DE102006015001A1

DE102006015001A1 - Verfahren zum Nachweis und/oder zur Anreicherung von Analytproteinen und/oder Analytpeptiden aus einer komplexen Proteinmischung

Info

Publication number: DE102006015001A1
Application number: DE102006015001A
Authority: DE
Inventors: Dieter Stoll; Thomas Joos; Markus Templin; Oliver Pötz
Original assignee: NMI Naturwissenschaftliches und Medizinisches Institut
Current assignee: NMI Naturwissenschaftliches und Medizinisches Institut
Priority date: 2006-03-31
Filing date: 2006-03-31
Publication date: 2007-10-11
Also published as: CN101416061A; US20100331199A1; JP2009531679A; CN101416061B; EP1999474A1; EP1999474B1; JP5350215B2; US20160054331A1; WO2007112927A1

Abstract

Die Erfindung betrifft Verfahren zum Nachweisen und/oder Anreichern einer Vielzahl von verschiedenen Analytproteinen und/oder Analytpeptiden aus einer Probenmischung, die Proteine und/oder Peptide aufweist. Bei dem Verfahren wird zunächst die Probenmischung bereitgestellt sowie anschließend erste Bindemoleküle, die spezifisch für ein Peptidepitop der verschiedenen Analytproteine und/oder Analytpeptide sind, wobei das Peptidepitop bis zu maximal fünf Aminosäuren umfasst. In einem nächsten Schritt werden die ersten Bindemoleküle mit der Probenmischung inkubiert und anschließend die an die ersten Bindemoleküle gebundenen Analytproteine und/oder Analytpeptide nachgewiesen.

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zum Nachweis und/oder zur Anreicherung von verschiedenen Analytproteinen und/oder Analytpeptiden aus einer Proteinmischung, die Proteine und/oder Peptide aufweist.
Ferner betrifft die vorliegende Erfindung Bindemoleküle, die spezifisch für den Terminus verschiedener Peptid-Analyten sind, sowie deren Verwendung in einem Verfahren zum Nachweis und/oder zur Anreichung von verschiedenen Analytproteinen und/oder Analytpeptiden aus einer Proteinmischung.
Derartige Verfahren bzw. Bindemoleküle sind umfangreich aus dem Stand der Technik bekannt.
Einsatzgebiete der bekannten Verfahren sind beispielsweise die Proteinanalytik und der Proteinnachweis in komplexen Proben, insbesondere Verfahren zur Analyse des Proteoms im Allgemeinen.
Unter "Proteom" versteht man die quantitative Gesamtheit der Proteine einer Zelle, eines Gewebes oder eines Organismus, also die Kenntnis aller exprimierten Proteine in allen Isoformen, Polymorphismen und posttranslationalen Modifikation, sowie ihrer jeweiligen Konzentrationen, und zwar zu einem bestimmten Zeitpunkt und unter bestimmten äußeren Bedingungen.
Demnach wird der Zustand einer Zelle, eines Gewebes oder eines Organismus insbesondere durch das quantitative Profil seiner Proteine beschrieben. So kann es beispielsweise sein, dass bei einer Krankheit die Expression bestimmter Proteine unterdrückt und die Expression anderer Proteine erhöht wird, oder dass bestimmte Proteine überhaupt erst exprimiert werden, oder dass bestimmte posttranslationale Proteinmodifikationen verändert werden. Daher eignet sich das Proteinprofil als direkter Indikator für den jeweiligen, aktuellen Zustand von Zellen, Geweben, Organen oder Organismen und damit als Krankheits- bzw. Gesundheitsindikator.
Darüber hinaus können über Veränderungen im Proteinprofil die Wirkung von Pharmaka verfolgt sowie deren Nebenwirkungen abgeschätzt werden.
Im Gegensatz zu den hierfür auch oftmals verwendeten mRNA-Profilen besteht bei der Bestimmung des Proteinprofils der Vorteil, dass über die sich verändernden Proteinprofile ein direkter Rückschluss auf die beteiligten Mechanismen möglich ist, da Zellvorgänge in der Regel unter direkter Beteiligung von Proteinen ablaufen, über die die Zellfunktionen ausgeführt werden.
Für eine qualitative und quantitative Erfassung von Proteinprofilen müssen Verfahren zum Nachweis von Proteinen auch in komplexen Proben einen Großteil der Proteine erfassen, wobei es möglich sein sollte, die Menge der Proteine über einen möglichst großen dynamischen Bereich quantitativ zu erfassen.
Dabei besteht eine Schwierigkeit darin, dass sich die Konzentrationen der verschiedenen Proteine in den meisten natürlichen Proben um 9-12 Größenordnungen unterscheiden können. Darüber hinaus gibt es für Proteine, im Gegensatz zu DNA oder RNA, keine Amplifizierungsmöglichkeiten.
Ferner gibt es bisher keine Methode, mit der alle Proteine, also sowohl sehr saure, sehr basische, sehr große, sehr kleine, hydrophobe als auch hydrophile Proteine erfasst werden können.
Gegenwärtig werden prinzipiell zwei Verfahren verwendet, um komplexe Proteome zu erfassen:

– 2D-Elektrophorese mit elektrophoretischer Trennung unterschiedlicher Proteine in zwei Dimensionen und anschließender definierter Proteolyse der getrennten Proteine sowie massenspektrometrischer Identifizierung der jeweiligen Proteinspezies über Peptidmassen.
– Ein- oder mehrdimensionale chromatographische Trennung von Peptiden aus einem definierten proteolytischen Abbau aller Proteine eines Proteoms mit anschließender Identifizierung der Peptide durch Tandem Massenspektrometrie und bioinformatischer Zuordnung der Peptidfragmente zu den ursprünglichen Proteinen des Proteoms über Protein – bzw. Genomdatenbanken.

Ergänzt werden diese Verfahren durch antikörperbasierte Methoden, bei denen Proteine durch die spezifische Bindung an korrespondierende Antikörper qualitativ und quantitativ nachgewiesen werden. Beispiele hierfür sind Western-Blots, ELISA oder Antikörpermikroarrays.
Die zweidimensionale Gel-Elektrophorese (2D.PAGE) trennt Proteine in der ersten Dimension nach isoelektrischem Punkt und in der zweiten Dimension nach Molekulargewicht auf. Sie erlaubt die Analyse komplexer Proteinmischungen mit sehr hoher Trennleistung für bis zu 10000 Proteine. Ein Nachteil dieses Verfahrens besteht darin, dass nur ein Teil der Proteine aus der zu untersuchenden Probe erfasst wird, sehr große und sehr kleine Proteine sowie sehr basische und sehr saure Proteinspezies werden unter Standardbedingungen nicht erfasst.
Darüber hinaus ist dieses Verfahren zeitaufwändig und schwierig reproduzierbar. Aufgrund der unterschiedlichen Anfärbeeffizienz für verschiedene Proteine und des kleinen dynamischen Detektionsbereiches sind quantitative Analysen schwierig und nur mit hohem Aufwand und Probenverbrauch möglich. Dabei kann häufig nur eine kleinere Proteinmenge pro Probe analysiert werden, wodurch Proteine, die nur in geringer Menge in der Probe vorhanden sind, nicht mehr oder zumindest nicht mehr eindeutig nachweisbar sind.
Die chromatografische Proteintrennung erfolgt in der Regel nach Molekülgröße (Größenausschlusschromatographie), Molekülladung (Ionenaustauschchromatographie) oder Hydrophobizität (Umkehrphasenchromatographie, hydrophobe Interaktionschromatographie). Die Trennleistung der chromatographischen Verfahren ist für Proteine kleiner als die der 2D-PAGE. Deshalb werden für Proteomanalysen häufig sehr aufwändige mehrdimensionale Trennungen durchgeführt. Nur antikörperbasierte Nachweisverfahren sind bisher in der Lage, aus komplexen Proteingemischen einzelne Analytproteine zu identifizieren. Allerdings sind etablierte Verfahren wie ELISA nicht für die Analyse von vielen Analyten aus einer Probe geeignet. Verfahren auf Basis von Antikörper-Arrays sind bisher hinsichtlich des parallelen Nachweises vieler unterschiedlicher Proteine aus komplexen Mischungen v.a. durch die geringe Zahl geeigneter, hochselektiver Antikörper limitiert.
Aufgrund der Limitierungen, die alle bisher verfügbaren Methoden zur Proteomanalyse hinsichtlich eines parallelen, schnellen, reproduzierbaren und empfindlichen Nachweises von Analytproteinen aus komplexen Proben haben, ist die reproduzierba re Fraktionierung von Proteinproben für die Proteomanalyse ein entscheidender Arbeitsschritt.
In der Literatur sind zahlreiche Veröffentlichungen bekannt, die sich mit Strategien zur Analyse von Proteomen beschäftigen.
So beschreiben u.a. Graham et al. "Broad-based proteomic strategies: a practical guide to proteomics and functional screening", J. Physiol. 563.1 (2005), S. 1-9, in einem Übersichtsartikel Vorgehensweisen für die Analyse von Proteomen und entwickeln unterschiedliche Strategien für einen qualitativen gegenüber einem quantitativen Ansatz.
Conrads et al., "Cancer Proteomics: many technologies, one goal"), Expert. Rev. Proteomics 2(5), (2005), betonen, dass es wichtig sei, aus der enormen Masse der Daten, die mittels Proteom-Analyse-Verfahren gewonnen werden, Biomarker zu identifizieren, die für Krebs oder andere Krankheiten spezifisch sind.
In Anbetracht der in der Literatur beschriebenen und oben genannten Aspekte der Proteomanalyse und der damit verbundenen Möglichkeiten für die Entwicklung neuer Diagnoseverfahren, Wirkstoffe und Therapien, sind neue Technologien, die die Nachteile bekannter Analysenverfahren vermeiden, von enormer Bedeutung.
Es ist daher Aufgabe der vorliegenden Erfindung, ein neues Verfahren bzw. ein Werkzeug bereitzustellen, mit dessen Hilfe sich Proteome oder Sub-Proteome qualitativ und/oder quantitativ analysieren lassen.
Bei dem eingangs genannten Verfahren wird diese Aufgabe erfindungsgemäß gelöst durch die Schritte:

a) Bereitstellen der Probenmischung und ggf. Fragmentierung der darin enthaltenen Proteine in definierte Peptide,
b) Bereitstellen von ersten Bindemolekülen, die spezifisch für ein Peptidepitop zumindest eines der verschiedenen Analytproteine und/oder Analytpeptide sind, wobei das Peptidepitop bis zu maximal fünf, vorzugsweise zwei bis drei Aminosäuren umfasst,
c) Inkubieren der erste Bindemoleküle mit der Probenmischung, und
d) Nachweisen und/oder Anreichern der an die ersten Bindemoleküle gebundenen verschiedenen Analytproteine und/oder Analytpeptide.

Die der Erfindung zugrunde liegende Aufgabe wird auf diese Weise vollkommen gelöst.
Der Erfindung liegt die überraschende Erkenntnis der Erfinder zugrunde, dass die erfindungsgemäß eingesetzten Bindemoleküle zum Nachweis und/oder zur Anreichung von verschiedenen Analytproteinen und/oder Analytpeptiden aus einer auch komplexen Probenmischung genutzt werden können, obwohl sie wegen der Erkennungssequenz mit definierten Aminosäuren in nur fünf, vorzugsweise vier, drei oder zwei Positionen an eine Vielzahl von Analytproteinen bzw. Analytpeptiden, also eher unselektiv binden.
Einzelne Positionen in der Erkennungssequenz können dabei sogar nur mit teilweise definierten, also einer Gruppe von Aminosäuren zugehörenden Aminosäuren besetzt sein. Beispiel für die Verteilung definierter und teilweise definierter Aminosäuren in einer solchen Erkennungssequenz wären OOXXO, OOXXX, oder OXOXO, wobei O die definierte Aminosäure und X eine Gruppe von Aminosäuren darstellt, wie bspw. die Gruppe der hydrophoben, aliphatischen oder aromatischen Aminosäuren.
Erfindungsgemäß werden also Bindemoleküle eingesetzt, die spezifisch bis zu maximal fünf Aminosäuren aufweisende Epitope erkennen.
Unter „Bindemolekül" wird vorliegend jedes Molekül oder jede Substanz verstanden, das dazu in der Lage ist, an ein Peptid/Protein zu binden, bzw. an welches ein Peptid/Protein binden kann.
Im Rahmen der vorliegenden Erfindung versteht sich, dass dabei jedes Bindemolekül eingesetzt werden kann, das ein Peptidepitop mit bis zu 5 Aminosäuren spezifisch erkennt.
Diese Bindemoleküle bieten die Möglichkeit, nicht nur ein ganz bestimmtes Protein bzw. Peptid aus einer komplexen Proteinmischung herauszufischen, sondern eine Vielzahl von verschiedenen Proteinen bzw. Peptiden, die dieses bis zu max. fünf Aminosäuren umfassende Epitop aufweisen. Es werden also Subproteome angereichert.
Mit dem neuen Verfahren wird es also ermöglicht, aus einer komplexen Protein- oder Peptidmischung mit einem Bindemolekül eine Vielzahl von verschiedenen Proteinen und/oder Peptiden spezifisch zu binden und diese gebundenen Proteine bzw. Peptide, ggf. nach Abtrennung der nicht gebundenen Komponenten der Mischung, in einem weiteren, nachgeschalteten Verfahren weiter zu analysieren.
Im Rahmen der vorliegenden Erfindung werden dabei unter „Analytproteinen/-peptiden" diejenigen Proteine/Peptide verstanden, die aus einer komplexen Probenmischung/Proteinmischung in Schritt c) an die Bindemoleküle binden.
Da die in dem erfindungsgemäßen Verfahren einzusetzenden Bindemoleküle Peptidepitope erkennen, die bis zu maximal fünf Aminosäuren aufweisen, ist die Wahrscheinlichkeit hoch, dass eine Vielzahl von Peptiden/Proteinen dieses Epitop aufweist, so dass auch eine Vielzahl von Peptiden/Proteinen von jeweils einem bestimmten Bindemolekül gebunden wird. Im Stand der Technik werden Bindemoleküle, die an verschiedene Analytproteine oder Peptide binden, als ungeeignet für die Anwendung in biologisch-biochemischen Fragestellungen eingestuft.
Im Rahmen der vorliegenden Erfindung versteht es sich, dass um so mehr Peptide/Proteine eines Proteoms ein bestimmtes Epitop aufweisen, je weniger Aminosäuren das entsprechende, vom Bindemolekül spezifisch erkannte Epitop aufweist bzw. je mehr unterschiedliche Aminosäuren pro Position erlaubt werden.
Damit werden bei einem Einsatz von Bindemolekülen, die für Epitope mit bspw. lediglich 3 Aminosäurenrest spezifisch sind, weitaus mehr Peptide/Proteine gebunden, als bei einem Einsatz von Bindemolekülen, die ein Epitop mit bspw. fünf Aminosäureresten spezifisch erkennen.
Es versteht sich ferner, dass im Rahmen der vorliegenden Erfindung in Schritt b) auch zwei oder mehr unterschiedliche erste Bindemoleküle bereitgestellt werden können, so dass die Menge an zu bindenden Analytproteinen/-peptiden weiter erhöht wird. Daraus ergibt sich die überraschende Möglichkeit, mit einer nach heutigem Stand der Technik herstellbaren, begrenzten Zahl an Bindemolekülen, alle Proteine/Peptide eines Proteoms zu binden. Bei 20 proteinogenen Aminosäuren beträgt die Zahl der theoretisch erforderlichen, unterschiedlichen Bindemoleküle, die 3 definierte Aminosäuren spezifisch binden, 20³ = 8000. Bei Bindung über Epitope mit 5 definierten Aminosäuren wären dagegen bereits 20⁵ = 3,2 Millionen unterschiedliche Bindemoleküle erforderlich, um alle theoretisch möglichen Epitope eines Proteins zu binden.
In einer bevorzugten Ausführungsform wird in Schritt a) eine Probenmischung mit denaturierten Analytproteinen und/oder Analytpeptiden eingesetzt.
Diese Ausführungsform hat den Vorteil, dass bei einem Einsatz denaturierter Proteine die in der Probenmischung denaturiert vorliegenden Proteine für das zumindest eine Bindemolekül leichter zugänglich werden und dieses besser binden können.
In einer weiteren Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens werden in Schritt a) die in der Probenmischung enthaltenen Proteine und/oder Peptide mit zumindest einer spezifischen Protease in definierte Peptide gespalten.
Bei diesem Verfahren wird also zunächst eine komplexe Probenmischung/Proteinmischung bereitgestellt, die Proteine und/oder Peptide aufweist, wobei diese Probenmischung jede beliebige, aus irgendeinem Gewebe oder einer Flüssigkeit gewonnenen Proben-/Proteinmischung sein kann, wie bspw. ein Gewebehomogenat, Serum, etc. Diese Proteinmischung kann durch Zugabe denaturierender Agentien wie bspw. Harnstoff oder Guanidinium-Hydrochlorid, und durch Reduktion und anschließende Alkylierung zusätzlich denaturiert werden, so dass bevorzugt entfaltete, für Proteasen zugängliche Proteinketten vorhanden sind. Die native oder denaturierte Proben-/Proteinmischung wird mit selektive spaltenden Proteasen wie zB. Trypsin oder Endoproteinase Lys C behandelt, welche die in der Probe vorliegenden Peptide/Proteine in kleinere, durch die Spezifität der Protease definierte Teilstücke spalten. Daneben existieren eine ganze Reihe von dem Fachmann bekannten Endo- oder Exoproteasen, die für eine spezifische Proteolyse eingesetzt werden können. Durch Wahl der Denaturierung der Proteinprobe kann die Zahl der möglichen Spaltpeptide bei Proteolyse gesteuert und die Komplexität der Analysenprobe eingestellt werden.
Nach Verdau mit einer oder mehreren Proteasen entsteht eine Peptidmischung, die in Schritt a) bereitgestellt wird. Nach Bereitstellung der Bindemoleküle in Schritt b), wird die Peptidmischung mit den Bindemolekülen inkubiert, wobei die Bindemoleküle an die entsprechenden Epitope der Peptide binden, und die entsprechenden, an die Bindemoleküle gebundenen Analytpeptide nachgewiesen/angereichert werden können.
Dieses Verfahren, also der Einsatz einer Peptidmischung in Schritt a) mit spezifischer Proteolyse einer Probenmischung hat u.a. auch den Vorteil, dass durch den proteolytischen Abbau die Termini der einzelnen Analytpeptide für die Bindemoleküle zugänglich sind.
In einer bevorzugten Ausführung werden Bindemoleküle eingesetzt, die direkt am C-/bzw. N-terminalen Ende binden, wodurch die Kreuzreaktivität bei kurzen Bindungsepitopen noch weiter stark reduziert werden kann. Gleichzeitig werden durch die proteolytische Fragmentierung eines Analytproteins mehrere nachweisbare Analytproteine generiert, wodurch ein redundanter Nachweis ermöglicht wird.
Gemäß einer weitere Ausführungsform werden in Schritt b) erste Bindemoleküle bereitgestellt, die an einer oder mehreren Positionen des Peptidepitops eine Aminosäurengruppen-spezifische Erkennung aufweisen.
Diese Ausführungsform hat danach den Vorteil, dass Bindemoleküle bereitgestellt werden, die für ein Epitop mit maximal bis zu fünf Aminosäuren spezifisch sind, wobei mindestens eine dieser Aminosäuren lediglich gruppenspezifisch erkannt wird, also bspw. aufgrund einer positiven oder negativen Ladung der betreffenden Aminosäure, wegen der hydrophob aliphatischen Eigenschaft der Aminosäure, etc. Im Stand der Technik ist es bekannt, Aminosäuren in Gruppen mit ähnlichen/identischen Eigenschaften zu klassifizieren. So zählen bspw. zu den aliphatischen hydrophoben Aminosäuren Alanin, Valin, Leucin und Isoleucin, zu den aromatischen Aminosäuren Tryptophan, Tyrosin und Phenylalanin, zu den sauren Aminosäuren Asparaginsäure und Glutaminsäure und zu den basischen Aminosäuren Lysin, Histidin und Arginin. Daher können entsprechend solcher Gruppeneintei lungen Bindemoleküle geschaffen und bereitgestellt werden, die bspw. innerhalb des entsprechenden Epitops an dessen Position 3 außer Glycin auch Alanin, Valin, Leucin und Isoleucin erkennen und somit insgesamt mehr Peptide binden, als Bindemoleküle, die keine gruppenspezifische Erkennung für zumindest eine Position des Peptids aufweisen. In einer weiteren Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens werden in Schritt b) erste Bindemoleküle bereitgestellt, die spezifisch für einen der beiden terminalen Peptidepitope der Analytproteine und/oder Analytpeptide sind, wobei das terminale Peptidepitop die freie NH₂-Gruppe oder die freie COOH-Gruppe und jeweils bis zu maximal fünf Aminosäuren umfasst.
Der Vorteil bei dieser Ausführungsform besteht darin, dass mit den erfindungsgemäß einzusetzenden Bindemolekülen wirksame Werkzeuge bereitgestellt werden, die spezifisch und stabil an die jeweiligen Termini binden. Hierbei spielt die Erkenntnis der Erfinder eine Rolle, dass für eine stabile Bindung lediglich bis zu maximal fünf Aminosäuren notwendig sind, und dass die terminale funktionelle Gruppe auf die Bindung einen so starken Einfluß haben kann, dass bei terminalen Epitopen mit wenigen Aminosäuren keine Kreuzreaktivität zu internen Epitopen mit derselben Aminosäurensequenz auftritt. Durch die Bindung an die Termini der Peptide besteht darüber hinaus die Möglichkeit, dass in einem nachfolgenden Schritt ein weiteres Bindemolekül eingesetzt werden kann, das an das andere terminalen Peptidepitop des isolierten/identifizierten Analytpeptids binden kann, so dass über den Einsatz eines weiteren Bindemoleküls die Peptide weiter selektioniert werden können.
Durch die kombinierte Bindung von Bindemolekülen an zwei kurze terminale Epitope (C-Terminus und N-Terminus), die jeweils aus maximal fünf Aminosäuren bestehen, ist überraschenderweise ein spezifischer Nachweis des Peptides auch dann möglich, wenn die Bindung jedes einzelnen Bindemoleküles für sich auch bei einer größeren Anzahl unterschiedlicher Peptide eines Proteoms auftritt. Das beschriebene Verfahren ermöglicht demzufolge den eindeutigen Nachweis eines bestimmten Peptides über ein geteiltes spezifisches Epitop.
In einer Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens ist bevorzugt, wenn die zumindest ersten Bindemoleküle auf einem Träger immobilisiert sind. Dabei ist insbesondere bevorzugt, wenn der Träger ausgewählt ist aus der Gruppe umfassend Mikroarrays, Trägermaterial für Affinitätssäulen, Chromatographiematerialien, Mikrokanalstrukturen, Kapillaroberflächen, Sensoroberflächen, polymere poröse Schwammstrukturen, Mikrosphären (oder „Beads").
Diese Ausführungsform hat den Vorteil, dass in Schritt b) die Bindemoleküle durch deren Immobilisierung auf einem Träger einfacher gehandhabt und bereitgestellt werden können und damit insgesamt ein praktisches Werkzeug für das erfindungsgemäße Verfahren darstellen. Dabei können die Bindemoleküle bspw. genau definiert in einem Array auf dem Träger angebracht werden, sowohl was die Bindemolekül-Menge, als auch die Ausrichtung und Anordnung auf dem Träger anbelangt, wobei diese Parameter von dem jeweils einzusetzenden Trägermaterial abhängen. Vorteilhafterweise können der Träger bzw. die auf dem Träger über die Bindemoleküle gebundenen Analytpeptide dann weiter analysiert werden.
Vorliegend kommen als Beads (oder „Mikrosphären") bspw. kodierte Beads (bspw. fluoreszenz- oder farbkodierte) oder magnetische Beads, u.a., in Betracht, wobei dem Fachmann klar sein wird, welche Beads für den jeweiligen Einsatz geeignet sind.
Im Rahmen der vorliegenden Erfindung kann ferner vorgesehen sein, dass auf den einzelnen Beads jeweils das gleiche Bindemolekül vorliegt, oder aber auf einem Bead unterschiedliche Bindemoleküle vorliegen, so dass mit jedem einzelnen Bead auch viele verschiedene Analytpeptide aus der Probenmischung heraus gebunden werden.
Die Immobilisierung der Bindemoleküle auf den Trägern kann durch im Stand der Technik bekannte Verfahren erfolgen (siehe bspw. Review Stoll et al. FBS 2000, Hermanson, Greg. T., Bioconjugate Techniques, Academic Press).
Bei dem erfindungsgemäßen Verfahren ist für die nachfolgenden Analyseschritte bzw. für einen weiteren Nachweis ferner bevorzugt, wenn der Nachweis in Schritt d) mittels Verfahren durchgeführt wird, die ausgewählt sind aus der Gruppe umfassend Massenspektroskopie, Immunoassays, Chromatographie, Elektrophorese, Elektrochemie, Oberflächenplasmonresonanz, Schwingquarz.
All diese Verfahren sind im Stand der Technik hinreichend bekannt und bieten jedes für sich genommen unterschiedliche Vorteile. Die Auswahl der verschiedenen Nachweisverfahren hängt dabei insbesondere davon ab, wie genau bzw. welche oder wie viel Proteine bzw. Analytpeptide weiter charakterisiert, isoliert, angereichert oder nachgewiesen werden sollen, und in welcher Form die Bindemoleküle in Schritt b) bereitgestellt werden, d.h. bspw. Träger-gebunden oder nicht, und wenn Träger-gebunden, auf welcher Art Träger.
So kommt bspw. die Massenspektroskopie als Verfahren zur Identifizierung in Betracht, wenn die Bindemoleküle auf Affinitätsmatrices gebunden vorliegen und die Analytpeptide an die auf den Affinitätsmatrices gebundenen Bindemoleküle binden. Die gebundenen Analytpeptide können in einem nachfolgenden Schritt von der Affinitätsmatrix eluiert werden und einer Analyse durch Massenspektroskopie oder Kapillar-HPLC-Elektrospray-Massenspektrometrie zugeführt werden. Affinitätschips (Mikroarrays) sind bspw. nach dem Stand der Technik für nachgeschaltete allgemein MS Analytik mittels MALDI-Massenspektrometrie (SELDI) geeignet. Beads werden zunehmend für Immunoassays eingesetzt.
In einer weiteren Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens ist bevorzugt, wenn der Nachweis und/oder das Anreichern der an die ersten Bindemoleküle gebundenen Analytproteine und/oder Analytpeptide über zweite Bindemoleküle erfolgt, die Analytproteine und/oder Analytpeptide spezifisch erkennen, die an die ersten Bindemoleküle gebunden sind.
Bei einem solchen Nachweisverfahren ist von Vorteil, dass die zweiten Bindemoleküle bspw. markiert sein können, und ein Nachweis der an die ersten Bindemoleküle gebundenen Analytproteine/-peptide über die Markierung der an die Analytproteine/-peptide ebenfalls bindenden zweiten Bindemoleküle erfolgen kann. Die Markierung kann dabei bspw. direkt oder indirekt sein, d.h. bspw. eine Fluoreszenz- oder eine radioaktive Markierung, oder aber eine Markierung, die erst durch Einsatz weiterer Substanzen/Chemikalien nachweisbar gemacht wird, wie z.B. Biotin-Strepavidin.
Es versteht sich, dass auch bei dieser Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens, nicht nur Bindemoleküle mit einer Spezifität eingesetzt werden können, sondern vielmehr auch zwei oder mehrere verschiedene zweite Bindemoleküle mit unterschiedlicher Spezifität.
Allgemein können bei dieser Ausführungsform zweite Bindemolekülen eingesetzt werden, die entweder spezifisch für ein internes Epitop eines konkreten Analytproteins bzw. einer Analytproteinfamilie sind, oder aber spezifisch für das andere terminale Epitop eines konkreten Analytproteins bzw. einer Analytproteinfamilie sind. Andererseits können auch Bindemoleküle eingesetzt werden, die wiederum ähnlich unspezifisch sind wie die ersten Bindemoleküle und mehrere Analytproteine binden.
In diesem Zusammenhang ist ferner bevorzugt, wenn in Schritt d) zweite Bindemoleküle bereitgestellt werden, die an einer oder mehreren Positionen des Peptidepitops eine Aminosäurengruppenspezifische Erkennung aufweisen.
Diese Ausführungsform hat, wie bereits entsprechend für die ersten Bindemoleküle, den Vorteil, dass Bindemoleküle bereitgestellt werden, die für ein Epitop mit maximal bis zu fünf Aminosäuren spezifisch sind, wobei mindestens eine dieser Aminosäuren lediglich gruppenspezifisch erkannt wird, also bspw. aufgrund einer positiven oder negativen Ladung der betreffenden Aminosäure, wegen der hydrophob aliphatischen Eigenschaft der Aminosäure, etc.
Dabei ist es bevorzugt, wenn das Nachweisen und/oder Anreichern in Schritt d) durch gleichzeitige Bindung von ersten und zweiten Bindemolekülen an verschiedenen Epitopen des Analytproteins und/oder Analytpeptids durch Verfahren wie FRET, proximity ligation assay etc erfolgt, wobei ferner vorzugsweise die ersten und zweiten Bindemoleküle in Lösung mit der Probe inkubiert werden.
In dieser Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens ist von Vorteil, dass beide Bindemoleküle ihr Analytprotein/Peptid in flüssiger Phase binden. Dabei ist insbesondere bevorzugt, wenn die beiden Bindemoleküle mit Markierungen wie z. B. Farbstoffpaaren (Fluorophor/Quencher bzw. Fluorophor 1/Fluorophor 2) oder Oligonucleotiden modifiziert sind, die einen Nachweis der paarweisen Bindung an das Analytmolekül mittels verschiedener, dem Stand der Technik entsprechender Assays wie Fluoreszenztransfer (FRET) Assays oder "Proximity Ligation Assays" entsprechen; siehe dazu Gustafsdottir et al., Proximity ligation assays for sensitive and specific protein analyses, in Anal Biochem. 2005 Oct 1;345(1):2-9. Epub 2005 Feb 7, sowie Arai et al., Fluorolabeling of antibody variable domains with green fluorescent protein variants: application to an energy transfer-based homogeneous immunoassay, in Protein Eng. 2000 May;13(5):369-76.
In einer Weiterbildung des erfindungsgemäßen Verfahrens ist bevorzugt, wenn die zweiten Bindemoleküle spezifisch für das jeweils andere terminale Peptidepitop sind, wobei insbesondere bevorzugt ist, wenn das jeweils andere Peptidepitop die freie NH₂-Gruppe oder die COOH-Gruppe und jeweils bis zu maximal fünf Aminosäuren umfasst.
Diese Ausführungsform bietet den Vorteil, dass über die zweiten Bindemoleküle aus der Vielzahl von verschiedenen Analytpeptiden, die an das erste Bindemolekül gebunden haben, nur bestimmte Analytpeptide gebunden werden, und zwar eben diejenigen, deren anderes terminale Peptidepitop von den zweiten Bindemolekülen spezifisch erkannt wird. Dadurch können die Analytproteine/-peptide gezielt weiter eingruppiert bzw. selektioniert werden. Über die Spezifität des entsprechenden zweiten Bindemoleküls kann die Menge der durch die ersten Bindemoleküle gebundenen Analytproteine/Analytpeptide gezielt weiter eingegrenzt werden, d.h., je spezifischer das zweite Bindemolekül ist, desto kleiner wird die Menge der Peptide, die auch vom zweiten Bindemolekül gebunden werden, und umgekehrt.
Insbesondere ist bevorzugt, wenn das in Schritt b) einzusetzende erste Bindemolekül spezifisch für eines der beiden terminalen Peptidepitope der Analytpeptide ist, wobei dieses terminale Peptidepitop die freie NH₂-Gruppe oder die freie COOH-Gruppe und 3 bis 5 Aminosäuren umfasst, und das zweite Bindemolekül spezifisch für das andere terminale Peptidepitop der Analytpeptide ist, wobei das andere terminale Peptidepitop die freie NH₂-Gruppe oder die freie COOH-Gruppe und 3 bis 5 Aminosäuren umfasst.
Die Erfinder der vorliegenden Anmeldung haben nämlich erkannt, dass durch die Verwendung von zwei Bindemolekülen mit bspw. jeweils einer drei-Aminosäuren-Spezifität mindestens die Spezifität eines für sechs Aminosäuren spezifischen Bindemoleküls erreicht werden kann, da neben den drei Aminosäuren weitere Parameter die Spezifität beeinflussen. In Kombination mit der Tatsache, dass dabei das C- und N-terminale Ende jedes Peptid fragments erkannt wird, können Analytpeptide/-proteine durch die Kombination von zwei kurzen Epitopen spezifisch nachgewiesen werden. Die Spezifität/Selektivität für die Analytpeptide/-proteine erfolgt damit durch den kombinierten Einsatz der beiden Bindemoleküle, da mit dem ersten Bindemolekül – gezielt – eine Vielzahl von Analytpeptiden/-proteinen gebunden wird, und erst mit Einsatz des zweiten Bindemoleküls die „Gesamtspezifität" signifikant erhöht wird, bzw. ein Maß annimmt, das dem eines sechs Aminosäuren-spezifischen Bindemoleküls zumindest gleich kommt.
Die „Auftrennung" eines 6er Epitops in zwei 3er Epitope – bevorzugt eines für das C- und eines für das N-terminale Ende – führt dabei zu einer drastischen Reduzierung der für die Analyse sämtlicher möglichen Peptide notwendigen Bindemoleküle. Vorliegend werden lediglich 2 × 20³ – statt 20⁶ bei einem 6er Epitop – verschiedene Bindemoleküle benötigt, um alle möglichen Peptide nachweisen zu können. Danach sind gemäß dem beanspruchten Ansatz lediglich 2 × 8000 Antikörper erforderlich, also jeweils 8000 für das N-terminale und 8000 für das C-terminale Ende der Peptide. Mit der Bereitstellung einer Bibliothek von 2 × 8000 Bindemolekülen kann damit jedes beliebige Analytpeptid aus einer Peptidmischung nachgewiesen werden. Im Vergleich dazu wären – für eine gleiche Analyse – bei einem 6er Epitop mehr als 10⁷ Bindemoleküle notwendig.
Ein weiterer Vorteil des erfindungsgemäßen Verfahrens liegt darin, dass mit den 2 × 20³ Bindemolekülen alle für proteinogene Aminosäuren theoretisch denkbaren N-/C-Termini aller Peptide beliebiger Proteome speziesunabhängig nachweisbar sind.
Es versteht sich, dass die Auswahl der Aminosäurentripletts und damit der Aminosäuren an sich von der zu untersuchenden Probe abhängt. So müssen je nach zu untersuchender Probe auch noch modifizierte Aminosäuren berücksichtigt werden, oder aber – bei nicht-menschlichen Proben – auch Aminosäuren, die nur bei tierischen, pflanzlichen oder mikrobiellen Proben zu finden sind. Dem Fachmann wird hierbei – ausgehend vom hierzu vorhandenen Stand der Technik – klar sein, welche Aminosäuren für welche Probenanalyse berücksichtigt werden müssen.
Mit dem erfindungsgemäßen Ansatz ist damit erstmals eine arraybasierte Proteomanalyse möglich.
In einer anderen Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens ist bevorzugt, wenn das Nachweisen und/oder Anreichern unter Einsatz zweiter Bindemoleküle erfolgt, die Analytproteine/Analytpeptide spezifisch erkennen, die an die ersten Bindemoleküle gebunden sind, wobei die zweiten Bindemoleküle spezifisch für ein Peptid-internes Epitop sind.
Bei dieser Ausführungsform ist von Vorteil, dass durch die „Vorauswahl" einer begrenzten Vielzahl von Analytpeptiden/-proteinen durch das erste Bindemolekül die Komplexität der Probe reduziert werden kann, und der anschließende eindeutige Nachweis mittels des zweiten Bindemoleküls über das protein-/ peptidspezifische interne Epitop erfolgt, so dass der Nachweis für genau ein gezieltes Protein bzw. Peptid in einer komplexen Mischung mit reduziertem Probenhintergrund erfolgen kann.
In diesem Zusammenhang ist in einer anderen Ausführungsform bevorzugt, wenn die zweiten Bindemoleküle spezifisch für ein Peptid-internes oder ein terminales Epitop sind, wobei die Epitope mindestens sechs Aminosäuren aufweisen.
Bei dieser Ausführungsform ist von Vorteil, dass durch den Einsatz von zweiten Bindemolekülen mit einer hohen Spezifität ganz gezielt einzelne Peptide identifiziert werden können.
Bei dem erfindungsgemäßen Verfahren ist allgemein bevorzugt, wenn die ersten und die zweiten Bindemoleküle ausgewählt sind aus der Gruppe umfassend Antikörper, Antikörperfragmente, Aptamere, rekombinante Bindemoleküle.
Die vorliegende Erfindung betrifft ferner Bindemoleküle, die spezifisch für das terminale Peptidepitop verschiedener Peptidanalyten sind, wobei das terminale Bindemolekül die freie NH₂-Gruppe oder die freie COOH-Gruppe, eine oder mehrere durch die Proteasespezifität definierte Aminosäure und bis zu maximal drei weitere terminale Aminosäuren und ggf. zusätzlich gruppenspezifische Erkennungsstellen umfasst.
Dabei ist bevorzugt, wenn das Bindemolekül ausgewählt ist aus der Gruppe umfassend Antikörper, Antikörperfragmente, Aptamere, rekombinante Bindemoleküle.
Die vorliegende Erfindung betrifft ferner die Verwendung eines erfindungsgemäßen Bindemoleküls in einem Verfahren gemäß der vorliegenden Erfindung.
Die vorliegende Erfindung betrifft ferner ein Verfahren zur Herstellung von in dem erfindungsgemäßen Verfahren einzusetzenden Bindemolekülen, bei welchem an einen Träger gebundene Pep tidepitope mit maximal fünf Aminosäuren für Immunisierungs-, Selektions- und Affinitätsmaturierungsverfahren eingesetzt werden.
Dabei ist bevorzugt, wenn zur Herstellung der Bindemoleküle in einem ersten Schritt Peptide mit C- und N-terminalen Tripletts bereitgestellt werden, wobei die Aminosäurentripletts alle möglichen Aminosäurenkombination aufweisen, die ausgehend von 20 proteinogenen Aminosäuren möglich sind, und im anschließenden Schritt diese Peptide zu Immunisierungs-, Selektions- und Affinitätsmaturierungsverfahren eingesetzt werden.
Dabei können bspw. klassische Immunisierungsverfahren, die im Stand der Technik hinreichend beschrieben sind, eingesetzt werden (siehe bspw. Antibodies: A Laboratory Manual, by Ed Harlow, David Lane). Andererseits können die Bindemoleküle auch in vitro generiert werden, wobei die Bindungstasche derart konstruiert wird, dass die terminale NH₃ ⁺/COO^- Funktion optimal binden kann, bspw. in Form einer Mulde mit entsprechender Gegenladung.
Zur synthetischen Herstellung der zur Immunisierung eingesetzten Peptide werden ebenfalls Verfahren eingesetzt, die im Stand der Technik hinreichend bekannt sind (siehe bspw. Fmoc Solid Phase Peptide Synthesis, A Practical Approach by W.C. Chan and P.D. White (Eds), Oxford University Press).
Es versteht sich, dass die vorstehend genannten und die nachstehend noch zu erläuternden Merkmale und Vorteile nicht nur in der angegebenen Kombination, sondern auch in Alleinstellung oder in anderer Kombination verwendbar sind, ohne den Rahmen der vorliegenden Erfindung zu verlassen.
Die Erfindung wird anhand der nachfolgenden Figuren und den Beispielen weiter erläutert. Es zeigen
1 eine schematische Darstellung des Schritts c) des erfindungsgemäßen Verfahrens, bei dem die Bindemoleküle mit der Probenmischung inkubiert werden;
2a eine schematische Darstellung einer Ausführungsform bezügl. Schritt d) des erfindungsgemäßen Verfahrens;
2b eine schematische Darstellung einer weiteren Ausführungsform bezügl. Schritt d);
2c eine schematische Darstellung einer weiteren Ausführungsform bezügl. Schritt d).
In 1 ist schematisch die Bindung der in einer Probenmischung enthaltenen Analytpeptide dargestellt. In der linken Hälfte der 1 ist dabei die Probenmischung dargestellt, die zuvor mit einer spezifischen Protease behandelt worden ist, so dass in der Mischung (Oligo-)Peptide vorliegen. Das N-terminale Ende der Peptide ist dabei mit H₃N⁺ bezeichnet, das C-terminale Ende mit COO^-.
In der rechten Hälfte der schematischen Darstellung ist gezeigt, wie die verschiedene Peptide an die an einen Träger immobilisierten ersten Bindemoleküle gebunden sind. Die Binde moleküle sind dabei mit den Bezugszeichen 10 und 12 angegeben, der Träger mit 14.
Mit Bezug auf das erfindungsgemäße Verfahren und die 1 werden also nach Bereitstellung des Probengemischs und der ersten Bindemoleküle diese beiden miteinander inkubiert, wodurch einige der im Probengemisch enthaltenen Peptide an die Bindemoleküle binden. Nicht gebundenes Probenmaterial wird abgewaschen.
In den 1 und 2a bis 2c ist jeweils schematisch und lediglich beispielhaft dargestellt, dass die eingesetzten ersten Bindemoleküle für ein Epitop spezifisch sind, das die freie NH₂-Gruppe oder die freie COOH-Gruppe und jeweils drei Aminosäuren umfasst. Die in den 1 und 2a bis 2d gezeigten Ausführungsbeispiele des erfindungsgemäßen Verfahrens sind lediglich beispielhaft, im Rahmen der vorliegenden Erfindung sind auch viele andere Ausführungsbeispiele denkbar, insbesondere die Bindemoleküle bzw. das durch die Bindemoleküle zu erkennende Epitop können anders ausgestaltet sein.
In 2a ist eine schematische Darstellung einer Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens mit Bezug auf Schritt d), dem Nachweis der gebundenen Analytpeptide gezeigt. Hierbei werden die an die Bindemoleküle gebundenen Analytpeptide eluiert und anschließend einer Massenspektroskopie unterzogen. Peptidsubpopulationen werden dabei mittels HPLC-MS/MS analysiert, wobei eine eindeutige Identifizierung in Sequenzdatenbanken stattfindet über die kombinatorische Auswertung über Sequence Tag + Peptidmasse + Teilepitop Affinitätsfraktionierung + Proteasespezifität.
In einer anderen Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens werden die Bindemoleküle auf Arrays von Affinitätsmatrices, bspw. Affinitätschips, immobilisiert. Durch Inkubation mit dem Probengemisch binden Analytpeptide bzw. Peptidsubpopulationen auf Arrays verschiedener Affinitätsmatrices. In dem nachgeschalteten Nachweisschritt wird jeder Punkt des Affinitätsarray durch direkte MALDI basierte massenspektrometrische Analyse untersucht (SELDI).
In 2b ist eine schematische Darstellung einer weiteren Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens mit Bezug auf Schritt d) gezeigt. Hier wurden die Bindemoleküle an einen Träger gebunden; nach Inkubation mit der Probenmischung binden Analytpeptide mit einem ihrer terminalen Enden an die Bindemoleküle. Anschließend wurden die Peptidsubpopulationen mit zweiten Bindemolekülen inkubiert, so dass die zweiten Bindemoleküle an die Analytpeptide binden (siehe rechte Hälfte der 2b, A und B). Je nach Spezifität der zweiten Bindemoleküle kann bspw. eine eindeutige Identifizierung durch spezifische Bindemoleküle erreicht werden, die für ein Peptid-internes Epitop (sechs bis sieben Aminosäuren) spezifisch sind (siehe rechte Hälfte der 2b, „A"). Eine eindeutige Identifizierung kann andererseits auch durch Bindemoleküle erreicht werden, die spezifisch gegen das andere terminale Epitop der Analytpeptide gerichtet sind. Dies ist in 2b, rechte Hälfte, „B" dargestellt. Das Bindemolekül kann dabei – wie in 2b gezeigt – ebenfalls für ein Epitop spezifisch sein, das jeweils die andere freie NH₂-Gruppe oder COOH-Gruppe und jeweils drei Aminosäuren umfasst. Dadurch wird sozusagen ein „geteiltes spezifisches Epitop" aus insgesamt 6 Aminosäuren erhalten (3 Aminosäuren bezüglich des ersten Bindemoleküls + drei Aminosäuren bezüglich des zweiten Bindemoleküls). Die Spezifität ergibt sich dabei aus der kombinierten Bindungsspezifität der beiden Bindemoleküle.
In 2c schließlich ist eine weitere Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens hinsichtlich des Schrittes d) gezeigt: In der linken Hälfte der 2c sind Peptidsubpopulationen über die ersten Bindemoleküle an Beads gebunden. Diese werden anschließend auf verschiedene Kavitäten verteilt und dort mit unterschiedlichen zweiten Bindemolekülen inkubiert. Die zweiten Bindemoleküle können nun – in Analogie zu 2b – wiederum für ein Peptid-internes Epitop oder aber für das andere terminale Epitop spezifisch sein, welches wiederum die freie NH₂-Gruppe oder die freie COOH-Gruppe und drei Aminosäuren umfasst. Auch hier können über die kombinatorische Verwendung zweier unspezifischer Bindemoleküle die Analytpeptide spezifisch identifiziert werden.
1. Beispiel: Charakterisierung des monoklonalen Antikörpers 3D5 als selektiv für drei carboxylterminale Aminosäuren
Der kommerziell erhältliche Antikörper anti-C-term Histag Antikörper 3D5 (Invitrogen, Carlsbad, CA) wurde hinsichtlich seiner Bindungsselektivität untersucht. Dieser Antikörper wurde durch Immunisierung einer Maus mit einem Fusionsprotein, das am C-Terminus sechs Histidine trägt, erzeugt. (siehe Lindner et al., „Specific detection of his-tagged proteins with recombinant anti-His tag scFv-phosphatase or scFv-phage fusions", Biotechniques 22, 140-149 (1997)). Das vom Antikörper erkannte Epitop und die Selektivität der Bindung für einzelne Aminosäurereste wurde mit einem Peptidarray untersucht. Peptidbibliotheken, die Varianten des terminalen Hexa-Histidin Peptides darstellen, wurden gerichtet auf Mikrosphären immobilisiert (siehe Poetz et al., „Protein microarrays for antibody profiling: Specificity and affinity determination on a chip", Proteomics 5, 2402-2411 (2005)). Hierbei wird für jedes der sechs terminalen Histidine eine Peptidpositionsbibliothek eingesetzt, bei der statt der definierten Aminosäure Mischungen aller 20 möglichen Aminosäuren vorkommen. Der Einfluss des Carboxyl-Terminus auf die Bindung konnte mit einem Peptid untersucht werden, das die vollständige Hexa-Histidin Sequenz trägt, dessen Ende jedoch keine freie COOH Gruppe sondern einen amidiertem C-Terminus trägt siehe Tabelle 1). Tabelle 1
Die Peptide aus Tabelle 1 wurden als biotinylierte Peptide synthetisiert und auf N-Avidin belegten Mikrosphären immobilisiert. Für die Bindungsstudien wurden die Mikrosphären mit Antikörper gemischt und die Bindung des Antikörpers an das Peptid mit Hilfe eines Phycoerythrin konjugierten anti-Maus-IgG nachgewiesen sowie mit einem Luminex L100 (Austin, TX, USA) ausgelesen. Die Randomisierung der Histidine an Position 1, 2, und 3 (vom c-Terminus aus) führte zum Einbruch des Messignals, wodurch gezeigt wurde, dass diese Aminosäuren zur Bindung notwendig sind. Gleiches gilt für die Blockierung der freien Carboxylgruppe durch Amidierung; diese Modifikation senkt die Anbindung des Antikörpers auf unter 15%, d.h. die negative Ladung der freien Carboxylgruppe ist für eine Reaktion des Antikörpers mit seinem Antigen zwingend. Der Austausch des vierten, fünften und sechsten Histidinsdurch eine Mischung aller zwanzig Aminosäuren führte zu keiner veränderten Bindung. Damit besteht das erkannte Epitop des beschriebenen Antikörpers aus 3 terminalen Aminosäuren und dem freien Terminus.
Die Ergebnisse der Selektivitätstests sind in dem folgenden Diagramm 1 aufgeführt.
Diagramm 1: Charakterisierung des monoklonalen anti-His(C-term) Antikörpers 3D5 der Firma Invitrogen (Carlsbad, CA, USA).
Überraschenderweise zeigte der Antikörper also nur eine Selektivität zu den drei C-terminalen Histidinen. Ein Austausch der folgenden Histidine durch die X-Position hatte keine bis kaum eine Auswirkung auf die Bindung des Antikörpers. Des Weiteren verhindert das Blockieren der negativen Ladung des C-Terminus durch eine Amidierung ebenfalls eine Bindung des Antikörpers. Die Kristallstruktur eines aus diesem Antikörper gewonnen scFv mit einem Hexa-Histidin Peptid bestätigt dieses Ergebnis (siehe Kaufmann et al., „Crystal structure of the anti-His tag antibody 3D5 single-chain fragment complexed to its antigen", J Mol Biol 318, 135-147 (2002)). Der Antikörper bindet an das Rückgrat der vier C-terminalen Histidine, an die Seitenketten der drei C-terminalen Histidine und an die Carboxyl-Gruppe des terminalen Histidins. Aufgrund dieser Peptidarray-Analysen und der Kristallstruktur kann dieser kommerzielle Antikörper als ein C-terminal tripeptidspezifischer Antikörper bezeichnet werden.
2. Beispiel
Aufgrund der Ergebnisse der Charakterisierung des Antikörpers 3D5 wurden verschieden Peptide mit drei Histidinen am C und N-Terminus in Kombination mit einem Peptidepitop synthetisiert. Außerdem wurden die C-terminal Histidin markierten Peptiden am N-Terminus mit einem Glycin und die N-terminal Histidin markierten Peptiden am C-Terminus mit Serin markiert, um korrespondierende Peptide massenspektrometrisch voneinander unterscheiden zu können (siehe Tabelle 2). Tabelle 2
Immunoassay Nachweis
Der Antikörper und die für die Peptidepitope spezifischen Antikörper (siehe Tabelle 2) wurden nach Standardprotokoll auf Mikrosphären immobilisiert. Die oben beschriebenen Peptide wurden einzeln in verschiedenen Konzentrationen zu Serum gegeben. Der Nachweis der Peptide erfolgte einerseits über die Peptidepitop-spezifischen Antikörper und andererseits über den His-Tag-Antikörper.
Massenspektrometrischer Nachweis
Der His-Tag-Antikörper 3D5 wurde chemisch auf Carboxy-Methyl-Cellulose immobilisiert. Dieses Material diente als Affinitätsmatrix, um die oben erwähnte Peptide aus einer komplexen Mischung aufzureinigen. Lediglich die Peptide mit C-terminalem His-Tag und einer freien Carboxylgruppe waren anschließend im Massenspektrometer nachzuweisen.
3. Beispiel
Experiment anhand eines β-Catenin in silico-Verdaus
Der Wnt-Signalweg spielt in allen tierischen Spezies eine große Rolle während der embryonalen Entwicklung. Eine anomale Aktivierung dieses Signalweges führt zu einer Tumorgenese. Mutationen im Protein Adenomatous Polyposis Coli (APC) oder β-Catenin resultieren in einer nukleären Akkumulation des Proteins β-Catenin. β-Catenin aktiviert im Komplex mit T-cell factor/lymphoid enhancing factor (TCF/LEF) Transkriptionsfaktoren Gene, die die Zellproliferation positiv beeinflussen und damit unkontrolliertes Zellwachstum fördern.
β-Catenin stellt damit ein klassisches Proto-Onkogen dar. Vorteile dieses Proteins als Modellprotein sind seine onkolgische Relevanz und seine hochkonservierte Sequenz zwischen verschiedenen Spezies. Die humane Sequenz und die klassischer Modellorganismen (Maus, Ratte) sind bis auf eine Aminosäure identisch.
In silico Verdau
Mit Hilfe eines EDV-Programms (http://www.expasy.org/tools/peptidecutter/) wurde das Protein β-Catenin in silico mit Trypsin verdaut. Die Fragmente wurden der Länge nach geordnet (siehe Tabelle 3).
Tabelle 3: Liste der Peptidfragmente, generiert durch einen in silico Verdau von β-Catenin mit Trypsin. Die Fragmente wurden der Peptidlänge nach geordnet.
Auswahl der Termini mit anschließender Datenbanksuche
Die Fragmente bzw. die Termini wurden nach verschiedenen Gesichtspunkten untersucht. Zunächst sollten die Fragmente eine Länge größer gleich 20 Aminosäuren aufweisen, um den Aufbau eines Sandwichimmunoassays zu ermöglichen. Eine kürzere Fragmentlänge erscheint aus sterischen Gründen nicht sinnvoll, da ansonsten die beiden Epitope des Peptidantigens ggf. nicht gleichzeitig für die Bindung von ersten und zweiten Bindemolekülen (Fänger- und Detektionsantikörper) in einem Assay zugänglich sind.
Aufgrund struktureller Eigenschaften des Proteins war es außerdem von Vorteil, Fragmente nahe des N- bzw. C-Terminus auszuwählen. Sowohl N- als auch C-Terminus sind aufgrund von Untersuchungen der Kristallstruktur und anderer Methoden (siehe Huber et al., Cell 1997, 90, 871-882) proteolytisch gut zugänglich. Dies ermöglicht die Generierung von Zielpeptiden mit einem proteolytischen Verdau ohne denaturierende Bedingungen.
Es wurde das Fragment bcat_TTF1 ausgewählt, da in diesem Bereich die Mutationen vorkommen, die für die Entstehung eines Tumors verantwortlich sind.
Fragment bcat_TLCF1 ist kein tryptisches Fragment, sondern ein Fragment das durch einen Verdau mit der Endoproteinase LysC entstehen würde. Die Auswahl der Termini dieses Fragmentstückes geschah, um alternativ auch ein weiteres Enzym zum Verdau verwenden zu können.
Datenbanksuche Fragmente
Eine humane, nicht redundante Proteindatenbank wurde nach den terminispezifischen Sequenzen (drei Aminosäuren N-Terminus bzw. vier Aminosäuren C-Terminus) der ausgewählten Peptidfragmente durchsucht. Die Ergebnisse stellen alle potentiellen N- und C-Termini dar, die durch einen tryptischen Verdau des humanen Proteoms entstehen könnten. Diese Sub-Proteome können nach Affinitätsreinigung durch die erzeugten terminispezifischen Antikörper beispielsweise mit Massenspektrometrie analysiert werden.
Die Datenbanksuche wurde außerdem eingeschränkt, indem nach beiden Termini gleichzeitig gesucht wurde. Bei der Suche wurden zwischen den beiden Termini 100 Aminosäuren ohne Einschränkung zugelassen. Damit wurde die Datenbank nach Trypsinfragmenten bis zu einer Länge von 107 Aminosäuren und den jeweiligen spezifischen Termini durchsucht. Bei der Kombinationssuche konnten jedoch aufgrund der Software interne Trypsinspaltstellen in den ausgegeben Fragmenten nicht ausgeschlossen werden. Nach Bereinigung der Treffer der Kombinationssuche auf internen Trypsin spaltstellen konnte die Zahl der gefundenen Proteine auf einen Treffer, nämlich das Zielprotein β-Catenin, reduziert werden, d.h. zwei terminispezifische Antikörper für drei bzw. für vier Aminosäuren reichen aus, um in allen betrachteten Fällen 100 Trefferquote für das Zielprotein zu erreichen.
In der unten stehenden Tabelle sind die Ergebnisse der Suche zusammengefasst (Tabelle 4). Tabelle 4: Datenbanksuche nach Anzahl der Proteine, die nach tryptischem Verdau entsprechende Termini enthalten
Zusammenfassung
Die Erfindung betrifft Verfahren zum Nachweisen und/oder Anreichern einer Vielzahl von verschiedenen Analytproteinen und/oder Analytpeptiden aus einer Probenmischung, die Proteine und/oder Peptide aufweist. Bei dem Verfahren wird zunächst die Probenmischung bereitgestellt, sowie anschließend erste Bindemoleküle, die spezifisch für ein Peptidepitop der verschiedenen Analytproteine und/oder Analytpeptide sind, wobei das Peptidepitop bis zu maximal fünf Aminosäuren umfasst. In einem nächsten Schritt werden die ersten Bindemoleküle mit der Probenmischung inkubiert und anschließend die an die ersten Bindemoleküle gebundenen Analytproteine und/oder Analytpeptide nachgewiesen.

Claims

Verfahren zum Nachweisen und/oder Anreichern einer Vielzahl von verschiedenen Analytproteinen und/oder Analytpeptiden aus einer Probenmischung, die Proteine und/oder Peptide aufweist, wobei das Verfahren die folgenden Schritte aufweist: a) Bereitstellen der Probenmischung und ggf. Fragmentierung der darin enthaltenen Proteine in definierte Peptide; b) Bereitstellen von ersten Bindemolekülen, die spezifisch für ein Peptidepitop zumindest eines der verschiedenen Analytproteine und/oder Analytpeptide sind, wobei das Peptidepitop bis zu maximal fünf, vorzugsweise zwei bis drei Aminosäuren umfasst; c) Inkubieren der ersten Bindemoleküle mit der Probenmischung; und d) Nachweisen und/oder Anreichern der an die ersten Bindemoleküle gebundenen Analytproteine und/oder Analytpeptide.
Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass in Schritt a) eine Probenmischung mit denaturierten Analytproteinen und/oder Analytpeptiden bereitgestellt wird.
Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass in Schritt a) die in der Probenmischung enthaltenen Proteine und/oder Peptide mit zumindest einer spezifischen Protease in definierte Peptide gespalten werden.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, dass in Schritt b) erste Bindemoleküle bereitgestellt werden, die an einer oder mehreren Positionen des Peptidepitops eine Aminosäurengruppen-spezifische Erkennung aufweisen.
Verfahren nach einem der Ansprüche 2 bis 4, dadurch gekennzeichnet, dass in Schritt b) erste Bindemoleküle bereitgestellt werden, die spezifisch für einen der beiden terminalen Peptidepitope der Analytproteine und/oder Analytpeptide sind, wobei das terminale Peptidepitop die freie NH₂-Gruppe oder die freie COOH-Gruppe und jeweils bis zu maximal fünf Aminosäuren umfasst.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, dass die ersten Bindemoleküle auf einem Träger immobilisiert sind.
Verfahren nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, dass der Träger ausgewählt ist aus der Gruppe umfassend Mikroarrays, Trägermaterial für Affinitätssäulen, Chromatographiematerialien, Mikrokanalstrukturen, Kapillaroberflächen, Sensoroberflächen, polymere poröse Schwammstrukturen, Beads.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 7, dadurch gekennzeichnet, dass das Nachweisen und/oder Anreichern in Schritt d) mittels Verfahren durchgeführt wird, die ausgewählt sind aus der Gruppe umfassend, Massenspektroskopie, Immunoassays, Chromatographie, Elektrophorese, Elektrochemie, Oberflächenplasmonresonanz, Schwingquarz.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 8, dadurch gekennzeichnet, dass das Nachweisen und/oder Anreichern in Schritt d) unter Einsatz zweiter Bindemoleküle erfolgt, die Analytproteine und/oder Analytpeptide spezifisch erkennen, die an die ersten Bindemoleküle gebunden sind.
Verfahren nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, dass das Nachweisen und/oder Anreichern in Schritt d) durch gleichzeitige Bindung von zwei verschiedenen Bindemolekülen an verschiedenen Epitopen des Analytproteins und oder Analytpeptids durch Verfahren wie FRET, proximity ligation assay etc erfolgt.
Verfahren nach Anspruch 9 oder 10, dadurch gekennzeichnet, dass die ersten und zweiten Bindemoleküle in Lösung mit der Probe inkubiert werden.
Verfahren nach Anspruch 5 und einem der Ansprüche 9 bis 11, dadurch gekennzeichnet, dass die zweiten Bindemoleküle spezifisch für das jeweils andere terminale Peptidepitop sind.
Verfahren nach Anspruch 12, dadurch gekennzeichnet, dass das jeweils andere terminale Peptidepitop die freie NH₂- Gruppe oder die freie COOH-Gruppe und jeweils bis zu maximal fünf Aminosäuren umfasst.
Verfahren nach einem der Ansprüche 9 bis 13, dadurch gekennzeichnet, dass in Schritt d) zweite Bindemoleküle bereitgestellt werden, die an einer oder mehreren Positionen des Peptidepitops eine Aminosäurengruppen-spezifische Erkennung aufweisen.
Verfahren nach einem der Ansprüche 12 bis 14, dadurch gekennzeichnet, dass das in Schritt b) einzusetzende erste Bindemolekül spezifisch für eines der beiden terminalen Peptidepitope der Analytpeptide ist, wobei das terminale Peptidepitop die freie NH₂-Gruppe oder die freie COOH-Gruppe und drei bis fünf Aminosäuren umfasst, und dass das zweite Bindemolekül spezifisch für das andere terminale Peptidepitop der Analytpeptide ist, und wobei das andere terminale Peptidepitop die freie NH₂-Gruppe oder die freie COOH-Gruppe und drei bis fünf Aminosäuren umfasst.
Verfahren nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, dass die zweiten Bindemoleküle spezifisch für einen Peptidinternes Epitop sind.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 16, dadurch gekennzeichnet, dass als erste und/oder zweite Bindemoleküle Antikörper, Antikörperfragmente, Peptid-Aptamere, rekombinante Bindemoleküle, eingesetzt werden.
Bindemolekül, das spezifisch für das terminale Peptidepitop verschiedener Peptid-Analyten ist, wobei das terminale Peptidepitop die freie NH₂-Gruppe oder die freie COOH-Gruppe, eine oder mehrere durch die Proteasespezifität definierte Aminosäure, und jeweils bis zu maximal drei weitere terminale Aminosäuren umfasst.
Bindemolekül nach Anspruch 18, dadurch gekennzeichnet, dass es ausgewählt ist aus der Gruppe umfassend Antikörper, Antikörperfragmente, Peptid-Aptamere, rekombinante Bindemoleküle.
Verwendung eines Bindemoleküls nach Anspruch 18 oder 19, in einem Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 17.
Verfahren zur Herstellung eines Bindemoleküls nach Anspruch 18 oder 19, bei welchem an einen Träger gebundene Peptidepitope mit maximal fünf Aminosäuren für Immunisierungs-, Selektions- und Affinitätsmaturierungsverfahren eingesetzt werden.
Verfahren zur Herstellung eines als Bindemolekül einzusetzenden Antikörpers gemäß Anspruch 19, bei welchem ein Immunisierungsprodukt eingesetzt wird, das aus einem Peptidepitop mit bestimmten terminalen Gruppen besteht, das an ein Trägerprotein gekoppelt ist.