマトグラフィーを使って抗原に対して精製さ
れるポリクローナル抗体であることを特徴とする、第６
および７項記載の方法。
【００６０】９． 抗原がβ−２−ミクログロブリンで
あることを特徴とする、第６〜８項記載の方法。
あることを特徴とする、第６〜８項記載の方法。
【００６１】１０．捕捉抗体がモノクローナルのフルオ
レセイン化抗体であり、そしてシグナル発生抗体が、ア
フィニティークロマトグラフィーを使ってβ−２−ミク
ログロブリンにおいて精製されるポリクローナル抗体で
あり、アルカリ性ホスファターゼに結合されることを特
徴とし、そして固相への固定が、抗フルオレセイン抗体
が結合される小さい磁気ビーズを用いて実施されること
を特徴とする、同時サンドイッチイムノアッセイを用い
てβ−２−ミクログロブリンを検出する方法。
レセイン化抗体であり、そしてシグナル発生抗体が、ア
フィニティークロマトグラフィーを使ってβ−２−ミク
ログロブリンにおいて精製されるポリクローナル抗体で
あり、アルカリ性ホスファターゼに結合されることを特
徴とし、そして固相への固定が、抗フルオレセイン抗体
が結合される小さい磁気ビーズを用いて実施されること
を特徴とする、同時サンドイッチイムノアッセイを用い
てβ−２−ミクログロブリンを検出する方法。
【図１】実施例１による標準対照を用いた測定値の測定
曲線を表すグラフである。
曲線を表すグラフである。
【図２】実施例２による標準対照を用いた測定値の測定
曲線を表すグラフである。
曲線を表すグラフである。
【図３】実施例３による標準対照を用いた測定値の測定
曲線を表すグラフである。
曲線を表すグラフである。
【図４】実施例４による標準対照を用いた測定値の測定
曲線を表すグラフである。
曲線を表すグラフである。
【図５】実施例５による標準対照を用いた測定値の測定
曲線を表すグラフである。
曲線を表すグラフである。
Claims (2)
- 【請求項１】 ポリクローナル抗体が、アフィニティー
クロマトグラフィーを用いる抗原上で精製されたことを
特徴とする、ポリクローナル抗体を含む同時サンドイッ
チイムノアッセイのための試験キット。 - 【請求項２】 イムノアッセイを行うための、アフィニ
ティークロマトグラフィーを用いる抗原上で精製された
ポリクローナル抗体の使用。
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| DE19602491.9 | 1996-01-25 | ||
| DE1996102491 DE19602491A1 (de) | 1996-01-25 | 1996-01-25 | Verfahren zur Vergrößerung des Assay-Bereiches und zum Vermeiden des Hook-Effektes bei simultanen Sandwich-Immunoassays und entsprechende Testkits |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH09210998A true JPH09210998A (ja) | 1997-08-15 |
Family
ID=7783559
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP9020903A Pending JPH09210998A (ja) | 1996-01-25 | 1997-01-21 | 同時サンドイツチイムノアツセイにおいてアツセイ範囲を拡大し、フツク効果を回避する方法、および対応する試験キツト |
Country Status (4)
| Country | Link |
|---|---|
| EP (1) | EP0787986A1 (ja) |
| JP (1) | JPH09210998A (ja) |
| CA (1) | CA2195727A1 (ja) |
| DE (1) | DE19602491A1 (ja) |
Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2011209140A (ja) * | 2010-03-30 | 2011-10-20 | Sekisui Medical Co Ltd | ヒトｃ反応性タンパク質（ｃｒｐ）測定用イムノクロマト試薬 |
| WO2018212261A1 (ja) * | 2017-05-18 | 2018-11-22 | 俊記 内原 | ４リピートタウの質的違いを検出する特異的結合試薬、これを用いた検査方法、検査キット、及び医薬のスクリーニング方法 |
| WO2023074323A1 (ja) * | 2021-11-01 | 2023-05-04 | 株式会社日立ハイテク | 免疫学的測定方法および免疫学的測定装置 |
Families Citing this family (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| DE10064827A1 (de) | 2000-12-22 | 2002-06-27 | Dade Behring Marburg Gmbh | Nachweisverfahren |
| CA2547351A1 (en) | 2003-12-01 | 2005-07-07 | Dade Behring Marburg Gmbh | Homogeneous detection method |
Family Cites Families (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| DE2724272A1 (de) | 1977-05-28 | 1978-12-07 | Tan Marinus Johan | Schulterlesestaender |
| US4595661A (en) | 1983-11-18 | 1986-06-17 | Beckman Instruments, Inc. | Immunoassays and kits for use therein which include low affinity antibodies for reducing the hook effect |
| DE3347162A1 (de) | 1983-12-27 | 1985-07-04 | Behringwerke Ag, 3550 Marburg | Photometrisches verfahren zur konzentrationsbestimmung bei reaktionen, die unter bildung oder verbrauch von streuzentren verlaufen |
| DE4034509A1 (de) * | 1990-10-30 | 1992-05-07 | Boehringer Mannheim Gmbh | Immunologisches praezipitationsverfahren zur bestimmung eines bindefaehigen analyten sowie reagenz zur durchfuehrung dieses verfahrens |
-
1996
- 1996-01-25 DE DE1996102491 patent/DE19602491A1/de not_active Withdrawn
-
1997
- 1997-01-13 EP EP97100409A patent/EP0787986A1/de not_active Withdrawn
- 1997-01-21 JP JP9020903A patent/JPH09210998A/ja active Pending
- 1997-01-22 CA CA 2195727 patent/CA2195727A1/en not_active Abandoned
Cited By (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2011209140A (ja) * | 2010-03-30 | 2011-10-20 | Sekisui Medical Co Ltd | ヒトｃ反応性タンパク質（ｃｒｐ）測定用イムノクロマト試薬 |
| WO2018212261A1 (ja) * | 2017-05-18 | 2018-11-22 | 俊記 内原 | ４リピートタウの質的違いを検出する特異的結合試薬、これを用いた検査方法、検査キット、及び医薬のスクリーニング方法 |
| JP2018194451A (ja) * | 2017-05-18 | 2018-12-06 | 公益財団法人東京都医学総合研究所 | ４リピートタウの質的違いを検出する特異的結合試薬、これを用いた検査方法、検査キット、及び医薬のスクリーニング方法 |
| WO2023074323A1 (ja) * | 2021-11-01 | 2023-05-04 | 株式会社日立ハイテク | 免疫学的測定方法および免疫学的測定装置 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CA2195727A1 (en) | 1997-07-26 |
| DE19602491A1 (de) | 1997-07-31 |
| EP0787986A1 (de) | 1997-08-06 |
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