JPS60190863A - アンジオテンシンの定量方法 - Google Patents
アンジオテンシンの定量方法Info
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- JPS60190863A JPS60190863A JP14521581A JP14521581A JPS60190863A JP S60190863 A JPS60190863 A JP S60190863A JP 14521581 A JP14521581 A JP 14521581A JP 14521581 A JP14521581 A JP 14521581A JP S60190863 A JPS60190863 A JP S60190863A
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- G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
- G01N33/531—Production of immunochemical test materials
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- G01N33/534—Production of labelled immunochemicals with radioactive label
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
本発明は、アンジオテンシンを定−）Ｊる方法に関−り
る１３さらに訂しく（，１６、既知１ｊｊｊ ｉ’ｉｌ
試桑をカラムクロマトグラフィにより分離し、４！″Ｉ
られた保持容量または保持時間により、生体試料中に含
有されるアンジオテンシンＩ、ＩＩＪ５よび■（以下Ｗ
に、△１、ＡＩおよび△■と記す）を同様の条１７１下
にり［１７１〜グラフイーを行ない、同一の保持容量ま
たは保持時間にＪ、すｆｉｌられる分画をラジオイムノ
アセイに（＝Ｊすことにより定量する方法に関づる。 内分泌性血圧調節因子には、レニン、アンジオテンシン
、アルトスプロン、カブコールアミンに代表される臂圧
因子およびカリクレイン、キニン、プロスタグランディ
ンに代表される降圧因子の存在が知られている。 ＡＩ、Ａ ｌ１Ｊ３よびＡＩＵは、それぞれ次の構造が
明らかとなっている。 １ ２ ３ ４ ５ Ｇ ＡＩ：ｌＩ−八Ｓｐ −Ａｒｇ −Ｖａｌ −Ｔｙｒ
−１１ｅ ・ ｌ１ｉｓ −７８９１０ Ｐｒｏ −Ｐｈｅ −１１ｉｓ −１ｅｕ ・０１１Δ
ｎ：ｌＩ ・ Ａｓｐ −Ａｒｇ −’Ｊａｌ −丁
Ｖｒ −１１ｅ −１１ｉｓ −１月゛０ ・ ｐＨ（
！ ・ ０１１ △ １１： ＩＩ −八ｒｇ ・ Ｖａｔ ・ Ｔｙｒ
−１１ｅ ・ １ｌｉｓ −Ｐ１゛０ ・ Ｐ １１
ｅ ・ ０１１このＡＩは、レニン重質にレニンが作
用し−Ｃ１該基質の１０番目および１１番目のＬｅｕ−
Ｌｅｕ結合を切１１７ｉザることにＪ、り生成され、Δ
■は、△■変１！／Ｉ酵素にＪ、す△■の８番目と９′
ｄ′ｊ目のＰｈｅ−１１ｉｓ結含を切断りることにより
生成され、そして１△■は、アミノペブヂダーゼにより
△■の１番目と２番Ｌ１のＡｓローＡｒ（］結合を切断
ＪることにＪ：り生成Ｊる。 コｈ ラＡ Ｔ 、Ａ Ｉｆ １１３Ｊ＝ ヒＡ ＩＩ
Ｉ ＬＡ、＋ｒｕ ＩＥｉ−上’Ｒ作用をイｊ−Ｊるこ
とが知られているが、現在で
る１３さらに訂しく（，１６、既知１ｊｊｊ ｉ’ｉｌ
試桑をカラムクロマトグラフィにより分離し、４！″Ｉ
られた保持容量または保持時間により、生体試料中に含
有されるアンジオテンシンＩ、ＩＩＪ５よび■（以下Ｗ
に、△１、ＡＩおよび△■と記す）を同様の条１７１下
にり［１７１〜グラフイーを行ない、同一の保持容量ま
たは保持時間にＪ、すｆｉｌられる分画をラジオイムノ
アセイに（＝Ｊすことにより定量する方法に関づる。 内分泌性血圧調節因子には、レニン、アンジオテンシン
、アルトスプロン、カブコールアミンに代表される臂圧
因子およびカリクレイン、キニン、プロスタグランディ
ンに代表される降圧因子の存在が知られている。 ＡＩ、Ａ ｌ１Ｊ３よびＡＩＵは、それぞれ次の構造が
明らかとなっている。 １ ２ ３ ４ ５ Ｇ ＡＩ：ｌＩ−八Ｓｐ −Ａｒｇ −Ｖａｌ −Ｔｙｒ
−１１ｅ ・ ｌ１ｉｓ −７８９１０ Ｐｒｏ −Ｐｈｅ −１１ｉｓ −１ｅｕ ・０１１Δ
ｎ：ｌＩ ・ Ａｓｐ −Ａｒｇ −’Ｊａｌ −丁
Ｖｒ −１１ｅ −１１ｉｓ −１月゛０ ・ ｐＨ（
！ ・ ０１１ △ １１： ＩＩ −八ｒｇ ・ Ｖａｔ ・ Ｔｙｒ
−１１ｅ ・ １ｌｉｓ −Ｐ１゛０ ・ Ｐ １１
ｅ ・ ０１１このＡＩは、レニン重質にレニンが作
用し−Ｃ１該基質の１０番目および１１番目のＬｅｕ−
Ｌｅｕ結合を切１１７ｉザることにＪ、り生成され、Δ
■は、△■変１！／Ｉ酵素にＪ、す△■の８番目と９′
ｄ′ｊ目のＰｈｅ−１１ｉｓ結含を切断りることにより
生成され、そして１△■は、アミノペブヂダーゼにより
△■の１番目と２番Ｌ１のＡｓローＡｒ（］結合を切断
ＪることにＪ：り生成Ｊる。 コｈ ラＡ Ｔ 、Ａ Ｉｆ １１３Ｊ＝ ヒＡ ＩＩ
Ｉ ＬＡ、＋ｒｕ ＩＥｉ−上’Ｒ作用をイｊ−Ｊるこ
とが知られているが、現在で
【ま、血月−上り７作用は
、４１一体中のＡＩＩ［の１１り定法がＩｉｌ［立ｌ）
’−ｃいないため、主としく△Ｉｆの作用にＪ、るしの
ど考えられている。 △■【ま、■ｉｉｉ’ｌ腎に夕・１づ−るミネラル■］
ルヂコイド（アンドロスノー１−」ン）放出刺激作用、
■Ｉ１１動脈に対りる直接数組１作用、■中枢神経を介
り−る面管収れ１１作用、Ｊ３Ｊ、び■）１１・′１に
作用してＮａ貯留、Ｇ Ｆ Ｒ（ル下、Ｋ排泄作用等多
様な生理粘性を右し、Ｊ、たカブ」−ルアミの１０へ・
２０ （ｊ′ｌの背圧作用を右するなど本態性および腎
性高面症を問わず高血圧に係わる因子として重要である
。 また、Ａ■については、副腎皮質に対づ−るアルトス−
ｊロンの生合成と分泌の促進、コルチゾールと］ルヂコ
ステロンの生合成と分泌の促進等心臓おにび血管に対し
ては血圧上背、心筋に対しては、いわゆるポジティブ−
イノ１−１］ピック作用（ｐｏｓｉｔｖｅ １ｎｏｔｒ
ｏｐｉｃ ａｃｔｉｏｎ）があること等腎臓に対しては
、腎血流の減少、レニン分泌の抑制等の生理ね５性が知
られている。 したがって、△■からＡ ＩＩを生成させる△■変換酵
素の活性を阻害づるＪ、うな物質、たとえば、ｔ）−３
−メルカプト−−メヂルブに２バノイル−Ｌ−ブ［］リ
ン（カブトリル、ｃａｐｔｏｒｉ ｌ ）を高血圧症の
患者に投与することにより、体内ＣのＡＩからＡ ＩＩ
Ｊ−３よびＡ ＩＩＩの生成を阻害し、昇圧因子を除
く等の治療も考えられている。 しかしながら、これらのシｒ、 １丁＋幾（１４を解明
りるだめに、生体内にａ）りるＡＩ 、Ａ ＩＩ ｉｔ
ｊよびＡ１１ｌの（ｒ在１配、生成量あるい（ま浦艮の
測定法および定ｆ（’Ｂ法の開発が望Ｊ、れ−（いるに
しかかわらヂ、い」：だモイ「立されていない。 Ｉことえぽ、つΔ−タース゛礼製造のマイクＩＮ・ボン
ドバックＣ１８を充１眞したカラムを使用し、０、（Ｉ
ＩＭの耐酸アン−しニウム水溶液と酢酸含イｊメヂルア
ル」−ルとを直線グラジェント溶離液どじ、波長２１０
ｒ＋ｍにＪ３ける紫外吸収を測定Ｊる検出器により、既
知試料の△■、Ａ ＩＩ、テトラゾカベシタイド（１３
Ｊ：びｉｉ ｈラベブタイドを分析りるカシムク＋ａ
・／Ｉ−グラフ１りｂ＼ＩＪ、力）＋ごイ【つ（報告さ
れた。しかしながら、この方法は牛体液中に存在覆るア
ンジン１デンシン等の１万〜１００万イｊＸ程度の多作
の試４′８１を必要とりるため、直接生体液中のアンジ
オテンシン類を検出し、そして定量り−ることは不可能
で゛ある。 本発明者は、生体液中に存在Ｊ８徴吊のＡＩ、ＡＩＩお
Ｊ、び△■を直接定Ｔｎする方法を開発することを目的
どして検詞し本発明を完成した。 ′？ｌなわち、本発明は、次の第１■程、第２工程およ
び第３工程からなるアンジオテンシンの定量方法をその
１１子とづる・ｂのである。 （イ）標準試薬アンジオテンシン含右液を特定条件下に
水性系カラムクロマ１〜グラフイーにより分離し、その
保持容量または保持時間を測定する第１］二程、 （ロ）微量のアンジオテンシン含イ１液を第１工程の特
定条４′１下でカラムクロマトグラフィーを行ない、第
１工程で１７られた保持容量または保持時間に等しい分
画を得る第２工程、（ハ）第２］−程で得られた分画を
、ラジＡイムノアゼイに付してアンジオテンシンを定ｆ
ｉｔ する第３工程。 本発明のカラムク【」７１〜グラフイーに使用づるカラ
ム充填剤としては、細孔径約３０Å以上を有し、交１条
基としてカルボキシアルキレン基（−Ａ ｌ ｋｙ ｌ
−ＣＯＯＨ＞を有づるシリカゲル系の充１眞剤をりλ
げることができる。アル４レン基どしては、メチレン阜
またはエチレン基を挙げることができる。ｆｌｕ ｔ’
１基をイｊりる充填剤を使用りる揚台にｔよ、Ａ ＩＩ
、△］７および△■の順に溶離されるが、塩基性！１４
をイー］りる充填剤を使用でる場合には、Ａｌｌ、Ａ１
およびＡ ＩＩの順に溶ｌｌ！Ｉｌされる。 本発明におりる水性糸カラムク【−１７トグラフイーど
は、水を主成分とづる溶離溶媒を使用Ｊ−ることをいい
、これらの溶離溶媒としては、各種の緩衝液を使用Ｊ−
ることがＣさ、好ましく（よ、リン酸緩衝液を挙げるこ
とができる。 カラムクロマ１〜グラフイーを行なう際の溶離法として
は、上記の各種緩衝液、塩溶液、水を組合せた温度勾配
法（グラジ丁ント法）による溶離がりｆましく使用され
る。たとえば、リン酸緩衝液とＪＲ，化すｌ−リウム水
溶８々どの直線グラジ］−ン１〜等は好適である。 本発明方法は、既知試料により一度カラムクロマ１−グ
ラフィーを行ない、得られた保持容Ｄ−’ｔまた（ま保
持時間にＪ、す、△■、Ａ １１ 、ＩＪよび△■の溶
離（分画を１１（定し、検出器によって定バ１不１１１
能な低温度のＡＩ、Ａ ＩＩおよびＡＩｌ［をａ有り−
る生体液を等しい条件下でカラムク１７１へグラフィー
を行ない、上記で■一定しｔこ位置の分画を採取し、こ
の分画につい−Ｃ微Ｅ首分析が１１能なラジオイムノア
レイにイ」シて、△■、△ＨＪ＞よび△■を定量づ−る
方法である。 本発明方法では、第１１′程のカラムクロマ１〜グラフ
イーと、第２工程でのカラムクロア１−グラフィーとを
同一の条（’ｌで行イ≧うことにより、ＡＩ、ＡＩＩお
よび△■の溶離位置を一致させる方法を採用しているが
、それは△■、△■およびＡｍの溶離位置を知る必要か
ら発明されたものであって、同−条イ′１でなく−１も
Δ丁、ＡＩＩ ６３Ｊ：びＡＩＩＩの保持容量または保
持時間を知ることによって容易に分画を採取づることが
できる。 したがって、ＡＩ、ＡＩおよびＡｌｌの保持容量ま１．
：（ま保１４時間を知れば、第］工程と第２工程どのカ
ラムク［１マドグラフイ一条１佳を等しくづる必要はな
い。 本発明方法によれば、生体中のＡＩ、ＡＨａ３よびＡ１
１ｌのようにピコグラム／ ｍＲ（’Ｉ）（Ｊ／ ｍで
）程度の低ｉＩ：ひ庶の△■、ＡＩＩ Ｊ３Ｊ、び△■
を正（ｉｆ「に測定Ｊることができ、高血圧症の１幾構
解明に資り−るどころ人と考えられる。 次に実施例により４Ｘ発明を説明づ−るが、本発明は、
これら実施例に限定されるしのでは４ｆい３゜実施例
１ （ａ）４票ｉシー試＆ヒ（既知〉によるカラムクロマ１
−グラフィー 試わｌ溶液：シグマ社製、ＡＩ、ＡＩＩおよびＡ■各３
１Ｊ９を、０．１３５Ｍの塩化す１〜リウムを含む３０
ｍＭのリン酸緩山！Ｉｆｆ （ＤｌｌＧ、５）ｌｏＯ
ｍに溶解した。 カラムクロア６３Ｊ、び充填剤：東？゛〔曹達（株）製
、１１Ｘ−５Ｘ−５３Ｏ０平均か“ｌ径５ｔ）、経孔径
約４００人であり、−Ｃ１１２−ＣＯＯ１１を交換基と
するシリノＪグル）を充填した長さ３０ ｃｍ、内径４
ｍｍのカラム カラム温度：至７ｕａ （約２８°０一定）溶離液：
０．１３５Ｍ Ｆ７） ｊ’ｒ’、化す１ヘリウムを含
イ１りる３０ ｍＪｙｌリンｕ Ｍ ｔＪｉ＋ ａ （
１１Ｉｆ Ｇ ５）および０ 、 り１Ｍ ｉｆ、Ａ化
ノ１ヘリウムを含む３Ｏｎ＋Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ６，
５を１０分間で０１３５〜０．５Ｍ塩化ブ１ヘリウム濶
磨になるように直線グラジエン１へを行ない、流速０．
７５ｍｆｆ／分となるようにカラムに流通さ氾た。 ポンプ：ミル１〜ン］］イ社製シングルプランジ＼Ｉ−
ポンプ。 （ｂ）第１工程 （ａ）に示した条件により、△ｉ、ＡＩ［およびＡＩＩ
［の１００成を別々に）Ｊラムクロマ１−グラフィーに
イリし、各△■、Ａ■おＪ：び△■の保持容１を測定し
た。次いでＡＩ、ＡＩおよびＡＩの試料溶液を混合し、
その１００成によりカラムクロマ１−グラフィーを行な
い第１図をＩＩ７だ。 第１図中ピーク（２）、（１）おにび（３）は、それぞ
れＡＩ、ＡＩＩ Ａ３よびＡＩＩＩであり、それらの保
持容■は、３．３ｄ、５１ｍＱおよび１００ｍ１であっ
た１、上記混合試料に０．００４％となるようにリゾデ
ーム（内部標準）を添加し、同一条件によりりロマトグ
ラフイーを行ない第２図をｉ’、Ｊ ｊこ。第２図中ピ
ーク（４）は、リゾブ−−ムぐある。リゾチームの保持
容１３は、９． Ｇｒｄであつｌこ 。 （Ｃ）生体液中の△■、ΔＩＩ Ｊ３よび△■のカラｌ
＼り［１７１へグラフィー ヒ１〜ＩＩ・１静脈Ｊ、す、予め氷冷した採血管（［Ｄ
丁△−２Ｋ Ｇ、 Ｏｍｇを含む）に５ｍＱの血液を採
取し、４°Ｃに−（遠心沈降（３０００ｒｌＪｌｎ 、
１５分間）させ、血すｉ、！を１７ｋ。ここで得られた
血漿２ ｍｅに、１０％ＦＤｌＡ−２Ｎａ水溶液３０成
を加え、ｊｑうした血漿（３Ｎ Ｉｎ 酸にでＩｉｌ
２に調整）を ｉ ｍＭの塩酸にて平衡化した［）ｏｗ
ｅｘ ＡＧ５０Ｗ−Ｘ２（５０へ・１００メツシユ）の
長さ１０ ｃｍ、内径５１１１１１１のカラムに流）由
ざｌ、３ｍＱの１５％アン′しニア水ＣΔ丁、ＡＩ［お
よび△Ｉｌｌを溶固［づることにより除蛋白を行ない、
次い−Ｃ真空凍結乾燥した。 １“１られた凍結乾燥試お１に、］二記 （ａ）’Ｃ試
おＩ溶油をｆ［成し人二どＩｉｌ ４にのリン酸緩衝液
（１こだし、０００４％とイｆるようにリゾデームを添
加）１１０成を加え、その１０Ｇ成を上記（ｂ）と同様
にカラムク＋−Ｊｖ ｌ−グラフィーを行ない、第３図
のりｌ」７１〜グラムを得るとともに、該（ｂ）項で得
られたＡＩ、Ａ ＩＩ ｉ１５よび△■に相当−りる保
持容ω分両各９００成を採取した。 （ｄ）ラジオイムノアゼイ ２５ （Ｃ）項で得られた△］１分画の４００μｅに ■（買
伍数１２５の沃素）で標識されたΔ丁２５ （１−ＡＩと記り、以下同様）をＡＩ［分画２５ の４００成に Ｉ−Ａｎを、そしてＡＩ分画の４００成
ニ１２５１− Ａ ｍ ヲ各々１００成（１（Ｈ）００
ｃ１＋ｍ）づつ加え、次いで家兎から得られた抗血清（
八■の抗体価１：１００００ 、Ａ Ｉの抗体価１・１
２００００、Ａ■にはＡＩＩ抗血清を使用した。）１０
０成を加え、４℃に３６時間保持した。これにヂャ一二
】−ルアキストラン溶液（Ｎｏｒｉｌ △：０．６％、
１）ｅｘｔｒｎ Ｔ−７０： ０．０６％含有）を１ｍ
ρ加え、４℃に２０分間保持した後、遠心沈降させ、沈
澱物の敢ｑ・］線■を測Ｔし、別に１；ノられｌζ検吊
線から、ＡＩ、Ａｌｌ１１５よび△■の含イ１１ｉを１
！１だ。結果を第１表に示した。 次に、腎性高血圧患者（９才、女性）にカブ１〜リル６
ｍｇを投与したときの値を第２表に承り。 第２８ （１）単位はＩ］！Ｉｔ／ 戒を示り
、４１一体中のＡＩＩ［の１１り定法がＩｉｌ［立ｌ）
’−ｃいないため、主としく△Ｉｆの作用にＪ、るしの
ど考えられている。 △■【ま、■ｉｉｉ’ｌ腎に夕・１づ−るミネラル■］
ルヂコイド（アンドロスノー１−」ン）放出刺激作用、
■Ｉ１１動脈に対りる直接数組１作用、■中枢神経を介
り−る面管収れ１１作用、Ｊ３Ｊ、び■）１１・′１に
作用してＮａ貯留、Ｇ Ｆ Ｒ（ル下、Ｋ排泄作用等多
様な生理粘性を右し、Ｊ、たカブ」−ルアミの１０へ・
２０ （ｊ′ｌの背圧作用を右するなど本態性および腎
性高面症を問わず高血圧に係わる因子として重要である
。 また、Ａ■については、副腎皮質に対づ−るアルトス−
ｊロンの生合成と分泌の促進、コルチゾールと］ルヂコ
ステロンの生合成と分泌の促進等心臓おにび血管に対し
ては血圧上背、心筋に対しては、いわゆるポジティブ−
イノ１−１］ピック作用（ｐｏｓｉｔｖｅ １ｎｏｔｒ
ｏｐｉｃ ａｃｔｉｏｎ）があること等腎臓に対しては
、腎血流の減少、レニン分泌の抑制等の生理ね５性が知
られている。 したがって、△■からＡ ＩＩを生成させる△■変換酵
素の活性を阻害づるＪ、うな物質、たとえば、ｔ）−３
−メルカプト−−メヂルブに２バノイル−Ｌ−ブ［］リ
ン（カブトリル、ｃａｐｔｏｒｉ ｌ ）を高血圧症の
患者に投与することにより、体内ＣのＡＩからＡ ＩＩ
Ｊ−３よびＡ ＩＩＩの生成を阻害し、昇圧因子を除
く等の治療も考えられている。 しかしながら、これらのシｒ、 １丁＋幾（１４を解明
りるだめに、生体内にａ）りるＡＩ 、Ａ ＩＩ ｉｔ
ｊよびＡ１１ｌの（ｒ在１配、生成量あるい（ま浦艮の
測定法および定ｆ（’Ｂ法の開発が望Ｊ、れ−（いるに
しかかわらヂ、い」：だモイ「立されていない。 Ｉことえぽ、つΔ−タース゛礼製造のマイクＩＮ・ボン
ドバックＣ１８を充１眞したカラムを使用し、０、（Ｉ
ＩＭの耐酸アン−しニウム水溶液と酢酸含イｊメヂルア
ル」−ルとを直線グラジェント溶離液どじ、波長２１０
ｒ＋ｍにＪ３ける紫外吸収を測定Ｊる検出器により、既
知試料の△■、Ａ ＩＩ、テトラゾカベシタイド（１３
Ｊ：びｉｉ ｈラベブタイドを分析りるカシムク＋ａ
・／Ｉ−グラフ１りｂ＼ＩＪ、力）＋ごイ【つ（報告さ
れた。しかしながら、この方法は牛体液中に存在覆るア
ンジン１デンシン等の１万〜１００万イｊＸ程度の多作
の試４′８１を必要とりるため、直接生体液中のアンジ
オテンシン類を検出し、そして定量り−ることは不可能
で゛ある。 本発明者は、生体液中に存在Ｊ８徴吊のＡＩ、ＡＩＩお
Ｊ、び△■を直接定Ｔｎする方法を開発することを目的
どして検詞し本発明を完成した。 ′？ｌなわち、本発明は、次の第１■程、第２工程およ
び第３工程からなるアンジオテンシンの定量方法をその
１１子とづる・ｂのである。 （イ）標準試薬アンジオテンシン含右液を特定条件下に
水性系カラムクロマ１〜グラフイーにより分離し、その
保持容量または保持時間を測定する第１］二程、 （ロ）微量のアンジオテンシン含イ１液を第１工程の特
定条４′１下でカラムクロマトグラフィーを行ない、第
１工程で１７られた保持容量または保持時間に等しい分
画を得る第２工程、（ハ）第２］−程で得られた分画を
、ラジＡイムノアゼイに付してアンジオテンシンを定ｆ
ｉｔ する第３工程。 本発明のカラムク【」７１〜グラフイーに使用づるカラ
ム充填剤としては、細孔径約３０Å以上を有し、交１条
基としてカルボキシアルキレン基（−Ａ ｌ ｋｙ ｌ
−ＣＯＯＨ＞を有づるシリカゲル系の充１眞剤をりλ
げることができる。アル４レン基どしては、メチレン阜
またはエチレン基を挙げることができる。ｆｌｕ ｔ’
１基をイｊりる充填剤を使用りる揚台にｔよ、Ａ ＩＩ
、△］７および△■の順に溶離されるが、塩基性！１４
をイー］りる充填剤を使用でる場合には、Ａｌｌ、Ａ１
およびＡ ＩＩの順に溶ｌｌ！Ｉｌされる。 本発明におりる水性糸カラムク【−１７トグラフイーど
は、水を主成分とづる溶離溶媒を使用Ｊ−ることをいい
、これらの溶離溶媒としては、各種の緩衝液を使用Ｊ−
ることがＣさ、好ましく（よ、リン酸緩衝液を挙げるこ
とができる。 カラムクロマ１〜グラフイーを行なう際の溶離法として
は、上記の各種緩衝液、塩溶液、水を組合せた温度勾配
法（グラジ丁ント法）による溶離がりｆましく使用され
る。たとえば、リン酸緩衝液とＪＲ，化すｌ−リウム水
溶８々どの直線グラジ］−ン１〜等は好適である。 本発明方法は、既知試料により一度カラムクロマ１−グ
ラフィーを行ない、得られた保持容Ｄ−’ｔまた（ま保
持時間にＪ、す、△■、Ａ １１ 、ＩＪよび△■の溶
離（分画を１１（定し、検出器によって定バ１不１１１
能な低温度のＡＩ、Ａ ＩＩおよびＡＩｌ［をａ有り−
る生体液を等しい条件下でカラムク１７１へグラフィー
を行ない、上記で■一定しｔこ位置の分画を採取し、こ
の分画につい−Ｃ微Ｅ首分析が１１能なラジオイムノア
レイにイ」シて、△■、△ＨＪ＞よび△■を定量づ−る
方法である。 本発明方法では、第１１′程のカラムクロマ１〜グラフ
イーと、第２工程でのカラムクロア１−グラフィーとを
同一の条（’ｌで行イ≧うことにより、ＡＩ、ＡＩＩお
よび△■の溶離位置を一致させる方法を採用しているが
、それは△■、△■およびＡｍの溶離位置を知る必要か
ら発明されたものであって、同−条イ′１でなく−１も
Δ丁、ＡＩＩ ６３Ｊ：びＡＩＩＩの保持容量または保
持時間を知ることによって容易に分画を採取づることが
できる。 したがって、ＡＩ、ＡＩおよびＡｌｌの保持容量ま１．
：（ま保１４時間を知れば、第］工程と第２工程どのカ
ラムク［１マドグラフイ一条１佳を等しくづる必要はな
い。 本発明方法によれば、生体中のＡＩ、ＡＨａ３よびＡ１
１ｌのようにピコグラム／ ｍＲ（’Ｉ）（Ｊ／ ｍで
）程度の低ｉＩ：ひ庶の△■、ＡＩＩ Ｊ３Ｊ、び△■
を正（ｉｆ「に測定Ｊることができ、高血圧症の１幾構
解明に資り−るどころ人と考えられる。 次に実施例により４Ｘ発明を説明づ−るが、本発明は、
これら実施例に限定されるしのでは４ｆい３゜実施例
１ （ａ）４票ｉシー試＆ヒ（既知〉によるカラムクロマ１
−グラフィー 試わｌ溶液：シグマ社製、ＡＩ、ＡＩＩおよびＡ■各３
１Ｊ９を、０．１３５Ｍの塩化す１〜リウムを含む３０
ｍＭのリン酸緩山！Ｉｆｆ （ＤｌｌＧ、５）ｌｏＯ
ｍに溶解した。 カラムクロア６３Ｊ、び充填剤：東？゛〔曹達（株）製
、１１Ｘ−５Ｘ−５３Ｏ０平均か“ｌ径５ｔ）、経孔径
約４００人であり、−Ｃ１１２−ＣＯＯ１１を交換基と
するシリノＪグル）を充填した長さ３０ ｃｍ、内径４
ｍｍのカラム カラム温度：至７ｕａ （約２８°０一定）溶離液：
０．１３５Ｍ Ｆ７） ｊ’ｒ’、化す１ヘリウムを含
イ１りる３０ ｍＪｙｌリンｕ Ｍ ｔＪｉ＋ ａ （
１１Ｉｆ Ｇ ５）および０ 、 り１Ｍ ｉｆ、Ａ化
ノ１ヘリウムを含む３Ｏｎ＋Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ６，
５を１０分間で０１３５〜０．５Ｍ塩化ブ１ヘリウム濶
磨になるように直線グラジエン１へを行ない、流速０．
７５ｍｆｆ／分となるようにカラムに流通さ氾た。 ポンプ：ミル１〜ン］］イ社製シングルプランジ＼Ｉ−
ポンプ。 （ｂ）第１工程 （ａ）に示した条件により、△ｉ、ＡＩ［およびＡＩＩ
［の１００成を別々に）Ｊラムクロマ１−グラフィーに
イリし、各△■、Ａ■おＪ：び△■の保持容１を測定し
た。次いでＡＩ、ＡＩおよびＡＩの試料溶液を混合し、
その１００成によりカラムクロマ１−グラフィーを行な
い第１図をＩＩ７だ。 第１図中ピーク（２）、（１）おにび（３）は、それぞ
れＡＩ、ＡＩＩ Ａ３よびＡＩＩＩであり、それらの保
持容■は、３．３ｄ、５１ｍＱおよび１００ｍ１であっ
た１、上記混合試料に０．００４％となるようにリゾデ
ーム（内部標準）を添加し、同一条件によりりロマトグ
ラフイーを行ない第２図をｉ’、Ｊ ｊこ。第２図中ピ
ーク（４）は、リゾブ−−ムぐある。リゾチームの保持
容１３は、９． Ｇｒｄであつｌこ 。 （Ｃ）生体液中の△■、ΔＩＩ Ｊ３よび△■のカラｌ
＼り［１７１へグラフィー ヒ１〜ＩＩ・１静脈Ｊ、す、予め氷冷した採血管（［Ｄ
丁△−２Ｋ Ｇ、 Ｏｍｇを含む）に５ｍＱの血液を採
取し、４°Ｃに−（遠心沈降（３０００ｒｌＪｌｎ 、
１５分間）させ、血すｉ、！を１７ｋ。ここで得られた
血漿２ ｍｅに、１０％ＦＤｌＡ−２Ｎａ水溶液３０成
を加え、ｊｑうした血漿（３Ｎ Ｉｎ 酸にでＩｉｌ
２に調整）を ｉ ｍＭの塩酸にて平衡化した［）ｏｗ
ｅｘ ＡＧ５０Ｗ−Ｘ２（５０へ・１００メツシユ）の
長さ１０ ｃｍ、内径５１１１１１１のカラムに流）由
ざｌ、３ｍＱの１５％アン′しニア水ＣΔ丁、ＡＩ［お
よび△Ｉｌｌを溶固［づることにより除蛋白を行ない、
次い−Ｃ真空凍結乾燥した。 １“１られた凍結乾燥試お１に、］二記 （ａ）’Ｃ試
おＩ溶油をｆ［成し人二どＩｉｌ ４にのリン酸緩衝液
（１こだし、０００４％とイｆるようにリゾデームを添
加）１１０成を加え、その１０Ｇ成を上記（ｂ）と同様
にカラムク＋−Ｊｖ ｌ−グラフィーを行ない、第３図
のりｌ」７１〜グラムを得るとともに、該（ｂ）項で得
られたＡＩ、Ａ ＩＩ ｉ１５よび△■に相当−りる保
持容ω分両各９００成を採取した。 （ｄ）ラジオイムノアゼイ ２５ （Ｃ）項で得られた△］１分画の４００μｅに ■（買
伍数１２５の沃素）で標識されたΔ丁２５ （１−ＡＩと記り、以下同様）をＡＩ［分画２５ の４００成に Ｉ−Ａｎを、そしてＡＩ分画の４００成
ニ１２５１− Ａ ｍ ヲ各々１００成（１（Ｈ）００
ｃ１＋ｍ）づつ加え、次いで家兎から得られた抗血清（
八■の抗体価１：１００００ 、Ａ Ｉの抗体価１・１
２００００、Ａ■にはＡＩＩ抗血清を使用した。）１０
０成を加え、４℃に３６時間保持した。これにヂャ一二
】−ルアキストラン溶液（Ｎｏｒｉｌ △：０．６％、
１）ｅｘｔｒｎ Ｔ−７０： ０．０６％含有）を１ｍ
ρ加え、４℃に２０分間保持した後、遠心沈降させ、沈
澱物の敢ｑ・］線■を測Ｔし、別に１；ノられｌζ検吊
線から、ＡＩ、Ａｌｌ１１５よび△■の含イ１１ｉを１
！１だ。結果を第１表に示した。 次に、腎性高血圧患者（９才、女性）にカブ１〜リル６
ｍｇを投与したときの値を第２表に承り。 第２８ （１）単位はＩ］！Ｉｔ／ 戒を示り
第１図は、ＡＩ、△■、おＪ：びＡＩ［［のクロマ１−
グラムであり、第２図は、△ｉ 、Ａ ＩＩ、Ａ Ｉｌ
ｌおＪ：びリゾチームのクロマ１〜グラムであり、そし
−Ｃ第３図は、リゾチームを添加した生体液のクロマ１
〜グラムである。 ビークト・・・・ＡＩ ピーク２・・・・・ＡＩ ピーク３・・・・・ＡＩ［ｌ ピーク４・・・・・リゾチーム 特Ｒ′Ｆ出願人 星 野 忠 夫 第１１羽 不２１渇 」ｌ続ネ市正拶）（方式） ％式％ １ 事件の表示 昭和５６年特￥１願第１４５２１５号 ２ 発明の名称 アンジオテンシンの定量方法 ３ 補正をする者 事イ′１どの関係 特ｙ（出願人 ４ 補正命令の日イ」 昭和５９年１１月２７日（発送日） ５ ？ｄｉ正の対象 明細書 ６ 補正の内容 願書に最初に添（＝ｉ した明細書の予相・別紙のどｄ
３す（内容に変更なし）
グラムであり、第２図は、△ｉ 、Ａ ＩＩ、Ａ Ｉｌ
ｌおＪ：びリゾチームのクロマ１〜グラムであり、そし
−Ｃ第３図は、リゾチームを添加した生体液のクロマ１
〜グラムである。 ビークト・・・・ＡＩ ピーク２・・・・・ＡＩ ピーク３・・・・・ＡＩ［ｌ ピーク４・・・・・リゾチーム 特Ｒ′Ｆ出願人 星 野 忠 夫 第１１羽 不２１渇 」ｌ続ネ市正拶）（方式） ％式％ １ 事件の表示 昭和５６年特￥１願第１４５２１５号 ２ 発明の名称 アンジオテンシンの定量方法 ３ 補正をする者 事イ′１どの関係 特ｙ（出願人 ４ 補正命令の日イ」 昭和５９年１１月２７日（発送日） ５ ？ｄｉ正の対象 明細書 ６ 補正の内容 願書に最初に添（＝ｉ した明細書の予相・別紙のどｄ
３す（内容に変更なし）
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 次の第１］−稈、第２］二稈および第３工程からなるア
ンジオテンシンの定娘力法。 （イ）標ン１１．試檗アンシフ１ラーンシン含イｊ液を
１、”■定条１７１下に水性系カラムクロマ１〜グラノ
イーにより分画し、その保持容量または保持＋１，７間
を測定する第１工程、 （ｕ）ｉ数量のう７ンジＡアンシン含イＪ液を第１ Ｉ
程の特定条１′１干でカラムクロマ１〜グラフイーを？
−７ない、第１丁稈Ｃ：ｉ！１られた保１、ｌＩ容［０
または保持１１５１間に等しい分画を１（Ｉ８第２」二
稈、（ハ）第２土程で１！、Ｊられだの画を、ランＡイ
ムノアセイに（”ｌ ｔ、 ’Ｕ）７ンジＡラーンシン
を定Ｊ’１ ′？Ｊる第３１−程、。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP14521581A JPS60190863A (ja) | 1981-09-14 | 1981-09-14 | アンジオテンシンの定量方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP14521581A JPS60190863A (ja) | 1981-09-14 | 1981-09-14 | アンジオテンシンの定量方法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS60190863A true JPS60190863A (ja) | 1985-09-28 |
| JPH0219909B2 JPH0219909B2 (ja) | 1990-05-07 |
Family
ID=15380027
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP14521581A Granted JPS60190863A (ja) | 1981-09-14 | 1981-09-14 | アンジオテンシンの定量方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPS60190863A (ja) |
Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPH01227961A (ja) * | 1988-03-09 | 1989-09-12 | Kissei Pharmaceut Co Ltd | アンジオテンシン２の酵素免疫化学的測定方法 |
| JPH01288766A (ja) * | 1988-01-26 | 1989-11-21 | Univ California | 低濃度のジオキシン類の免疫診断検出法 |
| JPH03277297A (ja) * | 1990-03-28 | 1991-12-09 | Saitetsuku Res:Kk | 組換え型ヒトアンジオテンシノーゲンの定量方法 |
-
1981
- 1981-09-14 JP JP14521581A patent/JPS60190863A/ja active Granted
Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPH01288766A (ja) * | 1988-01-26 | 1989-11-21 | Univ California | 低濃度のジオキシン類の免疫診断検出法 |
| JPH01227961A (ja) * | 1988-03-09 | 1989-09-12 | Kissei Pharmaceut Co Ltd | アンジオテンシン２の酵素免疫化学的測定方法 |
| JPH03277297A (ja) * | 1990-03-28 | 1991-12-09 | Saitetsuku Res:Kk | 組換え型ヒトアンジオテンシノーゲンの定量方法 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPH0219909B2 (ja) | 1990-05-07 |
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