FI90799B - Immunologisia määritysmenetelmiä ja niissä käytettävä reagenssi - Google Patents

Description

90799

Immunologisia määritysmenetelmiä ja niissä käytettävä rea-genssi

Keksinnön ala 5 Tämä keksintö koskee menetelmää, jossa saadaan li neaarinen standardikäyrä kerrostyyppisessä (sandwich type) immunologisessa määrityksessä.

Keksinnön taustaa Tämä keksintö, niin kuin muut immunologiset määri-10 tykset, on menetelmä antigeenin läsnäolon tai sen määrän määrittämiseksi nestemäisessä näytteessä, kuten potilaan veressä tai virtsassa. Toisin kuin muut immunologiset määritystekniikat, puheena oleva keksintö yksinkertaistaa immunologisen määrityksen tekniikkaa tarjoamalla käytet-15 täväksi menetelmän, jossa saadaan lineaarinen standardi-käyrä, erityisesti tilanteessa, jossa on mitattava korkeita antigeenin pitoisuuksia.

Antigeeni on aine, yleensä proteiini tai hiilihydraatti, joka kehoon joutuessaan stimuloi vasta-aineentuo-20 tantoa. Yksi esimerkki antigeenistä on tautia aiheuttava vieras aine kehossa, kuten virus.

Toinen esimerkki antigeenistä on aine, joka on todisteena kehon tietystä tilasta. Sellaiset antigeenit ovat diagnostisesti tärkeitä. Esimerkiksi antigeenin IgE (im-25 munoglobuliini E) läsnäolo on merkkinä allergiatilasta, kun taas antigeeni hCG (ihmisen korionigonadotropiini) on osoitus raskaudesta. Antigeeniä ferritiini, rautaa sisältävää proteiinia, yleensä mitataan osoituksena toisesta kahdesta tilasta: (1) anemiasta (jossa ferritiiniä on läs-30 nä suhteellisen pieninä pitoisuuksina) ja (2) rautayli-kuormituksesta (jossa ferritiiniä on läsnä suhteellisen korkeina pitoisuuksina). Nämä ovat vain muutamia malliesimerkkejä antigeeneistä, jotka ovat diagnostisesti hyödyllisiä immunologisissa määrityksissä.

35 Immunologiset määritystekniikat perustuvat komplek- 2 sin muodostumiseen määritettävänä olevan antigeenin ja vasta-aineen tai vasta-aineiden välille. Vasta-aineet ovat reagensseja, jotka lisätään immunologisen määritysmenette-lyn aikana. Tarjolla on keinoja, joilla kompleksoituneiden 5 antigeenin ja vasta-aineen määrä on havaittavissa. Tavallisesti havaitseminen saadaan aikaan käyttämällä leimaa.

Leima voi esimerkiksi olla radioaktiivinen leima, kuten 125 I , entsyymileima, kuten piparjuuren peroksidaasi (HPRO), tai fluoresoiva leima kuten fluoreseiini, vaikka 10 muutkin leimauskeinot ovat mahdollisia. Leima kiinnitetään toiseen jäsenistä, jotka muodostavat antigeeni:vasta-aine -kompleksin, ja se yleensä havaitaan ja/tai kvantitoidaan kun kompleksoidut leimatut antigeeni ja vasta-aine on erotettu kompleksoitumattomasta leimatusta antigeenistä tai 15 vasta-aineesta.

On olemassa useita tunnettuja menetelmiä, joissa käytetään vasta-aineita, jotka on leimattu analyyttisesti tunnistuskelpoisiksi. "Kerros"- ("sandwich") eli "kahden kohdan" tekniikkoihin kuuluu kompleksin muodostuminen an-20 tigeenin ja kahden vasta-aineen välille, jotka sitoutuvat kahteen eri kohtaan antigeenin pintaa niin, että antigeenin sanotaan olevan kerrostuneena ("sandwiched") kahden vasta-aineen väliin, kuten esitetään yhdysvaltalaisessa patentissa nro 4 016 143. Tarkoituksenmukainen menetelmä 25 tällaisissa tekniikoissa muodostuvan vasta-aine:antigee ni: vasta-aine -kompleksin määrän havaitsemiseksi on hankkia käytettäväksi ensimmäinen, leimaamaton vasta-aine sidottuna kiinteän faasin kantajaan ja toinen vapaa, leimattu vasta-aine. Tällä tavalla leima sitoutuu kiinteään kan-30 tajaan vasta-aine:antigeeni:vasta-aine -kerroksen kautta, ja leimattu kompleksi voidaan vaivatta eristää. Standardi-lähestymistavassa kiinteässä kantajassa olevan leiman määrä havaitaan ja/tai kvantitoidaan, vaikka, eräässä harvoin käytetyssä immunologisen kerrosmäärityksen muunnelmassa, 35 liuokseen jäävän leiman määrä voidaan mitata.

90799 3

Termejä ensimmäinen vasta-aine ja toinen vasta-aine käytetään tässä vain selvyyden vuoksi, eikä niiden ole tarkoitus osoittaa tai rajoittaa immunologisen reaktion suuntaa. Esimerkiksi, immunologisen määrityksen etenemis-5 tapa voi olla eteenpäin (forward mode), nopeasti eteenpäin (fast forward mode), samanaikaisesti (simultaneous mode) tai käänteisesti (reverse mode), kuten alalla tiedetään.

Ks. esimerkiksi yhdysvaltalainen patentti nro 4 736 110. Esimerkiksi antigeeni voi reagoida ensin sidotun vastalo aineen kanssa ja sitten leimatun vasta-aineen kanssa tai päinvastoin. Reaktiot voivat myös tapahtua samanaikaisesti. "Fast forward"- ja "simultaneous"-määritysten ollessa kyseessä, käytetään vain yhtä inkubaatiota kompleksin muodostuksen aikaansaamiseksi, kun taas "forward"- ja "rever-15 se"-määritykset vaativat ainakin kaksi inkubaatiota. Yhtä tai useampaa inkubaatiota noudattaen, leima jää kiinni kantajaan liukenemattomaksi tehty vasta-aine:antigeeni:-leimattu vasta-aine -kerroksen kautta. Leimatun vasta-aineen määrä kiinteässä kantajassa tai liuokseen jääneen 20 leiman määrä voidaan sitten määrittää.

Immunologisesta kerrosmäärityksestä on tullut hou-kutteleva laajoissa piireissä kliinisten ja diagnostisten kokeiden teollisuudessa sen spesifisyyden korkean asteen vuoksi. Kuitenkin tämän tyyppisellä immunologisella määri-25 tyksellä on usein vaikea tuottaa todellista lineaarista standardikäyrää. Mitä todellisella lineaarisella standar-dikäyrällä tarkoitetaan, on standardikäyrä, joka on suhteellisen lineaarinen, siis yleensä 90-105 % lineaarinen systeemin itsensä tuottamana. Tämä täytyy erottaa visuaa-30 lisesti lineaarisesta standardikäyrästä, jossa suhteellinen lineaarisuus on saatu aikaan matemaattisen käsittelyn avulla.

Siinä määritysten erityisessä tapauksessa, jossa huomattava määrä antigeeniä on mitattavana, todellisen 35 lineaarisen standardikäyrän tuottaminen on usein mahdoton 4 tehtävä. Tämä johtuu siitä, että antigeeni, kun sitä on läsnä huomattavassa määrin, ei pysty toimimaan reaktiosys-teemin rajoittavana tekijänä. Sitä vastoin, missä mielenkiinnon kohteena olevaa antigeeniä on läsnä riittävän pie-5 nessä määrin, antigeenistä tulee rajoittava tekijä immunologisessa määrityksessä, muodostaen näin luonnollisesti pseudo-ensimmäisen kertaluvun reaktion ja tuottaen lineaarisen standardikäyrän.

Taustaksi, kemiallisia reaktioita voidaan luokitel-10 la kineettisin perustein, siis niiden kertaluvun mukaan, riippuen tavasta, jolla reagoivien aineiden pitoisuus vaikuttaa reaktionopeuteen tietyissä olosuhteissa. Ensimmäisen kertaluvun reaktio on sellainen, joka etenee nopeudella, joka on suoraan verrannollinen vain yhden reagoivan 15 aineen pitoisuuteen. Yksinkertaisin esimerkki ensimmäisen kertaluvun reaktiosta on se, jossa reaktion A -> P nopeus on täysin verrannollinen A:n pitoisuuteen. Näin tapahtuu esimerkiksi isotooppihajoamisen tapauksessa. Ensimmäisen kertaluvun reaktioon perustuva määritys tuottaa yleensä 20 lineaarisen standardikäyrän.

Toisen kertaluvun reaktiossa reaktionopeus on verrannollinen kahden reagoivan aineen pitoisuuksien tuloon tai yhden reagoivan aineen pitoisuuden toiseen potenssiin. Esimerkki ensimmäisestä on reaktio A + B -> P. Esimerkki 25 jälkimmäisestä on reaktio 2A -> P. Toisen kertaluvun reaktioon perustuva määritys, erityisesti ensimmäistä tyyppiä olevaan toisen kertaluvun reaktioon, tavallisesti tuottaa epälineaarisen standardikäyrän. Tämä johtuu siitä, että reaktionopeus riippuu useamman kuin yhden reagoivan aineen 30 pitoisuudesta. Tämä pätee kolmannen kertaluvun reaktioil le, neljännen kertaluvun reaktioille ja niin edelleen.

Toisen kertaluvun reaktio, kuten A + B -> P, tai esimerkiksi kolmannen kertaluvun reaktio, kuten A + B + C -> P, voi tietyissä olosuhteissa vaikuttaa ole-35 van ensimmäistä kertalukua. Esimerkiksi, jos B:n ja/tai n 90799 5

Csn pitoisuudet ovat hyvin korkeat ja As n on hyvin matala, reaktio saattaa vaikuttaa olevan ensimmäistä kertalukua, koska sen nopeus on lähes verrannollinen vain yhden reagoivan aineen pitoisuuteen, nimittäin A:n. Tässä tapauk-5 sessa A toimii reaktionopeutta rajoittavana tekijänä. Näissä erityisissä olosuhteissa reaktio on näennäinen ensimmäisen kertaluvun eli pseudo-ensimmäisen kertaluvun reaktio.

Immunologista kerrosmääritystä voidaan yleisesti 10 pitää kolmannen kertaluvun reaktiona, jota esittää yhtälö: 0-Ab1 + Ag + Ab2* -> 0-Ab1-Ag-Ab2* jossa O-Abj on liukenemattomaksi tehty vasta-aine, Ag on 15 mielenkiinnon kohteena oleva antigeeni ja Ab2* on leimattu vasta-aine, joka täydentää kerroksen. Kyseen ollessa immunologisesta kerrosmäärityksestä, jossa mielenkiinnon kohteena oleva antigeeni on hyvin pienessä pitoisuudessa, antigeeni luonnollisesti toimii kokonaisreaktion nopeutta 20 rajoittavana tekijänä. Näin tässä rajoitetussa sovellutuksessa immunologisesta reaktiosta tulee pseudo-ensimmäisen kertaluvun reaktio, jonka reaktionopeus on lähes verrannollinen mitattavaksi haluttuun antigeenin konsentraati-oon. Tämä tekee mahdolliseksi lineaarisen standardikäyrän 25 tuottamisen.

Laajemmissa sovellutuksissa, joissa mielenkiinnon kohteena oleva antigeeni ei ole läsnä riittävän pienissä määrin toimiakseen luonnollisesti nopeutta rajoittavana tekijänä koko immunologiselle reaktiolle, saadaan tulok-30 sena epälineaarinen standardikäyrä. Olisi haluttavaa myös saada lineaarinen standardikäyrä aikaan tämän tyyppisissä immunologisissa kerrosmäärityksissä useista syistä. Muun muassa lineaarinen standardikäyrä mahdollistaa yhden pisteen kalibroinnin aikaansaamisen, joka vuorostaan johtaa 35 pienempiin kustannuksiin immunologisen määrityksen käytös- 6 sä kuin myös lisääntyneeseen käyttömukavuuteen. Yhden pisteen kalibroinnin tarpeisiin yksittäinen standardi tehdään nollakokeen ohella. Standardi antaa yksittäisen pisteen, kun taas nollakoe määrittelee standardikäyrän leikkauspis-5 teen y-akselilla. Koska standardikäyrä on suora viiva, tarvitaan vain kaksi pistettä käyrän määrittelemiseksi. Yksi ainoa muunnoskerroin voidaan laskea tästä käyrästä.

Puheen ollessa epälineaarisesta standardikäyrästä, keskimäärin viisi standardia joudutaan tekemään standar-10 dikäyrän kuvaajan piirtämiseksi. Tämä käy melko kalliiksi siellä, missä tehdään uusi standardikäyrä jokaista immunologisen määrityksen sarjaa varten. Lisäksi, lineaarisesta standardikäyrästä saadaan tarkempia tuloksia kuin epälineaarisesta standardikäyrästä. Tämä johtuu siitä, että epä-15 lineaarisen standardikäyrän käyränsovitukseen väistämättä sisältyy tietty määrä virhettä.

Näistä syistä useita yrityksiä on tehty lineaaristen standardikäyrien aikaansaamiseksi immunologisissa ker-rosmäärityksissä, jotka on suunniteltu mittaamaan antigee-20 niä, joka ei ole läsnä tarpeeksi pienessä pitoisuudessa antaakseen pseudo-ensimmäisen kertaluvun reaktion tyypillisissä määritysolosuhteissa.

Yksi tavallisimmista lähestymistavoista tähän ongelmaan on ollut säätää seuraavia kahta immunologiseen 25 kerrosmäärityssysteemiin kuuluvaa parametriä: (1) liukenemattomaksi tehdyn ensimmäisen vasta-aineen määrää ja/tai (2) leimatun toisen vasta-aineen määrää. Tarkemmin, liukenemattomaksi tehdyn ensimmäisen vasta-aineen määrää ja/tai leimatun toisen vasta-aineen määrää lisätään tätä 30 lähestymistapaa noudatettaessa. Lisättäessä vasta-aineen pitoisuutta, antigeenistä tulee reaktionopeutta rajoittava tekijä systeemissä, ja pseudo-ensimmäisen kertaluvun reaktio muodostuu. Näitten parametrien säätäminen on kuitenkin rajoitettua sovellettaessa sitä käytäntöön.

35 Ensimmäinen parametri koskee liukenemattomaksi teh- li 90799 7 dyn ensimmäisen vasta-aineen ylimäärän lisäämistä immunologiseen määrityssysteemiin. Kuitenkin sitä määrää vasta-ainetta, joka voidaan tehdä liukenemattomaksi, välttämättä rajoittaa kiinteän kantajan määrä systeemissä, usein pin-5 nan määrä helmissä, ja käytetty päällystysmenetelmä. Toisin sanoen on olemassa äärellinen raja vasta-aineen määrälle, joka voidaan tehokkaasti sitoa tietyn kiinteän kantajan pinnalle.

Toinen säädettävissä oleva parametri tekniikan ta-10 son mukaisissa menetelmissä on leimatun vasta-aineen ylimäärän lisääminen. Tämäkin parametri on rajoitettu siinä mielessä, että leimattu vasta-aine, jota lisätään systeemiin, väistämättä lisää tausta-arvon tasoa normaalissa immunologisessa kerrosmäärityksessä. Systeemin tausta-arvo 15 määritetään mittauksella, joka saadaan, kun vain reagens-sia eikä lainkaan mitattavaa ainetta sisältävä nollakoe tehdään systeemissä. Immunologisessa määrityssysteemissä nollakoe ei sisällä antigeniä, sulkien näin pois mahdollisuuden liukenemattomaksi tehty vasta-aine:antigeenijlei-20 mattu vasta-aine -kerroskompleksin muodostumiseen immunologisessa kerrosmäärityksessä.

Ihanteellisessa immunologisessa kerrosmäärityssysteemissä leimattua vasta-ainetta ei pitäisi olla kiinnittyneenä kiinteään faasiin, kun nollakoe tehdään. Siis teo-25 reettisesti ei pitäisi pystyä havaitsemaan leiman läsnäoloa liukenemattomaksi tehdyssä kantajassa. Siitä huolimatta, epätäydellisissä olosuhteissa, joita noudattaen immunologisia määrityksiä tehdään, tietty määrä leimattua vasta-ainetta adsorboituu epäspesifisestä suoraan kiin-30 teään kantajaan immunologisen määrityksen aikana. Tämä epäspesifinen adsorptio myötävaikuttaa kohonneeseen lukemaan nollakokeessa, siis liukenemattomassa kantajassa havaittavissa olevaan leimaan, joka ei liity mitattavaksi halutun kerroksen muodostumiseen. Lisättäessä ylimääräistä 35 leimattua vasta-ainetta systeemiin, saadaan lisää epäspe- 8 sifistä adsorptiota ja siten korkeampi tausta-arvon taso. Kohonnut tausta-arvon taso vaikuttaa haitallisesti immunologisen määrityksen herkkyyteen. Tekniikan tason mukaista leimatun vasta-aineen ylimäärän lisäämistä rajoittaa siksi 5 se kohonneen tausta-arvon määrä, jonka immunologinen määritys pystyy sietämään herkkyyttä menettämättä.

Edelleen toinen lähestymistapa, jota on käytetty, liittyy standardikäyrän matemaattiseen käsittelyyn visuaalisesti lineaarisen standardikäyrän aikaansaamiseksi. 10 Tämä on vastakohtana ensimmäiselle edellä kuvatulle tekniikan tason mukaiselle lähestymistavalle, jossa vasta-aineiden tasoa systeemissä säädetään yritettäessä saada todellinen lineaarinen standardikäyrä. Nimellä logit-transformaatio tunnettu tekniikka on tämän toisen lähesty-15 mistavan takana. Hyvin yksinkertaisesti ilmaistuna, logit-transformaation tuloksena saadaan puoiilogaritminen kuvaaja absorbanssin ja antigeenin määrän suhteesta. Tällaisessa kuvaajassa absorbanssin ja antigeenin määrän suhdetta voidaan likimääräisesti kuvata lineaarisella funktiolla 20 rajoitetulla analyysialueella, kuten Sorensen on kuvannut, Scand. J. Clin. Lab. Invest.. 42., 577-589 (1982).

Linearisaatiota logit-transformaatiolla ovat laajemmin kuvanneet Williams et ai., J. Immunological Methods . 85. 179-294 (1985). Yleensä nämä menettelyt vaativat 25 suhteellisen hienostuneita tietokoneita suorittamaan epälineaarisen standardikäyrän edustaman yhtälön pienimmän neliösumman ratkaisun. Vaikka muunnetun käyrän lineaarinen aproksimaatio voidaan tehdä tämän lähestymistavan pohjalta, ja konversiokerroin voidaan laskea arvoista, täyden 30 standardikäyrän ennemmmin kuin yksittäisen standardin tekemisen tarve jää jäljelle.

Sittemmin Zvaigzne et ai., Clin. Chem.. 32.(3), 437-440 (1986), kehittivät menettelyn jossa epälineaarinen standardikäyrä tallennetaan tietokoneeseen. Sitten Zvaigne 35 et ai. tekivät yksittäisen standardin seuraavien määritys- 90799 9 ten kohdalla määrittääkseen uudelleen transformoidun epälineaarisen standardikäyrän leikkauspisteen y-akselilla. Tässä mielessä Zvaigne et ai. pääsevät eräänlaiseen yhden pisteen kalibraatioon menetelmänsä yhteydessä. Tämä lähes-5 tyrnistäpä kuitenkin toimii vain erittäin stabiileissa rea-genssisysteemeissä. Lisäksi menetelmä vaatii suhteellisen hienostunutta tietokoneistettua laitteistoa, eikä se pysty täydellisesti helpottamaan tiettyä virheen määrää, joka sisältyy väistämättä käyränsovitusmenetelmään.

10 Niinpä on olemassa tarve menetelmälle, joka antaa käytettäväksi todellisen lineaarisen standardikäyrän immunologisissa kerrosmäärityksissä, jotka on suunniteltu havaitsemaan ja/tai mittaamaan niin suuressa määrin läsnä olevaa antigeeniä, että tekniikan tason mukaiset säädöt 15 immunologisessa määrityssysteemissä eivät pysty antamaan lineaarista standardikäyrää. Puheena olevan keksinnön on tarkoitus tarjota käytettäväksi sellainen menetelmä. Edelleen puheena olevan keksinnön on tarkoitus tarjota käytettäväksi menetelmä standardikäyrän kalibroimiseksi, jossa 20 tarvitsee tehdä vain yksi standardi, ja jota yksittäistä standardia voidaan käyttää muunnos kertoimen valmistamiseen ilman hienostunutta ja/tai kallista tietokoneistettua laitteistoa.

Keksinnön yhteenveto 25 Puheena olevan keksinnön mukaan ylimäärä ensimmäis tä vasta-ainetta, joka ei ole kiinteään kantajaan sidottu ja/tai ylimäärä leimaamatonta, vapaata toista vasta-ainetta lisätään immunologiseen määrityssysteemiin. Jälleen, termejä ensimmäinen vasta-aine ja toinen vasta-aine käyte-30 tään selvyyden vuoksi, eikä niiden ole tarkoitus rajoittaa keksintöä. Ensimmäisen vapaan, leimaamattoman vasta-aineen tarvitsee vain toimia analogina liukenemattomaan kantajaan sidotulle ensimmäiselle vasta-aineelle. Ensimmäinen vapaa, leimaamaton vasta-aine voi tosiaan olla eri vasta-aine 35 kuin ensimmäinen vasta-aine, joka on tehty liukenematto- 10 maksi. Sama pätee vapaaseen leimaamattomaan toiseen vasta-aineeseen. Siis se voi olla eri vasta-aine kuin leimattu toinen vasta-aine, jolle se toimii analogina.

Ensimmäisen vasta-aineen, joka ei ole sidottu liu-5 kenemattomaan kantajaan, lisäystä ei rajoita liukenemattoman kantajan saatavissa oleva pinta-ala. Leimaamattoman toisen vasta-aineen lisäys ei kohota immunologisen määrityksen tausta-arvoa. Näistä analogeista toisen tai molempien lisäys kuitenkin mahdollistaa pseudo-ensimmäisen ker-10 taluvun reaktion aikaansaamisen ja siten lineaarisen stan-dardikäyrän. Keksinnön mukaisille menetelmille ja reagens-seille on tunnusomaista se, mitä patenttivaatimuksissa esitetään. Keksinnön edut verrattuna tekniikan tason mukaisiin menetelmiin tulevat selviksi mukana olevien piir-15 rosten ja seuraavan keksinnön yksityiskohtaisen kuvauksen tarkastelun jälkeen.

Piirrosten lyhyt kuvaus

Kuva 1 on kaavio, joka esittää hCG:n (ihmisen ko-rionigonadotropiinin), jota yleensä esiintyy hyvin pieniä 20 määriä, immunologisessa määrityksessä aikaansaatua lineaarista standardikäyrää tyypillisissä immunologisen määrityksen olosuhteissa vain tekniikan tason mukaisia säätöjä tehtynä systeemiin.

Kuva 2 on kaavio, joka esittää ferritiinin immuno-25 logisessa määrityksessä tyypillisissä tekniikan tason mu kaisissa immunologisen määrityksen olosuhteissa aikaansaatua epälineaarista standardikäyrää ja puheena olevan keksinnön opetuksia noudattaen aikaansaatua lineaarista standardikäyrää.

30 Kuva 3 on kaavio, joka esittää IgEsn (immunoglohu iini E:n) immunologisessa määrityksessä tyypillisissä tekniikan tason mukaisissa immunologisen määrityksen olosuhteissa aikaansaatua epälineaarista standardikäyrää ja puheena olevan keksinnön opetuksia noudattaen aikaansaatua 35 lineaarista standardikäyrää.

Il 90799 11

Keksinnön yksityiskohtainen kuvaus Puheena olevan keksinnön mukaan ylimäärä ensimmäistä vasta-ainetta, joka ei ole kiinteään kantajaan sidottu ja/tai ylimäärä leimaamatonta, vapaata toista vasta-ainet-5 ta lisätään immunologiseen kerrosmäärityssysteemiin. Yllättäen jommankumman tai molempien näistä vasta-aineista lisäämisen huomattiin lisäävän immunologisen määrityksen säätämiseen käytettävissä olevia parametrejä. Tämä teki mahdolliseksi saada todellinen lineaarinen standardikäyrä 10 immunologisissa määrityksissä, joissa mielenkiinnon kohteena olevaa antigeeniä on läsnä riittävän suurissa määrin, että todellinen lineaarinen standardikäyrä ei tavallisesti ole saatavissa tekniikan tason mukaisilla menetelmillä.

15 Puheena oleva keksintö tarjoaa käytettäväksi kaksi lisäparametriä immunologisen kerrosmäärityksen säätämiseen pseudo-ensimmäisen kertaluvun reaktion ja siten lineaarisen standardikäyrän saamiseksi. Puheena olevan keksinnön mukaisesti kaksi lisäparametriä ovat kahden lisäreagenssin 20 tai -analogin muodossa, joita lisätään immunologiseen ker-rosmääritykseen johdattamaan liikaa antigeeniä pois halutusta lopputuotteesta. Tämä johdattuminen saadaan aikaan sillä, että uusia sivutuotteita muodostuu tavallisesti immunologisessa kerrosmäärityksessä muodostuvien lisäksi.

25 Tekniikan tason mukaiset immunologiset kerrosmää- ritykset tavallisesti tuottavat vain pienen määrän seuraa-via sivutuotteita haluttuun reaktioon, joka tuottaa O-At^-Ag-Ab2* -lopputuotteen: I. O-Al^-Ag (epätäydellinen kerros) 30 II. Ag-Ab2* (epätäydellinen kerros)

Leimattu sivutuote, Ag-Ab2* (II), on liukoinen eikä osaltaan lisää sitoutuneen leiman määrää, joka normaalisti korreloidaan näytteen sisältämään antigeenin määrään. Siinä epätavallisessa tilanteessa, että liuokseen jäävää va-35 paan leiman määrää havaitaan osoituksena tutkittavan näyt- 12 teen sisältämästä antigeenimäärästä, leimattu sivutuote (II) osaltaan hieman lisää signaalia.

Kun vain vapaata ensimmäistä vasta-ainetta lisätään immunologiseen määrityssysteemiin, puheena olevan keksin-5 nön opetusten mukaisesti, seuraavia sivutuotteita muodostuu sivutuotteiden I ja II lisäksi: III. Ab^Ag-Ab^ (vapaa, leimattu kerros) IV. Abx-Ag (epätäydellinen kerros)

Kun vain vapaata, leimaamatonta toista vasta-ainetta lisä-10 tään immunologiseen määrityssysteemiin, eri sivutuotteita muodostuu sivutuotteiden I ja II lisäksi: V. 0-Ab1-Ag-Ab2 (sitoutunut leimaamaton kerros) VI. Ag-Ab2 (epätäydellinen kerros)

Siinä tapauksessa, että sekä vapaata, leimaamatonta ensim-15 mäistä vasta-ainetta että vapaata, leimaamatonta toista vasta-ainetta lisätään immunologiseen määrityssysteemiin puheena olevan keksinnön opetusten mukaisesti, kaikkia sivutuotteita I-VI muodostuu, kuin myös vielä seuraavaa s ivutuotetta: 20 VII. 0-Ab1-Ag-Ab2

Sivutuotteiden III-VII kohdalla, ainoa uusi leimattu puheena olevaa keksintöä noudattaen muodostuva sivutuote, Ab1-Ag-Ab2* (III), on liukoinen eikä osaltaan lisää liukenemattomassa kantajassa havaittavan signaalin määrää.

25 Sivutuotteita on perinteisesti pidetty ei-toivot- tavina immunologisissa määrityksissä. Tämä johtuu siitä, että reaktion sivutuotteet kuluttavat pieniä määriä mielenkiinnon kohteena olevaa antigeeniä, eivätkä silti edus ta toivottua lopputuotetta, joka pyritään havaitsemaan 30 ja/tai kvantitoimaan. Siinä tapauksessa, että liukenemattomaan kantajaan sitoutuneen leiman määrä havaitaan osoituksena määritettävänä olevan näytteen sisältämästä antigeenin määrästä, kuten tilanne yleensä on, sivutuote ei lainkaan, ole mukana mitattavassa signaalissa. Reaktion 35 sivutuotteen lisääntyneen muodostumisen on perinteisesti 90799 13 katsottu vähentävän immunologisen määrityksen luotettavuutta.

On kuitenkin odottamatta havaittu, että uudet sivutuotteet, joita muodostuu puheena olevaa keksintöä nouda-5 tettaessa, eivät vaikuta haitallisesti immunologisen määrityksen tarkkuuteen. Tämä johtuu siitä, että sivutuotteiden muodostumisnopeudella näyttää olevan vakiosuhde näytteen sisältämään antigeenin määrään. Toisin sanoen lisääntynyt antigeenipitoisuus johtaa lisääntyneeseen sivutuot-10 teiden muodostumiseen, ja tämän lisääntymisen huomattiin tapahtuvan suoraviivaisesti.

Havaittiin myös, että puheena olevan keksinnön vapaa ensimmäinen vasta-aine toimii analogina kiinteään kantajaan sidotulle ensimmäiselle vasta-aineelle tyypillises-15 sä immunologisessa kerrosmäärityksessä. Samaten puheena olevan keksinnön leimaamaton toinen vasta-aine toimii analogina leimatulle toiselle vasta-aineelle immunologisessa kerrosmäärityksessä. Nämä analogit, yksittäin tai yhdessä, nostavat tehollisesti ensimmäisen vasta-aineen ja/tai toi-20 sen vasta-aineen pitoisuutta immunologisessa määrityssys-teemissä suhteessa määritettävänä olevaan antigeenin määrään, luoden näin pseudo-ensimmäisen kertaluvun reaktion. Tähän periaatteeseen pohjautuen todellisia lineaarisia standardikäyriä on saatu immunologisissa määrityksissä, 25 joissa tyypillisesti antigeenipitoisuus on riittävän suuri niin, että tekniikan tason mukaiset menetelmät todellisen lineaarisen standardikäyrän saamiseksi ovat osoittautuneet tehottomiksi tai riittämättömiksi.

Puheena olevan keksinnön edut, verrattuna tekniikan 30 tason mukaisiin menetelmiin todellisen lineaarisen standardikäyrän saamiseksi immunologisessa kerrosmäärityksessä, nähdään seuraavien esimerkkien yhteydessä. Yksinkertaisuuden ja selvyyden niinissä seuraavat esimerkit esittävät vain keksinnön sen puolen, joka hyödyntää vapaan en-35 simmäisen vasta-aineen lisäystä, ollen ymmärrettyä, että 14 leimaamattoman toisen vasta-aineen lisäys toimii vastaavalla tavalla.

Näissä esimerkeissä samanaikaisia immunologisia kerrosmäärityksiä tehtiin käyttäen polystyreenihelmelle 5 päällystettyä ensimmäistä vasta-ainetta ja piparjuuren pe-roksidaasiin (HRPO), joka toimii entsyymileimana, konju-goitua toista vasta-ainetta. Polystyreenihelmet päällystettiin mahdollisimman täyteen tiettyä immunologista määritystä varten tarkoitetulla ensimmäisellä vasta-aineella. 10 Leimatun toisen vasta-aineen määrä kvantitoitiin HRPO-ent-syymiaktiivisuuden mukaan, yhden yksikön HRPO-aktiivisuut-ta vastatessa karkeasti 1 μg leimattua vasta-ainetta. Ensimmäisen inkubaation jälkeen, jossa vasta-aine:antigeeni: vasta-aine -kompleksi muodostui, liukenematon kompleksi 15 eristettiin ja pantiin toiseen inkubaatioon, johon oli lisätty entsyymileiman substraattiliuos havaittavan signaalin tuottamiseksi. Sitten liukenemattomaan kantajaan sitoutuneen leiman määrä kvantitoitiin.

Esimerkki 1 20 Reagenssit: 1) Helmet: Ab1:llä päällystetty polystyreenihelmi 2) Konjugaattiliuos: puskuria, eläinproteiinia ja

Ab2-HRPO

3) Substraattiliuos: puskuria, H202 ja o-feny- 25 leenidiamiinia (OPD)

Menetelmä:

Konjugaattiliuos sisältää 0,5 Y Ab2-HRPO:a. Määritys suoritetaan inkuboimalla 20 μΐ näytettä 250 μ1:η konju-gaattiliuosta ja Ab^päällystetyn helmen kanssa 20 minuut-30 tia huoneenlämpötilassa ravistelussa. Ensimmäisen inkuba-tion jälkeen helmi pestään ja inkuboidaan taas 300 μΐ substraattiliuosta kanssa 20 minuuttia huoneenlämpötilassa. Sitten reaktio pysäytetään 1,0 ml:11a 0,9 N rikkihappoa ja absorbanssi aallonpituudella 492 nm mitataan spekt-35 rofotometrillä. Taulukko I on yhteenveto tuloksista, jotka li 90799 15 näkyvät myös kuvassa 1.

Taulukko I

Absorbanssi aallonpituudella 492 nm hCG (mKY/1) 10 25 50 100 200 300 400 5 0,045 0,11 0,22 0,42 0,778 1,25 1,59 Tämä esimerkki valaisee hCG:n (ihmisen korioni-gonadotropiinin) immunologista kerrosmääritystä tyypillisissä määritysolosuhteissa. Tavallisesti hCG-antigeeniä on 10 läsnä suhteellisesti hyvin pieninä määrinä, mikä siten vaatii äärimmäisen herkkää määritysmenetelmää. Mittausalue hCG:lle tutkittavassa näytteessä on suunnilleen 1-100 mKY/ml, eli suunnilleen 2 x 10”*^ M - 2 x 10”*® M. Reak-tioseoksessa itsessään todellinen pitoisuus on alle 10”** 15 M. Tämä pitoisuus on riittävän matala, että tekniikan tason mukainen lähestymistapa, Ab2*:n pitoisuuden lisääminen, on tehokas olosuhteiden aikaansaamiseksi kinetiikaltaan pseudo-ensimmäisen kertaluvun reaktiolle ja siten lineaariselle standardikäyrälle.

20 Esimerkki 2

Reagenssit: 1) Helmet: Ab^llä päällystetty polystyreenihelmi

2) Konjugaattiliuos: puskuria, eläinproteiinia ja Ab2-HRPO

25 3) Substraattiliuos: puskuria, H202 ja o-fenylee- nidiamiinia (OPD)

Menetelmä: Määritykset suoritettiin inkuboimalla 25 μΐ näytettä 300 μ1:η konjugaattiliuosta ja Ab^päällystetyn hel-30 men kanssa 45 minuuttia huoneenlämpötilassa, mitä seurasi helmen pesu ja toinen inkubatio substraattiliuoksessa. Sitgten reaktio pysäytettiin 1,0 ml:11a 0,9 N rikkihappoa ja absorbanssi aallonpituudella 492 nm mitattiin spektro-fotometrillä. Taulukko II on yhteenveto tuloksista, jotka 35 näkyvät myös kuvassa 2.

16

Taulukko II

Absorbanssi aallonpituudella 492 nm Konjugaattiliuos 2. inkubaatio 200 ng/ml 500 5 ng/ml A. 0,003 Y Ab2-HRP0/ml 15 min 1,15 1,79 B. 0,07 Y Ab2-HRP0/ml 3 min 1,09 2,19 C. 0,07 Y Ab2-HRP0/ml yhdessä 0,15 μg Ab1/ml 10 kanssa 5 min 0,43 1,13 D. Sama kuin C 10 min 0,76 1*95 Tämä esimerkki valaisee ferritiinin tyypillisissä määritysolosuhteissa tehtyä immunologista kerrosmääritystä 15 (A), käyttäen tekniikan tason mukaisia säätöjä systeemille (B) ja viimeiseksi käyttäen tämän keksinnön opetuksia (C) tarkoituksena lopuksi saada todellinen lineaarinen stan- dardikäyrä. Ferritiinin tapauksessa määritysalue 5-500 ng/ml keskimääräisessä seeruminäytteessä vastaa pitoisuus- -10 -9 20 aluetta noin 1x10 -1x10 M. Ferritiinin lopulli nen pitoisuus reaktioseoksessa on suunnilleen 10”*^ M. Kuten kuvassa 2 on osoitettu, ilman mitään systeemin säätöjä, paitsi Abx:n maksimaalista lataamista polystyreeni-helmeen, standardikäyrä on vain 60 % lineaarinen määritys-25 alueen yläpäässä. Ab2*:n 50-kertaisen ylimäärän lisäys paransi standardikäyrän lineaarisuutta vain 80 % asti.

Vapaata eli liukoista Ab1:tä tuotiin reaktioseok-seen toimimaan O-Abj-analogina. Liukoisen Abx:n lisäyksen uskotaan luoneen aiemmin identifioidut sivutuotteet III ja 30 IV seuraavan mukaisesti:

Abj + Ag + Ab2* -> Abx-Ag-Ab2* (III)

Abx + Ag -> Abx-Ag (IV)

Liukoisen Abx:n lisäys vähensi 0-Abx-Ag-Ab2*: n muodostumis-nopeutta ja tuotti matalamman signaalin kuten käyrästä C 35 kuvassa 2 ilmenee. Kuitenkin Abx:n läsnäolo 0-Abx:n lisäksi 90799 17 toimi pseudo-ensimmäisen kertaluvun reaktion ja lineaarisen käyrän luomiseksi. Signaali parani lisäämällä toisen inkubaation aika kymmeneen minuuttiin (D).

Esimerkki 3 5 Reagenssit: 1) Helmet: AbL:llä päällystetty polystyreenihelmi 2) Konjugaattiliuos: puskuria, eläinproteiinia ja

Ab2-HRP0 3) Substraattiliuos: puskuria, H202 ja o-fenylee 10 nidiamiinia (OPD)

Menetelmä:

Koe toteutettiin inkuboimalla 20 μΐ näytettä 300 μ1:η konjugaattiliuosta ja Ab^päällystetyn helmen kanssa huoneenlämpötilassa 30 minuuttia ravistelussa. Sit-15 ten helmi pestiin, inkuboitiin uudelleen 300 μ1:η subst-raattiliuosta kanssa, pysäytettiin 1 ml:11a 0,9 N rikkihappoa ja mitattiin aallonpituudella 492 nm. Taulukko 3 vertailee IgE-reagenssien suorituskykyä yhdistettyjen tekniikan tason opetusten ja puheena olevan keksinnön opetus-20 ten mukaisten muutosten kanssa ja niitä ilman.

Taulukko III

Absorbanssi aallonpituudella 492 nm Konjugaattiliuos IgE (KY/ml) 10 25 75 200 400 25 A. 0,02 Y Ab2-HRPO/ml 0,15 0,22 0,80 1,53 1,9 B. 0,1 Y Ab2-HRPO/ml ja 0,15 pg Ab^ml 0,04 0,105 0,39 1,0 1,9 Tämä esimerkki valaisee IgE:n (immunoglobuliini 30 E:n) immunologista kerrosmääritystä tyypillisissä määri-tysolosuhteissa tehtynä (A), ja myös hyödyntäen tekniikan tason mukaisten systeemien säätöjen ja tämän keksinnön opetusten yhdistettyä vaikutusta (B) todellisen lineaarisen standardikäyrän saamiseksi.

18

Mittausalueella noin 5-400 KY/ml tutkittavassa -10 -9 näytteessä, IgE:n lopullinen pitoisuus on 10 - 10 reaktioseoksessa. Ilman immunologisen määrityssysteemin parametrien asianmukaista säätöä standardikäyrä on alle 50 5 % lineaarinen mittausalueen yläpäässä. Melko suuri määrä

Ab2*:ta ja liukoista Abx:tä lisättiin tuottamaan lineaarinen käyrä (kuva 3). Tämä koe osoittaa, että puheena oleva keksintö kykenee käsittelemään äärimmäisiä tapauksia kuten IgE ilman mitään vaikeuksia.

10 Kuvissa 1, 2 ja 3 näkyvien kuvaajien vertailu osoittaa puheena olevan keksinnän tehokkuuden. Odottamatta havaittiin, että puheena olevan keksinnön opetusten hyödyntäminen antaa mahdollisuuden mennä tekniikan tason mukaisten rajoitusten tuolle puolen ja siten saada todelli-15 nen lineaarinen standardikäyrä immunologisissa määrityksissä, joissa mielenkiinnon kohteena olevan antigeenin pitoisuus on suhteellisen korkea.

Antigeeni hCG esimerkiksi, joka tavallisesti on reaktioseoksessa pienemmässä pitoisuudessa kuin noin 10“** 20 M, soveltuu käsiteltäväksi tehokkaasti tekniikan tason mukaisilla menetelmillä. Ferritiini ja IgE toisaalta ovat tavallisesti läsnä immunologisen määrityksen reaktioseoksessa noin 10”*® M ja noin 10”*® - 10”^ M pitoisuudessa vastaavasti. Nämä pitoisuudet ovat ainakin yhtä suuruus-25 luokkaa korkeammat kuin hCG-reaktioseoksen pitoisuus, ja siten vain tekniikan tason mukaisten parametrien säädöllä niiden käsittely on tehotonta. Puheena olevan keksinnön opetusten mukaanottamisen avulla kuitenkin todelliset lineaariset standardikäyrät saatiin ferritinin ja IgE:n im-30 munologisissa määrityksissä.

Edellä kuvatut esimerkit ovat ainoastaan mallikappaleita puheena olevan keksinnön käytöstä ferritiinin ja IgE:n immunologisissa kerrosmäärityksissä. Ammattimie-hille on ilmeistä, että muunnelmat juuri näissä esimer-35 keissä kuvatuista menetelmistä ovat hyödyllisiä muissa n 90799 19 immunologisissa määrityksissä. Näihin muihin immunologisiin määrityksiin kuuluvat määritykset hormoneille prolaktiini, HLH (ihmisen luteinisoiva hormoni), FSH (follikke-leita stimuloiva hormoni), gastriini, PTH (parathormoni), 5 HGH (ihmisen kasvuhormoni) ja ACTH (adrenokortikotropii-ni), tartuntataudille hepatiitti, tuumorimarkkereille CEA (karsinoembryonaalinen antigeeni), PAP (prostatan hapan fosfataasi ja alfa-fetoproteiini sekä CPK-MBslle (kreatii-nifosfokinaasi-MB:lie) ja insuliinille muiden muassa. Sikiö si puheena olevan keksinnön on katsottava olevan vain mu-kaanliitettyjen patenttivaatimusten rajoittama.

Kuten termiä tässä käytetään, "antigeenin" on tarkoitus sisältää mikä vain aine, jota vastaan vasta-aineita voidaan tuottaa, ja vastaavasti sen alaan sisältyvät 15 hapteenit, joista on voitu tehdä antigeenisiä vasta-aineiden tuottamistarkoituksessa.

Kuten termiä tässä käytetään, "vasta-aineen” on tarkoitus sisältää sekä polyklonaaliset että monoklonaaliset vasta-aineet ja lisäksi sisältää viittaus ehjiin 20 vasta-aineisiin ja niiden fragmentteihin, jotka sisältävät vasta-aineen sitoutumisalueen. Tällaiset fragmentit voivat olla Fab-tyyppisiä fragmentteja, jotka määritellään fragmentteina, joista puuttuu Fc-alue, esim. Fab-, Fab1- ja Ftab1)a-fragmentteja, tai ne voivat olla niin sanottuja 25 ”puolimolekyyli"-fragmentteja, jotka on saatu ehjän vasta-aineen raskasketjuosia yhdistävien disulfidisidosten pelkistävällä katkaisulla.

Claims (10)

1. Menetelmä antigeenin immunologisen määrityksen suorittamiseksi nestemäisessä näytteessä, tunnettu 5 siitä, että muodostetaan kompleksi antigeenin ja ainakin kahden vasta-aineen välille, yhden mainituista vasta-aineista ollessa ensimmäinen liukenemattomaan kantajaan sidottu vasta-aine ja yhden mainituista vasta-aineista ollessa toinen vapaa, leimattu vasta-aine, jolloin osa mai-10 nitusta leimatusta vasta-aineesta tulee sitoutuneeksi liu kenemattomaan kantajaan mainitun kompleksin välityksellä, ja että siihen lisätään lisävasta-aine valittuna ryhmästä, jonka muodostavat leimaamaton, vapaa ensimmäinen vasta-aine, leimaamaton, vapaa toinen vasta-aine ja niiden seok-15 set.

2. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että leimattu vasta-aine on leimattu jäsenellä ryhmästä, jonka muodostavat radioisotoopit, kerni -luminesoivat yhdisteet, bioluminesoivat yhdisteet, fluo- 20 resoivat yhdisteet, fosforisoivat yhdisteet, entsyymit, entsyymien kofaktorit, hapteenit, vasta-aineet, avidiini, biotiini, hiilihydraatit, lektiinit, metallikelatoijät ja näiden johdannaiset.

3. Patenttivaatimuksen 1 tai 2 mukainen menetelmä, 25 tunnettu siitä, että antigeenin pitoisuus immuno logisen määrityksen reaktioseoksessa on suurempi kuin noin 10"11 M.

4. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että antigeeni valitaan ryhmästä, jonka 30 muodostavat ferritiini ja IgE.

5. Immunologinen määritysmenetelmä, jossa saadaan lineaarinen standardikäyrä, antigeenin määrittämiseksi nestemäisessä näytteessä, jonka antigeenin pitoisuus reaktioseoksessa on vähintään 10"11 M, tunnettu siitä, 35 ettäs II 90799 (a) saatetaan nestemäinen näyte yhteyteen liukenemattomaan kantajaan sidotun ensimmäisen vasta-aineen, toisen vapaan, leimatun vasta-aineen ja lisävasta-aineen kanssa, joka lisävasta-aine valitaan ryhmästä, jonka muo- 5 dostavat leimaamaton, vapaa ensimmäinen vasta-aine, lei-maamaton, vapaa toinen vasta-aine ja niiden seokset, jolloin muodostuu liukenematon kompleksi, jonka muodostavat sidottu ensimmäinen vasta-aine:antigeeni:leimattu toinen vasta-aine, mainitun lisävasta-aineen kompleksoituessa 10 antigeenin kanssa sivutuotteiden muodostamiseksi reaktiossa, joka antaa mainitun liukenemattoman kompleksin, (b) erotetaan mainittu liukenematon kompleksi nestemäisestä näytteestä, reagoimattomasta vasta-aineesta ja kaikista liukoisista sivutuotteista, 15 (c) havaitaan joko liukenemattomaan kantajaan si toutuneen leimatun toisen vasta-aineen määrä tai reagoimattoman leimatun toisen vasta-aineen määrä.

6. Patenttivaatimuksen 5 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että leimattu vasta-aine on leimattu jä- 20 senellä ryhmästä, jonka muodostavat radioisotoopit, kemi- luminesoivat yhdisteet, bioluminesoivat yhdisteet, fluoresoivat yhdisteet, fosforisoivat yhdisteet, entsyymit, entsyymien kofaktorit, hapteenit, vasta-aineet, avidiini, biotiini, hiilihydraatit, lektiinit, metallikelatoijät ja 25 näiden johdannaiset.

7. Reagenssi, tunnettu siitä, että se sisältää (a) ensimmäisen vasta-aineen antigeenille, mainitun ensimmäisen vasta-aineen ollessa sidottuna kiinteään kan- 30 tajaan, (b) toisen vasta-aineen mainitulle antigeenille, mainitun toisen vasta-aineen ollessa vapaa ja leimattu, ja (c) lisävasta-aineen valittuna ryhmästä, jonka muodostavat leimaamaton, vapaa ensimmäinen vasta-aine, lei- 35 maamaton, vapaa toinen vasta-aine ja niiden seokset.

8. Immunologinen määritysmenetelmä antigeenille nestemäisessä näytteessä, tunnettu siitä, että muodostetaan kompleksi näytteessä olevan antigeenin ja ainakin kahden vasta-aineen välille, yhden mainituista 5 vasta-aineista ollessa ensimmäinen liukenemattomaan kantajaan sidottu vasta-aine ja yhden mainituista vasta-aineista ollessa toinen vapaa leimattu vasta-aine, jolloin osa mainitusta leimatusta vasta-aineesta tulee sitoutuneeksi liukenemattomaan kantajaan mainitun kompleksin välitykselle) lä, ja että siihen lisätään leimaamaton, vapaa analogi mainitulle ensimmäiselle vasta-aineelle.

9. Immunologinen määritysmenetelmä antigeenille nestemäisessä näytteessä, tunnettu siitä, että muodostetaan kompleksi näytteessä olevan antigeenin ja 15 ainakin kahden vasta-aineen välille, yhden mainituista vasta-aineista ollessa ensimmäinen liukenemattomaan kantajaan sidottu vasta-aine ja yhden mainituista vasta-aineista ollessa toinen vapaa leimattu vasta-aine, jolloin osa mainitusta leimatusta vasta-aineesta tulee sitoutuneeksi 20 liukenemattomaan kantajaan mainitun kompleksin välityksellä, ja että siihen lisätään leimaamaton, vapaa analogi mainitulle toiselle vasta-aineelle.

10. Immunologinen määritysmenetelmä antigeenille nestemäisessä näytteessä, tunnettu siitä, että 25 muodostetaan kompleksi näytteessä olevan antigeenin ja ainakin kahden vasta-aineen välille, yhden mainituista vasta-aineista ollessa ensimmäinen liukenemattomaan kantajaan sidottu vasta-aine ja yhden mainituista vasta-aineista ollessa toinen vapaa leimattu vasta-aine, jolloin osa 30 mainitusta leimatusta vasta-aineesta tulee sitoutuneeksi liukenemattomaan kantajaan mainitun kompleksin välityksellä, ja että siihen lisätään leimaamattomia, vapaita analogeja mainituille ensimmäiselle ja toiselle vasta-aineelle. II 90799