DE69115518T2

DE69115518T2 - Verfahren zur Abtrennung und Messung von Spurbestandteilen

Info

Publication number: DE69115518T2
Application number: DE69115518T
Authority: DE
Inventors: Shuju Matuura; Kenji Nakamura; Shinji Satomura
Original assignee: Wako Pure Chemical Industries Ltd
Current assignee: Fujifilm Wako Pure Chemical Corp
Priority date: 1990-01-09
Filing date: 1991-01-02
Publication date: 1996-08-29
Anticipated expiration: 2011-01-03
Also published as: DE69115518D1; ES2080886T3; ATE131933T1; EP0441470B1; EP0441470A2; EP0441470A3; US5780247A; GR3018568T3; DK0441470T3

Description

Ausgangssituation

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zum Separieren und Messen von zwei oder mehreren zu messenden Analyten, die die gleiche Wirkung oder verschiedene Wirkungen trotz ihrer ähnlichen Strukturen haben, oder zum Sepaneren und Messen von zwei oder mehreren zu messenden Analyten, die die gleiche Wirkung und die gleiche detektierbare chemische Charakteristik haben, und zwar in Proben, die von lebenden Körpern genommen werden, wie beispielsweise Körperflüssigkeiten, z.B. Serum, Blut, Plasma und Urin, Lymphozyten, Hämozyten und verschiedenen Zellen, was auf der Grundlage der chemischen und/oder physikalischen Eigenschaften der Analyeen rascher und leichter mit hoher Präzision erfolgt.
Unter den Spurenkomponenten, die in den von lebenden Körpern genommenen Proben enthalten sind, gibt es Spurenkomponenten, die die gleiche Wirkung, jedoch unterschiedliche chemische und/oder physikalische Eigenschaften haben, sowie Spurenkomponenten, die ähnliche Strukturen, jedoch verschiedene Wirkungen haben. Die ersteren umfassen beispielsweise physiologisch wirksame Substanzen, wie z.B. Enzyme (rsoenzyme), die hinsichtlich der Struktur zu ihrem Proteinabschnitt oder Zuckerketten-Abschnitt verschieden sind, sowie Hormone, die hinsichtlich der Zuckerkettenstruktur verschieden sind. Letztere schließen beispielsweise ein: physiologisch wirksame Substanzen, Z.B. Steroidhormone und andere Hormone, z.B. Thyroidstimulierendes Hormon (TSH) ((Thyrotropin)), Follikelstimulierendes Hormon (FSH), Choriogonadotropin (HCG), usw. Es ist gut bekannt, daß eine klinisch wirksame Indikation erhalten werden kann, wenn die Mengen dieser Spurenkomponenten in einer Probe einzeln auf der Grundlage ihrer verschiedenen Eigenschaften separiert und gemessen werden können.
Als eine konventionelle Methode zum Separieren und Messen dieser Spurenkomponenten können elektrophoretische Methoden, Immunoassay-Methoden und Methoden unter Einsatz von Antikörper- oder Inhibition von enzymatischer Aktivität unter Verwendung eines Inhibitors als beispielhaft angegeben werden. Diese Methoden sind jedoch beispielsweise insofern von Nachteil, daß zur Messung eine lange Zeit benötigt wird und daß sie quantitativ nicht ausreichend sind. Aus diesem Grund sind sie nicht immer durchführbar.
Andererseits wurden als von diesen Problemen freie Methoden vorgeschlagen, bei denen Isozyme von Lactatdehydrogenase mit Hilfe der Hochdruckflüssigchromatographie (HPLC) unter Verwendung einer mit einer Füllung für Ionenaustauschchromatographie gepackten Säule separiert und gemessen werden (J. Chromatogr., 374, 45 ... 50 (1986) und J. Chromatogr., 378, 456... 461 (1986)). Diese Methoden sind jedoch beispielsweise insofern von Nachteil, daß Substanzen, die mit Hilfe der Methoden separiert und gemessen werden können, in gewissem Umfang begrenzt sind und daß die Meßbedingungen zur Trennung in Abhängigkeit von den zu messenden Analyten festgelegt werden müssen. Daher sind diese Methoden nicht immer die besten, und es wird versucht, diese weiter zu verbessern.

Zusammenfassung

Angesichts dieser Verhältnisse wurde die Erfindung gemacht, die ein Verfahren gewähren soll, mit dem das Separieren und Messen von zwei oder mehreren zu messenden Analyten ermöglichen soll, die trotz ihrer ähnlichen Strukturen gleiche oder verschiedene Wirkungen haben, oder von zwei oder mehreren zu messenden Analyten, die gleiche Wirkung und die gleiche detektierbare chemische Charakteristik haben, beispielsweise von lebenden Körpern genommene Proben, und zwar rasch und mühelos mit hoher Präzision auf der Grundlage chemischer und/oder physikalischer Eigenschaften der Analyten.
Die vorliegende Erfindung gewährt ein Verfahren zum Separieren und Messen, umfassend: Mischen einer Probe, die zwei oder mehrere zu messende Analyte enthält, die trotz ihrer ähnlichen Strukturen gleiche oder verschiedene Wirkungen haben (nachfolgend abgekürzt als "Analyte A") mit einer Substanz, die für alle Analyte A Affinität aufweist und selbst über eine mit irgendeiner Methode detektierbare Eigenschaft verfügt oder mit einer Substanz markiert wurde, die mit irgendeiner Methode detektierbar ist (nachfolgend abgekürzt als "Affinitätssubstanz α") und mit einer Substanz, die zu mindestens einem der Analyten A Affinität besitzt, sich jedoch nicht im geringsten an einen der anderen Analyten A bindet (nachfolgend abgekürzt als "Affinitätssubstanz β"); Umsetzen der Analyten A mit der Affinitätssubstanz α und der Affinitätssubstanz β; Separieren eines Komplexes von Analyt(en) A und der Affinitätssubstanz α (nachfolgend abgekürzt als "Komplex I"), eines Komplexes von Analyt(en) A, der Affinitätssubstanz α und der Affinitätssubstanz β (nachfolgend abgekürzt als "Komplex II") und freier Affinitätssubstanz α voneinander mit Hilfe einer Hochdruckflüssigchromatographie; Messen der Menge der Affinitätssubstanz α in dem Komplex I und/oder der Menge der Affinitätssubstanz α in dem Komplex II; und dadurch Messen der Menge eines beliebigen der Analyten A in der Probe (dieses Verfahren wird nachfolgend abgekürzt als "Verfahren 1").
Die vorliegende Erfindung gewährt ein Verfahren zum Separieren und Messen, umfassend das Mischen einer Probe, die zwei oder mehrere zu messende Analyte enthält, die gleiche Wirkungen und die gleiche detektierbare chemische Charakteristik haben (nachfolgend abgekürzt als "Analyte B") mit einer Substanz, die Affinität zu mindestens einem der Analyte B aufweist, sich jedoch nicht im geringsten an einen der anderen Analyten B bindet (nachfolgend abgekürzt als "Affinitätssubstanz γ"); Umsetzen der Analyten B mit der Affinitätssubstanz γ; Separieren eines Komplexes von Analyt(en) B und der Affinitätssubstanz γ (nachfolgend abgekilrzt als "Komplex III") von freien Analyt(en) B mit Hilfe einer Hochdruckflüssigchromatographie; Messen der Menge von Analyt(en) B in dem Komplex III und/oder der Menge von freien Analyt(en) B; und dadurch Messen der Menge eines beliebigen der Analyten B in der Probe (dieses Verfahren wird nachfolgend abgekürzt als "Verfahren 2").

Kurze Beschreibung der Zeichnungen

Es zeigen:
Fig. 1 eine in Beispiel 2 erhaltene Eichkurve;
Fig. 2 eine schematische Darstellung des Aufbaus eines HPLC-Systems, das in den Beispielen 1, 2, 3, 4, 5 und 6 und Vergleichsbeispiel 1 angewendet wurde;
Fig. 3 eine in Beispiel 4 erhaltene Eichkurve;
Fig. 4 und 5 Flußdiagramme zur Erläuterung des erfindungsgemäßen Verfahrens.

Beschreibung der bevorzugten Ausführungsformen

Das erfindungsgemäße Verfahren 1 wird beispielsweise entsprechend der Darstellung in Fig. 4 folgendermaßen ausgeführt.
Zunächst wird eine von einem lebenden Körper abgenommene Probe, die die Analyten A enthält, mit einer Affinitätssubstanz α und einer Affinitätssubstanz β umgesetzt, indem sie erforderlichenfalls in eine geeignete Pufferlösung gegeben und gemischt werden, um einen Komplex I und einen Komplex II zu bilden. Sodann werden der Komplex I, der Komplex II und die freie Affinitätssubstanz α voneinander mit Hilfe einer HPLC unter Verwendung einer mit einer vorbestimmten Füllung gepackten Spule separiert. Danach werden die Menge der Affinitätssubstanz α, die in dem separierten Komplex I enthalten ist, oder die Menge der Affinitätssubstanz α, die in dem separierten Komplex II enthalten ist, oder beide mit Hilfe eines für die Eigenschaften der Affinitätssubstanz α geeigneten Meßmethode bestimmt. Auf diese Weise kann die Menge jedes der Analyten A in der Probe gemessen werden.
Die Analyten A, die mit Hilfe des erfindungsgemäßen Verfahren 1 gemessen werden können, sind solange nicht kritisch, wie sie die folgenden Bedingungen (i) und (ii) erfüllen.
(i) Es gibt eine Substanz, die sich mit allen Analyten A in der Probe bindet und die selbst eine mit irgendeiner Methode detektierbare Eigenschaft aufweist oder mit einer Substanz markiert werden kann, die mit irgendeiner Methode detektiert werden kann (nachfolgend abgekürzt als "detektierbare Substanz").
(ii) Es gibt eine Substanz, die einen stabilen Komplex mit mindestens einem der Analyten A über eine hohe Affinität zwischen der Substanz und dem/den Analyt(en) A binden kann, sich jedoch nicht im geringsten an einen der anderen Analyten A bindet. Typische Beispiele für die Analyten A sind: Enzyme, pilysiologisch wirksame Substanzen, tumorassozuerte Antigene, Substanzen mit einer Zuckerkette, usw., die in den von lebenden Körpern genommenen Proben enthalten sind, beispielsweise von Körperflüssigkeiten, z.B. Serum, Blut, Plasma, Urin u.dgl., Lymphozyten, Hämozyten und verschiedenen Zellen. Speziellere Beispiele für die Analyten A sind vorzugsweise Enzyme, wie beispielsweise: Amylase, alkalische Phosphatase, saure Phosphatase, γ-Glutamyl- Transferase (γ-GTP), Lipase, Kreatinkinase (CK), Lactatdehydrogenase (LDH), Glutamat-Oxalacetat-Transaminase (GOT), Glutamat-Pyruvat-Transaminase (GPT), Renin, Proteinkinasen, Tyrosinkinasen, u.dgl.; physiologisch wirksame Substanzen, wie beispielsweise Steroidhormone, Human-Choriogonadotropin (HCG), Prolactin, Thyroidstimulierendes Hormon (TSH), Lutropin ((luteinisierendes Hormon)) (LH), u.dgl.; sowie tumorassozuerte Antigene, wie beispielsweise Prostaglandin spezifisches Antigen (PSA), α&sub2;-Makroglobulin, karzinoembryonisches Antigen (CEA), α-Fetoprotein, u.dgl.
Die in dem erfindungsgemäßen Verfahren 1 verwendete Affinitätssubstanz α ist solange nicht kritisch, wie sie sich alle Analyte A bindet und selbst eine nach irgendeiner Methode detektierbare Eigenschaft aufweist oder mit einer detektierbaren Substanz markiert worden ist. Spezielle Beispiele einer Substanz mit Affinität für alle die Analyte A, die als die Affinitätssubstanz α oder zur Herstellung der Affinitätssubstanz α verwendet werden kann, sind Antikörper gegen spezielle Teilstrukturen oder Antigen-Determinanten von Substanzen mit Antigenwirkung (einschließend Haptene); Lektine mit Affinität für Zuckerketten mit einer speziellen Struktur, wie beispielsweise Concanavalin A, Lens culinaris lectin, Phaseolus vulgaris lectin, Datura stramonium agglutinin lectin, Aleuria aurantia lectin, Ricinus communis lectin, Arachis hypogaea lectin, Triticum vulgaris lectin, u.dgl.; sowie Inhibitoren für Enzyme, wie beispielsweise Amylase, Kreatinkinase (CK), Glutamat-Oxalacetat-Transaminase (GOT) u.dgl. Bevorzugte spezielle Beispiele für die Affinitätssubstanz α sind markierte Produkte, die durch Markieren dieser Substanzen mit einer detektierbaren Substanz erhalten werden. Die detektierbare Substanz umfaßt beispielsweise Enzyme, wie beispielsweise alkalische Phosphatasen, β-Galactosidase, Peroxidase, Mikroperoxidase, Glucoseoxidase, Glucose-6-Phospaht-dehydrogenase, Malatdehydrogenase, Luciferase, usw., die beispielsweise im Enzymimmunoassay (ELA) verwendet werden; Radioisotope, wie beispielsweise &sup9;&sup9;mTc, ¹³¹I, ¹²&sup5;I, ¹&sup4;C, ³H usw., die beispielsweise im Radioimmunoassay (RIA) verwendet werden; Substanzen die Fluoreszenz aussenden, wie beispielsweise Fluorescein, Dansyl-Rest, Fluorescamin, Cumarin, Naphthylamin, deren Derivate, usw., die beispielsweise im Fluoroimmunoassay (FIA) verwendet werden; lumineszierende Substanzen, wie beispielsweise Luciferin, Isoluminol, Luminol, Bis(2,4,6- trifluorphenyl)oxalat, usw.; Substanzen, die ultraviolettes Licht absorbieren können, wie beispielsweise Phenol, Naphthol, Anthracen, deren Derivate, usw.; sowie Substanzen mit Spin-Eigenschaften, die durch Verbindungen mit einer Oxyl-Gruppe repräsentiert werden, wie beispielsweise 4- Amino-2,2,6,6-tetramethylpiperidin-1-oxyl, 3-Amino-2,2,5,5- tetramethylpyrrolidin-1-oxyl, 2,6-Di-tert-butyl-α (3,5-Ditert-4-oxo-2,5-cyclohexadien-1-yliden)-p-tolyloxyl, usw. Es muß nicht darauf hingewiesen werden, daß detektierbare Substanzen auf diese Substanzen nicht beschränkt sind.
Als eine Methode zur Herstellung der Affinitätssubstanz α durch Markieren der vorstehend als Beispiel aufgeführten Substanzen mit der vorstehend als Beispiel aufgeführten detektierbaren Substanz können alle konventionellen Methoden zum Markieren exemplifiziert werden, die normalerweise Z.B. eingesetzt werden in den konventionellen EIA, RIA und FIA (Z.B. Yuichi Yamamura "Ikagaku Jikken Koza, Bd. 8", l. Ausg., NAKAYAMA-SHOTEN Ltd., 1971; Akira Kawao "Zusetsu Keito Kotai", l. Ausg., Soft Scienoe Inc., 1983, und Eiji Ishikawa, Tadashi Kawai und Kiyoshi Miyai "Koso Men-eki Sokuteiho", 2. Ausg., IGAKU-SHOIN Ltd., 1982). Die Herstellung kann nach diesen Methoden ausgeführt werden. Es muß nicht darauf hingewiesen werden, daß als eine Methode zum Markieren eine konventionelle Methode unter Einsatz der Reaktion von Avidin (oder Streptoavidin) mit Biotin verwendet werden kann.
Als die im erfindungsgemäßen Verfahren 1 verwendete Affinitätssubstanz α können außer den auf diese Weise mit den detektierbaren Substanzen markierten Substanzen solche Substanzen exemplifiziert werden, die selbst eine durch irgendeine Methode detektierbare Eigenschaft aufweisen. Als die durch irgendeine Methode detektierbare Eigenschaft der Affinitätssubstanz α, die in dem erfindungsgemäßen Verfahren verwendet wird, können Enzymaktivitäten exemplifiziert werden, Eigenschaften der Fluoreszenzemission, Eigenschaften der Lumineszenzemission und Eigenschaften des Absorbierens von ultraviolettem Licht.
Die in dem erfindungsgemäßen Verfahren 1 verwendete Affinitätssubstanz β ist solange nicht kritisch, wie sie einen stabilen Komplex mit mindestens einem der Analyten A über eine hohe Affinität zwischen der Affinitätssubstanz β und dem/den Analyt(en) A bildet, sich jedoch nicht im geringsten an einem der anderen Analyten A bindet. Bevorzugte spezielle Beispiele der Affinitätssubstanz β sind spezifische Antikörper gegen spezielle Teilstrukturen oder Antigen-Determinanten von Substanzen mit Antigen-Wirkung (einschließend Haptene); Lektine mit Affinität für Zuckerketten mit einer speziellen Struktur, wie beispielsweise Concanavalin A, Lens culinaris lectin, Phaseolus vulgaris lectin, Datura stramonium agglutinin lectin, Aleuria aurantia lectin, Ricinus communis lectin, Arachis hypogaea lectin, Triticum vulgaris lectin, u.dgl.; sowie spezielle Inhibitoren für Amylase, Kreatinkinase (CK), Glutamat-Oxalacetat-Transaminase (GOT) u.dgl.
Sofern erforderlich, kann die Affinitätssubstanz β mit der vorstehend für die Affinitätssubstanz α beschriebenen detektierbaren Substanz mit Hilfe der vorstehend exemplifizierten Methoden markiert werden. In diesem Fall, wenn die Affinitätssubstanz mit der gleichen detektierbaren Substanz markiert worden ist wie die Affinitätssubstanz α, wird die Nachweisempfindlichkeit für den Komplex II erhöht und resultiert zu einer leichteren Detektion. Wenn jedoch das erfindungsgemäße Verfahren 1 durch Verwendung der markierten Affinitätssubstanz β ausgeführt wird, sollte die freie Affinitätssubstanz β selbstverständlich von dem Komplex I und dem Komplex II mit Hilfe der HPLC abtrennbar sein.
Speziellere Beispiele von Kombinationen der vorgenannten Analyten A und Affinitätssubstanzen α und β sind in Tabelle 1 dargestellt. Tabelle 1 Analyt A Affinitätssubst. α Affinitätssubst. β Substanz mit Antigen-Wrkg. (einschl. Haptene) Zuckerketten Inhibitoren Proteasen Antikörper Nucleinsäuren Antikörper Lektine Proteasen Inhibitoren Antigen gegen Antikörper als Analyte komplementäre Polynucleotide Antikörper oder Lektine Antikörper oder komplementäre Polynucleotide
Das erfindungsgemäße Verfahren 1, die Reaktionsbedingungen für das Reagieren der Analyte A mit der Affinitätssubstanz α und der Affinitätssubstanz β zur Bildung des Komplexes I und des Komplexes II sind solange nicht kritisch, wie die Reaktionsbedingungen weder die Bildung des Komplexes I und des Komplexes II inhibieren noch die Eigenschaften der Analyte A, der Affinitätssubstanz α und der Affinitätssubstanz β verändern. Die Reaktion wird in der Regel unter Reaktionsbedingungen ausgeführt, wie sie zur Bildung eines Komplexes o.dgl. in einer konventionellen Methode eingesetzt werden, beispielsweise EIA, RIA, FIA oder Affinitätschromatographie. Wenn beispielsweise eine Pufferlösung in der Reaktion verwendet wird, können als Puffer oder andere Reagenzien ohne weiteres die in den vorgenannten konventionellen Methoden aufgeführten ausgewählt werden.
In dem erfindungsgemäßen Verfahren 1 sind die Konzentrationen der zum Bilden des Komplexes I und des Komplexes II verwendeten Affinitätssubstanz α und Affinitätssubstanz β nicht kritisch und können entsprechend in Abhängigkeit von den Werten festgelegt werden, bei denen die Meßgrenze der Analyte A bzw. die Meßempfindlichkeit für die Analyte A angesetzt werden. Als die jeweilige Affinitätssubstanz α und die Affinitätssubstanz β ist der Einsatz einer der Substanzen in der Regel ausreichend, obgleich erforderlichenfalls eine Kombination von zwei oder mehreren Substanzen verwendet werden kann. In diesem Fall, wenn beispielsweise eine Kombination von zwei oder mehreren Affinitätssubstanzen α eingesetzt wird, die an verschiedenen Stellen an den Analyten A anbinden, bzw. zwei oder mehrere Affinitätssubstanzen β, die an verschiedenen Stellen an zusätzlichem/zusätzlichen Analyt(en) A anbinden, werden die Molmassen des Komplexes I bzw. des Komplexes II demzufolge erhöht und in einigen Fällen auch ihre isoelektrischen Punkte variiert. Daher wird das Separieren des Komplexes I, des Komplexes II und der freien Affinitätssubstanz α leichter, so daß die Genauigkeit der Messung verbessert werden kann. Im Fall von beispielsweise Analyten A, die in Form einer Mischung von X, Y und Z vorliegen, macht eine kombinierte Verwendung von beispielsweise einer Affinitätssubstanz β für X und eine Affinitätssubstanz β für Y möglich, X, Y und Z gleichzeitig zu separieren und zu messen.
obgleich in dem erfindungsgemäßen Verfahren 1 der pH- Wert in der Reaktion nicht kritisch ist, solange er die Bildung des Komplexes I und des Komplexes II nicht verzögert, beträgt er in der Regel 2 bis 10, vorzugsweise 5 bis 9. obgleich die Reaktionstemperatur ebenfalls nicht kritisch ist, solange sie die Bildung des Komplexes I und des Komplexes II nicht verzögert, beträgt sie in der Regel 0 ºC ... 70 ºC, vorzugsweise 20 ºC ... 40 ºC. Hinsichtlich der Reaktionszeit kann die Reaktion, da die für die Bildung des Komplexes I und des Komplexes II erforderliche Zeit von den Anteilen der Analyte A, der Affinitätssubstanz α und der Affinitätssubstanz β abhängt, ohne weiteres je nach deren Eigenschaften über mehrere Sekunden bis zu mehreren Stunden ausgeführt werden.
Bei der zum Trennen des Komplexes I, des Komplexes II und der freien Affinitätssubstanz α im erfindungsgemäßen Verfahren 1 eingesetzten HPLC kann solange ohne irgendein spezielles Problem jede beliebige Apparatur eingesetzt werden, wie sie auf dem Gebiet der Analyse verwendet wird und eine konstante Durchflaufrate hat. Es muß jedoch nicht darauf hingewiesen werden, daß als in einer Trennspule verwendete Füllung je nach der Verschiedenheit der Eigenschaften zwischen Komplex I, Komplex II und der freien Affinitätssubstanz α zahlreiche Füllungen entsprechend ausgewählt werden können. Wenn beispielsweise die Molmasse des Komplexes II etwa das 1,2-fache oder mehr, vorzugsweise das 1,5-fache oder mehr, mehr bevorzugt das 2-fache oder mehr, der Molmasse des Komplexes I ist und die Molmasse des Komplexes I etwa das 1,2-fache oder mehr, vorzugsweise 1,5- fache oder mehr und mehr bevorzugt das 2-fache der Molmasse der freien Affinitätssubstanz α ist, sind Füllungen für Gelf iltration (Gelchromatographie) geeignet. Wenn die isoelektrischen Punkte von Komplex I, Komplex II und der freien Affinitätssubstanz α voneinander verschieden sind und die jeweilige Differenz zwischen den isoelektrischen Punkten 0,05 oder mehr, vorzugsweise 0,2 oder mehr, beträgt, sind Füllungen für Ionenaustauschchromatographie oder isoelektrische Fokussierung geeignet. Wenn der Komplex I, der Komplex II und die freie Affinitätssubstanz α hinsichtlich der Hydrophobie eindeutig voneinander verschieden sind, sind Füllungen für hydrophobe Chromatographie oder Umkehrphasenchromatographie, Hydroxylapatit, o.dgl. geeignet.
Ein Lösemittel (ein Elutionsmittel), das zum Trennen des Komplexes I, des Komplexes II und der freien Affinitätssubstanz α mit Hilfe der HPLC verwendet wird, ist solange nicht kritisch wie der Analyt A aus den gebildeten Komplexen I und II weder dissoziiert, noch von der in dem Komplex I und dem Komplex II enthaltenen Affinitätssubstanz α durch irgendeine Methode detektierbare Eigenschaft wegnimmt oder von der detektierbaren Substanz der Affinitätssubstanz α wegnimmt. In der Regel wird als das Lösemittel bevorzugt irgendeine der Pufferlösungen verwendet, die in konventionellen Methoden eingesetzt werden, wie beispielsweise der EIA, RIA, FIA, Affinitätschromatographie, usw. Bevorzugte spezielle Beispiele für das Lösemittel sind Pufferlösungen mit einem pH-Wert von 2 bis 10, die durch geeignete Wahl in Abhängigkeit von den Eigenschaften des Komplexes I, des Komplexes II und der freien Affinitätssubstanz α hergestellt werden, und zwar die folgenden Materialien, gefolgt durch Zusetzen und Mischen: beispielsweise Puffer, wie Phosphate, Acetate, Citrate, Good-Puffer, Tris(hydroxymethyl)-aminomethan u.dgl.; Salze wie Natriumchlorid, Kaliumchlorid, Ammoniumsulfat u.dgl.; organische Lösemittel, wie beispielsweise Methanol, Ethanol, Isopropanol, Acetonitril, Tetrahydrofuran, u.dgl.; sowie Tenside.
In dem erfindungsgemäßen Verfahren 1 wird die Menge der in den jeweiligen Komplexen I und II enthaltenden Affinitätssubstanz α, separiert mit Hilfe der HPLC, nach einer vorbestimmten Methode auf der Grundlage der nach irgendeiner Methode detektierbaren Eigenschaft der Affinitätssubstanz α, oder die detektierbare Substanz der Affinitätssubstanz α geitessen. Wenn diese Eigenschaft beispielsweise eine Enzymaktivität ist, wird die Messung nach einer konventionellen Methode der EIA ausgeführt, beispielsweise der Methode, die beschrieben wurde von Tsunehiro Kitagawa, Toshio Naabara, Akio Tsuji und Eiji Ishikawa "Koso Men-eki Sokuteibo", Extraausgabe Nr. 31 der Tanpakushitsu Kaausan Koso, Seiten 51 ... 63, KVORITSU-SHUPPAN Ltd., veröffentlicht am 10. September 1987, usw. Wenn es sich bei der detektierbaren Substanz um ein Radioisotop handelt, wird die Messung nach einer konventionellen Methode der RIA durch geeignete Wahl und Verwendung eines Meßgerätes ausgeführt, wie beispielsweise einem Geiger-Müller-Zählrohr, Flüssigszintillationszähler, Zählrohr mit Probenkanal, Zähler für HPLC o.dgl., und zwar abhängig von der Art und der Intensität einer von dem Radioisotop emittierten Strahlung (siehe beispielsweise Yuichi Yamairiura "Ikagaku Jieeen Koza", Bd. 8, 1. Ausg., NAKAYAMA- SHOTEN Ltd., 1971). Wenn es sich bei dieser Eigenschaft um Eigenschaften der Fluoreszenzemission handelt, wird die Messung nach einer konventionellen Methode der FIA unter Anwendung eines Meßgerätes ausgeführt, wie beispielsweise ein Fluorometer, z.B. nach der beschriebenen Methode von Akira Katano "Zusetsu Keikokoaai", 1. Ausg., Soft Science, Inc., 1983, usw. Wenn es sich bei der Eigenschaft um Eigenschaften der Lumineszenzemision handelt, wird die Messung nach einer konventionellen Methode unter Einsatz eines Meßinstrumentes ausgeführt, wie beispielsweise einem Lichtquantenzähler, z.B. die beschriebene Methode von Tsunehiro Kitagawa, Toshio Nanbara, Akio Tsuji und Eiji und Eiji Ishikawa "Koso Men-eki Sokuteiho", Extraausgabe Nr.31 der Tanpaaushitsu Kakusan Koso, S.252 263, KYORITSU-SHUPPAN Ltd., veröffentlicht am 10. September 1987, usw. Wenn es sich bei der Eigenschaft um Eigenschaften der Emission von ultraviolettem Licht handelt, wird die Messung mit Hilfe einer konventionellen Methode unter Einsatz eines Meßgerätes ausgeführt, wie beispielsweise einem Spektrophotometer. Wenn die detektierbare Substanz eine Substanz mit Spin-Eigenschaften ist, wird die Messung entsprechend einer konventionellen Methode unter Einsatz einer Elektronenspinresonanz-Apparatur ausgeführt, wie beispielsweise die beschriebene Methode von Tsunehiro Kitagawa, Toshio Nanbara, Akio Tsuji und Eiji Ishikawa "Koso Men-eki Sokuteiho", eine Extraausgabe Nr. 31 von Tanpakushitsu Kakusan Koso, S. 264 ... 271, KYORITSU-SHUPPAN Ltd., veröffentlicht am 10. September 1987, usw.
Für die Messung nach der HPLC-Trennung wird in dem erfindungsgemäßen Verfahren 1 vorzugsweise die Methode eingesetzt, umfassend das Einführen eines Ablaufs aus einer HPLC-Säule unbehandelt in eine Detektiersektion und direktes Messen der Menge der Affinitätssubstanz α, die im jeweiligen Komplex I und Komplex II in dem Ablauf enthalten ist, wie beispielsweise die beschriebene Methode von Shoji Hara und Akio Tsuji "Newest Liquid Chrottatography", 1. Ausg., S. 92 ... 104, NANZANDO Ltd., veröffentlicht am 1. Februar 1978. Der Grund dafür besteht bei dieser Methode in der möglichen schnellen Messung. In diesem Fall, wenn es sich bei der nach irgendeiner Methode detektierbaren Eigenschaft der Affinitätssubstanz α oder der detektierbaren Substanz der Affinitätssubstanz α beispielsweise um eine Enzymaktivität handelt, sollte selbstverständlich zwischen der HPLC-Säule und der Detektiersektion eine Reaktionssektion nach der sogenannten säulennachgeschalteten Methode vorgesehen werden. Als das Reagens zum Messen der Enzymaktivität, das in der Reaktionssektion verwendet wird, wenn es sich bei der Eigenschaft der Affinitätssubstanz α oder der detektierbaren Substanz um die Enzymaktivität handelt, kann ein nach einer konventionellen Methode hergestelltes Reagens verwendet werden, beispielsweise nach einer Methode auf der Grundlage der Aussagen von Tsunehiro Kitagawa, Toshio Nabara, Akio Tsuji und Eiji Ishikawa "KOSO Men-eki Sokuteibo", Extraausgabe Nr. 31 der Tanpakushitsu Kakusan Koso, S. 51 ... 63, KYORITSU-SHUPPAN Ltd., veröffentlicht am 10. September 1987, oder es kann eine Reagens eines kommerziell verfügbaren Analysensatzes für die klinische Untersuchung in geeigneter Weise gewählt und eingesetzt werden. Wenn es sich darüber hinaus bei der Eigenschaft der Affinitätssubstanz α oder der detektierbaren Substanz um eine andere als die Enzymaktivität handelt, kann eine Reaktionssektion zwischen der HPLC-Säule und der Detektiersektion verwendet werden, um ein vorbestimmtes Reagens zum Zwecke der Verbesserung der Nachweisempfindlichkeit zuzusetzen und reagieren zu lassen. Wenn die Affinitätssubstanz β mit der gleichen detektierbaren Substanz wie die Affinitätssubstanz α markiert ist, kann die Menge der Affinitätssubstanz β in dem Komplex II selbstverständlich auch durch Messen der Menge der Affinitätssubstanz α in dem jeweiligen Komplex bestimmt werden.
Wenn ein Antikörper oder (mehrere) Antikörper als die Substanz mit Affinität zu allen Analyten A verwendet wird, die als die Affinitätssubstanz α oder zur Herstellung der Affinitätssubstanz α und/oder der Affinitätssubstanz β eingesetzt werden, ist in dem erfindungsgemäßen Verfahren 1 auch die Verwendung des Antikörpers oder der Antikörper nach geeignetem Abbau mit einem Enzym, wie beispielsweise Pepsin oder Papain zu F (ab')&sub2;, Fab' oder Fab je nach den Aufgaben möglich. Insbesondere ist der Abbau zu Fab' insofern vorteilhaft, daß Fab' leicht mit einer detektierbaren Substanz markiert werden kann. Wenn der Antikörper oder die Antikörper in der Form von Fab' oder Fab verwendet werden, können die Affinitätssubstanz α oder die Affinitätssubstanz β oder beide an Analyt(en) A gebunden werden, zu denen die jeweilige Affinitätssubstanz Affinität besitzt, und zwar zu einem Anteil von 1 Molekül pro Molekül des/der Analyt(en) A (oder in einem Anteil von 1 Molekül pro Molekül Monomer für den Fall, daß der/die Analyt(en) A ein Dimer, ein Trimer o.dgl. ist/sind> , so daß die Retentionszeit des Komplexes I und des Komplexes II in der HPLC weitgehend konstant ist.
Der Einsatz von Fab' oder Fab wird daher bevorzugt. Auch in dem Fall der Verwendung eines monoklonalen Antikörpers oder Antikörper mit der Eigenschaft, sich lediglich an einem Epitop zu binden, können der oder die monoklonalen Antikörper an Analyt(en) A in einem Anteil von 1 Molekül pro Molekül des/der Analyt(en) A gebunden werden (oder in einem Anteil von 1 Molekül pro Molekül Monomer für den Fall, daß es sich bei dem/den Analyt(en) A um eine Dimer, Trimer o.dgl. handelt), so daß die Retentionszeit des Komplexes I und des Komplexes II in der HPLC weitgehend konstant wird. Daher wird der Einsatz des monoklonalen Antikörpers oder der monoklonalen Antikörper bevorzugt. Es muß nicht darauf hingewiesen werden, daß auch in diesem Fall nach dem Abbau zu Fab' oder Fab ein oder mehrere monoklonale Antikörper verwendet werden können.
Als der oder die Antikörper, die als die Substanz mit Affinität zu allen Analyten A eingesetzt werden, die als die Affinitätssubstanz α verwendet werden oder zur Herstellung der Affinitätssubstanz α und/oder der Affinitätssubstanz β, können in dem erfindungsgemäßen Verfahren 1 verwendet werden: entweder polyklonale Antikörper, die durch Immunisieren von Tieren hergestellt werden, wie beispielsweise Pferd, Rind, Schaf, Kaninchen, Ziege, Ratte, Maus usw., und zwar mit Analyt(en) A gemäß einer konventionellen Methode, beispielsweise der beschriebenen Methode von Tadashi Matsuhashi et al. "Men-ekigaku Jikken Nyumon", 2. Ausg., GAKKAI-SHUPPAN CENTER Ltd., 1981, usw.; oder monoklonale Antikörper, die durch Hybridomas erzeugt werden, welche durch Verschmelzen von Zellen aus eine Tumorlinie von Maus mit Maus-Milzzellen erhalten wurden, die zuvor mit Analyt(en) A nach der konventionellen Methode immunisiert wurden, d.h. der Zellfusionsmethode nach G. Köhler und C. Milstein (Nature, 256, 495, 1975). Diese polyklonalen und/oder monoklonalen Antikörper können einzeln oder in geeigneter Kombination von zwei oder mehreren davon verwendet werden.
Das erfindungsgemäße Verfahren 2 wird beispielsweise entsprechend der Darstellung in Fig. 5 ausgeführt.
Zunächst wird eine von einem lebenden Körper genommene Probe, die Analyte B enthält, mit einer Affinitätssubstanz γ erforderlichenfalls durch ihre Zugabe und durch Mischen in eine geeignete Pufferlösung umgesetzt, um einen Komplex III zu bilden. Der Komplex III wird sodann von dem/den Analyt(en) B durch HPLC unter Verwendung einer mit einer vorbestimmten Füllung gepackten Säule separiert. Danach wird die Menge des/der Analyt(e) B, die in dem abgetrennten Komplex III enthalten ist, oder die Menge des/der freien Analyten B, oder beide, mit Hilfe einer für die Eigenschaften der Analyten B geeigneten Methode bestimmt. Auf diese Weise kann die Menge eines beliebigen der Analyten B in der Probe bestimmt werden.
Die Analyten B, die mit Hilfe des erfindungsgemäßen Verfahrens 2 gemessen werden können, sind solange nicht kritisch, wie sie an sich nach irgendeiner Methode meßbar (detektierbar) sind und es eine Affinitätssubstanz γ gibt, d.h. eine Substanz, die einen stabilen Komplex mit mindestens einem der Analyten B über eine hohe Affinität zwischen der Substanz und dem/den Analyt(en) B bilden kann, sich jedoch nicht im geringsten an einen der anderen Analyten B binden. Typische Beispiele für die Analyten B sind Enzyme u.dgl., die in dem von lebenden Körpern genommenen Proben enthalten sind, beispielsweise Körperflüssigkeiten, wie Serum, Blut, Plasma, Urin u.dgl., Lymphozyten, Hämozyten und verschiedene Zellen. Speziellere Beispiele für die Analyten B sind Enzyme, wie beispielsweise Amylase, alkalische Phosphatase, saure Phosphatase, γ- Glutamyl-Transferase (γ-GTP), Lipase, Kreatinkinase (CK), Lactatdehydrogenase (LDH), Glutamat-Oxalacetat-Transaminase (GOT), Glutamat-Pyruvat-Transaminase (GPT), Renin, Proteinkinasen (PK), Tyrosinkinase u.dgl.
Die Affinitätssubstanz γ für die Analyten B, die in dem erfindungsgemäßen Verfahren 2 ist solange nicht kritisch, wie sie einen stabilen Komplex mit mindestens einem der Analyte über eine hohe Affinität zwischen der Affinitätssubstanz γ und dem/den Analyt(en) B bilden kann, sich jedoch nicht im geringsten mit einem der anderen Analyten B bindet. Die Affinitätssubstanz γ schließt beispielsweise ein: Antikörper gegen spezifische Teilstrukturen oder Antigen-Determinanten von Substanzen mit Antigenwirkung (einschließend Haptene); Lektine mit Affinität zu Zuckerketten mit einer spezifischen Struktur, wie beispielsweise Concanavalin A, Lens culinaris lectin, Phaseolus vulgaris lectin, Datura stramonium agglutinin lectin, Aleuria aurantia lectin, Ricinus communis lectin, Arachis hypogaea lectin, Triticum vulgaris lectin, u.dgl.; sowie Inhibitoren für Enzyme, wie beispielsweise Amylase, Kreatinkinase (CK), Glutamat-Oxalacetat-Transaminase (GOT) u.dgl.
Als die detektierbare chemische Charakteristik der Analyte B in dem Verfahren 2 können exemplifiziert werden: Enzymaktivitäten, Eigenschaften der Fluoreszenzemission, Eigenschaften der Lumineszenzemission und Eigenschaften des Absorbierens von ultraviolettem Licht.
Speziellere Beispiele für Kombinationen der vorgenannten Analyte B und der Affinitätssubstanz γ sind in Tabelle 2 dargestellt. Tabelle 2 Analyt B Affinitätssubstanz γ Enzyme Antikörper Lektine Inhibitoren
In dem erfindungsgemäßen Verfahren 2 sind die Reaktionsbedingungen für das Umsetzen des/der Analyt(e) B mit der Affinitätssubstanz γ zur Bildung des Komplexes III solange nicht kritisch, wie die Reaktionsbedingungen die Eigenschaften der Analyte B und der Affinitätssubstanz γ nicht verändern. Die Reaktion wird in der Regel unter Reaktionsbedingungen ausgeführt, wie sie zur Bildung eines Komplexes o.dgl. in einer konventionellen Methode eingesetzt werden, z.B. EIA, RIA, FIA oder Affinitätschromatographie. Wenn beispielsweise in der Reaktion eine Pufferlösung eingesetzt wird, können als die Puffer und anderen Reagenzien ohne weiteres die in den vorgenannten konventionellen Methoden eingesetzten gewählt werden.
In dem erfindungsgemäßen Verfahren 2 ist die Konzentration der zur Bildung des Komplexes III verwendeten Affinitätssubstanz γ nicht kritisch und kann in geeigneter Weise in Abhängigkeit von den Werten festgelegt werden, bei denen die Meßgrenze der Analyte B bzw. die Meßempfindlichkeit für die Analyte B angesetzt werden. Für die Affinitätssubstanz γ ist der Einsatz von (nur) einer Substanz in der Regel ausreichend, obgleich erforderlichenfalls eine Kombination von zwei oder mehreren Substanzen eingesetzt werden kann. In diesem Fall wird bei Einsatz einer Kombination von zwei oder mehreren Affinitätssubstanzen γ, die an verschiedenen Stellen anbinden, bzw. an zusätzlichem/zusätzlichen Analyt(en) B, die Molmasse des resultierenden Komplexes III dementsprechend erhöht und in einigen Fällen auch sein isoelektrischer Punkt verändert. Damit wird die Trennung des Komplexes III von freiem/freien Analyt(en) B leichter, so daß die Präzision der Messung verbessert werden kann. Darüber hinaus ermöglicht für den Fall, daß beispielsweise die Analyten B in Form einer Mischung von X', Y' und Z' vorliegen, die kombinierte Verwendung einer beispielsweise Affinitätssubstanz γ für X' und eine Affinitätssubstanz γ für Y' die gleichzeitige Trennung und Messung von X', Y' und Z'.
Obgleich der pH-Wert der Reaktion in dem erfindungsgemäßen Verfahren 2 solange nicht kritisch ist, wie er die Bildung des Komplexes III nicht verzögert, beträgt er in der Regel 2 bis 10, vorzugsweise 5 bis 9. Obgleich die Temperatur bei der Reaktion ebenfalls solange nicht kritisch ist, wie sie die Bildung des Komplexes III nicht verzögert, beträgt sie in der Regel 0ºC ... 50 ºC, vorzugsweise 20 ºC ... 40 ºC. Da im Zusammenhang mit der Reaktionszeit die für die Bildung des Komplexes III erforderliche Zeit von den Eigenschaften der Analyten B und der Affinitätssubstanz γ abhängt, kann die Reaktion über mehrere Sekunden bis zu mehreren Stunden in Abhängigkeit von deren Eigenschaften ausgeführt werden.
In der zum Separieren des Kaiplexes III von freiem/freien Analyt(en) B in dem erfindungsgemäßen Verfahren 2 eingesetzte HPLC kann problemlos jede beliebige Apparatur eingesetzt werden, soweit sie üblicherweise auf dem Gebiet der Analyse zur Anwendung kommt und eine konstante Durchflaufrate hat. Es muß nicht darauf hingewiesen werden, daß als in einer Trennsäule verwendete Füllung je nach der Verschiedenheit der Eigenschaften zwischen Komplex III und freien Analyten B zahlreiche Füllungen entsprechend ausgewählt werden können. Wenn beispielsweise die Molmasse des Komplexes III etwa das 1,2-fache oder mehr, vorzugsweise 1,5-fache oder mehr, mehr bevorzugt das 2-fache oder mehr, der Molmasse des/der freien Analyten B beträgt, sind Füllungen für die Gelfiltration (Gelchromatographie) geeignet. Wenn die Differenz zwischen den Isoelektrischen Punkten des Komplexes III und des/der freien Analyten B 0,05 oder mehr beträgt, vorzugsweise 0,2 oder mehr, sind Füllungen für Ionenaustauschchromatographie oder isoelektrische Fokussierung geeignet. Wenn der Komplex III und der freie Analyt/die freien Analyten B hinsichtlich der Hydrophobie wesentlich voneinander verschieden sind, sind Füllungen für hydrophobe Chromatographie oder Umkehrphasenchromatographie oder Hydroxylapatit geeignet.
Ein zum Separieren des Komplexes III von dem freien Analyt bzw. den freien Analyten B verwendetes Lösemittel (ein Elutionsmittel) ist solange nicht kritisch, wie weder der Analyt A aus den gebildeten Komplexen III dissoziiert, noch von der in dem Komplex III enthaltenen Analyten B eine durch irgendeine Methode detektierbarer Eigenschaft wegnimmt oder von der detektierbaren Substanz der Affinitätssubstanz α wegnimmt. In der Regel wird als das Lösemittel bevorzugt irgendeine der Pufferlösungen verwendet, die in konventionellen Methoden eingesetzt werden, wie beispielsweise der EIA, RIA, FIA, Affinitätschromatographie, usw. Bevorzugte spezielle Beispiele für das Lösemittel sind Pufferlösungen mit einem pH-Wert von 2 bis 10, die durch geeignete Wahl in Abhängigkeit von den Eigenschaften des Komplexes III und dem/den freien Analyt(en) B hergestellt werden, und zwar die folgenden Materialien, gefolgt durch Zusetzen und Mischen: beispielsweise Puffer, wie Phosphate, Acetate, Citrate, Good-Puffer, Tris(hydroxymethyl)-aminomethan u.dgl.; Salze wie Natriumchlorid, Kaliumchlorid, Ammoniumsulfat u.dgl.; organische Lösemittel, wie beispielsweise Methanol, Ethanol, Isopropanol, Acetonitril, Tetrahydrofuran, u.dgl.; sowie Tenside.
In dem erfindungsgemäßen Verfahren 2 wird/werden der/die Analyt(e) B, die in dem durch HPLC abgetrennten Komplex III enthalten sind oder der freie Analyt/die freien Analyte B in Abhängigkeit von der Art der detektierbaren chemischen Charakteristik der Analyte B nach einer vorbestimmten Methode gemessen. Wenn die Analyten B beispielsweise Enzyme sind, wird die Messung nach einer konventionellen Methode der EIA ausgeführt, beispielsweise die beschriebene Methode von Tsunehiro Kitagawa, Toshio Nanbara, Akio Tsuji und Eiji Ishkkawa "Koso Men-eki Sokuteiho", eine Extraausgabe Nr. 31 der Tanpakushitsu Kakusan Koso, Seiten 51 ... 63, KYORITSU-SHUPPAN Ltd., veröffentlicht am 10. September 1987, usw. Wenn die Analyten B Substanzen sind, die Fluoreszenz aussenden können, wird die Messung nach einer konventionellen Methode der FIA unter Verwendung eines Meßgerätes ausgeführt, wie beispielsweise einem Fluorometer, z.B. nach der beschriebenen Methode von Akira Kawao, "Zusetsu Keikokotai", 1. Ausg., Soft Science Inc., 1983, usw. Wenn die Analyten B lumineszierende Substanzen sind, wird die Messung nach einer konventionellen Methode unter Verwendung eines Meßgerätes ausgeführt, wie beispielsweise ein Lichtquantenzähler, z.B. nach der beschriebenen Methode von Tsunehiro Kitagawa, Toshio Nanbara, Akio Tsuji und Eiji Ishikawa "Koso Men-eki Sokuteiho", eine Extraausgabe Nr. 31 der Tanpakushitsu Kakusan Koso, Seiten 252 ... 263, KYORITSU-SHUPPAN Ltd., veröffentlicht am 10. September 1987, usw. Wenn die Analyten B Substanzen sind, die ultraviolettes Licht absorbieren können, wird die Messung nach einer konventionellen Methode unter Verwendung eines Meßgerätes ausgeführt, wie beispielsweise ein Spektrophotometer.
Für die Messung nach der HPLC-Trennung wird in dem erfindungsgemäßen Verfahren 2 vorzugsweise die Methode eingesetzt, umfassend das Einführen eines Ablaufs aus einer HPLC-Säule unbehandelt in eine Detektiersektion und direktes Messen der Menge des/der freien Analyten B, die im Komplex III oder in dem Ablauf enthalten ist, wie beispielsweise die beschriebene Methode von Shoji Hara und Akio Tsuji "Newest Liquid Chromatography", 1. Ausg., S. 92 ... 104, NANZANDO Ltd., veröffentlicht am 1. Februar 1978. Der Grund dafür besteht bei dieser Methode in der möglichen schnellen Messung. Wenn es sich in diesem Fall um die Analyten B, beispielsweise um Enzyme, handelt, sollte selbstverständlich eine Reaktionssektion der sogenannten säulennachgeschalteten Methode, bei der ein reagens zum Messen der Enzymaktivität dem Ablauf zugesetzt wird, um mit diesem zu reagieren, zwischen der HPLC-Säule und der Detektiersektion vorgesehen werden. Als das Reagens zum Messen der Enzymaktivität, das in der Reaktionssektion verwendet wird, wenn die Analyten B Enzyme sind, kann ein Reagens verwendet werden, das nach einer konventionellen Methode hergestellt wird, beispielsweise nach einer Methode auf der Grundlage der Aussagen von Tsunehiro Kitagawa, Toshio Naabara, Akio Tsuji und Eiji Ishikawa "Koso Men-eki Sokutetho", Extraausgabe Nr. 31 der Tanpaaushitsu Kakusan Koso, S. 51 ... 63, KYORITSU-SHUPPAN Ltd., veröffentlicht am 10. September 1987, usw.; oder es kann geeigneter Weise ein Reagens eines kommerziell verfügbaren Satzes zur klinischen Untersuchung gewählt und eingesetzt werden. Eine geeignete Reaktionssektion kann zwischen der HPLC-Säule und der Detektiersektion auch dann verwendet werden, wenn die Analyte B keine Enzyme sind, um so ein vorbestimmtes Reagens für die Aufgaben zur Verbesserung der Nachweisempfindlichkeit zuzusetzen und reagieren zu lassen.
Wenn in dem erfindungsgemäßen Verfahren 2 ein Antikörper als die Affinitätssubstanz γ verwendet wird, wird in Abhängigkeit von den Aufgaben die Verwendung des Antikörpers nach dem geeigneten Abbau mit einem Enzym, wie beispielsweise Pepsin oder Papain, zu F(ab')&sub2;, Fab' oder Fab bevorzugt. Der Grund hierfür ist folgender: Das als Antikörper in gewöhnlichem Antiserum enthaltene Immunglobulin gehört in der Regel zur IgG-Klasse. Die relative Molekülmasse von IgG beträgt etwa 150.000. Wenn ein Komplex III, der durch die Reaktion von IgG mit Analyt(en) B erhalten wurde, und freie Analyten B voneinander getrennt werden, beispielsweise nach dem Prinzip der Gelchromatographie, ist das Separieren schwierig, sofern die Molmasse der Analyten B etwa 50.000 oder mehr beträgt, weshalb die Art der Analyten B unweigerlich begrenzt ist. Wenn ein zu verwendender Antikörper mit einem Enzym zu F(ab')&sub2; (Molmasse etwa 100.000), Fab' (Molmasse etwa 50.000) oder Fab (Molmasse etwa 50.000) abgebaut wird, können Substanzen mit einer Molmasse von 10.000 oder darüber vorteilhaft als die Analyten B verwendet werden. Wenn eine monoklonaler Antikörper als die Affinitätssubstanz γ verwendet wird, der lediglich die Eigenschaft hat, sich an ein Epitop zu binden, kann die Affinitätssubstanz γ an dem/den Analyten B in einem Anteil von 1 Molekül pro Molekül des/der Analyten B gebunden werden (oder in einem Anteil von 1 Molekül pro Molekül Monomer für den Fall, daß der/die Analyt(en) B ein Dimer, Trimer o.dgl. ist), so daß die Retentionszeit des Komplexes III in der HPLC weitgehend konstant wird. Der Einsatz der monoklonalen Antikörper ist daher bevorzugt. In diesem Fall hat der Einsatz von Fab' oder Fab, die durch Abbauen der monoklonalen Antikörper erhalten wurden, die vorstehend beschriebenen Vorteile und wird daher selbstverständlich mehr bevorzugt.
Als der für die Affinitätssubstanz γ in dem erfindungsgemäßen Verfahren 2 eingesetzte Antikörper können verwendet werden, entweder polyklonale Antikörper, die durch Immunisieren von Tieren hergestellt werden, wie beispielsweise Pferd, Rind, Schaf, Kaninchen, Ziege, Ratte, Maus, usw., und zwar mit Analyt(en) B nach einer konventionellen Methode, beispielsweise die beschriebene Methode von Tadashi Matsuhashi et al., "Men-ekigaku Jikken Nyumon", 2. Ausg., GAKKAT- SHUPPAN CENTER Ltd., 1981, usw.; oder monoklonale Antikörper, erzeugt durch Hybridoma, erhalten durch Verschmelzen von Zellen einer Maus-Tumorreihe mit Maus-Milzzellen, die zuvor mit Analyt(en) B immunisiert wurden, und zwar nach der konventionellen Methode, d.h. der Zellfusionsmethode von G. Köhler und C. Milstein (Nature, 256, 495, 1975). Diese polyklonalen und/oder monoklonalen Antikörper können einzeln oder in geeigneter Kombination von zwei oder mehreren davon verwendet werden.
Wie aus dem vorgenannten ersichtlich, beträgt nach dem erfindungsgemäßen Verfahren 1 die für die Messung erforderliche Zeit mehrere Minuten bis mehrere Stunden, wobei die notwendige Meßprozedur selbst lediglich das Mischen einer Probe umfaßt, welche die Analyte A, die Affinitätssubstanz α und die Affinitätssubstanz β enthält, wonach der Komplex I, der Komplex II und die freie Affinitätssubstanz α voneinander mit Hilfe der HPLC separiert werden und die Menge der Affinitätssubstanz α in dem Komplex I und/oder die Menge der Affinitätssubstanz α in dem Komplex II gemessen werden. Nach dem Verfahren 2 der vorliegenden Erfindung beträgt die für die Messung erforderliche Zeit mehrere Minuten bis mehrere Stunden, wobei die notwendige Meßprozedur selbst lediglich das Mischen einer die Analyte B enthaltenden Probe mit der Affinitätssubstanz γ umfaßt, wonach der Komplex III von freiem Analyt oder freien Analyten B mit Hilfe der HPLC separiert und die Menge des Analyt oder der Analyten B in dem Komplex III und/oder die Menge des Analyt oder der Analyten B gemessen werden. Aus diesen Tatsachen wird offensichtlich, daß die erfindungsgemäßen Verfahren des Separierens und Messens die Ausführung einer angestrebten Messung im Vergleich zu den konventionellen Verfahren des Separierens und Messens leichter und schneller machen, wobei die Aufgabe der letzteren die gleiche ist wie die der Verfahren der vorliegenden Erfindung.
Die vorliegende Erfindung wird nachfolgend unter Bezugnahme auf die Beispiele konkreter erläutert, wobei die Beispiele nicht einschränkend, sondern veranschaulichend sind.

Beispiel 1

Separieren und Messen von Choriogonadotropinen (HCG), die in der Zuckerkettenstruktur verschieden sind

Elutionsmittel

Es wurde ein Elutionsmittel hergestellt, indem 3,9 g Natriumdihydrogenphosphat, 81 g Dinatriumhydrogenphosphatdodekahydrat, 44 g Natriumchlorid und 8,3 g 3-(p-Hydroxyphenyl)-propansäure in deionisiertem Wasser aufgelöst wurden, der pH-Wert der resultierenden Lösung mit 1n-NaOH-Lösung auf 7,5 eingestellt und das Gesamtvolumen auf 5 l aufgefüllt wurde.

Substratlösung

Es wurde eine 20 mMol-Lösung H&sub2;O&sub2; als eine Substratlösung hergestellt, indem eine 30%ige wäßrige Wasserstoffperoxidlösung mit deionisiertem Wasser verdünnt wurde.

Antikörder-Lösung

Nach einer konventionellen Methode wurde Anti-HCG-β- Ketten-monoklonaler Antikörper (verfügbar bei Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) zu Fab' behandelt. Dieses Fab' wurde mit Meerrettich-Peroxidase (POD) nach einer konventionellen Methode markiert und das so erhaltende, mit POD markierte Anti-HCG-β-Ketten-Fab' zu 50 inmol Phosphat-Puffer (pH 7,0, mit 150 mmol Natriumchlorid) zugegeben, um die Proteinkonzentration auf 95 ng/ml einzustellen, wodurch eine Antikörper-Lösung erhalten wurde.

Lektin-Lösung

Es wurde eine Lektin-Lösung hergestellt, indem Lens culinaris lectin (LCA-A) zu 50 mMol Phosphat-Puffer (pH 7,0) zugegeben wurde, um die Proteinkonzentration auf 1,5 mg/ml einzustellen.

Proben

Es wurden Lösungen mit einer HCG-Konzentration von 100, 200, 300, 400 oder 500 mIU/ml durch Auflösen in deionisiertem Wasser von jeweils kommerziell verfügbarem HCG (abgeleitet von plazentaren Zotten, verfügbar bei Sigma Chemical Co.) sowie HCG zubereitet, das von einem Chorionkarzinom abgeleitet wurde und aus dem Serum eines Patienten mit Chorionkarzinom gereinigt worden war.

Anwendungsbedinaungen der HPLC

Der Aufbau eines Systems wurde in Fig. 2 dargestellt.
Säule und Füllung: 0,46 cm Durchmesser x 60 cm, YMC-Diol-200 (ein Warenzeichen der Yamamura Chemical Laboratories Co., Ltd.)
Durchflaufrate: das Elutionsmittel: 0,5 ml/min Substratlösung: 0,05 ml/min
Reaktionssektion: 0,04 cm Durchmesser x 900 cm (bei 40 ºC gehalten)
Detektion: Es wurde die Fluoreszenz bei einer Erregungswellenlänge von 320 nm und einer Emissionswellenlänge von 404 nm gemes sen.

Meßverfahren

Nachdem 40 Mikroliter der Antikörper-Lösung, 40 Mikroliter der Lektin-Lösung und 20 Mikroliter jeder Probe gemischt und für 30 Minuten bei 30 ºC stehengelassen wurden, wurden mit Hilfe der HPLC 20 Mikroliter der Mischung analysiert.

Ergebnisse

Als Ergebnis der HPLC-Analyse wurde festgestellt, daß das mit POD markierte Anti-HCG-β-Ketten-Fab' nach 12,5 Minuten eluiert war, ein Komplex des POD markierten Anti- HCG-β-Ketten-Fab' und HCG, abgeleitet von plazentaren Zotten (Komplex I) nach 11,0 Minuten und ein Komplex des POD markierten Anti-HCG-β-Ketten-Fab', LCA-A und HCG, abgeleitet von Chorionkarzinom (Komplex II) nach 10,2 Minuten. Wie aus diesen Ergebnissen ersichtlich wird, können in der Zuckerkettenstruktur unterschiedliche HCG's voneinander unter Verwendung des POD markierten Anti-HCG-β-Ketten-Fab' und LCA-A als Affinitätssubstanz α bzw. Affinitätssubstanz β voneinander getrennt werden.

Beispiel 2

Separieren und Messen von HCG und Thyroidstimulierendes Hormon (TSH)

Elutionsmittel

Das gleiche wie in Beispiel 1.

Substratlösung

Die gleiche wie in Beispiel 1.

Antikörper-Lösung 1

Nach einer konventionellen Methode wurde Anti-HCG-α- Ketten-monoklonaler Antikörper (verfügbar bei Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) zu Fab' behandelt. Dieses Fab' wurde mit Meerrettich-Peroxidase (POD) nach einer konventionellen Methode markiert und das so erhaltene POD markierte Anti-HCG-α-Ketten-Fab' zu 50 mmol Phosphat-Puffer (pH 7,0, mit 150 inmol Natriumchlorid) gegeben, um die Proteinkonzentration auf 70 ng/ml einzustellen, womit die Antikörper-Lösung 1 erhalten wurde.

Antikörper-Lösung 2

Es wurde die Antikörper-Lösung 2 zubereitet, indem Anti-HCG-β-Ketten-monoklonaler Antikörper (verfügbar bei Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) zu 50 mmol Phosphat- Puffer (pH 7,5, mit 150 inmol NaCl) gegeben wurde, um die Proteinkonzentration auf 950 Mikrogramm/ml einzustellen.

Hormonlösungen

Die Hormonlösungen wurden zubereitet, indem kommerziell verfügbares HCG (abgeleitet von plazentaren Zotten, verfügbar bei Sigma Chemical Co.) und TSH (verfügbar bei UCB Bioproducts S.A.) in 50 mMol Phosphat-Puffer (pH 7,5, mit 150 mmol NaCl) aufgelöst wurden, um deren Konzentration jeweils auf 0,04; 0,08; 0,12; 0,16 oder 0,20 nMol einzustellen.

Anwendungsbedingungen der HPLC

Der Aufbau des Systems war der gleiche wie in Fig. 2.
Säule und Füllung: 0,46 cm Durchmesser x 60 cm, YMC-Diol-200 (Warenzeichen der Yamamura Chemical Laboratories Co., Ltd.)
Durchflaufrate: Elutionsmittel: 0,5 ml/min Substratlösung: 0,05 ml/min
Reaktionssektion: 0,04 cm Durchmesser x 900 cm (bei 55 ºC gehalten)
Detektion: Die Fluoreszenz wurde bei einer Erregungswellenlänge von 320 nm und einer Emissionswellenlänge von 404 nm gemessen.

Meßverfahren

Nachdem 40 Mikroliter der Antikörper-Lösung 1, 20 Mikroliter der jeweiligen Hormonlösung und 40 Mikroliter Antikörper-Lösung gemischt und sodann für 30 Minuten bei 30 ºC stehengelassen wurden, wurden 15 Mikroliter der Mischung mit Hilfe der HPLC analysiert.

Ergebnisse

Als Ergebnis der HPLC-Analyse wurde festgestellt, daß das POD markierte Anti-HCG-α-Ketten-Fab' nach 12,5 Minuten eluiert wurde, ein Komplex des POD markierten Anti-HCG-α- Ketten-Fab' und TSH (Komplex I) nach 11,7 Minuten und ein Komplex des POD markierten Anti-HCG-α-Ketten-Fab', Anti-HCG- β-Ketten-monoklonaler Antikörper und HCG "Komplex II) nach 10,2 Minuten eluiert wurden. Aus diesen Ergebnissen ist offensichtlich, daß HCG und TSH voneinander unter Verwendung des POD markierten Anti-HCG-α-Ketten-Fab' und des Anti-HCG- β-Ketten-monoklonalen Antikörpers als Affinitätssubstanz α bzw. Affinitätssubstanz β voneinander separiert werden können.
Fig. 1 zeigt Eichkurven, in denen die Beziehung zwischen der HCG-Konzentration (nmol) oder die TSH- Konzentration (nMol) der jeweiligen Probe und der Spitzenwert (Mikrovolt) des Komplexes dargestellt werden, welche Kurven als Ergebnis der HPLC-Analyse erhalten wurden. In Fig. 1 zeigt -m- eine Eichkurve für HCG und - - eine Eichkurve für TSH.

Beispiel 3

Separieren und Messen von HCG, luteinisierendem Hormon (LH) und Thyroidstimulierendem Hormon (TSH)

Elutionsmittel

Das gleiche wie in Beispiel 1.

Substratlösung

Die gleiche wie in Beispiel 1.

Antikörper-Lösung 1

Die gleiche wie in Beispiel 2.

Antikörper-Lösung 2

Antikörper-Lösung 2 wurde zubereitet, indem die jeweiligen Anti-HCG-β-Ketten-monoklonalen Antikörper (verfügbar bei Wako Pure Chemical Industries Ltd.) und die Anti-LH-β-Kettenmonoklonalen Antikörper (verfügbar bei Biodone Australia Pty. Ltd.) zu Fab mit Hilfe einer konventionellen Methode überführt und diese Fab zu 50 mmol Phosphat-Puffer (pH 7,5, mit 150 mMol NaCl) gegeben wurden, um die Konzentration des jeweiligen Proteins auf 2 Mikrogramm/ml einzustellen.

Hormonlösung

Es wurde eine Hormonlösung zubereitet, indem kommerziell verfügbares HCG (abgeleitet von plazentaren Zotten, verfügbar bei Sigma Chemical Co.), LH (verfügbar bei UCB Bioproducts S.A.) und TSH (verfügbar bei UCB Bioproducts S.A.) in 50 mmol Phosphat-Puffer (pH 7,5, mit 150 mMol NaCl) aufgelöst wurden, um die Konzentration jeweils auf 1 mMol einzustellen.

Anwendungsbedingungen der HPLC

Der Aufbau des Systems war der gleiche wie in Fig. 2.
Spule und Füllung: 0,46 cm Durchmesser x 60 cm, YMC-Diol-200 (ein Warenzeichen der Yamamura Chemical Laboratories Co., Ltd.)
Durchflaufrate: Elutionsmittel: 0,5 ml/min
Substratlösung: 0,05 ml/min
Reaktionssektion: 0,04 cm Durchmesser x 900 cm (bei 55 ºC gehalten)
Detektion: Die Fluoreszenz wurde bei einer Erregungswellenlänge von 320 nm und einer Emissionswellenlänge von 404 nm gemessen.

Meßverfahren

Nachdem 40 Mikroliter der Antikörper-Lösung 1, 30 Mikroliter der Hormonlösung und 40 Mikroliter der Antikörper-Lösung 2 gemischt und sodann für 30 Minuten bei ºC stehengelassen wurden, wurden 15 Mikroliter der Mischung mit Hilfe der HPLC analysiert.

Ergebnisse

Als Ergebnis der HPLC-Analyse wurde festgestellt, daß das POD markierte Anti-HCG-α-Ketten-Fab' mit einem Peak nach 12,5 Minuten eluiert wurde, ein Komplex des POD markierten Anti-HCG-α-Ketten-Fab', das Anti-HCG-β-Ketten-Fab und HCG nach 10,0 Minuten, ein Komplex des POD markierten Anti-HCG- α-Ketten-Fab', das Anti-LH-β-Ketten-Fab und LH nach 11,0 Minuten und ein Komplex des POD markierten HCG-α-Ketten-Fab' und TSH nach 11,9 Minuten eluiert wurden.
Aus diesen Ergebnissen ist offensichtlich, daß jedes Hormon in einer Probe, enthaltend HCG, LH und TSH durch Separieren und Messen gemäß dem Verfahren der vorliegenden Erfindung quantitativ gemessen werden kann.

Vergleichsbeispiel 1

Elutionsmittel

Das gleiche wie in Beispiel 1.

Antikörper-Lösung 1

Die gleiche wie in Beispiel 1.

Hormonlösung

Die gleiche wie in Beispiel 3.

Anwendungsbedinaungen der HPLC

Die gleichen wie in Beispiel 3.

Meßverfahren

Nachdem 40 Mikroliter der Antikörper-Lösung 1, 30 Mikroliter der Hormonlösung und 40 Mikroliter von 50 mmol Phosphat-Puffer (pH 7,5, mit 150 IUMOL NaCl) gemischt und sodann für 30 Minuten bei 30 ºC stehengelassen wurden, wurden 15 Mikroliter der Mischung mit Hilfe der HPLC analysiert.

Ergebnisse

Als Ergebnis der HPLC-Analyse wurde lediglich ein breiter Peak neben einem Peak beobachtet, der auf das POD markierte Anti-HCG-α-Ketten-Fab' zurückzuführen war, der nach 12 Minuten beobachtet wurde. Es konnte keiner der Peaks identifiziert werden, die auf einem Komplex des POD markierten Anti-HCG-α-Ketten-Fab' und HCG, einem Komplex der POD markierten Anti-HCG-α-Ketten-Fab' und LH und einem Komplex der POD markierten Anti-HCG-α-Ketten-Fab' bzw. TSH zurückzuführen war.
Aus diesen Ergebnissen ist offensichtlich, daß HCG, LH und TSH unter Anwendung des POD markierten Anti-HCG-α- Ketten-Fab' allein nicht separiert und detektiert werden können.

Beispiel 4

Separieren und Messen von α-Amylase-Isoenzymen

Elutionsmittel

Als Elutionsmittel wurde verwendet: 75 mMol N,N-Bis(2- hydroxyethyl)-2-aminoethansulfonsäure (BES)-NaOH-Puffer (pH 7,6), enthaltend 20 mMol NaCl und 2 mMol CaCl&sub2;.

Substratlösung

Es wurde eine Substratlösung durch Auflösen von p- Nitriophenylbenzyl-α-maltosepentaosid, α-Glukosidase und Glukoamylase in dem vorgenannten Elutionsmittel zubereitet und deren Konzentrationen auf 14 mg/ml, 150 Mikrogramm/ml bzw. 300 Mikrogramm/ml einzustellen.

Antikörder-Lösung

Es wurde eine Antikörper-Lösung zubereitet, durch Zusetzen von Anti-Human-Speichel-α-Amylase (Maus)-monoklonalem Antikörper (verfügbar bei Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) zu dem vorgenannten Elutionsmittel, um die Proteinkonzentration auf 0,5 mg/ml einzustellen.

Proben

Als Proben wurden Lösungen verwendet, die durch geeignete Verdünnung von Humanserum mit physiologischem Speichel zubereitet wurden.

Anwendungsbedingungen der HPLC

Der Aufbau des Systems war der gleiche wie in Fig. 2.
Säule und Füllung: 0,75 cm Durchmesser x 30 cm, TSK-Gel G 2000SW (Warenzeichen der Tosoh Ltd.)
Durchflaufrate: Elutionsmittel: 1,0 ml/min
Substratlösung: 0,1 ml/min
Reaktionssektion: 0,04 cm Durchmesser x 900 cm (bei 37 ºC gehalten)
Detektion: Es wurde die Absorption bei 400 nm gemessen.

Meßverfahren

Nachdem 300 Mikroliter der Antikörper-Lösung und 30 Mikroliter der jeweiligen Probe gemischt und danach für 30 Minuten bei 37 ºC inkubiert wurden, wurden 50 Mikroliter der Mischung mit Hilfe der HPLC analysiert.

Ergebnisse

Als Ergebnis der HPLC-Analyse wurden zwei Peaks beobachtet, die auf α-Amylase zurückzuführen sind, was darauf hinweist, daß Speichel-α-Amylase und Pankreas-α- Amylase voneinander separiert werden können.
Das vorgenannte Verfahren wurde mit der Ausnahme wiederholt, daß Proben verwendet wurden, die durch entsprechenden Zusatz von Pankreas-α-Amylase zu physiologischem Speichel zubereitet wurden. Es wurde eine Eichkurve aufgenommen, die die Beziehung zwischen dem erhaltenen Wert der Peakfläche und dem Aktivitätswert der Pankreas-α-Amylase darstellt.
Die erhaltenen Ergebnisse sind in Fig. 3 dargestellt. Die in Fig. 3 dargestellte Eichkurve wurde erhalten, indem der Peakflächenwert auf der Ordinate entsprechend dem einzelnen Aktivitätswert der Pankreas-α-Amylase (Mikrogramm/Liter) auf der Abszisse erhalten wurde.
Aus Fig. 3 ist zu erkennen, daß die Eichkurve im Nullpunkt beginnt und eine gute Linearität zeigt.

Beispiel 5

Separieren und Messen von γ-Glutamyl-Transferase (γ-GTP)- Isoenzyme

Elutionsmittel

Als Elutionsmittel wurde verwendet: 0,1 Mol Tris(hydroxymethyl)aminomethan-HCl-Puffer (pH 8,1), enthaltend 70 mMol Glycylglycin, 0,15 Mol NaCl und 2 mmol EDTA.

Lektin-Lösung

Es wurde eine Lektin-Lösung zubereitet, indem Lens culinaris lectin (LCA-A) in 50 mMol 2-(N-morpholino)ethansulfonsäure (MES)-Puffer (pH 7,0) zu einer Konzentration von 3 mg/ml aufgelöst wurden.

Substratlösung

Es wurde eine Substratlösung zubereitet, indem γ- Glutamyl-7-amido-4-methylcumarin in dem vorgenannten Elutionsmittel zu einer Konzentration von 0,4 mMol aufgelöst wurden.

Probe

Als Probe wurde frisches Humanserum verwendet.

Anwendungsbedingungen der HPLC

Der Aufbau des Systems war der gleiche wie in Fig. 2.
Säule und Füllung: 0,94 cm Durchmesser x 25 cm, Zorbax GF-250 (Warenzeichen der E.I. du Pont de Nemours & Co.)
Durchflaufrate: Elutionsmittel: 1,0 ml/min
Substratlösung: 0,5 ml/min
Reaktionssektion: 0,04 cm Durchmesser x 900 cm (gehalten bei 40 ºC)
Detektion: Die Fluoreszenz wurde bei einer Erregungswellenlänge von 395 nm und einer Emissionswellenlänge von 480 nm gemessen.

Meßverfahren

Nachdem 20 Mikroliter der Lektin-Lösung und 20 Mikroliter der Probe gemischt und danach für 30 Minuten bei 37 ºC inkubiert wurden, wurden 15 Mikroliter der Mischung mit Hilfe der HPLC analysiert.

Ergebnisse

Als Ergebnis der HPLC-Analyse wurde festgestellt, daß ein Komplex von γ-GTP mit einer Zuckerkette mit Fucose und LCA-A nach 5,8 Minuten und γ-GTP ohne Zuckerkette mit Fucose nach 11,3 Minuten eluiert wurden.

Beispiel 6

Separieren und Messen von Lactatdehydrogenase (LDH)- Isoenzymen

Elutionsmittel

Als Elutionsmittel wurde verwendet: 10 mMol Tris(hydroxymethyl)aminomethan-HCl-Puffer (pH 8,7), enthaltend 0,15 Mol NaCl.

Antikörder-Lösuny

Es wurde eine Antikörper-Lösung zubereitet, indem eine kommerziell verfügbare Anti-Human-LDH (H-Untereinheit)monoklonale Antikörper-Lösung (verfügbar bei ICN Biomedicals, Inc.) auf das 10-fache mit dem vorgenannten Elutionsmittel verdünnt wurde.

Substratlösung

Als Substratlösung wurden 500 mMol Tris(hydroxymethyl)aminomethan-HCl-Puffer (pH 8,7) verwendet, enthaltend 385 mMol L-Milchsäure und 22 mMol β-NAD&spplus;.

Probe

Als Probe wurde frisches Humanserum verwendet.

Anwendungsbedingungen der HPLC

Der Aufbau des Systems war der gleiche wie in Fig. 2.
Säule und Füllung: 0,8 cm Durchmesser x 30 cm, YMC-Diol-300 (ein Warenzeichen der Yamamura Chemical Laboratories Co., Ltd.)
Durchflaufrate: Elutionsmittel: 1,0 ml/min
Substratlösung: 0,1 ml/min
Reaktionssektion: 0,04 cm Durchmesser x 900 cm (gehalten bei 37 ºC)
Detektion: Die Fluoreszenz wurde bei einer Erregungswellenlänge von 370 nm und einer Emissionswellenlänge von 465 nm gemessen.

Meßverfahren

Nachdem 120 Mikroliter der Antikörper-Lösung und 30 Mikroliter der Probe gemischt und danach für 60 Minuten bei 30 ºC inkubiert wurden, wurden 100 Mikroliter der Mischung mit Hilfe der HPLC analysiert.

Ergebnisse

Als Ergebnis der HPLC-Analyse wurde festgestellt, daß das LDH&sub1; nach 11,1 Minuten, LDH&sub2; nach 10,1 Minuten, LDH&sub3; nach 9,3 Minuten, LDH&sub4; nach 8,9 Minuten und LDH&sub5; nach 8,3 Minuten eluiert wurden.
Wie bereits beschrieben, gewährt die vorliegende Erfindung ein Verfahren, mit dem das Separieren und Messen von Analyten in zu messenden Proben ermöglicht wird, die von lebenden Körpern abgenommen wurden, und zwar rasch und leicht mit hoher Präzision auf der Grundlage chemischer und/oder physikalischer Eigenschaften der Analyte. Nach dem ertindungsgemäßen Verfahren 1 beträgt die für die Messung erforderliche Zeit mehrere Minuten bis mehrere Stunden, wobei die erforderliche Meßprozedur selbst lediglich ein Mischen einer Probe umfaßt, welche die Analyte A, die Affinitätssubstanz α und die Affinitätssubstanz β enthält, wonach der Komplex I, der Komplex II und die freie Affinitätssubstanz α voneinander mit Hilfe der HPLC separiert und die Menge der Affinitätssubstanz α in dem
Komplex I und/oder die Menge der Affinitätssubstanz α in dem Komplex II gemessen werden. Nach dem erfindungsgemäßen Verfahren 2 beträgt die für die Messung erforderliche Zeit mehrere Minuten bis mehrere Stunden, wobei die erforderliche Meßprozedur lediglich ein Mischen einer Probe umfaßt, welche die Analyte B mit der Affinitätssubstanz γ enthält, wonach der Komplex III von dem freien Analyt oder den freien Analyten B mit Hilfe der HPLC separiert und die Menge des Analyten B in Komplex III und/oder die Menge des/der freien Analyten B gemessen werden. Das Verfahren der vorliegenden Erfindung ermöglicht daher im Vergleich zu konventionellen Verfahren des Separierens und Messens eine leichtere und schnellere Ausführung einer angestrebten Messung, wobei die Aufgabe des letzteren die gleiche ist, wie bei den Verfahren der vorliegenden Erfindung. Die vorliegende Erfindung ist in diesem Zusammenhang besonders effektiv und liefert einen wesentlichen Beitrag zur Technik.

Claims

1. Verfahren zum Separieren und Messen von Spurenkomponenten, welches Verfahren umfaßt:

Mischen einer Probe, die zwei oder mehrere zu messende Analyte A enthält, die trotz ihrer ähnlichen Strukturen gleiche oder verschiedene Wirkungen haben, mit einer Affinitätssubstanz α, die zu allen Analyten A Affinität aufweist und selbst über eine mit irgendeiner Methode detektierbare Eigenschaft verfügt oder mit einer Substanz markiert wurde, die mit irgendeiner Methode detektierbar ist, und mit einer Affinitätssubstanz β, die Affinität zu mindestens einem der Analyten A aufweist, sich jedoch nicht im geringsten an einen der anderen Analyten A bindet;

Umsetzen der Analyten A mit der Affinitätssubstanz α und der Affinitätssubstanz β;

Separieren eines Komplexes I von Analyt(en) A und der Affinitätssubstanz (1, eines Komplexes II von Analyt(en) A, der Affinitätssubstanz α und der Affinitätssubstanz β und freier Affinitätssubstanz α voneinander mit Hilfe einer Hochdruckflüssigchromatographie;

Messen der Menge der Affinitätssubstanz α in dem Komplex I und/oder der Menge der Affinitätssubstanz α in dem Komplex II, und

dadurch Messen der Menge eines beliebigen der Analyten A in der Probe.

2. Verfahren nach Anspruch 1, bei welchem die Analyten A Enzyme, physiologisch wirksame Substanzen, tumorassozuerte Antigene oder Substanzen sind, die Kette aufweisen.

3. Verfahren nach Anspruch 1, bei welchem die Affinitätssubstanz α ein markierte oder nichtmarkierter Antikörper oder markiertes oder nichtmarkiertes Lektin ist und die Affinitätssubstanz β ein Antikörper oder ein Lektin ist.

4. Verfahren nach Anspruch 3, bei welchem der Antikörper ein monoklonaler Antikörper ist.

5. Verfahren nach Anspruch 3, bei welchem das Lektin Concanavalin A, Lens culinaris lectin, Phaseolus vulgaris lectin, Datura stramonium agglutinin lectin, Aleuria aurantia lectin, Ricinus communis lectin, Arachis hypogaea lectin oder Triticum vulgaris lectin ist.

6. Verfahren nach Anspruch 1 bis 5, bei welchem die Trennung von Komplex I, Komplex II und freier Affinitätssubstanz α mit Hilfe einer Affinitätschromatographie ausgeführt wird, indem eine Säule verwendet wird, die gepackt ist mit: einer Packung für die Gelfiltration (Gelchromatographie), einer Packung für die Ionenaustauschromatographie, einer Packung für die hydrophobe Chromatographie, einer Packung für die isoelektrische Fokussierung, einer Packung für die Umkehrphasenchromatographie oder mit Hydroxyapatit.

7. Verfahren zum Separieren und Messen von Spurenkomponenten, welches Verfahren umfaßt;

Mischen einer Probe, die zwei oder mehrere zu messende Analyte B enthält, die gleiche Wirkungen und die gleiche detektierbare chemische Charakteristik haben, mit einer Affinitätssubstanz γ, die Affinität zu mindestens einem der Analyten B aufweist, sich jedoch nicht im geringsten an einen der anderen Analyten B bindet;

Umsetzen der Analyten B mit der Affinitätssubstanz γ ;

Separieren eines Komplexes III von Analyt(en) B und der und der Affinitätssubstanz γ von freien Analyt(en) B mit Hilfe einer Hochdruckflüssigchromatographie;

Messen der Menge von Analyt(en) B in dem Komplex III und/oder der Menge von freien Analyt(en) B; und

dadurch Messen der Menge eines beliebigen der Analyten B in der Probe.

6. Verfahren nach Anspruch 7, bei welchem die Analyte Enzyme sind.

9. Verfahren nach Anspruch 7, bei welchem die Affinitätssubstanz γ ein Antikörper oder Lektin ist.

10. Verfahren nach Anspruch 9, bei welchem der Antikörper ein monoklonaler Antikörper ist.

11. Verfahren nach Anspruch 9, bei welchem das Lektin Concanavalin A, Lens culinaris lectin, Phaseolus vulgaris lectin, Datura stramonium agglutinin lectin, Aleuria aurantia lectin, Ricinus communis lectin, Arachis hypogaea lectin oder Triticum vulgaris lectin ist.

12. Verfahren nach Anspruch 7 bis 11, bei welchem die Trennung des Komplexes III von freiem(n) Analyt(en) B mit Hilfe einer Hochdruckflüssigchromatographie ausgeführt wird, indem eine Säule verwendet wird, die gepackt ist mit: einer Packung für die Gelfiltration (Gelchromatographie), einer Packung für die Ionenaustauschromatographie, einer Packung für die hydrophobe Chromatographie, einer Packung für die isoelektrische Fokussierung, einer Packung für die Umkehrphasenchromatographie oder mit Hydroxylapatit.