CN101153872A - 一种新型检测评估危重病人的试剂盒和方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种检测、评估危重病人的试剂盒和新方法，为一种非侵入性危重蛋白的体外检测方法。本方法用抗体吸附表面基质及质谱法进行鉴别检测发现一种新型变异的β2－微球蛋白。变异的β2－微球蛋白或11465±15及11648±15Da峰值可用于危重病人的检测及评估。变异的β2－微球蛋白或11465±15及11648±15Da峰值升高者提示预后差。本发明提供方法能够检测ICU危重病人及十种不同肿瘤的危重病人，其灵敏度为94％，特异性为100％。通过11465±15及11648±15Da峰值或被抗体吸附表面基质上捕获的变异的β2－微球蛋白，用标准化质控血清控制下的定量性质谱分析来检测，可以应用到已经脱离人体的体液中的生物标志组合的检测方法或试剂盒开发。本方法准确、方便且快捷。

Description

一种新型检测评估危重病人的试剂盒和方法

技术领域

本发明涉及一种非侵入性检测、评估危重病人试剂盒的新方法，其特征是采用质谱法对样品中已被磁珠或抗体捕获的β2-微球蛋白进行精确地鉴别、检测的方法。本发明提供的方法能够检测ICU危重病人及十种不同肿瘤的危重病人，其灵敏度为94％，特异性为100％。

背景技术

随着人类基因组计划的实施和完成，科学家们提出了后基因组(post-genome)计划的概念，研究要点转移到功能基因组学上，而生物功能主要体现物质是蛋白质。1994年，澳大利亚Macquarie大学的Wilkins和Williams首先提出蛋白质组(proteome)的概念，指的是“一种基因组所表达的全部蛋白质”，即包括一种细胞乃至一种生物所表达的全部蛋白质。对于蛋白质组的研究是功能基因组学研究的核心，称为蛋白质组学(proteomics)。蛋白质组学被认为是后基因组研究中最主要的部分。与基因组相比，蛋白质组的组成更复杂，功能更活跃，应用前景更广泛。蛋白质组学从细胞整体水平进行蛋白质属性的研究，如表达水平、翻译后修饰及相互作用等，并由此获得对于疾病过程、细胞生理生化特征和调控网络的广泛完整的认识。所以，蛋白质组学技术正在逐步成为生物学、医学及制药学等的重要研究手段。

不论是细胞的正常功能还是病理特性都在一定程度上取决于细胞所表达的蛋白质功能。因此，鉴定人体内表达的蛋白质的区别，可用于体外疾病样本诊断及筛查，并最终用于药物开发和疾病治疗。而要进行蛋白质表达和功能的差异化分析，要求能够达到分辨细胞内分子的复杂混合物的程度。但细胞内许多物质往往以微量存在，目前用于分析蛋白的方法在上述各方面都有局限，用这些常规手段难以进行化学结构及蛋白质序列鉴定分析。用抗体及质谱联合可克服这一技术缺点。

发明内容：

本发明的目的是建立一种在生物样品中检测正常人与某种或多种疾病在离体血液中生物标志的试剂盒和方法。该方法为疾病的早期检测提供了新的途径，并为进一步发现新的变异的或修饰的生物标志提供了基础。

本发明涉及一种非侵入性检测、评估危重病人的新方法，其特征是采用质谱法对样品中已被WCX/SAX磁珠或抗体捕获的变异的β2-微球蛋白进行精确地鉴别、检测的方法。

本发明中的变异的β2-微球蛋白生物标志是利用一台质谱仪来发现的。该设备的质量精确度约为+/-0.1％。

β2-微球蛋白生物标志物首先能够被具有能与生物标志物结合的抗体或磁珠基质WCX/SAX吸附表面捕获，非吸附物能从基质上洗脱，吸附到底基的生物标志物在飞行质谱仪中被检测。生物标志物通过离子发生源，如激光，被离子化，产生的离子被一个离子感受集合器收集，然后质量分析器分析那些通过的离子。之后，检测器将检测的离子信息转换为质荷比。定量性控制及质谱激光能量调控：每次测试前，用质谱的标准化质控血清，将标准化质控血清中用于定量的标准峰4091.1Da或6634.0Da强度调至50％质谱信号强度的最大值。生物标志物的检测明显地将与信号强度的检测有关。这样，生物标志物的数量与质量都可以被检测出来。

飞行质谱对待分析物的分析生成飞行时间谱。该飞行时间谱的最终分析并不表示离子化能量攻击一个样本产生的单独的脉冲信号，而是一系列脉冲的信号之和。这样降低了干扰，并增加了动态范围。该飞行时间数据受数据处理软件的影响。软件中数据处理主要包括转换飞行时间与质荷比而产生质谱，降低基线而减少仪器的偏移量，和过滤高频噪音而减轻高频噪音。

通过对生物标志物的吸附和检测而产生的数据可利用计算机的数据分析程序进行分析。该计算机程序分析这些数据以显示检测出的标记物的数量，并显示信号的强度和确定被检测的每个生物标志物的分子量。数据分析还能包括一系列的确定生物标志物的信号强度和矫正数据对预定统计分布状态的偏离。例如，通过计算与某些参数相关的每个峰值的高度，可规范观测到的峰。该参数可能是由仪器和类似能量吸收分子等化学成分产生的不重要的干扰，这可以设置调零。

计算机可以将计算结果数据转换成各种形式来表现。其标准谱可以表示，但在一种形式中只有峰高和质量信息可以在谱带中保留，产生一个较清晰的图，并使具有几乎相同分子量的生物标志物更易显现。在另一种形式中，两个或更多的谱比较，便于突显独特的生物标记物和那些高于或低于校准样本的生物标志物。

分析一般包括展示从待分析物得到的信号的图谱中峰的鉴定。峰可以通过视图进行选择，软件是可用的，它可自动检测峰。一般情况下，该软件通过鉴定信号具有信噪比高于一个选择阈值并标记出在峰信号的质心处的峰的质量这样的方式操作。在一个有效的程序中，比较许多谱线以认定出现在质谱中某一选定范围内同样的一些峰。该软件的一个版本聚集所有出现在确定的质量范围内的各条光谱的峰，对所有在质量(质荷比)中值附近的峰指定一个质量(质荷比)簇。

对生物标志的检测需要将一个样本放基质的一个吸附点上，接着进行清洗。向吸附点上加入SINAPINIC酸等并让其干燥。而后，用质谱测定法对基质进行分析，而一个显示了蛋白质分子的遗留物图将生成，这张图是在蛋白质分子的质量-电荷比的基础上，以彼此分开的峰图的形式显示出来的。

因为本项发明中的生物标记是通过质量和抗体来标识的，因而它们可通过质谱测定法进行检测而直接知道它们特定的身份。这种方法比抗体为基础的ELISA及免疫荧光法更准确。

然而，如果有必要，这些生物标志也可通过，比如，确定多肽的氨基酸序列来进行鉴别。例如，一个生物标志能用许多酶描绘出来，例如V8蛋白酶(V8 protease)或胰蛋白酶，而且消化片段(digestion fragments)的分子量可被用来在数据库中搜索序列，这些序列与由多种酶生成的消化片断的分子量相吻合。或者，如果此生物标志不是已知数据库中的蛋白质分子，在生物标志的N极氨基酸序列(N-terminal Amino Acid Sequence)的基础上，可使用降解探针，而后，这些探针会被用来描绘由探测到了生物标志的样本所生成的基因组或cDNA库。最后，蛋白质生物标志可用蛋白质梯状排序法(protein laddersequencing)进行排序。通过将分子碎成碎片并将碎片用酶解作用或其他可按顺序从碎片末端除去一个单个氨基酸分子的方法进行处理后，可生成蛋白质梯度(protein ladders)。然后，用质谱对此梯度进行分析。阶梯状碎片(ladder fragments)在质量上的差异可鉴别出从分子末端被除去的氨基酸。

特异性是指某一物质或某种疾病的专一属性，它是代表某种物质或某种疾病的特征。通过某些特征可以识别某种物质或某种疾病，从而把它和其他物质或疾病区分开来。对专有特征的识别往往依赖于特殊的检测方法，例如要了解某种疾病是否存在有特异性抗原就要用有关特异性抗体来检测。自蛋白质组学研究有新发展以来，这种传统意义上特异性检测和界定方法有了很大的突破。如一个蛋白质不同片段变异是不同类型肿瘤的标志。根据基因到蛋白质表达的复杂过程，一种特异性基因的产物-蛋白质必定有相关多组分蛋白质的表达。通过对这些不同组分的检测形成一个综合模式图(蛋白指纹图谱)，将这种图谱(如某种肿瘤)与其他图谱(如正常人或其他疾病)相比较，进而识别这种特异蛋白(如肿瘤抗原或其片段)，从而将正常人与患某种疾病病人血液区分开来。

具体操作步骤：

以下是用本发明提供的一个操作方案实例。

1.样品处理及标准化质控血清制备

将生物样品稀释在稀释缓冲溶液中，视需要离心澄清样品。质谱的标准化质控血清制备定义符合如下标准：供血者10人，5男5女，血型为O型；年龄为18-30岁；民族汉。生化指标正常，包括：总胆固醇、甘油三酯、空腹血糖、乙肝表面抗原、肝功检查、肾功检查；无遗传病家族史；无重大传染病史。女性不能怀孕，男性为不吸烟者。

2.样品上样

将质谱的标准化质控血清及样品点样在磁性珠子(磁珠)作为支持物的基质上[a.可用WCX或SAX基质的磁珠，阴离子表面(WCX，Weak Cationic Exchanger，-羧酸基团)基质磁珠(实施例1)及阳离子表面(SAX，Strong Anionic Exchanger，-氨基基团)；或用b.已标记上抗β2-微球蛋白抗体基质的磁珠(实施例2)]。可以将质谱的标准化质控血清用于质谱的定量方法。基质的支持物可以是陶瓷珠、磁性珠、多聚体或Sepharosebeads。

3.洗涤

用结合缓冲液洗涤。在样品完全干燥前将第一份洗涤溶液加到该位点。洗涤溶液在位点上至少停留10秒。彻底清除第一份洗涤溶液，用第二份洗涤液重复以上步骤。0.5～2％三氟乙酸彻底洗涤整个磁珠阵列点，将生物标志洗脱至质谱专用金属片(有3×3mm圆孔)上，自然干燥金属片，加0.5μL吸能分子(以50％乙腈，0.5％三氟乙酸的制备的标准溶液)。

吸能分子可用Sinapinic acid或alpha-Cyano-4-hydroxycinnamic acid等。

4.质谱的定量控制及测试

用激光解吸/离子化飞行时间质谱仪，用氮激光仪(337nm)和80cm或120cm飞行管分析阵列去分析滞留与各位点的生物标志或蛋白质。用计算机分析数据进行数据重叠展示。

定量性质谱调控：每次测试前，用质谱的标准化质控血清，将标准化质控血清中用于定量的标准峰409L 1Da或6634.0Da强度调至50％信号强度的最大值。

本发明与其他非侵入性的体外检测方法比较，具有以下的特点：

(1)准确及精确

用抗体及质谱联合精确检测多种生物标志方法的一个特点是能够从复杂的样品混合物中准确地分辨出分析物。抗体与抗原结合的准确率超过95％。这是ELISA及免疫荧光试剂盒等的基楚。

质谱直接分析有很强的精确性，一般误差率只有0.1Da。因为蛋白质是由氨基酸组成的，而氨基酸的平均质量是已知的，如果知道了抗原或生物标志的总分子量，那么抗原的变异(指氨基酸变化)就很容易被推测出来。但ELISA及免疫荧光试剂盒无法知道抗原的变异。所以，用抗体及质谱联合精确检测生物标志方法可提供被分析物(抗原或生物标志)化学或结构特征的直接信息。举例：

已知纤维蛋白肽A分子的分子量为1536Da，化学结构为16个氨基酸(N端Ala-Asp-Ser-Gly-Glu-Gly-Asp-Phe-Leu-Ala-Glu-Gly-Gly-Gly-Val-Arg C端)。纤维蛋白肽A的抗体与质谱仪联合应用发现分子量为1536Da的纤维蛋白肽A。则100％可确定被分析物是纤维蛋白肽A，即最精确鉴别(金标准)。

用纤维蛋白肽A的抗体与质谱仪联合应用发现被分析物是分子量为1465±1Da变异的纤维蛋白肽A。则化学结构可以(从N端至C端)推测为15个氨基酸：N端Asp-Ser-Gly-Glu-Gly-Asp-Phe-Leu-Ala-Glu-Gly-Gly-Gly-Val-Arg C端。

(2)方便

本方法将蛋白质分成了阴离子、阳离子、抗体作用的蛋白质。这样，可用质谱仪直接进行分析。蛋白质被鉴定以后可以用数码格式(条码带)永远地保留下来。这样可以节省标本库的面积。

(3)快捷

用本发明提供的已知抗体及质谱联合精确检测生物标志方法进行疾病血清检测时，无需对蛋白质进行测序即可知“变异的或修饰的生物标志”。不像免疫荧光法试剂盒，无法知道“变异的或修饰的生物标志”。修饰的生物标志指甲基化、乙酰化、羟基化、磷酸化修饰等的高表达或低表达变化。用本发明提供的蛋白指纹法进行疾病血清诊断时，无需对蛋白质进行测序。

附图说明

图1正常人、ICU感染的危重病人、十种不同肿瘤的危重病人血清中11465±15及11648±15Da蛋白指纹峰值

具体实施方式

本发明将结合具体实施例作进一步说明，这些实例仅用于说明目的，而不用于限制本发明范围。

实施例1一种新型检测评估危重病人的试剂盒和方法

(1)实验方法

一、材料

1.标本来源：A.50例正常人对照组的血清；B.20例ICU感染的危重病人的血清；C.30例十种不同肿瘤的危重病人(患者死亡前两个月内)的血清。

2.质量控制：A.人标准化质控血清B.质谱激光能量调控：每次测试前，用上述标准化质控血清。

二、方法

1.样品的收集：全血采集后吸取血清，置于-80℃保存；-80℃冰箱中取出血清样品，置冰盒上融解；以10，000转/分，4℃离心2分钟；取上清液。

2.样品的准备：每个吸附剂基质支持物点需要血清3μl，将血清用2倍体积U9缓冲液(9M Urea，2％CHAPS，50mM Tris-HCL，pH9.0)稀释(例如：3μl血清用6μl缓冲液稀释)。将样品充分混匀。将9μl上述样品加入111μl相应的结合缓冲液，使得血清的总稀释倍数达到约40倍。将处理好的血清样品40μl上样到吸附剂基质上。

3.样品检测：上样，在WCX基质磁珠阵列点中加入40μl处理好的样品，置振荡器，400-600转/分，4℃震荡1小时。甩出样品，每孔加入200μl的结合缓冲液50mM NaAC，pH4.0-5.0。室温置振荡器400-600转/分，震荡5分钟，甩去孔中液体，再次加入结合缓冲液200μl，重复操作一次。每孔加入200μl HPLC水，立刻甩出。1％三氟乙酸彻底洗涤整个WCX磁珠阵列点，将生物标志洗脱至质谱专用金属片(有3×3mm圆孔)上，自然干燥金属片，加0.5μL吸能分子SINAPINIC酸(以50％乙腈，0.5％三氟乙酸的制备的标准溶液)。

4.将上述样品加入质谱中，就会生成飞行时间质谱。外部使用多肽分子质量标准来校正质量精确性。

(2)实验结果

用统计学方法，通过分析血清蛋白指纹峰，发现下述一种分子量为11465±15及11648±15Da蛋白指纹(图1A和1B)可以用于区分正常人血清、ICU危重病人的血清、肿瘤危重病人的血清：

筛选试验	正常人	ICU危重病人	肿瘤危重病人
				11465Da	(-)	(+)	(+)
11648Da	(-)	(+)	(+)
				合计(例)	50	19	28

50例正常人对照组的血清：阴性

19例ICU危重病人的血清：阳性

28例肿瘤危重病人的血清：阳性

发现分子量为11465±15及11648±15Da蛋白指纹的变化对于鉴别危重病人具有重要意义。通过这个峰的鉴别，本实验中20例ICU危重病人的血清样品中有19例被准确的检出；30例肿瘤危重病人的血清样品中有28例被准确的检出。此结果表明，该方法的灵敏度为94％(47/50)，特异性100％(50/50)。查已知cDNA数据库中的血β2-微球蛋白分子的分子量(99个氨基酸时，分子量为11729Da，pI6.07)。

实施例2 血液中β2-微球蛋白分子鉴定

用Carbodiimide方法(Carbodiimide Method)将带有羧酸基团标记的磁性珠上基质与抗β2-微球蛋白抗体的氨基基团结合(Gunn DL，et al.Preparation of sensitiveand stable erythrocytes byhe carbodiimide method for the detection of primaryand secondary IgM and IgG antibody.J Immunol Methods.1972；1(4)：381-389.)。

将样品点样在一个抗β2-微球蛋白抗体基质的位点上。

用结合缓冲液洗涤。在样品完全干燥前将第一份洗涤溶液加到该位点。洗涤溶液在位点上至少停留10秒。彻底清除第一份洗涤溶液，用第二份洗涤液重复以上步骤。用1％三氟乙酸彻底洗涤整个阵列点，将生物标志洗脱至质谱专用金属片(有3×3mm圆孔)上，自然干燥金属片，加0.5μL Sinapinic acid吸能分子(以50％乙腈，0.5％三氟乙酸的制备的标准溶液)。

用质谱仪，用氮激光仪(337nm)和80cm或120cm飞行管分析阵列去分析各位点的生物标志或蛋白质。用计算机分析数据进行数据重叠展示。

(3)实验结果

用抗β2-微球蛋白抗体基质与质谱仪联合应用发现被分析物是分子量与实施例1一致，而非已知cDNA数据库中的血液中β2-微球蛋白分子的分子量(11729Da)。则11465±15及11648±15Da化学结构可以推测为变异的β2-微球蛋白。发现下述变异的β2-微球蛋白可以用于区分正常人血清、ICU危重病人的血清、肿瘤危重病人的血清：

筛选试验	正常人	ICU危重病人	肿瘤危重病人
				变异的β2-微球蛋白	(-)	(+)	(+)
合计(例)	50	19	28

50例正常人对照组的血清：阴性

19例ICU危重病人的血清：阳性

28例肿瘤危重病人的血清：阳性

结论

将来自具有统计意义ICU危重病人和肿瘤危重病人群的样品与对照组(正常样品)比较，用WCX磁珠所捕获的11465±15及11648±15Da组或抗β2-微球蛋白抗体吸附表面所捕获的β2-微球蛋白生物标志是一致的。抗β2-微球蛋白抗体吸附表面所捕获的新型变异β2-微球蛋白或用WCX磁珠所捕获的11465及11648±15Da组的试剂盒可检测、评估危重病人。本发明提供方法能够检测ICU危重感染病人及十种不同肿瘤的危重病人，其灵敏度为94％，特异性为100％。

本方法用WCX基质、β2-微球蛋白抗体吸附表面基质及质谱法进行鉴别检测发现一种新型变异的β2-微球蛋白。变异的β2-微球蛋白可用于危重病人的检测及评估。变异的β2-微球蛋白升高者提示预后差。通过WCX基质及被抗体吸附表面基质上捕获的变异的β2-微球蛋白，用标准化质控血清控制下的定量性质谱分析来检测，可以应用到已经脱离人体的体液中的生物标志组合的检测方法或试剂盒开发。本方法准确、方便且快捷。

在本发明提及的所有文献都在本申请中引用参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

Claims (3)

1.本发明涉及一种检测、评估危重病人的试剂盒和新方法，其特征是采用质谱法对样品中已被基质捕获的变异的β2-微球蛋白生物标志进行精确地鉴别、检测的方法。该方法通过以下步骤实现：

(1)样品处理及质谱标准化质控血清制备；

(2)样品上样至磁珠基质上；

(3)洗涤；

(4)质谱的定量控制及质谱测试；

其中所述步骤(1)将生物样品稀释在稀释缓冲溶液中。用O型血，男女相等，混合制备质谱的标准化质控血清；所述步骤(2)将质谱的标准化质控血清及样品点样在磁珠基质上。所述步骤(3)用结合缓冲液洗涤。在样品完全干燥前将第一份洗涤溶液加到该位点。洗涤溶液在位点上至少停留10秒。彻底清除第一份洗涤溶液，用第二份洗涤液重复以上步骤。用0.5～2％三氟乙酸彻底洗涤磁珠，将生物标志洗脱至质谱专用的金属片上，自然干燥金属片，加0.5μL以50％乙腈，0.5％三氟乙酸制备的吸能分子标准溶液。吸能分子可用Sinapinic acid或alpha-Cyano-4-hydroxycinnamic acid等；所述步骤(4)用激光解吸/离子化飞行时间质谱仪，用氮激光仪(337nm)和80cm或120cm飞行管分析阵列去分析变异的β2-微球蛋白生物标志。用计算机分析数据为11465±15及11648±15Da峰值。定量性质谱调控：每次测试前，用质谱的标准化质控血清，将标准化质控血清中用于定量的标准峰4091.1Da或6634.0Da强度调至50％信号强度的最大值。

2.权利要求1所述的β2-微球蛋白生物标志试剂盒和分析方法，所捕获的变异的β2-微球蛋白生物标志来源于已经脱离人体的全血、血清和血浆。

3.权利要求1所述的基质包含阴离子表面基质、阳离子表面基质、抗β2-微球蛋白抗体基质。基质的支持物包含陶瓷珠、磁性珠、多聚体或Sepharose beads。

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