CN101416061A - 用于从复合蛋白质混合物检测和/或富集分析物蛋白质和/或分析物肽的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及用于从包括蛋白质和/或肽的样品混合物中检测和/或富集大量不同的分析物蛋白质和/或分析物肽的方法。该方法包括下列步骤:a)提供所述样品混合物,并且,当合适时,将其中包含的蛋白质断裂为限定的肽,b)提供第一结合分子,所述第一结合分子特异于不同分析物蛋白质和/或分析物肽中至少一种的肽表位,由此所述肽表位包括至多最多5,优选地2-3个氨基酸,c)与样品混合物一起温育第一结合分子,和d)检测和/或富集与第一结合分子结合的分析物蛋白质和/或分析物肽。本发明还涉及特异于不同肽分析物的末端肽表位的结合分子,由此所述末端肽表位包括游离的NH2基团或游离的COOH基团,一个或多于一个由蛋白酶特异性确定的氨基酸和在每种情形中至多最多3个另外的末端氨基酸。
Description
本发明涉及用于从包含蛋白质和/或多肽的蛋白质混合物中检测和/或富集多种分析物蛋白质和/或分析物肽的方法。
本发明还涉及特异于多种肽分析物末端的结合分子,并涉及它们在用于从蛋白质混合物中检测和/或富集多种分析物蛋白质和/或分析物肽的方法中的用途。
这些类型的方法和结合分子在现有技术中广泛已知。
已知方法的应用领域是例如复合样品中的蛋白质分析和蛋白质检测,特别是通常用于分析蛋白质组的方法。
所谓“蛋白质组”,意指细胞、组织或器官中蛋白质的数量总体,即已知的处于所有同种型、多态性和翻译后修饰的所有表达的蛋白质,和它们各自的浓缩物,特别是在限定的时间和限定的外部条件下。
因此,细胞、组织或生物体的状态具体地通过其蛋白质的数量分布(profile)描述。因此其可能是例如在疾病中存在某些蛋白质表达的减少和其他蛋白质表达的增加,或根本然后仅表达某些蛋白质,或改变某些翻译后的蛋白质修饰。因此蛋白质分布适合作为细胞、组织、器官或生物体各自的当前状态的直接指示,和由此作为疾病或健康的指示。
另外可能通过蛋白质分布中的改变追踪药物的作用和评估它们的副作用。
与也频繁用于该目的的mRNA分布相反,确定蛋白质分布的优势是关于涉及的机制的直接结论可能通过改变蛋白质分布进行,因为细胞过程通常与蛋白质的直接涉及一起进行,由此执行细胞的功能。
为了进行蛋白质分布的定性和定量检测,这样的检测蛋白质的方法是必要的,所述方法即使在复合的样品中也能够检测大多数蛋白质,并且应该可能在尽可能大的动态范围内定量地检测蛋白质的量。
与之相关的一个困难是在大多数天然样品中不同蛋白质的浓度可以以9-12个数量级而不同。另外,与DNA或RNA相反,不可能扩增蛋白质。
此外,仍然不存在这样的方法,通过该方法能够检测所有蛋白质,即非常酸性、非常碱性、非常大、非常小、疏水性和亲水性蛋白质。
目前,原则上使用两种用于检测复合蛋白质组的方法:
- 进行以二维电泳分离不同蛋白质的2D电泳,并随后进行分离的蛋白质的限定蛋白质水解,并通过由质谱分析获得的肽质量鉴定各个蛋白质种类。
- 从蛋白质组的全部蛋白质的限定的蛋白水解降解一维或多维层析分离肽,及随后通过串联的质谱分析鉴定肽,并通过蛋白质或基因组数据库向蛋白质组的原始蛋白质以生物信息分配肽片段。
这些方法通过基于抗体的方法得到补充,在所述基于抗体的方法中,通过与相应的抗体的特异性结合定性地和定量地检测蛋白质。其中的实例是蛋白质印迹、ELISA或抗体微阵列。
二维凝胶电泳(2D.PAGE)在第一维中按照等电点和在第二维中按照分子量分离蛋白质。这容许了用非常高的分离效率分析至多10,000种蛋白质的复合蛋白质混合物。该方法的一个缺点是仅从待研究样品中检测出一些蛋白质;在标准条件下,没有检测到非常大的和非常小的蛋白质,和非常碱性的和非常酸性的蛋白质种类。
另外,该方法是耗时的并难于复制。由于不同蛋白质染色效率的不同和小的动态检测范围,定量分析是困难的,并且可能造成非常大努力和样品的耗费。而且经常可能仅分析相对少量蛋白质/样品,且因此仅以小量存在于样品中的蛋白质不再是可检测的,或至少不再是可明确检测的。
层析蛋白质分离通常按照分子尺寸(大小排阻层析)、分子负荷(离子交换层析)或疏水性(反相层析、疏水相互作用层析)发生。层析方法的分离效率小于蛋白质的2D-PAGE的分离效率。由于该原因,为了蛋白质组分析,经常进行非常详细描述的多维分离。只有基于抗体的检测方法目前能够从复合的蛋白质混合物中鉴定出单独分析物蛋白质。然而,确定的方法,诸如ELISA,不适合于分析来自一份样品的许多分析物。目前,基于抗体阵列的方法在从复合混合物中平行检测许多不同蛋白质的方面,特别受到少量的合适的高度选择性抗体限制。
由于所有现存用于蛋白质组分析的方法在从复合样品中平行、迅速、可复制和灵敏检测分析物蛋白质的方面中的局限性,蛋白质样品的可再现的分离是对于蛋白质组分析关键的操作。
许多涉及关于分析蛋白质组分析方案的公开出版物在文献中已知。
因此,尤其是,Graham等,“广泛运用的蛋白质组方案:蛋白质组学和功能性筛选的实践指导(Broad-based proteomic strategies:a practicalguide to proteomics和functional screening)”生理学杂志(J.Physiol.)563(1),(2005),第1-9页,在综述文章中描述了用于分析蛋白质组的方法,并开发了定性对比定量方法的不同方案。
Conrads等,“癌症蛋白质组学:许多技术,一个目标(Cancer Proteomics:many technologies,one goal)”,蛋白质组学专家综述(Expert Rev.Proteomics)2(5),(2005),第693-703页,强调从通过蛋白质组分析的方法获得的大量数据中鉴定生物标记是很重要的,所述生物标记特异于癌症或其他疾病。
WO 2004/031730公开了用于确定样品中靶蛋白的量的流通法。特异性结合试剂,如抗体,用于捕获并因此富集复合蛋白质样品的蛋白水解消化中的特异性监测肽和具有与监测肽相同的化学结构但标记了的内部标准肽。随着洗脱到质谱仪中,对两种肽进行了定量测定。
特异性结合试剂或抗体应该反向结合约5-20个氨基酸残基的特异性肽序列,从而能够从这样的肽的混合物中捕获特异性肽,所述这样的肽是由蛋白水解酶引起的例如人血清的特异性裂解产生的。
监测肽必须高度特异于靶标,即不应该与靶生物体的任何其他蛋白质共享同源性。
由此,应该可能利用例如首先N-末端抗体,和后继的第二富集步骤中的C-末端抗体富集一种特异性肽。
考虑到本文献中描述的和以上提及的蛋白质组分析方面和与其相关的对于开发新型诊断方法的可能性,活性成分和治疗法,避免已知分析方法缺点的新型技术具有巨大的重要性。
因此,本发明的目的是提供新方法或工具,通过所述新方法或工具的帮助,能够定性地和/或定量地分析蛋白质组或亚蛋白质组(subproteome)。
在开始处提及的方法中,按照本发明,通过下列步骤实现了此目的:
a)提供样品混合物,且当合适时,将其中包含的蛋白质断裂为限定的肽,
b)提供第一结合分子,其特异于不同分析物蛋白质和/或分析物肽中至少一种的肽表位,其中该肽表位包括至多最多5个,优选地2或3个氨基酸,
c)与样品混合物一起温育所述第一结合分子,和
d)检测和/或富集与第一结合分子结合的不同分析物蛋白质和/或分析物肽。
通过该方法完全实现了本发明的目的。
本发明基于本发明人的出人意料的认识,即按照本发明使用的结合分子能够用于甚至从复合样品混合物中检测和/或富集不同的分析物蛋白质和/或分析物肽,尽管由于仅在5个,优选地4,3或2个位置具有限定的氨基酸的识别序列,它们结合于大量分析物蛋白质或分析物肽,即其是相当无选择性的。
而且,识别序列中的各个位置甚至可以仅被部分限定的氨基酸占据,所述部分限定的氨基酸即属于一组氨基酸的氨基酸。将限定的和部分限定的氨基酸分配到所述识别序列中的实例应该是OOXXO,OOXXX或OXOXO,其中O代表限定的氨基酸和X代表一组氨基酸,诸如例如,疏水性、脂肪族或芳香族氨基酸。
因此,按照本发明使用的结合分子特异性识别具有至多最多5个氨基酸的表位。
“结合分子”在本文中意指能够结合于肽/蛋白质或肽/蛋白质能够与之结合的任何分子或任何物质。
在本发明的上下文中理解到,在该情形中,可能使用特异性识别具有至多5个氨基酸的肽表位的任何结合分子。
这些结合分子提供不仅从复合蛋白质混合物中挑出非常特殊的蛋白质或肽的可能性,还有挑出大量不同的具有该表位的蛋白质或肽的可能性,所述表位包括至多最多5个氨基酸。因此存在亚蛋白质组(subproteome)的富集。
因此,该新方法使得利用一种结合分子特异性结合来自复合蛋白质或肽混合物的大量不同蛋白质和/或肽,并且在适合时,在去除了混合物的未结合成分后,以另一种后继的方法分析这些结合的蛋白质或肽成为可能。
“分析物蛋白质/肽”在本发明的上下文中意指在步骤c)中来自复合样品混合物/蛋白质混合物结合于结合分子的那些蛋白质/肽。
由于在按照本发明的方法中待用的结合分子识别具有至多最多5个氨基酸的肽表位,所以大量肽/蛋白质具有该表位的概率很高,因此,在每种情形中还存在特定结合分子与大量肽/蛋白质的结合。由于不适合于在生物学/生物化学研究中使用,在现有技术中对与不同分析物蛋白质或肽结合的结合分子分类。
在本发明的上下文中理解到,更多具有特定表位的蛋白质组的肽/蛋白质意指在由结合分子特异性识别的相应表位中更少的氨基酸和每个位置允许更多不同的氨基酸。
这意味着在使用特异于具有例如仅3个氨基酸残基的表位的结合分子时,结合比在使用特异性识别具有例如5个氨基酸残基的表位的结合分子时多得多的肽/蛋白质。
进一步理解,在本发明的上下文中,还可能在步骤b)中提供两种或更多不同的第一结合分子,这样进一步增加待结合的分析物蛋白质/肽的量。由此显现出用有限量结合分子结合蛋白质组中所有蛋白质/肽的惊人可能性,所述结合分子能够按照当前技术发展水平制备。关于这20种蛋白原氨基酸,理论上需要的特异性结合3个限定的氨基酸的不同结合分子的数量是203=8000。相反,在通过具有5个限定的氨基酸的表位结合的情形中,应该需要多到205=3.2百万个不同的结合分子,从而结合所有理论上可能的蛋白质表位。
在优选的实施方案中,在步骤a)中使用具有变性的分析物蛋白质和/或分析物肽的样品混合物。
该实施方案具有这样的优势,即在使用变性的蛋白质时,样品混合物中处于变性形式的蛋白质对于至少一种结合分子是更容易接近的,并能够更好地与后者结合。
在按照本发明方法的进一步实施方案中,在步骤a)中,样品混合物中存在的蛋白质和/或肽裂解为关于至少一种特异性蛋白酶和/或化学断裂的限定的肽。
因此,在该方法中,最初提供包括蛋白质和/或肽的复合样品混合物/蛋白质混合物,该样品混合物可能是获自任何组织或流体,诸如例如组织匀浆物、血清等的任何样品/蛋白质混合物。通过添加变性剂,诸如例如尿素或盐酸胍,和通过还原和随后的烷基化作用,能够另外对该蛋白质混合物变性,这样就出现了优选未折叠的蛋白质链,该蛋白质链是蛋白酶可接近的。用选择性裂解蛋白酶诸如,例如胰蛋白酶或内切蛋白酶Lys C处理天然的或变性的样品/蛋白质混合物,所述酶将样品中存在的肽/蛋白质裂解为较小的片段,该片段是通过蛋白酶的特异性确定的。还存在技术人员已知的完整系列内切-或外切蛋白酶,并且能够用于特异性蛋白质水解。可能通过选择蛋白质样品的变性来控制蛋白质水解中裂解的可能的肽的数量,并调节分析的样品的复杂性。此外,能够与例如溴化氰(Met的C侧)一起应用化学断裂。
用一种或多种蛋白酶和/或化学断裂的消化导致步骤a)中提供的肽混合物。在步骤b)中提供了结合分子后,与结合分子一起温育所述肽混合物,在其间,结合分子结合于肽的合适表位,并且能够检测/富集与结合分子结合的相应的分析物肽。
该方法,即在关于样品混合物的特异性蛋白质水解和/或化学断裂的步骤a)中使用肽混合物,也具有优势,特别是蛋白水解的降解使得单独的分析物肽的末端是结合分子可达到的。
虽然结合分子能够特异于肽-内部表位,在优选的实施方案中使用的结合分子直接结合于C-或N-末端,由此使其可能极大地减小甚至进一步与短结合表位的交叉-反应性。同时,分析物蛋白质的蛋白水解断裂产生大量可检测到的分析物蛋白质,这使得丰余检测成为可能。
在另一个实施方案中,在步骤b)中提供了第一结合分子,其在肽表位的一个或多个位置处显示出氨基酸组(amino acid group)-特异性识别。
于是该实施方案具有这样的优势,即提供了这样的结合分子,其特异于具有最多至多5个氨基酸的表位,这些氨基酸中至少一个仅是组-特异性识别的,即例如在相关的氨基酸正电荷或负负荷的基础上,因为氨基酸的疏水性脂肪族性质等。将氨基酸分类到具有类似/相同性质的组中是本领域现有技术已知的。因此,例如,脂肪族疏水性氨基酸包括丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸,芳香氨基酸包括色氨酸、酪氨酸和苯丙氨酸,酸性氨基酸包括天冬氨酸和谷氨酸,和碱性氨基酸包括赖氨酸、组氨酸和精氨酸。因此,按照所述组分类,可能产生和提供结合分子,其例如,在合适的表位中,在位置3处除甘氨酸外,还识别丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸,并总体上比这样的结合分子结合更多的肽,所述这样的结合分子不显示针对肽的至少一个位置的组-特异性识别。在按照本发明方法的另一个实施方案中,在步骤b)中提供了特异于分析物蛋白质和/或分析物肽的两个末端肽表位之一的第一结合分子,其中末端肽表位包括游离的NH2基团或游离的COOH基团,并且在每种情形中至多最多5个氨基酸。
该实施方案的优势是向特异性地并稳定地结合于各个末端的有效工具提供了按照本发明使用的结合分子。由本发明人的认识对此作出了贡献,所述认识是为了稳定结合仅需要至多最多5个氨基酸,且末端的官能团可以对结合具有如此强的影响,以至于在具有很少氨基酸的末端表位的情形中,不出现针对具有相同氨基酸序列的内部表位的交叉-反应性。对所述肽的末端的结合另外导致在后继步骤中能够使用另一种结合分子的可能性,所述结合分子能够结合于分离的/鉴定的分析物肽的其他末端肽表位,这样,通过使用另一种结合分子,可能进一步选择所述肽。
通过结合分子与其每一个由最多5个氨基酸组成的两个短末端表位(C末端和N末端)的组合结合,令人惊讶地,可能特异性检测所述肽,即使还发生每种单独的结合分子自身与相对大量的蛋白质组的不同肽的结合。因此所述方法使通过分成两半(split)的特异性表位确定地检测特定的肽成为可能。
在按照本发明方法的一个实施方案中,优选地,将至少第一结合分子固定在支持物上。关于这一点,特别优选地所述支持物选自包括下列各项的组:微阵列、用于亲合柱的支持材料、层析材料、微通道结构、毛细管表面、传感器表面、聚合多孔海绵结构、微球体(或珠)。
该实施方案具有这样的优势,即通过它们在支持物上的固定,在步骤b)中能够更容易地操作和提供结合分子,并由此总体上代表用于按照本发明方法的实施工具。关于这一点,结合分子可能例如精确定义地应用到所述支持物上的阵列中,其与结合分子的量和在支持物上的对准和排列相关,这些参数依赖于每种情形中待用的支持物材料。于是,有利地,可能进一步分析所述支持物和通过结合分子与所述支持物结合的分析物肽。
在该情形中珠(或“微球体”)的合适实例是标记的珠(例如荧光-或颜色-标记的)或特别的,磁性珠,且那种珠适合于具体的用途对于技术人员是清楚的。
本发明上下文中还可能提供在单独的珠上每种情形中存在的相同结合分子,或另外,一个珠上存在的不同的结合分子,这样通过与每个单独的珠的结合,从样品混合物中去除许多不同的分析物肽。
在支持物上固定结合分子能够通过现有技术已知的方法进行(见,例如,由Stoll等.,FBS 2000,Hermanson,Greg.T.,生物缀合技术(Bioconjugate Techniques),学术出版社(Academic Press)的综述)。
在按照本发明的方法中,如果通过这样的方法进行步骤d)中的检测对于后继分析步骤和进一步检测也是优选的,所述方法选自包括下列各项的组:质谱法、免疫测定、层析法、电泳、电化学、表面等离子体共振、晶体振荡器。
所有这些方法在现有技术中是充分熟知的,且各自提供不同的固有优势。关于这一点,不同检测方法的选择具体依赖于多么准确地进一步表征、分离、富集或检测蛋白质或分析物肽,和进一步表征、分离、富集或检测哪种或多少种蛋白质或分析物肽,以及步骤b)中提供何种形式的结合分子,即例如与支持物结合或不结合,且如果与支持物结合,结合于何种类型的支持物。
因此,例如,当结合分子与亲合基质结合,且分析物肽结合于与亲合基质结合的结合分子时,质谱法适合作为鉴定方法。在后继步骤中能够从亲合基质中洗脱结合的分析物肽,并且通过质谱法或毛细管HPLC电喷射质谱法对其进行分析。例如,按照关于通过MALDI质谱法(SELDI)的后继一般MS分析的现有技术,亲合性芯片(微阵列)是适合的。珠日益增多地用于免疫测定。
在按照本发明方法的另一个实施方案中,优选地,检测和/或富集与第一结合分子结合的分析物蛋白质和/或分析物肽通过第二结合分子发生,所述第二结合分子特异性识别与第一结合分子结合的分析物蛋白质和/或分析物肽。
在这样的检测方法中有利地,能够例如标记第二结合分子,并且对与第一结合分子结合的分析物蛋白质/肽的检测能够通过第二结合分子的标记发生,所述第二结合分子同样与分析物蛋白质/肽结合。在该情形中,标记可以是例如直接的或间接的,即,例如荧光的或放射性同位素标记,或其它只能通过使用另外的物质/化学制品,诸如,例如生物素-链霉抗生物素检测的标记。
在按照本发明方法的这个实施方案中,也理解,不仅可能使用具有一种特异性的结合分子,相反,还可能使用两种或更多不同的具有不同特异性的第二结合分子。
在该实施方案中,通常可能使用这样的第二结合分子,所述第二结合分子特异于具体的分析物蛋白质或分析物蛋白质家族的内部表位,或另外,特异于具体的分析物蛋白质或分析物蛋白质家族的其他末端表位。另一方面,还可能使用这样的结合分子,该结合分子又在非特异性和结合大量分析物蛋白质上类似于第一结合分子。
此外,可能首先使用这样的第二结合分子,所述结合分子作为捕获分子,特异于肽-内部表位,并且随后使用,作为通用的检测剂的,至少一种具有上述属性并被优选标记的第一结合分子。
在该情形中,进一步优选地,在步骤d)中提供第二结合分子,该第二结合分子在肽表位的一个或多个位置处显示氨基酸组-特异性识别。
作为与上述第一结合分子相应地,该实施方案具有这样的优势,即提供了特异于具有最多至多5个氨基酸的表位的结合分子,其中这些氨基酸中的至少一个被组-特异性地识别,即例如在相关氨基酸的正电荷或负电荷的基础上,因为该氨基酸的疏水性脂肪族特性等。
在该情形中,优选地,在步骤d)中的检测和/或富集通过第一和第二结合分子与分析物蛋白质和/或分析物肽的不同表位的同时结合,通过诸如FRET、邻近连接测定等的方法而发生,进一步优选地,在含有样品的溶液中温育第一和第二结合分子。
在按照本发明方法的这个实施方案中,有利地,这两种结合分子在液相中结合于它们的分析物蛋白质/肽。在该情形中,特别优选地,通过标记诸如,例如染料对(荧光团/猝灭剂或荧光团1/荧光团2)或寡核苷酸修饰这两种结合分子,所述标记适合于通过符合现有技术的不同检测,诸如荧光转移(FRET)测定或邻近连接测定检测与分析物分子的配对结合;关于这一点,参见Gustafsdottir等,关于灵敏且特异的蛋白质分析的邻近连接测定(Proximity ligation assays for sensitive和specific protein analyses),在生物化学分析(Anal Biochem.)中2005年10月1日;345(1):2-9.Epub2005年2月7日,和Arai等,具有绿色荧光蛋白质变体的抗体可变结构域的荧光标记:应用于基于能量传递的同质免疫测定(Fluorolabeling ofantibody variable domains with green fluorescent protein variants:applicationto an energy transfer-based homogeneous immunoassay),在蛋白质工程(Protein Eng.)中2000年5月;13(5):369-76。
在按照本发明方法的发展中,优选地,第二结合分子特异于各个其他末端肽表位,特别优选地,各个其他肽表位包括游离的NH2基团或COOH基团,且在每种情形中,至多最多5个氨基酸。
该实施方案具有这样的优势,即在大量不同的结合于第一结合分子的分析物肽中,仅有某些分析物肽与第二结合分子结合,具体地正好是它们的其他末端肽表位被第二结合分子特异性识别的那些。因此,可能以靶向的方式进一步对分析物蛋白质/肽进行分组或选择。相应的第二结合分子的特异性能够用于对由第一结合分子结合的分析物蛋白质/分析物肽的量的有目的的进一步限制,即更加特异的第二结合分子应该结合更小量的肽,并且反之亦然。
特别优选地,步骤b)中使用的第一结合分子特异于分析物肽的两个末端肽表位中的一个,该末端肽表位包括游离的NH2基团或游离的COOH基团和3-5个氨基酸,且第二结合分子特异于分析物肽的另一个末端肽表位,其中所述另一个末端肽表位包括游离的NH2基团或游离的COOH基团和3-5个氨基酸。
因为本申请的发明人认识到通过使用具有例如在每种情形中,三个氨基酸特异性的两种结合分子,可能获得至少结合分子特异于6个氨基酸的特异性,因为除三个氨基酸之外,其他参数会影响特异性。与在该情形中识别每种肽片段的C-和N-末端的这样的事实的结合,分析物肽/蛋白质的特异性检测可能通过组合两种短表位而进行。因此,通过组合使用两种结合分子产生分析物肽/蛋白质的特异性/选择性,其原因在于大量分析物肽/蛋白质由第一结合分子预先准备(deliberately)结合,且仅在使用第二结合分子的情况下,“总体特异性”显著增加,且达到至少等于6个氨基酸-特异性结合分子的水平。
将六个一组的表位“分割“为两组三个一组的表位-优选地,一组关于C-末端和一组关于N-末端-在该情形中,导致分析所有可能的肽所需要的结合分子的急剧减少。在该情形中,为了能够检测全部可能的肽,仅需要2×203个-而非对于六个一组的表位的206个-不同的结合分子。因此,在要求保护的方法中,仅需要2×8000个抗体,即在每种情形中,关于肽的N-末端8000个和关于肽的C-末端8000个。因此可能地,通过提供2×8000个结合分子的文库,从肽混合物中检测出任何需要的分析物肽。通过与之比较,对于六个一组的表位,应该需要多于107个结合分子-用于相同的分析。
因此,与在开始时提及的WO 2004/031730中所述的方法相反,本发明概念存在于利用两种自身非特异性结合分子,所述结合分子同时结合于分析物蛋白质或分析物肽,且由此允许分析物蛋白质/肽的特异性富集和/或确定。
按照本发明方法的另一个优点是用2×203个结合分子可能检测全部N/C末端,所述N/C末端在理论上不依赖于物种,对于任何蛋白质组的所有肽的蛋白原氨基酸是可能的。
应该理解,氨基酸三个一组的选择和氨基酸的选择自身依赖于待研究的样品。因此,依赖于待研究的样品,还必须考虑修饰的氨基酸,或另外-在非人样品的情形中-仅在动物、植物或微生物样品中存在的氨基酸。在该情形中对技术人员清楚地-基于与此有关的现有技术-对样品分析必须考虑所述氨基酸。
按照本发明的方法因此第一次使得基于阵列的蛋白质组分析成为可能。
在按照本发明方法的另一个实施方案中,优选地,检测和/或富集发生在使用第二结合分子的条件下,所述第二结合分子特异性识别与第一结合分子结合的分析物蛋白质/分析物肽,其中第二结合分子特异于肽-内部表位。
在该实施方案中有利地,通过由第一结合分子关于待减少的样品的复杂性“预选择”分析物肽/蛋白质的受限的多样性是可能的,且后继的确定检测以第二结合分子通过蛋白质/肽-特异性内部表位的方式而发生,这样可能在具有减少样品背景的复合混合物中精确检测一种靶定的蛋白质或肽。
在该情形中,在另一个实施方案中,优选地,第二结合分子特异于肽-内部或末端表位,所述表位具有至少6个氨基酸。
在该实施方案中,有利地,通过使用具有高度特异性的第二结合分子能够以非常有目的的方式鉴定个体肽。
在按照本发明的方法中,通常优选地,第一和第二结合分子选自包括抗体、抗体片段、适体、重组结合分子的组。
本发明进一步涉及特异于不同肽分析物的末端肽表位的结合分子,其中末端结合分子包括游离的NH2基团或游离的COOH基团,一个或多于一个由蛋白酶特异性限定的氨基酸和至多最多3个另外的末端氨基酸,且适当时,另外地,组-特异性识别位点。
在该情形中,优选地,结合分子选自包括抗体、抗体片段、适体、重组结合分子组成的组。
本发明进一步涉及根据本发明的结合分子在根据本发明方法中的用途。
本发明进一步涉及用于制备在按照本发明的方法使用的结合分子的方法,其中与支持物结合并具有最多5个氨基酸的肽表位用于免疫、选择和亲合力成熟方法。
在该情形中,对于制备结合分子优选地是在第一步中提供具有C-和N-末端三个一组的肽,其中氨基酸三个一组显示所有可能的氨基酸组合,这可能起始自20个蛋白原的氨基酸,和在后继步骤中,为了免疫、选择和亲合力成熟方法使用这些肽。
在该情形中,可能使用例如现有技术中充分详述的经典免疫方法(见,例如,抗体:实验室手册(Antibodies:A Laboratory Manual),编者Ed Harlow,David Lane)。在另一方面,还能够体外生成结合分子,在该情形中,以这样的方式构建结合袋,所述方式是末端NH3 +/COO-官能能够最佳地结合,例如以具有适当相反电荷的隐窝(recess)形式。
用于合成制备用于免疫的肽的方法同样是现有技术中充分熟知的(见,例如,Fmoc固相肽合成(Fmoc Solid Phase Peptide Synthesis),W.C.Chan和P.D.White(Eds)的实践方法,牛津大学出版社(Oxford UniversityPress))。
在本发明的另一个实施方案中,在与第一结合分子一起温育步骤a)的样品混合物前,与该样品混合物一起温育特异于肽-内部表位的第三结合分子。
在该情形中,优选地,所述肽-内部表位具有至少6个氨基酸。
因此,在一些实施方案中,第三结合分子作为捕获分子,起到如第二结合分子的作用,而第一结合分子现用作某种通用检测剂分子,所述检测剂分子优选地是标记的。
应该理解,以上提及的和下文中有待解释的特征和优势在不偏离本发明范围的条件下,不仅能够用在指定的组合中,还能够单独或在其他组合中使用。
通过下列附图和实施例进一步解释本发明,其中
图1是按照本发明方法的步骤c)的示意图,其中与样品混合物一起温育结合分子;
图2a是按照本发明方法步骤d)的一个实施方案的示意图;
图2b是步骤d)的另一个实施方案的示意图;
图2c是步骤d)的另一个实施方案的示意图;
图3显示末端特异性抗体(AMTR)对其他末端特异性抗体的交叉-反应性的确定。
图4显示图3条件下,抗体末端特异性的确定;
图5显示图3条件下,对抗体的X-位置的肽库扫描;和
图6显示图3条件下,对于抗体的免疫捕获测定结果;
图1是样品混合物中存在的分析物肽结合的示意图。图1左手侧描述用特异性蛋白酶预先处理的样品混合物,这样,(寡)肽存在于混合物中。该情形中的肽的N-末端指H3N+和C-末端COO-。
该示意图右手侧表示不同的肽是如何与固定在支持物上的第一结合分子结合的。该情形中的结合分子如参照编号10和12表示,且支持物由14表示。
因此,关于按照本发明和图1的方法,提供样品混合物和第一结合分子后,在一起温育这二者,由此样品混合物中存在的一些肽结合于结合分子。洗掉未结合的样品材料。
图1和2a-2c在每种情形中是仅作为这样的事实的实例的示意图,所述事实是使用的第一结合分子特异于这样的表位,所述表位包括游离的NH2基团或游离的COOH基团和在每种情形中三个氨基酸。按照本发明方法的图1和2a-2d中显示的示范性实施方案是仅作为实例,且许多其他示范性实施方案是在本发明范围内可能的;具体地,能够另外地设定由结合分子识别的结合分子和表位。
图2a显示按照本发明方法关于步骤d)的一个实施方案的示意图,即检测结合的分析物肽。在该情形中,洗脱与结合分子结合的分析物肽,并对其进行质谱法。该情形中,通过HPLC-MS/MS分析肽亚群,其中确定的鉴定由通过序列标记+肽质量+部分表位亲合分离+蛋白酶特异性的组合评估,发生在序列数据库中。
在按照本发明方法的另一个实施方案中,将结合分子固定在亲合基质的阵列,例如亲合芯片上。与样品混合物一起的温育导致分析物肽或肽亚群与不同亲合基质的阵列的结合。在后继的检测步骤中,通过直接基于MALDI的质谱分析(SELDI)检查亲合阵列的每个点。
图2b显示按照本发明方法关于步骤d)的另一个实施方案的示意图。在该情形中,结合分子与支持物结合;与样品混合物一起温育后,分析物肽结合于它们针对结合分子的末端之一。然后与第二结合分子一起温育肽亚群,这样第二结合分子结合于分析物肽(见图2b的右手侧,A和B)。依赖于第二结合分子的特异性,有可能例如通过特异性结合分子获得确定的鉴定,所述结合分子特异于肽-内部表位(6-7个氨基酸)(见图2b的右手侧,“A”)。在另一方面,通过特异性针对分析物肽的其他末端表位的结合分子也能够获得不确定的鉴定。这描述在图2b,右手侧,“B”中。该情形中,结合分子-如图2b中所示-同样地特异于这样的表位,其在每种情形中包括其他游离的NH2基团或COOH基团和在每种情形中3个氨基酸。其结果是“分成两半的特异性表位”,总共6个氨基酸(3个涉及第一结合分子的氨基酸+3个涉及第二结合分子的氨基酸)。在该情形中,特异性源自两种结合分子的组合结合特异性。
最后,图2c显示按照本发明的方法涉及步骤d)的另一个实施方案:在图2c的左手侧,肽亚群通过第一结合分子结合于珠。然后将这些分布在不同腔中,并与不同的第二结合分子一起温育。该第二结合分子现在可以-类似图2b-依次特异于肽-内部表位或另外地其他末端表位,所述其他末端表位依次包括游离的NH2基团或游离的COOH基团和3个氨基酸。再一次,通过组合使用两种非特异性结合分子能够特异性鉴定分析物肽。
1.实施例:表征选择三个羧基-末端氨基酸的单克隆抗体3D5
研究商购获得的抗体抗-C-末端His标记抗体3D5(Invitrogen,Carlsbad,CA)的结合选择性。通过用在C末端具有6个组氨酸的融合蛋白免疫小鼠产生该抗体(见Lindner等,“用重组的抗-His标记scFv-磷酸酶或scFv-噬菌体融合特异性检测his-标记的蛋白质(Specific detection of his-taggedproteins with recombinant anti-His tag scFv-phosphatase或scFv-phagefusions)”,生物技术(Biotechniques)22,140-149(1997))。利用肽阵列研究了由抗体识别的表位,和对于单独氨基酸残基结合的选择性。以定向方式,将代表末端六组氨酸肽的变体的肽库固定在微球体上(见Poetz等,“关于抗体分布的蛋白质微阵列:芯片上的特异性和亲和性确定(Proteinsmicroarrays for antibody profiling:Specificity和affinity determination on achip)”,蛋白质组(Proteomics)5,2402-2411(2005))。这需要对于这六个末端组氨酸之一使用肽位置库,其中代替确定的氨基酸,出现所有20种可能氨基酸的混合物。有可能利用具有完整六组氨酸序列但其末端具有酰胺化的C末端而非游离的COOH基团的肽(见表1),研究羧基末端对结合的影响。
表1
将表1中的肽合成为生物素化的肽,并固定在包被了N-抗生物素蛋白的微球体上。为了进行结合研究,混合微球体和抗体,并在藻红蛋白-缀合的抗-小鼠IgG的帮助下检测抗体与肽的结合,并用Luminex L100(奥斯汀(Austin),TX,美国)进行选择。位置1、2和3处(从C末端开始,即分别具有SEQ ID-No.16、15、14的肽)组氨酸的随机化导致测量的信号的下降,这显示出这些氨基酸对于结合是必要的。通过酰胺化作用将相同的内容应用于游离羧基基团的封闭(具有SEQ ID-No.10的肽);该修饰将抗体的结合减少到少于15%,即游离羧基基团的负电荷是抗体与其抗原反应所必须的。通过所有20种氨基酸的混合物替换第四、第五和第六组氨酸(分别地,具有SEQ ID-No.13、12、11的肽)不在结合引起变化。因此,所述抗体的识别的表位由3个末端氨基酸和游离末端组成。
在如下的图表1中详述了选择性测定的结果。
图表1:表征来自Invitrogen(Carlsbad,CA,美国)的单克隆抗-His(C-末端)抗体3D5。
因此,令人吃惊地,抗体仅显示出对三个C-末端组氨酸的选择性。由X位置替换后继的组氨酸对抗体的结合几乎没有或没有影响。此外,通过酰胺化作用封闭C末端负电荷同样阻止抗体的结合。获自该抗体并具有六组氨酸肽的scFv的晶体结构证实了该结果(见Kaufmann等,“与其抗原复合的抗-His标记抗体3D5单链片段的晶体结构(Crystal structure of theanti-His tag antibody 3D5 single-chain fragment complexed to its antigen)”,分子生物学杂志(J Mol Biol)318,135-147(2002))。抗体结合于四个C-末端组氨酸的主链,三个C-末端组氨酸的侧链和末端组氨酸的羧基基团。在这些肽阵列分析和晶体结构的基础上,该商业抗体可以称为C-末端三肽-特异性抗体。
2.实施例
在表征抗体3D5的结果的基础上,合成了与肽表位结合的在C和N末端具有三个组氨酸的不同肽。另外,用甘氨酸在N末端标记具有C-末端组氨酸标记的肽,并且用丝氨酸在C末端标记具有N-末端组氨酸标记的肽,从而能够通过质谱法彼此区分相应的肽(见表2)。
表2
免疫测定检测
通过标准方案,将特异于肽表位的一种抗体和多种抗体(见表2)固定在微球体上。以不同的浓度将上述肽个别地添加到血清中。首先通过肽表位-特异性抗体,并其次通过His标记抗体检测肽。
通过质谱法的检测
将His标记抗体3D5化学固定在羧甲基纤维素上。该材料起到亲合基质的作用,从而从复合混合物中纯化上述肽。只有具有C-末端His标记和游离的羧基基团的肽是随后在质谱仪中可检测到的。
3.实施例I
关于β-联蛋白在计算机(in silico)消化的试验
在所有动物物种中,Wnt信号传导通路在胚胎发育过程中是非常重要的。该信号传导通路的异常活化导致肿瘤发生。腺瘤性结肠息肉(APC)或β-联蛋白蛋白质中的突变导致β-联蛋白蛋白质的细胞核累积。在与T-细胞因子/淋巴增强因子(TCF/LEF)的复合物中,β-联蛋白激活转录因子基因,该基因正向影响细胞增殖并因此促进不受控制的细胞生长。
因此,β-联蛋白代表经典的原癌基因。该蛋白质作为模型蛋白质的优势是其与肿瘤学的相关性和其在不同物种之间的高度保守序列。人序列和经典模型生物体(小鼠、大鼠)除一个氨基酸外相同。
计算机消化
在EDP程序的帮助下,在计算机上,用胰蛋白酶消化β-联蛋白蛋白质(http://www.expasy.org/tools/peptidecutter/)。按照长度排列片段(见表3)。
表3:由用胰蛋白酶计算机消化β-联蛋白产生的肽片段的列表。按照肽长度排列片段。
用随后的数据库搜索选择末端
从不同的观点检查了片段和末端。首先意欲片段具有20个或更多氨基酸长度,从而使得构建夹心免疫测定成为可能。由于空间排列的原因,较短的片段长度似乎不明显,因为另外在测定中,肽抗原的两个表位,在合适时,不同时用于与第一和第二结合分子的结合(捕获和检测抗体)。
由于蛋白质的结构特征,其另外还有利于在N或C末端附近选择片段。在研究晶体结构和其他方法的基础上(见Huber等,细胞(Cell)1997,90,871-882),N末端和C末端容易受到蛋白质水解的影响。这使得可能在无变性条件下,用蛋白质水解消化产生靶肽。
选择了片段bcat_TTF1(SEQ ID No.70),因为造成肿瘤发展的突变发生在该区域内。
片段bcat_TTF1(SEQ ID No.70)不是胰蛋白酶片段,而是由内切蛋白酶LysC消化产生的片段。选择了该片段部分的末端,由此能够备选地使用另一种酶进行消化。
数据库搜索片段
关于所选择的肽片段的末端-特异性序列(N末端的三个氨基酸和C末端的4个氨基酸),搜索人类非-丰余蛋白质数据库。结果表示所有潜在的N和C末端,该末端可能由胰蛋白酶消化人类蛋白质组产生。在亲合纯化后,能够通过产生的末端-特异性抗体,例如利用质谱法,分析这些亚蛋白质组。
数据库搜索另外受到同时搜索两个末端的限制。在该搜索中,在无限制的条件下,在两个末端之间容许了100个氨基酸。由此,对于具有长度至多107个氨基酸的胰蛋白酶片段和各自的特异性末端,搜索了数据库。然而,在组合搜索中,由于软件,在产出片段中排除内部胰蛋白酶裂解位点是不可能。在从组合搜索的击中(hits)中消除内部胰蛋白酶裂解位点后,可能减少一个击中中存在的蛋白质的数量,即靶蛋白质β-联蛋白,即分别针对三个和针对四个氨基酸的两个末端-特异性抗体在所有考虑的情形中,足以获得针对靶蛋白质的100%击中率(hit rate)。
下表中总结了搜索的结果(表4)。
表4:数据库搜索在胰蛋白酶消化后包含合适末端的蛋白质的数量。
4.实施例II
体外β-联蛋白试验
将由计算机消化的β-联蛋白确定的片段末端用于生成末端特异性抗体,其结合于最后的3或4个氨基酸和肽的末端。通过与肽阵列一起的温育表征了这些抗体。
表5显示成功的免疫作用。
表5:成功的免疫作用
N-末端 C-末端 SEQ ID No. 兔 大鼠多克隆 单克隆 |
AAV- 成功的TEP- 成功的-LSGK 75 成功的-AMTR 76 成功的 成功的-DTDL 77 成功的 成功的-LGYR 78 成功的 成功的-QMLK 79 成功的-APFK 85 成功的 |
免疫方案
利用标准肽化学技术,合成了表4中显示的片段末端(胰蛋白酶肽片段的C-或N-末端的最后3或4个氨基酸)。将三个间隔区(8-氨基-3,6-二氧杂辛酸,DOA)添加到靶向的3或4个氨基酸抗原中。在肽的非靶定末端添加半胱氨酸(cystein)基团(例如,C-Doa-Doa-Doa-AMTR;SEQ ID No.86)。半胱氨酸的硫醇-基团容许通过双官能连接体(例如,m-马来酰亚胺苯甲酰-N-羟基磺基琥珀酰亚胺酯,sulfo-MBS)定向缀合于载体蛋白(例如,匙孔血蓝蛋白或卵清蛋白)。将肽载体蛋白质缀合物用于在兔和大鼠中进行标准免疫作用方案,从而产生多克隆和单克隆抗体。
表征末端特异性抗体
利用肽阵列,检验产生的抗血清或单克隆抗体的特异性和交叉-反应性。每个阵列由包含免疫原(游离的末端和3或4个氨基酸和间隔区)的肽、与myc融合的靶序列和ha肽组成。另外,利用乙酰化作用或酰胺化作用,分别在N-或C-末端封闭与其他肽融合的靶序列。
这些肽容许分析游离的末端对其合适抗体的结合的影响/贡献。此外,合成了一组不同的肽库。对靶末端的每个特异性氨基酸位置进行随机化,从而容许存在全部20种氨基酸之一。这些X-位置-库肽提供关于每个单独位置对抗原-抗体结合的影响的信息。结合信号的明显降低揭示该位置是否有力的有助于抗原-抗体相互作用,无结合信号降低揭示该位置未明显有助于抗原-抗体相互作用。
表6:对于一个靶末端(AMTR)的肽序列
与所述肽阵列一起温育所有的抗血清和抗体。结果容许评估免疫作用,确定与其他末端序列的交叉-反应性,确定间隔区对抗体-抗原反应的影响,确定特异于游离末端的抗体的特异性,和单独氨基酸位置对抗原-抗体结合的影响。
图3显示了交叉-反应性的确定。合成了靶末端,并固定在微球体上。将靶末端特异的多克隆血清-于此AMTR-与不同的微球体一起温育。该抗体仅与其靶末端结合,并且不与其他靶末端结合。这证明该抗体特异于其靶末端。
图4显示末端特异性的确定。用游离的羧基官能合成靶肽,并在免疫原末端作为酰胺官能。将肽固定在微球体上,并与靶末端特异性多克隆血清一起温育。该抗体不与靶末端的酰胺形式结合。这证明该抗体是末端特异性的,且抗体的结合需要游离的羧基功能。只有当该序列,于此AMTR出现在肽或蛋白质的C-末端时,抗体结合。
图5显示X-位置肽库扫描。合成了一组不同的肽库,其中通过容许存在全部20种氨基酸,随机化靶末端AMTR的每个氨基酸。包含X-位置-库肽的阵列提供关于单氨基酸残基对抗原-抗体反应的影响的信息。与原始表位相比结合信号的明显降低揭示该位置是否有力地有助于抗原-抗体相互作用。无结合信号降低揭示该位置未显著有助于抗原-抗体相互作用。对于该抗体,氨基酸A、T和R的侧链揭示出对结合事件最强的影响。
纯化
按照标准程序,用肽或蛋白质G亲合柱纯化多克隆兔以及单克隆大鼠抗体。
免疫捕获测定
在简单免疫测定设置中检验纯化的抗体的捕获能力。以生物素化的形式,合成从计算机消化鉴定的靶肽片段。在存在复合肽混合物-6mer肽库下-与固体在微球体上的抗体一起温育该肽。用荧光标记的链霉抗生物素检测捕获的肽。
图6显示免疫捕获测定的结果。将针对C-末端AMTR产生的末端特异性抗体固定在微球体上。与固定的抗体一起,以不同的浓度温育在C-末端包含AMTR的生物素化的肽。用荧光标记的链霉抗生物素检测捕获的肽。能够在较低的纳摩尔范围内检测到特异性肽分析物。
亲合质谱方法
在亲合质谱法试验中检验抗体。将AMTR特异性末端抗体固定在柱上。将在C-末端包含AMTR的肽与4个其他不同的肽混合,并装载到亲合柱上。用甘氨酸缓冲液pH2.5洗脱后,用质谱仪分析通过物,即洗脱的级分和起始混合物(注射的样品)。定量地从混合物中捕获并能够利用甘氨酸缓冲液洗脱AMTR特异性靶肽。在从抗-AMTR Ab亲合柱中洗脱的级分中,没有其他肽是可检测的。此外,在抗-AMTR Ab柱上的AMTR肽的亲合捕获导致在HPLC-ESI-质谱中超过5-倍的信号增加。
表7:用于证明亲合质谱方法概念研究的肽的列表。列出了ESI质谱中不同的、可能的质子化肽信号的肽标记、肽序列和计算的单同位素肽质量。以非纯化的粗制肽使用肽。因此,来自肽合成侧链的未经鉴定的污染是该混合物的一部分。
肽混合物
DNP=二硝基苯基-
DOA=3,6-二氧杂-8-氨基辛酸
序列表
<110>蒂宾根大学NMI自然科学和医学研究所
<120>用于从复合蛋白质混合物检测和/或富集分析物蛋白质和/或分析物肽的方法
<130>3605P135WO
<150>DE 10 2006 015 001.5
<151>2006-03-31
<160>99
<170>专利版本3.1
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<220>
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<220>
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<220>
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<222>(4)..(4)
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<222>(4)..(4)
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<213>人工序列
<220>
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<223>任何氨基酸,1-100
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<213>人工序列
<220>
<223>组合的β联蛋白肽片段的c-和n-末端
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(4)..(4)
<223>任何氨基酸,1-100
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<213>人工序列
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<223>组合的β联蛋白肽片段的c-和n-末端
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<213>人工序列
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<213>人工序列
<220>
<223>用间隔区修饰的β-联蛋白肽-片段的c-末端
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(2)..(4)
<223>三个间隔区氨基酸,每个是3,6-二氧杂-8-氨基辛酸
<400>86
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<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>与myc融合的β-联蛋白肽片段的C-末端
<400>87
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<212>PRT
<213>人工序列
<220>
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<400>88
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<211>15
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>与具有封闭的c-末端的myc融合的β-联蛋白肽片段的C-末端
<400>89
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<211>14
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>与具有封闭的c-末端的ha融合的β-联蛋白肽片段的C-末端
<400>90
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<211>10
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>随机化的β-联蛋白肽片段的C-末端
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(10)..(10)
<223>任何氨基酸
<400>91
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<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>随机化的β-联蛋白肽片段的C-末端
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(9)..(9)
<223>任何氨基酸
<400>92
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<211>10
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>随机化的β-联蛋白肽片段的C-末端
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(8)..(8)
<223>任何氨基酸
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<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>随机化的β-联蛋白肽片段的C-末端
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(7)..(7)
<223>任何氨基酸
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<210>95
<211>9
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>β-联蛋白肽片段的修饰的C-末端
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(1)..(1)
<223>二硝基苯基-修饰的
<400>95
<210>96
<211>13
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>c myc加上组氨酸标记
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(1)..(1)
<223>二硝基苯基-修饰的
<400>96
<210>97
<211>16
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>c myc加上间隔区加上组氨酸标记
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(11)..(13)
<223>3,6-二氧杂-8-氨基辛酸
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(11)..(1)
<223>二硝基苯基-修饰的
<400>97
<210>98
<211>15
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>HA加上间隔区加上组氨酸标记
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(10)..(12)
<223>3,6-二氧杂-8-氨基辛酸
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(1)..(1)
<223>二硝基苯基-修饰的
<400>98
<210>99
<211>17
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>HAV加上间隔区加上组氨酸标记
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(12)..(14)
<223>3,6-二氧杂-8-氨基辛酸
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(1)..(1)
<223>二硝基苯基-修饰的
<400>99
Claims (23)
1.用于从包括蛋白质和/或肽的样品混合物中检测和/或富集大量不同的分析物蛋白质和/或分析物肽的方法,由此所述方法包括下列步骤:
a)提供所述样品混合物,并且,当合适时,将其中包含的蛋白质断裂为限定的肽,
b)提供第一结合分子,所述第一结合分子特异于不同分析物蛋白质和/或分析物肽中至少一种的肽表位,由此所述肽表位包括至多最多5,优选地2-3个氨基酸,
c)与所述样品混合物一起温育所述第一结合分子,和
d)检测和/或富集与所述第一结合分子结合的分析物蛋白质和/或分析物肽。
2.按照权利要求1的方法,其特征在于在步骤a)中提供了具有变性的分析物蛋白质和/或分析物肽的样品混合物。
3.按照权利要求1或2的方法,其特征在于用至少一种特异性蛋白酶和/或通过化学断裂将所述样品混合物中存在的蛋白质和/或肽在步骤a)中裂解为限定的肽。
4.按照权利要求1-3中任一项的方法,其特征在于在步骤b)中提供第一结合分子,所述第一结合分子在肽表位的一个或多个位置处显示氨基酸组-特异性识别。
5.按照权利要求2-4中任一项的方法,其特征在于在步骤b)中提供第一结合分子,所述第一结合分子特异于分析物蛋白质和/或分析物肽的两个末端肽表位之一,其中所述末端肽表位包括游离的NH2基团或游离的COOH基团和在每种情形中至多最多5个氨基酸。
6.按照权利要求1-5中任一项的方法,其特征在于将所述第一结合分子固定在支持物上。
7.按照权利要求6的方法,其特征在于所述支持物选自包括下列各项的组:微阵列、用于亲合柱的支持材料、层析材料、微通道结构、毛细管表面、传感器表面、聚合多孔海绵结构、珠。
8.按照权利要求1-7中任一项的方法,其特征在于步骤d)中的检测和/或富集是通过选自包括下列各项的组的方法进行的:质谱法、免疫测定、层析法、电泳、电化学、表面等离子体共振、晶体振荡器。
9.按照权利要求1-8中任一项的方法,其特征在于步骤d)中的检测和/或富集是在使用第二结合分子的条件下发生的,所述第二结合分子特异性识别与所述第一结合分子结合的分析物蛋白质和/或分析物肽。
10.按照权利要求9的方法,其特征在于步骤d)中的检测和/或富集是通过两种不同的结合分子与所述分析物蛋白质和/或分析物肽的不同表位的同时结合,通过诸如FRET、邻近连接测定等的方法发生。
11.按照权利要求9或10的方法,其特征在于在含有所述样品的溶液中温育所述第一和第二结合分子。
12.按照权利要求5和权利要求9-11中任一项的方法,其特征在于所述第二结合分子特异于各个其他末端肽表位。
13.按照权利要求12的方法,其特征在于各个其他末端肽表位包括游离的NH2基团或游离的COOH基团和在每种情形中至多最多5个氨基酸。
14.按照权利要求9-13中任一项的方法,其特征在于在步骤d)中提供了第二结合分子,所述第二结合分子在肽表位的一个或多个位置处显示氨基酸组-特异性识别。
15.按照权利要求12-14中任一项的方法,其特征在于步骤b)中使用的第一结合分子特异于所述分析物肽的两个末端肽表位之一,其中所述末端肽表位包括游离的NH2基团或游离的COOH基团和3-5个氨基酸,并且在于所述第二结合分子特异于所述分析物肽的其他末端肽表位,且其中所述其他末端肽表位包括游离的NH2基团或游离的COOH基团和3-5个氨基酸。
16.按照权利要求9的方法,其特征在于所述第二结合分子特异于肽-内部表位。
17.按照权利要求1-16中任一项的方法,其特征在于将抗体、抗体片段、适体、重组结合分子用作第一和/或第二结合分子。
18.特异于不同的肽分析物的末端肽表位的结合分子,其中所述末端肽表位包括游离的NH2基团或游离的COOH基团、一个或多于一个由蛋白酶特异性限定的氨基酸和在每种情形中至多最多3个另外的末端氨基酸。
19.按照权利要求18的结合分子,其特征在于其选自包括抗体、抗体片段、适体、重组结合分子的组。
20.按照权利要求18或19的结合分子在按照权利要求1-17中任一项的方法中的用途。
21.用于制备按照权利要求18或19的结合分子的方法,其中将与支持物结合并具有最多5个氨基酸的肽表位用于免疫、选择和亲合力成熟方法。
22.用于制备用作按照权利要求19的结合分子的抗体的方法,其中使用了由肽表位组成的免疫产物,所述肽表位具有限定的末端基团并与载体蛋白偶联。
23.按照权利要求1-8中任一项的方法,其特征在于在与所述第一结合分子一起温育步骤a)中的样品混合物前,与所述样品混合物一起温育特异于肽-内部表位的第三结合分子。
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