DE3500190A1

DE3500190A1 - Verbesserte testzusammensetzungen, verfahren zu ihrer herstellung und ihre anwendung in testverfahren

Info

Publication number: DE3500190A1
Application number: DE19853500190
Authority: DE
Inventors: Colin Harrison Turramurra New South Wales Mansfield; Nicholas Tharmar North Punchbowl New South Wales Rajaretnam
Original assignee: MANLAB Pty Ltd
Current assignee: MANLAB Pty Ltd
Priority date: 1984-01-05
Filing date: 1985-01-04
Publication date: 1985-07-18
Also published as: GB2175906A; AU3722984A; GB8514349D0

Description

Verbesserte Testzusammensetzungen/ Verfahren zu ihrer Herstellung und ihre Anwendung in Testverfahren

Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf verbesserte Reagentien und Techniken, die bei Immunoassays brauchbar sind, wo u.a. Enzyme als Markierungen verwendet werden.

Zum Nachweis von Antikörpern in menschlichen oder tierischen Seren oder zum Nachweis von Antigenen herangezogene Immunoassays nutzen im allgemeinen Radioimmunoassay (RIA)- oder Enzym-gebundene Immunosorbens (ELISA)-Techniken.

Im allgemeinen verwenden diese Techniken ein vorbestimmtes Antigen, als Ligand bekannt, wie ein Nucleoprotein (virales Protein) oder reines Protein, gebunden an einen Träger, wie eine Polymermatrix oder Glasperlen. Gewöhnlich werden 96-WeIl-Mikrotiter-PoIystyrol-Schalen verwendet. Das Antigen wird an der Oberfläche des Trägers adsorbiert und der Antigen-Träger-Komplex mit einer Serumprobe oder einer anderen zu testenden Probe zusammengebracht. Alternativ kann ein

Antikörper an den Träger gebunden werden.

Der Träger wird dann gewaschen, um überschüssige Seren zu entfernen, und dann mit einem Enzym-markierten Konjugat (ELISA) oder radiomarkierten Konjugat (RIA) zusammengebracht, das mit irgend einem Antikörper (oder Antigen) einen Komplex bildet, der an den Antigen(körper)-Träger-Komplex gebunden wurde. Nach geeigneter Inkubationszeit wird das System auf das Vorliegen des markierten Konjugats getestet, das an den Träger gebunden wurde. Die ELISA-Methotik ist allgemein in dem US-Patent 3 654 090 beschrieben.

Wenngleich die obigen Immunoassay-Techniken in den letzten mehreren Jahren relativ gut entwickelt worden sind, sind diese Immunoassays in vieler Hinsicht nicht optimiert.

Tests auf viele verschiedene Antigene werden bei herabgesetzter Temperatur oder bei Raumtemperatur durchgeführt. Natürlich ist es unbequem, die Tests bei herabgesetzter Temperatur durchzuführen, aufgrund der Notwendigkeit, alle Reagentien auf der gleichen Temperatur zu haben und in Kälteräumen für Platz zu sorgen usw. Wenngleich es relativ bequem ist, die Tests bei Raumtemperatur durchzuführen, kann dies eine Fehlerquelle sein, da die Raumtemperatur schwankt. Es wird jedoch davon ausgegangen, daß die Tests nicht nur bei einer einheitlichen Temperatur, sondern auch bei einer Temperatur durchgeführt werden sollten, die erhöht ist, so daß der Test mit optimaler Geschwindigkeit verläuft.

Daher wird bei einer Ausführungsform der Erfindung eine Testmethode zur Verfügung gestellt, die sich dadurch auszeichnet, daß die Tests bei Temperaturen zwischen etwa 3 5 und 48⁰C, bevorzugter zwischen 40 und 45°C durchgeführt werden. Bei Temperaturen in diesen Bereichen sind die Testarbeitsweisen im allgemeinen optimiert und die Inkubationszeiten beträchtlich herabgesetzt, was zu wirtschaftlicheren Testarbeitsweisen

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9l,_v W ν«- WwW *****

führt.

Die Anwendung erhöhter Temperaturen für die Testarbeitsweisen erfordert bestimmte Modifikationen an bei dem Test verwendeten Reagentien. Beispielsweise stehen viele verschiedene Antigene für die Herstellung des Antigen-Träger-Komplexes zur Verfügung. Es ist jedoch immer angenommen worden, daß diese Komplexe Kühlung erfordern, um für jede beträchtliche Zeitspanne Aktivität zu bewahren. Auch besteht die Gefahr, daß der Komplex bei vernünftig hohen Temperaturen instabil wird.

Auch wird das Konjugat mit markiertem Enzym häufig kommerziell eingekauft, aber diese Konjugate werden im allgemeinen als bei Raumtemperatur instabil und bei Temperaturen von etwa 4⁰C zu lagern angesehen, um ihre Aktivität für eine wesentliche Zeitspanne zu bewahren, insbesondere die fertigen Testverdünnungen für die Routinearbeitsweise.

Daher ist es ein Ziel der vorliegenden Erfindung, stabilisierte Reagentien zu schaffen, die bei Immunoassay-Techniken brauchbar sind und erhöhte Stabilität bei höheren Temperaturen aufweisen.

Bei einer Form der vorliegenden Erfindung ist das markierte Enzym-Konjugat in Gegenwart von wenigstens 10 Vol./Vol.-% einer Polyhydroxyverbindung mit bis zu etwa 10 Kohlenstoffatomen stabilisiert. Vorzugsweise ist die stabilisierende Verbindung Glycerin. Das markierte Konjugat kann ein mit einem Antikörper oder einem Antigen konjugiertes Enzym umfassen. Das Konjugat kann in Lösung mit der erforderlichen Menge an Polyhydroxyverbindung verdünnt sein. Alternativ kann eine die Polyhydroxyverbindung enthaltende Lösung zum Rekonstituieren des lyophilisierten oder gefriergetrockneten Konjugats verwendet werden.

Bei einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung werden bis zu etwa 4 Gew./Vol.-% Polyethylenglykol oder eines ande-

ren Polyalkylenglykols zu der Konjugatlösung gegeben.

Bei einer weiteren Form der vorliegenden Erfindung wird ein Verfahren zur Herstellung eines an einen festen Träger, wie ein polymeres Material oder Glasmaterial, konjugierten Liganden, brauchbar bei Enzym-Immunoassay-Methoden, geschaffen, das die Stufen des

(i) Inkubierens des Liganden in Gegenwart eines festen Materials für eine zur wesentlichen Bindung zwischen dem Liganden und dem Träger ausreichende Zeit und

(ii) Waschens des Produkts der Stufe (i) mit einer Lösung, die ein Polyalkylenglykol in einer Konzentration zwischen 0,01 und 5 Gew.-/Vol.-% enthält,

umfaßt.

Der nach diesem Verfahren hergestellte Träger-Ligand-Komplex kann in Form eines Überzugs auf Küvetten, Glasplatten, Mikrotiter-Platten oder Teströhrchen zur Verfügung gestellt werden, odfir er kann in Form von Perlen, wie Polystyrol oder Glas, sein. Nach dem obigen Verfahren hergestellt, kann er unter verlängerten Lagerungsbedingungen bei Raumtemperatur ohne wesentlichen Aktivitätsverlust aufbewahrt werden. Wenn er verwendet werden soll, wird der Komplex, wenn er in trokkener Form vorliegt, in einem Puffer mit praktisch neutralem pH hydratisiert und darm mit dem zu testenden Serum zusammengebracht. Vorzugsweise ist der Ligand ein Antigen.

Weiter wurde, abgesehen von der Fähigkeit eines Polyalkylenglykols, den Ligand-Träger-Komplex zu stabilisieren, auch gefunden, daß eine solche Verbindung dazu neigt, die Protein-Protein-Bindung bei dem Test bei erhöhten Temperaturen zu stabilisieren. Daher werden gemäß einer weiteren Ausführungs-

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form der vorliegenden Erfindung Testmethoden zur Verfügung gestellt, die sich dadurch auszeichnen, daß sie in Gegenwart eines Polyalkylenglykols, wie Polyethylenglykol, durchgeführt werden. Vorzugsweise liegt die Konzentration des Polyethylenglykols zwischen 0,01 und 5 Gew.-/Vol.-%.

Insbesondere werden die erste Inkubationsstufe, in der die zu testende Probe mit dem Träger-Ligand-Komplex inkubiert wird, und die zweite Inkubationsstufe, in der das Enzym-markierte Konjugat mit der gebundenen Probe inkubiert wird, in Gegenwart von wenigstens 0,01 Gew./Vol.-% eines Polyalkylenglykols, wie Polyethylenglykol mit einem Molekulargewicht zwischen 6000 und 8 000, durchgeführt.

Erfindungsgemäß wurde auch gefunden, daß nicht nur die Inkubationszeiten für den Test aufgrund der Durchführung des Tests bei erhöhten Temperaturen verkürzt werden können, sondern die immunochemisehen Reaktionen in Gegenwart eines relativ hydrophilen Detergens mit praktisch neutralem pH und einem HLG-Verhältnis von wenigstens etwa 20 beschleunigt werden können. Die bevorzugten Detergentien sind Alkylbenzolsulfonate, vorzugsweise Ammonium- oder Natrium-lauryl- oder -dodecylbenzolsulfonate.

Daher wird bei einer weiteren Ausführungsform der vorliegenden Erfindung eine Testmethode zur Verfügung gestellt, die auf immunochemisehen Reaktionen basiert und sich dadurch auszeichnet, daß die immunochemisehen Reaktionen in Gegenwart eines relativ hydrophilen Detergens mit praktisch neutralem pH und einem HLG-Verhältnis von wenigstens 20 durchgeführt werden. Vorzugsweise liegt das Detergens in einer Menge zwischen 0,005 und 1 Vol./Vol.-%, bevorzugter etwa 0,04 Vol./ Vol.-%, vor.

Bei einer bevorzugten Form der vorliegenden Erfindung wird eine verbesserte Testmethode zum Nachweis der Gegenwart eines vorbestimmten Antikörpers in einer Fluidprobe geschaffen, die

1) das Vorlegen eines mit einem Antigen überzogenen Trägers, das mit dem Antikörper einen Komplex bildet,

2) das Inkubieren des überzogenen Trägers mit einer Probe des Körperfluids zur Bildung eines Komplexes zwischen dem Antigen und dem Antikörper,

3) das Waschen des überzogenen Trägers ohne Aufbrechen des Komplexes,

4) das Inkubieren des Antikörper-Antigen-Komplexes mit einem markierten Immunoprotein (Konjugat) zur Bildung eines Antigen-Antikörper-markierten Immunoprotein-Komplexes,

5) das Waschen des überzogenen Trägers zum Entfernen überschüssigen markierten Immunoproteins und

6) das quantitative oder qualitative Bestimmen der Gegenwart des Antigen-Antikörper-markierten Immunoprotein-Komplexes umfaßt, dadurch gekennzeichnet, daß Stufe 2 und/oder 4 und gegebenenfalls Stufe 6 in Gegenwart von 0,1 bis 5 Gew./Vol.-% eines Polyalkylenglykols und wenigstens 0,05 Vol./Vol.-% eines relativ hydrophilen Detergens mit praktisch neutralem pH und einem HLG-Verhältnis von wenigstens 20 durchgeführt wird. Vorzugsweise ist das Polyalkylenglykol Polyethylenglykol mit einem Molekulargewicht von 6000 bis 8000. Vorzugsweise ist das Detergens ein Natrium- oder Ammoniumsalz eines Alkylbenzolsulfonats.

Bei einer bevorzugten Ausführungsform des Verfahrens zur Herstellung des Ligand-Träger-Komplexes wird ein Trägermaterial, wie Glasperlen, oder eine Matrix aus Polystyrol, Polyvinylchlorid oder Polycarbonat, mit dem benötigten Antigen in einer gepufferten Lösung mit einem pH zwischen 5 und 10 inkubiert. Vorzugsweise ist der Puffer ein nicht Phosphatgruppen enthaltender Puffer, wie Tris-HCl oder Bicarbonat-Puffer.

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Wenn da« Antigen ein Nucleoprotein ist, ist ein bevorzugter pH etwa 9,6, wenn aber das Antigen ein relativ reines Protein ist, ist der pH etwas niedriger und am meisten bevorzugt zwischen 8 und 9. Vorzugsweise wird das Antigen mit dem Trägermaterial etwa 3 h bei etwa 37⁰C inkubiert.

Der Träger wird dann gewaschen, um nicht-gebundenes Antigen zu entfernen. Nach dem Waschen wird das Antigen durch Zusammenbringen des Trägers, an den Antigen gebunden ist, mit einem Polyalkylenglykol, vorzugsweise Polyethylenglykol, fixiert. Vorzugsweise wird zum Waschen des Trägers auch ein hydrophobes Detergens verwendet. Das Polyethylenglykol wird in einem Puffer verdünnt, der keine Aminogruppen enthält und einen pH von etwa 7 hat, z.B. ein Phosphatpuffer. Das Polyethylenglykol hat ein Molekulargewicht von etwa 6000 bis 8000. Die Konzentration des Polyethylenglykols liegt im Bereich von 0,01 bis 5 Gew./Vol.-% und am meisten bevorzugt bei etwa 0,15 Gew./Vol.-%. Das Detergens ist ein Detergens mit praktisch neutralem pH, wie Tween, Triton oder Detergentien mit ähnlichen HLG-Werten. Der HLG-Wert von Tween 20 ist 16,7 und von Triton X-100 13,5. Die Konzentration des Detergens ist etwa 0,005 bis 1 Vol./Vol.-%. Vorzugsweise ist bei Verwendung von Tween die Konzentration 0,05 Vol./Vol.-%. Vorzugsweise enthält die Lösung auch Glycerin in einer Menge bis zu etwa 1 Gew.-%, aber die Glycerin-Komponente ist nicht notwendig.

Der Protein-Protein- oder Immunoprotein-Protein-Komplex wird bei der RIA- oder ELISA-Technik dazu verwendet, die Immunoglobulin-Moleküle zu binden, die mit dem Antigen reagiert haben. Die verwendeten Immunoproteine oder Antisera sind z.B. Antihuman- oder Antianimal-Immunoglobuline, wie solche aus der Klasse IgG, IgM oder IgA, oder Antikörper zu biologisch aktiven Verbindungen, wie Thyroxin, Corticosteron und Insulin. Diese sind mit einem Protein konjugiert, das als Markierung für Testzwecke wirkt. Beispielsweise sind bevorzugte Protein-

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markierungen Enzyme, wie alkalische Phosphatase, Meerrettich-Peroxidase, ß-Galactosidase oder ß-Glucosidase. Alternativ

125
können J -markiertes Thy:

Proteine verwendet werden.

12 5
können J -markiertes Thyroxin oder andere radiomarkierte

Das Immunoprotein oder Protein wird mit der Proteinmarkierung, wie einem Enzym, in vorbestimmten Verhältnissen gemischt und in einer gepufferten Lösung zwischen pH 6 und 8 inkubiert. Vorzugsweise ist die Lösung von Antiseren und Proteinmarkierung eine verdünnte Lösung, die etwa 0,2 Vol./Vol.-% Glutaraldehyd enthält, und der verwendete Puffer ist 0,1 m Tris-HCl oder 0,1 m Phosphat-Puffer mit 10 mM Magnesiumchlorid oder anderen Cofaktoren entsprechend Enzym-Erfordernissen. Bei einer bekannten Methode der Konjugatbildung wird Glutaraldehyd während oder nach der Inkubation zugesetzt. Bis zu dieser Stufe ist es eine der Standardtechniken zur Konjugatbildung der Proteinmarkierung mit dem Antiserum.

Die nächste Stufe des Verfahrens ist bestrebt, nicht-konjugiertes Immunoprotein oder Proteinmarkierung vom Konjugat zu entfernen.

Vorzugsweise erfolgt die Trennung durch Dialyse in Gegenwart von 0,1 m Tris-HCl-Puffer mit 10 mM MgCl₂ und einem pH von 7 bis 9. Alternativ kann Säulenchromatographie angewandt werden.

Das Konjugat wird mit wenigstens etwa 10 und bis zu etwa 50 Vol./Vol.-% Glycerin versetzt. Vorzugsweise ist die Endkonzentration an Glycerin in der Konjugat-Lösung etwa 20 Vol./ Vol.-%. Vorzugsweise werden auch bis zu etwa 5 % Polyethylenglykol in die Konjugatlösung eingebracht.

Erfindungsgemäß wurde gefunden, daß die Zugabe von Glycerin zu dem Konjugat zu einer beträchtlichen Erhöhung der Temperaturbeständigkeit des Konjugats führt und es bei Raumtemperatur lagerbar und verwendbar macht und insbesondere dieses

BAD

Konjugat in einem Test bei erhöhten Temperaturen, wie etwa 45⁰C, verwendbar macht.

So kann der dieses Konjugat verwendende Test maximal gestaltet werden, insbesondere, da die zur Inkubation des Konjugats mit dem Antigen-Antikörper-Komplex erforderliche Zeit herabgesetzt wird.

Bei der Testarbeitsweise wird ein Detergens verwendet, um die immunologischen Reaktionen zu beschleunigen.

Vorzugsweise ist das Detergens ein Alkylbenzolsulfonatsalz, z.B. des Natriums oder Ammoniums, wie das unter dem Warenzeichen NANSA von Albright & Wilson auf demMarkt befindliche. Das Detergens wird in einer Menge zwischen 0,005 und 1 Vol./Vol.-%, vorzugsweise etwa 0,04 Vol./Vol.-%, verwendet. Zu viel Detergens führt zu nicht-spezifischer Bindung und Wegwaschen des Proteins vom Träger, während zu wenig keinen Einfluß hat. Die Menge kann in dem gegebenen Bereich variiert werden, um zu dem speziellen Test zu passen.

Das HLG-Verhältnis des Detergens ist relativ hoch, so daß das Detergens als hydrophiles Detergens anzusehen ist. Vorzugsweise ist das HLG-Verhältnis wenigstens etwa 20.

Das Detergens wird in der ersten Inkubation zwischen Träger-Ligand und Probe sowie in der zweiten Inkubation zwischen Träger-Ligand-gebundenem Antikörper und dem Enzym-markierten Konjugat verwendet. Gegebenenfalls wird es auch in der dritten Inkubationsstufe des Substrats mit der Enzym-Markierung eingesetzt, wenn die ELISA-Technik angewandt wird.

Ferner wird die Testarbeitsweise durch die Gegenwart eines Polyalkylenglykols, wie Polyethylenglykol (PEG) in den Teststufen, in denen Protein-Protein-Bindung eintritt, stabilisiert. So wird PEG in der ersten Inkubationsstufe eingesetzt, wo der Ligand-Träger die in der Probe vorhandenen Antikörper

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bindet, sowie in der zweiten Inkubationsstufe, in der das Enzym-markierte Konjugat den gebundenen Antikörper bindet. Gegebenenfalls ist PEG auch in der dritten Inkubation zugegen, hat aber wenig Einfluß in dieser Stufe des Tests.

Vorzugsweise wird PEG in einer Konzentration von 0,1 bis 5 Gew./Vol.-%, bevorzugter etwa 0,15 Gew./Vol.-%, verwendet. Vorzugsweise hat PEG ein Molekulargewicht zwischen 1000 und 20 000, bevorzugter zwischen 6000 und 8000.

Ungeachtet weiterer Formen, die unter den Rahmen der Erfindung fallen mögen, wird nun eine bevorzugte Ausführungsform unter Bezugnahme auf die folgenden Beispiele beschrieben.

Beispiel 1

Nachfolgend findet sich eine allgemeine Arbeitsweise zur Herstellung des Antigen-Träger-Komplexes, zur Herstellung des Antiserum-Enzym-Konjugats und die Testarbeitsweise gemäß der Erfindung.

Antigen: Toxoplasma gondii-Antigen
Puffer: 0,1 mBicarbonat-Puffer, pH 9,6

Antigen wird dispergiert und durch eine Glasspritze geschert. Alternativ und vorzugsweise geschieht dies durch Verwendung eines Beschallungsgeräts. Das Antigen wird mit Bicarbonat-Puff er etwa 40 bis 200 mal, je nach dem Antigen und der Reinheit der Probe, verdünnt.

250 μΐ Antigen in der Uberzugslösung werden auf eine Polymermatrix, wie Guildford-Polystyrol-Küvetten oder Mikrotiter-Platten, aufgebracht.

Für jeden Test werden zwei Schalen oder Küvetten verwendet. Die Kontrollschale ist mit einem Puffer alleine überzogen,

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während die Testschale mit dem Testantigen in der Pufferlösung überzogen ist.

Die Platte wird 2 bis 4 h bei 37°C inkubiert.

Die überzogenen Platten werden dann in der Lösung Phosphatgepufferter Salzlösung, die 0,05 % Tween 20 und 10 mM MgCl₂ enthält, fixiert. Dann werden die Platten 2 h bei 37°C inkubiert. Nach dem Ende der Inkubation können die Platten bei Raumtemperatur trocken tropfen.

Herstellung von Antiserum-Enzym-Konjugat

Enzym: Alkalische Phosphatase (Sigma Laboratories) Antiserum: Schaf-Antihuman-IgG (Silenus Laboratories)

Rohes alkalisches Phosphatase-Pulver wird chromatographisch gereinigt. Die gesammelten alkalischen Phosphatase-Praktionen, etwa 30 bis 40 ml, werden mit 6 bis 10 ml Antihuman-IgG gemischt und in Tris-HCl (0,1 M pH 8,6 + 10 mM MgCl2 + 0,15 M NaCl) oder einem Phosphatpuffer mit 10 mM MgCl₂ (pH 6 bis 8) über Nacht dialysiert.

Das Gemisch wird dann in Polyethylenglykol-Flocken in einem Dialysebeutel oder, wenn nötig, in einem Amicon-Concentrator konzentriert. Zu dem dialysierten konzentrierten Gemisch werden bis zu 0,4 % Glutaraldehyd (Endkonzentration) gegeben. Das Gemisch wird etwa 30 min gerührt. Das Gemisch wird dann in Tris-HCl (0,1 M. pH 8,6 + 10 mM MgCl₂ + 0,15 M. NaCl) in der ersten Dialyse über Nacht dialysiert. Das Konjugat, Immunoprotein und alkalische Phosphatase können nun an einer Sephadex G-200 oder G-150 oder Sephacryl S.300-Säule getrennt werden, wenn die Entfernung nicht-konjugierten Materials notwendig ist.

Nach der Reinigung wird das Konjugat in einer Lösung zu einer Endkonzentration wie folgt stabilisiert:

Tris-HCl (0,1 M pH 7,4)-Puffer mit 20 % Glycerin, 0,15 % PoIyethylenglykol, 10 mM MgCl₂ und 0,15 M NaCl.

Toxoplasma gondii-spezifischer IgG-Test Reagentien:

1) Küvetten/Platten überzogen mit Toxoplasma-Antigen.

2) Antihuman-IgG, konjugiert an alkalische Phosphatase, verdünnt in Stabilisatorlösung, geeignet für eine weitere 30-fache Verdünnung für den Test.

3) p-Nitrophenylphosphat in 3 mM Konzentration, gelöst in 2-Amirio, 2-methyl, 1-propanol-Puffer bei pH 9,9, 0,1 M, gefriergelagert in 5 ml-Teilmengen.

4) Serum- und Konjugat-Verdünner, hergestellt wie folgt:

Phosphat-gepufferte Salzlösung (20fach konzentriert) 50 ml Polyethylenglykol (15%ige Lösung) 10 ml

Magnesiumchlorid, 0,5 M 16 ml

NANSA (10 %ige Lösung) 2,5 ml

Wasser (destilliert) 921,5 ml

5) Waschlösung: Eine Lösung Phosphat-gepufferter Salzlösung mit 0,05 % Tween 20 und 5 mM Magnesiumchlorid.

6) Substrat-Verdünner 2-Amino,2-methyl11-propanol (0,1 M), NANSA 0,04 5 %,

Magnesiumchlorid 5 mM,
pH 10,25.

Testmethode:

Die überzogenen Platten/Küvetten werden durch dreimaliges Waschen in der Waschlösung hydratisiert. Die letzte Waschflüssigkeit läßt man 3 min darauf, bevor weitere 3 min abtropfen

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gelassen wird. 10 μΐ Serum werden dann sowohl auf die Kontroll- als auch die Testküvette für jede Probe aufgebracht.

Der Serum-Verdünner wird in alle Schalen pipettiert und die Platte/Küvette wird 30 min bei 45⁰C inkubiert. Am Ende der Inkubation werden die Platten/Küvetten in Phosphat-gepufferter Salzlösung, die Tween 20 enthält, gewaschen. Die Platten oder Küvetten werden dann wieder mit dem Konjugat gefüllt, das 30-fach verdünnt ist. Die Platten/Küvetten werden bedeckt und 15 min bei 45⁰C inkubiert.

Die Platten oder Küvetten werden viermal in Phosphat-gepufferter Salzlösung gewaschen.

Gefrorene Teilmengen von p-Nitrophenylphosphat werden 1:4 mit dem Substrat-Verdünner verdünnt. Die Platte/Küvette wird bedeckt und 20 bis 30 min bei 45°C inkubiert. Alle Lösungen werden bei 45°C vorinkubiert, bevor sie in die Küvetten/Platten abgegeben werden.

Die Aktivität alkalischer Phosphatase wird spektrophotometrisch durch Bestimmen von p-Nitrophenol bei 405 nm bestimmt. Die wiedergegebenen Ergebnisse sind der Durchschnitt von Wiederholungen. Wesentliche Abweichungen zwischen Wiederholungen führten zu Testwiederholung.

Beispiel 2

Das folgende Beispiel zeigt, daß nicht-spezifische Bindung verringert werden kann, wenn nach der Herstellung des Antigen-Träger-Komplexes der Komplex mit einer Proteinlösung, wie Rinder-Serumalbumin, bei pH 9,6 gewaschen wird.

Die angewandte Testarbeitsweise war der Toxoplasma gondii-Test, beschrieben in Beispiel 1. Toxoplasma-Komplementfixierendes Antigen wurde 2 h mit Polystyrol-Mikrotiter-Trögen

inkubiert. Nach 2stündiger Inkubation wurden sowohl die Kontroll- als auch die Testschalen abgetropft und gefüllt mit 250 μΙ-Teilmengen von

a) 2,5 % Rinder-Serumalbumin in Bicarbonatpuffer: 0,1 M bei pH 9,6.

b) 2,5 % Rinder-Serumalbumin in Tris-HCl-Puffer: 0,1 m bei pH 7,4 und

c) 2,5 % Phosphat-gepufferte Salzlösung bei pH 9,6.

Nach 30 min wurden die Platten mit Phosphat-gepufferter Salzlösung, die 5 mM Magnesiumchlorid und 0,05 % Tween 20 enthielt, gewaschen.

Die Ergebnisse sind in Tabelle 1 wiedergegeben.

Tabelle 1

Entfernung nicht-spezifischer Bindungsstellen an Polystyrol/

Antigen

	2,5% Bicarb. BSA	0	2,5% Tris HCl BSA	0	2,5% PBS BSA	ο,	normal ohne BSA	9	kein 2,5% Bicarb. BSA	ο,	2,5% Tris BSA	HCl	0	2,5% PBS BSA	normal ohne BSA
1	0,08	0	,16	0	,11	0,	21	10	0,24	O₁	,24	0	,31	0,32
2	0,09	0	,27	0	,21	0,	34	11	0,21	ο,	21	0	,29	0,31
3	0,17	0	,25	0	,18	0,	30	12	0,17	ο.	20	0	,27	0»29
4	0,11	0	,21	0	,17	ο,	31	13	0,20	0,	26	0	,29	0,26
5	0,12	0	,23	0	,16	ο,	24	14	0,17	ο,	18	0	,27	0,27
6	0,12	0	,22	0	ι"	0,	28	15	0,29	ο,	23	0	,29	0,30
7	0,11	0	,24	0	,24	ο,	28	16	0,25	0,	18	0	.34	0,34
8	0,21	,30	,26	30	0,30	30	,33	0,32

Dit! beMte NanliüborzugHlösuiicj zum Eliminieren nicht-spezifischer Bindung 1st eine Phosphat-gepufferte Salzlösung von Rinder-Serumalbumin. Die Serumproben, die wirklich positive spezifische IgG-Werte haben, werden durch diese Arbeitsweise nicht unterdrückt.

Beispiel 3

Verschiedene Aspekte des in Beispiel 1 beschriebenen Tests wurden getestet, um die Variablen bei dem Test zu optimieren. Bei Temperaturen von 45⁰C wurden die Inkubationszeiten optimiert.

Die erste Inkubationsperiode, d.h. die Inkubationsperiode des Serums mit dem Antigen-Träger-Komplex, wurde auf 30 min optimiert. Die zweite Inkubationsperiode, d.h. die Inkubation des Anti-IgG-Konjugat/alkalische Phosphatase mit dem Träger, wurde auf 15 min optimiert. Die dritte Inkubationsperiode, die Inkubation des Substrats mit dem gebundenen, markierten Enzym-Konjugat, wurde auf 30 min optimiert.

Die Optimierungsarbeitsweise umfaßte auch das Testen auf ein Temperatur-Optimum. Die angewandte Testarbeitsweise war die in Beispiel 1 beschriebene, und Inkubationszeiten waren wie oben. Der Test und alle Inkubationen erfolgten bei folgenden Temperaturen: 21⁰C, 3O°C, 37⁰C, 4O⁰C, 45⁰C, 5O°C und 55°C.

Die folgende Tabelle 2 faßt die optischen Dichten von acht getrennten Serumproben bei den obigen Temperaturen tabellarisch zusammen. Die Optimaltemperatür für den Test und die Inkubation ist ersichtlich etwa 40 bis 45°C.

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	21°C	30⁰C	Tabelle 2	40"C	45'C	50⁰C	55°C
	0,09	0,12		0,10	0,18	0,12	0,06
	0.13	0,23	37^eC	0,33	0,31	0,25	0,03
1	0,17	0,20	0,14	0,32	0,28	0,18	0,08
2	0,16	0,26	0,22	0,33	0,36	0,19	0,07
3	0,14	0,24	0,24	0,31	0,33	0,23	0,06
4	0,16	0,25	0,28	0,34	0,33	0,19	0,04
5	0,17	0,26	0,26	0,30	0,34	0,14	0,05
6	0,13	0,25	0,27	0,24	0,37	0,22	0,01
7	4		0,26
8		0,26
Beispiel

Die Langzeitlagerung des Enzym-markierten Konjugats bei Raumtemperatur in Gegenwart von 20 Vol./Vol.-% Glycerin wurde untersucht. Tests mit dem Konjugat wurden nach 0, 6 Tagen, 9 Tagen, 12 Tagen, 15 Tagen und 140 Tagen durchgeführt. Das Konjugat wurde mit drei handelsüblichen Produkten A, B und C verglichen, und die Ergebnisse sind als optische Dichten in Tabelle 3 wiedergegeben.

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Tabelle 3

Langzeitlagerung von Konjugat bei Raumtemperatur mit Glycerin

Tage
Verdünnung 1 6 9 12 15 140

HANLAB IkG 1 1:20 0,68 0,79 0,77 0,80 0,78 0,84 +201 Glycerin

MANLAB IgG 1 1:20 0,78 0,87 0,87 0,85 0,83 0,44

(kein Glycerin)

MANLAB IgG 2 1:20 0,38 0,49 0,42 0,43 0,46 0,42

+ 20% Glycerin

MANLAB IgG 2 1:20 0,31 0,36 0,33 0,32 0,31 0,19

(kein Glycerin)

A 1:10 0,41 0,82 0,67 0,79 0,64 1.16

B 1.15 0,81 0,95 0,85 0,86 0,83 1,18

C 1:120 0,52 0,90 0,98 1,11 0,91 1,21

Anmerkung: Alle Konjugate wurden verdünnt, um gegebenenfalls einen Wert am Tag 1 von früheren Proben-Versuchsansätzen zu ergeben.

Die obigen Ergebnisse zeigen eine ausgeprägte Schwankung bei Raumtemperaturen nach längerer Lagerung bei Raumtemperatur,
wenn die Produkte in Abwesenheit von Glycerin aufbewahrt werden. Nach längerer Lagerung bei Raumtemperatur in Gegenwart
von Glycerin gibt es keine wesentliche Schwankung der Ergebnisse.

Beispiel 5

Human-IgG-Fc-Fragment wurde auf Gilford-Küvetten zu 200 ug/ml in 0,1 Natriumbicarbonat-Carbonat-Puffer bei 37°C 2 h aufge-

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bracht. Die Küvetten wurden mit PBS Tween 0,05 % mit 5 mM Magnesiumchlorid gewaschen.

Konjugate von Antihuman-IgG wurden verdünnt mit

Tris-HCl 0,1 M, pH 7,4, mit 0,15 M Natriumchlorid und 10 mM Magnesiumchlorid. Unterschiedliche Konzentrationen an Glycerin wurden dem Verdünner zugesetzt, um eine Endkonzentration an Glycerin zwischen O und 40 Vol./Vol.-% zu erhalten. In einem Falle enthielt die Konjugatlösung ferner NANSA in einer Menge von etwa 0,04 Gew./Vol.-%.

Das Konjugat, wie oben verdünnt, wurde mit den IgG-überzogenen Küvetten 15 min bei 45°C inkubiert, die Küvetten wurden gewaschen, Substrat zugegeben und 30 min bei 45⁰C inkubiert. Die folgende Tabelle 4 zeigt die Ergebnisse.

Tabelle 4
Stabilisierung von Konjugat mit Glycerin

	Glycerin-	mit NANSA	ohne NANSA
	Konzentration	SSAL
1	0%	0,18	0,31
2	5%	0,25	0,31
3	10%	0,26	0,30
4	15%	0,25	0,34
5	20%	0,29	0,32
6	30%	0,32	0,35
7	40%	■_

BAD

Die Zugabe von Glycerin zum Konjugat verstärkte nicht die immunochemische Reaktion des Konjugats oder schien sie nicht wesentlich zu beeinflussen. Glycerin wirkt nur als Stabilisator für die Produktlagerung bei Raumtemperatur. Das Konjugat kann bald nach der Herstellung lyophilisiert und Glycerin nach Hydratation des Lyophilisats zugesetzt werden.

Die Zugabe von NANSA scheint über kurze Zeit die Aktivität des Konjugats nicht zu beeinflussen.

Beispiel 6

Die im vorhergehenden Beispiel angewandte Testarbeitsweise wurde zum Studium des Einflusses des Einbringens von Polyethylenglykol mit einem Molekulargewicht zwischen 6000 und 8000 in unterschiedlichen Mengen herangezogen. Die Testarbeitsweise wandte die gleichen Proben an, aber mit Konzentrationen an Polyethylenglykol von 0 bis 6 Gew./Vol.-% in der Verdünnung des Konjugats. Die erhaltenen Ergebnisse sind in der folgenden Tabelle 5 wiedergegeben. Daher wurde der Schluß gezogen, daß Polyethylenglykol keinen wesentlich verstärkenden Einfluß auf die Antigen-Antikörper-Komplexbildung hat.

Tabelle 5 Nr. Konz. an PEG optische Dichte

1 0% 0,18

2 0,2 0,19

3 0,4 0,19

4 0,6 0,16

5 1,0 0,18

6 2,0 0,18

7 4,0 0,16

8 6,0 0,12

Beispiel 7

Die Verwendung von Polyethylenglykol zum Stabilisieren des
Ligand-Träger-Komplexes ist in diesem Beispiel veranschaulicht.

Polystyrol-Platten A und B wurden mit Toxoplasma-Antigen 2 h inkubiert, in PBS-Tween 20 (0,05 %) und MgCl₂ (5 mM) mit 0,15 Gew./Vol.-% PEG gewaschen.

Tests wurden gemäß Beispiel 2 nach Lagerung der Platten bei Raumtemperatur für 0, 2, 10, 17 und 3 3 Tage durchgeführt, und die Ergebnisse sind in der folgenden Tabelle 6 wiedergegeben.

Über einen Zeitraum von 33 Tagen wurde kein wesentlicher
Aktivitätsverlust der überzogenen Platten festgestellt.

Tabelle 6

Zeit ο Tage 2 Tage 10 Tage 17 Tage 33 Tage Nomoal-

_NrA BABABABAB ^^Γ1:

1 0, 19 O, 15 0, 21 O, 15 0, 15 0, 10 0, 09 0, 15 0, 20 0, 22 0,18

2 0, 18 0, 15 0, 13 0, 11 0, 10 0, 12 0, 09 0, 15 0, 16 0, 19 0,16

3 0, 15 0, IA 0, 10 0, 11 0, 19 0, 08 0, 17 0, 13 0, 16 0, 19 0,15

4 0, 14 0, 12 0, 14 0, 13 0, 12 0, 11 0, 13 0, 12 0, 18 0, 19 0,14

5 0, 20 0, 16 0, 15 0, 13 0, 11 0, 08 0, 12 0, 20 0, 17 0, 16 0,18

6 0, 17 0, 14 0, 18 0, 25 0, 19 0, 24 0, 21 0, 22 0, 21 0, 24 0,25

7 0,16 0,13 0,15 0,26 0,24 0,26 0,22 0,28 0,17 0,22 0,29

8 0, 44 0, 46 0, 40 0, 42 0, 31 0, 44 0, 32 0, 40 0, 36 0, 47 0,50

KiiifluB der ΛηΙ i cjoii-Ant. j kürper-Roakl j on mit steigender Konzentrat, ion.

In diesem Beispiel wird die Testarbeitsweise von Beispiel 1 an 8 verschiedenen Proben angewandt. Die Konzentration an Polyethylenglykol wird in der Lösung von Antigen-Enzymmarkierung zwischen O und 0,2 Gew./Vol.-% variiert. Die erhaltenen Ergebnisse sind in der folgenden Tabelle 7 angegeben.

Tabelle 7

	Konzentration	0,025	an PEG, MG	0,075	8000,	in Gew./	Vol.-%	0,175	0	Routinewert	mit
		0,09		0,16				0,16	0		0,151
	0	0,26	0,05	0,28	0,10	0,125	0,150	0,25	0	,20	0,20
1	0,10	0,29	0,14	0,28	0,10	0,12	0,15	0,27	0	,14	0,22
2	0,25	0,15	0,26	0,19	0,22	0,25	0,22	0,12	0	,24	0,26
3	0,24	0,27	0,28	0,26	0,25	0,27	0,23	0,27	0	,28	0,13
4	0,16	0,24	0,15	0,25	0,14	0,13	0,12	0,20	0	,13	0,28
5	0,25	0,24	0,32	0,26	0,25	0,29	0,26	0,23	0	,29	0,22
6	0,19	0,27	0,26	0,26	0,22	0,24	0,20	0,22	0	,23	0,23
7	0,22	0,26	0,26	0,26	0,24		,27	0,27
8	0,25	0,31	0,27	0,29	0,24		,27

Daraus wurde der Schluß gezogen, daß die Gegenwart von PEG die Bildung des Antigen-Antikörper-Komplexes nicht beschleunigte oder verstärkte.

Beispiel 9

Ein Vergleich von Detergentien erfolgte unter Verwendung von Triton X--100, Tween 20, Tweeri 80, Natriumlaurylsulf at, Na-

BAD ORIGINAL

tr iumdodecy lbeiizol sulfoiiat und NANSA (Natriumalkylbenzolsulfonat) bei unterschiedlichen Konzentrationen. Die Testarbeitsweise brachte spezielle Mengen der oben ausgewählten De tergentien als Teil der Verdünner für das Serum und Körper-Antienzym-markierte Konjugat ein.

Die Ergebnisse finden sich in der folgenden Tabelle 8, basie rend auf der in Beispiel 1 beschriebenen Testarbeitsweise.

Die Verwendung von NANSA, dem Detergens Watriumalkylbenzolsulfonat, und/oder die Verwendung von Natriumdodecylbenzolsulfonat erhöht die Empfindlichkeit des Tests erheblich.

Tabelle

TRITOSI X-100 TvJEEN 20 TWEEN 80 Natrium- Natriumdodecyl- NANSA

laurylsulfat benzolsulfat

0,01t 0,051 0,011 0,051 0,011 0,051 0,011 0,051 0,011 0,051 0,0461

1 0,17 0,19 0,10 0,10

2 0,06 0,06 0,09 0,06

3 0,16 0,01 0,17 0,2*

4 0,01 0,04 0,05 0,05

5 0,09 0,0A 0,04 0,09

6 0,03 0,06 0,03 0,04

7 0,05 0,05 0,05 0,05

8 0,07 0,07 0,06 0,05

0,	03	,08	0,01	o,	03	0,02	0,21	o,	18
o,	04	,05	0,08	o,	09	0,13	0,25	o,	29
0,	17	,11	0,19	o,	10	0,15	0,20	o,	29
0,	04	,03	0,08	o,	04	0,06	0,20	o,	21
0,	03	,11	0,08	0,	06	0,12	0,16	o,	24
0,	03	,03	0,04	o,	05	0,05	0,20	0,	26
0,	04	.02	0,06	o,	05	0,11	0,17	0,	21
o,	05	,07	0,01	o,	10	0,10	0,17	o,	20

Beispiel 10

Der beschleunigende Einfluß eines Detergens wurde unter Verwendung von NANSA in unterschiedlichen Konzentrationen unter

Anwendung des Standardtests von Beispiel 2 und einer Standard-Inkubationszeit für jeweils die erste, zweite und dritte Inkubation gezeigt. Das NANSA wurde in vorbestimmten Konzentrationen bei der ersten und zweiten Inkubation zugesetzt, und die Ergebnisse sind in Fig. 1 dargestellt.

Es ist zu sehen, daß steigende Detergens-Konzentrationen bis zu einem Maximum erhöhte optische Dichten zu vorgegebenen Inkubationszeitpunkten ergeben. Doch wurde ermittelt, daß es eine optimale Konzentration gibt, nach der die Erhöhung der optischen Dichte zu falschen positiven Ergebnissen führt. Daher wurde der Schluß gezogen, daß die optimale Konzentration an NANSA zwischen 0,04 und 0,05 Vol./Vol.-% war.

Beispiel 11 Gleichzeitiges IgG und IgM ohne Trennung von IgG

Trägermatrix, Polystyrol-Küvetten von Guilford

Standards: Behring-Plasmaprotein-Standard, enthaltend vorgetestete Gehalte an IgG und IgM.

Reiner Standard: Reines Human-IgG (Fc-Fragment) von Calbiochem Behring.

Überzug: Das Plasmaprotein und reiner IgG-Standard wurden in Bicarbonat-Carbonat-Puffer (0,1 M) verdünnt und dann mit der festen Matrix 2 h inkubiert. Die Küvetten wurden mit PBS Tween (0,05 %) MgCl₂ (5 mM) gewaschen.

Das verwendete Konjugat war ein Routine-Anti-IgG-alkalisches Phosphatase-Konjugat bei einer Endverdünnung von 1050 und Anti-IgM-alkalische Phosphatase bei einer Endverdünnung von 900.

Die Küvetten wurden mit 250 μΐ des Konjugats 15 min inkubiert.

BAD ORIGINAL

μΐ Substratlösung wurden nach Waschen der Platten nach der obigen Inkubation zugesetzt, und diese Inkubation 30 min durchgeführt.

Alle Inkubationen erfolgten bei einer Temperatur von 4 5°C. Die Ergebnisse sind in Tabelle 9 wiedergegeben.

Tabelle 9

SUBSTANZ

IgM

Konzentration optische Konzentration optische Dichte Dichte

Behrlng Plasma-Protein Standard

reiner Standard

208ug/ml 2075ug/ml 4150ug/ml 8300ug/ml

200yß/ml

0,63
0,74
0,71

0,57

23ug/ml
232ug/ral
464ug/ml

0,37 0,33 0,19 0,11 0,07

Schlußfolgerungen:

(1) Reiner IgG-Standard ergab mit dem Plasma-Proteinstandard bei ähnlichen Konzentrationen vergleichbare Ergebnisse. Reiner IgG-Standard ergab unerhebliche Werte mit IgM-Konjugat, während ein signifikanter Wert mit 23 ug/ml IgM in Plasmaproteinstandard erhalten wurde.

Bei 10-facher IgG-Konzentration ist es möglich, eine vernünftige IgM-Messung zu erhalten, obgleich signifikante Hemmung der IgM-Messung bei sehr hohen (4150 μg/ml) Konzentrationen an IgG eintritt. Doch würde die Konzentration an spezifischem IgG und IgM normalerweise solche Konzentrationen nicht erreichen.

Die meisten Testmethoden, die ELISA für die Messung spezifischer IgM-Antikörper anwenden, legen nahe, daß es, um ein überschwemmen der antigenen Stellen durch hohe Gehalte an IgG zu verhindern, nötig ist, das IgG im Serum zu entfernen, bevor auf IgM getestet wird. Ein gewöhnliches Verfahren zur Durchführung dieses Entfernens besteht in der Verwendung von Protein A, das spezifisch IgG bindet. Es wird jedoch angenommen, daß die Empfindlichkeit der erfindungsgemäß angewandten Testarbeitsweisen durch die Messung von IgG und IgM ohne Abtrennung von IgG nicht herabgesetzt wird. Es wird angenommen, daß aufgrund der kürzeren Inkubationszeiten bei höheren Temperaturen der Ausschluß von IgM für die antigenen Stellen durch IgG nicht leicht eintritt und daher ein weiterer Vorteil der erfindungsgemäßen Testarbeitsweisen darin besteht, daß ein Entfernen von IgG beim Testen auf IgM-Antikörper nicht nötig ist.

Die oben gegebenen Beispiele wandten einen spezifischen Toxoplasma gondii-Test an. Doch ist der erfindungsgemäße Test auf einen breiten Bereich von Testarbeitsweisen zum Nachweis eines breiten Bereichs viraler Antikörper und/oder Antigene anwendbar, wie Rubella, CMV, Herpes 1 und 2, Toxoplasma, Influenza A, B und C, Parainfluenza 1, 2 und 3, Mycoplasma, Adenovirus, Q-Fieber, Masern, Varicella zoster, Ross River-Virus, Immunkomplexe, HCG und Thyroxin. Tierische Antikörper oder Antigene können ebenso nachgewiesen werden, wie Human-Antikörper oder -Antigene durch Verwendung der geeigneten Antisera.

Claims

DIPL-ING. HELMUT KOEPSELL 5KÖLN1, 4.Jan.1985 PATENTANWALT *\ r f\ η Ί η η Mittülslrasüe 7 % 0 0 U U iyU luiniuniiraaiiaiinsa lf Klllunt Köln Mn/501 Roy. Nr bitte unytttwn MANLAB PTY. LTD. 10 Elizabeth Street Paddington, New South Wales 2021 Australien Verbesserte Testzusaxnmensetzungen, Verfahren zu ihrer Herstellung und ihre Anwendung in Testverfahren Patentansprüche

1. Protein-Protein-Konjugat-Zusammensetzung, die wenigstens 10 Vol./Vol.-% einer Polyhydroxyverbindung mit bis zu 10 Kohlenstoffatomen enthält. %

2. Zusammensetzung nach Anspruch 1, worin die Polyhydroxyverbindung Glycerin ist.

3. Zusammensetzung nach Anspruch 1 oder 2, die wenigstens etwa 20 Gew./Vol.-% der Polyhydroxyverbindung enthält.

4. Zusammensetzung nach irgend einem der Ansprüche 1 bis 3, die ferner bis zu etwa 5 Gew./Vol.-% eines Polyalkylenglykols enthält.

5. Zusammensetzung nach Anspruch 4, in der das PoIyalkylenglykol Polyethylenglykol ist.

6. Zusammensetzung nach irgend einem der Ansprüche 1 bis 5, in der die Polyhydroxyverbindung in einer Konzentration zwischen 20 und 50 Gew./Vol.-% vorliegt.

7. Testverfahren auf der Grundlage immunologischer Reaktionen zwischen einer vorbestimmten Spezies in einer Probe und einem oder mehreren Immunoproteinen, die für diese Spezies relativ spezifisch ist bzw. sind, dadurch gekennzeichnet, daß die Inkubationenzwischen den Spezies und den Immunoproteinen bei dem Test bei Temperaturen zwischen 37°C und 50°C für vorbestimmte Zeitspannen durchgeführt werden.

8. Verfahren nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, daß es bei etwa 45⁰C durchgeführt wird.

9. Testverfahren zur qualitativen und/oder quantitativen Bestimmung einer vorbestimmten Spezies in einer Probe, umfassend

(1) das Vorlegen eines Trägers, an den ein Protein

oder Nucleoproteins das zur Bindung mit der Spezies durch eine immunologische Reaktion befähigt ist, gebunden oder adsorbiert ist,

(2) das Zusammenbringen des Trägers mit der Probe, so daß sich die Spezies an das Protein bindet,

(3) das Entfernen überschüssiger Probe vom Träger,

(4) das Zusammenbringen des Trägers mit einem markierten Protein, das sich relativ spezifisch an die Spezies zu binden vermag, wenn an den Träger gebunden, so daß das markierte Protein an die Spezies gebunden wird,

(5) das Entfernen ungebundenen markierten Proteins,

(6) das quantitative oder qualitative Bestimmen der Gegenwart des markierten Proteins,

wobei die Stufen (2) und/oder (4) in Gegenwart von bis zu 5 Gew./Vol.-% eines Polyalkylenglykols durchgeführt

werden.

10. Verfahren nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, daß als Polyalkylenglykol Polyethylenglykol verwendet wird.

11. Verfahren nach Anspruch 9 oder 10, dadurch gekennzeichnet, daß ein Polyalkylenglykol mit einem Molekulargewicht zwischen 6000 und 8000 verwendet wird.

12. Verfahren nach irgend einem der Ansprüche 9 bis 11, dadurch gekennzeichnet, daß das Polyalkylenglykol in einer Menge von etwa 0,15 Gew./Vol.-% verwendet wird.

13. Verfahren nach irgend einem der Ansprüche 9 bis 12, dadurch gekennzeichnet, daß die Stufen (2) und (4) in weiterer Gegenwart von bis zu 1 Vol./Vol.-% eines praktisch hydrophilen Detergens durchgeführt werden.

14. Verfahren nach Anspruch 13, dadurch gekennzeichnet, ^ daß als Detergens ein Salz eines Alkylbenzolsulfonats verwendet wird.

15. Testverfahren zur qualitativen oder quantitativen Bestimmung einer vorbestimmten Spezies in einer Probe, umfassend

(1) das Vorlegen eines Trägers, an den ein Protein, das zur Bindung mit der Spezies durch eine immunologische Reaktion befähigt ist, gebunden oder adsorbiert ist,

(3) das Entfernen überschüssiger Probe vom Träger,

(4) das Zusammenbringen des Trägers mit einem markierten Protein, das sich relativ spezifisch an die Spezies zu binden vermag, wenn an den Träger gebunden, so daß das markierte Protein an die Spezies und somit an den Träger gebun-

BAD ORIGINAL

den wird,

(5) das Entfernen ungebundenen markierten Proteins,

worin die Stufen (2) und (4) in Gegenwart von bis zu etwa 1 Vol./Vol.-% eines relativ hydrophilen Detergens durchgeführt werden.

16. Verfahren nach Anspruch 15, dadurch gekennzeichnet, daß das Detergens unter den Salzen eines Alkylbenzolsulfonats ausgewählt wird.

17. Verfahren nach Anspruch 16, dadurch gekennzeichnet, daß als Detergens Natrium- oder Ammoniumsalze von Dodecyl- und/oder Laurylbenzolsulfonat verwendet werden.

18. Verfahren zur Herstellung eines lagerbeständigen Träger-Ligand-Komplexes für immunologische Tests, gekennzeichnet durch

(1) Vorlegen eines festen oder teilchenförmigen Trägers oder einer Matrix für den Test,

(2) Binden eines vorbestimmten Proteins an die Oberfläche des Trägers und

(3) Zusammenbringen des Trägers, an den das Protein gebunden ist, mit einer Lösung von zwischen 0,01 und 5 Gew./ Vol.-% eines Polyalkylenglykols.

19. Verfahren nach Anspruch 18, dadurch gekennzeichnet, daß als Polyalkylenglykol Polyethylenglykol verwendet wird.

■ 20. Verfahren nach Anspruch 18, dadurch gekennzeichnet, daß als Träger Polystyrol, Polyvinylchlorid oder Glas verwendet wird.

21. Satz für ein Testverfahren, dadurch gekennzeichnet, daß er den lagerbeständigen Träger und/oder die Zusammensetzung gemäß einem der Ansprüche 1 bis 6 enthält.