CN107923874A - 蛋白质变异体的平行定量方法 - Google Patents

蛋白质变异体的平行定量方法 Download PDF

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Abstract

由于变异体而在生物体内的作用不同的蛋白质存在有多种。为了更准确地把握蛋白质在生物体内的作用而对样品中的蛋白质进行定量时,需要分别测定可能存在的各变异体的量。提供一种用质谱分析对具有2种以上变异体的蛋白质的各变异体进行平行定量的方法,其包含:对样品中的蛋白质进行蛋白酶消化,对于通过前述蛋白酶消化得到的肽中的、具有各变异体所特有的氨基酸序列的肽不进行分离而直接利用质谱分析进行检测,基于其结果确定样品中的各变异体的量。

Description

蛋白质变异体的平行定量方法
技术领域
本发明涉及蛋白质变异体的平行定量方法,更详细而言,涉及对于样品中可能混合存在的蛋白质变异体能够不进行分离而直接利用质谱分析同时进行检测和定量的方法。
背景技术
与正常组织同样地,在癌组织的增殖过程中,营养素的供给也是至关重要的,同时,增殖过程中生成的废物的排出也是重要的。因此,癌组织会随着增殖的进行而在自身组织内诱导新的血管,以谋求自身的生存。为了诱导血管就需要促进血管的生长,因此癌组织自己产生血管的生长因子、诱导新的血管。从而,通过确保营养素供给和废物排出途径而能够实现癌组织的进一步增殖。作为这种生长因子,血管内皮生长因子(vascularendothelial growth factor,VEGF)是代表性因子。
癌的化学疗法采取如下策略:通过抑制该生长因子的作用、抑制新生血管的生成,从而截断癌的食粮。例如,作为单克隆抗体的贝伐单抗(商品名Avastin)是通过中和属于VEGF家族的VEGF-A而发挥抗癌效果的抗体药物。贝伐单抗通过结合于VEGF的受体结合位点而竞争性抑制VEGF与受体的结合,从而抑制VEGF所引起的受体活化。此外,关于作为低分子化合物的分子靶向药,已知有抑制VEGF受体的酪氨酸激酶活性的索拉非尼、舒尼替尼等。
VEGF-A是1980年代发现的生长因子,现在已获知:根据外显子的组合而存在各种剪接变体(非专利文献1~4)。根据8个外显子的各种组合和3’区域的剪接位点的差异而产生繁多的剪接变体。就变体而言,在第8外显子的近位的剪接位点(Proximal splicingsite(PSS))受到剪接的变体表示为VEGF-Axxx,在远位的剪接位点(Distal splicing site(DSS))受到剪接的变体表示为VEGF-Axxxb,主要存在被称为VEGF-A206、VEGF-A189、VEGF-A183、VEGF-A165、VEGF-A148、VEGF-A145、VEGF-A121、VEGF-A189b、VEGF-A183b、VEGF-A165b、VEGF-A145b和VEGF-A121b的变体。其中,VEGF-Axxx型的变体具有血管新生促进作用,相反,VEGF-Axxxb型的变体则具有血管新生抑制作用,这些变体表达保持着精密的平衡,从而控制生物体的血管增殖、新生血管的产生。
基于选择性剪接的变体生成中,约70%左右由基因表达控制来决定,另一方面也报道了:随着癌等疾病的进展,剪接受到控制。即,存在伴有血管新生促进作用的变体表达控制和基于与细胞的恶性化相伴随的分子开关的变体表达机制。
用于蛋白质定量的最常规的技术为ELISA(Enzyme-Linked ImmunoSorbentAssay)。其为如下技术:制作针对测定对象蛋白的抗体,进而用检测用抗体夹持,从而简便地对测定对象分子进行定量。作为用于定量VEGF-A的固相ELISA试剂盒,可使用例如R&Dsystems公司的Human VEGF Quantikine ELISA Kit(http://www.rndsystems.com/Products/DVE00),据记载,利用该试剂盒时,测定范围为15.6-1000pg/mL(细胞培养上清)、31.2-2000pg/mL(血清或血浆)。此外还销售有多种ELISA试剂盒(IBL、Funakoshi、Sigma、Pierce、Life Technologies Corporation等),这些为能够定量总VEGF-A量的试剂盒、或能够定量部分变体的试剂盒。还开发了同时测定VEGF-A165、VEGF-A 121、VEGF-A 110的被称为3-ELISA system的multiplex ELISA(非专利文献5)。
此外,除了VEGF-A以外,还已知有多种存在剪接变体的蛋白质。进而,已知例如人B型钠利尿肽(BNP)为由32个氨基酸构成的肽,血中存在其加工后的变体,该混合存在的变体的比率可能为缺血性心脏病治疗后的生物标志物(非专利文献6)。
现有技术文献
非专利文献
非专利文献1:Harper,S.J.et al.,VEGF-A splicing:the key to anti-angiogenic therapeutics?,Nat Rev Cancer,2008
非专利文献2:Nowak,D.G.et al.,Expression of pro-and anti-angiogenicisoforms of VEGF is differentially regulated by splicing and growth factors,JCell Sci,2008
非专利文献3:Rennel,E.S.et al.,VEGF121b,a new member of the VEGF(xxx)bfamily of VEGF-A splice isoforms,inhibits neovascularisation and tumourgrowth in vivo,Br J Cancer,2009
非专利文献4:Woolard,J.et al.,VEGF165b,an inhibitory vascularendothelial growth factor splice variant:mechanism of action,in vivo effecton angiogenesis and endogenous protein expression,Cancer Res,2004
非专利文献5:Gutierrez,J.et al.,A new ELISA for use in a 3-ELISAsystem to assess concentrations of VEGF splice variants and VEGF(110)inovarian cancer tumors,Clin Chem,2008
非专利文献6:Fujimoto,H.et al.,Processed B-Type Natriuretic Peptide Isa Biomarker of Postinterventional Restenosis in Ischemic Heart Disease
发明内容
发明要解决的问题
ELISA由于不能直接测定测定对象而存在多种问题:如有时出现异常值,此外需要针对每一测定对象制作抗体而花费时间、成本,不能同时测定多个解析对象等。
此外,例如VEGF-A是被称为半胱氨酸结蛋白的具有复杂且特征性结构的蛋白质,因此VEGF-A本身的抗体容易制作且存在多种,但是制作对各变体特异性的高亲和性抗体则极其困难。因此推测,即使是能够对变体进行定量的抗体,也不能充分抑制非特异性结合,数据的偏差会增加。
由于种间交叉问题等,动物试验阶段所采用的ELISA分析条件多数情况下不能直接用于大型动物和人。因此,药物研究开发阶段和人临床试验中,不得不在各自的测定条件下进行比较。此外,在病变组织中的药剂浓度的ELISA中,抑制检测的基质成分是不同的,因此为了基于ELISA进行药代动力学分析,必需制作多个抗体。这导致了药物开发上的巨额成本、后期开发中的中途退出(dropout)等极大的风险。
进而,单克隆抗体为非常昂贵的药物,因此其应用应该限于有望得到药效的情况,因此期望能够在对患者给药前预测其药效。但是,如上所述,贝伐单抗的抗癌作用是通过结合于VEGF-A而发挥的VEGF-A中和活性来抑制血管新生,但该VEGF-A结合位点均等地具有发挥促进和抑制血管新生的效果的变体,因此测定来自治疗对象患者的样品的VEGF-A总量并不能准确地反映出要预测药效。这一点对于由于变体而在生物体内的作用不同的其它蛋白质也是同样的。
由于上述理由等,为了更准确地把握生物体内的蛋白质作用而对样品中的蛋白质进行定量时,需要分别测定可能存在的各变体的量。
用于解决问题的方案
使用质谱分析进行的蛋白质的定量和结构解析已经随着质谱分析技术、数据解析服务和软件的发展而迅速地拓宽其应用范围。特别是使用质谱分析进行的绝对定量技术作为一种不依赖于特异性抗体的方法而得到广泛认可。本发明人等对利用质谱分析同时定量蛋白质的变体的可能性进行了研究。
作为一例,为了能够一同定量VEGF-A的全部变体,设计了来自各变体的、通过蛋白酶消化而得到的肽片段。然后成功开发了能够通过选择具有各变异体所特有的氨基酸序列的肽、利用质谱分析对它们进行平行检测而进行变体的一同定量解析的分析条件。本发明人等开发的方法不仅限于VEGF-A,还能够同样用于具有2种以上变异体的蛋白质。
即,本发明包含以下的发明。
(1)一种用质谱分析对具有2种以上变异体的蛋白质的各变异体进行平行定量的方法,其包含:
对样品中的蛋白质进行蛋白酶消化,
利用质谱分析检测通过前述蛋白酶消化得到的肽中的、2种以上的具有各变异体所特有的氨基酸序列的肽,
基于前述质谱分析的结果确定样品中的各变异体的量。
(2)根据上述(1)所述的方法,其包含:对具有2种以上变异体所共有的氨基酸序列的肽进行进一步检测。
(3)根据上述(1)或(2)所述的方法,其中,变异体为前述蛋白质的剪接变体。
(4)根据上述(1)~(3)中任一项所述的方法,其中,前述蛋白质为血管内皮生长因子(VEGF)-A。
(5)根据上述(4)所述的方法,其中,前述变异体包含选自以下的VEGF-A剪接变体中的2种以上,所述VEGF-A剪接变体为:206(序列号1)、189(序列号2)、183(序列号3)、165(序列号4)、148(序列号5)、145(序列号6)、121(序列号7)、165b(序列号8)、121b(序列号9)和111(序列号10)。
(6)根据上述(4)或(5)所述的方法,其中,对具有序列号11~26所示的氨基酸序列的肽中的1种以上进行检测。
(7)一种试剂盒,其为使用高效液相色谱-质谱分析(LC-MS)实施上述(1)~(6)中任一项所述的方法中所使用的试剂盒,其含有:
蛋白酶;
反应容器,其用于使前述蛋白质与前述蛋白酶接触、从而消化蛋白质;
缓冲液,其用于利用前述蛋白酶进行消化反应;和
1种以上内标肽,其具有前述各变异体所特有的氨基酸序列。
(8)根据上述(7)所述的试剂盒,其进一步包含:记载有用于检测各变异体的质谱分析条件的说明书。
(9)根据上述(7)或(8)所述的试剂盒,其含有具有序列号11~26所示的氨基酸序列的肽作为内标肽。
(10)一种记录介质,其为记录有上述(1)~(6)中任一项所述的方法中所使用的、用于运行质谱分析的数据的计算机可读记录介质,前述数据包括:关于1种以上具有各变异体所特有的氨基酸序列的肽的母离子、碎片离子、预测保留时间和三重四级杆各自的电压数据。
(11)一种用于利用高效液相色谱-质谱分析(LC-MS)进行蛋白质变异体的平行检测的方法包,其包含上述(10)所述的记录介质和前述记录介质的使用说明书。
(12)根据上述(10)所述的记录介质或(11)所述的方法包,其中,前述数据为关于1种以上的具有序列号11~26所示的氨基酸序列的肽的数据。
本说明书包含作为本申请的优先权基础的日本专利申请号2015-153656号的公开内容。
发明的效果
根据本发明,能够一同检测混合存在在样品中的作用不同的变异体的量,能够综合得到以往使用ELISA时仅能部分性得到的信息。
例如,通过设定VEGF-A的质谱分析定量的最优化条件,能够将VEGF-A变体一同定量。通过准确地检测、定量各变体,能够把握每名癌患者的状态是以何种程度暴露于血管新生促进作用或血管新生抑制作用的癌,能够通过确定癌的增殖性建立更有效的给药策略。即,在为增殖性高的癌时,以用抗体进行中和为本的化学疗法可能是第一优选且可得到最大药效的给药法。另一方面,在判定增殖性不那么高时,则可以优选低分子抗癌剂、放射线治疗。因此,可以提供与每名患者相对应的抗癌治疗。
生长因子、细胞因子等功能性蛋白中,分别具有不同功能的变异体的蛋白质均存在多种。例如在用于了解药效的免疫检查中,还能够通过一同定量多个细胞因子的变体来确定目前的药效指标。
进而,在基础研究领域中,通过进行生长因子等激素分子的变体的一同定量值与生物学功能的相关关系解析,能够了解各变体的活性指标。
附图说明
图1-1:示出VEGFA变体的序列比对。
图1-2:图1-1之续。
图2-1:示出肽P09(序列号19)的预备的MS分析和Q3扫描分析的结果。
图2-2:示出肽P09(序列号19)的MS2分析结果、所选择的前体离子的通过分析得到的预测产物离子和所检测的产物离子的各峰。
图2-3:示出用于检测在肽P09(序列号19)的分析中所用的产物离子的碰撞能量的最优化条件的研究结果(使用LCMS-8040时)。
图2-4:示出用于检测在肽P09(序列号19)的分析中所用的产物离子的碰撞能量的最优化条件的研究结果(使用LCMS-8050时)。
图2-5:示出通过在最优化条件下检测y(2)、y(3)、y(4)、y(5)离子而定量肽P09(序列号19)的结果。
图3-1:示出肽P14(序列号24)的预备的MS分析和Q3扫描分析的结果。
图3-2:示出肽P14(序列号24)的MS2分析结果、所选择的前体离子的通过分析得到的预测产物离子和所检测的产物离子的各峰。
图3-3:示出用于检测在肽P14(序列号24)的分析中所用的产物离子的碰撞能量的最优化条件的研究结果(使用LCMS-8050时)。
图3-4:示出用于检测在肽P14(序列号24)的分析中所用的产物离子的碰撞能量的最优化条件的研究结果(使用LCMS-8050时)。
图3-5:示出肽P14(序列号24)的MS2分析结果、所选择的前体离子的通过分析得到的预测产物离子和所检测的产物离子的各峰。
图3-6:示出用于检测在肽P14(序列号24)的分析中所用的产物离子的碰撞能量的最优化条件的研究结果(使用LCMS-8050时)。
图3-7:示出通过在最优化条件下检测y(2)、y(3)、y(4)、y(5)离子而定量肽P14(序列号24)的结果。
图4:示出适合于肽P01~P16的同时定量的分析条件的一例。
图5:示出肽P01~P16的同时定量的一例。
具体实施方式
[变异体的定量方法]
本发明提供一种用质谱分析对具有2种以上变异体的蛋白质的各变异体进行平行定量的方法,其包含:
对样品中的蛋白质进行蛋白酶消化,
利用质谱分析检测通过前述蛋白酶消化得到的肽中的、2种以上的具有各变异体所特有的氨基酸序列的肽,
基于前述质谱分析的结果确定样品中的各变异体的量。
在此,蛋白质的“变异体”是指具有通过对于具有某种氨基酸序列的蛋白质的一部分利用缺失、取代、添加等而产生差异的不同的氨基酸序列的蛋白质,本领域中通常包括被称为“变异体”、“变异型”或“变体”的蛋白质。变异体可以是天然产生的也可以是人工制作的。
本发明中,设定为同一样品中混合存在有2种以上变异体的情况。因此,本发明的方法不包含当样品中仅含有不同于“野生型”的“变异型”蛋白质时、对该“变异体(变异型)”进行检测的情况。
作为变异体,可以列举例如剪接变体。如本领域中所熟知的,剪接变体是指:由真核生物的DNA转录生成的一次转录产物(pre-mRNA)在进行外显子连接而生成mRNA时,通过在不同位点进行剪接和不同外显子的选择等而生成多种具有不同序列的mRNA、并由各mRNA翻译出的不同蛋白质。这些变异体有时也记载为同一蛋白质的“同种型”。本说明书中将可能产生的全部蛋白质记载为“变异体”或“变体”。此外,由翻译产生的蛋白质在此后由于加工等受到修饰时、在被切断时,只要样品中可能混合存在该修饰产物和切断产物则也包含在本发明的方法的检测对象、即“变异体”或“变体”中。
需要说明的是,“样品”是指:假设存在特定的蛋白质的、采集自被检者的样品,可以为例如血液(全血、血清或血浆)、唾液、胸水、腹水等体液、来自组织的样品等。样品中可含有根据需要添加的试剂。为了从血液等样品中高效取得分析对象的蛋白质,可以使用例如对该蛋白质为特异性的抗体。例如蛋白质为VEGF-A时,可以使用贝伐单抗等抗VEGF-A抗体,通过免疫沉降从患者血清回收总VEGF-A并定量其中所含的VEGF-A变体的比例。VEGF-A与抗体的复合体可以在还原烷基化后进行蛋白酶消化,从而供于LCMS分析。
成为本发明的方法所检测的对象的肽为通过蛋白酶消化而得到的肽中的、具有各变异体所特有的氨基酸序列的肽。
本发明的方法中可以优选使用的蛋白酶可以根据作为用质谱分析进行定量或鉴定的对象的蛋白质的种类来适当选择,没有限定,可以列举例如:胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶、赖氨酰端肽酶(Lys-C)、V8蛋白酶、AspN蛋白酶(Asp-N)、ArgC蛋白酶(Arg-C)、木瓜蛋白酶、胃蛋白酶、二肽基肽酶等。蛋白酶也可以组合使用2种以上。更优选的是,作为本发明中所用的蛋白酶,可以列举胰蛋白酶、Lys-C、Glu-C、Asp-N、胰凝乳蛋白酶等。
在上述蛋白酶中,本发明中特别优选使用胰蛋白酶。胰蛋白酶的底物特异性高,此外切断后的肽的C末端存在Lys或Arg,因此可以使肽的电荷量和电荷分布均匀,特别适合制作用于质谱分析的样品。作为本发明的方法中可以优选使用的蛋白酶,可以列举例如Trypsin Gold(Promega Corporation制)、Trypsin TPCK-treated(Sigma公司制)等。
根据需要,蛋白酶还可以固定化于活性炭、多孔膜、多孔树脂珠、金属颗粒等支持体上而使用。用于质谱分析的蛋白酶消化步骤在本领域中经常进行,本领域技术人员可以适当确定具体反应条件。
本发明的方法能够通过检测具有各变异体所特有的氨基酸序列的肽来确定样品中的各变异体的存在和量。本说明书中的“各变异体所特有的氨基酸序列”是指存在于部分变异体、但不存在于其它变异体的氨基酸序列。因此,“具有各变异体所特有的氨基酸序列的肽”是指:通过某蛋白质的1种或多种部分变异体的蛋白酶消化而得到的、能够基于其的存在定量该1种或多种部分变异体的肽。特别是,关于具有1种变异体所特有的氨基酸序列的肽,本说明书中有时记载为“具有仅~所特有的氨基酸序列的肽”。
各变异体可含有1种或2种以上的“具有特有的氨基酸序列的肽”。有时为了根据蛋白质来确定某一变异体的存在和量而需要检测2种以上的这种肽。
在此基础上,本发明的方法还可以包含:对具有2种以上变异体所共有的氨基酸序列的肽进行进一步检测。这种肽可能是具有存在于样品中的全部变异体所共有的氨基酸序列的肽。通过也检测这种肽,由分析而得到的信息量变多,检测结果的可靠性可进一步提高。除了具有各变异体所特有的氨基酸序列的肽以外,还对具有2种以上变异体所共有的氨基酸序列的肽进行检测,从而可以确认确实能够测定意欲检测的蛋白质,并且能够进行各变异体的定量。进而,还能够定量蛋白质的总量,因此对具有变异体间所共有的氨基酸序列的肽进行定量是非常重要的。
部分变异体本身有可能不含“具有特有的氨基酸序列的肽”。例如,生成了由某蛋白质(变异体)部分缺失而成的变异体时,则该缺失变异体不含“具有特有的氨基酸序列的肽”。此时,可以基于具有其以外的变异体所特有的氨基酸序列的肽以及具有2种以上变异体所共有的氨基酸序列的肽的检测结果来定量不含“具有特有的氨基酸序列的肽”的上述变异体。需要说明的是,在各种变异体共存时等,某变异体的通过蛋白酶消化而得到的多种肽有可能全部是与任一其它变异体共有、包含的肽。此时,本说明书中,为了识别这些肽而记载为“具有(全部)变异体所共有的氨基酸序列的肽”和“具有(多种)变异体所特有的氨基酸序列的肽”。
例如在进行VEGF-A的剪接变体的同时定量时,除了具有各变体所特有的氨基酸序列的肽以外,还检测具有变体间所共有的氨基酸序列的肽,从而可以取得能够确实测定VEGF-A的证据和其中的各变异体的量等信息,进而还可以参照总VEGF-A量。
本发明的方法将2种以上的通过蛋白酶消化而得的肽供于质谱分析。混合存在有由蛋白酶消化而得的肽的样品不通过例如SDS-PAGE等进行分离而可直接进行质谱分析。但是,可以根据需要除去所用的蛋白酶等。
[质谱分析]
本发明的方法利用质谱分析对上述得到的含有2种以上的肽的样品进行分析,从而能够同时地平行进行多个变异体的鉴定、定量。质谱分析优选使用液相色谱-质谱分析(LC-MS)。
出于更确实地分离肽片段、提高分析精度等目的,利用液相色谱(LC)对供于质谱分析前的样品进行分离、浓缩。在利用LC进行样品的分离时,来自LC的洗脱液可以直接电离并供于质谱分析。还可以利用组合LC和串联质谱分析而成的LC/MS/MS、LC/MSn进行分析。此外,也可以暂时分取来自LC的洗脱液后供于质谱分析。对LC的柱没有特别限定,可以适当选择、使用通常用于肽分析的C30、C18、C8、C4等反相柱、亲水性亲和色谱用的载体等。
质谱分析能够确定氨基酸序列,因此能够判别肽片段是否为来自特定的蛋白质的肽片段。此外,可以基于峰强度确定样品中的肽片段浓度。在分析中,根据需要可以在进行脱盐、增溶、萃取、浓缩、干燥等处理后将样品用于分析中。
对质谱分析的电离法没有特别限定,可采用电轰击电离(EI)法、化学电离(CI)法、电场解吸(FD)法、高速原子碰撞(FAB)法、基质辅助激光解吸电离(MALDI)法、电喷雾电离(ESI)法等。对电离后的样品的分析方法也没有特别限定,可根据电离方法适宜来确定磁场偏转型、四极杆(Q)型、离子阱(IT)型、飞行时间(TOF)型、傅里叶变换离子离子回旋共振(FT-ICR)型等。此外,还可以使用三重四级杆型质谱分析装置等进行MS/MS分析、或MS3以上的多级质谱分析。
对使用本发明的方法时合适的装置没有特别限定,可以列举例如LCMS-8030、LCMS-8040、LCMS-8050和LCMS-8060(均为岛津制作所)、LCMS-IT-TOF、LCMS-Q-TOF(岛津制作所)。
为了基于质谱分析结果鉴定蛋白质,可以使用现有数据库。例如,利用Mascot检索(Matrix Science公司),根据质谱分析所得到的谱图信息自动进行设定的母离子、碎片离子系列的归属,从而可以取得蛋白质候补的鉴定等各种信息。
此外,通过利用多级的质谱分析等确定肽片段的氨基酸序列,从而还可以鉴定蛋白质。如果能够检测某变异体所具有特有的氨基酸序列的肽片段,则能够对目标变异体进行鉴定、定量。
需要说明的是,检测对象的肽优选氨基酸残基数为5~30左右的肽,更优选为7~25左右。氨基酸残基数过少时,柱保持能力弱而难以纯化,或者难以与杂质、来自同一蛋白质的其它部位的肽片段相区别,可能会成为误检等的原因。此外,氨基酸残基数过多时,由于回收率不稳定化、电离变困难等理由,有时变得难以检测或定量性变差。
在定量各变异体的浓度时,可以基于所检测的肽碎片离子(多级MS时,通过母离子开裂而得到的碎片离子)的峰面积、峰强度来算出各变异体的量。例如,通过预先求出的标准曲线(校正曲线)与峰面积的关联、来自添加于样品中的内标的峰面积与来自样品的峰面积的关联等算出样品中的肽片段的浓度,基于肽片段浓度算出各变异体的量、浓度。
为了检测各变异体,在几毫秒~几十毫秒范围的测定时间内进行各变异体的测定,可以一边切换通道一边连续进行分析。从而可以以定量样品中的某蛋白质和确定各变异体的存在比等为目的对样品中可能存在的变异体进行一同定量。利用质谱分析的检测迅速且准确,可在短时间内得到非常多的信息量。对能够通过本发明的方法进行平行定量的变异体的个数没有特别限定,可以是2种以上、3种以上、4种以上、5种以上,10种以上、15种以上、或20种以上。
[VEGF-A变体]
本发明优选的一实施方式是对血管内皮生长因子(VEGF)-A的剪接变体进行检测、定量的方法。
已知VEGF-A存在约10种剪接变体,可认为通过每个人体内存在的变体的混合物整体的平衡而发挥作用。
VEGF-A变体的各氨基酸序列可以通过参照可利用互联网等访问的数据库、例如SwissProt数据库(http://www.genome.jp/dbget-bin/www_bget?sp:VEGFA_HUMAN)而得到。
本发明人等为了选择适合于定量分析10种变体206、189、183、165、148、145、121、165B、121B和111(序列号1~10)的部分肽,首先通过序列比对对这些变体的氨基酸序列进行了比较。将比对的结果示于图1-1和1-2。
本发明人等为了能够一同定量VEGF-A的全部变体,研究了使用胰蛋白酶作为蛋白酶时由各变体生成的肽候补。即,为了能够识别各变体并定量,选择了在上述比对中具有全部变体所共有的序列和1种或多种变体所特有的序列的、通过蛋白酶消化而得到的片段(肽P01~P16、序列号11~26)。将其结果示于表1。
[表1]
表1.用于对VEGF-A变体进行一同定量的肤靶
如由表1可理解那样,肽P01(序列号11)、P02(序列号12)和P03(序列号13)是在全部10种变体中可检测到的肽。此外,肽P07(序列号17)和P08(序列号18)是在10种变体中的6种中可检测到的肽。与此相对地,肽P05(序列号15)、P06(序列号16)、P11(序列号21)、P12(序列号22)、P14(序列号24)、P15(序列号25)、P16(序列号26)分别为仅在变体206、206、189、183、145、121、165B中可检测到的肽。
即,肽P05、P06、P11、P12、P14、P15和P16分别为具有仅变体206、206、189、183、145、121、165B所特有的氨基酸序列的肽;P01~P03为具有10种变体所共有的氨基酸序列的肽。P04、P07~P10和P13为具有10种变体中的部分变体所特有的氨基酸序列的肽。
因此,通过对肽P01~P16进行组合检测,从而能够对变体206、189、183、165、148、145、121、165B、121B和111全部进行鉴定/定量。即,本发明提供上述的方法作为一实施方式,其中,前述变异体包含选自以下的VEGF-A的剪接变体中的2种以上,所述剪接变体为:206(序列号1)、189(序列号2)、183(序列号3)、165(序列号4)、148(序列号5)、145(序列号6)、121(序列号7)、165b(序列号8)、121b(序列号9)和111(序列号10)。该实施方式没有特别限定,包含例如检测具有序列号11~26所示的氨基酸序列的肽(P01~P16)中的1种以上。
如果通过上述实施方式更详细地说明本发明的方法,在样品中所含的变体已经明确或欲分析的变体为特定变体时,可以仅检测如表1所示的用于各变体的肽。
另一方面,在样品中所含的变体尚不明确、从而期望一同检测各变体时,可以同时定量这些P01~P16的肽。可以基于肽P01~P16的检测结果算出样品中的各变体的量。
例如,肽P14(序列号24)是具有仅变体145(序列号6)所特有的氨基酸序列的肽。因此,样品中的变体145的存在和量可以通过检测肽P01、P02、P03和P04并同时检测P14、或者不检测肽P01、P02、P03和P04而检测P14来确定。
此外,肽P16(序列号26)是具有仅变体165B(序列号8)所具有特有的氨基酸序列的肽。因此,样品中的变体165B的存在和量可以通过检测肽P01~P04、P07~P09、P13并同时检测P16、或者不检测肽P01~P04、P07~P09、P13而检测P16来确定。
另一方面,变体165、148、121B和111不含具有仅这些变体所特有的氨基酸序列的肽。但是,这些变体的存在和量可以基于具有部分变体所特有的氨基酸序列的肽的检测结果、或除此以外还基于具有所有变体所共有的氨基酸序列的肽的检测结果来确定。
例如,变体165(序列号4)通过胰蛋白酶消化可生成具有10种变体所共有的氨基酸序列的肽P01~P03、和具有部分变体所特有的氨基酸序列的肽P04、P07~P10和P13。此外,变体165与变体165B相比,在含有肽P01~P04、P07~P09和P13这点上一致,在含有肽P10而不含P16这点上不同。因此,样品中的变体165的存在和量除了肽P01、P02、P03以外还可以检测P04、P07、P08、P09、P10和P13并基于其检测结果来确定。
变体111(序列号10)通过胰蛋白酶消化而得到的肽为具有10种变体所共有的氨基酸序列的肽P01~P03、和具有6种变体(206、189、183、165、121B和111)所特有的氨基酸序列的肽P10。此外,变体121B(序列号9)的通过胰蛋白酶消化而得到的肽为变体111通过胰蛋白酶消化而得到的上述4种肽和P04。因此,样品中的这些变体的存在和量也可以检测这些肽并基于其检测结果来确定。
进而,通过定量具有全部变体所共有的氨基酸序列的肽P01~P03,能够定量全部VEGF-A的量,此外,能够同时测定P01~P03这一点,也能够作为准确无误地测定了VEGF-A的验证数据来使用。
[定量条件的最优化]
本发明的方法是鉴定和定量样品中的各变异体的方法,检测对象为样品通过蛋白酶消化而生成的肽。但是,为了建立用于检测各肽的具体条件,可以基于预先取得的氨基酸信息来进行肽的化学合成。肽的合成可以基于本领域中通常进行的手法来进行。
本发明的主要目的在于,建立临床中能够快速检测的方法。因此,本发明人等对于所合成的各肽的定量条件的最优化进行了研究。此后的记载虽然基于对VEGF-A进行的实验,但本领域技术人员可以理解,通过同样的步骤可以进行其它蛋白质的变异体的检测。
[1.结构的鉴定、MS/MS离子的确认]
虽然并非是必要阶段,但优选首先对合成的肽进行结构确认。例如,优选用LCMS-IT-TOF(岛津制作所)进行MS和MS/MS离子的确认和结构的具体解析。
出于上述目的,例如本发明人等进行了流动注射MS/MS自动分析。
可以制作整合有VEGF-A变体的个人数据库,对其使用进行Mascot检索的MascotMS/MS ion search进行碎片离子系列的归属。对于自动分析中MS/MS所未涉及的肽还可以再次以母离子为指标实施手动MS/MS分析。
进而,对于Mascot检索的结果中链长小而未达到基准的肽片段,与Fragment ioncalculator(http://db.systemsbiology.net:8080/proteomicsToolkit/FragIonServlet.html)进行碎片离子的对照。
以下的表2示出肽结构的鉴定和能够进行MS/MS离子的确认的质谱分析条件的例子。
[表2]
表2.结构的鉴定、MS/MS离于的确认
本发明人等对所合成的肽P01~P16各自进行了按照上述条件而检测出的母离子的价数鉴定。表3中示出其结果。表中示出母离子的m/z值的计算值,将能够通过适合于结构确定的LCMS-IT-TOF和适合于定量的LCMS-8050(均为岛津制作所)两者检测出的母离子以粗体且下划线示出,将仅能够通过LCMS-IT-TOF或LCMS-8050中的某一者检测出的母离子以下划线示出。
[表3]
表3.所检测出的VEGF-A肽的价数鉴定
No +1 +2 +3 +4 +5
P01 APMAEGGGQNHHEVVK 1660.786 830.8894 554.2596 415.9447 332.9558
P02 FMDVYQR 958.445 480.2226 320.4817 240.6113 192.6890
P03 IKPHQGQHIGEMSFLQHNK 2229.135 1115.5673 744.0448 558.2836 446.8269
P04 CECRPK 735.328 368.1681 245.7813 184.5880 147.8640
P05 SWSVYVGAR 1024.521 512.7648 342.1791 256.8863 205.7028
P06 CCLMPWSLPGPHPCGPCSER 2169.916 1085.4622 723.9774 543.2350 434.7817
P07 HLFVQDPQTCK 1315.646 658.3274 439.2209 329.6676 263.9262
P08 NTDSR 592.269 296.6385 198.0949 148.8232 119.2523
P09 QLELNER 901.474 451.2411 301.1634 226.1245 181.0933
P10 CDKPR 618.303 309.6556 206.7731 155.3318 124.4591
P11 SWSVPCGPCSER 1307.551 654.2796 436.5224 327.6437 262.3087
P12 SRPCGPCSER 1091.472 546.2403 364.4961 273.6241 219.0930
P13 QENPCGPCSER 1219.483 610.2458 407.1665 305.6268 244.6952
P14 SWSVCDKPR 1077.515 539.2615 359.8436 270.1347 216.3015
P15 QENCDKPR 989.447 495.2277 330.4878 248.1178 198.6879
P16 SLTRK 604.378 302.6931 202.1313 151.8505 121.6741
[2-1.使用装置(LCMS-8040)的MRM条件的最优化]
质谱分析条件根据使用的装置可能是不同的。因此,需要确定实际测定中所用的装置的最佳的MRM条件。
本发明人等接着用例如也适合于定量的LCMS-8040(岛津制作所)进行了Q3扫描和产物离子扫描。
与通过LCMS-IT-TOF归属后的离子进行对照,基于计算值和实测值选择用于MRM栅(MRM gate)的前体离子和产物离子。产物离子优选由具有序列特异性的y离子系列求出。但是,在难以选择y离子时,某些情况下也可以将b离子系列作为定量对象的边界值(transition)。
优选优先选择序列特异性片段。例如,可以以Pro的C末端侧片段等结构上的变形大的片段作为指标。
可以通过流动注射MRM求出最佳的碰撞能量。
表4示出用于检测VEGF-A变体的优化后的MRM条件的例子。
[表4]
表4.LCMS-8040MRM条件的最优化
[2-2.使用装置(LCMS-8050)的MRM条件的最优化]
本发明人等然后确认了用LCMS-8040确定的MRM栅候补能够用于LCMS-8050。此外进行了Q1预偏置(Pre Bias)电压、碰撞能量、Q3预偏置电压的最优化。
在此,将分辨率由“unit”变更为“high”,在高分辨率MRM模式下进行前体离子的m/z的最优化。
表5示出最优化后的用于检测VEGF-A变体的MRM条件的例子。
使用3种LCMS进行了生成离子的稳定性、再现性、机器种类依存性的确认,确认MRM边界值确实能发挥作用。
[表5]
表5.LCMS-8050MRM条件的最优化
[3.柱的保留时间的确定,MRM分析]
然后,使用LCMS-8050的L-column2(2μm,2.1x50mm(化学物质评价研究机构、CERI))进行保留时间的确定和所确定的条件下的MRM测定。将使用的LC条件示于以下。
[LC条件]
注射:200fmol/μL 5μL(注射时1pmol)
流速:0.4mL/分钟
B浓度:1-40%
A:0.1%甲酸/DDW(wako DDW 3L+FLUKA FA 3mL)
B:0.1%甲酸/乙腈(wako ACN 1L+FLUKA FA 1mL)
时间程序:1.00分钟控制器事件2(流动MS侧)
2.00分钟泵B.浓度1%
10.00分钟泵B.浓度40%
11.00分钟泵 B.浓度98%
11.00分钟控制器 事件0(流动排出侧)
13.00分钟泵 B.浓度98%
13.50分钟泵 B.浓度1%
15.00分钟泵 B.浓度1%
15.00分钟 控制器 停止
测定时间:1.00-11.00分钟
表6示出在最优化的条件下对肽P01~P16(序列号11~26)各自优选选择的测定片段的例子。表6对各肽示出1种碎片离子的m/z值和保留时间。通过检测这些碎片离子,能够进行肽P01~P16的检测。
[表6]
表6.VEGF-A变体定量的最优化条件(定量用MRM边界值和各肤的保留时间)
此外,本发明的方法为了检测肽P01~P16还可以分别选择2种以上碎片离子同时进行检测。表7汇总了用于肽P01~P16各自的定量的最优化的分析条件。
[表7]
表7.VEGF-A变体定量的最优化条件(MRM边界值)
作为使用本发明的方法的蛋白质定量的其它例子,没有限定,可以列举例如血管紧张素变体的定量。血管紧张素是由血管紧张素原利用酶解生成的肽,存在I~IV这4种变体。已知其中的血管紧张素II~IV具有升血压作用,而血管紧张素I没有升血压作用。因此,为了进行本发明的方法,可以基于血管紧张素原(SwissProt:P01015)和血管紧张素I~IV的氨基酸序列来选择适合于用质谱分析定量各变体的肽。
[试剂盒]
此外,本发明提供一种试剂盒,其为使用高效液相色谱-质谱分析(LC-MS)实施本发明的方法中所使用的试剂盒,其含有:
蛋白酶;
反应容器,其用于使前述蛋白质与前述蛋白酶接触、从而消化前述蛋白质;
缓冲液,其用于利用前述蛋白酶进行消化反应;和
1种以上内标肽,其具有前述各变异体所特有的氨基酸序列。
利用质谱分析的测定能够进行非常高精度的分析,另一方面,适当的样品制备和合适的分析条件的设定是非常重要的。例如,为了在临床中得到更简便准确的检查结果,本发明提供可以用于实施上述方法的试剂盒。
作为本发明的试剂盒中所含的反应容器,只要是能够使分析对象的蛋白质与蛋白酶在液相中接触的容器则任意容器均可,没有特别限定,如果考虑到质谱分析检测后的操作,则优选微管、平板。本领域技术人员可以考虑为了反应而进行的涡旋混合或旋转式混合、为了在反应后分离肽和蛋白酶而进行的过滤等反应工序而设定为适当的反应容器。
本发明的试剂盒中所含的缓冲液是用于与前述含有蛋白质的样品和蛋白酶一起导入到前述反应容器内、利用前述蛋白酶使消化反应得以进行的缓冲液,是提供适合于蛋白酶消化的反应条件的缓冲液。反应条件可以根据所选择的蛋白酶等适当确定,也可以根据缓冲液的组成适当确定。
此外,本发明的试剂盒可以包含过滤膜,其用于在蛋白酶消化反应后除去蛋白酶等、从而将消化反应的生成物与前述缓冲液一起提取出来。
此外,本发明的试剂盒可以包含记载有试剂盒的使用方法和/或用于检测各变异体的质谱分析条件的说明书。
此外,本发明的试剂盒可以包含1种以上的内标肽。内标肽通过与被检体同时或另行在相同条件下进行分析而提供更确实的分析结果。内标肽设为含有测定对象的变异体所特有的氨基酸序列且具有可通过本发明的试剂盒中所含的蛋白酶的消化而生成的氨基酸序列的肽。内标肽例如可以用稳定同位素标记。这种情况下,与不含同位素的肽相比,质谱分析定量条件可能会有一些不同,因此优选同时附上内标用定量条件。
例如,测定对象为VEGF-A的剪接变体时,可以含有具有序列号11~26中的任意1种以上氨基酸序列的肽作为内标肽。
通过使用本发明的试剂盒,可以使蛋白酶消化片段肽的制备等前处理和质谱分析操作更加简便,还能够容易地利用装置而实现自动化。特别是,如果以固定化酶的形态来提供胰蛋白酶等蛋白酶作为试剂盒的构成要素,则能够进一步简化肽制备操作。
试剂盒中还可以进一步含有试剂品质担保数据(原子纯度测定结果等),此外可以包含除上述以外的各种试剂等。对试剂盒的任选构成要素没有特别限定。
[记录介质]
此外,本发明提供一种记录介质,其为记录有上述本发明的方法所使用的、用于运行质谱分析的数据的计算机可读记录介质,前述数据没有限定,包括关于1种以上的具有各变异体所特有的氨基酸序列的肽的母离子、碎片离子、预测保留时间和三重四级杆各自(第1四级杆、第2四极杆、第3四极杆)的电压数据。
需要说明的是,上述预测保留时间、电压数据等为根据所用的机器和测定条件等而改变的数值,优选匹配机器来提供。此外,本领域技术人员可以理解,对于根据条件而改变的数值,优选也一并提供其变动幅度。
记录介质可以为任一种形态,没有特别限定。可以列举例如能够通过电磁方式、光学方式记录信息的磁盘、存储器。
更具体而言,上述的方法包中可以包含例如以下信息和软件功能。
·最优化的源离子m/z值
·最优化的碎片离子m/z值
·最优化的Q1预偏置电压值
·最优化的Q2碰撞能量电压值
·最优化的Q3预偏置电压值
·目标离子的预测保留时间和质谱分析时间
·定量值换算式
·解析结果报告输出功能
※:实际测定各条件项目,选择离子强度最高且最具有再现性的m/z值,将其作为最佳值。
例如,作为用于定量VEGF-A的剪接变体的数据,可以包含上述表6和/或表7中记载的条件/参数。
[方法包]
此外,本发明提供一种利用高效液相色谱-质谱分析(LC-MS)进行蛋白质变异体的平行检测的方法包,其包含上述记录介质和前述记录介质的使用说明书。
本说明书中,“方法包”是指:以可读取的形态包含针对特定分析对象的蛋白质的液相色谱质谱分析的分析条件、且能够单独流通的数据包。通过将方法包中所含的数据输入到LC-MS,从而能够在经过详细研究后得到的最佳测定条件下进行分析。
如上所述,利用质谱分析的测定能够进行非常高精度的分析,另一方面,分析条件根据目标离子而完全不同,因此合适的分析条件的设定非常重要,但也非常困难,为了条件设定而需要大量时间。通过预先准备这样的条件,从而可以实际提高进行质谱分析的用户的便利性。在此之前,本申请人为了能够使用户更简便地进行例如农药、兽药的质谱分析,一直在提供利用LC-MS分析这些的方法包。
作为上述记录介质或方法包的例子,可以列举仅包含限定于特定变体的信息的记录介质或方法包。因此,在分析对象的变异体为例如VEGF-A的剪接变体时,可以提供记载有适合于这些的分析条件的记录介质或方法包。
这种情况下,记录介质中所含的数据例如是:关于1种以上的具有序列号11~26所示的氨基酸序列的肽的分析条件的数据。
方法包可以记载在多个质谱分析装置间通用的数据,也可以记载适合于利用特定质谱分析装置的分析的各种数据。
记录介质或方法包可以与上述本发明的试剂盒一起提供、或与试剂盒分开提供。
实施例
通过以下实施例更具体地说明本发明,但本发明不受实施例限定。
<实施例1>
[肽P09(QLELNER、序列号19)的检测]
进行了用于检测具有VEGF-A变体206、189、183、165和165B中所含的序列且通过胰蛋白酶消化而由这些变体生成的肽P09的条件的最优化和检测。为了本实施例而化学合成了肽P09。
[1.结构的鉴定、MS/MS离子的确认]
首先,进行了所检测的母离子P09的价数鉴定。
将针对肽P09的价数(+1~+5)的m/z值的计算值示于表3。其中,LCMS-IT-TOF、LCMS-8040和LCMS-8050都检测到+2价的离子(图2-1)。
[2.MRM条件的最优化]
然后,将肽P09的+2价的离子作为前体离子,进行MRM分析。图2-2示出利用LCMS-IT-TOF的MS2分析和LCMS-8050的分析结果。
通过Mascot检索预测生成如图2-2的下图所示的、各6种y离子、b离子和相当于它们的各种分解物的各种离子,其中,通过利用LCMS-IT-TOF的MS2分析和LCMS-8050两者检测到4种y离子(y(2)、y(3)、y(4)、y(5))。因此表明:这些离子适合作为产物离子进行检测。
[3.LCMS-8050MRM条件的最优化]
对于所选择的4种离子(y(2)、y(3)、y(4)、y(5)),分别研究利用LCMS-8040和LCMS-8050在MRM下检测时的碰撞能量的最佳条件。将结果分别示于图2-3和2-4。
图2-3的结果表明:在使用LCMS-8040作为分析装置时,用于检测4种离子的最佳的碰撞能量均为20V。此外,图2-4的结果表明:在使用LCMS-8050作为分析装置时,用于检测4种离子的最佳的碰撞能量为15V或20V。
[4.柱的保留时间的确定,MRM分析]
使用2.3.中最优化而得的条件进行柱保留时间的设定。作为分析装置,使用LCMS-8050。需要说明的是,HPLC在表5所记载的条件下实施。
如图2-5所示,将肽P09的+2价离子作为前体离子来检测y(2)、y(3)、y(4)、y(5)离子时,保留时间为约4.6分钟,明确了在4.20~5.20分钟的测定时间宽度下能够进行充分的检测。下图示出使用所确定的测定条件进行测定的结果。
<实施例2>
[肽P14(SWSVCDKPR、序列号24)的检测]
进行了用于检测具有仅包含于VEGF-A变体145中的序列、通过胰蛋白酶消化而由该变体生成的肽P14的条件的最优化和检测。为了本实施例而化学合成了肽P14。
[1.结构的鉴定、MS/MS离子的确认]
首先,进行了所检测的母离子P14的价数鉴定。
将针对肽P14的价数(+1~+5)的m/z值的计算值示于表3。其中,LCMS-IT-TOF、LCMS-8040和LCMS-8050都检测到+2价和+3价的离子(图3-1)。
[2.MRM条件的最优化(1)]
然后,将肽P14的+2价的离子作为前体离子而进行MRM分析。图3-2示出利用LCMS-IT-TOF的MS2分析和LCMS-8050的分析结果。
通过Mascot检索预测生成如图3-2的下图所示的、各8种y离子、b离子和相当于它们的各种分解物的各种离子,其中,通过利用LCMS-IT-TOF的MS2分析和LCMS-8050两者检测到1种b离子(b(2))和6种y离子(y(3)、y(4)、y(5)、y(6)、y(7)和y(7)++)。此外,用LCMS-8050以高峰检测到y(2)离子。因此表明:这些离子适合作为产物离子进行检测。
[3.LCMS-8050MRM条件的最优化(1)]
对于7种离子(y(2)、b(2)、y(3)、y(7)++、y(5)、y(6)和y(7)),分别研究利用LCMS-8050作为分析装置进行检测时的碰撞能量的最佳条件。将结果示于图3-3和3-4。
图3-3和3-4的结果表明:在使用LCMS-8050作为分析装置时,用于检测上述离子的最佳的碰撞能量在15V~25V的范围内,
[4.MRM条件的最优化(2)]
与上述的2平行地,将肽P14的+3价的离子作为前体离子进行MRM分析,研究更适宜的分析条件。图3-5中示出利用LCMS-IT-TOF的MS2分析和LCMS-8050的分析结果。
通过Mascot检索所预测的离子中,通过利用LCMS-IT-TOF的MS2分析和LCMS-8050两者检测到4种离子(y(2)、y(3)、y(4)和y(5))。因此表明:这些离子适合作为产物离子进行检测。
[5.LCMS-8050MRM条件的最优化(2)]
对于4种离子(y(2)、y(3)、y(4)和y(5)),分别研究利用LCMS-8050作为分析装置进行检测时的碰撞能量的最佳条件。将结果示于图3-6。
图3-6的结果表明:在使用LCMS-8050作为分析装置时,用于检测4种离子的最佳的碰撞能量为15V(y(4)和y(5))或20V(y(2)和y(3))。
[6.柱的保留时间的确定,MRM分析]
使用4.5.中最优化而得的条件进行柱保留时间的设定。作为分析装置,使用LCMS-8050。需要说明的是,HPLC在表5所记载的条件下实施。
如图3-7所示,将肽P14的+3价离子作为前体离子来检测y(2)、y(3)、y(4)、y(5)离子时,保留时间为约4.61分钟,明确了在4.20~5.20分钟的测定时间宽度下能够进行充分的检测。下图示出使用所确定的测定条件进行测定的结果。
<实施例3>
与实施例1和2同样地,对P01~P16这10种肽分别研究最佳的分析条件。将其结果示于图4。需要说明的是,虽然未示出具体数据,但图4的结果是对各肽进行与P09和P14同样的研究而得到的结果。
<实施例4>
利用本发明人等的方法实际分析了将肽P01~P16以特定的量比混合而成的样品。更具体而言,一边按照图4所示的条件以事件时间0.023秒、保留时间20.0m秒切换通道一边连续进行分析。将结果示于图5。
图5的结果表明:能够平行且同时地检测混合包含在样品中的肽。各肽的量和相对比分别反映了预先添加到测定样品中的肽量。
产业上的可利用性
根据本发明的方法,以往即使存在具有多个变异体的蛋白质也仅能进行整体定量或部分变异体的定量,在作为混合存在的变异体的复合结果发挥作用的临床中,利用这样的信息是存在问题的。
本发明的方法能够利用MRM分析同时平行地得到各变异体的信息,能够即刻将得到的定量值反馈给医生,能够作为临床给药、治疗法选择项的指标。提供以往完全未提出的新的医疗。
本说明书引用的全部出版物、专利和专利申请直接通过引用而并入本说明书中。
序列表
<110> 株式会社岛津制作所(Shimadzu Corporation)
国立研究开发法人国立癌症研究中心(National Cancer Center)
<120> 蛋白质变异体的平行定量方法
<130> PH-6544-PCT
<150> JP 2015-153656
<151> 2015-08-03
<160> 38
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 232
<212> PRT
<213> 人类(Homo sapiens)
<400> 1
Met Asn Phe Leu Leu Ser Trp Val His Trp Ser Leu Ala Leu Leu Leu
1 5 10 15
Tyr Leu His His Ala Lys Trp Ser Gln Ala Ala Pro Met Ala Glu Gly
20 25 30
Gly Gly Gln Asn His His Glu Val Val Lys Phe Met Asp Val Tyr Gln
35 40 45
Arg Ser Tyr Cys His Pro Ile Glu Thr Leu Val Asp Ile Phe Gln Glu
50 55 60
Tyr Pro Asp Glu Ile Glu Tyr Ile Phe Lys Pro Ser Cys Val Pro Leu
65 70 75 80
Met Arg Cys Gly Gly Cys Cys Asn Asp Glu Gly Leu Glu Cys Val Pro
85 90 95
Thr Glu Glu Ser Asn Ile Thr Met Gln Ile Met Arg Ile Lys Pro His
100 105 110
Gln Gly Gln His Ile Gly Glu Met Ser Phe Leu Gln His Asn Lys Cys
115 120 125
Glu Cys Arg Pro Lys Lys Asp Arg Ala Arg Gln Glu Lys Lys Ser Val
130 135 140
Arg Gly Lys Gly Lys Gly Gln Lys Arg Lys Arg Lys Lys Ser Arg Tyr
145 150 155 160
Lys Ser Trp Ser Val Tyr Val Gly Ala Arg Cys Cys Leu Met Pro Trp
165 170 175
Ser Leu Pro Gly Pro His Pro Cys Gly Pro Cys Ser Glu Arg Arg Lys
180 185 190
His Leu Phe Val Gln Asp Pro Gln Thr Cys Lys Cys Ser Cys Lys Asn
195 200 205
Thr Asp Ser Arg Cys Lys Ala Arg Gln Leu Glu Leu Asn Glu Arg Thr
210 215 220
Cys Arg Cys Asp Lys Pro Arg Arg
225 230
<210> 2
<211> 215
<212> PRT
<213> 人类(Homo sapiens)
<400> 2
Met Asn Phe Leu Leu Ser Trp Val His Trp Ser Leu Ala Leu Leu Leu
1 5 10 15
Tyr Leu His His Ala Lys Trp Ser Gln Ala Ala Pro Met Ala Glu Gly
20 25 30
Gly Gly Gln Asn His His Glu Val Val Lys Phe Met Asp Val Tyr Gln
35 40 45
Arg Ser Tyr Cys His Pro Ile Glu Thr Leu Val Asp Ile Phe Gln Glu
50 55 60
Tyr Pro Asp Glu Ile Glu Tyr Ile Phe Lys Pro Ser Cys Val Pro Leu
65 70 75 80
Met Arg Cys Gly Gly Cys Cys Asn Asp Glu Gly Leu Glu Cys Val Pro
85 90 95
Thr Glu Glu Ser Asn Ile Thr Met Gln Ile Met Arg Ile Lys Pro His
100 105 110
Gln Gly Gln His Ile Gly Glu Met Ser Phe Leu Gln His Asn Lys Cys
115 120 125
Glu Cys Arg Pro Lys Lys Asp Arg Ala Arg Gln Glu Lys Lys Ser Val
130 135 140
Arg Gly Lys Gly Lys Gly Gln Lys Arg Lys Arg Lys Lys Ser Arg Tyr
145 150 155 160
Lys Ser Trp Ser Val Pro Cys Gly Pro Cys Ser Glu Arg Arg Lys His
165 170 175
Leu Phe Val Gln Asp Pro Gln Thr Cys Lys Cys Ser Cys Lys Asn Thr
180 185 190
Asp Ser Arg Cys Lys Ala Arg Gln Leu Glu Leu Asn Glu Arg Thr Cys
195 200 205
Arg Cys Asp Lys Pro Arg Arg
210 215
<210> 3
<211> 209
<212> PRT
<213> 人类(Homo sapiens)
<400> 3
Met Asn Phe Leu Leu Ser Trp Val His Trp Ser Leu Ala Leu Leu Leu
1 5 10 15
Tyr Leu His His Ala Lys Trp Ser Gln Ala Ala Pro Met Ala Glu Gly
20 25 30
Gly Gly Gln Asn His His Glu Val Val Lys Phe Met Asp Val Tyr Gln
35 40 45
Arg Ser Tyr Cys His Pro Ile Glu Thr Leu Val Asp Ile Phe Gln Glu
50 55 60
Tyr Pro Asp Glu Ile Glu Tyr Ile Phe Lys Pro Ser Cys Val Pro Leu
65 70 75 80
Met Arg Cys Gly Gly Cys Cys Asn Asp Glu Gly Leu Glu Cys Val Pro
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Thr Glu Glu Ser Asn Ile Thr Met Gln Ile Met Arg Ile Lys Pro His
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Gln Gly Gln His Ile Gly Glu Met Ser Phe Leu Gln His Asn Lys Cys
115 120 125
Glu Cys Arg Pro Lys Lys Asp Arg Ala Arg Gln Glu Lys Lys Ser Val
130 135 140
Arg Gly Lys Gly Lys Gly Gln Lys Arg Lys Arg Lys Lys Ser Arg Pro
145 150 155 160
Cys Gly Pro Cys Ser Glu Arg Arg Lys His Leu Phe Val Gln Asp Pro
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Gln Thr Cys Lys Cys Ser Cys Lys Asn Thr Asp Ser Arg Cys Lys Ala
180 185 190
Arg Gln Leu Glu Leu Asn Glu Arg Thr Cys Arg Cys Asp Lys Pro Arg
195 200 205
Arg
<210> 4
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<212> PRT
<213> 人类(Homo sapiens)
<400> 4
Met Asn Phe Leu Leu Ser Trp Val His Trp Ser Leu Ala Leu Leu Leu
1 5 10 15
Tyr Leu His His Ala Lys Trp Ser Gln Ala Ala Pro Met Ala Glu Gly
20 25 30
Gly Gly Gln Asn His His Glu Val Val Lys Phe Met Asp Val Tyr Gln
35 40 45
Arg Ser Tyr Cys His Pro Ile Glu Thr Leu Val Asp Ile Phe Gln Glu
50 55 60
Tyr Pro Asp Glu Ile Glu Tyr Ile Phe Lys Pro Ser Cys Val Pro Leu
65 70 75 80
Met Arg Cys Gly Gly Cys Cys Asn Asp Glu Gly Leu Glu Cys Val Pro
85 90 95
Thr Glu Glu Ser Asn Ile Thr Met Gln Ile Met Arg Ile Lys Pro His
100 105 110
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<212> PRT
<213> 人类(Homo sapiens)
<400> 5
Met Asn Phe Leu Leu Ser Trp Val His Trp Ser Leu Ala Leu Leu Leu
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Tyr Leu His His Ala Lys Trp Ser Gln Ala Ala Pro Met Ala Glu Gly
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Gly Gly Gln Asn His His Glu Val Val Lys Phe Met Asp Val Tyr Gln
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Arg Ser Tyr Cys His Pro Ile Glu Thr Leu Val Asp Ile Phe Gln Glu
50 55 60
Tyr Pro Asp Glu Ile Glu Tyr Ile Phe Lys Pro Ser Cys Val Pro Leu
65 70 75 80
Met Arg Cys Gly Gly Cys Cys Asn Asp Glu Gly Leu Glu Cys Val Pro
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Thr Glu Glu Ser Asn Ile Thr Met Gln Ile Met Arg Ile Lys Pro His
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Glu Cys Arg Pro Lys Lys Asp Arg Ala Arg Gln Glu Asn Pro Cys Gly
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<213> 人类(Homo sapiens)
<400> 6
Met Asn Phe Leu Leu Ser Trp Val His Trp Ser Leu Ala Leu Leu Leu
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Tyr Leu His His Ala Lys Trp Ser Gln Ala Ala Pro Met Ala Glu Gly
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Gly Gly Gln Asn His His Glu Val Val Lys Phe Met Asp Val Tyr Gln
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Glu Cys Arg Pro Lys Lys Asp Arg Ala Arg Gln Glu Lys Lys Ser Val
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Arg Gly Lys Gly Lys Gly Gln Lys Arg Lys Arg Lys Lys Ser Arg Tyr
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Lys Ser Trp Ser Val Cys Asp Lys Pro Arg Arg
165 170
<210> 7
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<212> PRT
<213> 人类(Homo sapiens)
<400> 7
Met Asn Phe Leu Leu Ser Trp Val His Trp Ser Leu Ala Leu Leu Leu
1 5 10 15
Tyr Leu His His Ala Lys Trp Ser Gln Ala Ala Pro Met Ala Glu Gly
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Gly Gly Gln Asn His His Glu Val Val Lys Phe Met Asp Val Tyr Gln
35 40 45
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<210> 8
<211> 191
<212> PRT
<213> 人类(Homo sapiens)
<400> 8
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Gly Gly Gln Asn His His Glu Val Val Lys Phe Met Asp Val Tyr Gln
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Cys Lys Cys Ser Cys Lys Asn Thr Asp Ser Arg Cys Lys Ala Arg Gln
165 170 175
Leu Glu Leu Asn Glu Arg Thr Cys Arg Ser Leu Thr Arg Lys Asp
180 185 190
<210> 9
<211> 147
<212> PRT
<213> 人类(Homo sapiens)
<400> 9
Met Asn Phe Leu Leu Ser Trp Val His Trp Ser Leu Ala Leu Leu Leu
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Tyr Leu His His Ala Lys Trp Ser Gln Ala Ala Pro Met Ala Glu Gly
20 25 30
Gly Gly Gln Asn His His Glu Val Val Lys Phe Met Asp Val Tyr Gln
35 40 45
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65 70 75 80
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115 120 125
Glu Cys Arg Pro Lys Lys Asp Arg Ala Arg Gln Glu Lys Cys Asp Lys
130 135 140
Pro Arg Arg
145
<210> 10
<211> 137
<212> PRT
<213> 人类(Homo sapiens)
<400> 10
Met Asn Phe Leu Leu Ser Trp Val His Trp Ser Leu Ala Leu Leu Leu
1 5 10 15
Tyr Leu His His Ala Lys Trp Ser Gln Ala Ala Pro Met Ala Glu Gly
20 25 30
Gly Gly Gln Asn His His Glu Val Val Lys Phe Met Asp Val Tyr Gln
35 40 45
Arg Ser Tyr Cys His Pro Ile Glu Thr Leu Val Asp Ile Phe Gln Glu
50 55 60
Tyr Pro Asp Glu Ile Glu Tyr Ile Phe Lys Pro Ser Cys Val Pro Leu
65 70 75 80
Met Arg Cys Gly Gly Cys Cys Asn Asp Glu Gly Leu Glu Cys Val Pro
85 90 95
Thr Glu Glu Ser Asn Ile Thr Met Gln Ile Met Arg Ile Lys Pro His
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Gln Gly Gln His Ile Gly Glu Met Ser Phe Leu Gln His Asn Lys Cys
115 120 125
Glu Cys Arg Cys Asp Lys Pro Arg Arg
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<210> 11
<211> 16
<212> PRT
<213> 人类(Homo sapiens)
<400> 11
Ala Pro Met Ala Glu Gly Gly Gly Gln Asn His His Glu Val Val Lys
1 5 10 15
<210> 12
<211> 7
<212> PRT
<213> 人类(Homo sapiens)
<400> 12
Phe Met Asp Val Tyr Gln Arg
1 5
<210> 13
<211> 19
<212> PRT
<213> 人类(Homo sapiens)
<400> 13
Ile Lys Pro His Gln Gly Gln His Ile Gly Glu Met Ser Phe Leu Gln
1 5 10 15
His Asn Lys
<210> 14
<211> 6
<212> PRT
<213> 人类(Homo sapiens)
<400> 14
Cys Glu Cys Arg Pro Lys
1 5
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<211> 9
<212> PRT
<213> 人类(Homo sapiens)
<400> 15
Ser Trp Ser Val Tyr Val Gly Ala Arg
1 5
<210> 16
<211> 20
<212> PRT
<213> 人类(Homo sapiens)
<400> 16
Cys Cys Leu Met Pro Trp Ser Leu Pro Gly Pro His Pro Cys Gly Pro
1 5 10 15
Cys Ser Glu Arg
20
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<211> 11
<212> PRT
<213> 人类(Homo sapiens)
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His Leu Phe Val Gln Asp Pro Gln Thr Cys Lys
1 5 10
<210> 18
<211> 5
<212> PRT
<213> 人类(Homo sapiens)
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Asn Thr Asp Ser Arg
1 5
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<211> 7
<212> PRT
<213> 人类(Homo sapiens)
<400> 19
Gln Leu Glu Leu Asn Glu Arg
1 5
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<211> 5
<212> PRT
<213> 人类(Homo sapiens)
<400> 20
Cys Asp Lys Pro Arg
1 5
<210> 21
<211> 12
<212> PRT
<213> 人类(Homo sapiens)
<400> 21
Ser Trp Ser Val Pro Cys Gly Pro Cys Ser Glu Arg
1 5 10
<210> 22
<211> 10
<212> PRT
<213> 人类(Homo sapiens)
<400> 22
Ser Arg Pro Cys Gly Pro Cys Ser Glu Arg
1 5 10
<210> 23
<211> 11
<212> PRT
<213> 人类(Homo sapiens)
<400> 23
Gln Glu Asn Pro Cys Gly Pro Cys Ser Glu Arg
1 5 10
<210> 24
<211> 9
<212> PRT
<213> 人类(Homo sapiens)
<400> 24
Ser Trp Ser Val Cys Asp Lys Pro Arg
1 5
<210> 25
<211> 8
<212> PRT
<213> 人类(Homo sapiens)
<400> 25
Gln Glu Asn Cys Asp Lys Pro Arg
1 5
<210> 26
<211> 5
<212> PRT
<213> 人类(Homo sapiens)
<400> 26
Ser Leu Thr Arg Lys
1 5
<210> 27
<211> 14
<212> PRT
<213> 人类(Homo sapiens)
<400> 27
Met Ala Glu Gly Gly Gly Gln Asn His His Glu Val Val Lys
1 5 10
<210> 28
<211> 5
<212> PRT
<213> 人类(Homo sapiens)
<400> 28
Asp Val Tyr Gln Arg
1 5
<210> 29
<211> 17
<212> PRT
<213> 人类(Homo sapiens)
<400> 29
Pro His Gln Gly Gln His Ile Gly Glu Met Ser Phe Leu Gln His Asn
1 5 10 15
Lys
<210> 30
<211> 4
<212> PRT
<213> 人类(Homo sapiens)
<400> 30
Cys Arg Pro Lys
1
<210> 31
<211> 7
<212> PRT
<213> 人类(Homo sapiens)
<400> 31
Ser Val Tyr Val Gly Ala Arg
1 5
<210> 32
<211> 15
<212> PRT
<213> 人类(Homo sapiens)
<400> 32
Pro Trp Ser Leu Pro Gly Pro His Pro Cys Gly Pro Cys Ser Glu
1 5 10 15
<210> 33
<211> 5
<212> PRT
<213> 人类(Homo sapiens)
<400> 33
Pro Gln Thr Cys Lys
1 5
<210> 34
<211> 5
<212> PRT
<213> 人类(Homo sapiens)
<400> 34
Glu Leu Asn Glu Arg
1 5
<210> 35
<211> 8
<212> PRT
<213> 人类(Homo sapiens)
<400> 35
Pro Cys Gly Pro Cys Ser Glu Arg
1 5
<210> 36
<211> 4
<212> PRT
<213> 人类(Homo sapiens)
<400> 36
Cys Ser Glu Arg
1
<210> 37
<211> 8
<212> PRT
<213> 人类(Homo sapiens)
<400> 37
Pro Cys Gly Pro Cys Ser Glu Arg
1 5
<210> 38
<211> 5
<212> PRT
<213> 人类(Homo sapiens)
<400> 38
Cys Asp Lys Pro Arg
1 5

Claims (12)

1.一种用质谱分析对具有2种以上变异体的蛋白质的各变异体进行平行定量的方法,其包含:
对样品中的蛋白质进行蛋白酶消化,
利用质谱分析检测通过所述蛋白酶消化得到的肽中的、2种以上的具有各变异体所特有的氨基酸序列的肽,
基于所述质谱分析的结果确定样品中的各变异体的量。
2.根据权利要求1所述的方法,其包含:对具有2种以上变异体所共有的氨基酸序列的肽进行进一步检测。
3.根据权利要求1或2所述的方法,其中,变异体为所述蛋白质的剪接变体。
4.根据权利要求1~3中任一项所述的方法,其中,所述蛋白质为血管内皮生长因子(VEGF)-A。
5.根据权利要求4所述的方法,其中,所述变异体包含选自以下的VEGF-A剪接变体中的2种以上,所述VEGF-A剪接变体为:206(序列号1)、189(序列号2)、183(序列号3)、165(序列号4)、148(序列号5)、145(序列号6)、121(序列号7)、165b(序列号8)、121b(序列号9)和111(序列号10)。
6.根据权利要求4或5所述的方法,其中,对具有序列号11~26所示的氨基酸序列的肽中的1种以上进行检测。
7.一种试剂盒,其为使用高效液相色谱-质谱分析(LC-MS)实施权利要求1~6中任一项所述的方法中所使用的试剂盒,其含有:
蛋白酶;
反应容器,其用于使所述蛋白质与所述蛋白酶接触、从而消化所述蛋白质;
缓冲液,其用于利用所述蛋白酶进行消化反应;和
1种以上内标肽,其具有所述各变异体所特有的氨基酸序列。
8.根据权利要求7所述的试剂盒,其进一步包含:记载有用于检测各变异体的质谱分析条件的说明书。
9.根据权利要求7或8所述的试剂盒,其含有:具有序列号11~26所示的氨基酸序列的肽作为内标肽。
10.一种记录介质,其为记录有权利要求1~6中任一项所述的方法中所使用的、用于运行质谱分析的数据的计算机可读记录介质,
所述数据包括:关于1种以上具有各变异体所特有的氨基酸序列的肽的母离子、碎片离子、预测保留时间和三重四级杆各自的电压数据。
11.一种用于利用高效液相色谱-质谱分析(LC-MS)进行蛋白质变异体的平行检测的方法包,其包含权利要求10所述的记录介质和所述记录介质的使用说明书。
12.根据权利要求10所述的记录介质或权利要求11所述的方法包,其中,所述数据为关于1种以上的具有序列号11~26所示的氨基酸序列的肽的数据。
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