JPH01227961A

JPH01227961A - アンジオテンシン２の酵素免疫化学的測定方法

Info

Publication number: JPH01227961A
Application number: JP5559688A
Authority: JP
Inventors: Iwao Shimaoka; 巌島岡; Makoto Murakami; 真村上; Tetsuhiro Kubota; 哲弘久保田
Original assignee: Kissei Pharmaceutical Co Ltd
Current assignee: Kissei Pharmaceutical Co Ltd
Priority date: 1988-03-09
Filing date: 1988-03-09
Publication date: 1989-09-12

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】

〔Ｒ業１−の利用分野〕水弁１１１１はｆｙノＡ−７ン／ン１１の測定ツノ状に
関するものこある。更に詳しく述べれば、本発明はｆンジシ（テンシン１１
の酵素免疫化学的測定力法（トｎｚｙｍｅ　１ｍｍｕｎ
。Ａｓ５ａｙ、　　以下ＥＩＡという）に関するものであ
る。〔従来の技術〕アンジオテンシン■は血管収縮作用などを有−Ｊ−る高
血圧症の一つの囚ｆである。蛋白分解酵素の−っであるレーンがアンジオテンンノー
ゲンに作用することによっ−Ｃデカペプチドのアンジオ
テンシンＩが生成し、これがアンジオテンシン変換酵素
によって分解されて生成する。このレニン−アンジオテンノン系に作用する１り血圧治
療剤は現在多くの注１２１を集め、＋ｉ々の化合物が検
討されている。このような薬物の効果セ］定において血中のアンジオテ
ンシンＩＩの生成量を測定することは極めて土留であり
、ずでにい＜−）かの測定方法が考案されている。しか
しながら、これ゛まで行われている測定方法はいずれも
１２５１などのような放射性同位元素で標識したアンジ
オテンシン１１４用いろ、いわゆる放射免疫化学的測定
方法（Ｒａｄｉｏ　１ｍｍｕｎ。＾５ｓａｙ、　　以下ＲＩ　Ａという）がほとんどであ
る。ＲＩΔは放射性同位元素を用いるため、その測定におい
て特殊な装置や施設を要し、しかも取り扱いに充分な注
意を払う必要がある。〔発明が解決しようとする課題〕従来知られているアンジオテンシンＩＩの測定方法はＲ
Ｉ　Ａによるものであり、測定に特殊な装置や施設を要
し、取り扱い−１−の安全性に問題があるなどの欠点を
有している。このため簡便に、−度に多くの試料を測定でき、しかも
安全で、感度の高い測定方法の開発が望まれていた。〔課題を解決するだめの手段および作用〕本発明者らは
先に述べた問題点を解決すべく検討した結果、β−Ｄ−
ガラクトンダーゼで標識したアンジ」テンシン１１を用
いることにより酵素免疫化学的に測定ができることを見
出した。ずなわら、抗アンジン寸テンンンＨ抗体に、ｒ
ンジ］テン／ンＨを含む試料およびβ−，り一ガラクト
ンダーセーアンノオデンンンＩＩの溶液を加え、競合的
に抗体と結合したβ−Ｄ−ガラクトンダーゼーアンジオ
テンシンＩＩの酵素活性を蛍光的に測定することにより
試料中のアンジオテンシンｎの含ｔをきわめて感度よく
、しかも安全に、特殊な装置や施設を用いることなく測
定できることを見出し、本発明を成すに至った。すなわち、本発明はアンジオテンシンＩＩの酵素免疫化
学的測定方法を提供するものである。本発明に使用されるβ−Ｄ−ガラクトンダーゼーアンジ
オテンンン■は通常知られているＮ−（ｍ−マレイミド
ベンゾイルオキシ）サクンンイミド法（以下ＭＢＳ法と
いう）に従い１．　Ｎ−（ｍ−マレイミドベンゾイルオ
キシ）アンジオテンシンＩＩを作製し、これとβ−Ｄ−
ガラタト／ダーセを反応さけることにより製造すること
ができる。このβ−Ｄ−ガラクトシダーゼー°ｒンジオテンンンＩ
Ｉの酵素の反応効率は測定感度に直接影響を与えるため
、できるだけ高い反応効率をもつ方が好ましい。水弁明考らは反応効率の１１”行いもＱ）を１１′！−
るべく検討した結果、Ｎ−（ｍ−マレイミドベンツイル
オキシ）゛ノ′ンジオテン／ン）Ｉ古β−Ｄ−ガラクト
シダーゼをモル比２１：１の割合で反応した時に最も反
応効率の高いものが得られることを見出した。このようにして製造されるβ−Ｄ−ガラクトシダーゼー
アンジオテンンンＩＩの反応効率は４６％と高く、これ
を用いることにより感度の高い測定をすることができる
。標識酵素の基質としては、Ｅ　Ｉ　Ａで通常用いられる
β−Ｄ−ガラクトンダーゼの蛍光基質であればよく、例
えば、４−メチルウンベリフェリル−β−■）−ガラク
トンドなどをあげることができる。本発明において使用する抗体は通常の抗体作製方法に従
って調製される。例えば、アンジオテンシン■−牛血清
アルブミン複合体を抗原として免疫した家兎血清より得
ることができる。本発明のような競合法によるＣＩＡとしては２抗体法、
２抗体固相法、１抗体固相法などの方法が行われるが、
操作等の簡便さの点で１抗体固相法が最も好ましい。こ
の場合、固＋［］化に用いろ固開目としてヒ゛−ズ、ゲ
ル、チューブあるいはマイクロプレートなどが−９に用
いられるが、人肇試？、測定の容易さなどの点でマイク
ロプレートが好ましい。固相法に用いるマイクロプレートとしてはＥＩＡに用い
られるものであればどのような材質であってもよい。た
だし、各人に抗体が均等に固Ｍ］化される必要があるの
で、各人の径、深さ、表面積が均一のものでなければな
らない。マイクロプレートに固相化した抗体は保存＋１Ｊ能であ
り、あらかじめ犬９にイ１成しておくことにより、常に
測定に必要な抗体を確保しておくことができる。また、
大量の試料にも対応することができる。本発明の測定方法を好適に実施ずろには、例えばアンジ
オテンンンＩＩ−牛血清アルブミンで免疫した家兎血清
より採取した抗アンジオテンシン１１抗体をマイクロプ
レートの各人に等ｔずつのけて吸着させた後、緩衝液て
遊離の抗体を洗浄する。試料溶液およびβ−［）−ガラクトシド溶液　°ｒンジ
オデンンンＩＩ溶液を一定隨ず１）加え４℃で一夜放置
して競合的に結合さける。Ｍ　雑のアンジオテンシンＩ
Ｉを１１　ＩＩｎ液で洗浄した後、４−メチルウンベリ
フェリル−β−Ｄ　ガラクトシド溶液を加え、１時間後
反応停止液を加えて反応を停車し、分解した４−メチル
ウンベリフエエ】ンを蛍光的に測定する。あらかじめ作
成した標準曲線により試料中のアンジオテンシンＩＩへ
場を換算する。［発明の効果〕本発明の−ｒンジＡデンンン１１のＥ　ＩΔは感度がよ
く、絶対晴で０．４５１］ｇ〜Ｉ［］００　ｐｇの範囲
であれば測定＋１Ｊ能である。一般に、プラズマ中の′
ｒンジオテンンンＩＩの濃度は１０〜ｌｏＯｐｇ／ｍＡ
であるのでプラズマ０５〜１−程度で充分測定すること
ができる。また、本発明の測定方法はＲＩ　Ａのような特殊な装置
ｄ、設備も不要であり、取り扱いもきわめて安全て簡便
な方法である。さらにマイクロプレートを用いた１抗体固＋目法による
Ｅ＝：　ＩΔ法は煩雑なり　／　Ｆ分離↑・を作も不用
であり、大量の試料にも対応できるなどの利点をもつ。〔実施例〕本発明の内容を以下の実施例により史に詳細に説明する
。抗アンジオテンシンＨＷ丼の作成アンジオテンノン１１７．５ｍｇと牛血清アルブミン３
０ｍｇを蒸留水１０献に溶解し、ゆ−っくりかきまぜな
がら、その中に６０ｍｇ／−の１−エチル−３（３＝ジ
メチルアミノプロピル）カルボジイミド溶液０，５−を
滴下し、さらに室温で１晩ゆっくりかきまぜてカップリ
ング反応を行った。反応液を蒸留水にて４℃で４８時間
透析を行った後、凍結乾燥して抗アンジオテンンン■−
牛血

【＾アルブミン複合体を（）、４℃にて保存した。得られたアンジオテンシンロー生血２Ｎ　’／’ルブミ
ン複合体１　ｍｇを生理食塩水１−に溶解した後、等量
のコンプリート　フロイド　アジュバント（Ｃｏｍｐｌ
ｅｔｅ　Ｆｒｅｕｎｄ’ｓ　ａｄ３ｕｖａｎｔ）と充分
に混和し、ウサギの背部皮下に数十ケ所に分けて皮下注
射を行った。２週間後、同量を背部皮下に注射した後、
さらに２週問おきに３回同雫を大腿部分に注射して追加
免疫を行った。抗体の力価が充分高まったところで頚動
脈から全採血を行い、血清を分取した。得られた抗ｆンジオテンンン■抗血清は、最終希釈倍４
−ｉ　１　＋　１４８０００で、′２５Ｉで標識したア
ンジオテンシン１１の５０％が結合した。 β−Ｉ）−ガラクトンダーゼーアンジオテンシン１１の
調製アンジオテンシン１１２　ｍｇ　（１，９μｍｏｌｅ）
　　を１ｍＮの０．ＩＭ−リン酸ナトリウｌ−緩衝液（
ｐ＋＋　７．０）に溶解し、これに５　ｍ）Ｈ／　ｍｌ
のＮ−（ｍ−マレイミドベンゾイルオキシ）スクシンイ
ミドのテトラヒドロフラン溶液０．４ｍｊを加え、３０
ｔで３Ｄ分間反応させた。反応液にエタノール２証とエ
ーテル２０〜２５献を加えてかきまげ、析出する白色沈
澱をろ取、エーテルで２回洗浄後乾燥して、ｆＬ−（ｍ
−マレイミドベンゾイルオキ／）７ンジンステンンンＩ
Ｉを得た。得ふれた標品を少量の２５％エタノールに溶
解し、メルカプトエタノールと反応させ、残存したＳＮ
基を定量することにより、この標品のマレイミド残基…
をｆｆ１ｌｌ定した結果、５０Ｊ当たり４２　ｎｍｏｌ
ｅであった。Ｅ、Ｃｏ１１由来、β−Ｄ−ガラクトンダーゼ（Ｂｏｅ
ｒ＋ｎｇｅｒ社製品）０．５ｍｇ（約１　ｎｍｏｌｅ）
を１−の〇、１トリン酸ナリトウム緩衝液（ｐＨ７，０
）に溶かし、この溶液を【斂しくかきまぜながら、５．
９５ｄ、　１３．０９扉、２５．ｄおよび５０ｄ　（マ
レイミド残基噴にして５．１１．２１および４２　ｎｍ
ｏｌｅ）のＮ−（ｍ−マレイミトヘンゾイルオキシ）ア
ンジオテンシンＩＩの２５％エタノール溶液をそれぞれ
少量ずつ滴ｔした。３０℃で２０分間反応させた後、直
ちにセントリフＤ　−ＣＦ３０Ａ（アミコン社製品）に
より遠心濾過を行い、未反応の＼−（ｍ−マレイミドベ
ンゾイルオキン）アンジオテンシンＩＩを除去した。次
いで、セファロース４Ｂ　（Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ　４Ｂ
）カラムク０７トグラフイーにより精製して、β−Ｄ＝
ガラクトシダーゼの酵素活性画分とアンジオテンシンＩ
Ｉの免疫活性画分が一致するβ−Ｄ−ガラクトシダーゼ
ーアンジオテンシンＩＩの両分を集ｙつ濃縮した。相用らの方法〔エンドクリソ１］ジー（Ｅｎｄｏｃｒｉ
−ｎｏｌｏｇｙ）　　、１０５巻、１号、１〜６ページ
、１９７９年〕に従って抗体反応性をもする酵素活性量
を測定したことろ、２１；１と４２＝１のモル比で反応
させた場合の標品が高い値を示し、それぞれ全酵素活性
の４６．０％と４０．１％が抗体反応性を有していた。以後のＥＩＡには、上記でｊ）た標識アンジオテンシン
ＩＩのうち、ｌ　ｎｍｏｌｅのβ−Ｄ−ガラクトシダー
セに対し、マレイミド残基にして２＋　ｎｍｏｌｅの、
〜（ｍ−マレイミドベンゾイルオキシ）アンジオテンシ
ンＩＩを反応させて得られたβ−Ｄ−ガラクトンダーゼ
ーアンジオテンンンＩＩを用いた。なお、図１にはセファｆＪ−ス４［（カラムによるβ−
Ｄ−ガラクトンダーゼーアンジＡテンシンＩＩの精製パ
ターンを示した。マイクロプレートによる■＝：　Ｉ　Ａ　模作１、　抗
体の同相化０．１！Ａ−塩化ナトリウム、ｌ　ｍＭ−塩化マグネシ
ウム、０゜１％−アジ化ナトリウムを含む２０　ｍＬ　
）リス−塩酸緩衝液（ｐｔ（７，４）を用いて抗アンジ
オテンンン■抗血清を１０．０００倍に希釈した抗体溶
液１００通を、ＥＩＡ用９用穴６穴マイクロプレートＮ
ｕｎｃ−１ｍｍｕｎｏ　Ｐｌａｔｅ　Ｉ）　　の各人に
入れ、３７℃で１時間保温して抗体を物理的に吸着させ
た。次に０．５％−牛血請アルブミン、０．１％−アジ
化ナトリウムを含む０、ＩＭ−）リス−塩酸緩衝液１ｏ
ａｄを加え３７℃で３０分保温後、内容物をアスピレー
タ−により除去し、０．０５％家兎血清アルブミン、ｌ
　ｍＭ−塩化マグネシウム、０．１１塩化ナトリウム、
０．１％−アジ化ナトリウムを含む２０　ｍＭ−ＩＪン
酸す）　ｌ）ラム緩衝液（ｐ］１７．０）　（以下緩衝
液Ａという）　　２００ｍで２回洗浄を行った後、ＥＩ
Ａに使用した。保存する場合は緩衝液Ａを２００　ＪＪ
１入れて使用時まで４℃で保管した。２、　抗原抗体反応標′準曲線作製用のアンジオテンシン１１溶液（１０ｎ
ｇ／ｉ　〜４．５　ｐｇ　／ｍｅのアンジオテンシンＩ
Ｉを含む緩衝液Ａの溶液）、または試料溶液１００Ｉを
抗体固相化マイクロプレートに加え、５分量り放置した
後、緩衝液Ａて）皇液を）０’（ｉ≧に希釈した５０〜
６０μｕｎｉｔのβ　Ｄ−ガラクトシダーセーアンジ４
テンンンＨ溶液１００通を追加して室温で３０分間放置
し、さらに４℃で一晩反応させた。反応後アスピレータ
ーで内容物を除去し、さらに緩衝液Ａ２ＱＯｄで１回洗
浄した。３、　β　Ｄ−ガラクトシダーゼ活性の測定洗浄後のマ
イクロプレートに［１，ｌ　ｍＭ、Ｉ　Ｑ）４−メチル
ウンベリフェリル−β−Ｄ−ガラクトシドを含む緩衝液
Δを２００ｄ加え、３０′ｃで１時間反応させた。０．１トクリシンー水酸化ナトリウム緩衝液（ｐＨ１０
、３）　　を２００通加えて反応を停止さけ、生成した
べ一メチルウンベリフェｔ】ンの蛍光を励起波長３６０
ｎｍ、蛍光波長４５０　ｎｍて測定した。なお、蛍光強度の標準物質として４−メチルウンベリフ
ェロン溶液を用い、β−Ｄ−ガラクトンダーセーアンジ
オテンシンＩＩの量は、−Ｆ４記の条件で１　μｍ　ｏ
　ｌ　ｅの４−メチルウンベリフェリル−β−Ｄ−ガラ
クトノドを氷解する酵黍活性を１ニー　ノドとして表示
した。標準曲線の作製上記の標準曲線作製用アンジオテンシン１１溶液を用い
て、ＥＩＡによる標準曲線を作製した。結果は図２に示
す通りであった。本発明のＥ　Ｉ　Ａ法での最小検出感
度は０．４５　ｐｇ　（Ｂ／ｆｌｏ％９５％１ｎｔｅｒ
−ｃｅｐｔ　ｖｉ）であり、０．４５−１０００　ｐｇ
／１ｕｂｅの間で安定した標準曲線が得られた。ＥＩＡ用試料の調製採血は、血液１ｄに対し０，０３〜１−フ、１ナンスｌ
】ｌＪ：／、０．１Ｍ−エチレンジアミン四酢酸（Ｌｉ
ｔ］ＴＡ）　オヨび２　ｇ／！ネオマイシンを含むプｌ
】テアーセ阻害剤溶）ｆｆ１２５ｄを入れたポリスチレ
ンチューブ中にで行い、採血後直ちに４℃で遠心分離し
てプラズマを得た。得られたプラズマよりＮｕｓｓｈｅｒｇｅｒらの方法〔
）＼イバーテンンヨン　サブリメント１（ＨＹＰ［ンＲ
ＴいＳＩ［ｌＮ５ＬＩＩＩＩＩ１．　ｌ）　　、７　巻
、３１“）、１〜７ページ、１９８５年〕に従ってアン
ジオテンシンＩＩの抽出を行った。まず、ボンドエルート（Ｂｏｎｄ　１Ｎｕｔ）　ｐｆｌ
カートリッジカラム（Ａｎａｌｙｔ＋ｃｈｅｍ社製品）
をメタノールおよび蒸留水容１−を順次流して活性化し
た後、プラズマ　０．５−をカラムにかけ、蒸留水１ｍ
Ｎで洗浄した。メタノール０．５−を通してアンジオテ
ンシンＩＩを溶出し、溶出液をポリプロピレンチューブ
中に集め、窒素ガスあるいは遠心エバポレーターを用い
て蒸発乾固した。残留物を１５０通の蒸留水に溶解した
後、１００ｄを高速液体りτ】マドグラフィー　〔溶出
条件；溶媒、アセトニ）　ＩＪル１０．０４％−リン酸
・１２／８８、温度：４５℃、流速：１ｎｆ／ｎ＋＋ｎ
、使用カラム：［ｌＤＳ系ＴＳＫ　ｇｅｌ　Ｔ１１８０
．１にかけ、アンジオテンシンＩＩの溶出画分をフラク
／ヨンコレクターを用い、５０扉の０．５　Ｍ−、）リ
スー塩酸緩ｉｌＹ液（ｐＨ８，０）を入れたポリプロピ
レンチューブ中に分取した。分取液は直しに凍結乾燥し、援ｉΦｉ液Ａ　１２０ｄに
溶解してその１００通をｌ’：　Ｉ　Ａ試料とし−Ｃ用
いた。再現性試験上記の方法に従い、大プラズマよりｒンジオテンンンＩ
Ｉを抽出、分離した後、ＥＩＡを行うことにより、その
同時再現性、経時再現性および添加回収率を調べた。［同時再現性〕　：濃度の異なる５種類の犬プラズマを
用い各々５回測定した。結果はＦ表に示す通りであった
。Ａ　　　５　　　　１８．５　　　１．６５　　　８．
９Ｂ　　　５　　　　２５．０　　　３．１０　　１２
．４Ｃ５３６，０［４１３，４Ｄ　　　５　　　　４７．９　　　４、＋６　　　８．
７Ｅ　　　５　　　　＋９３．０　　２９．１９　　１
５．１〔経時再現性〕　：ａ度の異なる３種類の大プラ
ズマを用いて５回測定した。結果は一ト表に示す通りで
あった。 Δ　　　　５　　　　１ｇ、９　　　　３．６５　　　
１９．３Ｂ　　　　　５　　　　４５．８　　　　６，
６２　　　１４．５Ｃ５１６０，７９，９９６，２〔添加回収率〕　；抽出＋）ｉＪＯ大プラズマに既知の
アンジオテンシンＩＩを添加し抽出、分離操作およびＥ
ＩＡを経てその回収・ｔを求めた。結果は下表に示す通
りであ−９た。１２、５　　　　８９．８　Ｊ−に。７　　　１：＋２
　　１０６５０、０　　　１２５．８　＋、　１．　ｌ
　　　　４９．２　　　９８７４．４　　　　１５０．
３←１屹９　　　７２．８　　　　９８１４８．８　　
　１９９０　＋１８．１　　１２１．５　　　８２カプ
トプリル投５前後のプラズマアンン−（テンアンジオテ
ンシン変換酵素阻害薬であるカプトプリルをピーグル犬
６頭に各々体重１　ｋｇ当たり１０ｍｇずつ経口投与し
た後、経時的に採血を行い、プラズマ中のアンジオテン
シンＩＩを抽出、分離した後、その濃度を本発明のＦｉ
　Ｉ　Ａにより測定した。結果は図３に示す通りであった。

【図面の簡単な説明】

図１はセファ「コース４Ｂカラムクロマトクラフイーに
よるβ−Ｄ−ガラクトシダーセ−アンジ」ｉンシンＩＩ
の精製パターン図である。（芭軸はフラクション番号、
縦軸はβ−Ｄ−ガラクトンダーセの酵素活性（蛍光強度
）およびアンジオテンシンＩＩの免疫活性をそれぞれ左
吉右に［」盛ったものである。図２は標準曲線作製用アンジ」テンノン１１溶液を用い
た、本発明のＥＩＡによる標準曲線図である。横軸は非
標識アンジオテンシンＩＩのｍ　（ｐｇ／ｌ　ｕ　ｂ　
ｅ、　）であり、縦軸は標識ｒンジＡデンンンＩＩの結
合＋！（Ｂ／１１０％）を示す。図３はカプトプリル投ｌｊ前後のプラズマアンジ」テン
ノンＩＩの変動をボずグラフである。横軸は投与後の経
過時間（採血時、時間）であり、縦軸はプラズマＩＴＴ
Ｌ１２中のアンジ」テンシンＩＩの測定量（ｐｇ／　ｍ
ｌ、　）を示す。特１．′ｌ出願人キノセイ薬品工業株式会社第　　１　　図が−埴　削素粘告ト→免投話性フラノノ書ノ査弓＠　　　２　　−］（χ） −ｒ／／オテ７ノノｎ　壜（Ｉ’ｇ／ｌｕｂｅ）第３図経過時間　　（時間）

Claims

【特許請求の範囲】

（１）抗アンジオテンシンII抗体にアンジオテンシンI
Iを含む試料およびβ−Ｄ−ガラクトシダーゼで標識化
したアンジオテンシンIIの溶液を加え、競合的に抗体と
結合したβ−Ｄ−ガラクトシダーゼ−アンジオテンシン
IIの酵素活性を蛍光的に測定することにより試料中のア
ンジオテンシンIIの含量を換算することを特徴とする、
アンジオテンシンIIの酵素免疫化学的測定方法。
（２）抗アンジオテンシンII抗体を固相化したマイクロ
プレートにアンジオテンシンIIを含む試料およびβ−Ｄ
−ガラクトシダーゼで標識化したアンジオテンシンIIの
溶液をのせ、競合的に抗体と結合したβ−Ｄ−ガラクト
シダーゼ−アンジオテンシンIIの酵素活性を蛍光的に測
定することにより試料中のアンジオテンシンIIの含量を
換算することを特徴とする請求項第１項のアンジオテン
シンIIの酵素免疫化学的測定方法。
（３）抗体としてアンジオテンシンII−牛血清アルブミ
ン複合体で免疫した家兎血清より作製した抗アンジオテ
ンシンII抗体を用い、標識化酵素の基質として４−メチ
ルウンベリフェリル−β−Ｄ−ガラクトシドを用いるこ
とを特徴とする請求項第１項のアンジオテンシンIIの酵
素免疫化学的測定方法。
（４）β−Ｄ−ガラクトシダーゼ−アンジオテンシンI
I。
（５）Ｎ−（ｍ−マレイミドベンゾイルオキシ）アンジ
オテンシンIIとβ−Ｄ−ガラクトシダーゼをモル比２１
：１の割合で反応させることを特徴とするβ−Ｄ−ガラ
クトシダーゼ−アンジオテンシンIIの製造方法。