DE3877617T2

DE3877617T2 - Verfahren zum erreichen einer linearen normkurve in einem sandwich-immunoassay.

Info

Publication number: DE3877617T2
Application number: DE8888303904T
Authority: DE
Inventors: Linda Katherine Cragle; Shih-Yun Lee; Frederick William Rood; Ker-Kong Tung
Original assignee: Beckman Instruments Inc
Current assignee: Beckman Coulter Inc
Priority date: 1987-04-30
Filing date: 1988-04-29
Publication date: 1993-05-13
Anticipated expiration: 2008-04-30
Also published as: EP0289335A2; AU1981288A; NO885808L; EP0289335A3; ATE84879T1; FI886000A; AU617959B2; FI90799B; DE3877617D1; US4788138A; EP0289335B1; WO1988008535A1; JPH01503177A; NO175657C; JP2568910B2; ES2045113T3; FI90799C; CA1294870C; NO885808D0; NO175657B

Description

Diese Erfindung betrifft eine Methode zur Herstellung einer linearen Standardkurve in einem Immunoassay gemäß der Sandwich-Methode.
Diese Erfindung ist wie andere Immunoassaytechniken ein Verfahren zur Feststellung des Vorhandenseins oder der Menge von Antigen in einer flüssigen Probe, wie z.B. dem Blut oder dem Urin eines Patienten. Im Gegensatz zu anderen Immunoassaytechniken vereinfacht die vorliegende Erfindung den Immunoassayvorgang durch Schaffung einer Methode zur Herstellung einer linearen Standardkurve, insbesondere für den Fall, wo höhere Konzentrationen von Antigen gemessen werden sollen.
Ein Antigen ist eine Substanz, normalerweise ein Protein oder Kohlenhydrat, das, wenn in den Körper eingeführt, die Produktion eines Antikörpers stimuliert. Ein Beispiel für ein Antigen ist ein Fremdstoff im Körper, welcher eine Erkrankung hervorruft, wie z.B. ein Virus.
Ein weiteres Beispiel für ein Antigen ist eine Substanz, welche einen Zustand des Körpers nachweist. Solche Antigene haben diagnostische Bedeutung. Z.B. weist das Vorhandensein des Antigens IgE (Immunglobulin E) auf einen allergischen Zustand hin, während das Antigen HCG (menschliches Choriongonadotropin) einen Hinweis auf Schwangerschaft liefert. Das Antigen Ferritin, ein eisenhältiges Protein, wird normalerweise als ein Hinweis auf eine von zwei Bedingungen gemessen: (1) Anämie (wobei Ferritin in relativ niederen Konzentrationen vorhanden ist); und (2) Eisenüberangebot (wobei Ferritin in relativ hohen Konzentrationen vorhanden ist). Dies sind nur einige Beispiele für Antigene, welche in Immunoassays dignostische Verwendung finden.
Immunoassaytechniken basieren auf der Bildung eines Komplexes zwischen dem untersuchten Antigen und einem Antikörper oder mehreren Antikörpern. Die Antikörper sind Reagenzien, welche während des Immunoassayverfahrens beigegeben werden. Es sind Mittel vorgesehen, durch die die Menge Antigen-Antikörper-Komplex bestimmbar ist. Normalerweise wird die Bestimmung mit Hilfe eines Markers durchgeführt. Der Marker kann z.B. ein radioaktiver Marker, wie z.B. I¹²&sup5;, ein Enzymmarker, wie z.B. Meerrettich-Peroxidase (HRPO) oder ein fluoreszierender Marker, wie z.B. Fluoreszein, sein, wobei jedoch auch andere Markierungsmittel möglich sind. Der Marker wird an einen der Teile gebunden, welche den Antigen- Antikörper-Komplex bilden, und wird üblicherweise nach der Trennung des markierten Antigen-Antikörper-Komplexes vom markierten, keinen Komplex bildenden Antigen oder Antikörper nachgewiesen und/oder quantitativ bestimmt.
Es gibt verschiedene bekannte Immunoassaymethoden, welche Antikörper verwenden, die zur analytischen Identifizierung markiert werden. "Sandwich"- oder "Zweiseiten"-Techniken umfassen die Bildung eines Komplexes zwischen dem Antigen und zwei Antikörpern, die an zwei verschiedene Stellen auf der Oberfläche des Antigens so gebunden sind, daß das Antigen sozusagen zwischen den beiden Antikörpern eingebunden ist, wie im U.S.Patent Nr. 4,016,043 beschrieben. Eine vorteilhafte Methode für die Bestimmung der Menge des Antikörper-Antigen-Antikörper-Komplexes, die bei solchen Techniken entstehen, ist die Schaffung eines ersten nicht markierten Antikörpers, der an einen Festphasenträger gebunden ist, und eines zweiten nicht gebundenen, markierten Antikörpers. Auf diese Weise wird der Marker an den Festphasenträger durch das Antikörper-Antigen-Antikörper-Sandwich gebunden, und der markierte Komplex kann einfach isoliert werden. Im Standardversuch wird die Markermenge auf dem Festphasenträger bestimmt und/oder quantitativ bestimmt, obwohl in einer selten verwendeten Variante des Sandwichimmunoassays die in Lösung bleibende Markermenge gemessen werden kann.
Die Ausdrücke erster Antikörper und zweiter Antikörper werden hier zum Zwecke der Klarheit verwendet und sollen nicht die Richtung der Immunreaktion andeuten oder einschränken. Z.B. kann das Immunoassay in folgender Weise erfolgen: vorwärts, schnell vorwärts, simultan oder umgekehrt, wie aus dem Stand der Technik bekannt ist. Siehe z.B. U.S.Patent 4,376,110. Z.B. kann das Antigen zuerst mit dem gebundenen Antikörper und dann mit dem markierten Antikörper eine Reaktion eingehen oder umgekehrt. Die Reaktionen können auch gleichzeitig stattfinden. Im Falle von schnell vorwärts oder simultan erfolgenden Assays wird nur eine Inkubation zur Komplexbildung verwendet, während vorwärts und umgekehrt erfolgende Assays mindestens zwei Inkubationen erfordern. Gemäß einer oder mehreren solchen Inkubationen wird der Marker an den Träger durch das Sandwich aus unlöslich gemachtem Antikörper-Antigen-markiertem Antikörper gebunden. Die Menge von markiertem Antikörper auf dem Festträger oder die in Lösung bleibende Menge kann dann bestimmt werden.
Das Sandwich-Immunoassay wird wegen seines hohen Grades an Spezifizität auf dem Gebiet von klinischen und diagnostischen Tests außerordentlich geschätzt. Bei dieser Art von Immunoassay ist es jedoch oft schwierig, eine tatsächlich lineare Standardkurve herzustellen. Unter einer tatsächlich linearen Standardkurve versteht man eine Standardkurve, die relativ linear ist, z.B. normalerweise ungefähr 90 bis 105 % linear, durch das System selbst bedingt. Davon unterscheidet sich eine visuell lineare Standardkurve, bei der die relative Linearität durch mathematische Manipulation erreicht wird.
Im speziellen Fall von Assays, bei denen eine signifikante Menge Antigen gemessen werden soll, ist die Herstellung einer tatsächlich linearen Standardkurve häufig ein nicht zu lösendes Problem. Der Grund dafür besteht darin, daß das Antigen, wenn es in signifikanter Menge vorhanden ist, nicht als limitierender Faktor im Reaktionssystem wirken kann. Wenn jedoch das Antigen von Bedeutung in ausreichend geringer Menge vorhanden ist, wird das Antigen der verhältnislimentierende Faktor im Immunoassay, wodurch natürlich eine Reaktion-Pseudo erster Ordnung geschaffen wird und eine lineare Standardkurve entsteht.
Grundsätzlich können chemische Reaktionen auf kinetischer Basis klassifiziert werden, d.h. durch Reaktionsordnung, abhängig von der Art, in der die Reaktionsrate durch die Konzentration von Reaktanden unter einer bestimmten Gruppe von Bedingungen beeinflußt wird. Eine Reaktion erster Ordnung ist eine solche, die mit einer Rate abläuft, die direkt proportional zur Konzentration von nur einem Reaktanden ist. Das einfachste Beispiel einer Reaktion erster Ordnung ist gegeben, wenn die Reaktionsrate A T P genau proportional zur Konzentration von A ist. Dies erfolgt z.B. beim Isotopenzerfall. Ein Assay auf der Basis einer Reaktion erster Ordnung ergibt normalerweise eine lineare Standardkurve.
In einer Reaktion zweiter Ordnung ist die Reaktionsrate proportional zum Produkt der Konzentration von zwei Reaktanden oder zur zweiten Potenz der Konzentration eines einzigen Reaktanden. Ein Beispiel für ersteres ist die Reaktion A + B T P. Ein Beispiel für zweiteres ist die Reaktion 2A T P. Ein Assay auf der Basis einer Reaktion zweiter Ordnung, insbesondere einer Reaktion zweiter Ordnung der zuerst erwähnten Art, erzeugt normalerweise eine nichtlineare Standardkurve. Dies ergibt sich daraus, daß die Reaktionsrate von der Konzentration nicht nur eines, sondern mehrerer Reaktanden abhängt. Dies gilt auch für die Reaktionen dritter Ordnung, vierter Ordnung usw.
Eine Reaktion zweiter Ordnung, wie z.B. A + B T P, oder z.B. eine Reaktion dritter Ordnung, wie z.B. A + B + C T P, kann unter bestimmten Umständen als Reaktion erster Ordnung erscheinen. Wenn z.B. die Konzentration von B und/oder C sehr hoch ist, und jene von A sehr nieder ist, kann die Reaktion als solche erster Ordnung erscheinen, da ihre Rate fast proportional zur Konzentration von nur einem Reaktanden ist, nämlich A. In diesem Fall wirkt A als verhältnislimitierender Faktor. Unter diesen besonderen Bedingungen ist die Reaktion eine offensichtliche Reaktion oder eine Reaktion-Pseudo erster Ordnung.
Ein Sandwich-Immunoassay kann im allgemeinen als eine Reaktion dritter Ordnung betrachtet werden, dargestellt durch die Gleichung:
O-Ab&sub1; + Ag + Ab&sub2;* T o-Ab&sub1;-Ag-Ab&sub2;*,
worin O-Ab&sub1; ein nicht löslich gemachter Antikörper, Ag das Antigen von Bedeutung und Ab&sub2;* der markierte Antikörper ist, der das Sandwich vervollständigt. Im Falle eines Sandwich- Immunoassays, bei dem das Antigen von Bedeutung eine sehr niedrige Konzentration aufweist, wirkt das Antigen natürlich als verhältnislimitierender Faktor in der Gesamtreaktion. Somit wird bei dieser beschränkten Anwendung die Immunreaktion zu einer Reaktion-Pseudo erster Ordnung, bei der die Reaktionsrate beinahe proportional zur Konzentration des Antigens ist, welches gemessen werden soll. Dadurch wird die Herstellung einer linearen Standardkurve ermöglicht.
Bei umfangreicheren Anwendungen, bei denen das Antigen von Bedeutung nicht in ausreichend niederen Mengen vorhanden ist, um natürlich als verhältnislimitierender Faktor in der gesamten Immunreaktion zu wirken, entsteht eine nichtlineare Standardkurve.
Die Herstellung einer linearen Standardkurve in Sandwich- Immunoassays dieser Art wäre aus verschiedenen Gründen wünschenswert. Unter anderem ermöglicht eine lineare Standardkurve eine Einpunktkalibrierung, die ihrerseits verringerte Kosten bei der Durchführung des Immunoassays sowie Vereinfachungen für das das Immunoassay durchführende Personal bedeutet. Zum Zwecke einer Einpunktkalibrierung wird ein einzelner Standard an einer Blindprobe ausgeführt. Der Standard ergibt den einzigen Punkt, während die Blindprobe den y-Abschnitt der Standardkurve definiert. Da die Standardkurve eine gerade Linie ist, sind nur zwei Punkte notwendig, um die Kurve zu definieren. Ein einziger Umrechnungsfaktor kann aus dieser Kurve berechnet werden.
Bei einer nichtlinearen Standardkurve müssen normalerweise fünf Standards ausgeführt werden, um die Kurve zeichnen zu können. Dies wird ziemlich teuer, wenn eine neue Standardkurve für jede Gruppe von Immunoassays, die durchgeführt werden, hergestellt wird. Weiters ergibt eine lineare Standardkurve genauere Ergebnisse als eine nichtlineare Standardkurve. Dies entsteht dadurch, daß bei der Kurvenanpassung der nichtlinearen Standardkurve eine gewisse innewohnende Fehlerquote auftritt.
Aus diesen Gründen wurden verschiedene Versuche unternommen, lineare Standardkurven in Sandwich-Immunoassays zu erhalten, die zur Messung eines Antigens dienen, welches nicht in ausreichend geringer Menge vorhanden ist, um unter typischen Assaybedingungen eine Reaktion-Pseudo erster Ordnung zu ergeben.
Einer der häufigsten Versuche zur Lösung dieses Problems ist die Einstellung der folgenden zwei Parameter, die im Sandwich-Immunoassaysystem vorhanden sind: (1) Die Menge an unlöslich gemachtem erstem Antikörper; und/oder (2) die Menge an markiertem zweitem Antikörper. Konkret wird die Menge an unlöslich gemachtem erstem Antikörper und/oder die Menge an markiertem zweitem Antikörper im Immunoassaysystem gemäß diesem Versuch erhöht. Durch die Erhöhung der Antikörperkonzentration wird das Antigen der verhältnislimitierende Faktor im System, und eine Reaktion-Pseudo erster Ordnung entsteht. Die Einstellung dieser Parameter ist jedoch bei dieser praktischen Anwendung beschränkt.
Der erste Parameter betrifft die Zugabe von überschüssigem, unlöslich gemachtem erstem Antikörper zum Immunoassaysystem. Die Menge an Antikörper, welche unlöslich gemacht werden kann, ist zwangszweise durch die Menge an Festphasenträger im System, oft die Menge an Perlenoberfläche, und durch die verwendete Beschichtungsmethode begrenzt. Es gibt in anderen Worten eine bestimmte Grenze bezüglich der Antikörpermenge, welche wirkungsvoll an die Oberfläche eines bestimmten Festphasenträgers gebunden werden kann.
Der zweite für die Einstellung verfügbare Parameter ist bei Methoden des Standes der Technik die Zugabe von überschüssigem markiertem Antikörper. Dieser Parameter wird auch dadurch begrenzt, daß der markierte Antikörper, welcher dem System beigegeben wird, von sich aus den Hintergrundlevel des Standard-Sandwich-Immunoassays erhöht. Der Hintergrund eines Systems wird bestimmt durch die Messung, die man erhält, wenn eine Blindprobe das System durchläuft, die nur Reagenz und keine der zu messenden Substanzen enthält. In einem Immunoassaysystem enthält die Blindprobe kein Antigen, wodurch die Möglichkeit der Bildung des Sandwichkomplexes aus unlöslich gemachtem Antikörper:Antigen:markiertem Antikörper in einem Sandwich-Immunoayssay ausschließt.
In einem idealen Sandwich-Immunoassaysystem sollte wegen des Nichtvorhandenseins eines Antikörper:Antigen:Antikörper- Sandwichs kein markierter Antikörper an die Festphase gebunden sein, wenn eine Blindprobe ausgeführt wird. Somit sollte theoretisch die Feststellung der Gegenwart eines Markers auf dem unlöslich gemachten Träger nicht möglich sein. Unter den nicht perfekten Bedingungen, unter denen Immunoassays durchgeführt werden, wird eine bestimmte Menge des markierten Antikörpers unspezifisch direkt auf dem Festphasenträger während des Immunoassas adsorbiert. Diese unspezifische Adsorption trägt zu einer erhöhten Blindprobenablesung bei, nämlich bestimmbarer Marker auf dem unlöslichen Träger, der nicht auf die Bildung des Sandwichs, der gemessen werden soll, zurückzuführen ist. Wenn zusätzlicher markierter Antikörper dem System beigegeben wird, entsteht eine zusätzliche unspezifische Adsorption und somit ein höherer Hintergrundlevel. Ein erhöhter Hintergrundlevel beeinflußt die Empfindlichkeit eines Immunoassays nachteilig. Die Zugabe von überschüssigem markiertem Antikörper gemäß dem Stand der Technik ist deshalb beschränkt durch das Maß an erhöhtem Hintergrund, welches das Immunoassaysystem tolerieren kann, ohne an Empfindlichkeit einzubüßen.
Ein weiterer Versuch, der unternommen wurde, umfaßt die mathematische Manipulation der Standardkurve, um eine visuell lineare Kurve zu erhalten. Dieser unterscheidet sich vom ersten Versuch des Standes der Technik, der oben beschrieben wurde und bei dem die Menge an Antikörpern im System eingestellt wird, um eine tatsächlich lineare Standardkurve zu erreichen. Eine als logarithmische Transformation bekannte Technik liegt diesem zweiten Versuch zugrunde. Am einfachsten ausgedrückt ergibt die logarithmische Transformation eine halblogarithmische Darstellung der Beziehung zwischen Absorptionsfähigkeit und Antigenmenge. In einer solchen Darstellung kann die Beziehung zwischen Absorptionsfähigkeit und Antigenkonzentration in einem beschränkten analytischen Bereich durch eine lineare Funktion genähert werden, wie von Sorenson, Scand. J. Clin. Lab. Invest., 42, 577-89 (1982) beschrieben.
Linearisierung durch logarithmische Transformation wird eingehender von Williams et al, J. Immunological Methods, 85, 179-294 (1985) beschrieben. Im allgemeinen erfordern diese Verfahren relativ komplizierte Computer, um die durch die nichtlineare Standardkurve dargestellte Gleichung gemäß der Methode der kleinsten Quadrate zu lösen. Während eine lineare Näherung der transformierten Kurve auf diese Art erfolgen und ein Umwandlungsfaktor aus diesen Daten berechnet werden kann, bleibt die Notwendigkeit bestehen, eher eine vollständige Standardkurve als einen einzigen Standard aufzustellen.
In jüngerer Zeit entwickelte Zvaigzne et al., Clin. Chem., 32(3), 437-440 (1986) ein Verfahren, bei dem die nichtlineare Standardkurve in einem Computer gespeichert wird. Zvaigzne et al. stellte dann im Verlaufe von darauffolgenden Assays einen einzigen Standard auf, um den y-Abschnitt der transformierten nichtlinearen Standardkurve zu aktualisieren. Dabei erreichen Zvaigzne et al. eine Form von Einpunktkalibrierung bei ihrer Methode. Dieser Versuch ist jedoch nur bei extrem stabilen Reagenzsystemen erfolgreich wirksam. Außerdem erfordert diese Methode relativ komplizierte Computer, und sie kann eine bestimmte Fehleranzahl, die mit der Kurvenanpassung immer verbunden ist, nicht zur Gänze vermindern.
Es besteht daher Bedarf an einer Methode zur Erstellung einer tatsächlich linearen Standardkurve bei Sandwich- Immunoassays bestimmt zur Feststellung und/oder Messung von Antigen, das in solcher Menge vorhanden ist, daß Einstellungen gemäß dem Stand der Technik beim Immunoassay keine lineare Standardkurve ergeben. Es ist ein Ziel der vorliegenden Erfindung, eine solche Methode zu schaffen. Es ist ein weiteres Ziel der vorliegenden Erfindung, eine Methode zur Kalibrierung einer Standardkurve zu schaffen, wobei nur ein einziger Standard aufgestellt werden muß und dieser einzige Standard verwendet werden kann, um einen Umwandlungsfaktor ohne komplizierte und/oder teure Computerausrüstung herzustellen.
Erfindungsgemäß wird überschüssiger erster Antikörper, der nicht an den Festphasenträger gebunden ist, und/oder überschüssiger unmarkierter ungebundener zweiter Antikörper dem Immunoassaysystem beigegeben. Die Ausdrücke erster Antikörper und zweiter Antikörper werden der Klarheit und Einfachheit halber verwendet und sollen die vorliegende Erfindung nicht einschränken. Der erste nicht gebundene, nicht markierte Antikörper muß nur als Analog für den ersten, an den unlöslichen Träger gebundenen Antikörper dienen. Der erste nicht gebundene, nicht markierte Antikörper kann ein anderer Antikörper sein als der erste Antikörper, welcher unlöslich gemacht ist. Dasselbe gilt für den nicht gebundenen, nicht markierten zweiten Antikörper, d.h. er kann ein anderer Antikörper sein als der markierte, zweite Antikörper, für den er als Analog dient.
Die Zugabe des ersten, an den unlöslichen Träger nicht gebundenen Antikörpers wird durch die auf dem unlöslichen Träger zur Verfügung stehende Oberfläche nicht beschränkt. Die Zugabe von nicht markiertem, nicht gebundenem zweitem Antikörper vergrößert den Hintergrund des Immunoassays nicht. Die Zugabe eines oder beider Analoge ermöglicht eine Reaktion-Pseudo erster Ordnung und somit eine lineare Standardkurve. Die Vorteile der vorliegenden Erfindung im Vergleich zu herkömmlichen Methoden werden klar nach Durchsicht der beiliegenden Zeichnungen und der folgenden detaillierten Beschreibung der Erfindung.
Die Fig. 1 ist eine grafische Darstellung der linearen Standardkurve in einem Immunoassay für HCG (menschliches Choriongonadotropin), welches im allgemeinen in kleinsten Mengen vorhanden ist bei typischen Immunoassaybedingungen, wobei nur Einstellungen des Standes der Technik am System vorgenommen wurden.
Die Fig. 2 ist eine grafische Darstellung der nichtlinearen Standardkurve in einem Immunoassay für Ferritin unter typischen herkömmlichen Immunoassaybedingungen und der linearen Standardkurve, die gemäß den Lehren der vorliegenden Erfindung erstellt wurde.
Die Fig. 3 ist eine grafische Darstellung der nichtlinearen Standardkurve in einem Immunoassay für IgE (Immunglobulin E) unter typischen herkömmlichen Immunoassaybedingungen und der linearen Standardkurve, die gemäß den Lehren der vorliegenden Erfindung erstellt wurde.
Gemäß der vorliegenden Erfindung wird überschüssiger erster Antikörper, der nicht an den Festphasenträger gebunden ist und/oder überschüssiger, nicht markierter, nicht gebundener zweiter Antikörper dem Sandwich-Immunoassaysystem beigegeben. Überraschenderweise führte die Zugabe von entweder einem oder von beiden Antikörpern zu einer Zunahme der Parameter, die für die Einstellung des Immunoassaysystems zur Verfügung standen. Dadurch konnte eine tatsächlich lineare Standardkurve bei Immunoassays erstellt werden, wobei das Antigen von Bedeutung in so hohen Mengen vorhanden ist, daß eine tatsächlich lineare Standardkurve mit Hilfe von herkömmlichen Methoden normalerweise nicht möglich ist.
Die vorliegende Erfindung schafft zwei zusätzliche Parameter für die Einstellung in einem Sandwich-Immunoassay, um eine Reaktion-Pseudo erster Ordnung und somit eine lineare Standardkurve zu erhalten. Gemäß der vorliegenden Erfindung haben die beiden zusätzlichen Parameter die Form von zusätzlichen Reaktanden oder Analogen, welche dem Sandwich- Immunoassay zugeführt werden, um überschüssiges Antigen vom gewünschten Endprodukt wegzuleiten. Dies erfolgt durch die Bildung von Nebenprodukten zusätzlich zu jenen, die sich normalerweise bei einem Sandwich-Immunoassay bilden.
Herkömmliche Sandwich-Immunoassays ergeben normalerweise nur eine geringe Menge der folgenden Nebenprodukte zusätzlich zur gewünschten Reaktion, die das O-Ab&sub1;-Ag-Ab&sub2;* Endprodukt ergibt:
I. O-Ab&sub1;-Ag (unvollständiges Sandwich)
II. Ag-Ab&sub2;* (unvollständiges Sandwich)
Das markierte Nebenprodukt Ag-Ab&sub2;* (II) ist löslich und trägt nichts bei zur Menge an gebundenem Marker, der mit der Menge Antigen, welches in der Probe enthalten ist, standardkorreliert ist. In der ungewöhnlichen Situation, bei der die Menge an ungebundenem, in Lösung bleibendem Marker als ein Hinweis auf die Menge Antigen festgestellt wird, welche in einer Testprobe enthalten ist, trägt das markierte Nebenprodukt (II) geringfügig zum Signal bei.
Wenn nur nicht gebundener erster Antikörper gemäß den Lehren der vorliegenden Erfindung einem Immunoassaysystem beigegeben wird, bilden sich die folgenden Nebenprodukte zusätzlich zu den Nebenprodukten I und II:
III. Ab&sub1;-Ag-Ab&sub2;* (nicht gebundenes, markiertes Sandwich)
IV. Ab&sub1;-Ag (unvollständiges Sandwich)
Wenn nur nicht gebundener, nicht markierter zweiter Antikörper einem Immunoassaysystem beigegeben wird, bilden sich verschiedene Nebenprodukte zusätzlich zu den Nebenprodukten I und II, nämlich:
V. 0-Ab&sub1;-Ag-Ab&sub2; (gebundes, nicht markiertes Sandwich)
VI. Ag-Ab&sub2; (unvollständiges Sandwich)
Wenn beide, nicht gebundener erster Antikörper und freier, nicht markierter zweiter Antikörper, gemäß den Lehren der vorliegenden Erfindung einem Immunoassaysystem beigegeben werden, bilden sich alle Nebenprodukte I-VI sowie das folgende zusätzliche Nebenprodukt:
VII. Ab&sub1;-Ag-Ab&sub2;
Bei den Nebenprodukten III-VII ist das einzige zusätzliche, markierte Nebenprodukt, hergestellt gemäß der vorliegenden Erfindung, Ab&sub1;-Ag-Ab&sub2;* (III), löslich und trägt zu der auf dem löslichen Träger festgestellten Signalgröße nicht bei.
Nebenprodukte werden herkömmlicherweise bei einem Immunoassay als unerwünscht betrachtet. Der Grund dafür liegt darin, daß Reaktionsnebenprodukte kleine Mengen des Antigen von Bedeutung verbrauchen, jedoch das gewünschte Endprodukt, welches nachgewiesen und/oder quantitativ bestimmt werden soll, nicht darstellen. Wenn die Markermenge, welche an den unlöslichen Träger gebunden ist, als Hinweis auf die Antigenmenge festgestellt wird, welche in der untersuchten Probe vorhanden ist, was die übliche Situation ist, trägt keines der Nebenprodukte zum zu messenden Signal bei. Die verstärkte Bildung von Reaktionsnebenprodukten wird daher herkömmlicherweise als Beeinträchtigung der Integrität eines Immunoassays betrachtet.
Es hat sich jedoch unerwarteterweise gezeigt, daß die zusätzlichen Nebenprodukte, die sich erfindungsgemäß bilden, die Genauigkeit eines Immunoassays nicht nachteilig beeinflussen. Der Grund dafür liegt darin, daß die Rate der Bildung von Nebenprodukten scheinbar eine konstante Beziehung zur Antigenmenge hat, die in einer Testprobe enthalten ist. In anderen Worten führt eine erhöhte Antigenkonzentration zu erhöhter Nebenproduktbildung, und es wurde festgestellt, daß diese Erhöhung geradlinig erfolgt.
Man hat weiters festgestellt, daß der erfindungsgemäße nicht gebundene erste Antikörper als Analog für den ersten Antikörper wirkt, der in einem charakteristischen Sandwich- Immunoassay an den Festphasenträger gebunden ist. In gleicher Weise wirkt der erfindungsgemäße, nicht markierte zweite Antikörper als Analog für den markierten zweiten Antikörper in einem Sandwich-Immunoassay. Diese Analoge, einzeln oder zusammen, erhöhen tatsächlich die Konzentration des ersten Antikörpers und/oder zweiten Antikörpers im Immunoassaysystem relativ zur Antigenmenge, welche untersucht wird, wodurch eine Reaktion-Pseudo erster Ordnung hergestellt wird. Auf der Grundlage dieses Prinzips wurden tatsächlich lineare Kurven in Immunoassays hergestellt, in denen die Antigenkonzentration so hoch ist, daß Methoden des Standes der Technik zur Herstellung einer tatsächlich linearen Standardkurve sich als unwirksam oder nicht ausreichend erwiesen.
Die Vorteile der vorliegenden Erfindung im Vergleich zu herkömmlichen Methoden zur Herstellung einer tatsächlich linearen Kurve in einem Sandwich-Immunoassay sind aus den folgenden Beispielen ersichtlich. In Hinblick auf Einfachheit und Klarheit zeigen die folgenden Beispiele nur jenen Aspekt der Erfindung, der die Zugabe von nicht gebundenem erstem Antikörper vorsieht, wobei jedoch klar ist, daß die Zugabe von nicht markiertem, nicht gebundem zweitem Antikörper in ähnlicher Weise funktioniert.
In diesen Beispielen wurden gleichzeitig Sandwich- Immunoassays durchgeführt, wobei ein erster Antikörper, der auf eine Polystyrolperle aufgetragen wurde, und ein zweiter Antikörper verwendet wurde, der mit Meerrettichperoxidase (HRPO) konjugiert wurde, welche als Enzymmarker wirkt. Die Polystyrolperlen wurden für ein bestimmtes Immunoassay mit dem gewählten ersten Antikörper vollständig beschichtet. Die Menge an markiertem zweitem Antikörper wurde gemäß der HRPO- Enzymaktivität mengenmäßig bestimmt, wobei eine Einheit von HRPO-Aktivität ungefähr gleich ist einem g markierten Antikörper. Nach einer ersten Inkubation, bei der ein Antikörper:Antigen:Antikörper-Komplex gebildet wurde, wurde der unlöslich gemachte Komplex isoliert und einer zweiten Inkubation unterworfen, bei der eine Substratlösung für den Enzymmaker beigegeben wurde, um ein feststellbares Signal herzustellen. Die Signalgröße gebunden an den unlöslichen Träger wurde dann mengenmäßig bestimmt.

Beispiel 1

Reagenzien:
1)Perlen: Polystyrolperlen beschichtet mit Ab&sub1;
2)Konjugatlösung: Puffer, Tierprotein und Ab&sub2;-HRPO
3)Substratlösung: Puffer, H&sub2;O&sub2; und o-Phenylendiamin (OPD)

Verfahren:

Die Konjugatlösung enthält 0,5 U Ab&sub2;-HRPO. Das Assay erfolgt durch Inkubieren von 20 ul Probe mit 250 ul Konjugatlösung und einer Ab&sub1;-beschichteten Perle über einen Zeitraum von 20 Minuten bei Raumtemperatur unter Schütteln. Nach der ersten Inkubation wird die Perle gewaschen und mit 300 ul Substratlösung 20 Minuten bei Raumtemperatur wieder inkubiert. Die Reaktion wird dann mit 1,0 ml 0,9N Schwefelsäure gestoppt und auf einem Spektrophotometer in bezug auf Absorptionsvermögen bei 492 nm gemessen. Die Tabelle I faßt die Ergebnisse zusammen, die auch in der Fig. 1 gezeigt werden. Tabelle I Absorptionsvermögen bei 492 nm
Dieses Beispiel zeigt ein Sandwich-Immunoassay für HCG (menschliches Choriongonadotropin) unter typischen Assaybedingungen. HCG-Antigen ist normalerweise in relativ winzigen Mengen vorhanden, sodaß eine Assaymethode mit extrem hoher Empfindlichkeit erforderlich ist. Der Meßbereich für HCG in einer Testprobe beträgt ungefähr 1 bis 100 mIU/ml, oder ungefähr 2 x 10&supmin;¹²M bis 2 x 10&supmin;¹&sup0;M. In der Reaktionsmischung selbst beträgt die tatsächliche Konzentration von HCG weniger als 10&supmin;¹¹M. Diese Konzentration ist ausreichend nieder, sodaß der herkömmliche Versuch, die Ab&sub2;*-Konzentration zu erhöhen, wirksam ist zur Herstellung der Bedingungen für eine kinetische Reaktion-Pseudo erster Ordnung und somit einer linearen Standardkurve.

Beispiel 2

Verfahren:

Die Assays erfolgten durch Inkubieren von 25 ul Probe mit 300 l Konjugatlösung und einer Ab&sub1;-beschichteten Perle über einen Zeitraum von 45 Minuten bei Raumtemperatur unter Schütteln, worauf die Perle gewaschen wurde und eine zweite Inkubation mit der Substratlösung durchgeführt wurde. Die Reaktion wurde dann durch die Zugabe von 0,1 ul 0,9 N Schwefelsäure gestoppt, und das Absorptionsvermögen wurde bei 492 nm auf einem Spektrophotometer gemessen. Die Tabelle II faßt die Ergebnisse zusammen, die auch in Fig. 2 gezeigt werden. Tabelle II Absorptionsvermögen bei 492 nm Konjugatlösung 2. Inkubation
Dieses Beispiel erläutert ein Sandwich-Immunoassay für Ferritin unter typischen Assaybedingungen (A), wobei herkömmliche Einstellungen am System (B) erfolgten, und schließlich unter Verwendung der Lehren der vorliegenden Erfindung (C), um schließlich eine tatsächliche lineare Standardkurve herzustellen. Bei Ferritin entspricht der Assaybereich von 5 bis 500 ng/ml Ferritin in einer durchschnittlichen Serumprobe einem Konzentrationsbereich von ungefähr 1 x 10&supmin;&sup9;M bis 1 x 10&supmin;&sup9;M. Die endgültige Konzentration von Ferritin in der Reaktionsmischung beträgt ungefähr 10&supmin;¹&sup0;M. Wie in Fig. 2 angedeutet, ist die Standardkurve ohne Einstellungen im System, außer der maximalen Beladung mit Ab&sub1; auf der Polystyrolperle, nur 60% linear am oberen Ende des Assaybereichs. Die Zugabe eines 50-fachen Ab&sub2;*-Überschusses verbesserte die Linearität der Standardkurve bis nur 80%.
Nicht gebundenes oder lösliches Ab&sub1; wurde in die Reaktionsmischung eingeführt, um als 0-Ab&sub1; Analog zu wirken. Es wird angenommen, daß die Zugabe von löslichem Ab die Nebenprodukte III und IV, wie oben angegeben, wie folgt hergestellt hat.
Ab&sub1; + Ag + Ab&sub2;*TAb&sub1;-Ag-Ab&sub2;* (III)
Ab&sub1; + Ag T Ab&sub1;-Ag (IV)
Die Zugabe von löslichem Ab reduzierte die Rate der O-Ab&sub1;- Ag- Ab&sub2;* Bildung und erzeugte ein niedrigeres Signal, wie in Kurve C in Fig. 2 angeführt. Trotzdem bewirkte die Gegenwart von Ab&sub1;, zusätzlich zu Ab&sub1;-O eine Reaktion-Pseudo erster Ordnung und eine lineare Kurve. Das Signal wurde durch Erhöhung der zweiten Inkubationszeit auf zehn Minuten (D) verbessert.

Beispiel 3

Reagenzien:
1)Perlen: Polystyrolperle beschichtet mit Ab&sub1;
2)Konjugatlösung: Puffer, Tierprotein und Ab&sub2;-HRPO
3)Substratlösung: Puffer, H&sub2;O&sub2; und o-Phenylendiamin (OPD)

Verfahren:

Der Versuch erfolgte durch Inkubieren von 20 ul Probe mit 300 ul Konjugatlösung und einer Ab&sub1;-beschichteten Perle bei Raumtemperatur 30 Minuten lang unter Schütteln. Die Perle wurde dann gewaschen, wieder mit 300 ul Substratlösung inkubiert, mit 1 ml 0,9 N Schwefelsäure gestoppt und bei 492 nm abgelesen. Die Tabelle III vergleicht das Verhalten von IgE Reagenzien mit und ohne den kombinierten Modifikationen der Lehren des Standes der Technik und den Lehren der vorliegenden Erfindung. Tabelle III Absorptionsvermögen bei 492 nm Konjugatlösung IgE (IU/ml)
Dieses Beispiel erläutert ein Sandwich-Immunoassay für IgE (Immunglobulin E) durchgeführt unter typischen Assaybedingungen (A) unter Verwendung der kombinierten Wirkungen von herkömmlichen Einstellungen im System und der Lehre der vorliegenden Erfindung (B), um eine tatsächlich lineare Standardkurve herzustellen.
Bei einem Assaybereich von ungefähr 5 bis 400 IU/ml in der Testprobe beträgt die Endkonzentration von IgE 10&supmin;¹&sup0;M bis 10&supmin;&sup9;M in der Reaktionsmischung. Ohne geeignete Einstellung der Parameter des Immunoassaysystems ist die Standardkurve weniger als 50% linear am oberen Ende des Assaybereichs. Eine ziemlich große Menge von Ab&sub2;* und löslichem Ab&sub1; wurde zur Herstellung einer linearen Kurve beigegeben (Fig. 3). Dieser Versuch zeigt, daß die vorliegende Erfindung extreme Fälle, wie z.B. IgE, ohne Schwierigkeit bewältigen kann.
Ein Vergleich der in der Fig. 1, Fig. 2 und Fig. 3 gezeigten Darstellung zeigt die Wirksamkeit der vorliegenden Erfindung. Es hat sich unerwarteterweise herausgestellt, daß die Anwendung der Lehren der vorliegenden Erfindung ein Überschreiten der Beschränkungen gemäß dem Stand der Technik erlaubt und somit die Herstellung einer tatsächlich linearen Standardkurve in Immunoassays ermöglicht, wo die Konzentration des Antigens von Bedeutung relativ hoch ist.
Das Antigen HCG z.B., welches normalerweise in der Reaktionsmischung mit einer Konzentration von weniger als ungefähr 10&supmin;¹¹M enthalten ist, eignet sich selbst zur wirkungsvollen Behandlung mit Hilfe von herkömmlichen Methoden. Ferritin und IgE andererseits sind normalerweise in der Immunoassay-Reaktionsmischung mit einer Konzentration von 10&supmin;¹&sup0;M bzw. ungefähr 10&supmin;¹&sup0;-10&supmin;&sup9;M enthalten. Diese Konzentrationen sind mindestens um eine Größenordnung höher als die Konzentration der HCG Reaktionsmischung und werden somit unwirksam behandelt durch Anpassungen an die herkömmlichen Reaktionsparameter allein. Durch Einbeziehung der Lehren der vorliegenden Erfindung wurden jedoch tatsächlich lineare Standardkurven für Ferritin- und IgE-Immunoassays erreicht.
Die oben beschriebenen Beispiele beziehen sich nur auf die Anwendung der vorliegenden Erfindung in Ferritin- und IgE- Sandwich-Immunoassays. Es wird jedem Fachmann klar sein, daß Varianten der in diesen Beispielen beschriebenen Verfahren in anderen Immunoassays von Vorteil sein können. Zu diesen anderen Immunoassays gehören Assays für die Hormone: Prolaktin, HLH (menschliches luteinisierendes Hormon), FSH (follikel-stimulierendes Hormon), Gastrin, PTH (Parathormon), HGH (menschliches Wachstumshormon) und ACTH (adrenocorticotropes Hormon); für die Infektionskrankheit: Hepatitis; die Tumormarker: CEA (carcino-embryonales Antigen), PAP (saure Prostataphosphatase und alpha-Fetoprotein); und auch für: CPK-MB (Kreatin-Phosphor-Kinase-MB) und Insulin u.a. Die vorliegende Erfindung wird daher nur von den beiliegenden Ansprüchen begrenzt.
Der hier verwendete Ausdruck "Antigen" umfaßt jede Substanz, zu welcher Antikörper hergestellt werden können und umfaßt somit Haptene, welche zum Zwecke der Herstellung von Antikörpern antigen gemacht werden können.
Der hier verwendete Ausdruck "Antikörper" umfaßt sowohl polyclonale als auch monoclonale Antikörper und hat Bezug auf intakte Antikörper sowie deren Fragmente, welche die Bindungsregion des Antikörpers enthalten. Solche Fragmente können Fab-Fragmente sein, welche als Fragmente definiert werden, die keinen Fc-Teil haben, z.B. Fab, Fab¹ und F(ab¹)&sub2;, oder sie können als "Halbmolekül"-Fragmente bezeichnet werden, welche durch reduktive Spaltung der Disulfidbindungen hergestellt werden, die die schweren Kettenbestandteile im intakten Antikörper verbinden.

Claims

1. Verfahren zur Durchführung eines Immunoassays für ein Antigen in einer flüssigen Probe, umfassend die Schritte: Bilden eines Komplexes zwischen dem Antigen und mindestens zwei Antikörpern in der genannten flüssigen Probe, wobei einer der genannten Antikörper ein erster, an einen unlöslichen Träger gebundener Antikörper und einer der genannten Antikörper ein zweiter, nicht gebundener, markierter Antikörper ist, wobei ein Teil des genannten markierten Antikörpers durch den genannten Komplex an den unlöslichen Träger gebunden wird, gekennzeichnet durch Einführen eines zusätzlichen Antikörpers ausgewählt aus dem nicht markierten, nicht gebundenen, ersten Antikörper, dem nicht markierten, nicht gebundenen, zweiten Antikörper oder Mischungen derselben.

2. Verfahren nach Anspruch 1, worin der zusätzliche Antikörper der nicht markierte, nicht gebundene, erste Antikörper oder der nicht markierte, nicht gebundene, zweite Antikörper ist.

3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, worin der Antikörpermarker ausgewählt wird aus: Radioisotopen, chemilumineszierenden Verbindungen, biolumineszierenden Verbindungen, fluoreszierenden Verbindungen, phosphoreszierenden Verbindungen, Enzymen, Enzymcofaktoren, Haptenen, Antikörpern, Avidin, Biotin, Kohlenhydraten, Lektinen, Metallchelatoren und Derivaten derselben.

4. Verfahren nach Anspruch 3, worin der genannte Marker ein Enzym ist.

5. Verfahren nach Anspruch 4, worin das genannte Enzym Meerrettichperoxidase ist.

6. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 5, worin die Antigenkonzentration in der Immunoassay-Reaktionsmischung größer als ungefähr 10&supmin;¹¹ M ist.

7. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 5, worin das Antigen ausgewählt wird aus Prolaktin, menschlichem luteinisierendem Hormon, follikelstimulierendem Hormon, Gastrin, Parathormon, menschlichem Wachstumshormon, adrenocorticotropem Hormon, Hepatitis-, Ferritin-, carcino-embryonalem Antigen, saurer Prostataphosphatase, alpha-Fetoprotein, Immunglobulin E, Kreatin-Phoshor-Kinase- MB und Insulin.

8. Verfahren nach Anspruch 7, worin das Antigen Ferritin oder Immunglobulin-E ist.

9. Verfahren zur Herstellung einer linearen Standardkurve in einem Immunoassay für die Bestimmung eines Antigens in einer flüssigen Probe, umfassend die Schritte:

(a) Zusammenbringen der flüssigen Probe mit einem ersten, an einen unlöslichen Träger gebundenen Antikörper, einem zweiten, nicht gebundenen, markierten Antikörper und einem zusätzlichen Antikörper ausgewählt aus dem nicht markierten, nicht gebundenen, ersten Antikörper, dem nicht markierten, nicht gebundenen, zweiten Antikörper und Mischungen derselben, wodurch ein unlöslicher Komplex aus gebundenem, erstem Antikörper: Antigen: markiertem, zweitem Antikörper gebildet wird, wobei der genannte zusätzliche Antikörper mit dem Antigen komplexiert wird, um Nebenprodukte zur Reaktion zu bilden, die den genannten unlöslichen Komplex ergibt;

b) Trennen des genannten unlöslichen Komplexes von der flüssigen Probe, nicht zur Reaktion gebrachtem Antikörper und allen löslichen Nebenprodukten;

(c) Bestimmen entweder der Menge des markierten, zweiten, an den unlöslichen Träger gebundenen Antikörpers oder der Menge des nicht zur Reaktion gebrachten, markierten, zweiten Antikörpers.

10. Verfahren nach Anspruch 9, worin der genannte zusätzliche Antikörper der nicht markierte, nicht gebundene, erste Antikörper oder der nicht markierte, nicht gebundene, zweite Antikörper ist.

11. Verfahren nach Anspruch 9 oder 10, worin die Menge des markierten, an den unlöslichen Träger gebundenen Antikörpers bestimmt wird.

12. Verfahren nach einem der Ansprüche 9 bis 11, worin der Antikörpermarker ausgewählt wird aus Radioisotopen, chemilumineszierenden Verbindungen, biolumineszierenden Verbindungen, fluoreszierenden Verbindungen, phosphoreszierenden Verbindungen, Enzymen, Enzymcofaktoren, Haptenen, Antikörpern, Avidin, Biotin, Kohlenhydraten, Lektinen, Metallchelatoren und Derivaten derselben.

13. Verfahren nach Anspruch 12, worin der genannte Marker Meerrettichperoxidase ist.

14. Verfahren nach einem der Ansprüche 9 bis 13, worin die Antigenkonzentration in der Immunoassay-Reaktionsmischung größer als ungefähr 10&supmin;¹¹ M ist.

15. Verfahren nach einem der Ansprüche 9 bis 14, worin das Antigen ausgewählt wird aus Prolaktin, menschlichem, luteinisierendem Hormon, follikelstimulisierendem Hormon, Gastrin, Parathormon, menschlichem Wachstumshormon, adrenocorticotropem Hormon, Hepatitis-, Ferritin-, carcino-embryonalem Antigen, saurer Prostataphosphatase, alpha-Fetoprotein, Immunglobulin E, Kreatin-Phosphor-Kinase- MB und Insulin.

16. Verfahren nach Anspruch 15, worin das Antigen Ferritin oder Immunglobulin-E ist.

17. Reagens umfassend:

(a) einen ersten Antikörper zu einem Antigen, wobei der erste Antikörper an einen unlöslichen Träger gebunden ist;

(b) einen zweiten Antikörper zu dem genannten Antigen, wobei der genannte zweite Antikörper nicht gebunden und markiert ist; und

(c) einen zusätzlichen Antikörper ausgewählt aus dem nicht markierten, nicht gebundenen, ersten Antikörper, dem nicht markierten, nicht gebundenen, zweiten Antikörper, und Mischungen derselben.

18. Reagens nach Anspruch 17, worin der genannte zusätzliche Antikörper der nicht markierte, nicht gebundene, erste Antikörper oder der nicht markierte, nicht gebundene, zweite Antikörper ist.

19. Verfahren nach Anspruch 1, worin der genannte zusätzliche Antikörper ausgewählt wird aus einem nicht markierten, nicht gebundenen Äquivalent für den genannten ersten Antikörper, und einem nicht markierten, nicht gebundenen Äquivalent für den genannten zweiten Antikörper oder aus Mischungen der genannten nicht markierten, nicht gebundenen Äquivalenten.