DE69935850T2

DE69935850T2 - Verfahren zur messung der gesamkonzentration eines analytes

Info

Publication number: DE69935850T2
Application number: DE69935850T
Authority: DE
Inventors: Jeffrey Kenneth 11 Pwll-y-mi Cardiff HORTON; Peter Martin Vale of Glamorgan BAXENDALE
Original assignee: GE Healthcare UK Ltd
Current assignee: GE Healthcare UK Ltd
Priority date: 1998-02-16
Filing date: 1999-02-15
Publication date: 2008-01-10
Anticipated expiration: 2019-02-16
Also published as: JP3732090B2; JP2002503812A; EP1057021B1; WO1999041609A1; CA2321090C; ES2285830T3; EP1057021A1; CA2321090A1; US6692921B1; DE69935850D1; ATE360206T1; DK1057021T3

Description

Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf das Gebiet der Immunoassays. Die Erfindung stellt ein einfaches und günstiges Verfahren bereit, das zur Messung eines Bereichs verschiedener Typen von Analyten geeignet ist, die auftreten entweder vollständig oder teilweise komplexiert mit löslichen Bindungsproteinen oder Rezeptoren in Serum oder Plasma. Die Erfindung bezieht sich auch auf Kits von Reagenzien, die geeignet sind zum Ausführen von Messungen von Analyten unter Verwenden von auf Trennung basierenden oder homogenen Immunoassays.
Für mehr als dreißig Jahre waren die Immunoassays das Verfahren der Wahl zum Messen niedriger Analytenkonzentrationen in komplexen biologischen Fluiden. Die Prozedur ist gleichermaßen anwendbar auf die Messung von Verbindungen niedrigen Molekulargewichts, wie Arzneimittel, Stereoide, und der gleichen, wie auch auf Verbindungen großen Molekulargewichts, wie Proteinmoleküle. Die Technik kombiniert Empfindlichkeit und Spezifität und wurde verwendet in biologischer Grundlagenforschung, um die physiologische und möglicherweise pathologische Rolle eines weiten Bereiches leistungsfähiger biologisch aktiver Substanzen zu untersuchen, einschließlich Cytokine, Stereoidhormone, cyclische Nukleotide, Prostaglandine, Leukotriene und Wachstumsfaktoren. Assayentwürfe vermehrten sich über die letzten dreißig Jahre, wie auch die verschiedenen Typen von Signalreagenzien und Detektionssystemen. Ausgeklügelte Instrumente mit verbundener Computerhardware wurden entwickelt mit dem Ziel, den Probendurchsatz zu vergrößern. Eine weitere Hintergrundinformation in Bezug auf Immunoassaytechniken kann gefunden werden in „The Immunoassay Handbook", (Wild, D.G. Ed, Stockton Press, New York, [1994]).
Die frühsten Verfahren waren jene, die einen Schritt des Trennens des gebundenen Analyten vom freien beinhalteten, um fähig zu sein, die Menge des gebundenen Analyten zu messen. Verschiedene Trennverfahren wurden beschrieben, einschließlich Aktivkohleabsorbtion, Ammoniumsulfatpräzipitation. Kürzlich wurden feste Träger genutzt für Immunoassayprozeduren, einschließlich magnetische Teilchen und die Wände von Mikrotiterwellplatten. Eine kürzliche Entwicklung war die Einführung der homogenen Radioimmunoassaytechnologie, z.B. die Technik von Scintillationsproximityassays auf (SPA), umfasst vom US Patent Nr. 4,568,649 .
Als eine Alternative für auf Radioisotopen basierende Immunoassayverfahren wurden nicht-radioaktive Systeme eingeführt. Heute sind Enzyme die am meisten verbreitet verwendeten Tracer in derartigen Immunoassaysystemen wie ELISAs und EIAs. Wenn in Kombination mit colorimetrischen Endpunkten verwendet, liefern sie hochempfindliche, robuste, präzise, genaue und günstige Immunoassays. Ein Hauptdurchbruch kam mit der Einführung von 96-Well-Mikrotiterplatten. Kostengünstige automatische colorimetrische Multiwellplatten-Laser sind verfügbar. Eine Anzahl anderer nicht-isotopischer Maker wurden beschrieben, von denen lumineszente und fluoreszente Maker die populärsten sind.
Trotz der weit verbreiteten Verwendung von Immunoassays gibt es immer noch Schwierigkeiten in der Messung von Analyten, die von besonderen Probentypen, insbesondere Plasma und Serum, abgeleitet sind, in denen der Analyt vollständig oder teilweise mit einem löslichen Rezeptor oder Bindungsprotein komplexiert sein kann. Engelberts et al (The Lancet, 338, 515-6, 1991) verglichen die Ergebnisse der Messung von TNFα in Plasmaproben von Patienten mit septischem Schock, unter Verwenden eines Bereichs von Assaytypen, und bemerkten eine merkliche Variation in der Menge des detektierten TNF. In diesem Zusammenhang wurde vorgeschlagen, dass TNF-Bindungsproteine, die in biologischen Fluiden vorhanden sind, die biologische Aktivität von TNF verhindern und Diskrepanzen zwischen verschiedenen Assaymessungen verursachen. Die Schwierigkeit beim Messen von Analyten in der Form ihrer Komplexe mit löslichen Rezeptoren oder Bindungsproteinen kann auf dem Maskieren von Antikörperbindungsstellen beruhen.
Dieses Problem wurde zuvor angegangen durch die Entwicklung eines „oligoklonalen" Assaysystems (Medgenix), in dem bis zu drei nicht-neutralisierende monoklonale Antikörper verwendet werden in einem Standart-ELISA-Assay für die Messung von Cytokinen. In diesem Assayformat werden monoklonale Antikörper ausgewählt, um Epitope zu erkennen, die erkennbar verschieden von der Bindungsstelle des Rezeptors oder Bindungsproteins sind. Als ein Ergebnis wird behauptet, dass der Assay keiner Interferenz von löslichen Rezeptoren oder Inhibitoren unterliegt und fähig ist, das gesamte Cytokin zu messen.
US Patent Nr. 4,121,975 (Ullman und Lavine) beschreibt ein Verfahren für die Vorbehandlung von Serumproben vor der Bestimmung durch Immunoassay eines Polyiodthyronins, insbesondere Thyroxin. In diesem Assay wird ein alkalisches Salycilat zum Serum als ein Mittel zum Freisetzen von Thyroxin von seinem Bindungsprotein zugegeben. Alpha-Cyclodextrin ist auch in der Serumprobe enthalten, um natürlich auftretende endogene interferierende Moleküle zu komplexieren, wie freie Fettsäuren, Lipide und Arzneimittel. Cyclodextrin wurde nicht zum Serum gegeben, um das Salicylat abzusondern oder die Antikörperkomponenten des Immunoassays zu schützen. Außerdem ist das Verfahren beschrieben zur Verwendung mit nur einem Analyten.
US Patent Nr. 4,789,804 (Khanna und Pearlman) beschreibt ein Verfahren zur Serumvorbehandlung vor den Digoxin-Immunoassay. Das Verfahren umfasst das Inkontaktbringen der zu analysierenden Serumprobe mit β-Cyclodextrin oder β-Cyclodextrinpolymer in einer Menge und unter Bedingungen, die ausreichend sind, um zu ermöglichen, das ein wesentlicher Teil von Digoxin in der Probe an das β-Cyclodextrin bindet. Der β-Cyclodextrin-Digoxin-Komplex wird getrennt von den anderen Komponenten des Mediums durch Filtration oder Zentrifugation, und das Digoxin von der Probe ist daher hoch konzentriert. Das Digoxin wird freigesetzt vom β-Cyclodextrin-Komplex unter Verwenden von Cyclohexanol, um eine Digoxinprobe bereitzustellen, die durch eine Anzahl von Immunoassaytechniken analysiert werden kann.
Das europäische Patent mit der Veröffentlichungsnummer 0348 173 offenbart die Verwendung eines Detergenz in einer flüssigen Einzelreagenzzusammensetzung, um das Binden eines Enzymdonors/Analytenkonjugats und einer anti-Analytenkomponente zu verhindern. Die Zugabe der Probe und eines Cyclodextrins zum flüssigen Einzelreagenz kehrt die Effekte des Detergenz um und ermöglicht, dass die Analyten/anti-Analytenreaktion stattfindet.
JP 04-326046 beschreibt die Verwendung eines Cyclodextrins, um die Freisetzung eines unlöslichen oder instabilen Bestandteils eines lebenden Organismus und die Messung des Bestandteils bei Vorhandensein eines Detergenz zu ermöglichen.
Das vorliegende Verfahren stellt ein neues, günstiges und schnelles Verfahren zur Quantifizierung eines Gesamtanalyten in einer Probe bereit, in der der Analyt teilweise oder vollständig an sein(en) löslichen/lösliches Rezeptor oder Bindungsprotein gebunden sein kann. Das Verfahren hängt nicht von der Verwendung eines Multi-Antiköperformates ab, und erfordert nicht die extensive Manipulation der Probe, um sicherzustellen, dass der Analyt in einer Form vorliegt, die zur Messung geeignet ist. Das hier beschriebene Verfahren kombiniert die herkömmliche Immunoassaytechnologie mit einer Detergenz-vermittelten Dissoziation des Analyten von seinem Rezeptor oder Bindungsprotein.
Demgemäß stellt die vorliegende Erfindung ein Verfahren des Ausführens eines Assays für einen Analyten bereit, der mindestens teilweise gebunden als ein Komplex mit seinem löslichen Rezeptor oder Bindungsprotein auftritt, wobei das Verfahren die Schritte umfasst:

i) Bilden einer Fluid-Mischung durch Mischen einer Zell-freien biologischen Fluidprobe, die den zu bestimmenden Analyten enthält, mit einem Detergens zum Dissoziieren des Komplexes, wobei die Konzentration des Detergens im Bereich von 0,25–4 Gew.-% des biologischen Fluids liegt,
ii) Mischen der Fluid-Mischung aus Schritt i) mit Reagenzien, umfassend einen spezifischen Bindungspartner des Analyten zum Binden an den Analyten, und Ausführen eines spezifischen Bindungsassays für den Analyten,
iii) und Mischen der Fluid-Mischung aus Schritt i) mit einem Komplexbildner für das Detergens, wobei die Menge des Komplexbildners im Bereich von 1 bis 5 % der Bindungsreaktionsmischung liegt, wodurch der spezifische Bindungsassay des Schrittes ii) bei Vorhandensein des Komplexbildners ausgeführt wird.

Der Analyt kann eine Komponente eines biologischen Fluids sein. Ein beliebiger Analyt, für den ein spezifischer Bindungspartner verfügbar ist, kann im Prinzip in der Erfindung eingesetzt werden. Typische spezifisch-bindende Partnerkombinationen, die zur Verwendung mit der Erfindung geeignet sind, können ausgewählt sein aus: Hapten-Antikörper-, Arzneimittel-Antikörper-, Stereoidhormon-Antikörper-, Protein-Antikörper-, Peptid-Antikörper-, und Polypeptid-Antikörper-Wechselwirkungen. Ein spezifisches Bindungsproteinpräparat kann ersetzt werden für einen Antikörper in diesen Systemen. Bevorzugt ist der spezifische Bindungsassay ein Protein-Bindungsassay oder insbesondere eine Immunoassay. Typische Analyten umfassen Proteine, Peptide, Cytokine, Chemokine, Second-Messenger, wie cyclisches AMP und cGMP, Hormone, Arzneimittel, Stereoide, Prostaglandine, Vitamine und Leukotriene.
Der Assay kann entworfen sein, um einen Analyten zu messen, der in einer biologischen Fluidprobe vorhanden ist, z.B. Serum, Plasma, oder amniotisches Fluid, wobei in der Probe der Analyt vollständig oder teilweise als ein Komplex mit seinem löslichen Rezeptor oder Bindungsprotein verbunden sein kann. Bevorzugte Fluide sind Serum und Plasma.
Geeigneterweise kann das Detergenz ein beliebiges Reagenz sein, das zum Dissozieren eines Analyten von seinem komplementären Rezeptor oder Bindungsprotein fähig ist, und kann sein kationisch, anionisch, zwitterionisch oder nicht-ionisch in seiner Natur. Beispiele geeigneter Detergenzien umfassen Dodecyltrimethylammoniumbromid (DTAB); Cetylpyridiniumchlorid (CPC); Benzethoniumchlorid (BZC); Natriumdodecylsulfat (SDS) und N-Dodecyl-N,N-dimethyl-3-ammonio-1-propan-sulfonat (DDAPS). DTAB, CPC und BZC sind kationische oberflächenaktive Mittel; DDAPS ist ein zwitterionisches oberflächenaktives Mittel und SDS ist ein anionisches oberflächenaktives Mittel. Typische Konzentrationen von Detergenz liegen bevorzugt im Bereich von 0,5–2,5 Gewichtsprozent des Gewichts der zu bestimmenden Probe. Falls zu wenig Detergenz verwendet wird, kann die Dissoziation des Analyten von seinem löslichen Rezeptor oder Bindungsprotein langsam oder unvollständig sein. Zusätzlich zur dissoziativen Aktivität des Detergenz, um die Freisetzung eines zur Messung geeigneten Analyten freizusetzen, kann das Detergenz auch nachteilig die Bindung des Analyten an seinen spezifischen Bindungspartner beeinflussen, der im Verlauf des Schrittes ii) für den Assay zugegeben wird. Der Komplexbildner wird verwendet, um jenen unerwünschten nachteiligen Effekt zu verhindern oder aufzuheben.
Ein Schlüsselmerkmal der Erfindung ist die Verwendung eines Komplexbildners für das Detergenz. Der Komplexbildner wirkt, um zu verhindern, dass das Detergenz und jegliche damit verbundene daran gebundene Komponenten nachteilig eine Bindungsreaktion zwischen dem Analyten und seinem spezifischen Bindungspartner beeinflussen. Der Komplexbildner kann dies ausführen z.B. durch chemisches Reagieren mit dem Detergenz oder durch es physikalisch absorbieren. Bevorzugte Komplexbildner sind komplexe Kohlenhydratmoleküle, wie Cyclodextrine. Cyclodextrine sind toroidale Moleküle, bestehend aus 6, 7 oder 8 Glucoseeinheiten (α-, β- und γ-Cyclodextrin).
Das Innere des Ringes bindet einen hydrophoben Schweif eines Moleküles, wie ein oberflächenaktives Mittel. Der resultierende Einschlusskomplex wird allgemein gebildet mit einer 1:1-Stöchiometrie zwischen oberflächenaktivem Mittel und Cyclodextrin. γ-Cyclodextrin und besonders α-Cyclodextrin sind zur Verwendung in dieser Erfindung bevorzugt. Bevorzugt wird genügend Komplexbildner verwendet, um fähig zu sein, all die vorhandenen Zelllysereagenzien zu komplexieren oder inaktivieren.
Bevorzugt werden mehrfache Stufen in Sequenz in einer Multiwellplatte, wie einer Mikrotiterplatte, oder in Assayröhrchen ausgeführt. Falls erwünscht, können die Inhalte individueller Wells einer Multiwellplatte in individuelle Wells einer anderen Multiwellplatte in jeder Stufe während des Ausführens des Verfahrens übertragen werden. Jedoch ist es ein Vorteil der Erfindung, dass die Schritte i), ii), und iii) bevorzugt in einem einzigen Reaktionsgefäß unter Verwenden eines homogenen Immunoassays ausgeführt werden können.
Bevorzugt wird die aus Schritt i) resultierende behandelte Probe verwendet ohne jegliche Zwischentrennung oder -reinigung, zum Ausführen der Schritte ii) und iii). Bevorzugt ist der Komplexbildner in einem der Reagenzien enthalten, das mit der Fluidprobe in Schritt ii) gemischt wird. So können die in einem Assay gemäß der Erfindung vorhandenen Komponenten typischerweise umfassen:

a) eine Probe, die möglicherweise den Analyten enthält, oder dessen verdächtigt ist;
b) ein Detergenz
c) ein unmarkierter spezifischer Bindungspartner des Analyten, der auf einem festen Träger immobilisiert ist, oder dazu fähig ist;
d) ein spezifischer Bindungspartner oder ein Analogon des Analyten, die entweder markiert oder unmarkiert sind und fähig sind, markiert zu werden.

Eine oder beide der Komponenten c) und d) umfassen einen Komplexbildner, wobei die Reihenfolge der Zugabe der Komponenten c) und d) unerheblich ist.
In einem Format der Erfindung ist der Immunoassay ein Enzym-verknüpfter Immunosorbentassay (ELISA). In diesem Format sind die Komponenten a), b), c) und d) in den Wells einer Mikrotiterwellplatte enthalten, wobei die Komponente b) ein Enzym-markierter spezifischer Bindungspartner der zu testenden Verbindung ist. Die Assay-Messung wird initiiert durch die Zugabe der Detektionsreagenzien, die zur Detektion des Enzymmarkers geeignet sind, zu den Wells. In einem alternativen Format der Erfindung ist der Immunoassay ein Radioimmunoassay. In diesem Format sind die Komponenten a), b), c) und d) in Assayröhrchen enthalten, wobei die Komponente d) ein radioaktiv markiertes Analogon der zu testenden Verbindung ist.
Geeignete Komplexbildnerreagenzien sind ausgewählt aus der Gruppe, die besteht aus komplexen Kohlenhydraten, einschließlich Cyclodextrine. In einem bevorzugten Format wird α-Cyclodextrin im Verfahren dieser Erfindung eingesetzt.
Das Verfahren umfasst das Inkubieren einer Probe, die einen zu messenden Analyten enthält oder dessen verdächtig ist, mit Detergenz, Zugeben zur Mischung die Reagenzien, die zum Ausführen eines Immunoassays für die Messung des Analyten nötig sind, wobei einer oder mehrere derartige Reagenzien in einem Puffer aufgelöst sind, die ein Komplexbildnermittel enthalten, und Messen des erzeugten Signals als ein Maß der Menge des vorhandenen Analyten. Das erhaltene Signal kann verglichen werden mit den Signalen, die unter Verwenden eines Satzes von Standardmengen eines Analyten erhalten werden, unter Verwenden einer parallelen Prozedur und Erzeugen einer Standardkurve für den Assay.
In einem Format ist der Immunoassayprozess ein Radioimmunoassay, in dem das Reagenz d) ein Analogon ist, das ein Radioisotop enthält. Geeignete Radioisotope zur Verwendung im Assayverfahren der vorliegenden Erfindung umfassen β-emittierende Isotope, wie Tritium und Iod-125, das Auger-Elektronen emittiert.
In einem alternativen Format ist der Immunoassayprozess ein Enzym-Immunoassay, in dem das Reagenz d) ein spezifischer Bindungspartner ist, der an einen Enzymmarker gebunden ist oder gebunden werden kann. Typische Enzymmarker, die zur Verwendung in der vorliegenden Erfindung geeignet sind, sind alkalische Phosphatase, β-Galactosidase, Mehrrettich-peroxidase, Malat-dehydrogenase und Glycose-6-phosphatdehydrogenase. Mehrrettich-peroxidase ist ein besonders bevorzugter Enzymmarker zur Verwendung im Enzymimmunoassayverfahren gemäß der vorliegenden Erfindung.
In einem anderen Format kann der markierte spezifische Bindungspartner einen Fluoreszenzmarker umfassen. Geeignete Fluoreszenzmarker zur Verwendung in der vorliegenden Erfindung können ausgewählt werden aus Fluorescein, Rhodamin und Cyanin-Farbstoffen.
Das genaue Assayformat, die Wahl des spezifischen Bindungspartners, der Detektionsmarker und die Natur der zu testenden Substanz sind nicht für die vorliegende Erfindung entscheidend. Vielmehr beruht die Erfindung auf der unerwarteten Beobachtung, das ein Analyt, der vollständig oder teilweise mit seinem/seinen löslichen Bindungsprotein oder Rezeptoren komplexiert sein kann, durch Verwendung eines Detergenzbehandlungsschrittes in der Assayprozedur bestimmt werden kann, wodurch ein Komplexbildnermittel auch enthalten ist, um den Analyten zu einer zur Messung geeigneten Form zu machen.
Veranschaulichend für die Immunoassayverfahren, die in der vorliegenden Erfindung eingesetzt werden können, sind die folgenden Assayformate.
I. Radioimmunoassays
i) Heteroqene (Trennunqs-basierender) Radioimmunoassay (RIA)
Die vorliegende Erfindung stellt ein einfaches Verfahren zum Messen von Analyten bereit, die vollständig oder teilweise mit löslichen Bindungsproteinen oder Rezeptoren komplexiert sein können. Die Immunoassayreagenzien (Antisera und Tracer) können zu denselben Wells gegeben werden, wie sie für Schritt i) des Prozesses verwendet werden. In der Alternative kann eine aliquote Menge der Probe aus Schritt i) in individuelle Wells eines zweiten Gefäßes übertragen werden, zu denen die Immunoassayreagenzien gegeben werden. Der Prozess wird danach ausgeführt in einzelnen Wells oder Röhrchen ohne weitere Probenpräparation.
Ein Detergenz wird zur zu messenden Plasma- oder Serumprobe gegeben, gefolgt von unmarkiertem spezifischen Bindungspartner und einem Analogon des Analyten, wobei eine oder beide Reagenzien in Puffer hergestellt sind, die das Komplexbildnermittel enthalten. Die Reagenzien werden zusammen für eine geeignete Zeitdauer inkubiert: der gebundene markierte Analyten-spezifische Bindungspartner-Immunkomplex wird getrennt vom ungebundenen Marker durch herkömmliche Mittel (z.B. Aktivkohleabsorbtion, Ammoniumsulfatpräzipitation oder magnetische Teilchen), und eine aliquote Menge des Überstandes oder des Pellets wird zum Zählen entnommen. Die Konzentration des Analyten in den Proben wird bestimmt durch Interpolation aus einer Standardkurve.
ii) Scintillationsproximitäts-RIA
Ein Detergenz wird zur Plasma- oder Serumprobe gegeben, gefolgt von markiertem spezifischen Bindungspartner, unmarkiertem Bindungspartner und mit einem zweiten Antiköper derivatisierten Scintillationskügelchen, die in einem Puffer hergestellt sind, die das Komplexbildnermittel enthalten. Die Immunoassayreagenzien (Antisera und Tracer, SPA-Kügelchen, hergestellt im Komplexbildnermittel) können zugegeben werden zu denselben Wells der Mikrotiterplatte, die zu Behandlung der Proben mit Detergenz verwendet wird. Standards können zum Entleeren von Mikrotiterwells auf derselben Platte zugegeben werden. Reagenzien (Antisera, Tracer und SPA-Kügelchen) können zu denselben Wells gegeben werden, wie sie für Schritt i) des Prozesses verwendet werden. In der Alternative kann eine aliquote Menge der Plasma- oder Serumprobe von Schritt i) übertragen werden in individuelle Wells eines zweiten Gefäßes, zu dem die Immunoassayreagenzien gegeben werden, die in den komplexierenden Mitteln hergestellt sind. Die Platte oder Assay-Röhrchen werden für eine geeignete Zeitdauer inkubiert, vor dem Zählen auf einem β- Scintillationszähler. Die Konzentration eines Analyten in den Proben wird bestimmt durch Interpolation aus einer Standardkurve.
Alternativ wird nach der Detergenzbehandlung ein spezifischer Bindungspartner, der an scintillierende Kügelchen gekoppelt ist, mit dem Analyten inkubiert, zusammen mit einem zweiten spezifischen Bindungspartner. Der zweite Bindungspartner ist unmarkiert und eine Detektion findet durch ein drittes Bindungsreagenz statt, das markiert ist.
Alternativ wird nach der Detergenzbehandlung der Antigen-/zweiter spezifischer Bindungspartner-Komplex an die Scintillationskügelchen gebunden, wobei der zweite spezifische Bindungspartner unmarkiert ist und die Detektion durch ein drittes Bindungsreagenz erfolgt, das markiert ist.
II. Nicht-radioaktive Immunoassayformate
i) Enymimmunoassay (EIA)
Dieser Ansatz basiert auf dem Wettbewerb zwischen unmarkiertem Analyt und einer fixen Menge von Enzym-markiertem Analyt für eine begrenzte Anzahl von Bindungsstellen auf einem Analyten-spezifischen Antikörper. Mit fixen Mengen spezifischen Antiköpers und Enzym-markiertem Analyten ist die Menge von Enzym-markiertem Liganden, der durch den Antiköper gebunden wird, umgekehrt proportional zur Konzentration von zugegebenen unmarkierten Liganden. Der Enzym-markierte Ligand, den an den Körper gebunden wird, wird auf Polystyrolmikrotiterwells immobilisiert, die mit einem zweiten Antikörper vorbeschichtet sind. So wird jeglicher ungebundener Ligand von dem Well durch einfaches Waschen entfernt. Die Menge von Enzym-markierten Liganden, der an den Antikörper gebunden ist, wird bestimmt durch die Zugabe von Enzymsubstrat.
Zu messende Plasma- oder Serumproben werden mit Detergenz wie in Schritt i) behandelt. Arbeitsstandards werden hergestellt in Puffer, der das Detergenz enthält. Der spezifische Antikörper und das Enzymkonjugat werden hergestellt mit Assaypuffer, der Komplexbildner-(Cyclodextrin)-Mittel enthält. Standards und die vorbehandelte Serum- oder Plasmaprobe werden zu den Wells einer mit einem zweiten Antikörper beschichteten Mikrotiterplatte gegeben. Nicht-spezifisches Binden wird gemessen in der Abwesenheit spezifischer Antisera. Der Standard 0 besteht aus Assaypuffer, der nur Detergenz enthält. Spezifische Antisera und Enzymkonjugat (hergestellt in Assaypuffer, der Cyclodextrin enthält) werden in die Wells pipettiert. Mikrotiterplatten werden inkubiert, gefolgt von gründlichem Waschen und Zugabe von Enzymsubstrat. Die optische Dichte wird gemessen und die Konzentration des Analyten in den Serum- oder Plasmaproben wird bestimmt durch Interpolation von einer Standardkurve.
ii) Enzym-verknüpfter Immunosorbentassay (ELISA)
Dieser Ansatz setzt die quantitative "Sandwich"-Enzymimmunoassay-Technik ein. Für den Analyten spezifische Antikörper werden auf die Wells einer Mikrotiterplatte geschichtet.
Zu messende Plasma- oder Serumproben werden behandelt mit Detergenz wie Schritt i). Arbeitsstandards werden hergestellt in Puffer, der das Detergenz enthält, in einer ähnlichen Weise wie die Proben. Die anderen Komponenten des ELISA-Systems (z.B. biotinylierter Antikörper, Enzym-markierter spezifischer Antikörper, Streptavidin-markiertes Enzym, unmarkierter spezifischer Antikörper und/oder Enzym-markierte zweite Antikörper) werden zugegeben, wobei sie das Komplexbildner-(Cyclodextrin-)Mittel enthalten. Die optische Dichte wird gemessen und die Konzentration des Analyten in den Serum- oder Plasmaproben wird bestimmt durch Interpolation von einer Standardkurve.
iii) „EMIT"Typ (Rubenstein K.E. et al. 1972. Biochem. Biophys. Res. Comm. 47:846)
Die Enzyme Malat-dehydrogenase und Glucose-6-phosphat-dehydrogenase wurden extensiv im homogenen Immunoassay verwendet, der durch das EMIT-(Enzaym Multiplite Immunoassay Technic)-System veranschaulicht ist. Beide Enzyme werden durch die Umwandlung des Cofaktors NAD zu NADH₂ in einem Spektrometer bei 340 nm überwacht. In diesem Assaysystem wetteifert der Analyt mit markiertem Antigen um Antikörperbindungsstellen. Die Aktivität des Enzyms ist modifiziert, wenn der Antikörper an das markierte Antigen bindet.
Zu messende Plasma- oder Serumproben werden behandelt mit Detergenz wie in Schritt i), und dann werden die anderen Komponenten des homogenen EMIT-EIA zugegeben, aufgelöst in Puffer, der das Komplexbildner-(Cyclodextrin)-Mittel enthält. Die optische Dichte wird gemessen und die Konzentration des Analyten in den Proben wird bestimmt durch Interpolation von einer Standardkurve.
iv)„CEDIA"-Typ (Henderson D.R. et al 1986 Clin. Chem. 32, 1637-161)
Im Immunoassayverfahren des klonierten Enzym-Donors wurden zwei inaktive Fragmente der β-Galctosidase synthetisiert durch Gentechnik. Das grolle Fragment, der Enzym-Akzeptor, enthält 95 % des Enzyms, und das kleine Fragment, der Enzym-Donor, besteht aus den verbleibenden 5 %. Beim Mischen aggregieren die zwei Fragmente in Tetrameren, die β-Galctosidase-Enzymaktivität besitzen. In diesem Assay wird das Antigen an den Enzym-Donor auf eine derartige Weise konjugiert, dass die Aggregation mit dem Enzym-Akzeptor blockiert ist, falls der Antikörper ein Antigen bindet. Bei Vorhandensein des Analyten wird weniger Konjugat durch den Antikörper gebunden und die Enzymaktivität wird stimuliert. Bei Abwesenheit eines Analyten verhindert das Binden des Antikörpers an das Konjugat die Bildung des aktiven Enzyms.
Zu messende Plasma- oder Serumproben werden behandelt mit Detergenz wie in Schritt i) und dann werden die anderen Komponenten des homogenen CEDIA (Antikörper, Enzym-Donor/Ligand-Konjugat, Enzym-Akzeptor-Monomer) in Puffer augelöst zugegeben, der das Komplexbildner-(Cyclodextrin)-Mittel enthält. Die optische Dichte wird gemessen und die Konzentration des Analyten in den Proben wird bestimmt durch Interpolation von einer Standardkurve.
v) Trennunqs-basierende Fluoreszenz-Immunoassays
Mit anderen Markern gibt die Verwendung von Fluorophoren Anlass zu einer Anzahl verschiedener Immunoassay-Verfahren, die eingeteilt werden in die Basiskategorien Fluoreszenz-Immunoassay (FIA; mit begrenztem Reagenz, markiertem Antigen) und immunofluorometrischem Assay (IFMA/Überschussreagenzmarkierter Antikörper). Grundsätzlich sind FIAs und IFMAs identisch zu anderen Immunoassays wie EIAs und ELISAs, mit der Außnahme, dass ein Fluorophor (z.B. ein Cyaninfarbstoff, Rhodamin oder Fluorescein) als ein Marker verwendet wird.
In diesen Assays werden zu messende Plasma- oder Serumproben mit Detergenz wie in Schritt i) behandelt. Arbeitsstandards werden hergestellt im Puffer, der das Detergenz enthält, auf eine ähnliche Weise zu den Proben. Die anderen Schlüsselkomponenten des Assaysystems werden zugegeben, hergestellt in Puffer, der das Komplexbildner-(Cyclodextrin)-Mittel enthält. Die Fluoreszenzintensität wird gemessen und die Konzentration des Analyten in den Proben wird bestimmt durch Interpolation von einer Standardkurve.
vi) Homogene Fluoreszenz-Immunoassays
a) Fluoreszenzpolarisation
Fluoreszenzpolarisation ist eine Technik, die zum Unterscheiden vom freien Analyten ohne die Notwendigkeit einer Trennung verwendet wird. In kompetetiven Assays, für kleine Moleküle, Fluoreszenz-markierte Antigene (z.B. unter Verwenden von Fluorescein, Rhodamin oder Cyanin-Frabstoffreagenzien) als ein Tracer. An der Signal-Erzeugungs und -Detektionsstufe erzeugt ein Fluorimeter senkrecht polarisiertes Licht bei der Anregungswellenlänge des Fluorophors.
Das emittierte Licht, bei einer niedrigeren Wellenlänge wegen der Stokes-Verschiebung, wird durch einen senkrecht polarisierenden Filter detektiert. Weil der freie Tracer bei einer sehr hohen Geschwindigkeit rotiert, liegt das emittierte Licht immer in einer vom einfallenden Licht verschiedenen Ebene, so ist die Menge des durch den polarisierenden Filter detektierten Lichtes minimal. Jedoch wird der Tracer, der an das viel größere Antikörpermolekül gebunden ist, vom Rotieren bei einer derartig hohen Geschwindigkeit abgehalten, und das emittierte Licht liegt fast in derselben Ebene wie das einfallende Licht. Zu messende Plasma- oder Serumproben werden behandelt mit Detergenz wie in Schritt i), und dann werden die anderen Komponenten des homogenen Fluoreszenzassays (Antikörper, Fluoreszenz-markiertes Antigen) aufgelöst in Puffer zugegeben, der das Komplexbildner-(Cyclodextrin)-Mittel enthält. Die Fluoreszenz wird gemessen und die Konzentration des Analyten in den Proben wird bestimmt durch Interpolation von einer Standardkurve.
b) Fluoreszenz-Resonanz-Energietransfer (FRET)
Verschiedene Fluorophore besitzen oft verschiedene Anregungs- und Emissionsspektren (siehe Tabelle 1). Jedoch kann der Anregungspeak eines Fluorophors mit dem Emissionspeak eines anderen Fluorophors überlappen. Dieses Prinzip kann angewendet werden für homogene Assays auf eine oder zwei Weisen, abhängig von den Eigenschaften des zweiten Zeitfluorophors. Falls der zweite Fluorophor in unmittelbarer Nachbarschaft des ersten angeordnet ist, findet ein Quenchen der Fluoreszenzemission durch Energietransfer statt. Dieses Prinzip wurde verwendet in FREI durch Koppeln eines Fluorophors an einen Antikörper und eines anderen an das Antigen. Binden des Antigens an den Antikörper führt zu naher Nachbarschaft und nachfolgendem Quenchen. Ein alternatives System beinhaltet zwei Populationen von Antikörpern, die gegen dasselbe Antigen gewachsen sind, markiert mit zwei verschiedenen Flurophoren. Das Binden der zwei Antikörper gibt Anlass zu naher Nachbarschaft und daher Energietransfer zwischen den zwei, was zu Quenchen oder Reduktion in der Fluoreszenz führt. Der zweite Fluorophor kann als ein Energietransferakzeptor wirken und bei einer höheren Wellenlänge emittieren als der Donorfluorophor, anstelle von als ein Quencher zu wirken. So reflektiert die Bestimmung der Emission bei der höheren Wellenlänge das Niveau des Bindens des markierten Antigens an den Antikörper in kompetetiven Assays oder an markierte Antikörper in einem Sandwich-Assay. Zu messende Plasma- oder Serumproben werden mit Detergenz wie in Schritt i) behandelt, und dann werden die anderen Komponenten des homogenen Fluoreszenzenergietransferassays aufgelöst in Puffer zugegeben, der das Komplexbildner-(Cyclodextrin)-Mittel enthält. Fluoreszenz wird gemessen und die Konzentration des Analyten in den Proben wird durch Interpolation von einer Standardkurve bestimmt. Tabelle 1. Die spektralen Eigenschaften von Cyanin-Fluoreszenzfarbstoffen

Fluorophor Anregung (nm) Emission (nm)

Cy2 489 506

Cy3 550 570

Cy3,5 581 596

Cy5 649 670

Cy5,5 675 694

Cy7 743 767

FluorX 494 520
c) Zeitaufgelöste Fluoreszenz
Hintergrund-Fluoreszenz ist eines der Hauptprobleme mit der Verwendung eines Fluoreszenzimmunoassays, und ihr Vorhandensein kann ernsthaft die Verwendung dieser Verfahren begrenzen. Jedoch besitzt die Hintergrund-Fluoreszenz, die in dem meisten biologischen Material vorhanden ist, die kurze Lebenszeit von ein paar Nanosekunden. Für Fluorosphore mit langen Fluoreszenzlebensdauern ist es möglich, Fluoreszenz an einem Zeitpunkt zu messen, wenn nahezu die gesamte Hintergrund-Fluoreszenz verschwunden ist. Dies ist im Wesentlichen das Prinzip der Zeit-aufgelösten Fluoreszenz und dieses Verfahren kann verwendet werden in Kombination mit Fluoreszenz-Energietransfer und Fluoreszenz-Polarisationstechniken.
III. Andere Verfahren
Das in diesem Patent beschriebene Verfahren kann angewandt werden auf andere Immunoassaytechniken wie Chemilumineszenz, Nephelometrie, Latex-Agglutinationsassays und ihre Varianten.
Beispiele
1. Systemoptimierung
Eine Messung von Interleukin-6 (IL-6) wurde als ein Modellsystem zum Studieren der Dissoziation von löslichen Rezeptoren und der Messung des gesamten Cytokins im Plasma ausgewählt. Detergenzien wurden verwendet in einer Reihe von vorbereitenden Experimenten in Kombination mit Komplexbildnerreagenz, um die optimale Konzentration zu bestimmen. Dosis-Respons-Kurven für IL-6 wurden erzeugt in Detergenz und Cyclodextrin. Parameter, wie Assay-Empfindlichkeit, Arbeitsbereich und Antigen:Antikörper-Bindung wurden verwendet, um die geeignetsten Reagenzien und optimalen Konzentrationen sowohl für das Detergenz als auch das Cyclodextrin zu etablieren.
Reagenzien, Puffer und Ausrüstung

Human Interleukin-6 ELISA kit, Amersham, RPN 2754
alpha-Cyclodextrin, USB, 13979
Dodecyltrimethylammoniumbromid (DTAB), Sigma, D8638
Entsorgbare Teströhrchen zum Herstellen von Arbeitsstandards
Pipetten und Pipettierausrüstung
Labor-Glasausrüstung
Destilliertes Wasser
Magnetrührer
Mikrotiterplattenwäscher
Mikrotiterplattenleser

Verfahren
Standardkurven wurden hergestellt wie folgt. Arbeitsstandards (10,24–400 pg/ml IL-6) wurden hergestellt in Polypropylenröhrchen mir Assaypuffer, der 1 %iges (G/V) DTAB enthielt. Der biotinylierte Antikörper wurde hergestellt in Puffer, der 3 %iges (G/V) alpha-Cyclodextrin enthielt. 50 μl von biotinyliertem Antikörperreagenz (enthaltend Cyclodextrin) wurde zugegeben zu der Anti-IL-6-beschichteten Platte. 50μl Arbeitsstandard wurde pipettiert in Wells der Anti-IL-6-beschichteten Platte. Nicht-spezfisches Binden wurde bestimmt in Abwesenheit von IL-6 (0-IL-6-Standard). Die Reihenfolge der Zugabe von biotinyliertem Antikörper und Standards ist für die Prozedur nicht entscheidend. Jedoch wurden in allen Beispielen verbesserte Ergebnisse erhalten, wenn der biotinylierte Antikörper zu der Anti-IL-6-beschichteten Platte gegeben wurde vor den Standards. Die Anti-IL-6-Platte, enthaltend biotinyliertem Antikörper und Standards, wurde inkubiert für 2 Stunden bei Raumtemperatur. Die Platte wurde gründlich gewaschen, gefolgt von der Zugabe von 100 μl/Wells verdünntem (30 μl Konzentrat zu 12 ml Streptavidin-Verdünnungspuffer) Peroxidase-markiertem Straptavidin. Die Platte wurde bei Raumtemperatur für 30 Minuten inkubiert, gefolgt von gründlichem Waschen. 100 μl TMB-Substrat wurde hinzugegeben zu jedem Wells der Platte, gefolgt von einer 30-Minuten-Inkubation bei Raumtemperatur. Die Reaktion wurde beendet durch die Zugabe von 100 μl/Well Schwefelsäure. Die optische Dichte wurde bestimmt mit einem Mikrotiterplattenspektrophotometer.
Vergleiche wurden gemacht mit Kurven, hergestellt mit Assaypuffern, enthaltend:
Standards und Antikörper nur in Assaypuffer (DTAB und Cyclodextrin abwesend)
Standards, hergestellt in DTAB, Antikörper hergestellt nur in Assaypuffer.
Ergebnisse
Die Wirkung des Einbeziehens eines Detergenz und eines Kompexbildnermittels auf dem IL-6-ELISA-System ist dargestellt in 1 & 2. 1 zeigt eine Inhibierung des Antikörperbindens, wenn 1 %iges (G/V) DTAB zu dem IL-6 Assay gegeben wurde. Das Binden wurde wieder hergestellt bei Einbeziehen von 3 %igem (G/V) alpha-Cyclodextrin zum biotinylierten Anti-IL-6-Antikörper.
2.Messung des gesamten Interleukin-6 im Plasma
Diese Experiment beschreibt ein einfaches Verfahren zur Messung des gesamten Cytokins im Plasma. Die hier beschriebene Technik ist ein Zwei-Schritte-Verfahren, bei dem ein Detergenz zum Plasma gegeben wird und eine aliquote Menge nachfolgend zur Messung unter Verwenden einer Immunoassay (ELISA)-Technik entfernt wird. Die entscheidene Komponente des ELISA (der biotinylierte Antikörper) wurde hergestellt im Puffer, der Cyclodextrin enthielt.
Reagenzien, Puffer und Ausrüstung

Human Interleukin-6 ELISA kit, Amersham, RPN 2754
Normales menschliches Plasma
alpha-Cyclodextrin, USB, 13979
Dodecyltrimethylammoniumbromid (DTAB), Sigma, D8638
Entsorgbare Teströhrchen zum Herstellen von Arbeitsstandards
Pipetten und Pipettierausrüstung
Labor-Glasausrüstung
Destilliertes Wasser
Magnetrührer
Mikrotiterplattenwäscher
Mikrotiterplattenleser

Verfahren
Detergenz (DTAB) wurde zu Plasma oder Serum gegeben, um eine Endkonzentration von 1 % (G/V) zu ergeben. Typischerweise wurden 100 μl 10 %-iges (G/V) DTAB in Assaypuffer zu 900 μl Serum- oder Plasmaprobe gegeben. Eine aliquote Menge (50 μl) des behandelten Serums oder Plasmas wurde entfernt für den Assay. IL-6-Standards wurden hergestellt mit Assaypuffer, der 1 %iges (G/V) DTAB enthielt.
Arbeitsstandards (10,24–400 μg/ml IL-6) wurden hergestellt in Polypropylenröhrchen mit einem Assaypuffer, der 1 %-iges (G/V) DTAB enthielt. Der biotinylierte Antikörper wurde hergestellt in Puffer, der 3 %iges (G/V) alpha-Cyclodextrin enthielt. 50 μl biotinyliertes Antikörperreagenz (enthalten Cyclodextrin) wurde zugegeben zur Anti-IL-6-beschichteten Platte. 50 μl Arbeitsstandard und die vorbehandelten Serum- oder Plasmaprobe wurden in getrennte Wells der Anti-IL-6-beschichteten Platte pipettiert. Nicht-spezifisches Binden wurde bestimmt in Abwesenheit von IL-6. Die Anti-IL-6-Platte, enthaltend biotinylierten Antikörper und Standards/Proben, wurde 2 Stunden lang bei Raumtemperatur inkubiert. Die Platte wurde gründlich gewaschen, gefolgt von der Zugabe von 100 μl/Well verdünntes (30 μl Konzentrat zu 12 ml Streptavidin-Verdünnungspuffer) Peroxidase-markiertes Streptavidin. Die Platte wurde bei Raumtemperatur 30 Minuten lang inkubiert, gefolgt von gründlichem Waschen. 100 μl des TMB-Substrats wurde zugegeben, gefolgt von einer 30-Minuten-Inkubation bei Raumtemperatur. Die Reaktion wurde beendet durch die Zugabe von 100 μl/Well Schwefelsäure. Die optische Dichte wurde bestimmt mit einem Mikrotiterplattenspektrophotometer. IL-6-Gehalte wurden bestimmt unter Verwenden einer log/linearen Analyse mit Bezug auf eine Standardkurve. Gehalte von Cytokin in Serum oder Plasma wurden bestimmt durch Interpolation.
Ergebnisse
Die Wirkungen des Zugebens von Detergenz zu normalen menschlichen Plasmaproben und von Cyclodextrin zu den Schlüsselreagenzien des IL-6-ELISA-Systems sind in Tabelle 2 gezeigt. Plasmaproben wurden verdünnt mit Assaypuffer (reines Plasma und verdünnt 1:5–1:20) vor der Messung. Kontrollproben wurden hergestellt bei Abwesenheit des Detergenz und gemessen ohne die Zugabe von Cyclodextrin zu den biotinylierten Antikörpern. Proben, behandelt mit Detergenz und gemessen in Anwesenheit von Cyclodextrin, zeigten einen beträchtlichen Anstieg in der IL-6-Konzentration (einen mittleren Anstieg von 165 %). Diese unerwartete Beobachtung wird als das Ergebnis der Dissoziation von Plasma-IL-6 von natürlich auftretenden, löslichem IL-6-Rezeptor betrachtet. Tabelle 2. Messung von IL-6 in Plasma

Probenverdünnung Kontrolle (pg/ml) Proben plus Detergenz Antikörper plus Cyclodextrin (pg/ml)

Reines Plasma 3,5 8,9

1:5 4,1 7,6

1:10 3,6 7,6

1:20 1,6 9,8
3. Ausbeute bekannter Mengen von zugegebenen Interleukin-6 von Plasmaproben
Um die Nützlichkeit des Verfahrens zu bestätigen, wurden Ausbeuteexperimente ausgeführt mit bekannten Mengen von IL-6, das zu normalem menschlichen Plasma gegeben wurde. Proben wurden gemessen bei Vorhandensein und Abwesenheit von Detergenz und Cyclodextrin. Ein Bereich von Konzentrationen von IL-6 und Verdünnungen des Plasmas wurde bewertet.
Reagenzien, Puffer und Ausrüstung

Human Interleukin-6 ELISA kit, Amersham, RPN 2754
Normales menschliches Plasma
Recombinant human interleukin-6, Amersham, ARM 20010
alpha-Cyclodextrin, USB, 13979
Dodecyltrimethylammoniumbromid (DTAB), Sigma, D8638
Entsorgbare Teströhrchen zum Herstellen von Arbeitsstandards
Pipetten und Pipettierausrüstung
Labor-Glasausrüstung
Destilliertes Wasser
Magnetrührer
Mikrotiterplattenwäscher
Mikrotiterplattenleser

Verfahren
Rekombinantes IL-6 wurde zugegeben zu normalem menschlichen Plasma in einem Bereich von Konzentrationen (25–200 pg/ml). Mehrere verschiedene Verdünnungen (reines Plasma, 1:5–1:20) des Plasmas wurden mit IL-6 geimpft. Detergenz (DTAB) wurde zu Plasma gegeben, um eine Endkonzentration von 1 % (G/V) zu ergeben. Typischerweise wurden 100 μl 10 %-iges (G/V) DTABs, hergestellt in Assaypuffer, zu 900 μl Plasmaprobe gegeben. Eine aliquote Menge (50 μl) des behandelten Plasmas wurde für den Assay entfernt. IL-6-Standards wurden hergestellt mit Assaypuffer, der 1 %iges (G/V) DTAB enthielt.
Arbeitsstandards (10,24–400 pg/ml IL-6) wurden hergestellt in Polypropylenröhrchen mit Assaypuffer, der 1 %iges (G/V) DTAB enthielt. Der biotinylierte Antikörper wurde hergestellt in Puffer, der 3 %iges (G/V) alpha-Cyclodextrin enthielt. 50 μl biotinyliertes Antikörper-Reagenz (enthaltend Cyclodextrin) wurde zugegeben zu der Anti-IL-6-beschichteten Platte. 50 μl des Arbeitsstandards und eine vorbehandelte Plasmaprobe wurden in getrennte Wells der Anti-IL-6-beschichteten Platte pipettiert. Nicht-spezifisches Binden wurde bestimmt in Abwesenheit von IL-6. Die Anti-IL-6-Platte, enthaltend biotinylierten Antikörper und Standards/Proben, wurde inkubiert für zwei Stunden bei Raumtemperatur. Die Platte wurde gründlich gewaschen, gefolgt von der Zugabe von 100 μl/Well verdünntes (30 μl Konzentrat zu 12 ml Streptavidin-Verdünnungspuffer) Peroxidase-markiertes Streptavidin. Die Platte wurde bei Raumtemperatur für 30 Minuten inkubiert, gefolgt von gründlichem Waschen. 100 μl TMB-Substrat wurde zugegeben zu jedem Well der Platte, gefolgt von einer 30-Minuten-Inkubation bei Raumtemperatur. Die Reaktion wurde beendet durch die Zugabe von 100 μl/Well Schwefelsäure. Die optische Dichte wurde bestimmt mit einem Mikrotiterplattenspektrophotometer. Interleukin-6-Gehalte wurden bestimmt unter Verwenden einer log/linearen Analyse mit Bezug auf eine Standardkurve. Gehalte von Cytokin im Plasma wurden bestimmt durch Interpolation. Kontrollproben wurden hergestellt in Abwesenheit des Detergenz und gemessen ohne die Zugabe von Cyclodextrin zu den biotinylierten Antikörpern.
Ergebnisse
Die Wirkung des Zugebens von Detergenz zu normalen menschlichen Plasmaproben, die mit bekannten Konzentrationen von rekombinanten IL-6 geimpft waren, ist in 3 gezeigt. Die Ausbeute von IL-6, gemessen in Abwesenheit von Detergenz und Cyclodextrin, war relativ gering (mittlere Ausbeute 63 %). Proben, behandelt mit Detergenz und gemessen bei Vorhandensein von Cyclodextrin, zeigten einen Anstieg in der Ausbeute von zugegebenem IL-6 (mittlere Ausbeute 93 %). Diese unerwartete Beobachtung wird als das Ergebnis der Dissoziation von Plasma-IL-6 von natürlich auftretendem, löslichen IL-6-Rezeptor betrachtet.
4. Wirkung des Zugebens von löslichem Interleukin-6-Rezeptors zu Plasmaproben
Ausbeuteexperimente wurden ausgeführt mit bekannten Mengen von IL-6 und löslichem Rezeptor, zugegeben zu normalem menschlichen Plasma. Proben wurden gemessen sowohl bei Vorhandensein als auch in Abwesenheit von Detergenz und Cyclodextrin. Ein Bereich von Konzentrationen von IL-6 und Verdünnungen des Plasmas wurden verwertet.
Reagenzien, Puffer und Ausrüstung

Human Interleukin-6 ELISA kit, Amersham, RPN 2754
Normales menschliches Plasma
Recombinant human interleukin-6, Amersham, ARM 20010
Recombinanter löslicher menschlicher IL-6-Rezeptor, R&D-Systeme, 227SR-025
alpha-Cyclodextrin, USB, 13979
Dodecyltrimethylammoniumbromid (DTAB), Sigma, D8638
Entsorgbare Teströhrchen zum Herstellen von Arbeitsstandards
Pipetten und Pipettierausrüstung
Labor-Glasausrüstung
Destilliertes Wasser
Magnetrührer
Mikrotiterplattenwäscher
Mikrotiterplattenleser

Verfahren
Rekombinantes IL-6 wurde zugegeben zu normalem menschlichen Plasma in einem Bereich von Konzentrationen (25–200pg/ml) in Anwesenheit von 12,5 ng/ml löslichem IL-6-Rezeptor. Mehrere verschiedene Verdünnungen (reines Plasma, 1:5–1:20) des Plasmas wurden mit IL-6 geimpft. Detergenz (DTAB) wurde zu Plasma gegeben, um eine Endkonzentration von 1 % (G/V) zu ergeben. Typischerweise wurden 100 μl 10 %iges (G/V) DTAB, hergestellt in Assaypuffer, zu 900 μl Plasmaprobe gegeben. Eine aliquote Menge (50 μl) des behandelten Plasmas wurde für den Assay entfernt. IL-6-Standards wurden hergestellt mit Assaypuffer, der 1 %iges (G/V) DTAB enthielt. Arbeitsstandards (10,24–400 pg/ml IL-6) wurden hergestellt in Polypropylenröhrchen mit Assaypuffer, der 1 %iges (G/V) DTAB enthielt. Der biotinylierte Antikörper wurde hergestellt in Puffer, der 3 %iges (G/V) alpha-Cyclodextrin enthielt. 50 μl biotinyliertes Antikörperreagenz (enthaltend Cyclodextrin) wurde zugegeben zu der Anti-IL-6-beschichteten Platte. 50 μl Arbeitsstandard und vorbehandelte Plasmaprobe wurden pepitiert in getrennte Wells der Anti-IL-6-beschichteten Platte. Nicht-spezifisches Binden wurde bestimmt in Abwesenheit von IL-6. Die Anti-IL-6-Platte, enthaltend biotinylierten Antikörper und Standards/Proben, wurde inkubiert für 2 Stunden bei Raumtemperatur. Die Platte wurde gründlich gewaschen, gefolgt von der Zugabe von 100 μl/Well verdünntes (30 μl Konzentrat zu 12 ml Streptavidin-Verdünnungspuffer) Peroxidase-markiertem Streptavidin. Die Platte wurde inkubiert bei Raumtemperatur für 30 Minuten, gefolgt von gründlichem Waschen. 100 μl TMB-Substrat wurde zu jedem Well der Platte gegeben, gefolgt von einer 30-Minuten-Inkubation bei Raumtemperatur. Die Reaktion wurde beendet durch die Zugabe von 100 μl/Well Schwefelsäure. Die optische Dichte wurde bestimmt mit einem Mikrotiterplattenspektrophotometer. Interleukin-6-Gehalte wurden bestimmt unter Verwenden einer log/linearen Analyse mit Bezug auf eine Standardkurve. Gehalte von Cytokin im Plasma wurden bestimmt durch Interpolation. Kontrollproben wurden hergestellt in Abwesenheit des Detergenz und gemessen ohne die Zugabe von Cyclodextrin zu den biotinyierten Antikörpern.
Ergebnisse
Die Wirkungen von Zugeben des Detergenz zu normalen menschlichen Plasmaproben, die mit bekannten Konzentrationen von Rekombinaten IL-6 und 12,5 mg/ml löslichem IL-6-Rezeptor geimpft waren, sind in 4 gezeigt. Die Ausbeute von IL-6, gemessen in Abwesenheit des Detergenz und Cyclodextrin war relativ gering (mittlere Ausbeute 22 %). Proben, behandelt mit Detergenz und gemessen in Anwesenheit von Cyclodextrin, zeigten einen Anstieg in der Ausbeute von zugegebenen IL-6 (mittlere Ausbeute 47 %). Klar ist der Anstieg in der Ausbeute das direkte Ergebnis der Dissoziation von Plasma-IL-6 von dem rekombinaten IL-6-Rezeptor.
5. Direkte Messung von Prostaglandin-E₂ in Plasma
Dieses Experiment beschriebt ein einfaches Verfahren zur direkten Messung von Prostaglandin-E₂ (PGE₂) in Plasma. Gemäß des Verfahrens wird Detergenz zum Plasma gegeben und eine aliquote Menge wird nachfolgend entfernt zur Messung unter Verwenden eines kompetitiven Enzym-Immunoassays (EIA). Die entscheidenden Komponenten des Assays (die Antiseren und das PGE₂-Konjugat) wurden hergestellt in Puffer, der Cyclodextrin enthielt.
Reagenzien und Ausrüstung

Prostaglandin E₂ EIA kit, Amersham Pharmacia Biotech, RPN 222
Normales menschliches Plasma (hergestellt in Anwesenheit von Indomethacin- s. u.)
alpha-Cyclodextrin, USB, 13979
Dodecyltrimethylammoniumbromid (DTAB), Sigma D8638
Entsorgbare Teströhrchen zum Herstellen von Arbeitsstandards
Pipetten und Pipettierausrüstung
Labor-Glasausrüstung
Destilliertes Wasser
Magnetrührer
Mikrotiterplattenwäscher
Mikrotiterplattenleser

Verfahren
Alle Plasmaproben wurden sofort nach dem Sammeln verarbeitet und soweit wie möglich dem Assay unterzogen. Gehalte von PGE₂ im Plasma nehmen signifikant ab, wenn sie bei –15°C bis –30°C für eine Woche gelagert werden. EDTA oder Citrat werden als Anticoagulantien empfohlen. 2g von Dinatrium-EDTA und 0,8 g NaCl wurden zu Wasser gegeben, der pH mit 1 M NaOH auf 7,4 eingestellt und das Endvolumen aufgefüllt auf 100 ml mit destliliertem Wasser. 50 mg Indomethacin wurden zugegeben zu 3,5 ml absolutem Ethanol. Für jedes Blutsammelröhrchen wurden 0,25 ml EDTA-Lösung zu 0,05 ml Indomethacin gegeben. 10 ml frisches Blut wurde zugegeben zu jedem Röhrchen, die Probe unmittelbar bei 15000 × g für 15 Minuten bei 4°C zentrifugiert, die obere Plasmaschicht entfernt und schnell eingefroren. Die Proben wurden gelagert bei –15°C bis –30°C.
Detergenz (DTAB) wurde zugegeben zum Plasma, um eine Endkonzentration von 0,25 % (G/V) zu ergeben. Typischerweise wurden 100 μl 2,5 %iges (G/V) DTAB hergestellt in PGE₂-EIA-Kit-Assaypuffer, zu 900 μl Plasmaprobe gegeben. Eine aliquote Menge (50 μl) des behandelten Plasmas wurde für den Assay entfernt. PGE₂-Standards wurden hergestellt mit Assaypuffer, enthaltend 0,25 %iges (G/V) DTAB.
Arbeits-PGE₂-Standards (2,5–320 pg/Well) wurden hergestellt in Polypropylenröhrchen mit Assaypuffer, der 0,25 %iges (G/V) DTAB enthielt. Der PGE₂-Antikörper und das PGE₂-Konjugat wurden hergestellt mit Assaypuffer, der 1,5 % (G/V) alpha-Cyclodextrin enthielt. 50 μl Arbeitsstandard und DTAB-behandelte Plasmaprobe wurden pipettiert in getrennte Wells einer Ziegen-anti-Maus-IgG- beschichteten Platte. Nicht-spezifisches Binden wurde gemessen in Abwesenheit von PGE₂-Antiseren. Null-Standard-PGE₂ bestand aus Assaypuffer, der 0,25 % (G/V) DTAB enthielt. 50 μl Antiseren und 50 μl Konjugat (hergestellt in Assaypuffer, der 1,5 % (G/V) alpha-Cyclodextrin enthielt) wurden in die geeigneten Testwells pepitiert (enthaltend Standards oder behandelte Plasmaproben). Die Platten wurden inkubiert für eine Stunde bei Raumtemperatur mit konstantem Schütteln, gefolgt von gründlichem Waschen. 150 μl TMB-Substrat wurde zugegeben zu allen Wells und inkubiert für 30 Minuten bei Raumtemperatur. Die Reaktion wurde beendet durch die Zugabe von 100 μl/Well Schwefelsäure. Die optischen Dichten wurden bestimmt mit einem Mikrotiterplattenspektrophotometer, eingestellt auf 450 nm. Intrazelluläre PGE₂-Gehalte wurden bestimmt unter Verwenden einer log/linearen Analyse mit Bezug auf eine Standardkurve. Die Gehalte wurden eingeschätzt durch Interpolation.
Ergebnisse
Die Wirkungen des Zugebens von Detergenz zu Plasmaproben und Cyclodextrin zu den Schlüsselreagenzien des PGE₂-EIA-Systems sind in Tabelle 3 gezeigt. Kontrollproben wurden hergestellt in Abwesenheit von Detergenz und gemessen ohne die Zugabe von Cyclodextrin zu Anitseren und Konjugat. Plasmaproben, behandelt mit Detergenz und gemessen in Anwesenheit von Cyclodextrin zeigten einen beträchtlichen Anstieg in der PGE₂-Konzentration (mittlerer Anstieg von 215 %). Diese unerwartete Beobachtung wird als das Ergebnis der Dissoziation von PGE₂ von einem natürlich auftretenden löslichen PGE₂-Rezeptor betrachtet. Tabelle 3. Messung von PGE₂ in Plasma

Probe Kontrolle (pg/Well) Plasmaproben, behandelt mit Detergenz. Antiseren und Konjugat hergestellt in Cyclodextrin. (pg/Well)

1 5,7 18,0

2 11,5 23,5

3 9,1 20,0

4 7,4 35,0

5 8,9 38,0
6. Ausbeute bekannter Mengen von zugegebenen Prostaglandin E₂ von Plasmaproben
Plasmaproben wurden hergestellt in Anwesenheit von Indomethacin, wie beschrieben in Beispiel 5. Einen Bereich von Konzentrationen des PGE₂ und Verdünnungen des Plasmas wurden bewertet.
Reagenzien und Ausrüstung

Verfahren
PGE₂ wurde zugegeben zu menschlichem Plasma über einen Bereich von Konzentrationen (25–200 pg/ml). Mehrere verschiedene Verdünnungen (reines Plasma, 1:5–1:20) des Plasmas wurden mit PGE₂ geimpft. Typischerweise wurden 100 μl 2,5 %iges (G/V) DTAB hergestellt in PGE₂ EIA-Kit-Assaypuffer, zu 900 μl Plasmaprobe gegeben. Eine aliquote Menge (50 μl) des behandelten Plasmas wurde für den Assay entfernt. PGE₂-Standards wurden hergestellt mit Assaypuffer, enthaltend 0,25 %iges (G/V) DTAB. Arbeits-PGE₂-Standards (2,5–320 μg-Well) wurden hergestellt im Polypropylenröhrchen mit einem Assaypuffer, der 0,25 %iges (G/V) DTAB enthielt. Der PGE₂-Antikörper und das PGE₂-Konjugat wurden hergestellt mit Assaypuffer, der 1,5 %iges (G/V) alpha-Cyclodextrin enthielt. 50 μl Arbeitsstandard und DTAB-behandelte Plasmaproben wurden in verschiedene Wells einer Ziegen-anti-Maus-IgG-beschichteten Platte pepitiert. Nicht-spezifisches Binden wurde gemessen in Abwesenheit von PGE₂-Antiseren. Null-Standard-PGE₂ bestand aus Assaypuffer, der nun 0,25 %iges (G/V) DTAB enthielt. 50 μl Antiseren und 50 μl Konjugat (hergestellt in Assaypuffer, der 1,5 %iges (G/V) alpha-Cyclodextrin enthielt) wurden pepetiert in geeigneten Testwells (enthaltend Standards oder behandelte Plasmaproben). Die Platten wurden inkubiert für eine Stunde bei Raumtemperatur mit konstantem Schütteln, gefolgt von gründlichem Waschen. 150 μl TMB-Substrat wurden zu allen Wells gegeben und inkubiert für 30 Minuten bei Raumtemperatur. Die Reaktion wurde beendet durch die Zugabe von 100 μl/Well Schwefelsäure. Die optischen Dichten wurden bestimmt mit einem Mikrotiterplattenspektophotometer, eingestellt auf 450 nm. Intrazelluläre PGE₂-Gehalte wurden bestimmt unter Verwenden einer log/linearen Analyse mit Bezug auf eine Standardkurve. Gehalte wurden eingeschätzt durch Interpolation. Kontrollproben wurden hergestellt in Abwesenheit von Detergenz und gemessen ohne die Zugabe von Cyclodextrin in Antiseren und Konjugat.
Ergebnisse
Der Wirkung des Zugebens von Detergenz zu normalen menschlichen Plasmaproben, die mit bekannten Konzentrationen von PGE₂ geimpft waren, ist in 5 gezeigt. Die Ausbeute von PGE₂, gemessen in Abwesenheit von Detergenz und Cyclodextrin war relativ gering (mittlere Ausbeute 63 %). Proben, behandelt mit Detergenz und gemessen in Anwesenheit von Cyclodextrin, zeigten einen Anstieg in der Ausbeute von zugegebenen PGE₂ (mittlere Ausbeute 103 %). Diese unerwartete Beobachtung wird als das Ergebnis einer Dissoziation von PGE₂ von natürlich auftretendem löslichem PGE₂-Rezeptor betrachtet.
Legenden für die Figuren
1. Inhibierung des Bindens in dem IL-6 ELISA mit Detergenz
Interleukin-6-Standards (10,24–400 pg/ml) wurden hergestellt in einem Standardverdünnungsmittel, entweder bei Vorhandensein (☐) oder Abwesenheit (•) des Detergenz (1 %iges G/V DTAB). Aliquote Mengen (50 μl) von biotinyliertem Antikörper (null Cyclodextrin) wurden zugegeben zu der Anti-II-6-beschichteten Platte, gefolgt von Standard (50 μl). Die Platte wurde inkubiert für 2 Stunden bei Raumtemperatur und die optische Dichte gemessen wie beschrieben unter dem Verfahrensabschnitt.
2. Wiederherstellung des Bindens in dem IL-6-ELISA mit Cyclodextrin
Interleukin-6 (10,24–400 pg/ml) wurde hergestellt in einem Standardverdünnungsmittel, entweder bei Vorhandensein (☐) oder Abwesenheit (•) des Detergenz (1 %iges G/V DTAB). Aliquote Mengen (50 μl) von biotinyliertem Antikörper, hergestellt in Anwesenheit (☐) oder Abwesenheit (•) von Cyclodextrin (3 %iges G/V) wurden zugegeben zu der Anti-IL-6-beschichteten Platte, gefolgt von Standard (50 μl). Die Platte wurde inkubiert für 2 Stunden bei Raumtemperatur und die optische Dichte gemessen wie beschrieben unter dem Verfahrensabschnitt.
3. Ausbeute von rekombinantem Interleukin-6 aus Plasma
Normale menschliche Plasmaproben wurden geimpft mit Konzentrationen (25–200 pg/ml) von rekombinantem menschlichen Interleukin-6. Proben wurden gemessen bei Vorhandensein (A) und Abwesenheit (B) von Detergenz und Cyclodextrin. Eine Anzahl verschiedener Verdünnung von Plasma wurden bewertet. Assays wurden ausgeführt wie beschrieben unter dem Verfahrensabschnitt.
4. Ausbeute von rekombinatem Interleukin-6 aus Plasma in Anwesenheit eines löslichen IL-6-Rezeptors
Normale menschliche Plasmaproben wurden geimpft mit bekannten Konzentrationen (25–200 pg/ml) von rekombinantem menschlichen Interleukin-6 und löslichem IL-6-Rezeptor (12,5 ng/ml). Proben wurden gemessen in Anwesenheit (A) und Abwesenheit (B) von Detergenz und Cyclodextrin. Eine Anzahl verschiedener Verdünnungen des Plasmas wurden bewertet. Assays wurden ausgeführt wie beschrieben unter dem Verfahrensabschnitt.
5. Ausbeute von PGE₂ aus Plasma
Normale menschliche Plasmaproben wurden geimpft mit bekannten Konzentrationen (25–200 pg/ml) von PGE₂. Proben wurden gemessen in Anwesenheit (A) und Abwesenheit (B) von Detergenz und Cyclodextrin. Eine Anzahl verschiedener Verdünnungen des Plasmas wurden bewertet. Assays wurden ausgeführt wie beschrieben unter dem Verfahrensabschnitt.

Claims

Verfahren des Ausführens eines Assays für einen Analyten, der mindestens teilweise gebunden als ein Komplex mit seinem löslichen Rezeptor oder Bindungsprotein auftritt, wobei das Verfahren die Schritte umfasst: i) Bilden einer Fluid-Mischung durch Mischen einer Zell-freien biologischen Fluidprobe, die den zu bestimmenden Analyten enthält mit einem Detergens zum Dissoziieren des Komplexes, wobei die Konzentration des Detergens im Bereich von 0,25–4 Gew.-% des biologischen Fluids liegt, ii) Mischen der Fluid-Mischung aus Schritt i) mit Reagenzien, umfassend einen spezifischen Bindungspartner des Analyten zum Binden an den Analyten, und Ausführen eines spezifischen Bindungsassays für den Analyten iii) und Mischen der Fluid-Mischung aus Schritt i) mit einem Komplexbildner für das Detergens, wobei die Menge des Komplexbildners im Bereich von 1 bis 5 % der Bindungsreaktionsmischung liegt, wodurch der spezifische Bindungsassay des Schrittes ii) bei Vorhandensein des Komplexbildners ausgeführt wird.
Verfahren nach Anspruch 1, bei dem der Komplexbildner ein Cyclodextrin ist.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 oder 2, bei dem die Schritte i), ii) und iii) alle ausgeführt werden in einem einzigen Reaktionsgefäß.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, bei dem mehrere Assays parallel in Wells einer Multiwellplatte oder mit Assayröhrchen ausgeführt werden.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, bei dem der Assay des Schrittes iii) ein homogener Assay ist.
Verfahren nach Anspruch 5, bei dem der Assay des Schrittes ii) ein Szintillationsproximitäts-Assay ist.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 6, bei dem der spezifische Bindungsassay des Schrittes ii) ein Immunoassay ist.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 7, bei dem der Analyt Interleukin-6 oder Prostaglandin-E₂ ist, das Detergens Dodecyltrimethylammoniumbromid ist und der Komplexbildner α-Cyclodextrin ist.