JP2568910B2 - サンドイッチ免疫検定における線形標準曲線を得るための方法 - Google Patents
サンドイッチ免疫検定における線形標準曲線を得るための方法Info
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- Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
- Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10S436/00—Chemistry: analytical and immunological testing
- Y10S436/827—Lectins
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
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- Engineering & Computer Science (AREA)
- Immunology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
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- Biomedical Technology (AREA)
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- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
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Description
【発明の詳細な説明】 発明の分野 本発明は、サンドイッチタイプの免疫検定において線
形標準曲線（linear standard curve）を得るための方
法に関する。
形標準曲線（linear standard curve）を得るための方
法に関する。
発明の背景 本発明は、他の免疫検定技術と同様、患者の血液また
は尿のような流体サンプル中の抗原の存在または量を測
定する方法である。他の免疫検定技術とは異なり、本発
明は、特に、高濃度の抗原を測定しようとする場合の、
線形標準曲線を得るための方法を提供することにより、
免疫検定方法を簡素化するものである。
は尿のような流体サンプル中の抗原の存在または量を測
定する方法である。他の免疫検定技術とは異なり、本発
明は、特に、高濃度の抗原を測定しようとする場合の、
線形標準曲線を得るための方法を提供することにより、
免疫検定方法を簡素化するものである。
抗原は、体内に入ったときに抗体の生産を促進する物
質、通常は蛋白質または炭水化物である。抗原の一例
は、体内において、ウイルスのような病気の原因となる
異物である。
質、通常は蛋白質または炭水化物である。抗原の一例
は、体内において、ウイルスのような病気の原因となる
異物である。
抗原の他の例は、身体の状態を証明する物質である。
かかる抗原は、診断に役立つ意義を持っている。例え
ば、抗原IgE（免疫グロブリンＥ）はアレルギー状態を
示し、一方抗原hCG（ヒト絨毛性性腺刺激ホルモン）は
妊娠の徴候である。抗原フェリチンは、鉄含有蛋白質で
あり、通常は、（１）貧血（フェリチンが比較的低濃度
で存在する場合）と、（２）鉄オーバーロード（iron o
verload）（フェリチンが比較的高濃度で存在する場
合）の２つの状態の一方の徴候として測定される。これ
らは、免疫検定において診断的用途を有する抗原のほん
の数例に過ぎない。
かかる抗原は、診断に役立つ意義を持っている。例え
ば、抗原IgE（免疫グロブリンＥ）はアレルギー状態を
示し、一方抗原hCG（ヒト絨毛性性腺刺激ホルモン）は
妊娠の徴候である。抗原フェリチンは、鉄含有蛋白質で
あり、通常は、（１）貧血（フェリチンが比較的低濃度
で存在する場合）と、（２）鉄オーバーロード（iron o
verload）（フェリチンが比較的高濃度で存在する場
合）の２つの状態の一方の徴候として測定される。これ
らは、免疫検定において診断的用途を有する抗原のほん
の数例に過ぎない。
免疫検定技術は、検定を行なっている抗原と抗体との
間での複合体（complex）の形成に依存するものであ
る。抗体は、免疫検定処置の際に加えられる試薬であ
る。複合体化した抗原と抗体の量を検出することができ
る手段が提供されている。通常は、検出は、標識を使用
することにより行なわれる。標識は、例えば、I125のよ
うな放射性標識、西洋わさびペルオキシダーゼ（HRPO）
のような酵素標識またはフルオレセインのような蛍光標
識であるが、他の標識手段も可能である。標識は、抗
原：抗体複合体を形成する構成要素の１つに付され、通
常は、複合体化していない標識抗原または抗体から、複
合体化した標識抗原および抗体を分離した後に検出およ
び／または定量される。
間での複合体（complex）の形成に依存するものであ
る。抗体は、免疫検定処置の際に加えられる試薬であ
る。複合体化した抗原と抗体の量を検出することができ
る手段が提供されている。通常は、検出は、標識を使用
することにより行なわれる。標識は、例えば、I125のよ
うな放射性標識、西洋わさびペルオキシダーゼ（HRPO）
のような酵素標識またはフルオレセインのような蛍光標
識であるが、他の標識手段も可能である。標識は、抗
原：抗体複合体を形成する構成要素の１つに付され、通
常は、複合体化していない標識抗原または抗体から、複
合体化した標識抗原および抗体を分離した後に検出およ
び／または定量される。
分析的に同定することができるように標識付けされる
抗体を使用した免疫検定には幾つかの公知の方法があ
る。「サンドイッチ」（“sandwich"）または「２部
位」（“two-site"）技術は、米国特許第4,016,143号に
開示されているように、抗原が２つの抗体間に「サンド
イッチ」されると云われるようにして、抗原と、抗原の
表面の２つの異なった場所に結合する２つの抗体との間
での複合体の形成からなる。かかる方法により形成され
る抗原：抗体：抗原複合体の量を検出する好都合な方法
は、固相支持体に結合された第１の未標識抗体と第２の
未結合標識抗体とを提供するものである。このようにし
て、標識は、抗体：抗原：抗体サンドイッチを介して固
体支持体に結合し、標識複合体は容易に単離することが
できる。標準的な方法では、固体支持体の標識の量が検
出および／または定量されるが、サンドイッチ免疫検定
の一の稀に使用される変更では、溶液に残っている標識
の量を測定することができる。
抗体を使用した免疫検定には幾つかの公知の方法があ
る。「サンドイッチ」（“sandwich"）または「２部
位」（“two-site"）技術は、米国特許第4,016,143号に
開示されているように、抗原が２つの抗体間に「サンド
イッチ」されると云われるようにして、抗原と、抗原の
表面の２つの異なった場所に結合する２つの抗体との間
での複合体の形成からなる。かかる方法により形成され
る抗原：抗体：抗原複合体の量を検出する好都合な方法
は、固相支持体に結合された第１の未標識抗体と第２の
未結合標識抗体とを提供するものである。このようにし
て、標識は、抗体：抗原：抗体サンドイッチを介して固
体支持体に結合し、標識複合体は容易に単離することが
できる。標準的な方法では、固体支持体の標識の量が検
出および／または定量されるが、サンドイッチ免疫検定
の一の稀に使用される変更では、溶液に残っている標識
の量を測定することができる。
第１の抗体および第２の抗体という語は、本明細書に
おいては明確にするために使用されているものであっ
て、免疫反応の方向を示しまたは制限することを意図す
るものではない。例えば、免疫検定は、本技術分野にお
いて公知のように、正反応、高速正反応、同時反応また
は可逆反応方式で進めることができる。例えば、米国特
許第4,376,110号を参照されたい。例えば、抗原は、先
ず結合抗体と反応し、次に標識抗体と反応することがで
き、あるいは逆にすることもできる。反応はまた、同時
に起ることもある。高速正反応および同時反応検定の場
合には、複合体の形成を行なわせるのにインキュベーシ
ョンを１回だけ使用し、一方、正反応および可逆反応検
定は少なくとも２回のインキュベーションを必要とす
る。１回以上のかかるインキュベーションによれば、標
識は不溶化抗体：抗原：標識抗体のサンドイッチを介し
て支持体に付される。固体支持体の標識抗体の量または
溶液に残っている量が、次に検出される。
おいては明確にするために使用されているものであっ
て、免疫反応の方向を示しまたは制限することを意図す
るものではない。例えば、免疫検定は、本技術分野にお
いて公知のように、正反応、高速正反応、同時反応また
は可逆反応方式で進めることができる。例えば、米国特
許第4,376,110号を参照されたい。例えば、抗原は、先
ず結合抗体と反応し、次に標識抗体と反応することがで
き、あるいは逆にすることもできる。反応はまた、同時
に起ることもある。高速正反応および同時反応検定の場
合には、複合体の形成を行なわせるのにインキュベーシ
ョンを１回だけ使用し、一方、正反応および可逆反応検
定は少なくとも２回のインキュベーションを必要とす
る。１回以上のかかるインキュベーションによれば、標
識は不溶化抗体：抗原：標識抗体のサンドイッチを介し
て支持体に付される。固体支持体の標識抗体の量または
溶液に残っている量が、次に検出される。
サンドイッチ免疫検定は、その高度の特異性のため
に、臨床および診断試験産業において広く魅力的なもの
となろつている。しかしながら、この種の免疫検定で
は、実際に線形の標準曲線を得るのはしばしば困難であ
る。実際に線形の標準曲線という意味は、比較的線形で
ある、即ち、得られた系それ自身において通常は約90-1
05％線形である標準曲線であるということである。これ
は、視覚的に線形の標準曲線と区別されるべきであり、
この場合には相対的直線性は数学的手法により得られ
る。
に、臨床および診断試験産業において広く魅力的なもの
となろつている。しかしながら、この種の免疫検定で
は、実際に線形の標準曲線を得るのはしばしば困難であ
る。実際に線形の標準曲線という意味は、比較的線形で
ある、即ち、得られた系それ自身において通常は約90-1
05％線形である標準曲線であるということである。これ
は、視覚的に線形の標準曲線と区別されるべきであり、
この場合には相対的直線性は数学的手法により得られ
る。
かなりの量の抗原を測定しようとする特殊な検定の場
合には、実際に線形の標準曲線の作成は、しばしば不可
能な作業となる。これは、抗原はかなりの量存在する場
合には、反応系において制限因子として作用することが
できないからである。これに対し、問題の抗原が充分に
低い量存在する場合には、抗原は、免疫検定において速
度制限因子となり、かくして、当然にして擬似一時反応
を行ない、線形標準曲線をつくる。
合には、実際に線形の標準曲線の作成は、しばしば不可
能な作業となる。これは、抗原はかなりの量存在する場
合には、反応系において制限因子として作用することが
できないからである。これに対し、問題の抗原が充分に
低い量存在する場合には、抗原は、免疫検定において速
度制限因子となり、かくして、当然にして擬似一時反応
を行ない、線形標準曲線をつくる。
背景技術としていえば、化学反応は動力学的ベース
で、つまり、反応速度が所定の条件のもとで反応成分の
濃度によって影響される態様に依存して、反応次数によ
り分類することができる。一次反応は、１つの反応成分
だけの濃度に直接比例した速度で進行する反応である。
一次反応の最も簡単な例は、反応Ａ→Ｐの反応速度がＡ
の濃度に正確に比例する場合である。これは、例えば、
アイソトープの壊変において起こるものである。一次反
応に基づく検定は通常、線形標準曲線を形成する。
で、つまり、反応速度が所定の条件のもとで反応成分の
濃度によって影響される態様に依存して、反応次数によ
り分類することができる。一次反応は、１つの反応成分
だけの濃度に直接比例した速度で進行する反応である。
一次反応の最も簡単な例は、反応Ａ→Ｐの反応速度がＡ
の濃度に正確に比例する場合である。これは、例えば、
アイソトープの壊変において起こるものである。一次反
応に基づく検定は通常、線形標準曲線を形成する。
二次反応においては、反応速度は２つの反応成分の濃
度の積または単一の反応成分の濃度の二乗に比例する。
前者の例は、反応Ａ＋Ｂ→Ｐである。後者の例は、反応
2A→Ｐである。二次反応、特に前者のタイプの二次反応
に基づく検定は、通常、非線形標準曲線を形成するであ
ろう。これは、反応速度が１つよりも多い反応成分の濃
度に依存するからである。これは、三次反応、四次反応
などについてもあてはまる。
度の積または単一の反応成分の濃度の二乗に比例する。
前者の例は、反応Ａ＋Ｂ→Ｐである。後者の例は、反応
2A→Ｐである。二次反応、特に前者のタイプの二次反応
に基づく検定は、通常、非線形標準曲線を形成するであ
ろう。これは、反応速度が１つよりも多い反応成分の濃
度に依存するからである。これは、三次反応、四次反応
などについてもあてはまる。
Ａ＋Ｂ→Ｐのような二次反応または、例えば、Ａ＋Ｂ
＋Ｃ→Ｐのような三次反応は、ある状況のもとでは、一
次反応であると考えることができる。例えば、Ｂおよび
／またはＣの濃度が著しく高く、かつ、Ａの濃度が著し
く低い場合には、反応速度はただ１つの反応成分、即
ち、Ａの濃度にほぼ比例するから、反応は一次反応であ
ると考えることができる。この場合には、Ａは速度制限
因子として作用する。これらの特定の条件のもとでは、
反応は、見掛け上のまたは擬似一次反応である。
＋Ｃ→Ｐのような三次反応は、ある状況のもとでは、一
次反応であると考えることができる。例えば、Ｂおよび
／またはＣの濃度が著しく高く、かつ、Ａの濃度が著し
く低い場合には、反応速度はただ１つの反応成分、即
ち、Ａの濃度にほぼ比例するから、反応は一次反応であ
ると考えることができる。この場合には、Ａは速度制限
因子として作用する。これらの特定の条件のもとでは、
反応は、見掛け上のまたは擬似一次反応である。
サンドイッチ免疫検定は、一般には、 Ｏ−Ab1＋Ag＋Ab2 ＊→Ｏ−Ab1−Ag−Ab2 ＊ なる式によって表わされる三次反応と見なすことがで
き、上記式において、O-Ab1は不溶化抗体であり、Agは
今検定しようとする抗原であり、Ab2 ＊はサンドイッチ
を完成する標識抗体である。問題の抗原が著しく低い濃
度であるサンドイッチ免疫検定の場合には、抗原は当然
にして、反応全体において速度制限因子として作用す
る。かくして、この限定された適用おいては、免疫反応
は擬似一次反応となり、反応速度は測定しようとする抗
原の濃度にほぼ比例する。これにより、線形標準曲線を
形成することができる。
き、上記式において、O-Ab1は不溶化抗体であり、Agは
今検定しようとする抗原であり、Ab2 ＊はサンドイッチ
を完成する標識抗体である。問題の抗原が著しく低い濃
度であるサンドイッチ免疫検定の場合には、抗原は当然
にして、反応全体において速度制限因子として作用す
る。かくして、この限定された適用おいては、免疫反応
は擬似一次反応となり、反応速度は測定しようとする抗
原の濃度にほぼ比例する。これにより、線形標準曲線を
形成することができる。
より広い適用を考えると、問題の抗原が免疫反応全体
において速度制限因子として当然に作用するのに充分に
低い量で存在しない場合には、非線形標準曲線が得られ
るであろう。幾つかの理由により、この種のサンドイッ
チ免疫検定において線形標準曲線を得ることがやはり所
望される。特に、線形標準曲線は、一点検定（single p
oint calibration）を行なうことができ、これにより、
作業者に便宜を図ることができるとともに免疫検定を実
施する場合のコストの低減をもたらすことができる。一
点検定のために、一点標準（single standard）がブラ
ンクと一緒に実行される。その標準が一点を生じ、一
方、そのブランク値は標準曲線のｙ切片を規定する。標
準曲線は直線であるので、２つの点だけが、曲線を規定
するのに必要となる。ただ１つの変換因子をこの曲線か
ら算出することができる。
において速度制限因子として当然に作用するのに充分に
低い量で存在しない場合には、非線形標準曲線が得られ
るであろう。幾つかの理由により、この種のサンドイッ
チ免疫検定において線形標準曲線を得ることがやはり所
望される。特に、線形標準曲線は、一点検定（single p
oint calibration）を行なうことができ、これにより、
作業者に便宜を図ることができるとともに免疫検定を実
施する場合のコストの低減をもたらすことができる。一
点検定のために、一点標準（single standard）がブラ
ンクと一緒に実行される。その標準が一点を生じ、一
方、そのブランク値は標準曲線のｙ切片を規定する。標
準曲線は直線であるので、２つの点だけが、曲線を規定
するのに必要となる。ただ１つの変換因子をこの曲線か
ら算出することができる。
非線形標準曲線の場合には、曲線をプロットするため
に５つの標準の平均値を通常は求められなければならな
い。これは、実施される免疫検定の各バッチごとに新た
な標準曲線をつくる場合には著しく費用のかかるものと
なる。さらにまた、線形標準曲線は、非線形標準曲線よ
りもより正確な結果を与える。これは、その非線形標準
曲線にあてはめる場合に固有な、ある大きさの誤差があ
るからである。
に５つの標準の平均値を通常は求められなければならな
い。これは、実施される免疫検定の各バッチごとに新た
な標準曲線をつくる場合には著しく費用のかかるものと
なる。さらにまた、線形標準曲線は、非線形標準曲線よ
りもより正確な結果を与える。これは、その非線形標準
曲線にあてはめる場合に固有な、ある大きさの誤差があ
るからである。
これらの理由から、代表的な検定条件のもとで擬似一
次反応を行なわせるのに十分に低い量では存在しない抗
原を測定するように考えられた、サンドイッチ免疫検定
における線形標準曲線を得るために、種々の試みがなさ
れてきた。
次反応を行なわせるのに十分に低い量では存在しない抗
原を測定するように考えられた、サンドイッチ免疫検定
における線形標準曲線を得るために、種々の試みがなさ
れてきた。
かかる問題に対するもっとも普遍的な解決法の１つ
は、サンドイッチ免疫検定系において存在する２つの因
子、即ち、（１）不溶化第１抗体の量および／または
（２）標識第２抗体の量を調整するものであった。特
に、免疫検定系における不溶化された第１の抗体の量お
よび／または標識第２抗体の量は、この方法により、増
加する、抗体の濃度を増大させることにより、抗原は、
系において速度制限因子となり、擬似一次反応が行なわ
れる。しかしながら、これらのパラメータの調整は、実
際の適用においては制限される。
は、サンドイッチ免疫検定系において存在する２つの因
子、即ち、（１）不溶化第１抗体の量および／または
（２）標識第２抗体の量を調整するものであった。特
に、免疫検定系における不溶化された第１の抗体の量お
よび／または標識第２抗体の量は、この方法により、増
加する、抗体の濃度を増大させることにより、抗原は、
系において速度制限因子となり、擬似一次反応が行なわ
れる。しかしながら、これらのパラメータの調整は、実
際の適用においては制限される。
第１のパラメータは、免疫検定系に対して過剰の不溶
化第１抗体を添加することに関する。しかしながら、不
溶化することができる抗体の量は、系における固体支持
体の量、しばしばビーズの表面の大きさによって、か
つ、使用されるコーティング法によって必然的に制限さ
れる。即ち、所定の固体支持体の面に有効に結合される
抗体の量に対する有限限界がある。
化第１抗体を添加することに関する。しかしながら、不
溶化することができる抗体の量は、系における固体支持
体の量、しばしばビーズの表面の大きさによって、か
つ、使用されるコーティング法によって必然的に制限さ
れる。即ち、所定の固体支持体の面に有効に結合される
抗体の量に対する有限限界がある。
先行技術のもとで調整のために利用される第２のパラ
メータは、過剰の標識抗体の添加である。このパラメー
タもまた、系に添加される標準抗体が標準的なサンドイ
ッチ免疫検定のバックグラウンドのレベルを本来的に増
大させるということによって制限される。系のバックグ
ラウンドは、試薬だけを含み、測定すべき物質をいずれ
も含まないブランクを系において実施するときに得られ
る測定により決定される。免疫検定系においては、ブラ
ンクは抗原を含まず、かくして、サンドイッチ免疫検定
における不溶化抗体：抗原：標準抗体のサンドイッチ複
合体の形成の可能性を排除する。
メータは、過剰の標識抗体の添加である。このパラメー
タもまた、系に添加される標準抗体が標準的なサンドイ
ッチ免疫検定のバックグラウンドのレベルを本来的に増
大させるということによって制限される。系のバックグ
ラウンドは、試薬だけを含み、測定すべき物質をいずれ
も含まないブランクを系において実施するときに得られ
る測定により決定される。免疫検定系においては、ブラ
ンクは抗原を含まず、かくして、サンドイッチ免疫検定
における不溶化抗体：抗原：標準抗体のサンドイッチ複
合体の形成の可能性を排除する。
理想的なサンドイッチ免疫検定系においては、ブラン
クが実施されるときには、抗体：抗原：抗体サンドイッ
チが存在しないことにより、固相に付着する標準抗体は
存在すべきでない。かくして、理論的には、不溶化支持
体における標識の存在を検出することはできない。それ
にも拘らず、免疫検定が不完全な状態において行なわれ
るときには、ある量の標準抗体が免疫検定の際に直接固
体支持体に非特異的に吸収される。この非特異的吸収
は、ブランクの読みの上昇、即ち、測定しようとするサ
ンドイッチの形成には関連しない不溶性支持体上の検出
可能な標準の発生の一因となる。追加して標識抗体を系
に加える場合には、更に非特異的な吸収があり、かくし
て、バックグラウンドのレベルは一層高くなる。増加し
たバックグラウンドのレベルは、免疫検定の感度に悪影
響を及ぼす。従って、先行技術における過剰の標識抗体
の添加は、免疫系が感度のロスを受けることなく許容す
ることができるバックグラウンドの増大量によって制限
される。
クが実施されるときには、抗体：抗原：抗体サンドイッ
チが存在しないことにより、固相に付着する標準抗体は
存在すべきでない。かくして、理論的には、不溶化支持
体における標識の存在を検出することはできない。それ
にも拘らず、免疫検定が不完全な状態において行なわれ
るときには、ある量の標準抗体が免疫検定の際に直接固
体支持体に非特異的に吸収される。この非特異的吸収
は、ブランクの読みの上昇、即ち、測定しようとするサ
ンドイッチの形成には関連しない不溶性支持体上の検出
可能な標準の発生の一因となる。追加して標識抗体を系
に加える場合には、更に非特異的な吸収があり、かくし
て、バックグラウンドのレベルは一層高くなる。増加し
たバックグラウンドのレベルは、免疫検定の感度に悪影
響を及ぼす。従って、先行技術における過剰の標識抗体
の添加は、免疫系が感度のロスを受けることなく許容す
ることができるバックグラウンドの増大量によって制限
される。
とられてきた更に別の方法は、目視的に線形の曲線を
得るために標準曲線の数学的手法を取扱うものである。
これは、系における抗体のレベルを実際の線形標準曲線
を得るためにおいて調整する、上記した第１の先行技術
の方法とは対照をなすものである。ロジット変換（logi
t transformation）として知られる技術が、この第２の
方法の基礎をなす。最も簡単に述べると、ロジット変換
により、吸収と抗原の量との間の関係を片対数的にプロ
ットすることができる。このようなプロットにおいて
は、スカンジナビアン・ジャーナル・オブ・クリニカル
・アンド・ラボラトリー・インベスティゲイション（Sc
and.J.Clin.Lab.Invest.）第42巻、第577-589頁（1982
年）においてソレンソン（Sorenson）が説明しているよ
うに、吸収と抗原の濃度との間の関係は限られた分析範
囲において一次関数に近くなる。
得るために標準曲線の数学的手法を取扱うものである。
これは、系における抗体のレベルを実際の線形標準曲線
を得るためにおいて調整する、上記した第１の先行技術
の方法とは対照をなすものである。ロジット変換（logi
t transformation）として知られる技術が、この第２の
方法の基礎をなす。最も簡単に述べると、ロジット変換
により、吸収と抗原の量との間の関係を片対数的にプロ
ットすることができる。このようなプロットにおいて
は、スカンジナビアン・ジャーナル・オブ・クリニカル
・アンド・ラボラトリー・インベスティゲイション（Sc
and.J.Clin.Lab.Invest.）第42巻、第577-589頁（1982
年）においてソレンソン（Sorenson）が説明しているよ
うに、吸収と抗原の濃度との間の関係は限られた分析範
囲において一次関数に近くなる。
ロジット変換による線形化（linearization）は、ジ
ャーナル・オブ・イミュノロジカル・メソッズ（J.Immu
nological Methods）第85巻、第179-294頁（1985年）に
おいてウィリアムズ（Williams）等によって詳細に説明
されている。一般的には、これらの方法は、非線形標準
曲線によって表わされる式に対する最小二乗解を得るの
に、比較的複雑なコンピュータを必要とする。変換され
た曲線の線形近似をこの方法に基づいて得ることがで
き、かつ、変換因子をこのデータから算出することがで
きるが、単一標準ではなく完全な標準曲線を得る必要が
残っている。
ャーナル・オブ・イミュノロジカル・メソッズ（J.Immu
nological Methods）第85巻、第179-294頁（1985年）に
おいてウィリアムズ（Williams）等によって詳細に説明
されている。一般的には、これらの方法は、非線形標準
曲線によって表わされる式に対する最小二乗解を得るの
に、比較的複雑なコンピュータを必要とする。変換され
た曲線の線形近似をこの方法に基づいて得ることがで
き、かつ、変換因子をこのデータから算出することがで
きるが、単一標準ではなく完全な標準曲線を得る必要が
残っている。
さらに最近になって、ヅバイグヅネ（Zvaigzne）等
は、クリニカル・ケミストリー（Clin.Chem.）第32
（３）巻、第437-440頁（1986年）において、非線形標
準曲線がコンピュータに記憶される手法を開発した。ヅ
バイグヅネ等は、後の検定に際して変換された非線形標
準曲線のｙ切片を新しくするために、単一標準を実行す
る。この点に関して、ヅバイグヅネ等は、彼らの方法に
おいて一点検定の形態をとっている。しかしながら、こ
の方法は、著しく安定な試薬系に有効に作用するに過ぎ
ない。更に、この方法は、比較的複雑なコンピュータ化
された装置を必要とするとともに、曲線あてはめ処理に
固有の、ある量の誤差を完全には無くすことができな
い。
は、クリニカル・ケミストリー（Clin.Chem.）第32
（３）巻、第437-440頁（1986年）において、非線形標
準曲線がコンピュータに記憶される手法を開発した。ヅ
バイグヅネ等は、後の検定に際して変換された非線形標
準曲線のｙ切片を新しくするために、単一標準を実行す
る。この点に関して、ヅバイグヅネ等は、彼らの方法に
おいて一点検定の形態をとっている。しかしながら、こ
の方法は、著しく安定な試薬系に有効に作用するに過ぎ
ない。更に、この方法は、比較的複雑なコンピュータ化
された装置を必要とするとともに、曲線あてはめ処理に
固有の、ある量の誤差を完全には無くすことができな
い。
従って、免疫検定系に対する先行技術の調整によって
は線形標準曲線を得ることができないような、十分な量
で存在する抗原を検出および／または測定するように構
成されたサンドイッチ免疫検定において、実際の線形標
準曲線を提供することができる方法が必要とされてい
る。本発明の目的は、このような方法を提供することに
ある。本発明の別の目的は、単一標準だけを実行するこ
とが必要とされ、かつ、複雑につくられおよび／または
高価なコンピュータ化された装置なしに、変換因子を得
るのに単一標準を使用することができる、標準曲線を検
定する方法を提供することにある。
は線形標準曲線を得ることができないような、十分な量
で存在する抗原を検出および／または測定するように構
成されたサンドイッチ免疫検定において、実際の線形標
準曲線を提供することができる方法が必要とされてい
る。本発明の目的は、このような方法を提供することに
ある。本発明の別の目的は、単一標準だけを実行するこ
とが必要とされ、かつ、複雑につくられおよび／または
高価なコンピュータ化された装置なしに、変換因子を得
るのに単一標準を使用することができる、標準曲線を検
定する方法を提供することにある。
発明の概要 本発明によれば、固体支持体に結合されていない過剰
の第１の抗体および／または過剰の未標識未結合第２抗
体が実質的に線形の標準曲線を得るような擬似一次反応
を起こすのに十分な量として、免疫検定系に加えられ
る。ここで十分な量とは、第１の未結合未標識抗体、第
２の未結合未標識抗体が過剰量であることを意味する。
再び、第１の抗体および第２の抗体という語は、明確化
と簡素化のために使用されているものであって、本発明
を限定するものではない。第１の未結合未標識抗体は、
不溶性支持体に結合される第１の抗体の類似体として作
用することが必要となる。第１の未結合未標識抗体は、
実際には、不溶化される第１の抗体とは異なる抗体とす
ることができる。同じことが、未結合未標識第２抗体に
ついてもあてはなる。即ち、未結合未標識第２抗体が類
似体として作用する第２の標識抗体とは異なる抗体とす
ることができる。
の第１の抗体および／または過剰の未標識未結合第２抗
体が実質的に線形の標準曲線を得るような擬似一次反応
を起こすのに十分な量として、免疫検定系に加えられ
る。ここで十分な量とは、第１の未結合未標識抗体、第
２の未結合未標識抗体が過剰量であることを意味する。
再び、第１の抗体および第２の抗体という語は、明確化
と簡素化のために使用されているものであって、本発明
を限定するものではない。第１の未結合未標識抗体は、
不溶性支持体に結合される第１の抗体の類似体として作
用することが必要となる。第１の未結合未標識抗体は、
実際には、不溶化される第１の抗体とは異なる抗体とす
ることができる。同じことが、未結合未標識第２抗体に
ついてもあてはなる。即ち、未結合未標識第２抗体が類
似体として作用する第２の標識抗体とは異なる抗体とす
ることができる。
不溶性支持体に結合していない第１の抗体の添加は、
不溶性支持体の利用することができる表面積によっては
限定されない。未標識未結合第２抗体の添加は、免疫検
定のバックグラウンドを増加させないであろう。しかし
ながら、これらの類似体の一方または双方の添加は、擬
似一次反応を行なわせることができ、かくして、線形標
準曲線を得ることができる。先行技術の方法をしのぐ本
発明の利点は、添付図面と、本発明の以下の詳細な説明
を考慮した後に明らかになるであろう。
不溶性支持体の利用することができる表面積によっては
限定されない。未標識未結合第２抗体の添加は、免疫検
定のバックグラウンドを増加させないであろう。しかし
ながら、これらの類似体の一方または双方の添加は、擬
似一次反応を行なわせることができ、かくして、線形標
準曲線を得ることができる。先行技術の方法をしのぐ本
発明の利点は、添付図面と、本発明の以下の詳細な説明
を考慮した後に明らかになるであろう。
図面の簡単な説明 第１図は、先行技術の調整だけが系に対してなされる
代表的な免疫検定条件において、一般に微量存在するhC
G（ヒト絨毛性性腺刺激ホルモン）の免疫検定において
得られる線形標準曲線を示すグラフである。
代表的な免疫検定条件において、一般に微量存在するhC
G（ヒト絨毛性性腺刺激ホルモン）の免疫検定において
得られる線形標準曲線を示すグラフである。
第２図は、代表的な先行技術の免疫条件によるフェリ
チンの免疫検定において得られる非線形標準曲線および
本発明の教示に従って得られる線形標準曲線を示すグラ
フである。
チンの免疫検定において得られる非線形標準曲線および
本発明の教示に従って得られる線形標準曲線を示すグラ
フである。
第３図は、代表的な先行技術の免疫条件による、IgE
（免疫グロブリンＥ）の免疫検定において得られる非線
形標準曲線および本発明の教示に従って得られる線形標
準曲線を示すグラフである。
（免疫グロブリンＥ）の免疫検定において得られる非線
形標準曲線および本発明の教示に従って得られる線形標
準曲線を示すグラフである。
発明の詳細な説明 本発明によれば、固体支持体に結合されていない過剰
の第１の抗体および／または過剰の未標識未結合第２抗
体がサンドイッチ免疫検定系に加えられる。驚いたこと
に、これらの抗体の一方または双方の添加は、免疫検定
系を調整するために利用しうるパラメータを増加させる
ことがわかった。これにより、先行技術の方法によって
は実際に線形の標準曲線を通常は得ることができないよ
うな十分に高い量で検定したい抗原が存在する場合に、
実際に線形の標準曲線を得ることができる。
の第１の抗体および／または過剰の未標識未結合第２抗
体がサンドイッチ免疫検定系に加えられる。驚いたこと
に、これらの抗体の一方または双方の添加は、免疫検定
系を調整するために利用しうるパラメータを増加させる
ことがわかった。これにより、先行技術の方法によって
は実際に線形の標準曲線を通常は得ることができないよ
うな十分に高い量で検定したい抗原が存在する場合に、
実際に線形の標準曲線を得ることができる。
本発明は、擬似一次反応と、それにより、線形標準曲
線とを得るための、サンドイッチ免疫検定において、調
整のために利用することができる２つの追加のパラメー
タを提供する。本発明によれば、２つの追加のパラメー
タは、追加の反応成分または類似体の形態をとり、これ
らは、過剰の抗原を目的の最終生成物からそらすため
に、サンドイッチ免疫検定系に加えられる。この転換
は、サンドイッチ免疫検定において通常形成される副生
成物に対する追加の副生成物の形成を介して行なわれ
る。
線とを得るための、サンドイッチ免疫検定において、調
整のために利用することができる２つの追加のパラメー
タを提供する。本発明によれば、２つの追加のパラメー
タは、追加の反応成分または類似体の形態をとり、これ
らは、過剰の抗原を目的の最終生成物からそらすため
に、サンドイッチ免疫検定系に加えられる。この転換
は、サンドイッチ免疫検定において通常形成される副生
成物に対する追加の副生成物の形成を介して行なわれ
る。
先行技術のサンドイッチ免疫検定は、通常、O-Ab1‐A
g-Ab2 ＊目的化合物を形成する目的の反応に対して、少
量の次の副生成物を生ずるのみである。
g-Ab2 ＊目的化合物を形成する目的の反応に対して、少
量の次の副生成物を生ずるのみである。
I.O-Ab1‐Ag（不完全サンドイッチ） II.Ag-Ab2 ＊（不完全サンドイッチ） 標識副生成物Ag-Ab2 ＊（II）は、可溶性であり、サンプ
ルに存在する抗原の量に対し通常相関関係のある結合標
識の量には寄与しない。溶液に残留している未結合標識
の量が試験サンプルに存在する抗原の量を示すものとし
て検出される非通常的な場合には、標識副生成物（II）
は、シグナルにわずかに寄与する。
ルに存在する抗原の量に対し通常相関関係のある結合標
識の量には寄与しない。溶液に残留している未結合標識
の量が試験サンプルに存在する抗原の量を示すものとし
て検出される非通常的な場合には、標識副生成物（II）
は、シグナルにわずかに寄与する。
未結合第１抗体だけが免疫検定系に加えられる場合に
は、本発明の教示に従って次の副生成物が、副生成物Ｉ
およびIIのほかに形成される。
は、本発明の教示に従って次の副生成物が、副生成物Ｉ
およびIIのほかに形成される。
III.Ab1‐Ag-Ab2 ＊（未結合標識サンドイッチ） IV.Ab1‐Ag（不完全サンドイッチ） 未結合未標識第２抗体だけが免疫検定系に加えられる
場合には、異なる副生成物が、副生成物ＩおよびII以外
に形成される、即ち、 V.O-Ab1‐Ag-Ab2（結合未標識サンドイッチ） VI.Ag-Ab2（不完全サンドイッチ） 本発明の教示に従って、未結合第１抗体と遊離の未標識
第２抗体の双方が免疫検定系に加えられる場合には、副
生成物Ｉ乃至VIの全てが、次の別の副生成物とともに形
成される。
場合には、異なる副生成物が、副生成物ＩおよびII以外
に形成される、即ち、 V.O-Ab1‐Ag-Ab2（結合未標識サンドイッチ） VI.Ag-Ab2（不完全サンドイッチ） 本発明の教示に従って、未結合第１抗体と遊離の未標識
第２抗体の双方が免疫検定系に加えられる場合には、副
生成物Ｉ乃至VIの全てが、次の別の副生成物とともに形
成される。
VII.Ab1‐Ag-Ag2 副生成物III-VIIの場合には、本発明に従って得られる
追加の標識副生成物Ab1‐Ag-Ab2 ＊（III）だけが、可溶
性であり、可溶性支持体上に検出されるシグナルの量に
は寄与しない。
追加の標識副生成物Ab1‐Ag-Ab2 ＊（III）だけが、可溶
性であり、可溶性支持体上に検出されるシグナルの量に
は寄与しない。
副生成物は、これまでは免疫検定においては望ましく
ないものと考えられていた。これは、反応副生成物が問
題の抗原を少量消費し、検出しおよび／または定量しよ
うとする所望の最終生成物を表わすことにはならないか
らである。不溶性支持体に結合される標識の量が通常の
場合のように、検定しているサンプルに存在する抗原の
量を示すものとして検出される場合には、いずれの副生
成物も、測定しているシグナルには寄与しない。このよ
うにして、反応副生成物の形成の増大は、従来は免疫検
定の完全性を減じるものと見なされていた。
ないものと考えられていた。これは、反応副生成物が問
題の抗原を少量消費し、検出しおよび／または定量しよ
うとする所望の最終生成物を表わすことにはならないか
らである。不溶性支持体に結合される標識の量が通常の
場合のように、検定しているサンプルに存在する抗原の
量を示すものとして検出される場合には、いずれの副生
成物も、測定しているシグナルには寄与しない。このよ
うにして、反応副生成物の形成の増大は、従来は免疫検
定の完全性を減じるものと見なされていた。
しかしながら、意外にも、本発明により形成される追
加の副生成物は、免疫検定の精度に悪影響を及ぼさない
ことがわかった。これは、副生成物の形成の速度が、試
験サンプルに存在する抗原の量に対し一定の関係を有す
るからであると考えられる。換言すれば、抗原の濃度が
増加すると、副生成物の形成が多くなり、かかる増加が
直線的な方式で起こることがわかった。
加の副生成物は、免疫検定の精度に悪影響を及ぼさない
ことがわかった。これは、副生成物の形成の速度が、試
験サンプルに存在する抗原の量に対し一定の関係を有す
るからであると考えられる。換言すれば、抗原の濃度が
増加すると、副生成物の形成が多くなり、かかる増加が
直線的な方式で起こることがわかった。
更に、本発明の未結合第１抗体は、代表的なサンドイ
ッチ免疫検定において固体の支持体に結合される第１の
抗体の類似体として作用することがわかった。同様に、
本発明の未標識第２抗体は、サンドイッチ免疫検定にお
いて第２の標識抗体の類似体として作用する。これらの
類似体は、個々にまたは一緒になって、検定しようとす
る抗原の量に対する免疫検定における第１の抗体および
／または第２の抗体の濃度を有効に高め、こうして、擬
似一次反応を起こす。この原則に基づいて、典型的に
は、抗原濃度が、実際に線形の標準曲線を得るためには
先行技術の方法が効果的ではないまたは不十分であるこ
とを明白となったような十分に高い場合に、実際に線形
の曲線が免疫検定において得られた。
ッチ免疫検定において固体の支持体に結合される第１の
抗体の類似体として作用することがわかった。同様に、
本発明の未標識第２抗体は、サンドイッチ免疫検定にお
いて第２の標識抗体の類似体として作用する。これらの
類似体は、個々にまたは一緒になって、検定しようとす
る抗原の量に対する免疫検定における第１の抗体および
／または第２の抗体の濃度を有効に高め、こうして、擬
似一次反応を起こす。この原則に基づいて、典型的に
は、抗原濃度が、実際に線形の標準曲線を得るためには
先行技術の方法が効果的ではないまたは不十分であるこ
とを明白となったような十分に高い場合に、実際に線形
の曲線が免疫検定において得られた。
サンドイッチ免疫検定において実際に線形の曲線を得
るための先行技術の方法に対する本発明の利点は、以下
の実施例により明らかとなる。簡素化と明確化のため
に、以下の実施例は、未結合第１抗体の添加を利用した
本発明の観点を単に示すものであり、未標識未結合第２
抗体の添加は同様な態様で作用するものである。
るための先行技術の方法に対する本発明の利点は、以下
の実施例により明らかとなる。簡素化と明確化のため
に、以下の実施例は、未結合第１抗体の添加を利用した
本発明の観点を単に示すものであり、未標識未結合第２
抗体の添加は同様な態様で作用するものである。
これらの実施例において、同時サンドイッチ免疫検定
は、ポリスチレンビーズに被覆した第１の抗体と、酵素
標識として作用する西洋わさびペルオキシダーゼ（HRP
O）と複合した第２の抗体とを使用して行なった。ポリ
スチレンビーズには、特定の免疫検定のために指定され
た第１の抗体を、最大限まで被覆した。標識第２抗体の
量は、HRPO酵素活性に従って定量したが、HRPOの一単位
は、標識抗体のｌμｇと略同等である。抗体：抗原：抗
体複合体を形成する第１のインキュベーションの後に、
不溶化された複合体を単離し、検出可能なシグナルを得
るために酵素標識の基質溶液が加えられる第２のインキ
ュベーションを行なった。不溶性支持体に結合されたシ
グナルの量を次に定量した。
は、ポリスチレンビーズに被覆した第１の抗体と、酵素
標識として作用する西洋わさびペルオキシダーゼ（HRP
O）と複合した第２の抗体とを使用して行なった。ポリ
スチレンビーズには、特定の免疫検定のために指定され
た第１の抗体を、最大限まで被覆した。標識第２抗体の
量は、HRPO酵素活性に従って定量したが、HRPOの一単位
は、標識抗体のｌμｇと略同等である。抗体：抗原：抗
体複合体を形成する第１のインキュベーションの後に、
不溶化された複合体を単離し、検出可能なシグナルを得
るために酵素標識の基質溶液が加えられる第２のインキ
ュベーションを行なった。不溶性支持体に結合されたシ
グナルの量を次に定量した。
実施例１ 試薬 １）ビーズ：Ab1を被覆したポリスチレンビーズ ２）複合溶液：緩衝剤、動物蛋白質およびAb2‐HRPO ３）基質溶液：緩衝剤、H2O2、およびｏ−フェニレンジ
アミン（OPD） 方法： 複合溶液は、0.5UのAb2‐HRPOを含む。検定は、試料2
0μｌを250μｌの複合溶液とAb1−被覆ビーズを用い、2
0分間室温で振とうしながらインキュベーションするこ
とにより行なう。第１のインキュベーションの後、ビー
ズを洗浄し、300μｌの基質溶液を用い20分間室温で再
度インキュベーションを行なう。次に、反応を、0.9N硫
酸1.0mlを用いて停止し、分光光度計で492nmの吸光度を
測定した。第Ｉ表は結果の概要を示すもので、結果は第
１図にも示されている。
アミン（OPD） 方法： 複合溶液は、0.5UのAb2‐HRPOを含む。検定は、試料2
0μｌを250μｌの複合溶液とAb1−被覆ビーズを用い、2
0分間室温で振とうしながらインキュベーションするこ
とにより行なう。第１のインキュベーションの後、ビー
ズを洗浄し、300μｌの基質溶液を用い20分間室温で再
度インキュベーションを行なう。次に、反応を、0.9N硫
酸1.0mlを用いて停止し、分光光度計で492nmの吸光度を
測定した。第Ｉ表は結果の概要を示すもので、結果は第
１図にも示されている。
この実施例は、典型的な検定条件でのhCG（ヒト絨毛
性性腺刺激ホルモン）のサンドイッチ免疫検定を示す。
hCG抗原は通常、比較的微量で存在するので、著しく高
感度の検定方法を必要とする。試験サンプルにおけるhC
Gの測定範囲は、約１ないし100mIU/ml即ち約2x10-12M〜
2x10-10Mである。反応混合物自体においては、hCGの実
際の濃度は、10-11よりも小さい。この濃度は、Ab2 ＊濃
度を高める先行技術の方法が擬似一次反応速度の条件、
かくして、線形標準曲線を得るのに有効であるように十
分に低いものである。
性性腺刺激ホルモン）のサンドイッチ免疫検定を示す。
hCG抗原は通常、比較的微量で存在するので、著しく高
感度の検定方法を必要とする。試験サンプルにおけるhC
Gの測定範囲は、約１ないし100mIU/ml即ち約2x10-12M〜
2x10-10Mである。反応混合物自体においては、hCGの実
際の濃度は、10-11よりも小さい。この濃度は、Ab2 ＊濃
度を高める先行技術の方法が擬似一次反応速度の条件、
かくして、線形標準曲線を得るのに有効であるように十
分に低いものである。
実施例２ 試薬 １）ビーズ：Ab1で被覆したポリスチレンビーズ ２）複合溶液：緩衝剤、動物蛋白質およびAb2‐HRPO ３）基質溶液：緩衝剤、H2O2、およびｏ−フェニレンジ
アミン（OPD） 手順： 検定は、試料25μｌを300μｌの複合溶液とAb1−被覆
ビーズを用い、45分間室温で振とうしながらインキュベ
ーションすることにより行ない、ヒーズの洗浄後、第２
のインキュベーションを基質溶液を用いて行なった。次
に、反応を、0.9N硫酸1.0mlの添加をもって停止し、吸
光度を分光光度計で492nmにおいて測定した。第II表は
結果の概要を示すもので、結果は第２図にも示されてい
る。
アミン（OPD） 手順： 検定は、試料25μｌを300μｌの複合溶液とAb1−被覆
ビーズを用い、45分間室温で振とうしながらインキュベ
ーションすることにより行ない、ヒーズの洗浄後、第２
のインキュベーションを基質溶液を用いて行なった。次
に、反応を、0.9N硫酸1.0mlの添加をもって停止し、吸
光度を分光光度計で492nmにおいて測定した。第II表は
結果の概要を示すもので、結果は第２図にも示されてい
る。
この実施例は、実際に線形の標準曲線を最終的に得る
ために、典型的な検定条件（Ａ）のもとで、系に対する
先行技術の調整（Ｂ）を利用して、かつ、最後に本発明
の教示（Ｃ）を利用して実施されたフェリチンに関する
サンドイッチ免疫検定を示す。フェリチンの場合には、
平均的な血清サンプルにおけるフェリチンの５〜500ng/
mlの検定範囲は、約1x10-10M〜1x10-9Mの濃度範囲に相
当する。反応混合物におけるフェリチンの最終濃度は、
約10-10Mである。第２図に示すように、ポリスチレンビ
ードに対するAb1の最大の装置以外に系に対する調整を
行なわないと、標準曲線は、検定範囲の上昇端部で60％
だけ線形である。50倍過剰のAb2 ＊を添加したところ、
標準曲線の線形性は、わずか80％まで改善された。
ために、典型的な検定条件（Ａ）のもとで、系に対する
先行技術の調整（Ｂ）を利用して、かつ、最後に本発明
の教示（Ｃ）を利用して実施されたフェリチンに関する
サンドイッチ免疫検定を示す。フェリチンの場合には、
平均的な血清サンプルにおけるフェリチンの５〜500ng/
mlの検定範囲は、約1x10-10M〜1x10-9Mの濃度範囲に相
当する。反応混合物におけるフェリチンの最終濃度は、
約10-10Mである。第２図に示すように、ポリスチレンビ
ードに対するAb1の最大の装置以外に系に対する調整を
行なわないと、標準曲線は、検定範囲の上昇端部で60％
だけ線形である。50倍過剰のAb2 ＊を添加したところ、
標準曲線の線形性は、わずか80％まで改善された。
未結合または可溶性Ab1を、O-Ab1として作用するよう
に反応混合物に導入した。可溶性Ab1の添加は、上記し
た副生成物IIIとIVを以下のようにして形成するものと
考えられる。
に反応混合物に導入した。可溶性Ab1の添加は、上記し
た副生成物IIIとIVを以下のようにして形成するものと
考えられる。
Ab1＋Ag＋Ab2 ＊→Ab1‐Ag-Ab2 ＊ （III） Ab1＋Ag→Ag1‐Ag （IV） 可溶性Ab1の添加により、O-Ab1‐Ag-Ab2 ＊の形成速度
が低下するとともに、第２図において曲線Ｃで示すよう
に、より低いシグナルが生じた。それにも拘らず、Ab1
‐Ｏ以外にAb1が存在することは、擬似一次反応と線形
曲線を形成させるように作用した。シグナルは２回目の
インキュベーション時間を10分（Ｄ）に延ばすことによ
り改善された。
が低下するとともに、第２図において曲線Ｃで示すよう
に、より低いシグナルが生じた。それにも拘らず、Ab1
‐Ｏ以外にAb1が存在することは、擬似一次反応と線形
曲線を形成させるように作用した。シグナルは２回目の
インキュベーション時間を10分（Ｄ）に延ばすことによ
り改善された。
実施例３ 試薬 １）ビーズ：Ab1で被覆したポリスチレンビーズ ２）複合溶液：緩衝剤、動物蛋白質およびAb2‐HRPO ３）基質溶液：緩衝剤、H2O2、およびｏ−フェニレンジ
アミン（OPD） 方法： 実験は、試料20μｌを300μｌの複合溶液とAb1−被覆
ビーズを用い、室温で30分間振とうしながら20mlのサン
プルをインキュベーションすることにより行なった。次
に、ビーズを洗浄し、300μｌの基質溶液を用いてイン
キュベーションを再度行い、0.9N硫酸1.0mlで停止し、4
92nmで読んだ。第III表は、先行技術の教示と本発明の
教示との組み合わせによる修正を行なって得たIgE試薬
の性能とかかる修正を行なわずに得た性能との比較を示
す。
アミン（OPD） 方法： 実験は、試料20μｌを300μｌの複合溶液とAb1−被覆
ビーズを用い、室温で30分間振とうしながら20mlのサン
プルをインキュベーションすることにより行なった。次
に、ビーズを洗浄し、300μｌの基質溶液を用いてイン
キュベーションを再度行い、0.9N硫酸1.0mlで停止し、4
92nmで読んだ。第III表は、先行技術の教示と本発明の
教示との組み合わせによる修正を行なって得たIgE試薬
の性能とかかる修正を行なわずに得た性能との比較を示
す。
この実施例は、実際に線形の標準曲線を得るために、
典型的な検定条件（Ａ）のもとで、かつ、系に対する先
行技術の調整と本発明の教示（Ｂ）とを利用して実施さ
れたIgE（免疫グロブリンＥ）に関するサンドイッチ免
疫検定を示す。
典型的な検定条件（Ａ）のもとで、かつ、系に対する先
行技術の調整と本発明の教示（Ｂ）とを利用して実施さ
れたIgE（免疫グロブリンＥ）に関するサンドイッチ免
疫検定を示す。
試験サンプルにおける約５〜400IU/mlの検定範囲にお
いては、IgEの最終濃度は、10-10M〜10-9Mである。免疫
検定系のパラメータの適当な調整を行なわないと、標準
曲線は、線形性が検定範囲の上昇端部において50％より
も小さかった。線形曲線を得るために、むしろ多量のAb
2 ＊と可溶性Ab1を添加した（第３図）。この実験は、本
発明が、IgEのような極端な例を何らの困難なしに、取
扱うことができることを示すものである。
いては、IgEの最終濃度は、10-10M〜10-9Mである。免疫
検定系のパラメータの適当な調整を行なわないと、標準
曲線は、線形性が検定範囲の上昇端部において50％より
も小さかった。線形曲線を得るために、むしろ多量のAb
2 ＊と可溶性Ab1を添加した（第３図）。この実験は、本
発明が、IgEのような極端な例を何らの困難なしに、取
扱うことができることを示すものである。
第１図、第２図および第３図に示すプロットを比較す
ると、本発明の有効性がわかる。意外にも、本発明の教
示を利用すると、先行技術の制限を越えることができ、
かくして、関連の抗原の濃度が比較的高い場合の免疫検
定において、実際に線形の標準曲線を得ることができる
ことがわかった。
ると、本発明の有効性がわかる。意外にも、本発明の教
示を利用すると、先行技術の制限を越えることができ、
かくして、関連の抗原の濃度が比較的高い場合の免疫検
定において、実際に線形の標準曲線を得ることができる
ことがわかった。
例えば、約10-11Mよりも低い濃度で反応混合物中に通
常存在する抗原hCGは、先行技術の方法による処理に有
効に役立つ。これに対し、フェリチンおよびIgEは、そ
れぞれ約10-10Mおよび約10-10〜10-9Mの濃度で免疫検定
反応混合物に通常存在する。これらの濃度は、hCG反応
混合物の濃度よりも少なくとも１桁大きく、したがっ
て、先行技術の反応パラメータだけに対する調整によっ
ては有効に処理されない。しかしながら、本発明の教示
を組込むことにより、実際に線形の標準曲線がフェリチ
ンおよびIgE免疫検定で得られた。
常存在する抗原hCGは、先行技術の方法による処理に有
効に役立つ。これに対し、フェリチンおよびIgEは、そ
れぞれ約10-10Mおよび約10-10〜10-9Mの濃度で免疫検定
反応混合物に通常存在する。これらの濃度は、hCG反応
混合物の濃度よりも少なくとも１桁大きく、したがっ
て、先行技術の反応パラメータだけに対する調整によっ
ては有効に処理されない。しかしながら、本発明の教示
を組込むことにより、実際に線形の標準曲線がフェリチ
ンおよびIgE免疫検定で得られた。
上記した実施例は、フェリチンとIgEサンドイッチ免
疫検定における本発明の使用例に過ぎないものである。
これらの実施例に記載の実際の処理の変更が他の免疫検
定において有用であることは、当業者には明らかであろ
う。これらの他の免疫検定の含まれるものは、ホルモ
ン:HLH［ヒト−リューチナイジングホルモン（HumanLeu
tenizingHormon）］、FSH（卵胞刺激ホルモン）、ガス
トリン、PTH（副甲状腺ホルモン）、HGH（ヒト成長ホル
モン）およびACTH（副腎皮質刺激ホルモン）；伝染病：
肝炎；腫瘍マーカー（tumor marker）:CEA（がん胎児性
抗原）、PAP［プロステート酸ホスファターゼ（Prostat
e Acid Phoshpatase）およびアルファ−フェトプロテイ
ン（alpha-fetoprotein）；並びに:CPK-MB（クレアチン
ホスホキナーゼ−MB）およびインシュリンなどの免疫検
定がある。従って、本発明は、添付請求の範囲によって
のみ限定されるものと考えるべきである。
疫検定における本発明の使用例に過ぎないものである。
これらの実施例に記載の実際の処理の変更が他の免疫検
定において有用であることは、当業者には明らかであろ
う。これらの他の免疫検定の含まれるものは、ホルモ
ン:HLH［ヒト−リューチナイジングホルモン（HumanLeu
tenizingHormon）］、FSH（卵胞刺激ホルモン）、ガス
トリン、PTH（副甲状腺ホルモン）、HGH（ヒト成長ホル
モン）およびACTH（副腎皮質刺激ホルモン）；伝染病：
肝炎；腫瘍マーカー（tumor marker）:CEA（がん胎児性
抗原）、PAP［プロステート酸ホスファターゼ（Prostat
e Acid Phoshpatase）およびアルファ−フェトプロテイ
ン（alpha-fetoprotein）；並びに:CPK-MB（クレアチン
ホスホキナーゼ−MB）およびインシュリンなどの免疫検
定がある。従って、本発明は、添付請求の範囲によって
のみ限定されるものと考えるべきである。
本発明書において使用されているように、「抗原」な
る後は、抗体がつくられるいかなる物質を含むものであ
り、従って、抗体を作るために抗原とされてきたハプテ
ンをその範囲に含む。
る後は、抗体がつくられるいかなる物質を含むものであ
り、従って、抗体を作るために抗原とされてきたハプテ
ンをその範囲に含む。
本明細書において使用されているように、［抗体］な
る後は、多クローン性抗体と単クローン性抗体の双方を
含むとともに、完全な抗体および抗体の結合領域を含む
抗体のフラグメントを含むものである。このようなフラ
グメントは、Fc部分のないフラグメントとして定義され
るFabタイプのフラグメント、例えば、Fab、Fab1、およ
びF(ab1)2フラグメントがあり、あるいは完全な抗体に
おけるヘビーチェーン成分を連結するジスルフィド結合
の還元的開裂によって得られる、いわゆる「半分子」フ
ラグメントがある。
る後は、多クローン性抗体と単クローン性抗体の双方を
含むとともに、完全な抗体および抗体の結合領域を含む
抗体のフラグメントを含むものである。このようなフラ
グメントは、Fc部分のないフラグメントとして定義され
るFabタイプのフラグメント、例えば、Fab、Fab1、およ
びF(ab1)2フラグメントがあり、あるいは完全な抗体に
おけるヘビーチェーン成分を連結するジスルフィド結合
の還元的開裂によって得られる、いわゆる「半分子」フ
ラグメントがある。
本発明は、本発明の本質的精神から逸脱することなく
幾つかの形態で実施することができるので、本発明は、
上記説明に対応するものとして添付請求の範囲によって
規定されるものである。
幾つかの形態で実施することができるので、本発明は、
上記説明に対応するものとして添付請求の範囲によって
規定されるものである。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 ルード、フレデリック ウィリアム ジ ュニア アメリカ合衆国 92028 カリフォルニ ア州 フォールブルック ブエオニス ティエンポス 2608 (72)発明者 リー、シー‐ユン アメリカ合衆国 92069 カリフォルニ ア州 サン マルコス マクレラン ス トリート 1311 (56)参考文献 国際公開85／663（ＷＯ，Ａ) 国際公開85／2258（ＷＯ，Ａ) 欧州特許公開101228（ＥＰ，Ａ) Ｍｅｔｈａｄｓ ｏｆ Ｅｒｓｙｍａ ｔｉｃ．Ａｎａｌｙｓｉｓ，１，Ｐ. 233−260，（1983)
Claims (27)
- 【請求項１】抗原と少なくとも２つの抗体との間で複合
体を形成する段階であって、前記抗体の１つは不溶性支
持体に結合された第１の抗体であり、前記抗体の１つは
第２の未結合標識抗体であり、これにより前記標識抗体
の一部が前記複合体を介して不溶性支持体に結合される
段階と、さらに、未標識未結合第１抗体、未標識未結合
第２抗体及びこれらの混合物からなる群より選ばれる追
加の抗体を、実質的に線形の標準曲線を得るような擬似
一次反応を起こすのに十分な量存在するように導入する
段階を有してなる液体サンプルにおける抗原の免疫検定
方法。 - 【請求項２】前記追加の抗体が未標識未結合第１抗体で
ある請求項１に記載の方法。 - 【請求項３】前記追加の抗体が未標識未結合第２抗体で
ある請求項１に記載の方法。 - 【請求項４】標識抗体が放射性同位体、化学発光化合
物、生物発光化合物、蛍光化合物、燐光化合物、酵素、
酵素補因子、ハプテン、抗体、アビジン、ビオチン、炭
水化物、レクチン、金属キレート化剤およびこれらの誘
導体よりなる群から選ばれる１種で標識される請求項
１、２または３に記載の方法。 - 【請求項５】前記標識が酵素である請求項４に記載の方
法。 - 【請求項６】前記酵素が西洋わさびペルオキシダーゼで
ある請求項５に記載の方法。 - 【請求項７】免疫検定反応混合物における抗原の濃度が
約10-11Mより大きい請求項１、２または３に記載の方
法。 - 【請求項８】抗原がプロラクチン、HLH、FSH、ガストリ
ン、PTH、HGH、ACTH、肝炎、フェリチン、CEA、PAP、ア
ルファーフェトプロテイン、IgE、CPK-MBおよびインシ
ュリンよりなる群から選ばれる請求項１、２または３に
記載の方法。 - 【請求項９】抗原がフェリチンおよびIgEよりなる群か
ら選ばれる請求項８に記載の方法。 - 【請求項１０】（ａ）液体サンプルを、不溶性支持体に
結合された第１の抗体、第２の未結合標識抗体、並びに
未標識未結合第１抗体、未標識未結合第２抗体およびこ
れらの混合物よりなる群から選ばれる追加の抗体と接触
させることにより結合第１抗体：抗原：標識第２抗体の
不溶性複合体を形成するとともに、前記追加の抗体が副
生成物を形成するように抗原と複合体を形成して前記不
溶性複合体を得る反応とする段階であって、ここで前記
追加の抗体が、実質的に線形の標準曲線を得るような擬
似一次反応を起こすのに十分な量存在する段階と、 （ｂ）前記不溶性複合体を、流体サンプル、未反応抗体
およびいずれかの可溶性副生成物から分離する段階と、 （ｃ）不溶性支持体に結合された標識第２抗体の量また
は未反応標識第２抗体の量を検出する段階 とを有してなる液体サンプルにおける抗原を測定するた
めに免疫検定において線形標準曲線を得る方法。 - 【請求項１１】前記追加の抗体が未標識未結合第１抗体
である請求項10に記載の方法。 - 【請求項１２】前記追加の抗体が未標識未結合第２抗体
である請求項10に記載の方法。 - 【請求項１３】不溶性支持体に結合された標識抗体の量
が検出される請求項10に記載の方法。 - 【請求項１４】不溶性支持体に結合された標識抗体の量
が検出され、かつ、前記追加の抗体は未標識未結合第１
抗体である請求項10に記載の方法。 - 【請求項１５】不溶性支持体に結合された標識抗体の量
が検出され、かつ、前記追加の抗体は未標識未結合第２
抗体である請求項10に記載の方法。 - 【請求項１６】標識抗体が放射性同位体、化学発光化合
物、生物発光化合物、蛍光化合物、燐光化合物、酵素、
酵素補因子、ハプテン、抗体、アビジン、ビオチン、炭
水化物、レクチン、金属キレート化剤およびこれらの誘
導体よりなる群から選ばれる１種で標識される請求項1
0、11、12、13、14または15に記載の方法。 - 【請求項１７】前記標識が酵素である請求項16に記載の
方法。 - 【請求項１８】前記酵素が西洋わさびペルオキシダーゼ
である請求項17に記載の方法。 - 【請求項１９】免疫検定反応混合物における抗原の濃度
が約10-11Mより大である請求項10、11、12、13、14また
は15に記載の方法。 - 【請求項２０】抗原がプロラクチン、HLH、FSH、ガスト
リン、PTH、HGH、ACTH、肝炎、フェリチン、CEA、PAP、
アルファーフェトプロテイン、IgE、CPK-MBおよびイン
シュリンよりなる群から選ばれる請求項10、11、12、1
3、14または15に記載の方法。 - 【請求項２１】抗原がフェリチンおよびIgEよりなる群
から選ばれる請求項20に記載の方法。 - 【請求項２２】（ａ）抗原に対するものであって、不溶
性支持体に結合された第１の抗体と、 （ｂ）前記抗原に対するものであって、未結合かつ標識
された第２の抗体と、 （ｃ）未標識未結合第１抗体、未標識未結合第２抗体お
よびこれらの混合物よりなる群から選ばれる追加の抗体
であって、実質的に線形の標準曲線を得るような擬似一
次反応を起こすのに十分な量存在する追加の抗体 を含有してなる試薬。 - 【請求項２３】前記追加の抗体が未標識未結合第１抗体
である請求項22に記載の試薬。 - 【請求項２４】前記追加の抗体が未標識未結合第２抗体
である請求項22に記載の試薬。 - 【請求項２５】サンプルに含まれる抗原と少なくとも２
つの抗体との間で複合体を形成する段階であって、前記
抗体の１つは不溶性支持体に結合された第１の抗体であ
り、前記抗体の１つは第２の未結合標識抗体であり、こ
れにより前記標識抗体の一部が前記複合体を介して不溶
性支持体に結合される段階と、さらに、前記第１の抗体
用の未標識未結合の類似体を、実質的に線形の標準曲線
を得るような擬似一次反応を起こすのに十分な量存在す
るように添加する段階を有してなる液体サンプルにおけ
る抗原の免疫検定方法。 - 【請求項２６】サンプルに含まれる抗原と少なくとも２
つの抗体との間で複合体を形成する段階であって、前記
抗体の１つは不溶性支持体に結合された第１の抗体であ
り、前記抗体の１つは第２の未結合標識抗体であり、こ
れにより前記標識抗体の一部が前記複合体を介して不溶
性支持体に結合される段階と、さらに、前記第２の抗体
用の未標識未結合類似体を、実質的に線形の標準曲線を
得るような擬似一次反応を起こすのに十分な量存在する
ように添加する段階を有してなる液体サンプルにおける
抗原の免疫検定方法。 - 【請求項２７】サンプルに含まれる抗原と少なくとも２
つの抗体との間で複合体を形成する段階であって、前記
抗体の１つは不溶性支持体に結合された第１の抗体であ
り、前記抗体の１つは第２の未結合標識抗体であり、こ
れにより前記標識抗体の一部が前記複合体を介して不溶
性支持体に結合される段階と、さらに、前記第１および
第２の抗体用の未標識未結合の類似体を、実質的に線形
の標準曲線を得るような擬似一次反応を起こすのに十分
な量存在するように添加する段階を有してなる液体サン
プルにおける抗原の免疫検定方法。
Applications Claiming Priority (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US44,099 | 1987-04-30 | ||
| US044,099 | 1987-04-30 | ||
| US07/044,099 US4788138A (en) | 1987-04-30 | 1987-04-30 | Method to achieve a linear standard curve in a sandwich immunoassay |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH01503177A JPH01503177A (ja) | 1989-10-26 |
| JP2568910B2 true JP2568910B2 (ja) | 1997-01-08 |
Family
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| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP63505605A Expired - Lifetime JP2568910B2 (ja) | 1987-04-30 | 1988-04-13 | サンドイッチ免疫検定における線形標準曲線を得るための方法 |
Country Status (11)
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|---|---|
| US (1) | US4788138A (ja) |
| EP (1) | EP0289335B1 (ja) |
| JP (1) | JP2568910B2 (ja) |
| AT (1) | ATE84879T1 (ja) |
| AU (1) | AU617959B2 (ja) |
| CA (1) | CA1294870C (ja) |
| DE (1) | DE3877617T2 (ja) |
| ES (1) | ES2045113T3 (ja) |
| FI (1) | FI90799C (ja) |
| NO (1) | NO175657C (ja) |
| WO (1) | WO1988008535A1 (ja) |
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