JP3732090B2 - 全アナライトの測定方法 - Google Patents
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Description
【０００１】
本発明は、イムノアッセイの分野に関連する。本発明は、血清または血漿中の可溶性結合タンパク質またはレセプターと全面的かまたは部分的か何れかで複合をなす種々の型の範囲のアナライトの測定に適当な、簡単で便利の良い方法を提供する。本発明は、分離に基づくイムノアッセイまたは均一イムノアッセイを用いるアナライトの測定に適当な試薬のキットにも関係する。
【０００２】
３０年以上もの間、イムノアッセイは、混合体液中の低濃度アナライトを測定するために選択される方法であった。その方法は、薬剤、ステロイドなどのような低分子量化合物およびタンパク質分子ような巨大分子量化合物の測定に等しく適用された。その技術は、感度および特異性を併せ持ち、サイトカイン、ステロイドホルモン、環状ヌクレオチド、プロスタグランジン、ロイコトリエンおよび成長因子を含む広範囲の強力な生物活性物質の生理学的役割および可能性のある病理学的役割を調べる基礎生物学の研究に使用されてきた。アッセイのデザインは、種々の型のシグナル試薬および検出システムを有するにつれて、過去３０年以上増え続けてきた。コンピューターハードウエアを伴う複雑な機器は、サンプル処理量の増大を目的として発達してきた。イムノアッセイ技術に関連する更なる背景情報は、'The Immunoassay Handbook', (Wild, D. G. Ed, Stockton Press, New York, [1994])に見ることができる。
【０００３】
最も初期の方法には、結合アナライト量の測定ができるよう、遊離アナライトから結合アナライトを分離するステップが含まれていた。木炭吸着、硫酸アンモニウム沈殿を含む種々の分離方法が記載されている。さらに近年になると、固体支持体が、磁性粒子およびマイクロタイターウェルプレートの壁を含むイムノアッセイ法に使用された。最近の発達は、均一ラジオイムノアッセイ技術の導入であり、例えばシンチレーション近接アッセイ(scintillation proximity assay)(ＳＰＡ)であり、米国特許番号４，５６８，６４９に含まれている。
【０００４】
放射性同位元素に基くイムノアッセイ法に代わる他の方法として、非放射性システムが導入された。今日、酵素は、ＥＬＩＳＡおよびＥＩＡと同様なイムノアッセイシステムに最も広く使用されているトレーサーである。比色終点と合せて使用すると、それらにより、高感度で、強力で、正確で、精密で、そして便利のよいイムノアッセイが提供される。重大な進歩は、９６ウェルマイクロタイタープレートの導入により生じた。安価な自動化比色性マルチウェルプレートリーダーが利用可能である。多くの他の非同位元素標識が述べられており、そのうち、発光および蛍光標識が最も普及している。
【０００５】
イムノアッセイの使用が広まったにも拘わらず、特定のサンプル型、顕著なのは血漿および血清から誘導され、可溶性結合タンパク質またはレセプターと全面的にまたは部分的に複合をなすアナライトの測定は未だ困難である。Engelbertら(The Lancet, 338, 515-6, 1991)は、ある範囲のアッセイ型を用い敗血症ショックの患者の血漿サンプル中のＴＮＦαの測定結果を比較し、検出されたＴＮＦ量に顕著な変化が生じたことを示している。この文書では、体液中に存在するＴＮＦ結合タンパク質は、ＴＮＦの生物学的活性を抑制し、種々のアッセイ測定間の矛盾の原因となっていることを提唱している。可溶性レセプターまたは結合タンパク質との複合体型のアナライト測定の困難性は、抗体結合部位のマスキングが原因であり得る。
【０００６】
この問題は、３以下の非中和モノクローナル抗体をサイトカインの測定用の標準ＥＬＩＳＡアッセイに用いる“オリゴクローナル”アッセイシステム(Medgenix)の発達により、以前に対処された。このアッセイ型では、モノクローナル抗体は、レセプターまたは結合タンパク質の結合部位とは認識可能的に異なるエピトープを認識し選択する。結果として、アッセイは、可溶性レセプターまたは阻害剤の干渉がないことが明らかにされ、全サイトカインの測定を可能とする。
【０００７】
米国特許番号４，１２１，９７５(Ullman and Lavine)には、血清サンプルを前処理した後、イムノアッセイによりポリヨードチロニン、特にチロキシンを測定する方法について記載されている。このアッセイでは、アルカリ性サリチラートを血清に試薬として加え、結合タンパク質からチロキシンを放出させた。α-シクロデキストリンもまた、遊離脂肪酸、脂質および薬剤のような内因性干渉分子(endogenous interfering molecule)が天然に生ずる、複合された血清サンプル中に含まれる。サリチラートを可溶状態にとどめおくか、またはイムノアッセイの抗体部分を保護するするため、シクロデキストリンを血清中には加えなかった。さらに、当該方法は、単一のアナライトを用いる使用について記載する。
【０００８】
米国特許番号４，７９８，８０４(Khanna and Pearlman)には、血清の前処理後にジゴキシンイムノアッセイをする方法について記載している。当該方法は、血清サンプルの接触を含み、ある量のβ-シクロデキストリンまたはβ-シクロデキストリンポリマーで、β-シクロデキストリンに結合するサンプル中の実質的ジゴキシン部分となるのに十分な条件下、分析する。β-シクロデキストリン-ジゴキシン複合体を、濾過および遠心分離により他の培地成分から分離する。そのため、サンプルのジゴキシンは高濃度となる。ジゴキシンは、シクロヘキサノールを用いβ-シクロデキストリン複合体から放出され、多くのイムノアッセイ技術により分析され得るジゴキシンサンプルが提供される。
【０００９】
本発明の方法は、新規であり、便利のよい、そして迅速である、サンプル中の全アナライトを定量する方法であって、当該アナライトは、可溶性結合タンパク質またはレセプターとすべてかまたは部分的に結合していてもよい。当該方法は、多数の抗体型の使用に依存せず、アナライトを測定に適当な型とする高価なサンプル操作も必要としない。本明細書中に記載した当該方法は、便利のよいイムノアッセイ技術を、アナライトをレセプターまたは結合タンパク質から解離させるのを仲介する界面活性剤と組合せる。
【００１０】
結果的に、本発明は、可溶性結合タンパク質またはレセプターと複合体として少なくとも部分的に結合するアナライトをアッセイする方法であって、以下のステップを含む方法を提供する：
ｉ)測定するアナライトを含む体液サンプルを、当該複合体を解離する界面活性剤と混合すること、
ii)ステップｉ)のサンプルを、アナライトに結合するアナライトの特異的結合パートナーを含む試薬と混合し、アナライトの特異的結合アッセイを実施すること、および
iii)ステップｉ)のサンプルを当該界面活性剤用の封鎖剤(sequestrant)と混合し、それによってステップii)の結合が封鎖剤存在下で生ずる。
【００１１】
当該アナライトは、体液の一成分である。特異的結合パートナーが利用できる任意のアナライトが、原理的に、本発明に利用し得る。本発明の使用に適当な典型的な特異的結合パートナーの組み合わせは、ハプテン-抗体、薬剤-抗体、ステロイドホルモン-抗体、タンパク質-抗体、ペプチド-抗体およびポリペプチド-抗体相互作用の中から選択され得る。特異的結合タンパク質調製物をこれらシステムの抗体と置換し得る。好ましくは、特異的結合アッセイはタンパク質結合アッセイまたは特にイムノアッセイである。典型的なアナライトには、タンパク質、ペプチド、サイトカイン、ケモカイン、サイクリックＡＭＰおよびｃＧＭＰのような第二メッセンジャー、ホルモン、薬剤、ステロイド、プロスタグランジン、ビタミンおよびロイコトリエンが含まれる。
【００１２】
当該アッセイは、体液サンプル、例えば、血清、血漿または羊水に存在するアナライトを測定するために設計され、当該サンプルであるアナライトは、可溶性レセプターまたは結合タンパク質と複合体としてすべてまたは部分的に結合し得る。好ましい液体は血清および血漿である。
【００１３】
適当に、界面活性剤は、相補的レセプターまたは結合タンパク質からアナライトを分離し得る任意の試薬であり、陽イオン性、陰イオン性、双性イオン性または非イオン性である。適当な界面活性剤の例は、ドデシルトリメチルアンモニウムブロミド(ＤＴＡＢ)、セチルピリジニウムクロリド(ＣＰＣ)、ベンゾチオニウムクロリド(ＢＺＣ)、ドデシル硫酸ナトリウム(ＳＤＳ)、および硫酸Ｎ-ドデシル-Ｎ，Ｎ-ジメチル-３-アンモニオ-１-プロパン(ＤＤＡＰＳ)を含む。ＤＴＡＢ、ＣＰＣおよびＢＺＣは陽イオン性界面活性剤であり、ＤＤＡＰＳは双性イオン性界面活性剤であり、そして、ＳＤＳは陰イオン性界面活性剤である。典型的な界面活性剤濃度は、測定するサンプルの重量の０．２５-４重量％の範囲であり、好ましくは０．５-２．５重量％の範囲である。使用する界面活性剤が少なすぎれば、可溶性レセプターまたは結合タンパク質からのアナライト解離は遅く、または不完全である。測定に適当なアナライトを放出するための界面活性剤の解離活性に加えて、界面活性剤はまた、アッセイのステップii)で加えた特異的結合パートナーへのアナライトによる結合に逆の影響を与える。封鎖剤を使用し、望ましくない逆効果を阻害するか、なくす。
【００１４】
本発明の鍵となる特徴は、界面活性剤の封鎖剤の使用である。この封鎖剤の作用により、界面活性剤およびそれに結合する任意の付随部分が、アナライトとその特異的結合パートナーとの間の結合反応に悪影響を与えることを阻止する。封鎖剤は、例えば化学的に界面活性剤と反応することにより、または物理的にそれを吸収することによってこの作用を行う。好ましい封鎖剤は、シクロデキストリンのような複合炭水化物分子である。シクロデキストリンは、６、７または８グルコース単位を含むトロイダル分子である(α-、β-およびγ-シクロデキストリン)。
【００１５】
環の内側が、界面活性剤のような分子の疎水性末端に結合する。生成する封入体複合体は、界面活性剤とシクロデキストリンとの間で１：１の化学量論で通常形成される。γ-シクロデキストリンおよび特にα-シクロデキストリンが本発明の使用に好ましい。好ましくは、十分量の封鎖剤が用いられ、存在する全ての細胞溶解試薬を封鎖するかまたは不活性化し得る。適当には、封鎖剤量は、反応混合物の重量の０．５-１０重量％、好ましくは１-５重量％である。
【００１６】
好ましくは、多段階が、マイクロタイタープレートのようなマルチプルプレートまたはアッセイチューブにおいて連続的に行われる。望ましいならば、マルチウェルプレートの各ウェルの内容物は、当該方法を実施する間の任意の段階において他のマルチウェルプレートの各ウェルに移し得る。しかし、ステップｉ)、ii)およびiii)は、均一イムノアッセイを用い単一反応容器で好ましくは実施し得る点が本発明の利点である。
【００１７】
好ましくは、ステップｉ)から得られる処置サンプルを、ステップii)およびiii)を行うために、中間の分離または精製を全く行わずに、使用し得る。好ましくは、封鎖剤には、ステップii)の液体サンプルと混合する試薬のうち１つが含まれる。そのため、本発明のアッセイに存在する成分には、
ａ)アナライトを含む可能性があり、または含むと思われるサンプル、
ｂ)界面活性剤、
ｃ)固定化支持体に固定され、または固定可能な、アナライトの非標識特異的結合パートナー、
ｄ)標識されるか、または非標識であってかつ標識され得るかの何れかである、アナライトの特異的結合パートナーまたは類似体
を典型的に含み得る。
【００１８】
ｃ)およびｄ)のどちらかの成分、または両成分には、封鎖剤が含まれ、成分ｃ)およびｄ)の添加の順序は重要ではない。
【００１９】
本発明の１つの型では、イムノアッセイは、酵素結合免疫測定法(ＥＬＩＳＡ)である。この型では、成分ａ)、ｂ)、ｃ)およびｄ)は、マイクロタイターウェルプレートのウェル内に含まれ、成分ｄ)は、試験される化合物の酵素標識特異的結合パートナーである。アッセイ測定は、酵素標識の検出に適当な検出試薬をウェルに加えることにより開始される。本発明の他の型では、イムノアッセイは、ラジオイムノアッセイである。この型では、成分ａ)、ｂ)、ｃ)およびｄ)がアッセイチューブに含まれ、成分ｄ)は、試験される化合物の放射活性標識類似体である。
【００２０】
適当な封鎖剤を、シクロデキストリンを含む複合炭水化物からなる群から選択される。好ましい型では、α-シクロデキストリンを本発明の方法に用いる。
【００２１】
当該方法には、界面活性剤で 測定されるアナライトを含むかまたは含むと思われるサンプルをインキュベーションすること、当該混合物にアナライトの測定用のイムノアッセイを行うために必要な試薬を加えること、そのような１つまたはそれ以上の試薬を封鎖剤を含む緩衝液に溶解すること、および存在するアナライト量の測定として生じるシグナルを測定することを含む。得られたシグナルを、同一手順を用いてアッセイの標準曲線を作成した一群のアナライトの既知量を用い得られたシグナルと比較し得る。
【００２２】
他の態様では、本発明は、記載の方法によりアナライトをアッセイするキットであって、界面活性剤、界面活性剤用の封鎖剤、アナライトの特異的結合パートナー、トレーサーおよび非結合トレーサーから結合トレーサーを分離する分離手段を含むキットを提供する。トレーサーは、アナライトの特異的結合パートナーであるか、または他のアッセイ試薬である標識アッセイ試薬である。構想している分離手段には、例えばＳＰＡビーズまたは磁性ビーズに、またはアッセイ容器の内部表面に固定化されたアッセイ試薬が含まれる。キットにはまた、アナライト標準および緩衝液が含まれる。
【００２３】
ある型では、イムノアッセイ法は、ラジオイムノアッセイであり、その試薬ｄ)は放射性同位元素を含む類似体である。本発明のアッセイ法の使用に適当な放射性同位元素には、トリチウムのようなβ-放射する同位元素およびオージェ電子を放射するヨウ素-１２５を含む。
【００２４】
他の型では、イムノアッセイ法は、酵素-イムノアッセイであり、その試薬ｄ)は、酵素標識に結合するかまたは結合し得る特異的結合パートナーである。本発明の使用に適当な典型的な酵素標識は、アルカリホスファターゼ、β-ガラクトシダーゼ、ワサビのペルオキシダーゼ、リンゴ酸デヒドロゲナーゼおよびグルコース-６-ホスフェートデヒドロゲナーゼである。ワサビのペルオキシダーゼは、本発明の酵素イムノアッセイ法の使用に特に好ましい酵素標識である。
【００２５】
他の型では、標識された特異的結合パートナーには蛍光標識が含まれ得る。本発明の使用に適当な蛍光標識は、フルオレセイン、ローダミンおよびシアニン色素から選択される。
【００２６】
精密なアッセイ型、特異的結合パートナーの選択、検出標識、および試験される物質の性質は、本発明に重要ではない。むしろ、本発明が依存する予測し得ない観察によると、可溶性結合タンパク質またはレセプターと全面的にまたは部分的に複合をなすアナライトがアッセイ法の界面活性剤処置ステップの使用により測定され、それによって封鎖剤も測定に適当な型のアナライトとなるように含まれる。
【００２７】
本発明で使用され得るイムノアッセイ法の解説は以下のアッセイ型のとおりである。
【００２８】
Ｉ．ラジオイムノアッセイ
ｉ)不均一(分離に基づく)ラジオイムノアッセイ(ＲＩＡ)
本発明は、可溶性結合タンパク質またはレセプターとすべてまたは部分的に複合をなすアナライトを測定する単一の方法を提供する。イムノアッセイ試薬(抗血清およびとレーサー)をプロセスのステップｉ)に使用するのと同じウェルに添加し得る。他に、ステップｉ)のサンプルのアリコートを、イムノアッセイ試薬を加える第二容器である各ウェルに移し得る。その後、当該プロセスを、更なるサンプルを調製せずに単一ウェルまたはチューブにおいて実施する。
【００２９】
界面活性剤を測定する血漿または血清サンプルに加え、その後、アナライトの非特異的結合パートナーおよび標識類似体を加え、それらのうちの１つまたは両方を封鎖剤を含む緩衝液中に調製する。試薬を適当な時間ともにインキュベーションする。結合した標識アナライト特異的結合パートナーイムノ複合体を、通常の方法(例えば、木炭吸着、硫酸アンモニウム沈殿または磁性粒子)により非結合標識から分離し、上清またはペレットのアリコートをカウンティングに用いる。サンプル中のアナライト濃度を、標準曲線から内挿により決定する。
【００３０】
ii)シンチレーション近接ＲＩＡ
界面活性剤を血漿または血清サンプルに加え、その後、標識特異的結合パートナー、非標識結合パートナーおよび封鎖剤を含む緩衝液で調製された、二次抗体で誘導化されたシンチレーションビーズを加える。イムノアッセイ試薬(抗血清、トレーサー、封鎖剤中で調製されたＳＰＡビーズ)を、界面活性剤によるサンプルの処置に使用するマイクロタイタープレートと同一のウェルに加え得る。標準を同一プレートのからのマイクロタイターウェルに加える。試薬(抗血清、トレーサーおよびＳＰＡビーズ)をプロセスのステップｉ)に使用するウェルと同一のウェルに加える。他に、ステップｉ)の血漿または血清サンプルのアリコートを封鎖剤中に調製したイムノアッセイ試薬に加える第二容器である各ウェルに移し得る。プレートまたはアッセイチューブを適当な時間インキュベーションし、その後β-シンチレーションカウンターでカウントする。サンプル中のアナライト濃度を、標準曲線から内挿により決定する。
【００３１】
他に、界面活性剤処置の後に、シンチレーションビーズと結合した特異的結合パートナーをアナライトともに、二次特異的結合パートナーと共にインキュベーションする。二次結合パートナーは標識せず、検出は標識する三次結合試薬を介する。
【００３２】
他に、以下の界面活性剤処置、抗原／二次特異的結合パートナー複合体をシンチレーションビーズと結合させ、二次特異的結合パートナーは非標識であり、検出は標識された三次結合試薬を介する。
【００３３】
II．非放射活性イムノアッセイ型
ｉ)酵素イムノアッセイ(ＥＩＡ)
このアプローチは、アナライト特定抗体における制限数の結合部位に対する、非標識アナライトと固定量の酵素標識アナライトの競合に基く。固定量の特定抗体および酵素標識アナライトと共に、抗体が結合する酵素標識リガンド量は、加えた非標識リガンド濃度に反比例する。抗体に結合する酵素標識リガンドを、二次抗体で事前に被覆したポリスチレンマイクロタイターウェル上に固定化する。そして、任意の非結合リガンドを、単に洗浄することによりウェルから除去する。抗体に結合する酵素標識リガンド量は、酵素基質の添加により決定される。
【００３４】
測定する血漿または血清サンプルを、ステップｉ)のように界面活性剤で処理する。常用標準を、界面活性剤を含む緩衝液で調製する。特異的抗体および酵素コンジュゲートを、封鎖剤(シクロデキストリン)を含むアッセイ緩衝液で調製する。標準および前処理血清または血漿サンプルを二次抗体被覆マイクロタイタープレートに加える。非特異的結合を特異的抗血清のない条件下測定する。ゼロ標準は、界面活性剤のみを含むアッセイ緩衝液からなる。特異的抗血清および酵素コンジュゲート(シクロデキストリンを含むアッセイ緩衝液で調製した)をウェル中にピペットする。マイクロタイタープレートをインキュベーションし、その後、洗浄し、酵素基質を加える。光学密度を測定し、血清または血漿サンプル中のアナライト濃度を標準曲線から内挿することにより決定する。
【００３５】
ii)酵素結合免疫測定法(ＥＬＩＳＡ)
このアプローチは定量性“サンドイッチ”酵素イムノアッセイ技術を用いる。アナライトに特異的な抗体は、マイクロタイタープレートのウェル上に被覆される。
【００３６】
測定する血漿または血清サンプルをステップｉ)の界面活性剤で処理する。常用標準をサンプルと同様の方法で界面活性剤を含む緩衝液で調製する。ＥＬＩＳＡシステムの他の成分(例えば、ビオチニル化抗体、酵素標識特異的抗体、ストレプトアビジン標識酵素、非標識特異的抗体および／または酵素標識二次抗体)を加え、封鎖剤(シクロデキストリン)が含まれる。光学密度を測定し、血清または血漿サンプル中のアナライト濃度を標準曲線から内挿することにより決定する。
【００３７】
iii)“ＥＭＩＴ”型(Rubenstein K. E. et al., 1972, Biochem. Biophys. Res. Comm. 47:846)
酵素リンゴ酸デヒドロゲナーゼおよびグルコース-６-ホスフェートデヒドロゲナーゼを、ＥＭＩＴ(Enzyme Multiplied Immunoassay Technique)システムにより例示される均一イムノアッセイにおいて大量に用いる。両酵素を、補因子ＮＡＤからＮＡＤＨ2への変換を３４０ｎｍの分光光度計でモニターする。このアッセイシステムでは、アナライトは、抗体結合部位に対し標識抗原と競合する。抗体を標識抗原に結合させるとき、酵素活性を修飾する。
【００３８】
測定する血漿または血清サンプルをステップｉ)の界面活性剤で処理し、次いで均一ＥＭＩＴ ＥＩＡの他の成分を加え、封鎖剤(シクロデキストリン)を含む緩衝液中に溶解する。光学密度を測定し、サンプル中のアナライト濃度を標準曲線から内挿することにより決定する。
【００３９】
iv)“ＣＥＤＩＡ”型(Henderson D. R. et al., 1986 Clin. Chem. 32, 1637-1641)
クローンドエンザイムドナーイムノアッセイ法では、β-ガラクトシダーゼの２つの不活性断片を遺伝子工学により合成した。大きい断片、酵素アクセプターには、酵素の９５％が含まれ、小さい断片、酵素ドナーは残りの５％からなる。混合によって２つの断片は会合し、β-ガラクトシダーゼ酵素活性を有するテトラマーとなる。このアッセイでは、抗体が抗原に結合するならば酵素アクセプターとの会合をブロックするような方法で抗原を酵素ドナーに連結させる。アナライトの存在下、より少ないコンジュゲートが抗体と結合し、酵素活性が刺激される。アナライトの非存在下では、コンジュゲートに結合する抗体は、活性酵素の形成を阻止する。
【００４０】
測定される血漿または血清サンプルは、ステップｉ)の界面活性剤で処理し、次いで、均一ＣＥＤＩＡ(抗体、酵素-ドナー／リガンドコンジュゲート、酵素アクセプターモノマー)の他の成分を加え、封鎖剤(シクロデキストリン)を含む緩衝液中に溶解する。光学密度を測定し、血清または血漿サンプル中のアナライト濃度を標準曲線から内挿することにより決定する。
【００４１】
ｖ)分離に基づく蛍光イムノアッセイ
他の標識を用いる場合、フルオロホアの使用により、根本的なカテゴリーでは蛍光イムノアッセイ(ＦＩＡ：制限試薬、標識抗原を用いる)および免疫蛍光アッセイ(ＩＦＭＡ：過剰試薬、標識抗体)に分類される多種のイムノアッセイ法が生ずる。基本的に、ＦＩＡおよびＩＦＭＡは、ＥＩＡおよびＥＬＩＳＡのような他のイムノアッセイと同一であるが、フルオロホア(例えば、シアニン色素、ローダミンまたはフルオレセイン)を標識として用いる。
【００４２】
これらのアッセイでは、測定する血漿または血清サンプルをステップｉ)の界面活性剤で処理する。常用標準を、サンプルと同様な方法で界面活性剤を含む緩衝液で調製する。アッセイシステムの他の鍵となる成分を加え、封鎖剤(シクロデキストリン)を含む緩衝液に調製する。蛍光密度を測定し、サンプル中のアナライト濃度を、標準曲線から内挿により測定する。
【００４３】
vi)均一蛍光イムノアッセイ
ａ)蛍光偏光法
蛍光偏光法は、分離の必要もなく遊離アナライトを識別するのに使用する。競合アッセイでは、小分子の場合、トレーサーとして蛍光標識抗原(例えば、フルオレセイン、ローダミンまたはシアニン色素試薬)を用いる。シグナルが発生する段階および検出する段階では、蛍光計は、フルオロホアの励起波長で垂直方向の偏光を生ずる。
【００４４】
ストークスシフトに起因する低波長の放射光を垂直偏光フィルターで検出する。遊離トレーサーは高速で回転するため、放射光は、入射光とは常に異なる面となり、そのため、偏光フィルターを通して検出される光の量は最小となる。しかし、多量の抗体分子に結合するトレーサーは、高速での回転が抑制され、放射光は、入射光と殆ど同じ面となる。測定する血漿または血清をステップｉ)の界面活性剤で処理し、次いで、均一蛍光アッセイ(抗体、蛍光標的抗原)の他の成分を加え、封鎖剤(シクロデキストリン)を含む緩衝液に溶解する。蛍光を測定し、サンプル中のアナライト濃度を標準曲線から内挿により決定する。
【００４５】
ｂ)蛍光共鳴エネルギー転移(ＦＲＥＴ)
別のフルオロホアは時折異なる活性および放射スペクトル(表１参照)を有する。しかし、あるフルオロホアの活性ピークは、他のフルオロホアの放射ピークと重なり得る。この原理を１つまたは２つの方法で均一アッセイに適用し得、それは第二のフルオロホアの性質に依存する。第二フルオロホアが第一の直近(immediate vicinity)に位置するならば、蛍光放射の消光がエネルギー転移を通じて生じる。この原理は、あるフルオロホアを抗体および他のものを抗原に結合することによりＦＲＥＴで使用する。抗原による抗体への結合により、近接(close proximity)およびその後の消光が生じる。他のシステムでは、二種のフルオロホアで標識した、同じ抗原に対し生ずる二群の抗体を含む。２つの抗体による結合により、近接が生じ、そのため、蛍光を消光または減少する２つのリーディングの間でエネルギー転移が生ずる。第二フルオロホアは、エネルギー転移アクセプターとして作用し、クエンチャーとしての作用の代わりにドナーフルオロホアよりも高い波長を放出する。そのため、より高い波長の放射測定は、競合アッセイの抗体またはサンドイッチアッセイの標識抗体に対する標識抗原の結合レベルに反映する。測定する血漿または血清をステップｉ)の界面活性剤で処理し、次いで、均一蛍光エネルギー転移アッセイの他の成分を加え、封鎖剤(シクロデキストリン)を含む緩衝液に溶解する。蛍光を測定し、サンプル中のアナライト濃度を、標準曲線から内挿により決定する。
【表１】
表１．シアニン蛍光色素のスペクトル性
【００４６】
ｃ)時間分解蛍光法
バックグラウンド蛍光には、蛍光イムノアッセイの使用に関する主な問題が１つあり、その存在によりこれら方法の使用が相当制限される。しかし、殆どの生体物質に存在するバックグラウンド蛍光は、数ナノ秒の短い寿命である。蛍光寿命の長いフルオロホアの場合、事実上、すべてのバックグラウンド蛍光が消失したときに蛍光を測定し得る。これは、実質的には、時間分解蛍光の原理であり、この方法は、蛍光エネルギー転位および蛍光偏光技術と組合せて使用し得る。
【００４７】
III．他の方法
この特許明細書に記載する方法は、化学ルミネセンス、比濁分析、ラテックス凝集反応およびそれらの変形型のような他のイムノアッセイ技術に適用し得る。
【００４８】
実施例
１．システムの最適化
インターロイキン-６(ＩＬ-６)の測定は、可溶性レセプターの解離および血漿中の全サイトカインの測定を研究するモデルシステムとして選択された。界面活性剤は、最適濃度を測定するための封鎖剤(sequestrating reagent)と組合せた一連の予備実験に使用した。ＩＬ-６の用量応答曲線を界面活性剤およびシクロデキストリン中で作成した。アッセイ感度、動作範囲および抗原：抗体結合のようなパラメーターを用い、界面活性剤およびシクロデキストリン両方の最も適当な試薬および最適な濃度を設定した。
【００４９】
試薬、緩衝液および装置
ヒトインターロイキン-６ ＥＬＩＳＡキット、Amersham、ＲＰＮ ２７５４
α-シクロデキストリン、ＵＳＢ、１３９７９
ドデシルトリメチルアンモニウムブロミド(ＤＴＡＢ)、Sigma、Ｄ８６３８
常用標準調製用の使い捨て試験チューブ
ピペットおよびピペッティング装置
研究用ガラス製品
蒸留水
マグネティックスターラー
マイクロタイタープレートウオッシャー
マイクロタイタープレートリーダー
【００５０】
方法
標準曲線を以下のように作成した。常用標準(１０．２４-４００ｐｇ/ｍｌ ＩＬ-６)を、１％(ｗ／ｖ)ＤＴＡＢを含むアッセイ緩衝液を有するポリプロピレンチューブ中に調製した。ビオチニル化抗体を、３％(ｗ／ｖ)α-シクロデキストリンを含む緩衝液で調製した。ビオチニル化抗体試薬(シクロデキストリンを含む)５０μｌを抗-ＩＬ-６被覆プレートに加えた。常用標準５０μｌを抗-ＩＬ-６被覆プレートのウェルにピペットした。非特異的結合をＩＬ-６非存在下(ＩＬ-６ゼロの標準)で測定した。ビオチニル化抗体および標準を添加する順序は当該方法に重要でない。しかし、全実施例では、ビオチニル化抗体を標準の前に抗-ＩＬ-６被覆プレートを加えたとき、結果が改善された。ビオチニル化抗体および標準を含む抗-ＩＬ-６プレートを２時間室温でインキュベーションした。プレートを完全に洗浄し、その後、希釈した(ストレプトアビジン希釈緩衝液１２ｍｌに濃縮する３０μｌ)ペルオキシダーゼ標識ストレプトアビジン１００μｌ／ウェルを加えた。プレートを３０分間室温でインキュベーションし、その後、完全に洗浄した。ＴＭＢ基質１００μｌをプレートの各ウェルに加え、３０分間室温でインキュベーションした。当該反応は、硫酸１００μｌ／ウェルの添加により終了した。光学密度をマイクロタイタープレートスペクトロメーターで決定した。
【００５１】
比較は、
アッセイ緩衝液中にのみ標準および抗体(ＤＴＡＢおよびシクロデキストリンなし)
ＤＴＡＢに調製した標準、アッセイ緩衝液中にのみ調製した抗体
を含むアッセイ緩衝液で調製した曲線を用い行った。
【００５２】
結果
ＩＬ-６ ＥＬＩＳＡシステムにおける界面活性剤および封鎖剤を含む効果を図１および２に示している。図１は、１％(ｗ／ｖ)ＤＴＡＢをＩＬ-６アッセイに加えたときの抗体結合の阻害を示す。結合により、３％(ｗ／ｖ)α−シクロデキストリンによるビオチニル化抗-ＩＬ-６抗体への封入が回復する。
【００５３】
２．血漿中の全インターロイキン-６の測定
この実験は、血漿中の全サイトカインの測定用の単一の方法について記載されている。本明細書に記載の当該技術は、界面活性剤を血漿に加え、その後、アリコートを測定用にイムノアッセイ(ＥＬＩＳＡ)技術を用い取出す２ステップの方法である。ＥＬＩＳＡ(ビオチニル化抗体)の重要成分を、シクロデキストリンを含む緩衝液に調製した。
【００５４】
試薬、緩衝液および装置
ヒトインターロイキン-６ ＥＬＩＳＡキット、Amersham、ＲＰＮ ２７５４
通常のヒト血漿
α-シクロデキストリン、ＵＳＢ、１３９７９
ドデシルトリメチルアンモニウムブロミド(ＤＴＡＢ)、Sigma、Ｄ８６３８
常用標準調製用の使い捨て試験チューブ
ピペットおよびピペッティング装置
研究用ガラス製品
蒸留水
マグネティックスターラー
マイクロタイタープレートウオッシャー
マイクロタイタープレートリーダー
【００５５】
方法
界面活性剤(ＤＴＡＢ)を血漿または血清に加え、最終濃度１％(ｗ/ｖ)とした。典型的には、アッセイ緩衝液中１０％(ｗ/ｖ)ＤＴＡＢ１００μｌを血清または血漿サンプル９００μｌに加えた。処理血清または血漿のアリコート(５０μｌ)をアッセイのために取出した。ＩＬ-６標準を、１％(ｗ/ｖ)ＤＴＡＢを含むアッセイ緩衝液で調製した。
【００５６】
常用標準(１０．２４-４００ｐｇ/ｍｌ ＩＬ-６)を、１％(ｗ／ｖ)ＤＴＡＢを含むアッセイ緩衝液を有するポリプロピレンチューブ中に調製した。ビオチニル化抗体を、３％(ｗ／ｖ)α-シクロデキストリンを含む緩衝液で調製した。ビオチニル化抗体試薬(シクロデキストリンを含む)５０μｌを抗-ＩＬ-６被覆プレートに加えた。常用標準５０μｌおよび前処理血清または血漿サンプルを抗-ＩＬ-６被覆プレートのセパレートウェルにピペットした。非特異的結合をＩＬ-６非存在下で測定した。ビオチニル化抗体および標準／サンプルを含む抗-ＩＬ-６プレートを２時間室温でインキュベーションした。プレートを完全に洗浄し、その後、希釈した(ストレプトアビジン希釈緩衝液１２ｍｌに濃縮する３０μｌ)ペルオキシダーゼ標識ストレプトアビジン１００μｌ／ウェルを加えた。プレートを３０分間室温でインキュベーションし、その後、完全に洗浄した。ＴＭＢ基質１００μｌをプレートの各ウェルに加え、３０分間室温でインキュベーションした。当該反応は、硫酸１００μｌ／ウェルの添加により終了した。最適密度をマイクロタイタープレートスペクトロメーターで決定した。ＩＬ-６レベルを、標準曲線を参照して対数／直線分析し、決定した。光学密度を測定し、血清または血漿サンプル中のサイトカインレベルを内挿することにより決定する。
【００５７】
結果
界面活性剤を通常のヒト血漿サンプルに加えた効果およびシクロデキストリンをＩＬ-６ ＥＬＩＳＡシステムの鍵となる試薬に加えた効果を表２に示す。血漿サンプルを測定する前にアッセイ緩衝液で希釈した(ニート血漿および１：５-１：２０希釈)。対照サンプルを界面活性剤の非存在下で調製し、ビオチニル化抗体にシクロデキストリンを添加することなく測定した。界面活性剤で処理し、シクロデキストリン存在下で測定したサンプルでは、重要なＩＬ-６濃度増加(平均１６５％)が見られた。この予測されなかった観察は、天然に生ずる可溶性ＩＬ-６レセプターから血漿ＩＬ-６が解離する結果であると考えられる。
【００５８】
表２．血漿中のＩＬ-６の測定
【表２】
【００５９】
３．血漿サンプル由来の既知量の添加インターロイキン-６の回復
当該方法を利用するため、回復実験を、通常ヒト血漿に加えた既知量のＩＬ-６で行った。サンプルを界面活性剤およびシクロデキストリン存在下および非存在下で測定した。ＩＬ-６の濃度範囲および血漿の希釈範囲を評価した。
【００６０】
試薬、緩衝液および装置
ヒトインターロイキン-６ ＥＬＩＳＡキット、Amersham、ＲＰＮ ２７５４
通常のヒト血漿
組換え体ヒトインターロイキン-６、Amersham、ＡＲＭ ２００１０
α-シクロデキストリン、ＵＳＢ、１３９７９
ドデシルトリメチルアンモニウムブロミド(ＤＴＡＢ)、Sigma、Ｄ８６３８
常用標準調製用の使い捨て試験チューブ
ピペットおよびピペッティング装置
研究用ガラス製品
蒸留水
マグネティックスターラー
マイクロタイタープレートウオッシャー
マイクロタイタープレートリーダー
【００６１】
方法
組換え体ＩＬ-６を、ある濃度範囲(２５-２００ｐｇ/ｍｌ)で通常のヒト血漿に加えた。数種の血漿希釈(ニート血漿、１：５-１：２０)をＩＬ-６でスパイクした。界面活性剤(ＤＴＡＢ)を血漿に加え、最終濃度１％(ｗ/ｖ)とした。典型的には、アッセイ緩衝液中１０％(ｗ/ｖ)ＤＴＡＢ１００μｌを血漿サンプル９００μｌに加えた。処理血漿のアリコート(５０μｌ)をアッセイのために取出した。ＩＬ-６標準を、１％(ｗ/ｖ)ＤＴＡＢを含むアッセイ緩衝液で調製した。
【００６２】
常用標準(１０．２４-４００ｐｇ/ｍｌ ＩＬ-６)を、１％(ｗ／ｖ)ＤＴＡＢを含むアッセイ緩衝液を有するポリプロピレンチューブ中に調製した。ビオチニル化抗体を、３％(ｗ／ｖ)α-シクロデキストリンを含む緩衝液で調製した。ビオチニル化抗体試薬(シクロデキストリンを含む)５０μｌを抗-ＩＬ-６被覆プレートに加えた。常用標準５０μｌ前処理血漿サンプルを抗-ＩＬ-６被覆プレートのセパレートウェルにピペットした。非特異的結合をＩＬ-６非存在下で測定した。ビオチニル化抗体および標準／サンプルを含む抗-ＩＬ-６プレートを２時間室温でインキュベーションした。プレートを完全に洗浄し、その後、希釈した(ストレプトアビジン希釈緩衝液１２ｍｌに濃縮する３０μｌ)ペルオキシダーゼ標識ストレプトアビジン１００μｌ／ウェルを加えた。プレートを３０分間室温でインキュベーションし、その後、完全に洗浄した。ＴＭＢ基質１００μｌをプレートの各ウェルに加え、３０分間室温でインキュベーションした。当該反応は、硫酸１００μｌ／ウェルの添加により終了した。光学密度をマイクロタイタープレートスペクトロメーターで決定した。ＩＬ-６レベルを、標準曲線を参照して対数／直線分析し、決定した。血漿中のサイトカインレベルを内挿することにより決定した。対照サンプルを界面活性剤の非存在下調製し、シクロデキストリンをビオチニル化抗体に加えることなく測定した。
【００６３】
結果
既知濃度の組換え体ＩＬ-６でスパイクした通常のヒト血漿サンプルに界面活性剤を加えた効果を図３に示す。界面活性剤およびシクロデキストリン非存在下で測定したＩＬ-６の回復は比較的低かった(平均６３％回復)。界面活性剤で処置し、シクロデキストリン存在下で測定したサンプルでは、添加ＩＬ-６の回復に増加が見られた(平均回復９３％)。この予測されなかった観察は、天然に生ずる可溶性ＩＬ-６レセプターから血漿ＩＬ-６が解離する結果であると考えられる。
【００６４】
４．可溶性インターロイキン-６レセプターによる血漿サンプルへの効果
回復実験は、通常のヒト血漿に加えた既知量のＩＬ-６および可溶性レセプターで行った。サンプルは、界面活性剤およびシクロデキストリンの存在下および非存在下の両方で測定した。ある濃度範囲のＩＬ-６および希釈範囲の血漿で評価した。
【００６５】
試薬、緩衝液および装置
ヒトインターロイキン-６ ＥＬＩＳＡキット、Amersham、ＲＰＮ ２７５４
通常のヒト血漿
組換え体ヒトインターロイキン-６、Amersham、ＡＲＭ２００１０
組換え体ヒトＩＬ-６可溶性レセプター、Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ、２２７ＳＲ−０２５
α-シクロデキストリン、ＵＳＢ、１３９７９
ドデシルトリメチルアンモニウムブロミド(ＤＴＡＢ)、Sigma、Ｄ８６３８
常用標準調製用の使い捨て試験チューブ
ピペットおよびピペッティング装置
研究用ガラス製品
蒸留水
マグネティックスターラー
マイクロタイタープレートウオッシャー
マイクロタイタープレートリーダー
【００６６】
方法
組換え体ＩＬ-６を、ある濃度範囲(２５-２００ｐｇ/ｍｌ)で通常のヒト血漿に１２．５ｎｇ／ｍｌ可溶性ＩＬ-６レセプター存在下加えた。数種の血漿希釈(ニート血漿、１：５-１：２０)をＩＬ-６でスパイクした。界面活性剤(ＤＴＡＢ)を血漿に加え、最終濃度１％(ｗ/ｖ)とした。典型的には、アッセイ緩衝液中１０％(ｗ/ｖ)ＤＴＡＢ１００μｌを血漿サンプル９００μｌに加えた。処理血漿のアリコート(５０μｌ)をアッセイのために除去した。ＩＬ-６標準を、１％(ｗ/ｖ)ＤＴＡＢを含むアッセイ緩衝液で調製した。
【００６７】
常用標準(１０．２４-４００ｐｇ/ｍｌ ＩＬ-６)を、１％(ｗ／ｖ)ＤＴＡＢを含むアッセイ緩衝液を有するポリプロピレンチューブ中に調製した。ビオチニル化抗体を、３％(ｗ／ｖ)α-シクロデキストリンを含む緩衝液で調製した。ビオチニル化抗体試薬(シクロデキストリンを含む)５０μｌを抗-ＩＬ-６被覆プレートに加えた。常用標準５０μｌおよび前処理血漿サンプルを抗-ＩＬ-６被覆プレートのセパレートウェルにピペットした。非特異的結合をＩＬ-６非存在下で測定した。ビオチニル化抗体および標準／サンプルを含む抗-ＩＬ-６プレートを２時間室温でインキュベーションした。プレートを完全に洗浄し、その後、希釈した(ストレプトアビジン希釈緩衝液１２ｍｌに濃縮する３０μｌ)ペルオキシダーゼ標識ストレプトアビジン１００μｌ／ウェルを加えた。プレートを３０分間室温でインキュベーションし、その後、完全に洗浄した。ＴＭＢ基質１００μｌをプレートの各ウェルに加え、３０分間室温でインキュベーションした。当該反応は、硫酸１００μｌ／ウェルの添加により終了した。光学密度をマイクロタイタープレートスペクトロメーターで決定した。ＩＬ-６レベルを、標準曲線を参照して対数／直線分析し、決定した。血漿中のサイトカインレベルを内挿することにより決定した。対照サンプルを界面活性剤の非存在下調製し、シクロデキストリンをビオチニル化抗体に加えることなく測定した。
【００６８】
結果
既知濃度の組換え体ＩＬ-６および１２．５ｍｇ/ｍｌ可溶性ＩＬ-６レセプターでスパイクした通常のヒト血漿サンプルに界面活性剤を加えた効果を図４に示す。界面活性剤およびシクロデキストリン非存在下で測定したＩＬ-６の回復は比較的低かった(平均２２％回復)。界面活性剤で処置し、シクロデキストリン存在下で測定したサンプルでは、添加ＩＬ-６の回復に増加が見られた(平均回復４７％)。明らかに、回復の増加により、組換え体ＩＬ-６レセプターから血漿ＩＬ-６が解離する直接の結果である。
【００６９】
５．血漿中のプロスタグランジンＥ2の直接測定
この実験は、血漿中のプロスタグランジンＥ2(ＰＧＥ2)の直接測定のための単一の方法を記載する。方法によると、界面活性剤を血漿に加え、その後、アリコートを測定用に競合酵素イムノアッセイ(ＥＩＡ)を取出す。当該アッセイの重要な成分(血清およびＰＧＥ2コンジュゲート)をシクロデキストリンを含む緩衝液に調製した。
【００７０】
試薬および装置
プロスタグランジンＥ2 ＥＩＡキット、Amersham Pharmacia Biotech、ＲＰＮ ２２２
通常のヒト血漿(ヨードメタシン(indomethacin)存在下で調製した−以下参照)
α-シクロデキストリン、ＵＳＢ、１３９７９
ドデシルトリメチルアンモニウムブロミド(ＤＴＡＢ)、Sigma、Ｄ８６３８
常用標準調製用の使い捨て試験チューブ
ピペットおよびピペッティング装置
研究用ガラス製品
蒸留水
マグネティックスターラー
マイクロタイタープレートウオッシャー
マイクロタイタープレートリーダー
【００７１】
方法
全血漿サンプルを、回収後直接用い、できるだけ早くアッセイを行った。１週間−１５℃から−３０℃で保存するならば、血漿中のＰＧＥ2レベルが有意に減少した。ＥＤＴＡまたはシトレートが抗凝結薬として推奨される。ＥＤＴＡナトリウム２ｇおよびＮａＣｌ０．８ｇを水に添加し、ｐＨを１Ｍ ＮａＯＨで７．４に調節し、最終体積を蒸留水で１００ｍｌとした。ヨードメタシン５０ｍｇを無水エタノール３．５ｍｌに加えた。各血液回収チューブでは、ＥＤＴＡ溶液０．２５ｍｌをヨードメタシン０．０５ｍｌに加えた。新しい血液１０ｍｌを各チューブに加え、当該サンプルを直接１５０００×ｇ、４℃で１５分間遠心分離し、上部の血漿層を取り出し、急速冷凍した。サンプルを−１５℃から−３０℃に保存した。
【００７２】
界面活性剤(ＤＴＡＢ)を血漿に加え、最終濃度０．２５%(ｗ/ｖ)とした。典型的には、２．５％(ｗ/ｖ)ＤＴＡＢ１００μｌをＰＧＥ2 ＥＩＡキットアッセイ緩衝液中に調製し、血漿サンプル９００μｌに加えた。処理血漿のアリコート(５０μｌ)をアッセイ用に取出した。ＰＧＥ2標準を、０．２５％(ｗ/ｖ)ＤＴＡＢを含むアッセイ緩衝液で調製した。
【００７３】
常用ＰＧＥ2標準(２．５-３２０ｐｇ/ウェル)を、０．２５％(ｗ／ｖ)ＤＴＡＢを含むアッセイ緩衝液を有するポリプロピレンチューブ中に調製した。ＰＧＥ2抗体およびＰＧＥ2コンジュゲートを、１．５％(ｗ／ｖ)α-シクロデキストリンを含むアッセイ緩衝液で調製した。常用標準５０μｌおよびＤＴＡＢ処理血漿サンプルをヤギ抗マウスＩｇＧ被覆プレートのセパレートウェルにピペットした。非特異的結合をＰＧＥ2抗血清非存在下で測定した。ゼロ標準ＰＧＥ2は、０．２５％(ｗ/ｖ)ＤＴＡＢのみを含むアッセイ緩衝液からなる。抗血清５０μｌおよびコンジュゲート５０μｌ(１.５％(ｗ/ｖ)α-シクロデキストリンを含むアッセイ緩衝液中で調製した)を適当な試験ウェル中にピペットした(標準または処理血漿サンプルを含む)。プレートを１時間室温で一定に攪拌しながらインキュベーションし、その後完全に洗浄した。ＴＭＢ基質１５０μｌを全ウェルに加え、３０分間室温でインキュベーションした。当該反応は、硫酸１００μｌ／ウェルの添加により終了した。光学密度を４５０ｎｍに設定したマイクロタイタープレートスペクトロメーターで決定した。細胞内ＰＧＥ2レベルを、標準曲線を参照して対数／直線分析し、決定した。レベルは内挿することにより決定した。
【００７４】
結果
界面活性剤を血漿サンプルに加えた効果およびシクロデキストリンをＰＧＥ2 ＥＩＡシステムの鍵となる試薬に加えた効果を表３に示す。対照サンプルを界面活性剤の非存在下調製し、抗血清およびコンジュゲートにシクロデキストリンを添加することなく測定した。界面活性剤で処理し、シクロデキストリン存在下で測定した血漿サンプルでは、重要なＰＧＥ2濃度の増加(平均２１５％)が見られた。この予測されなかった観察は、天然に生ずる可溶性ＰＧＥ2レセプターからＰＧＥ2が解離する結果であると考えられる。
表３．血漿中のＰＧＥ2の測定
【表３】
【００７５】
６．血漿サンプルからの既知量の添加プロスタグランジンＥ2の回復
血漿サンプルを実施例５に記載のようにヨードメタシン存在下調製した。ある濃度範囲のＰＧＥ2および希釈範囲の血漿を評価した。
【００７６】
試薬および装置
プロスタグランジンＥ2 ＥＩＡキット、Amersham Pharmacia Biotech、ＲＰＮ ２２２
通常のヒト血漿(ヨードメタシン(indomethacin)存在下で調製した)
α-シクロデキストリン、ＵＳＢ、１３９７９
ドデシルトリメチルアンモニウムブロミド(ＤＴＡＢ)、Sigma、Ｄ８６３８
常用標準調製用の使い捨て試験チューブ
ピペットおよびピペッティング装置
研究用ガラス製品
蒸留水
マグネティックスターラー
マイクロタイタープレートウオッシャー
マイクロタイタープレートリーダー
【００７７】
方法
ＰＧＥ2をヒト血漿にさまざまな濃度範囲(２５-２００ｐｇ/ｍｌ)で加えた。数種の血漿希釈(ニート血漿、１：５-１：２０)をＰＧＥ2でスパイクした。典型的に、ＰＧＥ2 ＥＩＡキットアッセイ緩衝液中に調製した２．５％(ｗ/ｖ)ＤＴＡＢ１００μｌを血漿サンプル９００μｌに加えた。処理血漿のアリコート(５０μｌ)をアッセイ用に取出した。ＰＧＥ2標準を、０．２５％(ｗ/ｖ)ＤＴＡＢを含むアッセイ緩衝液で調製した。常用ＰＧＥ2標準(２．５-３２０ｐｇ/ウェル)を、０．２５％(ｗ／ｖ)ＤＴＡＢを含むアッセイ緩衝液を有するポリプロピレンチューブ中に調製した。ＰＧＥ2抗体およびＰＧＥ2コンジュゲートを、１．５％(ｗ／ｖ)α-シクロデキストリンを含むアッセイ緩衝液で調製した。常用標準５０μｌおよびＤＴＡＢ処理血漿サンプルをヤギ抗マウスＩｇＧ被覆プレートのセパレートウェルにピペットした。非特異的結合をＰＧＥ2抗血清非存在下で測定した。ゼロ標準ＰＧＥ2は、０．２５％(ｗ/ｖ)ＤＴＡＢのみを含むアッセイ緩衝液からなる。抗血清５０μｌおよびコンジュゲート５０μｌ(１.５％(ｗ/ｖ)α-シクロデキストリンを含むアッセイ緩衝液中で調製した)を適当な試験ウェル中にピペットした(標準または処理血漿サンプルを含む)。プレートを１時間室温で一定に攪拌しながらインキュベーションし、その後完全に洗浄した。ＴＭＢ基質１５０μｌを全ウェルに加え、３０分間室温でインキュベーションした。当該反応は、硫酸１００μｌ／ウェルの添加により終了した。光学密度を４５０ｎｍに設定したマイクロタイタープレートスペクトロメーターで決定した。細胞内ＰＧＥ2レベルを、標準曲線を参照して対数／直線分析し、決定した。レベルは内挿することにより決定した。対照サンプルを界面活性剤の非存在下調製し、シクロデキストリンを抗血清およびコンジュゲートに加えることなく測定した。
【００７８】
結果
界面活性剤を通常のヒト血漿サンプルに加え既知濃度のＰＧＥ2でスパイクした効果を表５に示す。界面活性剤およびシクロデキストリンの非存在下測定したＰＧＥ2の回復は、比較的低かった(平均６３％の回復)。界面活性剤で処理し、シクロデキストリン存在下で測定したサンプルでは、添加ＰＧＥ2の回復が増加した(平均回復１０３％)。この予測されなかった観察は、天然に生ずる可溶性ＰＧＥ2レセプターからＰＧＥ2が解離する結果であると考えられる。
【図面の簡単な説明】
【図１】 界面活性剤によるＩＬ-６ＥＬＩＳＡにおける結合阻害
インターロイキン-６標準(１０．２４-４００ｐｇ/ｍｌ)を、界面活性剤(１％ｗ/ｖ ＤＴＡＢ)の存在下(□)または非存在下(●)の何れかで標準希釈中に調製した。ビオチニル化抗体(シクロデキストリンなし)のアリコート(５０μｌ)を抗-ＩＬ-６被覆プレートに加え、その後標準(５０μｌ)を加えた。プレートを２時間室温でインキュベーションし、光学密度を方法セクションで記載したように測定した。
【図２】 シクロデキストリンによるＩＬ-６ ＥＬＩＳＡの結合の回復
インターロイキン-６標準(１０．２４-４００ｐｇ/ｍｌ)を、界面活性剤(１％ｗ/ｖ ＤＴＡＢ)の存在下(□)または非存在下(●)の何れかで標準希釈中に調製した。ビオチニル化抗体のアリコート(５０μｌ)をシクロデキストリン(３％ｗ/ｖ)存在下(□)または非存在下(●)で調製し、抗-ＩＬ-６被覆プレートに加え、その後標準(５０μｌ)を加えた。プレートを２時間室温でインキュベーションし、光学密度を方法セクションで記載したように測定した。
【図３】 血漿の組換え体インターロイキン-６の回復
通常のヒト血漿サンプルを既知濃度の(２５-２００ｐｇ/ｍｌ)組換え体ヒトインターロイキン-６でスパイクした。サンプルを界面活性剤およびシクロデキストリン存在下(Ａ)および非存在下(Ｂ)で測定した。多種の血漿希釈を評価した。アッセイは方法セクションで記載したように行った。
【図４】 可溶性ＩＬ-６レセプター存在下の血漿由来の組換え体インターロイキン-６の回復
通常のヒト血漿サンプルを既知濃度(２５-２００ｐｇ/ｍｌ)の組換え体ヒトインターロイキン-６および可溶性ＩＬ-６レセプター(１２．５ｎｇ/ｍｌ)でスパイクした。サンプルを界面活性剤およびシクロデキストリン存在下(Ａ)および非存在下(Ｂ)で測定した。多種の血漿希釈剤を評価した。アッセイは方法セクションで記載したように行った。
【図５】 血漿由来のＰＧＥ2の回復
通常のヒト血漿サンプルを既知濃度(２５-２００ｐｇ/ｍｌ)のＰＧＥ2でスパイクした。サンプルを界面活性剤およびシクロデキストリン存在下(Ａ)および非存在下(Ｂ)で測定した。多種の血漿希釈を評価した。アッセイは方法セクションで記載したように行った。
本発明は、イムノアッセイの分野に関連する。本発明は、血清または血漿中の可溶性結合タンパク質またはレセプターと全面的かまたは部分的か何れかで複合をなす種々の型の範囲のアナライトの測定に適当な、簡単で便利の良い方法を提供する。本発明は、分離に基づくイムノアッセイまたは均一イムノアッセイを用いるアナライトの測定に適当な試薬のキットにも関係する。
【０００２】
３０年以上もの間、イムノアッセイは、混合体液中の低濃度アナライトを測定するために選択される方法であった。その方法は、薬剤、ステロイドなどのような低分子量化合物およびタンパク質分子ような巨大分子量化合物の測定に等しく適用された。その技術は、感度および特異性を併せ持ち、サイトカイン、ステロイドホルモン、環状ヌクレオチド、プロスタグランジン、ロイコトリエンおよび成長因子を含む広範囲の強力な生物活性物質の生理学的役割および可能性のある病理学的役割を調べる基礎生物学の研究に使用されてきた。アッセイのデザインは、種々の型のシグナル試薬および検出システムを有するにつれて、過去３０年以上増え続けてきた。コンピューターハードウエアを伴う複雑な機器は、サンプル処理量の増大を目的として発達してきた。イムノアッセイ技術に関連する更なる背景情報は、'The Immunoassay Handbook', (Wild, D. G. Ed, Stockton Press, New York, [1994])に見ることができる。
【０００３】
最も初期の方法には、結合アナライト量の測定ができるよう、遊離アナライトから結合アナライトを分離するステップが含まれていた。木炭吸着、硫酸アンモニウム沈殿を含む種々の分離方法が記載されている。さらに近年になると、固体支持体が、磁性粒子およびマイクロタイターウェルプレートの壁を含むイムノアッセイ法に使用された。最近の発達は、均一ラジオイムノアッセイ技術の導入であり、例えばシンチレーション近接アッセイ(scintillation proximity assay)(ＳＰＡ)であり、米国特許番号４，５６８，６４９に含まれている。
【０００４】
放射性同位元素に基くイムノアッセイ法に代わる他の方法として、非放射性システムが導入された。今日、酵素は、ＥＬＩＳＡおよびＥＩＡと同様なイムノアッセイシステムに最も広く使用されているトレーサーである。比色終点と合せて使用すると、それらにより、高感度で、強力で、正確で、精密で、そして便利のよいイムノアッセイが提供される。重大な進歩は、９６ウェルマイクロタイタープレートの導入により生じた。安価な自動化比色性マルチウェルプレートリーダーが利用可能である。多くの他の非同位元素標識が述べられており、そのうち、発光および蛍光標識が最も普及している。
【０００５】
イムノアッセイの使用が広まったにも拘わらず、特定のサンプル型、顕著なのは血漿および血清から誘導され、可溶性結合タンパク質またはレセプターと全面的にまたは部分的に複合をなすアナライトの測定は未だ困難である。Engelbertら(The Lancet, 338, 515-6, 1991)は、ある範囲のアッセイ型を用い敗血症ショックの患者の血漿サンプル中のＴＮＦαの測定結果を比較し、検出されたＴＮＦ量に顕著な変化が生じたことを示している。この文書では、体液中に存在するＴＮＦ結合タンパク質は、ＴＮＦの生物学的活性を抑制し、種々のアッセイ測定間の矛盾の原因となっていることを提唱している。可溶性レセプターまたは結合タンパク質との複合体型のアナライト測定の困難性は、抗体結合部位のマスキングが原因であり得る。
【０００６】
この問題は、３以下の非中和モノクローナル抗体をサイトカインの測定用の標準ＥＬＩＳＡアッセイに用いる“オリゴクローナル”アッセイシステム(Medgenix)の発達により、以前に対処された。このアッセイ型では、モノクローナル抗体は、レセプターまたは結合タンパク質の結合部位とは認識可能的に異なるエピトープを認識し選択する。結果として、アッセイは、可溶性レセプターまたは阻害剤の干渉がないことが明らかにされ、全サイトカインの測定を可能とする。
【０００７】
米国特許番号４，１２１，９７５(Ullman and Lavine)には、血清サンプルを前処理した後、イムノアッセイによりポリヨードチロニン、特にチロキシンを測定する方法について記載されている。このアッセイでは、アルカリ性サリチラートを血清に試薬として加え、結合タンパク質からチロキシンを放出させた。α-シクロデキストリンもまた、遊離脂肪酸、脂質および薬剤のような内因性干渉分子(endogenous interfering molecule)が天然に生ずる、複合された血清サンプル中に含まれる。サリチラートを可溶状態にとどめおくか、またはイムノアッセイの抗体部分を保護するするため、シクロデキストリンを血清中には加えなかった。さらに、当該方法は、単一のアナライトを用いる使用について記載する。
【０００８】
米国特許番号４，７９８，８０４(Khanna and Pearlman)には、血清の前処理後にジゴキシンイムノアッセイをする方法について記載している。当該方法は、血清サンプルの接触を含み、ある量のβ-シクロデキストリンまたはβ-シクロデキストリンポリマーで、β-シクロデキストリンに結合するサンプル中の実質的ジゴキシン部分となるのに十分な条件下、分析する。β-シクロデキストリン-ジゴキシン複合体を、濾過および遠心分離により他の培地成分から分離する。そのため、サンプルのジゴキシンは高濃度となる。ジゴキシンは、シクロヘキサノールを用いβ-シクロデキストリン複合体から放出され、多くのイムノアッセイ技術により分析され得るジゴキシンサンプルが提供される。
【０００９】
本発明の方法は、新規であり、便利のよい、そして迅速である、サンプル中の全アナライトを定量する方法であって、当該アナライトは、可溶性結合タンパク質またはレセプターとすべてかまたは部分的に結合していてもよい。当該方法は、多数の抗体型の使用に依存せず、アナライトを測定に適当な型とする高価なサンプル操作も必要としない。本明細書中に記載した当該方法は、便利のよいイムノアッセイ技術を、アナライトをレセプターまたは結合タンパク質から解離させるのを仲介する界面活性剤と組合せる。
【００１０】
結果的に、本発明は、可溶性結合タンパク質またはレセプターと複合体として少なくとも部分的に結合するアナライトをアッセイする方法であって、以下のステップを含む方法を提供する：
ｉ)測定するアナライトを含む体液サンプルを、当該複合体を解離する界面活性剤と混合すること、
ii)ステップｉ)のサンプルを、アナライトに結合するアナライトの特異的結合パートナーを含む試薬と混合し、アナライトの特異的結合アッセイを実施すること、および
iii)ステップｉ)のサンプルを当該界面活性剤用の封鎖剤(sequestrant)と混合し、それによってステップii)の結合が封鎖剤存在下で生ずる。
【００１１】
当該アナライトは、体液の一成分である。特異的結合パートナーが利用できる任意のアナライトが、原理的に、本発明に利用し得る。本発明の使用に適当な典型的な特異的結合パートナーの組み合わせは、ハプテン-抗体、薬剤-抗体、ステロイドホルモン-抗体、タンパク質-抗体、ペプチド-抗体およびポリペプチド-抗体相互作用の中から選択され得る。特異的結合タンパク質調製物をこれらシステムの抗体と置換し得る。好ましくは、特異的結合アッセイはタンパク質結合アッセイまたは特にイムノアッセイである。典型的なアナライトには、タンパク質、ペプチド、サイトカイン、ケモカイン、サイクリックＡＭＰおよびｃＧＭＰのような第二メッセンジャー、ホルモン、薬剤、ステロイド、プロスタグランジン、ビタミンおよびロイコトリエンが含まれる。
【００１２】
当該アッセイは、体液サンプル、例えば、血清、血漿または羊水に存在するアナライトを測定するために設計され、当該サンプルであるアナライトは、可溶性レセプターまたは結合タンパク質と複合体としてすべてまたは部分的に結合し得る。好ましい液体は血清および血漿である。
【００１３】
適当に、界面活性剤は、相補的レセプターまたは結合タンパク質からアナライトを分離し得る任意の試薬であり、陽イオン性、陰イオン性、双性イオン性または非イオン性である。適当な界面活性剤の例は、ドデシルトリメチルアンモニウムブロミド(ＤＴＡＢ)、セチルピリジニウムクロリド(ＣＰＣ)、ベンゾチオニウムクロリド(ＢＺＣ)、ドデシル硫酸ナトリウム(ＳＤＳ)、および硫酸Ｎ-ドデシル-Ｎ，Ｎ-ジメチル-３-アンモニオ-１-プロパン(ＤＤＡＰＳ)を含む。ＤＴＡＢ、ＣＰＣおよびＢＺＣは陽イオン性界面活性剤であり、ＤＤＡＰＳは双性イオン性界面活性剤であり、そして、ＳＤＳは陰イオン性界面活性剤である。典型的な界面活性剤濃度は、測定するサンプルの重量の０．２５-４重量％の範囲であり、好ましくは０．５-２．５重量％の範囲である。使用する界面活性剤が少なすぎれば、可溶性レセプターまたは結合タンパク質からのアナライト解離は遅く、または不完全である。測定に適当なアナライトを放出するための界面活性剤の解離活性に加えて、界面活性剤はまた、アッセイのステップii)で加えた特異的結合パートナーへのアナライトによる結合に逆の影響を与える。封鎖剤を使用し、望ましくない逆効果を阻害するか、なくす。
【００１４】
本発明の鍵となる特徴は、界面活性剤の封鎖剤の使用である。この封鎖剤の作用により、界面活性剤およびそれに結合する任意の付随部分が、アナライトとその特異的結合パートナーとの間の結合反応に悪影響を与えることを阻止する。封鎖剤は、例えば化学的に界面活性剤と反応することにより、または物理的にそれを吸収することによってこの作用を行う。好ましい封鎖剤は、シクロデキストリンのような複合炭水化物分子である。シクロデキストリンは、６、７または８グルコース単位を含むトロイダル分子である(α-、β-およびγ-シクロデキストリン)。
【００１５】
環の内側が、界面活性剤のような分子の疎水性末端に結合する。生成する封入体複合体は、界面活性剤とシクロデキストリンとの間で１：１の化学量論で通常形成される。γ-シクロデキストリンおよび特にα-シクロデキストリンが本発明の使用に好ましい。好ましくは、十分量の封鎖剤が用いられ、存在する全ての細胞溶解試薬を封鎖するかまたは不活性化し得る。適当には、封鎖剤量は、反応混合物の重量の０．５-１０重量％、好ましくは１-５重量％である。
【００１６】
好ましくは、多段階が、マイクロタイタープレートのようなマルチプルプレートまたはアッセイチューブにおいて連続的に行われる。望ましいならば、マルチウェルプレートの各ウェルの内容物は、当該方法を実施する間の任意の段階において他のマルチウェルプレートの各ウェルに移し得る。しかし、ステップｉ)、ii)およびiii)は、均一イムノアッセイを用い単一反応容器で好ましくは実施し得る点が本発明の利点である。
【００１７】
好ましくは、ステップｉ)から得られる処置サンプルを、ステップii)およびiii)を行うために、中間の分離または精製を全く行わずに、使用し得る。好ましくは、封鎖剤には、ステップii)の液体サンプルと混合する試薬のうち１つが含まれる。そのため、本発明のアッセイに存在する成分には、
ａ)アナライトを含む可能性があり、または含むと思われるサンプル、
ｂ)界面活性剤、
ｃ)固定化支持体に固定され、または固定可能な、アナライトの非標識特異的結合パートナー、
ｄ)標識されるか、または非標識であってかつ標識され得るかの何れかである、アナライトの特異的結合パートナーまたは類似体
を典型的に含み得る。
【００１８】
ｃ)およびｄ)のどちらかの成分、または両成分には、封鎖剤が含まれ、成分ｃ)およびｄ)の添加の順序は重要ではない。
【００１９】
本発明の１つの型では、イムノアッセイは、酵素結合免疫測定法(ＥＬＩＳＡ)である。この型では、成分ａ)、ｂ)、ｃ)およびｄ)は、マイクロタイターウェルプレートのウェル内に含まれ、成分ｄ)は、試験される化合物の酵素標識特異的結合パートナーである。アッセイ測定は、酵素標識の検出に適当な検出試薬をウェルに加えることにより開始される。本発明の他の型では、イムノアッセイは、ラジオイムノアッセイである。この型では、成分ａ)、ｂ)、ｃ)およびｄ)がアッセイチューブに含まれ、成分ｄ)は、試験される化合物の放射活性標識類似体である。
【００２０】
適当な封鎖剤を、シクロデキストリンを含む複合炭水化物からなる群から選択される。好ましい型では、α-シクロデキストリンを本発明の方法に用いる。
【００２１】
当該方法には、界面活性剤で 測定されるアナライトを含むかまたは含むと思われるサンプルをインキュベーションすること、当該混合物にアナライトの測定用のイムノアッセイを行うために必要な試薬を加えること、そのような１つまたはそれ以上の試薬を封鎖剤を含む緩衝液に溶解すること、および存在するアナライト量の測定として生じるシグナルを測定することを含む。得られたシグナルを、同一手順を用いてアッセイの標準曲線を作成した一群のアナライトの既知量を用い得られたシグナルと比較し得る。
【００２２】
他の態様では、本発明は、記載の方法によりアナライトをアッセイするキットであって、界面活性剤、界面活性剤用の封鎖剤、アナライトの特異的結合パートナー、トレーサーおよび非結合トレーサーから結合トレーサーを分離する分離手段を含むキットを提供する。トレーサーは、アナライトの特異的結合パートナーであるか、または他のアッセイ試薬である標識アッセイ試薬である。構想している分離手段には、例えばＳＰＡビーズまたは磁性ビーズに、またはアッセイ容器の内部表面に固定化されたアッセイ試薬が含まれる。キットにはまた、アナライト標準および緩衝液が含まれる。
【００２３】
ある型では、イムノアッセイ法は、ラジオイムノアッセイであり、その試薬ｄ)は放射性同位元素を含む類似体である。本発明のアッセイ法の使用に適当な放射性同位元素には、トリチウムのようなβ-放射する同位元素およびオージェ電子を放射するヨウ素-１２５を含む。
【００２４】
他の型では、イムノアッセイ法は、酵素-イムノアッセイであり、その試薬ｄ)は、酵素標識に結合するかまたは結合し得る特異的結合パートナーである。本発明の使用に適当な典型的な酵素標識は、アルカリホスファターゼ、β-ガラクトシダーゼ、ワサビのペルオキシダーゼ、リンゴ酸デヒドロゲナーゼおよびグルコース-６-ホスフェートデヒドロゲナーゼである。ワサビのペルオキシダーゼは、本発明の酵素イムノアッセイ法の使用に特に好ましい酵素標識である。
【００２５】
他の型では、標識された特異的結合パートナーには蛍光標識が含まれ得る。本発明の使用に適当な蛍光標識は、フルオレセイン、ローダミンおよびシアニン色素から選択される。
【００２６】
精密なアッセイ型、特異的結合パートナーの選択、検出標識、および試験される物質の性質は、本発明に重要ではない。むしろ、本発明が依存する予測し得ない観察によると、可溶性結合タンパク質またはレセプターと全面的にまたは部分的に複合をなすアナライトがアッセイ法の界面活性剤処置ステップの使用により測定され、それによって封鎖剤も測定に適当な型のアナライトとなるように含まれる。
【００２７】
本発明で使用され得るイムノアッセイ法の解説は以下のアッセイ型のとおりである。
【００２８】
Ｉ．ラジオイムノアッセイ
ｉ)不均一(分離に基づく)ラジオイムノアッセイ(ＲＩＡ)
本発明は、可溶性結合タンパク質またはレセプターとすべてまたは部分的に複合をなすアナライトを測定する単一の方法を提供する。イムノアッセイ試薬(抗血清およびとレーサー)をプロセスのステップｉ)に使用するのと同じウェルに添加し得る。他に、ステップｉ)のサンプルのアリコートを、イムノアッセイ試薬を加える第二容器である各ウェルに移し得る。その後、当該プロセスを、更なるサンプルを調製せずに単一ウェルまたはチューブにおいて実施する。
【００２９】
界面活性剤を測定する血漿または血清サンプルに加え、その後、アナライトの非特異的結合パートナーおよび標識類似体を加え、それらのうちの１つまたは両方を封鎖剤を含む緩衝液中に調製する。試薬を適当な時間ともにインキュベーションする。結合した標識アナライト特異的結合パートナーイムノ複合体を、通常の方法(例えば、木炭吸着、硫酸アンモニウム沈殿または磁性粒子)により非結合標識から分離し、上清またはペレットのアリコートをカウンティングに用いる。サンプル中のアナライト濃度を、標準曲線から内挿により決定する。
【００３０】
ii)シンチレーション近接ＲＩＡ
界面活性剤を血漿または血清サンプルに加え、その後、標識特異的結合パートナー、非標識結合パートナーおよび封鎖剤を含む緩衝液で調製された、二次抗体で誘導化されたシンチレーションビーズを加える。イムノアッセイ試薬(抗血清、トレーサー、封鎖剤中で調製されたＳＰＡビーズ)を、界面活性剤によるサンプルの処置に使用するマイクロタイタープレートと同一のウェルに加え得る。標準を同一プレートのからのマイクロタイターウェルに加える。試薬(抗血清、トレーサーおよびＳＰＡビーズ)をプロセスのステップｉ)に使用するウェルと同一のウェルに加える。他に、ステップｉ)の血漿または血清サンプルのアリコートを封鎖剤中に調製したイムノアッセイ試薬に加える第二容器である各ウェルに移し得る。プレートまたはアッセイチューブを適当な時間インキュベーションし、その後β-シンチレーションカウンターでカウントする。サンプル中のアナライト濃度を、標準曲線から内挿により決定する。
【００３１】
他に、界面活性剤処置の後に、シンチレーションビーズと結合した特異的結合パートナーをアナライトともに、二次特異的結合パートナーと共にインキュベーションする。二次結合パートナーは標識せず、検出は標識する三次結合試薬を介する。
【００３２】
他に、以下の界面活性剤処置、抗原／二次特異的結合パートナー複合体をシンチレーションビーズと結合させ、二次特異的結合パートナーは非標識であり、検出は標識された三次結合試薬を介する。
【００３３】
II．非放射活性イムノアッセイ型
ｉ)酵素イムノアッセイ(ＥＩＡ)
このアプローチは、アナライト特定抗体における制限数の結合部位に対する、非標識アナライトと固定量の酵素標識アナライトの競合に基く。固定量の特定抗体および酵素標識アナライトと共に、抗体が結合する酵素標識リガンド量は、加えた非標識リガンド濃度に反比例する。抗体に結合する酵素標識リガンドを、二次抗体で事前に被覆したポリスチレンマイクロタイターウェル上に固定化する。そして、任意の非結合リガンドを、単に洗浄することによりウェルから除去する。抗体に結合する酵素標識リガンド量は、酵素基質の添加により決定される。
【００３４】
測定する血漿または血清サンプルを、ステップｉ)のように界面活性剤で処理する。常用標準を、界面活性剤を含む緩衝液で調製する。特異的抗体および酵素コンジュゲートを、封鎖剤(シクロデキストリン)を含むアッセイ緩衝液で調製する。標準および前処理血清または血漿サンプルを二次抗体被覆マイクロタイタープレートに加える。非特異的結合を特異的抗血清のない条件下測定する。ゼロ標準は、界面活性剤のみを含むアッセイ緩衝液からなる。特異的抗血清および酵素コンジュゲート(シクロデキストリンを含むアッセイ緩衝液で調製した)をウェル中にピペットする。マイクロタイタープレートをインキュベーションし、その後、洗浄し、酵素基質を加える。光学密度を測定し、血清または血漿サンプル中のアナライト濃度を標準曲線から内挿することにより決定する。
【００３５】
ii)酵素結合免疫測定法(ＥＬＩＳＡ)
このアプローチは定量性“サンドイッチ”酵素イムノアッセイ技術を用いる。アナライトに特異的な抗体は、マイクロタイタープレートのウェル上に被覆される。
【００３６】
測定する血漿または血清サンプルをステップｉ)の界面活性剤で処理する。常用標準をサンプルと同様の方法で界面活性剤を含む緩衝液で調製する。ＥＬＩＳＡシステムの他の成分(例えば、ビオチニル化抗体、酵素標識特異的抗体、ストレプトアビジン標識酵素、非標識特異的抗体および／または酵素標識二次抗体)を加え、封鎖剤(シクロデキストリン)が含まれる。光学密度を測定し、血清または血漿サンプル中のアナライト濃度を標準曲線から内挿することにより決定する。
【００３７】
iii)“ＥＭＩＴ”型(Rubenstein K. E. et al., 1972, Biochem. Biophys. Res. Comm. 47:846)
酵素リンゴ酸デヒドロゲナーゼおよびグルコース-６-ホスフェートデヒドロゲナーゼを、ＥＭＩＴ(Enzyme Multiplied Immunoassay Technique)システムにより例示される均一イムノアッセイにおいて大量に用いる。両酵素を、補因子ＮＡＤからＮＡＤＨ2への変換を３４０ｎｍの分光光度計でモニターする。このアッセイシステムでは、アナライトは、抗体結合部位に対し標識抗原と競合する。抗体を標識抗原に結合させるとき、酵素活性を修飾する。
【００３８】
測定する血漿または血清サンプルをステップｉ)の界面活性剤で処理し、次いで均一ＥＭＩＴ ＥＩＡの他の成分を加え、封鎖剤(シクロデキストリン)を含む緩衝液中に溶解する。光学密度を測定し、サンプル中のアナライト濃度を標準曲線から内挿することにより決定する。
【００３９】
iv)“ＣＥＤＩＡ”型(Henderson D. R. et al., 1986 Clin. Chem. 32, 1637-1641)
クローンドエンザイムドナーイムノアッセイ法では、β-ガラクトシダーゼの２つの不活性断片を遺伝子工学により合成した。大きい断片、酵素アクセプターには、酵素の９５％が含まれ、小さい断片、酵素ドナーは残りの５％からなる。混合によって２つの断片は会合し、β-ガラクトシダーゼ酵素活性を有するテトラマーとなる。このアッセイでは、抗体が抗原に結合するならば酵素アクセプターとの会合をブロックするような方法で抗原を酵素ドナーに連結させる。アナライトの存在下、より少ないコンジュゲートが抗体と結合し、酵素活性が刺激される。アナライトの非存在下では、コンジュゲートに結合する抗体は、活性酵素の形成を阻止する。
【００４０】
測定される血漿または血清サンプルは、ステップｉ)の界面活性剤で処理し、次いで、均一ＣＥＤＩＡ(抗体、酵素-ドナー／リガンドコンジュゲート、酵素アクセプターモノマー)の他の成分を加え、封鎖剤(シクロデキストリン)を含む緩衝液中に溶解する。光学密度を測定し、血清または血漿サンプル中のアナライト濃度を標準曲線から内挿することにより決定する。
【００４１】
ｖ)分離に基づく蛍光イムノアッセイ
他の標識を用いる場合、フルオロホアの使用により、根本的なカテゴリーでは蛍光イムノアッセイ(ＦＩＡ：制限試薬、標識抗原を用いる)および免疫蛍光アッセイ(ＩＦＭＡ：過剰試薬、標識抗体)に分類される多種のイムノアッセイ法が生ずる。基本的に、ＦＩＡおよびＩＦＭＡは、ＥＩＡおよびＥＬＩＳＡのような他のイムノアッセイと同一であるが、フルオロホア(例えば、シアニン色素、ローダミンまたはフルオレセイン)を標識として用いる。
【００４２】
これらのアッセイでは、測定する血漿または血清サンプルをステップｉ)の界面活性剤で処理する。常用標準を、サンプルと同様な方法で界面活性剤を含む緩衝液で調製する。アッセイシステムの他の鍵となる成分を加え、封鎖剤(シクロデキストリン)を含む緩衝液に調製する。蛍光密度を測定し、サンプル中のアナライト濃度を、標準曲線から内挿により測定する。
【００４３】
vi)均一蛍光イムノアッセイ
ａ)蛍光偏光法
蛍光偏光法は、分離の必要もなく遊離アナライトを識別するのに使用する。競合アッセイでは、小分子の場合、トレーサーとして蛍光標識抗原(例えば、フルオレセイン、ローダミンまたはシアニン色素試薬)を用いる。シグナルが発生する段階および検出する段階では、蛍光計は、フルオロホアの励起波長で垂直方向の偏光を生ずる。
【００４４】
ストークスシフトに起因する低波長の放射光を垂直偏光フィルターで検出する。遊離トレーサーは高速で回転するため、放射光は、入射光とは常に異なる面となり、そのため、偏光フィルターを通して検出される光の量は最小となる。しかし、多量の抗体分子に結合するトレーサーは、高速での回転が抑制され、放射光は、入射光と殆ど同じ面となる。測定する血漿または血清をステップｉ)の界面活性剤で処理し、次いで、均一蛍光アッセイ(抗体、蛍光標的抗原)の他の成分を加え、封鎖剤(シクロデキストリン)を含む緩衝液に溶解する。蛍光を測定し、サンプル中のアナライト濃度を標準曲線から内挿により決定する。
【００４５】
ｂ)蛍光共鳴エネルギー転移(ＦＲＥＴ)
別のフルオロホアは時折異なる活性および放射スペクトル(表１参照)を有する。しかし、あるフルオロホアの活性ピークは、他のフルオロホアの放射ピークと重なり得る。この原理を１つまたは２つの方法で均一アッセイに適用し得、それは第二のフルオロホアの性質に依存する。第二フルオロホアが第一の直近(immediate vicinity)に位置するならば、蛍光放射の消光がエネルギー転移を通じて生じる。この原理は、あるフルオロホアを抗体および他のものを抗原に結合することによりＦＲＥＴで使用する。抗原による抗体への結合により、近接(close proximity)およびその後の消光が生じる。他のシステムでは、二種のフルオロホアで標識した、同じ抗原に対し生ずる二群の抗体を含む。２つの抗体による結合により、近接が生じ、そのため、蛍光を消光または減少する２つのリーディングの間でエネルギー転移が生ずる。第二フルオロホアは、エネルギー転移アクセプターとして作用し、クエンチャーとしての作用の代わりにドナーフルオロホアよりも高い波長を放出する。そのため、より高い波長の放射測定は、競合アッセイの抗体またはサンドイッチアッセイの標識抗体に対する標識抗原の結合レベルに反映する。測定する血漿または血清をステップｉ)の界面活性剤で処理し、次いで、均一蛍光エネルギー転移アッセイの他の成分を加え、封鎖剤(シクロデキストリン)を含む緩衝液に溶解する。蛍光を測定し、サンプル中のアナライト濃度を、標準曲線から内挿により決定する。
【表１】
表１．シアニン蛍光色素のスペクトル性
ｃ)時間分解蛍光法
バックグラウンド蛍光には、蛍光イムノアッセイの使用に関する主な問題が１つあり、その存在によりこれら方法の使用が相当制限される。しかし、殆どの生体物質に存在するバックグラウンド蛍光は、数ナノ秒の短い寿命である。蛍光寿命の長いフルオロホアの場合、事実上、すべてのバックグラウンド蛍光が消失したときに蛍光を測定し得る。これは、実質的には、時間分解蛍光の原理であり、この方法は、蛍光エネルギー転位および蛍光偏光技術と組合せて使用し得る。
【００４７】
III．他の方法
この特許明細書に記載する方法は、化学ルミネセンス、比濁分析、ラテックス凝集反応およびそれらの変形型のような他のイムノアッセイ技術に適用し得る。
【００４８】
実施例
１．システムの最適化
インターロイキン-６(ＩＬ-６)の測定は、可溶性レセプターの解離および血漿中の全サイトカインの測定を研究するモデルシステムとして選択された。界面活性剤は、最適濃度を測定するための封鎖剤(sequestrating reagent)と組合せた一連の予備実験に使用した。ＩＬ-６の用量応答曲線を界面活性剤およびシクロデキストリン中で作成した。アッセイ感度、動作範囲および抗原：抗体結合のようなパラメーターを用い、界面活性剤およびシクロデキストリン両方の最も適当な試薬および最適な濃度を設定した。
【００４９】
試薬、緩衝液および装置
ヒトインターロイキン-６ ＥＬＩＳＡキット、Amersham、ＲＰＮ ２７５４
α-シクロデキストリン、ＵＳＢ、１３９７９
ドデシルトリメチルアンモニウムブロミド(ＤＴＡＢ)、Sigma、Ｄ８６３８
常用標準調製用の使い捨て試験チューブ
ピペットおよびピペッティング装置
研究用ガラス製品
蒸留水
マグネティックスターラー
マイクロタイタープレートウオッシャー
マイクロタイタープレートリーダー
【００５０】
方法
標準曲線を以下のように作成した。常用標準(１０．２４-４００ｐｇ/ｍｌ ＩＬ-６)を、１％(ｗ／ｖ)ＤＴＡＢを含むアッセイ緩衝液を有するポリプロピレンチューブ中に調製した。ビオチニル化抗体を、３％(ｗ／ｖ)α-シクロデキストリンを含む緩衝液で調製した。ビオチニル化抗体試薬(シクロデキストリンを含む)５０μｌを抗-ＩＬ-６被覆プレートに加えた。常用標準５０μｌを抗-ＩＬ-６被覆プレートのウェルにピペットした。非特異的結合をＩＬ-６非存在下(ＩＬ-６ゼロの標準)で測定した。ビオチニル化抗体および標準を添加する順序は当該方法に重要でない。しかし、全実施例では、ビオチニル化抗体を標準の前に抗-ＩＬ-６被覆プレートを加えたとき、結果が改善された。ビオチニル化抗体および標準を含む抗-ＩＬ-６プレートを２時間室温でインキュベーションした。プレートを完全に洗浄し、その後、希釈した(ストレプトアビジン希釈緩衝液１２ｍｌに濃縮する３０μｌ)ペルオキシダーゼ標識ストレプトアビジン１００μｌ／ウェルを加えた。プレートを３０分間室温でインキュベーションし、その後、完全に洗浄した。ＴＭＢ基質１００μｌをプレートの各ウェルに加え、３０分間室温でインキュベーションした。当該反応は、硫酸１００μｌ／ウェルの添加により終了した。光学密度をマイクロタイタープレートスペクトロメーターで決定した。
【００５１】
比較は、
アッセイ緩衝液中にのみ標準および抗体(ＤＴＡＢおよびシクロデキストリンなし)
ＤＴＡＢに調製した標準、アッセイ緩衝液中にのみ調製した抗体
を含むアッセイ緩衝液で調製した曲線を用い行った。
【００５２】
結果
ＩＬ-６ ＥＬＩＳＡシステムにおける界面活性剤および封鎖剤を含む効果を図１および２に示している。図１は、１％(ｗ／ｖ)ＤＴＡＢをＩＬ-６アッセイに加えたときの抗体結合の阻害を示す。結合により、３％(ｗ／ｖ)α−シクロデキストリンによるビオチニル化抗-ＩＬ-６抗体への封入が回復する。
【００５３】
２．血漿中の全インターロイキン-６の測定
この実験は、血漿中の全サイトカインの測定用の単一の方法について記載されている。本明細書に記載の当該技術は、界面活性剤を血漿に加え、その後、アリコートを測定用にイムノアッセイ(ＥＬＩＳＡ)技術を用い取出す２ステップの方法である。ＥＬＩＳＡ(ビオチニル化抗体)の重要成分を、シクロデキストリンを含む緩衝液に調製した。
【００５４】
試薬、緩衝液および装置
ヒトインターロイキン-６ ＥＬＩＳＡキット、Amersham、ＲＰＮ ２７５４
通常のヒト血漿
α-シクロデキストリン、ＵＳＢ、１３９７９
ドデシルトリメチルアンモニウムブロミド(ＤＴＡＢ)、Sigma、Ｄ８６３８
常用標準調製用の使い捨て試験チューブ
ピペットおよびピペッティング装置
研究用ガラス製品
蒸留水
マグネティックスターラー
マイクロタイタープレートウオッシャー
マイクロタイタープレートリーダー
【００５５】
方法
界面活性剤(ＤＴＡＢ)を血漿または血清に加え、最終濃度１％(ｗ/ｖ)とした。典型的には、アッセイ緩衝液中１０％(ｗ/ｖ)ＤＴＡＢ１００μｌを血清または血漿サンプル９００μｌに加えた。処理血清または血漿のアリコート(５０μｌ)をアッセイのために取出した。ＩＬ-６標準を、１％(ｗ/ｖ)ＤＴＡＢを含むアッセイ緩衝液で調製した。
【００５６】
常用標準(１０．２４-４００ｐｇ/ｍｌ ＩＬ-６)を、１％(ｗ／ｖ)ＤＴＡＢを含むアッセイ緩衝液を有するポリプロピレンチューブ中に調製した。ビオチニル化抗体を、３％(ｗ／ｖ)α-シクロデキストリンを含む緩衝液で調製した。ビオチニル化抗体試薬(シクロデキストリンを含む)５０μｌを抗-ＩＬ-６被覆プレートに加えた。常用標準５０μｌおよび前処理血清または血漿サンプルを抗-ＩＬ-６被覆プレートのセパレートウェルにピペットした。非特異的結合をＩＬ-６非存在下で測定した。ビオチニル化抗体および標準／サンプルを含む抗-ＩＬ-６プレートを２時間室温でインキュベーションした。プレートを完全に洗浄し、その後、希釈した(ストレプトアビジン希釈緩衝液１２ｍｌに濃縮する３０μｌ)ペルオキシダーゼ標識ストレプトアビジン１００μｌ／ウェルを加えた。プレートを３０分間室温でインキュベーションし、その後、完全に洗浄した。ＴＭＢ基質１００μｌをプレートの各ウェルに加え、３０分間室温でインキュベーションした。当該反応は、硫酸１００μｌ／ウェルの添加により終了した。最適密度をマイクロタイタープレートスペクトロメーターで決定した。ＩＬ-６レベルを、標準曲線を参照して対数／直線分析し、決定した。光学密度を測定し、血清または血漿サンプル中のサイトカインレベルを内挿することにより決定する。
【００５７】
結果
界面活性剤を通常のヒト血漿サンプルに加えた効果およびシクロデキストリンをＩＬ-６ ＥＬＩＳＡシステムの鍵となる試薬に加えた効果を表２に示す。血漿サンプルを測定する前にアッセイ緩衝液で希釈した(ニート血漿および１：５-１：２０希釈)。対照サンプルを界面活性剤の非存在下で調製し、ビオチニル化抗体にシクロデキストリンを添加することなく測定した。界面活性剤で処理し、シクロデキストリン存在下で測定したサンプルでは、重要なＩＬ-６濃度増加(平均１６５％)が見られた。この予測されなかった観察は、天然に生ずる可溶性ＩＬ-６レセプターから血漿ＩＬ-６が解離する結果であると考えられる。
【００５８】
表２．血漿中のＩＬ-６の測定
【表２】
３．血漿サンプル由来の既知量の添加インターロイキン-６の回復
当該方法を利用するため、回復実験を、通常ヒト血漿に加えた既知量のＩＬ-６で行った。サンプルを界面活性剤およびシクロデキストリン存在下および非存在下で測定した。ＩＬ-６の濃度範囲および血漿の希釈範囲を評価した。
【００６０】
試薬、緩衝液および装置
ヒトインターロイキン-６ ＥＬＩＳＡキット、Amersham、ＲＰＮ ２７５４
通常のヒト血漿
組換え体ヒトインターロイキン-６、Amersham、ＡＲＭ ２００１０
α-シクロデキストリン、ＵＳＢ、１３９７９
ドデシルトリメチルアンモニウムブロミド(ＤＴＡＢ)、Sigma、Ｄ８６３８
常用標準調製用の使い捨て試験チューブ
ピペットおよびピペッティング装置
研究用ガラス製品
蒸留水
マグネティックスターラー
マイクロタイタープレートウオッシャー
マイクロタイタープレートリーダー
【００６１】
方法
組換え体ＩＬ-６を、ある濃度範囲(２５-２００ｐｇ/ｍｌ)で通常のヒト血漿に加えた。数種の血漿希釈(ニート血漿、１：５-１：２０)をＩＬ-６でスパイクした。界面活性剤(ＤＴＡＢ)を血漿に加え、最終濃度１％(ｗ/ｖ)とした。典型的には、アッセイ緩衝液中１０％(ｗ/ｖ)ＤＴＡＢ１００μｌを血漿サンプル９００μｌに加えた。処理血漿のアリコート(５０μｌ)をアッセイのために取出した。ＩＬ-６標準を、１％(ｗ/ｖ)ＤＴＡＢを含むアッセイ緩衝液で調製した。
【００６２】
常用標準(１０．２４-４００ｐｇ/ｍｌ ＩＬ-６)を、１％(ｗ／ｖ)ＤＴＡＢを含むアッセイ緩衝液を有するポリプロピレンチューブ中に調製した。ビオチニル化抗体を、３％(ｗ／ｖ)α-シクロデキストリンを含む緩衝液で調製した。ビオチニル化抗体試薬(シクロデキストリンを含む)５０μｌを抗-ＩＬ-６被覆プレートに加えた。常用標準５０μｌ前処理血漿サンプルを抗-ＩＬ-６被覆プレートのセパレートウェルにピペットした。非特異的結合をＩＬ-６非存在下で測定した。ビオチニル化抗体および標準／サンプルを含む抗-ＩＬ-６プレートを２時間室温でインキュベーションした。プレートを完全に洗浄し、その後、希釈した(ストレプトアビジン希釈緩衝液１２ｍｌに濃縮する３０μｌ)ペルオキシダーゼ標識ストレプトアビジン１００μｌ／ウェルを加えた。プレートを３０分間室温でインキュベーションし、その後、完全に洗浄した。ＴＭＢ基質１００μｌをプレートの各ウェルに加え、３０分間室温でインキュベーションした。当該反応は、硫酸１００μｌ／ウェルの添加により終了した。光学密度をマイクロタイタープレートスペクトロメーターで決定した。ＩＬ-６レベルを、標準曲線を参照して対数／直線分析し、決定した。血漿中のサイトカインレベルを内挿することにより決定した。対照サンプルを界面活性剤の非存在下調製し、シクロデキストリンをビオチニル化抗体に加えることなく測定した。
【００６３】
結果
既知濃度の組換え体ＩＬ-６でスパイクした通常のヒト血漿サンプルに界面活性剤を加えた効果を図３に示す。界面活性剤およびシクロデキストリン非存在下で測定したＩＬ-６の回復は比較的低かった(平均６３％回復)。界面活性剤で処置し、シクロデキストリン存在下で測定したサンプルでは、添加ＩＬ-６の回復に増加が見られた(平均回復９３％)。この予測されなかった観察は、天然に生ずる可溶性ＩＬ-６レセプターから血漿ＩＬ-６が解離する結果であると考えられる。
【００６４】
４．可溶性インターロイキン-６レセプターによる血漿サンプルへの効果
回復実験は、通常のヒト血漿に加えた既知量のＩＬ-６および可溶性レセプターで行った。サンプルは、界面活性剤およびシクロデキストリンの存在下および非存在下の両方で測定した。ある濃度範囲のＩＬ-６および希釈範囲の血漿で評価した。
【００６５】
試薬、緩衝液および装置
ヒトインターロイキン-６ ＥＬＩＳＡキット、Amersham、ＲＰＮ ２７５４
通常のヒト血漿
組換え体ヒトインターロイキン-６、Amersham、ＡＲＭ２００１０
組換え体ヒトＩＬ-６可溶性レセプター、Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ、２２７ＳＲ−０２５
α-シクロデキストリン、ＵＳＢ、１３９７９
ドデシルトリメチルアンモニウムブロミド(ＤＴＡＢ)、Sigma、Ｄ８６３８
常用標準調製用の使い捨て試験チューブ
ピペットおよびピペッティング装置
研究用ガラス製品
蒸留水
マグネティックスターラー
マイクロタイタープレートウオッシャー
マイクロタイタープレートリーダー
【００６６】
方法
組換え体ＩＬ-６を、ある濃度範囲(２５-２００ｐｇ/ｍｌ)で通常のヒト血漿に１２．５ｎｇ／ｍｌ可溶性ＩＬ-６レセプター存在下加えた。数種の血漿希釈(ニート血漿、１：５-１：２０)をＩＬ-６でスパイクした。界面活性剤(ＤＴＡＢ)を血漿に加え、最終濃度１％(ｗ/ｖ)とした。典型的には、アッセイ緩衝液中１０％(ｗ/ｖ)ＤＴＡＢ１００μｌを血漿サンプル９００μｌに加えた。処理血漿のアリコート(５０μｌ)をアッセイのために除去した。ＩＬ-６標準を、１％(ｗ/ｖ)ＤＴＡＢを含むアッセイ緩衝液で調製した。
【００６７】
常用標準(１０．２４-４００ｐｇ/ｍｌ ＩＬ-６)を、１％(ｗ／ｖ)ＤＴＡＢを含むアッセイ緩衝液を有するポリプロピレンチューブ中に調製した。ビオチニル化抗体を、３％(ｗ／ｖ)α-シクロデキストリンを含む緩衝液で調製した。ビオチニル化抗体試薬(シクロデキストリンを含む)５０μｌを抗-ＩＬ-６被覆プレートに加えた。常用標準５０μｌおよび前処理血漿サンプルを抗-ＩＬ-６被覆プレートのセパレートウェルにピペットした。非特異的結合をＩＬ-６非存在下で測定した。ビオチニル化抗体および標準／サンプルを含む抗-ＩＬ-６プレートを２時間室温でインキュベーションした。プレートを完全に洗浄し、その後、希釈した(ストレプトアビジン希釈緩衝液１２ｍｌに濃縮する３０μｌ)ペルオキシダーゼ標識ストレプトアビジン１００μｌ／ウェルを加えた。プレートを３０分間室温でインキュベーションし、その後、完全に洗浄した。ＴＭＢ基質１００μｌをプレートの各ウェルに加え、３０分間室温でインキュベーションした。当該反応は、硫酸１００μｌ／ウェルの添加により終了した。光学密度をマイクロタイタープレートスペクトロメーターで決定した。ＩＬ-６レベルを、標準曲線を参照して対数／直線分析し、決定した。血漿中のサイトカインレベルを内挿することにより決定した。対照サンプルを界面活性剤の非存在下調製し、シクロデキストリンをビオチニル化抗体に加えることなく測定した。
【００６８】
結果
既知濃度の組換え体ＩＬ-６および１２．５ｍｇ/ｍｌ可溶性ＩＬ-６レセプターでスパイクした通常のヒト血漿サンプルに界面活性剤を加えた効果を図４に示す。界面活性剤およびシクロデキストリン非存在下で測定したＩＬ-６の回復は比較的低かった(平均２２％回復)。界面活性剤で処置し、シクロデキストリン存在下で測定したサンプルでは、添加ＩＬ-６の回復に増加が見られた(平均回復４７％)。明らかに、回復の増加により、組換え体ＩＬ-６レセプターから血漿ＩＬ-６が解離する直接の結果である。
【００６９】
５．血漿中のプロスタグランジンＥ2の直接測定
この実験は、血漿中のプロスタグランジンＥ2(ＰＧＥ2)の直接測定のための単一の方法を記載する。方法によると、界面活性剤を血漿に加え、その後、アリコートを測定用に競合酵素イムノアッセイ(ＥＩＡ)を取出す。当該アッセイの重要な成分(血清およびＰＧＥ2コンジュゲート)をシクロデキストリンを含む緩衝液に調製した。
【００７０】
試薬および装置
プロスタグランジンＥ2 ＥＩＡキット、Amersham Pharmacia Biotech、ＲＰＮ ２２２
通常のヒト血漿(ヨードメタシン(indomethacin)存在下で調製した−以下参照)
α-シクロデキストリン、ＵＳＢ、１３９７９
ドデシルトリメチルアンモニウムブロミド(ＤＴＡＢ)、Sigma、Ｄ８６３８
常用標準調製用の使い捨て試験チューブ
ピペットおよびピペッティング装置
研究用ガラス製品
蒸留水
マグネティックスターラー
マイクロタイタープレートウオッシャー
マイクロタイタープレートリーダー
【００７１】
方法
全血漿サンプルを、回収後直接用い、できるだけ早くアッセイを行った。１週間−１５℃から−３０℃で保存するならば、血漿中のＰＧＥ2レベルが有意に減少した。ＥＤＴＡまたはシトレートが抗凝結薬として推奨される。ＥＤＴＡナトリウム２ｇおよびＮａＣｌ０．８ｇを水に添加し、ｐＨを１Ｍ ＮａＯＨで７．４に調節し、最終体積を蒸留水で１００ｍｌとした。ヨードメタシン５０ｍｇを無水エタノール３．５ｍｌに加えた。各血液回収チューブでは、ＥＤＴＡ溶液０．２５ｍｌをヨードメタシン０．０５ｍｌに加えた。新しい血液１０ｍｌを各チューブに加え、当該サンプルを直接１５０００×ｇ、４℃で１５分間遠心分離し、上部の血漿層を取り出し、急速冷凍した。サンプルを−１５℃から−３０℃に保存した。
【００７２】
界面活性剤(ＤＴＡＢ)を血漿に加え、最終濃度０．２５%(ｗ/ｖ)とした。典型的には、２．５％(ｗ/ｖ)ＤＴＡＢ１００μｌをＰＧＥ2 ＥＩＡキットアッセイ緩衝液中に調製し、血漿サンプル９００μｌに加えた。処理血漿のアリコート(５０μｌ)をアッセイ用に取出した。ＰＧＥ2標準を、０．２５％(ｗ/ｖ)ＤＴＡＢを含むアッセイ緩衝液で調製した。
【００７３】
常用ＰＧＥ2標準(２．５-３２０ｐｇ/ウェル)を、０．２５％(ｗ／ｖ)ＤＴＡＢを含むアッセイ緩衝液を有するポリプロピレンチューブ中に調製した。ＰＧＥ2抗体およびＰＧＥ2コンジュゲートを、１．５％(ｗ／ｖ)α-シクロデキストリンを含むアッセイ緩衝液で調製した。常用標準５０μｌおよびＤＴＡＢ処理血漿サンプルをヤギ抗マウスＩｇＧ被覆プレートのセパレートウェルにピペットした。非特異的結合をＰＧＥ2抗血清非存在下で測定した。ゼロ標準ＰＧＥ2は、０．２５％(ｗ/ｖ)ＤＴＡＢのみを含むアッセイ緩衝液からなる。抗血清５０μｌおよびコンジュゲート５０μｌ(１.５％(ｗ/ｖ)α-シクロデキストリンを含むアッセイ緩衝液中で調製した)を適当な試験ウェル中にピペットした(標準または処理血漿サンプルを含む)。プレートを１時間室温で一定に攪拌しながらインキュベーションし、その後完全に洗浄した。ＴＭＢ基質１５０μｌを全ウェルに加え、３０分間室温でインキュベーションした。当該反応は、硫酸１００μｌ／ウェルの添加により終了した。光学密度を４５０ｎｍに設定したマイクロタイタープレートスペクトロメーターで決定した。細胞内ＰＧＥ2レベルを、標準曲線を参照して対数／直線分析し、決定した。レベルは内挿することにより決定した。
【００７４】
結果
界面活性剤を血漿サンプルに加えた効果およびシクロデキストリンをＰＧＥ2 ＥＩＡシステムの鍵となる試薬に加えた効果を表３に示す。対照サンプルを界面活性剤の非存在下調製し、抗血清およびコンジュゲートにシクロデキストリンを添加することなく測定した。界面活性剤で処理し、シクロデキストリン存在下で測定した血漿サンプルでは、重要なＰＧＥ2濃度の増加(平均２１５％)が見られた。この予測されなかった観察は、天然に生ずる可溶性ＰＧＥ2レセプターからＰＧＥ2が解離する結果であると考えられる。
表３．血漿中のＰＧＥ2の測定
【表３】
６．血漿サンプルからの既知量の添加プロスタグランジンＥ2の回復
血漿サンプルを実施例５に記載のようにヨードメタシン存在下調製した。ある濃度範囲のＰＧＥ2および希釈範囲の血漿を評価した。
【００７６】
試薬および装置
プロスタグランジンＥ2 ＥＩＡキット、Amersham Pharmacia Biotech、ＲＰＮ ２２２
通常のヒト血漿(ヨードメタシン(indomethacin)存在下で調製した)
α-シクロデキストリン、ＵＳＢ、１３９７９
ドデシルトリメチルアンモニウムブロミド(ＤＴＡＢ)、Sigma、Ｄ８６３８
常用標準調製用の使い捨て試験チューブ
ピペットおよびピペッティング装置
研究用ガラス製品
蒸留水
マグネティックスターラー
マイクロタイタープレートウオッシャー
マイクロタイタープレートリーダー
【００７７】
方法
ＰＧＥ2をヒト血漿にさまざまな濃度範囲(２５-２００ｐｇ/ｍｌ)で加えた。数種の血漿希釈(ニート血漿、１：５-１：２０)をＰＧＥ2でスパイクした。典型的に、ＰＧＥ2 ＥＩＡキットアッセイ緩衝液中に調製した２．５％(ｗ/ｖ)ＤＴＡＢ１００μｌを血漿サンプル９００μｌに加えた。処理血漿のアリコート(５０μｌ)をアッセイ用に取出した。ＰＧＥ2標準を、０．２５％(ｗ/ｖ)ＤＴＡＢを含むアッセイ緩衝液で調製した。常用ＰＧＥ2標準(２．５-３２０ｐｇ/ウェル)を、０．２５％(ｗ／ｖ)ＤＴＡＢを含むアッセイ緩衝液を有するポリプロピレンチューブ中に調製した。ＰＧＥ2抗体およびＰＧＥ2コンジュゲートを、１．５％(ｗ／ｖ)α-シクロデキストリンを含むアッセイ緩衝液で調製した。常用標準５０μｌおよびＤＴＡＢ処理血漿サンプルをヤギ抗マウスＩｇＧ被覆プレートのセパレートウェルにピペットした。非特異的結合をＰＧＥ2抗血清非存在下で測定した。ゼロ標準ＰＧＥ2は、０．２５％(ｗ/ｖ)ＤＴＡＢのみを含むアッセイ緩衝液からなる。抗血清５０μｌおよびコンジュゲート５０μｌ(１.５％(ｗ/ｖ)α-シクロデキストリンを含むアッセイ緩衝液中で調製した)を適当な試験ウェル中にピペットした(標準または処理血漿サンプルを含む)。プレートを１時間室温で一定に攪拌しながらインキュベーションし、その後完全に洗浄した。ＴＭＢ基質１５０μｌを全ウェルに加え、３０分間室温でインキュベーションした。当該反応は、硫酸１００μｌ／ウェルの添加により終了した。光学密度を４５０ｎｍに設定したマイクロタイタープレートスペクトロメーターで決定した。細胞内ＰＧＥ2レベルを、標準曲線を参照して対数／直線分析し、決定した。レベルは内挿することにより決定した。対照サンプルを界面活性剤の非存在下調製し、シクロデキストリンを抗血清およびコンジュゲートに加えることなく測定した。
【００７８】
結果
界面活性剤を通常のヒト血漿サンプルに加え既知濃度のＰＧＥ2でスパイクした効果を表５に示す。界面活性剤およびシクロデキストリンの非存在下測定したＰＧＥ2の回復は、比較的低かった(平均６３％の回復)。界面活性剤で処理し、シクロデキストリン存在下で測定したサンプルでは、添加ＰＧＥ2の回復が増加した(平均回復１０３％)。この予測されなかった観察は、天然に生ずる可溶性ＰＧＥ2レセプターからＰＧＥ2が解離する結果であると考えられる。
【図面の簡単な説明】
【図１】 界面活性剤によるＩＬ-６ＥＬＩＳＡにおける結合阻害
インターロイキン-６標準(１０．２４-４００ｐｇ/ｍｌ)を、界面活性剤(１％ｗ/ｖ ＤＴＡＢ)の存在下(□)または非存在下(●)の何れかで標準希釈中に調製した。ビオチニル化抗体(シクロデキストリンなし)のアリコート(５０μｌ)を抗-ＩＬ-６被覆プレートに加え、その後標準(５０μｌ)を加えた。プレートを２時間室温でインキュベーションし、光学密度を方法セクションで記載したように測定した。
【図２】 シクロデキストリンによるＩＬ-６ ＥＬＩＳＡの結合の回復
インターロイキン-６標準(１０．２４-４００ｐｇ/ｍｌ)を、界面活性剤(１％ｗ/ｖ ＤＴＡＢ)の存在下(□)または非存在下(●)の何れかで標準希釈中に調製した。ビオチニル化抗体のアリコート(５０μｌ)をシクロデキストリン(３％ｗ/ｖ)存在下(□)または非存在下(●)で調製し、抗-ＩＬ-６被覆プレートに加え、その後標準(５０μｌ)を加えた。プレートを２時間室温でインキュベーションし、光学密度を方法セクションで記載したように測定した。
【図３】 血漿の組換え体インターロイキン-６の回復
通常のヒト血漿サンプルを既知濃度の(２５-２００ｐｇ/ｍｌ)組換え体ヒトインターロイキン-６でスパイクした。サンプルを界面活性剤およびシクロデキストリン存在下(Ａ)および非存在下(Ｂ)で測定した。多種の血漿希釈を評価した。アッセイは方法セクションで記載したように行った。
【図４】 可溶性ＩＬ-６レセプター存在下の血漿由来の組換え体インターロイキン-６の回復
通常のヒト血漿サンプルを既知濃度(２５-２００ｐｇ/ｍｌ)の組換え体ヒトインターロイキン-６および可溶性ＩＬ-６レセプター(１２．５ｎｇ/ｍｌ)でスパイクした。サンプルを界面活性剤およびシクロデキストリン存在下(Ａ)および非存在下(Ｂ)で測定した。多種の血漿希釈剤を評価した。アッセイは方法セクションで記載したように行った。
【図５】 血漿由来のＰＧＥ2の回復
通常のヒト血漿サンプルを既知濃度(２５-２００ｐｇ/ｍｌ)のＰＧＥ2でスパイクした。サンプルを界面活性剤およびシクロデキストリン存在下(Ａ)および非存在下(Ｂ)で測定した。多種の血漿希釈を評価した。アッセイは方法セクションで記載したように行った。
Claims (10)
- 可溶性レセプターまたは結合タンパク質と複合体として少なくとも部分的に結合するアナライトをアッセイする方法であって、
ｉ)測定するアナライトを含む体液サンプルを、当該複合体を解離する界面活性剤と混合することにより液体混合物を形成すること、
ii)ステップｉ)の液体混合物を、アナライトに結合するアナライトの特異的結合パートナーを含む試薬と混合し、アナライトの特異的結合アッセイを実施すること、および
iii)ステップｉ)の液体混合物を当該界面活性剤用の封鎖剤(sequestrant)と混合し、それによってステップii)の特異的結合アッセイを封鎖剤存在下で生じさせる方法。 - 封鎖剤がシクロデキストリンである、請求項１に記載の方法。
- 封鎖剤量が結合反応混合物の１-５％の範囲である、請求項２に記載の方法。
- ステップｉ)、ii)およびiii)をすべて単一反応容器で行う、請求項１から３の何れか１つに記載の方法。
- マルチプルアッセイを、マルチウェルプレートのウェルまたはアッセイチューブで平行に行う、請求項１から４の何れかに記載の方法。
- ステップii)のアッセイが均一アッセイである、請求項１から６の何れかに記載の方法。
- ステップii)のアッセイがシンチレーション近接アッセイ(scintillation proximity assay)である、請求項６に記載の方法。
- ステップii)の特異的結合アッセイがイムノアッセイである、請求項１から７の何れかに記載の方法。
- アナライトがインターロイキン-６またはプロスタグランジンＥ２であり、界面活性剤がドデシルトリメチルアンモニウムブロミドであり、そして、封鎖剤がα-シクロデキストリンである、請求項１から８の何れかに記載の方法。
- 請求項１から９の何れかにおいて請求した方法による、アナライトのアッセイに適当なキットであって、界面活性剤；界面活性剤の封鎖剤；アナライトの特異的結合パートナー；トレーサー；および非結合トレーサーから結合トレーサーを分離する分離手段を含むキット。
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